JP5172531B2

JP5172531B2 - Lipase inhibitor, antioxidant, carbohydrase inhibitor, and method for producing drug

Info

Publication number: JP5172531B2
Application number: JP2008208008A
Authority: JP
Inventors: 英人木村; 智史小川; 愛新見; 一成横田
Original assignee: 寿製菓株式会社
Priority date: 2008-08-12
Filing date: 2008-08-12
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2028-08-12
Also published as: JP2010043023A

Description

本発明はポリフェノールの技術に関し、特に食品、健康食品等で使用可能なトチノキ種皮由来の重合ポリフェノールに適用して有効な技術である。 The present invention relates to a polyphenol technique, and is particularly effective when applied to a polymerized polyphenol derived from a carrot seed coat that can be used in foods, health foods, and the like.

近年、生活習慣病の予防に関心が高まり、天然由来の機能性成分の検索が盛んに行われている。かかる中、例えば、生体内で発生するフリーラジカルや活性酸素が、老化、発癌、動脈硬化などの発症因子であると報告されている。それらの予防目的で、抗酸化物質の検索が盛んに行われている。例えば、ポリフェノールの一種であるプロシアニジンが、そうである。かかる物質は、ブドウ、赤ワイン、リンゴ、黒豆、クランベリーなど広く食品中に見出される。その抗酸化能や種々の機能について、多数の報告が見受けられる。 In recent years, interest in prevention of lifestyle-related diseases has increased, and search for naturally-derived functional components has been actively conducted. Among these, for example, it has been reported that free radicals and active oxygen generated in vivo are onset factors such as aging, carcinogenesis, and arteriosclerosis. For these preventive purposes, search for antioxidant substances has been actively conducted. For example, procyanidins, a type of polyphenol. Such substances are widely found in foods such as grapes, red wine, apples, black beans and cranberries. There are many reports on its antioxidant capacity and various functions.

また、生活習慣病のリスクファクターとして、肥満が、糖尿病や動脈硬化さらには高脂血症などの生活習慣病と密接に関係していると考えられている。それらを予防するために、糖質や脂肪の分解吸収を抑制する目的で、α−アミラーゼや、α−グルコシダーゼなどの糖質分解酵素が検索されている。膵リパーゼなどの脂肪分解酵素の阻害物質の検索も活発に行われている。例えば、糖質分解酵素阻害物質については、非特許文献１、２に、カテキン類の研究が報告されている。また、特許文献１には、グァバ葉抽出物に関しての開示が見られる。さらには、ブドウ種子、柿葉、プーアル茶などの抽出物に関して、特許文献２には記載がある。 As a risk factor for lifestyle-related diseases, obesity is considered to be closely related to lifestyle-related diseases such as diabetes, arteriosclerosis and hyperlipidemia. In order to prevent them, saccharide-degrading enzymes such as α-amylase and α-glucosidase have been searched for the purpose of suppressing the decomposition and absorption of carbohydrates and fats. Searches for inhibitors of lipolytic enzymes such as pancreatic lipase are also actively conducted. For example, regarding carbohydrase inhibitors, research on catechins has been reported in Non-Patent Documents 1 and 2. Patent Document 1 discloses disclosure relating to a guava leaf extract. Furthermore, Patent Document 2 describes the extracts of grape seeds, persimmon leaves, puer tea and the like.

さらには、リパーゼ阻害物質として、豆科植物カワラケツメイに含まれているフラボノイド類およびその配糖体に関して、特許文献３に開示がある。タマリンドのプロシアニジンを有効成分とする抗肥満剤に関しても、特許文献４に記載がある。 Furthermore, Patent Document 3 discloses flavonoids and glycosides thereof that are contained in leguminous plant Kawaraketsumei as lipase inhibitors. Patent Document 4 also describes an anti-obesity agent containing tamarind procyanidin as an active ingredient.

トチノキ(Aesculus turbinata Blume)の種子、すなわち栃の実は日本で縄文時代から食用にされている。現代でも、栃餅や栃の実団子などの製菓原料として利用されている。本発明者らは、栃の実の生物活性を明らかにする目的で、皮剥ぎした天然の栃の実、および食用にするため木灰であく抜き処理された栃の実について研究を行っていた。その結果、両栃の実からそれぞれサポニン類を単離した。かかるサポニン類については、非特許文献４、５に、それらが血糖値上昇抑制作用を示すことを報告した。さらに、それらのサポニン類が膵リパーゼに対し阻害活性を示すことも、非特許文献６、７で報告した。マウスに高脂肪食とともに摂食させたところ、体重の増加を抑制することを初めて見出したのである。非特許文献８には、リパーゼ阻害および糖質分解酵素阻害作用を有する物質が肥満や糖尿病への治療薬として利用し得ることが記載されている。
特開平７−５９５３９号公報特開平９−２２７３９８号公報特開平８−２５９５５７号公報特開平９−２９１０３９号公報 Hara, Y. and Honda, M., The inhibition of α-amylase by tea polyphenols. Agric.Biol.Chem., 54, 1939-1945 (1990) Miwa, H.,and Yoshihiko, H., Inhibition of ratintestinal sucrase and α-glucosidase activities by tea polyphenpls., Biosci. Biotech. Biochem., 57, 123-124 (1993) 木村英人，渡邉あい，地阪光生，山本達之，木村靖夫，勝部拓矢，横田一成，「あく抜き処理トチノキ種子のサポニン成分の化学構造と血糖値上昇抑制抑制作用」、食科工, 51,672-679 (2004). 木村英人, 地阪光生, 木村靖夫, 勝部拓矢, 横田一成,「あく抜き処理したトチノキ種子から単離されたサポニン成分の血糖値上昇抑制作用と苦味の低減化」、食科工, 53, 31-38 (2006). Kimura, H., Ogawa, S., Jisaka, M., Kimura, Y., Katsube, T.and Yokota, K. ,“Identification of novel saponins from edible seeds of Japanese horse chestnut(Aesculus turbinata Blume) after treatment with wooden ashes and their nutraceutical activity.” J Pharm Biomed Anal. 41, 1657-1665 (2006). Kimura, H., Ogawa, S., Jisaka, M., Katsube, T.and Yokota, K.,“ Antiobese effects of novel saponins from edible seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME) after treatment with wood ashes.”J. Agric. FoodChem., 56,4783-4788(2008). Sudjaroen, Y., Haubner, R., Wurtele,G., Hull, W.E., Erbenc, G., Spiegelhalder,B., Changbumrung, S., Bartsch, H. and Owen, R.W., “Isolation and structure elucidation of phenolic antioxidants from Tamarind (Tamarindus indica L.) seeds and pericarp.”Food and Chemical Toxicology , 43, 1673-1682(2005). 辻正富、斉藤宜彦、井上修二、「総説抗肥満症をめざした創薬：過去、現在、未来への展望消化吸収阻害系薬物」、日薬理誌、118、ｐ340-346(2004) Tochinoki (Aesculus turbinata Blume) seeds, that is, tomato seeds, have been edible in Japan since the Jomon period. Even in modern times, it is used as a raw material for confectionery such as Tochigi and Tochi no real dumplings. For the purpose of clarifying the biological activity of tochi fruits, the present inventors have been studying peeled natural tochi fruits and tochi fruits that have been treated with wood ash for edible use. As a result, saponins were isolated from both tochi fruits. Regarding these saponins, Non-Patent Documents 4 and 5 reported that they exhibit an inhibitory effect on the increase in blood glucose level. Furthermore, it was also reported in Non-Patent Documents 6 and 7 that these saponins show inhibitory activity against pancreatic lipase. When a mouse was fed with a high fat diet, it was found for the first time that the increase in body weight was suppressed. Non-Patent Document 8 describes that substances having lipase inhibitory activity and carbohydrase inhibitory activity can be used as therapeutic agents for obesity and diabetes.
JP-A-7-59539 JP-A-9-227398 JP-A-8-259557 JP-A-9-291039 Hara, Y. and Honda, M., The inhibition of α-amylase by tea polyphenols.Agric.Biol.Chem., 54, 1939-1945 (1990) Miwa, H., and Yoshihiko, H., Inhibition of ratintestinal sucrase and α-glucosidase activities by tea polyphenpls., Biosci. Biotech. Biochem., 57, 123-124 (1993) Hideto Kimura, Ai Watanabe, Mitsuo Chisaka, Tatsuyuki Yamamoto, Ikuo Kimura, Takuya Katsube, Kazunari Yokota, "Chemical structure of saponin component of perforated seeds and inhibitory action to suppress increase in blood glucose level", 51,672-679 (2004). Hideto Kimura, Mitsuo Chisaka, Ikuo Kimura, Takuya Katsube, Kazunari Yokota, “Inhibition of Glucose Level Suppression and Bitterness of Saponin Components Isolated from Boiled Tochinoki Seeds”, Shokuhin, 53 , 31-38 (2006). Kimura, H., Ogawa, S., Jisaka, M., Kimura, Y., Katsube, T. and Yokota, K., “Identification of novel saponins from edible seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata Blume) after treatment with wooden ashes and their nutraceutical activity. ”J Pharm Biomed Anal. 41, 1657-1665 (2006). Kimura, H., Ogawa, S., Jisaka, M., Katsube, T. and Yokota, K., “Antiobese effects of novel saponins from edible seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME) after treatment with wood ashes.” J. Agric. FoodChem., 56,4783-4788 (2008). Sudjaroen, Y., Haubner, R., Wurtele, G., Hull, WE, Erbenc, G., Spiegelhalder, B., Changbumrung, S., Bartsch, H. and Owen, RW, “Isolation and structure elucidation of phenolic antioxidants from Tamarind (Tamarindus indica L.) seeds and pericarp. ”Food and Chemical Toxicology, 43, 1673-1682 (2005). Masatomi Tsuji, Yoshihiko Saito, Shuji Inoue, “Review: Drug Discovery for Anti-Obesity: Perspectives for Past, Present, Future” Digestion Absorption Inhibitory Drugs, Pharmacological Journal of Japan, 118, p340-346 (2004)

近年生活習慣病が社会問題となっている。これらを予防する目的で、食品由来の機能性物質の検索が盛んに行われている。当社では、以前から栃の実に着目し研究を進めてきた。その結果、本発明者らは、前記の如く、皮剥ぎした天然の栃の実、および食用にするため木灰であく抜き処理された栃の実からそれぞれサポニン類を単離し、それらが血糖値上昇抑制作用を示すことを見出した。さらに、それらのサポニン類が膵リパーゼに対し阻害活性を示すことも見出した。 In recent years, lifestyle-related diseases have become a social problem. In order to prevent these problems, search for food-derived functional substances has been actively conducted. We have been conducting research with a focus on the fruits of Tochi. As a result, as described above, the present inventors isolated saponins from peeled natural tomato fruits and tochi fruits that had been processed with wood ash for edible use, and they increased blood sugar levels. It was found to show an inhibitory action. Furthermore, it discovered that those saponins showed inhibitory activity with respect to pancreatic lipase.

