JP5165567B2 - 組織細胞内への核酸の電気的導入 - Google Patents
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Description
前記組織を第1に、200〜2000ボルト/cmの高電圧場強度からなる少なくとも1のパルスで、第2に、50〜200ボルト/cmの低電圧場強度及び300〜2000m秒の持続時間からなる単一パルスで電気的に刺激する、使用である。
筋肉を、免疫刺激効果又はワクチン効果等、直接又は間接的な治療効果を有する分子の分泌器官とすること、
組織細胞(特に筋細胞)の機能不全を補正することである。
薬剤が腫瘍血管形成を有効に低減、抑制又は逆行させ、
薬剤が腫瘍の成長を低減又は抑制し、
薬剤が転移を阻害し、
薬剤が抗癌性を示す
ように選択された、1種又は数種(少なくとも2種)の活性分子を発現させる。
RDDタンパク質又はその有効断片(有効(efficient)とは、断片によりコード化されたタンパク質が、RDDポリペプチド全体と同一又は類似の治療活性を誘発することを意味する)をコード化する核酸の、
インビボで組織細胞内に導入され、組織細胞内でRDDポリペプチド又はその治療活性断片を生成することを目的とした薬剤の調製のための使用であって、
前記薬剤を組織内に注入し、
前記組織を、第1に200〜2000ボルト/cmの高電圧(HV)場強度からなる少なくとも1のパルスで、第2に50〜200ボルト/cmの低電圧(LV)場強度及び300〜2000m秒の持続時間からなる単一パルスで電気的に刺激する、使用である。
a)前記核酸を前記組織内に注入し、
b)前記組織を、第1に、200〜2000ボルト/cmの高電圧(HV)場強度からなる少なくとも1のパルスで、第2に、50〜200ボルト/cmの低電圧(LV)場強度及び300〜2000m秒の持続時間からなる単一パルスで電気的に刺激する、使用として定義することもできる。
宿主内の免疫応答を誘発するであろう免疫原をコード化する核酸を、宿主の筋細胞(特に骨格筋細胞)内にトランスフェクトすることによる、宿主への免疫性付与、又は、
筋細胞(特に骨格筋細胞)内又は腫瘍組織細胞内に核酸をトランスフェクトすることによる、宿主への治療活性分子の全身送達が挙げられる。
免疫原コード化核酸を、生きている動物の組織、特に筋肉内に注入する工程と、
前記組織を第1に、200〜2000ボルト/cmの高電圧(HV)場強度からなる少なくとも1のパルスで、第2に、50〜140ボルト/cmの低電圧(LV)場強度及び300〜2000m秒の持続時間からなる単一パルスで電気的に刺激し、前記の電気的刺激によって、前記核酸を前記組織の細胞内に導入し、宿主の免疫応答を誘発し得る免疫原を前記核酸に前記宿主内で発現させる工程と、
抗体を回収する工程とを含んでなる、方法である。
-材料及び方法
プラスミドDNA
蛍ルシフェラーゼ(Soubrier他、1999)をコード化する変性細胞質luc+遺伝子のコード配列の上流に挿入されたサイトメガロウィルス・プロモーター(pcDNA3のヌクレオチド229〜890、Invitrogen)を含有するプラスミドpXL 3031(pCMV-Luc+)を使用した。常法によりプラスミドDNAを調製した(Ausubel他、1994)。或いは、EndoFree Plasmid Giga Kit(QIAGEN、Courtabeuf、フランス)を用いてPBS(リン酸緩衝生理食塩水、Gibco、Cergy-Pontoise、フランス)中で調製したpEGFP-N1プラスミド(BD Biosciences Clontech、Saint Quentin Yvelines、フランス)も使用した。このプラスミドは、CMVプロモーターの制御下にある緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を特徴とする。
何れの実験処置においても、7〜9週齢の雌のC57Bl/6マウスに、麻酔薬としてケタミン(100mg/kg;Ketalar、Panpharma、フランス)及びキシラジン(40mg/kg;Rompun、Bayer、フランス)を腹腔内投与し、麻酔を施した。実験前に電気かみそりで脚を剃毛した。ルシフェラーゼ測定用の実験群には、各群に少なくとも10個の筋肉(マウス5匹)を含めた。GFP定性データについては、各実験条件につき4つの筋肉を使用した。
ルシフェラーゼ実験では、30μlの0.9%NaCl中で調製したプラスミドDNA3μgを注射した。殆どの実験では(図1〜5)、DNA溶液に120IU/mlのヘパリン(Laboratoires Leo、Saint Quentin en Yvelines、フランス)を追加した。ヘパリン(MW10〜12kDa)1mgは、ほぼ137IUに相当する。26ゲージ針を有するハミルトン・シリンジを用いてDNAを頭側脛骨筋内に注射した。GFP実験については、20μlのPBS中4μgを、何れもヘパリン不在下で、各処理脛骨筋内に注射した。