かかる一連の研究では、古来から食用に供されてきた栃の実部分に着目して行われていた。そのため、トチノキ種皮は、廃棄処分されるのが常であった。食用に供するという観点からは、当然に、栃の実にしか目が向かなかったのである。しかし、本発明者らは、廃棄処分されるトチノキ種皮が、結構大量であることに思い至った。かかるトチノキ種皮をも有効に活用することができないかと考えたのである。通常は食用に供されない部分にも、有用な成分が含まれているのではないかと考えた。 Such a series of researches have focused on the real part of Tochi that has been used for food since ancient times. For this reason, it was usual to dispose of Tochinoki seed coat. Of course, from the point of view of serving it as an edible, it was only the eyes of Tochi. However, the present inventors have come to realize that the amount of Tochinoki seed coat to be disposed of is quite large. We thought that such a cypress seed coat could be used effectively. It was thought that useful components were also contained in parts that were not normally used for food.

本発明の目的は、通常は食用に供されてこなかった、所謂食品残渣部分のトチノキ種皮から、食品、健康食品等で利用できる有効成分を見出し、それを活用する技術を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a technique for finding an active ingredient that can be used in foods, health foods, and the like from a sour food seed coat of a so-called food residue portion that has not been provided for edible use.

本発明の前記ならびにその他の目的と新規な特徴は、本明細書の記述および添付図面から明らかになるであろう。 The above and other objects and novel features of the present invention will be apparent from the description of this specification and the accompanying drawings.

本願において開示される発明のうち、代表的なものの概要を簡単に説明すれば、次のとおりである。 Of the inventions disclosed in the present application, the outline of typical ones will be briefly described as follows.

我々は、食品残渣として廃棄されているトチノキ種皮を初めて調べた。その結果、トチノキ種皮からポリフェノールを抽出し得ることが分かった。かかるポリフェノールを精製した。さらに、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)、および液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化(electrospray ionization, ESI)質量分析法(LC-ESI MS)による分析を行った。かかる結果、重合性のポリフェノールであることが分かった。そして、さらに、トチノキ種皮由来のポリフェノール類の抗酸化性、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼおよびブタ膵リパーゼに対する阻害活性を調べ、極めて有効な成分が有することを初めて見出した。かかる成分を食品、あるいは健康食品に利用しうることも見出した。 We examined for the first time the seedlings that were discarded as food residues. As a result, it was found that polyphenols can be extracted from the cypress seed coat. Such polyphenols were purified. In addition, high-performance liquid chromatography (HPLC), matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS), and liquid chromatography-electrospray ionization (ESI) mass spectrometry (LC-ESI MS) ). As a result, it was found that it was a polymerizable polyphenol. Furthermore, the antioxidant properties of α-amylase, α-glucosidase and porcine pancreatic lipase were examined for the polyphenols derived from cypress seed coat, and it was found for the first time that they have extremely effective components. It has also been found that such ingredients can be used in foods or health foods.

すなわち、トチノキ種皮のポリフェノールを熱水（あるいはアルコール、あるいはアセトンでも可）抽出した。かかる抽出物を、各種カラムクロマトグラフィーで精製し、構造を明らかにした。その結果、構造的特徴は、flavan-3-olを基本とする重合体で重合度が3〜23のポリフェノールであることが、初めて確認された。さらに、分子内には、0〜10のA-type interflavan結合を有することも明らかとなった。 That is, the polyphenols of the seedlings of cypress were extracted with hot water (or alcohol or acetone). The extract was purified by various column chromatography to clarify the structure. As a result, it was confirmed for the first time that the structural characteristics were a polyphenol having a polymerization degree of 3 to 23 and a polymer based on flavan-3-ol. Furthermore, it was also revealed that the molecule has 0 to 10 A-type interflavan bonds.

本願において開示される発明のうち、代表的なものによって得られる効果を簡単に説明すれば以下のとおりである。 Among the inventions disclosed in the present application, effects obtained by typical ones will be briefly described as follows.

本発明で初めて見出されたトチノキ種皮由来のポリフェノールを食品、健康食品等に使用することで、つぎのような作用が得られることが分かった。すなわち、トチノキ種皮由来のポリフェノールは、抗酸化作用、糖質分解酵素阻害（α−グルコシダーゼ阻害、α−アミラーゼ阻害）作用、リパーゼ阻害作用を有しているため、食品等に添加して摂取すると、活性酸素の除去、血糖値の上昇抑制、肥満防止等の効果が得られることが分かった。 It has been found that the following actions can be obtained by using polyphenols derived from the seed of seedlings found in the present invention for foods and health foods. In other words, polyphenols derived from the seeds of cinnamomum have antioxidant activity, carbohydrase inhibition (α-glucosidase inhibition, α-amylase inhibition) activity, and lipase inhibition activity. It has been found that effects such as removal of active oxygen, suppression of increase in blood glucose level, prevention of obesity and the like can be obtained.

以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。本発明は、トチノキ種皮から抽出されるポリフェノールに関する技術である。かかるポリフェノールは、重合構造を有していることが確かめられた。また、活性作用としては、例えば、抗酸化作用、糖質分解酵素阻害（α−グルコシダーゼ阻害、α−アミラーゼ阻害）作用、リパーゼ阻害作用を有している。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. The present invention relates to a technique relating to polyphenols extracted from cypress seed coats. Such a polyphenol was confirmed to have a polymerized structure. Moreover, as an active effect | action, it has an antioxidant effect | action, carbohydrase inhibitor (alpha-glucosidase inhibition, alpha-amylase inhibition) action, and a lipase inhibitory action, for example.

かかるトチノキ種皮由来のポリフェノールは、例えば、その純品は、茶色の粉末である。水に対して可溶である。アルコールに対して可溶である。かかるポリフェノールは、例えば、食品、健康食品に混ぜて使用することができる。混合使用するに際しては、例えば、純品を適量秤量して混合すればよい。あるいは、水溶液等として、液体にして混合しても構わない。かかる混合する食品あるいは食品添加物としては、例えば、菓子、パン、茶、ジュースなどの飲料、清酒、ビール、豆腐、麺類、調味料等が挙げられる。健康食品としては、ドリンク剤、サプリメント等が挙げられる。また、純品を乳糖、結晶セルロース、デンプン、デキストリン等の賦形剤と共に成型して、そのまま飲むようにすることもできる。医薬品としての使用も十分に考えられる。 Such polyphenols derived from the seed of seedling are, for example, pure brown powder. It is soluble in water. Soluble in alcohol. Such polyphenols can be used, for example, mixed with foods and health foods. When mixing and using, for example, an appropriate amount of a pure product may be weighed and mixed. Alternatively, it may be mixed as a liquid as an aqueous solution or the like. Examples of such foods or food additives to be mixed include beverages such as confectionery, bread, tea and juice, sake, beer, tofu, noodles, seasonings and the like. Examples of health foods include drinks and supplements. In addition, a pure product can be molded with an excipient such as lactose, crystalline cellulose, starch, dextrin, etc., and can be drunk as it is. Use as a medicine is also fully considered.

トチノキ種皮由来のポリフェノールは、現在市販されている特定健康食品としてのポリフェノール製品よりも、極めてその効能が高いことが確認されている。また、トチノキ種皮由来であるため、従来は食品残渣として廃棄されていたものから製造できるので、極めて低コストで製造できるものと考えられる。 It has been confirmed that polyphenols derived from cypress seed coat are much more effective than polyphenol products as specific health foods currently on the market. In addition, since it is derived from the seeds of cypress, it can be manufactured from what was conventionally discarded as a food residue, so it can be manufactured at a very low cost.

かかる構成のトチノキ種皮由来のポリフェノールは、次のようにして製造、試験等を行った。その詳細について、実験に基づき説明する。 The polyphenol derived from the cypress seed coat having such a structure was manufactured and tested as follows. The details will be described based on experiments.

（実験材料）
本実験では、兵庫県美方郡周辺の山林で採取された栃の実を使用した。また、タンナーゼは三共(東京)から入手した。Folin-Ciocalteu 試薬、プロシアニジンB2, 1, 1- diphenyl -2- piclylhydrazyl(DPPH)は4-methylumbelliferyl oleate (4-MU oleate)、ブタ膵リパーゼ(type II)、ブタ膵臓のα−アミラーゼVI-B、ヒト唾液α−アミラーゼ、ラット小腸アセトン粉末はSigma(St. Louis, MO, USA)から入手した。グルコースCIIテストワコー、トリグリセライドE-テストワコーおよびその他の試薬は、和光純薬工業（大阪）から購入した。 (Experimental material)
In this experiment, we used tomato seeds collected in the forest around Mikata-gun, Hyogo. Tannase was obtained from Sankyo (Tokyo). Folin-Ciocalteu reagent, procyanidin B 2, 1, 1-diphenyl-2-piclylhydrazyl (DPPH) is 4-methylumbelliferyl oleate (4-MU oleate), porcine pancreatic lipase (type II), porcine pancreatic α-amylase VI-B, human salivary α-amylase, Rat small intestine acetone powder was obtained from Sigma (St. Louis, MO, USA). Glucose CII Test Wako, Triglyceride E-Test Wako and other reagents were purchased from Wako Pure Chemical Industries (Osaka).

（トチノキ種皮のポリフェノール成分の抽出・精製）
トチノキ(Aesculus turbinata Blume)の種皮10 g (水分11.54 %)を粉砕し、蒸留水200 ml を加えて、2 時間、加熱還流を行った。かかる抽出液を東洋濾紙No.5を用いて、濾別した。その後、残渣に蒸留水200 ml を加え、再度同様の操作を行った。抽出液をロータリーエバポレーターで減圧留去し、抽出物1.56 g を得た。かかる抽出物をDIAION HP-20(長さ300 mm×内径30 mm、日本錬水製、東京)を用いたカラムクロマトグラフィーに供した。蒸留水500 ml、次にメタノール500 mlで溶出した。得られたメタノール画分を減圧濃縮し、0.67 gの残渣を得た。 (Extraction and purification of polyphenol components from cypress seed coat)
10 g of seed coat (Aesculus turbinata Blume) (water 11.54%) was pulverized, 200 ml of distilled water was added, and the mixture was heated to reflux for 2 hours. The extract was filtered using Toyo filter paper No. 5. Thereafter, 200 ml of distilled water was added to the residue, and the same operation was performed again. The extract was distilled off under reduced pressure using a rotary evaporator to obtain 1.56 g of extract. The extract was subjected to column chromatography using DIAION HP-20 (length 300 mm × inner diameter 30 mm, manufactured by Nippon Nensui, Tokyo). Elution was performed with 500 ml of distilled water and then with 500 ml of methanol. The obtained methanol fraction was concentrated under reduced pressure to obtain 0.67 g of a residue.

この残渣を、Chromatorex ODS 1024T カラム(長さ300 mm×内径30 mm、富士シリシア化学、春日井)に供した。5 % メタノール500 ml で洗浄後、50 %メタノール500 ml で溶出した。この溶出液を減圧留去し、精製物0.54 g を得た。この精製物100 mg をエタノールに溶解し、Sephadex LH-20カラム(長さ100 mm×内径10 mm，GE Healthcare UK Ltd, England )に供した。エタノール40 ml、メタノール40 ml、70 % アセトン40 mlの順に溶出し、溶出液を2 ml ずつ分取した。同様の操作を繰り返し行い、各溶出画分を減圧下溶媒留去して、エタノール溶出画分(F1)0.02 g、メタノール溶出画分(F2)0.27 g、70 % アセトン溶出画分(F3)0.10 g の乾固物を得た。各フラクション毎に総ポリフェノール量をFolin-Ciocalteu 法により測定した。 This residue was applied to a Chromatorex ODS 1024T column (length 300 mm × inner diameter 30 mm, Fuji Silysia Chemical, Kasugai). After washing with 500 ml of 5% methanol, elution was performed with 500 ml of 50% methanol. The eluate was distilled off under reduced pressure to obtain 0.54 g of a purified product. 100 mg of this purified product was dissolved in ethanol and applied to a Sephadex LH-20 column (length 100 mm × inner diameter 10 mm, GE Healthcare UK Ltd, England). Elution was performed in the order of 40 ml of ethanol, 40 ml of methanol, and 40 ml of 70% acetone, and the eluate was fractionated by 2 ml. The same operation was repeated, and each elution fraction was evaporated under reduced pressure to give ethanol elution fraction (F1) 0.02 g, methanol elution fraction (F2) 0.27 g, 70% acetone elution fraction (F3) 0.10. A dry product of g was obtained. For each fraction, the total polyphenol content was measured by the Folin-Ciocalteu method.

（トチノキ種皮のポリフェノール成分のHPLCによる分析）
トチノキ種皮のポリフェノール成分を分析する目的で、順相および逆相HPLCによる分析を行った。HPLC装置には、島津製作所のLC-2010AシステムとクロマトパックC-R8Aを用いた。順相HPLC分析は次の条件で行った。すなわち、カラムは、ワイエムシィ製のYMC-Pack SIL-06 カラム(長さ250 mm×内径4.6 mm)を使用した。移動相は、(A)ジクロロメタン、(B)メタノール、(C)50 % 酢酸水溶液(v/v)を用いた。移動相A/B/C液の混合比(v/v)が0〜30分は82 :14 : 4から67.6 :28.4 : 4、30分から45分は67.6 :28.4 : 4から56.8 : 39.2 : 4、45分から50分は56.8 :39.2 : 4から10 : 86 : 4 の濃度勾配で、50分から60分は10 : 86 : 4で流速1.0 ml/minで送液した。 (Analysis by HPLC of polyphenol component of Japanese horse chestnut seed coat)
For the purpose of analyzing the polyphenol component in the seedling of cinnamon seed, analysis by normal phase and reverse phase HPLC was performed. Shimadzu LC-2010A system and Chromatopack C-R8A were used for the HPLC system. Normal phase HPLC analysis was performed under the following conditions. That is, a YMC-Pack SIL-06 column (length 250 mm × inner diameter 4.6 mm) manufactured by YMC was used as the column. As the mobile phase, (A) dichloromethane, (B) methanol, and (C) 50% aqueous acetic acid solution (v / v) were used. The mixing ratio (v / v) of the mobile phase A / B / C solution is 0 to 30 minutes from 82: 14: 4 to 67.6: 28.4: 4, from 30 minutes to 45 minutes is 67.6: 28.4: 4 to 56.8: 39.2: 4 From 45 to 50 minutes, the solution was fed at a concentration gradient of 56.8: 39.2: 4 to 10: 86: 4, and from 50 to 60 minutes at 10: 86: 4 at a flow rate of 1.0 ml / min.

検出波長は280 nm とした。カラム温度は25℃に設定した。逆相HPLC分析には、Phenomenex 製のLUNA C18 (2)カラム(長さ250 mm×内径4.6 mm) を使用した。移動相は、(A) 0.1 % ギ酸水溶液、(B)0.1 % ギ酸含有アセトニトリルを用いて、B液の濃度が0 分から5 分までは10 % 、5 分から11 分は10 % から16 %、11 分から 21 分は16 % から17 % 、21 分から22 分は17 % から80 % に上昇する濃度勾配に設定した。検出波長は280 nm、流速は1.3 ml/min，カラム温度は35 ℃に設定した。 The detection wavelength was 280 nm. The column temperature was set to 25 ° C. For reverse phase HPLC analysis, a LUNA C18 (2) column (length 250 mm x inner diameter 4.6 mm) from Phenomenex was used. The mobile phase was (A) 0.1% formic acid aqueous solution and (B) 0.1% formic acid-containing acetonitrile.The concentration of solution B was 10% from 0 to 5 minutes, 10% to 16% from 5 to 11 minutes, 11% Concentration gradients were set from 16% to 17% from 21 minutes to 21 minutes and from 17% to 80% from 21 minutes to 22 minutes. The detection wavelength was 280 nm, the flow rate was 1.3 ml / min, and the column temperature was 35 ° C.

（タンナーゼ処理によるガロイル基の確認）
トチノキ種皮ポリフェノールのガロイル基の有無を確認する目的で、DIAION HP-20 カラムとChromatorex ODS 1024Tカラムで精製した標品10 mg を0.1 M Mcllvaine 緩衝液(pH 7.4)10 ml に溶解した。これにタンナーゼ(1 mg , 0.5 unit)を加え、30 分間、室温にて反応させた。5 分間、100 ℃で加熱して反応を停止した。その後、前述の逆相HPLCの条件で、遊離した没食子酸を分析した。なお、標準物質として、(-)-エピガロカテキンガレートも同様に処理した。 (Confirmation of galloyl group by tannase treatment)
For the purpose of confirming the presence or absence of galloyl groups in torch seed coat polyphenols, 10 mg of a sample purified with a DIAION HP-20 column and a Chromatorex ODS 1024T column was dissolved in 10 ml of 0.1 M Mcllvaine buffer (pH 7.4). To this was added tannase (1 mg, 0.5 unit) and allowed to react at room temperature for 30 minutes. The reaction was stopped by heating at 100 ° C. for 5 minutes. Thereafter, the released gallic acid was analyzed under the above-described reverse phase HPLC conditions. In addition, (−)-epigallocatechin gallate was treated in the same manner as a standard substance.

（MALDI-TOF MSによるトチノキ種皮ポリフェノールの分析）
MALDI-TOF MSの測定は、窒素レーザー (波長337 nm , パルス幅，2 ns）及び遅延引き出し機構を有するイオン化源を備えたApplied Biosystems Japan製のVoyager-DE RP 飛行時間型質量分析計を用いて行った。加速電圧は20 kV で、正イオンモードおよび負イオンモードにて分析した。試料溶液は、試料1 mgをアセトニトリル1に対し0.1%トリフルオロ酢酸を2の割合で混合した溶液1mlに溶解して調製した。かかる試料溶液3 μlに、マトリックス試薬として2, 5-ジヒドロキシ安息香酸を20%エタノールに溶解し、10 mg/mlの濃度に調製した溶液を1μlを混合した溶液を試料プレート上に1μl滴下し、室温にて乾燥させた後に測定に供した。 (Analysis of Tochinoki seed coat polyphenols by MALDI-TOF MS)
MALDI-TOF MS was measured using a Voyager-DE RP time-of-flight mass spectrometer manufactured by Applied Biosystems Japan equipped with a nitrogen laser (wavelength 337 nm, pulse width, 2 ns) and an ionization source with a delayed extraction mechanism. went. The acceleration voltage was 20 kV, and analysis was performed in positive ion mode and negative ion mode. A sample solution was prepared by dissolving 1 mg of a sample in 1 ml of a solution in which 0.1% trifluoroacetic acid was mixed with acetonitrile 1 at a ratio of 2. 1 μl of a solution prepared by dissolving 1 μl of a solution prepared by dissolving 2,5-dihydroxybenzoic acid as a matrix reagent in 20% ethanol and a concentration of 10 mg / ml in 3 μl of the sample solution, After drying at room temperature, it was used for measurement.

（トチノキ種皮重合ポリフェノール(F2, F3)の構成単位のLC-ESI MS質量分析）
トチノキ種皮重合ポリフェノールの構成成分を調べる目的で、酸分解およびdodecylsulfide誘導化を行い、LC-ESI MSによる質量分析を行った。F2、F3 のメタノール溶液(2 mg/ml)1 ml に3.3 % 塩酸−メタノール溶液1 ml 、および0.5 % ドデカンチオール−メタノール溶液2 mlを加えて混合し、40 ℃で30 分間反応させた。この反応液20μl を、逆相のカラムを接続したLC-ESI MSにより分析した。 (LC-ESI MS mass spectrometric analysis of the structural unit of Tochino seed coat polymerized polyphenols (F2, F3))
For the purpose of investigating the constituents of polyphenols of tomato seed coat, acid decomposition and dodecylsulfide derivatization were performed, and mass spectrometry was performed by LC-ESI MS. 1 ml of a methanol solution (2 mg / ml) of F2 and F3 was mixed with 1 ml of a 3.3% hydrochloric acid-methanol solution and 2 ml of a 0.5% dodecanethiol-methanol solution and reacted at 40 ° C. for 30 minutes. 20 μl of this reaction solution was analyzed by LC-ESI MS connected to a reverse phase column.

LC-ESI MS装置は、サーモクエスト社製のイオントラップ型質量分析装置モデルLCQ Deca XPを用いた。カラムはワイエムシィ製のYMC-ODS Pro C18 RS (長さ150 mm×内径4.6 mm)を使用した。移動相は、(A)0.1 % ギ酸水溶液、(B)アセトニトリルを用いて、移動相のB液の濃度が60 分間で65 % から85 % になる直線濃度勾配にて流速0.2 ml/minで送液した。なお、検出波長は280 nm に設定した。ESI MSは正イオンモードで行った。また、末端のdodecylsulfide 化されない部分については、前述の方法のHPLC 条件で分析した。 The LC-ESI MS apparatus used was an ion trap mass spectrometer model LCQ Deca XP manufactured by ThermoQuest. The column used was YMC-ODS Pro C18 RS (length 150 mm × inner diameter 4.6 mm) manufactured by YMC. The mobile phase is (A) 0.1% formic acid aqueous solution and (B) acetonitrile, and the mobile phase B solution is sent at a flow rate of 0.2 ml / min with a linear concentration gradient from 65% to 85% in 60 minutes. Liquid. The detection wavelength was set at 280 nm. ESI MS was performed in positive ion mode. Further, the portion of the terminal which was not converted to dodecylsulfide was analyzed under the HPLC conditions described above.

（トチノキ種皮ポリフェノール成分の抗酸化作用）
（１）DPPH ラジカル消去能：エタノールに溶解させた400 μM 1.1 - diphenyl - 2 - piclylhydrazyl (DPPH ) 300 μl，200 mM MES 緩衝液(pH 6.0)300 μl，エタノール300 μl、蒸留水に溶解した被験サンプル300μl を混合し、20 分間放置した。反応後、520 nm の吸光度を測定した。
（２）β−カロチン退色法：0.1 mlのリノール酸／クロロホルム溶液(1 g /10 ml)、0.25 mlのβ−カロチン／クロロホルム溶液(10 mg /10 ml)、0.5 mlのツィーン40／クロロホルム溶液(2 g/10 ml)を混合した後、窒素ガスで乾固した。その後、蒸留水45 ml、0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.8)を加え、リノール酸-β−カロチンエマルジョンを作成した。サンプル溶液(100μg/ml)20μlにリノール酸-β-カロチンエマルジョン(980μl)を加え、50℃の恒温槽で振盪しながら470 nmの吸光度を経時的に測定した。 (Antioxidant effect of polyphenol component of cinnamon seed coat)
(1) DPPH radical scavenging ability: 400 µM 1.1-diphenyl-2-piclylhydrazyl (DPPH) 300 µl dissolved in ethanol, 200 µM MES buffer (pH 6.0) 300 µl, ethanol 300 µl, ethanol dissolved in distilled water 300 μl of sample was mixed and left for 20 minutes. After the reaction, the absorbance at 520 nm was measured.
(2) β-Carotene fading method: 0.1 ml linoleic acid / chloroform solution (1 g / 10 ml), 0.25 ml β-carotene / chloroform solution (10 mg / 10 ml), 0.5 ml Tween 40 / chloroform solution (2 g / 10 ml) was mixed and dried with nitrogen gas. Thereafter, 45 ml of distilled water and 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 6.8) were added to prepare a linoleic acid-β-carotene emulsion. Linoleic acid-β-carotene emulsion (980 μl) was added to 20 μl of the sample solution (100 μg / ml), and the absorbance at 470 nm was measured over time while shaking in a 50 ° C. constant temperature bath.

（膵リパーゼ阻害活性試験法）
0.1 %デオキシコール酸ナトリウムを含む0.1 M Mcllvaine緩衝液（pH7.4）40μlに、同様の緩衝液で溶解した0.1 mM 4-methylumbelliferyl oleate (4MU oleate)100μｌと、 F1〜F3を蒸留水に溶解した溶液10μlをよく混合した。その後、0.066 unitsのブタ膵リパーゼ（Type II）を同様の緩衝液で溶解した酵素液50μlを加えて、37℃、20分間反応させた。反応後、0.1 Mの塩酸水溶液1mlを加えて反応を停止させた。その後、さらに0.1 Mクエン酸ナトリウム水溶液2mlを加えた後、励起波長320 nm、蛍光波長450 nmの吸収を測定することにより遊離した4-MUの量を測定した。なお、ブランクには、100℃、10分加熱して失活させた酵素で反応させたものを用いた。 (Pancreatic lipase inhibitory activity test method)
100 μl of 0.1 mM 4-methylumbelliferyl oleate (4MU oleate) dissolved in the same buffer and 40 μl of 0.1 M Mcllvaine buffer (pH 7.4) containing 0.1% sodium deoxycholate and F1 to F3 were dissolved in distilled water. 10 μl of the solution was mixed well. Thereafter, 50 μl of an enzyme solution in which 0.066 units of porcine pancreatic lipase (Type II) was dissolved in the same buffer was added and reacted at 37 ° C. for 20 minutes. After the reaction, 1 ml of 0.1 M hydrochloric acid aqueous solution was added to stop the reaction. Thereafter, 2 ml of a 0.1 M sodium citrate aqueous solution was further added, and the amount of 4-MU released was measured by measuring absorption at an excitation wavelength of 320 nm and a fluorescence wavelength of 450 nm. In addition, what was made to react with the enzyme deactivated by heating at 100 degreeC for 10 minutes was used for the blank.

（マウスによる油脂負荷試験法）
マウスによる油脂負荷試験を、次のようにして行った。雄のICRマウスは、日本エスエルシー（静岡）から購入した。生後6週齢で雄のICRマウスを、飼料としてオリエンタル酵母工業（東京）の実験動物用固型飼料MFを用いて、1週間、予備飼育した。その後、油脂負荷試験に供した。油脂エマルジョンとして、コーン油6 ml、コール酸80 mg、オレイン酸コレステロール2 mg、生理食塩水6 mlを混合した後、超音波処理したものを用意した。16時間絶食したマウスの尾静脈より採血した。 (Fat test method using mice)
The oil and fat load test by the mouse was performed as follows. Male ICR mice were purchased from Nippon SLC (Shizuoka). Male ICR mice at 6 weeks of age were preliminarily raised for 1 week using the solid feed MF for experimental animals of Oriental Yeast Co., Ltd. (Tokyo) as feed. Then, it used for the fat and oil load test. As an oil emulsion, 6 ml of corn oil, 80 mg of cholic acid, 2 mg of cholesterol oleate, and 6 ml of physiological saline were mixed and then subjected to ultrasonic treatment. Blood was collected from the tail vein of mice fasted for 16 hours.

その後、被検物として、トチノキ種皮熱水抽出物をDIAION HP-20カラムとChromatorex ODS 1024Tカラムで精製した標品を生理食塩水100μlに懸濁し、マウス体重1 kgあたり0, 100, 200, 500 mg のいずれかとなるようにして胃ゾンデを用いて経口投与した。その後すぐ100μlの油脂エマルジョンを胃ゾンデを用いて経口投与した。75分毎にマウスの尾静脈より採血し、血液を遠心（6200 rpm, 4℃, 20分）し、血漿中の中性脂肪をトリグリセライドE−テストワコー（和光純薬，大阪）により測定した。なお、供試マウスは1群あたり6匹とした。血漿トリグリセリド量は、平均±標準誤差で表した。被検物0 mg / kg体重群に対する各ポリフェノール投与群の血漿トリグリセリド量の比較を、Dunnett法により検定し、P<0.05の場合を有意差ありとした。 Thereafter, as a test substance, a specimen prepared by purifying the Tochinoki seed coat hot water extract with a DIAION HP-20 column and a Chromatorex ODS 1024T column was suspended in 100 μl of physiological saline, and 0, 100, 200, 500 per kg body weight of the mouse. Oral administration was performed using a gastric sonde so that the dose was 1 mg. Immediately thereafter, 100 μl of an oil / fat emulsion was orally administered using a stomach tube. Blood was collected from the tail vein of mice every 75 minutes, blood was centrifuged (6200 rpm, 4 ° C., 20 minutes), and neutral fat in plasma was measured with Triglyceride E-Test Wako (Wako Pure Chemicals, Osaka). The number of test mice was 6 per group. Plasma triglyceride content was expressed as mean ± standard error. Comparison of plasma triglyceride levels in each polyphenol administration group with respect to the test substance 0 mg / kg body weight group was tested by Dunnett's method, and P <0.05 was considered significant.

（α-アミラーゼ阻害活性測定法）
酵素はブタ膵臓とヒト唾液由来のものを用いた。これらの酵素標品は、20℃でpH 6.9の条件の下に、3分間あたり1 mgのマルトースを生成する酵素量を1 Uとした場合、ブタ膵臓α-アミラーゼVI-Bが19.5 U/mg、また、ヒト唾液α-アミラーゼが30.3 U/mgの比活性を示した。基質の0.4 %可溶性澱粉と5 mM CaCl₂を含む50 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）300μ1に、F1〜F3を蒸留水に溶解した溶液50μlを加えた。 (Measurement method of α-amylase inhibitory activity)
Enzymes derived from porcine pancreas and human saliva were used. These enzyme preparations are 19.5 U / mg of porcine pancreatic α-amylase VI-B when the amount of enzyme that produces 1 mg of maltose per 3 minutes is 1 U under the condition of pH 6.9 at 20 ° C. In addition, human salivary α-amylase showed a specific activity of 30.3 U / mg. 50 μl of a solution prepared by dissolving F1 to F3 in distilled water was added to 300 μl of 50 mM sodium acetate buffer (pH 6.0) containing 0.4% soluble starch of the substrate and 5 mM CaCl ₂ .

さらに、基質溶液と同じ緩衝液で溶解したブタ膵α-アミラーゼVI-B 0.3 U、または、ヒト唾液α-アミラーゼ0.3 Uを含む上記緩衝液150μlを加え、30℃で5分間反応させた。
沸騰水中で10分間、加熱することで酵素反応を停止させた。その反応液に0.5 M酢酸水溶液1 mlを加え、さらに0.015 %ヨウ素と0.15 %ヨウ化カリウムを含む水溶液3 mlを加えた後、よく撹拌し、基質の澱粉濃度を反映する700 nmの吸光度の減少を測定した。ブランクには、各試料について、沸騰水中で10分間加熱して失活させた酵素を用いた。 Further, 150 μl of the above buffer solution containing porcine pancreatic α-amylase VI-B 0.3 U dissolved in the same buffer as the substrate solution or human saliva α-amylase 0.3 U was added and reacted at 30 ° C. for 5 minutes.
The enzyme reaction was stopped by heating in boiling water for 10 minutes. Add 1 ml of 0.5 M acetic acid aqueous solution to the reaction solution, add 3 ml of aqueous solution containing 0.015% iodine and 0.15% potassium iodide, then stir well and decrease absorbance at 700 nm reflecting the starch concentration of the substrate Was measured. As a blank, an enzyme which was inactivated by heating in boiling water for 10 minutes was used for each sample.

（α-グルコシダーゼ（マルターゼ、スクラーゼ）阻害活性測定法）
酵素の調製は次のようにして行った。ラット小腸アセトン粉末（Sigma製）1 gに、50 mMマレイン酸緩衝液（pH 6) 9 mlを加え、氷中にてガラスホモジナイザーにて撹拌した。その後、3000 rpm、4℃で10 分間、遠心分離した上清を粗酵素液とした。マルターゼの活性測定では、粗酵素液を50 mMマレイン酸緩衝液（pH 6)で3倍希釈したものを使用した。マルターゼとスクラーゼの基質溶液には、それぞれ、74 mMマルトースと74 mMスクロースを0.1 Mマレイン酸緩衝液（pH 6）に溶解したものを用いた。 (Α-glucosidase (maltase, sucrase) inhibitory activity measurement method)
The enzyme was prepared as follows. 9 g of 50 mM maleic acid buffer (pH 6) was added to 1 g of rat small intestine acetone powder (manufactured by Sigma), and the mixture was stirred in ice with a glass homogenizer. Thereafter, the supernatant obtained by centrifugation at 3000 rpm and 4 ° C. for 10 minutes was used as a crude enzyme solution. In measuring the activity of maltase, a crude enzyme solution diluted 3-fold with 50 mM maleate buffer (pH 6) was used. As the substrate solution of maltase and sucrase, those obtained by dissolving 74 mM maltose and 74 mM sucrose in 0.1 M maleate buffer (pH 6) were used.

この基質溶液100μlに、種々の量のF1〜F3を蒸留水に溶解した液5μlと0.1 Mマレイン酸緩衝液（pH 6.0）45μlの混合液を加えて混合した。その後、37℃で3分間、予備加温した。そして、酵素液50μlを加えて全容量200μlとして30分間、酵素反応させた。反応後、水800μlを加えた後、沸騰水中で2分間加熱することで、酵素反応を停止した。別に、各試料について酵素液を加えた後、直ちに水を加えて沸騰水中で2分間加熱し、酵素を失活させたものをブランクとした。 To 100 μl of this substrate solution, a mixture of 5 μl of various amounts of F1 to F3 dissolved in distilled water and 45 μl of 0.1 M maleate buffer (pH 6.0) was added and mixed. Thereafter, preheating was performed at 37 ° C. for 3 minutes. Then, 50 μl of enzyme solution was added to make a total volume of 200 μl, and the enzyme reaction was performed for 30 minutes. After the reaction, 800 μl of water was added, and then the enzyme reaction was stopped by heating in boiling water for 2 minutes. Separately, after adding an enzyme solution to each sample, water was immediately added and heated in boiling water for 2 minutes to inactivate the enzyme, and a blank was used.

以上の要領でトチノキ種皮から得られたポリフェノールを、次に示すように評価した。 The polyphenol obtained from the cypress seed coat in the above manner was evaluated as follows.

（トチノキ種皮ポリフェノールの抽出量）
トチノキ種皮の熱水抽出物(1560 mg)をDIAION HP-20とChromatorex ODS 1024Tカラムで精製し、その後Sephadex LH-20カラムにかけたところ、図１に示すように、エタノール溶出区(F1)が20 mg、メタノール溶出区(F2)が270 mg、70%アセトン溶出区(F3)が100 mgの精製物が回収された。各溶出区を通じたF1, F2およびF3の溶出パターンは、図２に示す通りである。 (Extracted amount of Tochinoki seed coat polyphenol)
A hot water extract (1560 mg) of cypress seed coat was purified with a DIAION HP-20 and Chromatorex ODS 1024T column, and then applied to a Sephadex LH-20 column. As shown in FIG. A purified product was recovered in an amount of mg, 270 mg in methanol elution section (F2), and 100 mg in 70% acetone elution section (F3). The elution patterns of F1, F2 and F3 through each elution zone are as shown in FIG.

ポリフェノールを多く含むとされている代表的な食品であるワイン、茶、コーヒー、およびリンゴの総ポリフェノール量は、それぞれ1.8 mg/ml、0.9 mg/ml、1.0 mg/ml および2.2 mg/gであると報告されている。今回、10 gのトチノキ種皮から得られた熱水抽出物の総ポリフェノール量は580 mgであった。トチノキ種皮がポリフェノールの抽出原料として非常に有用であることが示唆された。なお、総ポリフェノールの測定法であるFolin-Ciocalteu法はアスコルビン酸の影響を受けるとされている。しかし、トチノキ種皮の熱水抽出物中のアスコルビン酸をHPLC分析した結果、アスコルビン酸は検出されなかった。 Typical polyphenol-rich foods such as wine, tea, coffee and apple have total polyphenol levels of 1.8 mg / ml, 0.9 mg / ml, 1.0 mg / ml and 2.2 mg / g, respectively. It is reported. This time, the total polyphenol content of the hot water extract obtained from 10 g of cypress seed coat was 580 mg. It was suggested that tomato seed coat is very useful as a raw material for polyphenol extraction. The Folin-Ciocalteu method, which is a method for measuring total polyphenols, is said to be affected by ascorbic acid. However, HPLC analysis of ascorbic acid in the hot water extract of cypress seed coat showed that ascorbic acid was not detected.

（トチノキ種皮のポリフェノールのHPLC 分析）
Sephadex LH-20カラムで分離したF1〜F3の各フラクションを、図３に示すように、順相および逆相HPLCにより分析した。F2、 F3では同様のリテンションタイムにピークが確認された。Sudjareonらの報告（非特許文献7）から推察すると、順相HPLCの条件では、重合度が少ないものから多いものの順に溶出されるが、重合度が10 mer以上のものは分離できない。そのため、F2およびF3では、リテンションタイム50分付近に重合度が10 mer以上のものがまとめて溶出されたと考えられた。 (HPLC analysis of polyphenols in cypress seed coat)
F1 to F3 fractions separated on a Sephadex LH-20 column were analyzed by normal phase and reverse phase HPLC as shown in FIG. In F2 and F3, peaks were observed at similar retention times. As inferred from the report of Sudjareon et al. (Non-patent Document 7), the normal phase HPLC conditions elute in ascending order of the degree of polymerization, but those having a degree of polymerization of 10 mer or more cannot be separated. Therefore, it was considered that in F2 and F3, those having a polymerization degree of 10 mer or more were eluted together around a retention time of 50 minutes.

逆相HPLCによる分析においても、F2、F3は同様のリテンションタイムにピークが確認されたものの、Sephadex LH-20カラムでF2とF3は明確に溶出位置が異なる。そのため、重合度の異なるポリフェノールであると考えられた。また、トチノキ種皮ポリフェノールがガロイル基を有するのかを調べる目的で、タンナーゼ処理を行い、遊離する没食子酸を調べた。しかし、没食子酸は検出されなかった。 In the analysis by reverse phase HPLC, although F2 and F3 were confirmed to have peaks at the same retention time, the elution positions of F2 and F3 clearly differ on the Sephadex LH-20 column. Therefore, it was thought that it was polyphenol from which a polymerization degree differs. In addition, for the purpose of investigating whether or not Tochinoki seed coat polyphenol has a galloyl group, tannase treatment was carried out to examine free gallic acid. However, gallic acid was not detected.

尚、図３（Ａ）〜（Ｆ）では、それぞれに縦軸は波長２８０ｎｍにおける吸光度を、横軸には保持時間（分）をとっている。しかし、図中の表示では、まとめて縦軸、横軸を記載した。 3A to 3F, the vertical axis represents absorbance at a wavelength of 280 nm, and the horizontal axis represents retention time (minutes). However, in the display in the figure, the vertical axis and the horizontal axis are collectively shown.

（MALDI-TOF MSによるトチノキ種皮ポリフェノールの分析）
Sephadex LH-20カラムで分離したF1〜F3の各フラクションを、MALDI-TOF-MSにて質量分析を行った。正イオンモードおよび負イオンモードによる分析で、ともに明確なピークが得られた。しかし、負イオンモードにおいて、より高分子側のピークまで検出された。図４に負イオンモードで測定した結果を示した。図４（Ａ）に示すF1では、m/z 865(3 mer)などの主に分子量ｚ1000以下のピークが確認された。図４（Ｂ）、（Ｃ）にそれぞれ示すF2およびF3では、それぞれ重合度が少なくとも19 mer、23 merのポリマーであることが確認される。 (Analysis of Tochinoki seed coat polyphenols by MALDI-TOF MS)
The F1 to F3 fractions separated on the Sephadex LH-20 column were subjected to mass spectrometry using MALDI-TOF-MS. In the positive ion mode and negative ion mode analyses, clear peaks were obtained. However, in the negative ion mode, even a peak on the polymer side was detected. FIG. 4 shows the result of measurement in the negative ion mode. In F1 shown in FIG. 4A, a peak mainly having a molecular weight of z1000 or less such as m / z 865 (3 mer) was confirmed. In F2 and F3 shown in FIGS. 4B and 4C, respectively, it is confirmed that the polymers have a polymerization degree of at least 19 mer and 23 mer, respectively.

図５（Ａ）、（Ｂ）に、F2を正イオンモードおよび負イオンモードで測定した結果を示した。主ピークは、(+)-カテキンまたは(-)-エピカテキン単位(C/EC unit)の質量に相当する288 u 、およびA-type interflavan結合を有する構造を示す286 uごとのピークが確認された。図５では、C/EC unitとA-type interflavan結合の比率は2.5 : 1〜5 : 1である。しかし、図４でF2、F3ともに検出された明確なピークであるm/z 4311は、C/EC unitが10, A-type interflavan結合が5に相当し、C/EC unitとA-typeの比率は2 : 1となっている。また、主ピークとともに16 u差のピークが確認された。正イオンモードで測定した場合、[M+Na]⁺ と[M+K]⁺の質量差であるとも考えられるが、今回、負イオンモードでも同様に16 u差のピークが確認されていることから、図５に示すように、水酸基数の異なる構成成分が含まれていることが推察された。 5A and 5B show the results of measuring F2 in the positive ion mode and the negative ion mode. As for the main peak, 288 u corresponding to the mass of (+)-catechin or (-)-epicatechin unit (C / EC unit) and a peak every 286 u indicating a structure having an A-type interflavan bond were confirmed. It was. In FIG. 5, the ratio of C / EC unit and A-type interflavan binding is 2.5: 1 to 5: 1. However, m / z 4311, which is a clear peak detected in both F2 and F3 in FIG. 4, corresponds to C / EC unit of 10 and A-type interflavan binding of 5, and C / EC unit and A-type The ratio is 2: 1. In addition, a 16 u difference peak was confirmed together with the main peak. When measured in the positive ion mode, it may be the mass difference between [M + Na] ⁺ and [M + K] ⁺ , but this time, a peak of 16 u difference has been confirmed in the negative ion mode as well. From FIG. 5, it was inferred that components having different numbers of hydroxyl groups were included.

（トチノキ種皮重合ポリフェノール(F2, F3)の構成単位のLC-ESI MSによる質量分析）
重合ポリフェノール画分の(F2, F3)を酸分解し、dodecylsulfide誘導体を作成した。これらの誘導体を逆相のカラムを接続し、検出波長を280 nmに設定した正イオンモードでのLC-ESI MSで分析した。その結果、F2とF3は同様な溶出パターンを示した。図６にF3の分析結果を示した。280 nmで検出したクロマトグラムで28.9分と33.8 分、そして38.7分に主なピークが確認された。 (Mass spectrometry of LC-ESI MS for structural units of Tochinoki seed coat polymerized polyphenols (F2, F3))
(F2, F3) of the polymerized polyphenol fraction was acid-decomposed to prepare a dodecylsulfide derivative. These derivatives were analyzed by LC-ESI MS in positive ion mode with a reversed phase column connected and a detection wavelength set to 280 nm. As a result, F2 and F3 showed similar elution patterns. FIG. 6 shows the analysis result of F3. Chromatograms detected at 280 nm showed major peaks at 28.9, 33.8, and 38.7 minutes.

それぞれの質量分析での分子イオンピークはm/z 1063.7 [M+H]⁺，m/z 776.9 [M+H]⁺，m/z 491.0 [M+H]⁺であり、それぞれA-type interflavan結合を2つ有する3 merのdodecylsulfide誘導体、A-type interflavan結合を1つ有する2 merのdodecylsulfide誘導体、および(+)-カテキンあるいは(-)-エピカテキンのdodecylsulfide誘導体であることが明らかとなった。末端ユニットを前述の逆相HPLCの条件で確認したところ、(+)-カテキンが8.3分、(-)-エピカテキンが12.0分に検出され、(+)-カテキンと(-)-エピカテキンの比は、F2が1 : 1.1，F3が1 : 0.6であった。 The molecular ion peaks in each mass spectrometry are m / z 1063.7 [M + H] ⁺ , m / z 776.9 [M + H] ⁺ , m / z 491.0 [M + H] ⁺ , respectively, and A-type interflavan 3 mer dodecylsulfide derivatives with two bonds, 2 mer dodecylsulfide derivatives with one A-type interflavan bond, and dodecylsulfide derivatives of (+)-catechin or (-)-epicatechin . When the terminal unit was confirmed under the above-mentioned reverse phase HPLC conditions, (+)-catechin was detected at 8.3 minutes and (-)-epicatechin was detected at 12.0 minutes, and (+)-catechin and (-)-epicatechin were detected. The ratio was 1: 1 for F2 and 1: 0.6 for F3.

（トチノキ種皮ポリフェノール成分の抗酸化作用）
トチノキ種皮ポリフェノール精製物とその関連物質の抗酸化性を、DPPHラジカル消去能の測定と、β-カロチン退色法にて調べた。図７にそれらの結果を50%効果濃度（EC₅₀）で示した。この結果、F2とF3に一般的に抗酸化物質として知られているアスコルビン酸、カテキン、エピカテキンと同等もしくはそれ以上の抗酸化性が認められた。 (Antioxidant effect of polyphenol component of cinnamon seed coat)
Antioxidative properties of purified polyphenol and its related substances were investigated by measuring DPPH radical scavenging ability and β-carotene bleaching method. FIG. 7 shows the results as a 50% effective concentration (EC ₅₀ ). As a result, F2 and F3 were found to have antioxidant properties equivalent to or higher than those of ascorbic acid, catechin, and epicatechin, which are generally known as antioxidants.

（トチノキ種皮ポリフェノールの膵リパーゼに対する阻害活性）
図８に示すように、精製したトチノキ種皮ポリフェノール(F1〜F3)のブタ膵リパーゼに対する阻害活性を測定した。ブタ膵リパーゼに対する阻害活性は、主にF2とF3に回収された。IC₅₀は、F2が0.82 μg/ml、F3が0.29 μg/mlであり、非常に強い阻害活性を示した。ポリフェノール関連物質である(-)-エピカテキン、西洋トチノキ種皮に含まれているプロシアニジンB2についてもブタ膵リパーゼに対する阻害活性を測定した。その結果、5μg/mlの濃度で(-)−エピカテキン、プロシアニジンB2は阻害活性を示さなかった。以前からリパーゼ阻害活性を示すことが報告されている(-)−エピガロカテキンガレートのIC₅₀は、0.5 μg/mlであった。 (Inhibitory activity of Tochigi seed coat polyphenols against pancreatic lipase)
As shown in FIG. 8, the inhibitory activity against purified porcine pancreatic polyphenols (F1-F3) on porcine pancreatic lipase was measured. The inhibitory activity against porcine pancreatic lipase was mainly recovered in F2 and F3. IC ₅₀ was 0.82 μg / ml for F2 and 0.29 μg / ml for F3, indicating a very strong inhibitory activity. The inhibitory activity against porcine pancreatic lipase was also measured for (-)-epicatechin, a polyphenol-related substance, and procyanidin B2 contained in the seed coat of Western horse chestnut. As a result, (−)-epicatechin and procyanidin B2 showed no inhibitory activity at a concentration of 5 μg / ml. The IC ₅₀ of (−)-epigallocatechin gallate, which has been reported to show lipase inhibitory activity, was 0.5 μg / ml.

（マウスによる油脂負荷試験の結果）
トチノキ種皮熱水抽出物をDIAION HP-20カラムとChromatorex ODS 1024Tカラムで精製した標品（ポリフェノール含有量82 %)の200 mg/kg 体重投与群においては投与後2.5時間後、500 mg/kg 体重投与群においては1.25、2.5時間後時において無投与群に対して有意に血漿トリグリセリド量の上昇を抑制した。かかる結果を、図９に示した。これは、トチノキ種皮由来のポリフェノールがリパーゼを阻害することによって、血中のトリグリセリドの上昇を抑制したためと考えられる。 (Results of oil load test using mice)
In the 200 mg / kg body weight group of a preparation (100% polyphenol content) purified from Drosophila seed coat hot water extract using DIAION HP-20 column and Chromatorex ODS 1024T column, 500 mg / kg body weight 2.5 hours after administration In the administration group, the increase in plasma triglyceride level was significantly suppressed at 1.25 and 2.5 hours after the administration group. The results are shown in FIG. This is thought to be because the polyphenol derived from the seed of seedlings of cypress inhibits the rise of triglycerides in the blood by inhibiting lipase.

（トチノキ種皮ポリフェノールのα-アミラーゼに対する阻害活性）
精製したトチノキ種皮ポリフェノール(F1〜F3)のブタ膵α−アミラーゼとヒト唾液α-アミラーゼに対する阻害活性を測定した。その結果を、図１０に示した。ブタ膵α−アミラーゼに対する阻害活性では、IC₅₀は、F2が143 μg/ml、F3が12 μg/mlであった。また、ヒト唾液α−アミラーゼに対する阻害活性では、IC₅₀は、F2が96μg/ml、F3が7μg/mlであった。 (Inhibitory activity of Tochigi seed coat polyphenols against α-amylase)
The inhibitory activity of purified Tochinoki seed coat polyphenols (F1-F3) on porcine pancreatic α-amylase and human salivary α-amylase was measured. The results are shown in FIG. In the inhibitory activity against porcine pancreatic α-amylase, the IC ₅₀ was 143 μg / ml for F2 and 12 μg / ml for F3. Further, in the inhibitory activity against human salivary α-amylase, the IC ₅₀ was 96 μg / ml for F2 and 7 μg / ml for F3.

（トチノキ種皮ポリフェノールのα-グルコシダーゼ＜マルターゼ、スクラーゼ＞阻害活性)
F1〜F3のラット小腸由来のα-グルコシダーゼ(マルターゼ、スクラーゼ）に対する阻害活性を測定したところ、いずれもマルターゼ、スクラーゼに対して図１０に示すように、阻害活性を示した。マルターゼに対する阻害活性はF3＞F2＞F1となり、重合度が高いポリフェノールほど高い阻害活性を示した。また、スクラーゼに対する阻害活性はF2＞F1＞F3であった。 (Alpha-glucosidase <maltase, sucrase> inhibitory activity of tochinoki seed coat polyphenol)
The inhibitory activity of F1 to F3 on α-glucosidase (maltase, sucrase) derived from rat small intestine was measured, and both showed inhibitory activity against maltase and sucrase as shown in FIG. The inhibitory activity against maltase was F3>F2> F1, and the higher the degree of polymerization, the higher the inhibitory activity. The inhibitory activity against sucrase was F2>F1> F3.

（各種ポリフェノール類との機能の比較）
トチノキ種皮熱水抽出物とすでに特定保健用食品として利用されているグァバ葉茶、および烏龍茶との機能の比較を行った。各サンプルの重量はFolin-Ciocalteu法により総ポリフェノール量を求めた。なお、アスコルビン酸の影響を考慮し、アスコルビン酸も定量した上で重量を設定した。各サンプルについてブタ膵リパーゼ、ラット小腸由来のスクラーゼとマルターゼ、ブタ膵アミラーゼ、ヒト唾液アミラーゼに対する阻害活性を調べた。かかる結果と、DPPHラジカル消去能を調べた結果とを、図１１に示した。この結果、リパーゼおよびブタ膵アミラーゼに対する阻害活性において、グァバ葉茶および烏龍茶ポリフェノールに比べて高い阻害活性を示した。 (Comparison of functions with various polyphenols)
A comparison was made of the functions of the hot water extract of Tochinoki seed coat and guava leaf tea and oolong tea that have already been used as foods for specified health use. As for the weight of each sample, the total amount of polyphenols was determined by the Folin-Ciocalteu method. In consideration of the influence of ascorbic acid, the weight was set after quantifying ascorbic acid. Each sample was examined for inhibitory activity against porcine pancreatic lipase, rat small intestine-derived sucrase and maltase, porcine pancreatic amylase, and human salivary amylase. The results and the results of examining the DPPH radical scavenging ability are shown in FIG. As a result, the inhibitory activity against lipase and porcine pancreatic amylase was higher than that of guava leaf tea and oolong tea polyphenol.

（アルカリ溶液浸漬処理によるトチノキ種皮ポリフェノールの抽出法）
上記説明のトチノキ種皮由来のポリフェノールは、熱水抽出で行った。しかし、本発明者は、種々検討の結果、アルカリ溶液浸漬処理でも行えることを見出した。すなわち、トチノキ種皮ポリフェノールを効率よく抽出するための方法を検討した結果、アルカリ性の溶液に浸漬してから熱水抽出することで収量が上がることが明らかとなった。また、トチノキ種皮をアルカリ性の水溶液で加熱抽出しても効果的であった。 (Extraction method of Tochinoki seed coat polyphenol by alkaline solution immersion treatment)
The polyphenol derived from the cypress seed coat described above was extracted by hot water extraction. However, as a result of various studies, the present inventor has found that the alkaline solution immersion treatment can be performed. That is, as a result of investigating a method for efficiently extracting cypress seed coat polyphenol, it was found that the yield was increased by hot water extraction after immersion in an alkaline solution. It was also effective to heat and extract the torch seed coat with an alkaline aqueous solution.

トチノキ種皮を水洗い後、水を切った状態のもの10 g(水分61%）を食品添加物である「かんすい」0%(コントロール）、0.001%、0.05%、1%の水溶液100 mlに一晩浸漬した。その後、150 mlの蒸留水で30分間加熱し、ポリフェノールの抽出を行った。この操作を再度行い、得られた抽出液をエバポレーターにて乾固した。この乾固物について、Folin-Ciocalteu法にて総ポリフェノール量を測定した。なお、0.001%かんすい水溶液のpHは8.89、0.05%は10.79、1%かんすい水溶液は11.08であった。 After washing the torch seeds with water, 10 g (61% water content) of the drained water is added overnight to 100 ml of 0% (control), 0.001%, 0.05%, 1% aqueous solution of food additive Soaked. Then, the polyphenol was extracted by heating with 150 ml of distilled water for 30 minutes. This operation was performed again, and the resulting extract was dried with an evaporator. For this dried product, the total polyphenol content was measured by the Folin-Ciocalteu method. The pH of the 0.001% aqueous solution was 8.89, 0.05% was 10.79, and 1% aqueous solution was 11.08.

実験の結果、皮重量1 gあたりの総ポリフェノール回収量は、コントロールが31.3 mg、 0.001%かんすい水溶液が34.22 mg、1%かんすい水溶液が42.08 mgであった。浸漬液のpHがアルカリ性になるほど、回収できる総ポリフェノール量は高くなる結果となった。なお、蒸留水で加熱後の水溶液はどれも中性を示した。 As a result of the experiment, the total amount of polyphenol recovered per 1 g of skin weight was 31.3 mg for the control, 34.22 mg for the 0.001% aqueous rinsing solution, and 42.08 mg for the 1% rinsing aqueous solution. As the pH of the immersion liquid became alkaline, the total amount of polyphenols that could be recovered increased. In addition, all the aqueous solutions after heating with distilled water showed neutrality.

（アルカリ溶液によるトチノキ種皮ポリフェノールの抽出法）
トチノキ種皮を水洗い後、水を切った状態のもの60 g(水分57.12%）を食品添加物である「かんすい」0%(コントロール）,0.001%, 0.05%, 1%の水溶液1000 ml中で1時間煮出した。その後濾過し、Folin-Ciocalteu法にて各かんすい水溶液のポリフェノール量を測定した。なお、0.001%かんすい水溶液のpHは8.89, 0.05%は10.79，1%は11.08であった。 (Extraction method for polyphenols of cypress seed coat with alkaline solution)
60 g of water (57.12% water) after washing the water seed seed coat with water, 1 in 1000 ml of 0% (control), 0.001%, 0.05%, 1% aqueous solution of food additive Boiled for hours. Thereafter, the mixture was filtered, and the amount of polyphenol in each aqueous solution was measured by the Folin-Ciocalteu method. The pH of the 0.001% aqueous solution was 8.89, 0.05% was 10.79, and 1% was 11.08.

実験の結果、皮重量1 gあたりの総ポリフェノール回収量は、コントロールが16.75 mg、0.001%かんすい水溶液が17.69 mg、 0.05%が23.37 mg、 1%が62.24 mgであった。煮出し時水溶液のpHがアルカリ性になるほど、抽出されるポリフェノール量は高くなる結果となった。なお、煮出し後の各かんすい水溶液のpHは、0%(コントロール）で4.64、0.001%で4.81, 0.05%で7.42, 1%で9.94であった。トチノキ種皮をアルカリ性の水溶液で加熱抽出することはポリフェノールの回収手段として効果的であることが分かった。 As a result of the experiment, the total amount of polyphenol recovered per 1 g of skin weight was 16.75 mg for the control, 17.69 mg for the 0.001% aqueous rinsing solution, 23.37 mg for 0.05%, and 62.24 mg for 1%. As the pH of the aqueous solution at the time of boiling became alkaline, the amount of polyphenol extracted was higher. The pH of each aqueous solution after boiling was 4.64 at 0% (control), 4.81 at 0.001%, 7.42 at 0.05%, and 9.94 at 1%. It has been found that heat extraction of a cinnamon seed coat with an alkaline aqueous solution is effective as a polyphenol recovery means.

上記評価は、まとめれば、次のようになる。すなわち、(1)トチノキ種皮熱水抽出物の総ポリフェノール量は種皮10 gあたり580 mg/gと非常に高いことが確認された。(2)トチノキ種皮ポリフェノールをDIAION HP-20、Chromatrex ODS 1024 T、Sephadex LH-20カラムで分離したF1、 F2、 F3をHPLCおよびMALDI-TOF MSで分析した結果、主成分は重合ポリフェノールであり少なくともF2では19 mer、F3では23 merの重合であると推察された。また、HPLCおよびLC-ESI MSによる分析でトチノキ種皮ポリフェノールはガロイル基を持たず、A-type interflavan結合を有する構造であることが確認された。 The above evaluation can be summarized as follows. That is, it was confirmed that (1) the total polyphenol content in the hot water extract of Tochinoki seed coat was very high at 580 mg / g per 10 g of seed coat. (2) As a result of analyzing F1, F2, and F3 obtained by separating the cypress seed coat polyphenol with DIAION HP-20, Chromatrex ODS 1024 T, Sephadex LH-20 column by HPLC and MALDI-TOF MS, the main component is at least a polymerized polyphenol. It was inferred that the polymerization was 19 mer for F2 and 23 mer for F3. In addition, analysis by HPLC and LC-ESI MS confirmed that the tomato seed coat polyphenol had no galloyl group and a structure having an A-type interflavan bond.

因みに、flavan-3-olの基本骨格は、図１２に示すような構造を有している。図６に示すように、かかる基本骨格の１位のＯと、４位のＣとが、interflavan結合に関与しているものと推察された。 Incidentally, the basic skeleton of flavan-3-ol has a structure as shown in FIG. As shown in FIG. 6, it was inferred that O at the 1st position and C at the 4th position of the basic skeleton were involved in the interflavan bond.

(3)トチノキ種皮ポリフェノール(F1〜F3)の抗酸化能をDPPHラジカル消去能、β-カロチン退色法にて測定したところ、F2、F3にアスコルビン酸や(+)-カテキン、(-)-エピカテキンと同等もしくはそれら以上の抗酸化能があることが確認された。(4)ヒト唾液およびブタ膵臓α−アミラーゼに対するトチノキ種皮ポリフェノールの阻害活性を測定したところ、Sephadex LH-20メタノール溶出区（F2)と70%アセトン溶出区(F3)で高い阻害活性を示した。 (3) Antioxidant ability of Tochinoki seed coat polyphenols (F1 to F3) was measured by DPPH radical scavenging ability and β-carotene bleaching method, and ascorbic acid, (+)-catechin, (-)-epi was added to F2 and F3. It was confirmed that it has an antioxidant capacity equivalent to or higher than that of catechin. (4) When the inhibitory activity of Tochinoki seed coat polyphenol against human saliva and porcine pancreatic α-amylase was measured, it showed high inhibitory activity in Sephadex LH-20 methanol elution zone (F2) and 70% acetone elution zone (F3).

(5)α−グルコシダーゼに対するトチノキ種皮ポリフェノールの阻害活性を測定したところ、スクラーゼ活性、マルターゼ活性ともに阻害した。(6)トチノキ種皮ポリフェノールのブタ膵リパーゼに対する阻害活性を測定した結果、IC₅₀はSephadex LH-20カラムで分離したF2で0.82μg/ml、F3で0.29μg/mlと高い阻害活性を示した。 (5) As a result of measuring the inhibitory activity of Tochinoki seed coat polyphenol against α-glucosidase, both the sucrase activity and the maltase activity were inhibited. (6) As a result of measuring the inhibitory activity of Tochinoki seed coat polyphenol on porcine pancreatic lipase, IC ₅₀ showed high inhibitory activity of 0.82 μg / ml for F2 and 0.29 μg / ml for F3 separated by Sephadex LH-20 column.

以上の結果より、食品残渣として廃棄対象となっていたトチノキ種皮は、意外にも、有用なポリフェノールを多く含んでいることが分かった。かかるトチノキ種皮を、食品、あるいは健康食品に利用することで、生活習慣病予防に役立つものと思われる。さらに栃の実種皮は食品加工廃棄物であることから、資源の有効利用という点でも意義深い。 From the above results, it was found that the cypress seed coat, which was to be discarded as a food residue, unexpectedly contained a lot of useful polyphenols. It seems that the use of such seeds is useful for preventing lifestyle-related diseases. Furthermore, since the seed seed coat of Tochi is a food processing waste, it is also significant in terms of effective use of resources.

かかるトチノキ種皮由来のポリフェノールは、例えば、食品に添加する場合には、前述の如く、水、あるいはアルカリ性の水溶液で抽出して得たエキスをそのまま使用してもよい。また、水、アルカリ性の水溶液、アルコール、アセトンなどの溶媒で抽出し、デキストリン等と混合後スプレードライを行い粉末状態とした後、食品に加えてもよい。また、菓子、パン、茶、ジュースなどの飲料、清酒、ビール、豆腐、麺類、調味料等の食品には、1 mg以上、500 mg以下添加すればよい。1 mg未満では、添加の効果は現れない場合もある。また、食品100 gあたり1 gを超えては、食品自体が渋味が強くなり食味が悪くなる不都合が考えられる。適正な添加量は、1 mg以上、500 mg以下である。すなわち、食品として、あるいは食品添加物としての使用が考えられる。 For example, when the polyphenols derived from the seed of seedling are added to food, an extract obtained by extraction with water or an alkaline aqueous solution as described above may be used as it is. Alternatively, it may be extracted with a solvent such as water, an alkaline aqueous solution, alcohol, acetone, etc., mixed with dextrin or the like and spray-dried to form a powder, and then added to food. In addition, foods such as confectionery, bread, tea, juice, and other foods such as sake, beer, tofu, noodles, and seasonings may be added in an amount of 1 mg to 500 mg. If it is less than 1 mg, the effect of addition may not appear. Further, if the amount exceeds 1 g per 100 g of food, the food itself may have a strong astringency and a bad taste. The appropriate addition amount is 1 mg or more and 500 mg or less. That is, the use as a foodstuff or a food additive is considered.

食品への利用の実施例として、飲料への利用事例をあげる。トチノキ種皮ポリフェノールを総ポリフェノール量（Folin-Ciocalteu法で求めた重量）として76 mg、焙煎した小豆4gを混合し、500 mlのお湯で5分間煮出して飲料を調製した。この飲料とすでに糖の吸収を抑えるという用途で特定保健用食品として利用されているグァバ茶とを、総ポリフェノール濃度70μMでのα−アミラーゼ阻害活性を比較した。その結果、当飲料の方がグァバ葉茶にくらべ4倍の阻害活性を示した。飲料としては、黒豆茶、ハーブティー、紅茶、黒豆茶、プーアル茶、ヤーコン茶、緑茶などにもちいても良好な味であった。 Examples of use for foods are given as examples of use for foods. Tochinoki seed coat polyphenols were mixed with 76 mg of the total polyphenol content (weight determined by the Folin-Ciocalteu method) and 4 g of roasted red beans, and boiled in 500 ml of hot water for 5 minutes to prepare a beverage. This beverage was compared with α-amylase inhibitory activity at a total polyphenol concentration of 70 μM between this beverage and guava tea that has already been used as a food for specified health use in order to suppress sugar absorption. As a result, this beverage showed 4 times the inhibitory activity compared to guava leaf tea. As beverages, black bean tea, herb tea, black tea, black bean tea, puer tea, yacon tea, green tea, etc., had a good taste.

また、健康食品への添加も当然に考えられる。例えば、ドリンク剤や錠剤、カプセル等サプリメントなどの健康食品への添加が考えられる。かかる健康食品の添加に際しては、1日あたり1 mg以上、500 mg以下、添加すればよい。 Naturally, addition to health food is also conceivable. For example, addition to health foods such as supplements such as drinks, tablets and capsules can be considered. When adding such health food, 1 mg or more and 500 mg or less may be added per day.

本発明に係るポリフェノールは、上記の如く、食品、健康食品等に添加した場合を示したが、医薬品としての使用も当然に考えられる。前述の非特許文献８に示すように、リパーゼ阻害および糖質分解酵素阻害作用を有する物質が肥満や糖尿病への治療薬として利用されている。そこで、リパーゼ阻害および糖質分解酵素阻害作用を示すトチノキ種皮ポリフェノールも、錠剤およびドリンク剤の形態で医薬品として提供し利用することもできる。 As described above, the polyphenol according to the present invention has been shown to be added to foods, health foods and the like. As shown in Non-Patent Document 8 described above, substances having lipase inhibitory activity and carbohydrase inhibitory activity are used as therapeutic agents for obesity and diabetes. Therefore, tochinoki seed coat polyphenols exhibiting lipase inhibition and saccharide-degrading enzyme inhibition effects can also be provided and used as pharmaceuticals in the form of tablets and drinks.

以上、本発明者によってなされた発明を実施の形態に基づき具体的に説明したが、本発明は前記実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で種々変更可能であることはいうまでもない。 As mentioned above, the invention made by the present inventor has been specifically described based on the embodiment. However, the present invention is not limited to the embodiment, and various modifications can be made without departing from the scope of the invention. Needless to say.

上記実施の形態では、トチノキ種皮から初めて上記構造的特徴を有するポリフェノールを得た。しかし、同じ構造的特徴を有するポリフェノールが、トチノキの種皮以外の部分からも抽出されるかも知れない。また、他の植物から、本発明と同じポリフェノールが抽出されるかも知れない。かかる場合には、抽出由来をトチノキ種皮とすることがなければ、本明細書に述べた構造的特徴を有するポリフェノールということができる。また、かかる構造的特徴を有するポリフェノールは、合成しても構わない。その場合には、例えば合成ポリフェノールと把握して、本明細書で述べたトチノキ種皮由来のポリフェノールを天然ポリフェノールと把握しても構わない。 In the said embodiment, the polyphenol which has the said structural characteristic was obtained for the first time from the cypress seed coat. However, polyphenols having the same structural characteristics may be extracted from parts other than the seed coats of cypress. Moreover, the same polyphenol as this invention may be extracted from another plant. In such a case, it can be said that the polyphenol having the structural characteristics described in the present specification is obtained unless the extraction is derived from the seed of seedling. Polyphenols having such structural features may be synthesized. In that case, for example, it may be grasped as a synthetic polyphenol, and the polyphenol derived from the cypress seed coat described in this specification may be grasped as a natural polyphenol.

さらには、本明細書では、例えばトチノキ(Aesculus turbinata Blume)の種皮を用いた場合を示したが、かかるトチノキの種皮には、当然にセイヨウトチノキ(Aesculus hippocustanum L.)種皮も含むものである。 Furthermore, in the present specification, for example, a case where a seed coat of a horse chestnut (Aesculus turbinata Blume) is used is shown, but naturally a seed coat of a horse chestnut (Aesculus hippocustanum L.) is also included in the seed coat of such a horse chestnut.

本発明は、ポリフェノールの食品、健康食品、あるいは医薬の分野で有効に利用することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be effectively used in the fields of polyphenol foods, health foods, and medicines.

本発明に係るトチノキ種皮由来の総ポリフェノール量を示す図表である。It is a chart which shows the total amount of polyphenol derived from the cypress seed coat which concerns on this invention. 本発明に係るトチノキ種皮由来のポリフェノールのカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す説明図である。It is explanatory drawing which shows the elution pattern of the column chromatography of the polyphenol derived from the cypress seed coat which concerns on this invention. （Ａ）〜（Ｆ）は、本発明に係るトチノキ種皮由来のポリフェノールのＨＰＬＣ分析の様子を示す説明図である。(A)-(F) is explanatory drawing which shows the mode of the HPLC analysis of the polyphenol derived from the cypress seed coat which concerns on this invention. （Ａ）〜（Ｃ）は、本発明に係るトチノキ種皮由来のポリフェノールのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによる分析結果を示す説明図である。(A)-(C) are explanatory drawings which show the analysis result by the MALDI-TOF MS of the polyphenol derived from the cypress seed coat which concerns on this invention. （Ａ）、（Ｂ）は、本発明に係るトチノキ種皮由来のポリフェノールのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによる分析結果を示す説明図である。(A), (B) is explanatory drawing which shows the analysis result by the MALDI-TOF MS of the polyphenol derived from the cypress seed coat which concerns on this invention. （Ａ）、（Ｂ）は、本発明に係るトチノキ種皮由来のポリフェノールのクロマトグラム、マスクロマトグラムの様子を示す説明図である。(A), (B) is explanatory drawing which shows the mode of the chromatogram and mass chromatogram of the polyphenol derived from the cypress seed coat which concerns on this invention. 本発明に係るトチノキ種皮由来のポリフェノールの抗酸化性を示す図表である。It is a chart which shows the antioxidant property of the polyphenol derived from the cypress seed coat which concerns on this invention. 本発明に係るトチノキ種皮由来のポリフェノールの酵素活性阻害性を示す図表である。It is a chart which shows the enzyme activity inhibitory property of the polyphenol derived from the cypress seed coat which concerns on this invention. 本発明に係るトチノキ種皮由来のポリフェノールのマウスの油脂負荷試験の結果を示す説明図である。It is explanatory drawing which shows the result of the oil-fat load test of the mouse | mouth of the polyphenol derived from the cypress seed coat which concerns on this invention. 本発明に係るトチノキ種皮由来のポリフェノールの糖質酵素の活性阻害性を示す図表である。It is a graph which shows the activity inhibitory activity of the carbohydrate enzyme of the polyphenol derived from the cypress seed coat which concerns on this invention. 本発明に係るトチノキ種皮由来のポリフェノールと、グァバ茶、ウーロン茶由来のポリフェノールの機能性を比較した図表である。It is the table | surface which compared the functionality of the polyphenol derived from the cypress seed coat which concerns on this invention, and the polyphenol derived from guava tea and oolong tea. 本発明に係るトチノキ種皮由来のポリフェノールを構成するflavan-3-olの基本骨格を示す説明図である。It is explanatory drawing which shows the basic skeleton of flavan-3-ol which comprises the polyphenol derived from the cypress seed coat which concerns on this invention. flavan-3-ol類を示す構造式である。This is a structural formula showing flavan-3-ols.

Claims

A polymer having a basic skeleton extracted from tomato seed coat and represented by (Chemical Formula 1), having a position where O at the 1st position and C at the 4th position are interflavan-bonded and having a degree of polymerization of 3 or more A lipase inhibitor.

The lipase inhibitor according to claim 1, wherein the degree of polymerization is 10 or more.

A polymer having a basic skeleton extracted from tomato seed coat and represented by (Chemical Formula 1), having a position where O at the 1st position and C at the 4th position are interflavan-bonded and having a degree of polymerization of 3 or more An antioxidant.

A polymer having a basic skeleton extracted from tomato seed coat and represented by (Chemical Formula 1), having a position where O at the 1st position and C at the 4th position are interflavan-bonded and having a degree of polymerization of 3 or more A glucolytic enzyme inhibitor.

By heating and extracting the torch seed coat with water or an alkaline aqueous solution, a polymer having the basic skeleton shown in (Chemical Formula 1), having a portion having an interflavan bond, and having a polymerization degree of 3 or more is extracted. The manufacturing method of the chemical | medical agent which has a process.

6. The method for producing a drug according to claim 5, comprising a step of separating a polyphenol having a polymerization degree of 10 or more from the heat-extracted solution.

The method for producing a drug according to claim 5, wherein the drug is a lipase inhibitor.