HV用方形波電気パルス発生器PS-15(Jouan、St Herblain、フランス)と、LV用マイクロプロセッサ駆動式スイッチ/関数発生器(リュブリャナ大学電気工学科(スロヴェニア)で作製)とからなる装置によって、HVパルスとLVパルスとの組み合わせを発生させた。本装置によって、HV+LV組み合わせパルスにおける各電気パラメータを、正確に制御することが可能であった(Satkauskas他、2002)。
DNA電気的導入から2日後にマウスを屠殺した。筋肉(正味重量ほぼ60mg)を取り出して1ml細胞培養溶解試薬溶液(10mlの細胞培養溶解試薬(Promega、Charbonnieres、フランス))中でホモジナイズし、40mlの蒸留水で希釈し、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Boehringer Mannheim、マンハイム、ドイツから入手)1錠を追加した。4℃、12,000rpmで10分間の遠心分離後、10μlの上澄みを用いてルシフェラーゼ活性を評価した。この評価は、50μlのルシフェラーゼ・アッセイ基質(Promega)を筋肉溶解物に加えた後から、Walac Victor2 照度計を使用して、1秒間に生成された光を積算することによって行なった。結果は照度計から相対光単位(RLU)で収集した。精製蛍ルシフェラーゼ・タンパク質を用いた較正により、106のRLUが、発現されたルシフェラーゼほぼ70ngに相当することが示された。最終結果は、筋肉1つ当たりのルシフェラーゼのpgとして表わした。
pEGFP-N1プラスミド注射から3日後にマウスを屠殺し、Leica GFP Plusフィルターセット(品番10446143:励起フィルター480/40nm、二色性ミラー505nm LP、バリヤフィルター510nm LP)(Leica、Rueil-Malmaison、フランス)を備えたLeica Mz12蛍光立体顕微鏡を用いて、トランスフェクトされた組織を観察した。デジタル冷却カラーカメラ(AxioCam HRc、Zeiss、Le Pecq、フランス)を用いて写真を撮影し、カメラによって検出された光をソフトウェア(AxioVision Light Edition Release 4.1.1.0)で積算することにより、GFP発現の定量化を行った。
数群の統計的な比較には、不対値用の両側スチューデントt−検定を用いた。図面ではルシフェラーゼ発現データを平均±SDで示した。
ルシフェラーゼ実験の場合は測定感度が高いため、少量のヘパリン(120IU/ml)を追加したプラスミドDNA溶液を注射した。この投与量のヘパリンは、筋肉による自然のDNA取り込みを大幅に減少させるが、筋線維内へのDNA電気的導入の効果を著しく損なうことはない(Satkaukas他、2001)。従って、ヘパリン存在下でも、DNA電気的導入効率に対するHVパルス及びLVパルスの各々の関与を、より正確に分析することができる。加えて、HVパルスとLVパルスとの間のラグを、1秒に固定した。
電気的透過化用(HV)パルスの役割の分析には、過去のデータ(Satkaukas他、2002)で最良の遺伝子発現レベルを与えたLVパルスを使用した。この教示に従い、本実験ではLV成分パラメータを80V/cm、持続時間100m秒の4つのLVに固定し、パルス間の遅延は1秒とした。
図1に示す結果が得られたことから、LV成分の役割を分析するために、800V/cm及び100μ秒からなる単一のHVを使用した。まずLV数の影響について実験を行なった。LVパルス強度は80V/cmに、持続時間は100m秒に、LV間の遅延は1秒に固定した。LV数を1から4に増やすと、ルシフェラーゼ発現は著しく増大した(図2)。過去のデータ(Satkaukas他、2002)と一致して、LV数4の場合には、LV数1の場合と比較して、10倍のルシフェラーゼ発現が見られた。LVパルス数を更に増加させても(6又は8)、更なる有意な増大は観察されなかった。
100μ秒、800V/cmの単一のHVと、これに続く1秒間の遅延後の、60、80、又は100V/cmからなる400m秒の単一のLVパルスとを使用して、GFP遺伝子の電気的導入を行なった後、筋肉内部の蛍光の分布及び強度を、蛍光立体顕微鏡を使用して定性的及び半定量的に測定した。写真の撮影は、一定の露光時間(100m秒、パネルA、B及びC)で行なうか、或いは可変露光時間で、即ち、各写真の光量を等量とするカメラの自動露光時間調節を有効にして行なった(パネルD、E及びF)。得られた写真は、実験条件毎に4つの筋肉で観察された画像を表わすものである。二連で写真を作製したところ、結果の再現性とともに、LVパルスの電場強度の増大に伴う蛍光の大幅な増大が示された(パネルA、B及びC)。これらの画像における平均緑色濃度の定量分析は、定性データを支持している。すなわち、強度レベル256の相対強度において、60V/cmではレベル41(左側の筋肉)及び33(右側の筋肉)に達した(パネルA)のに対し、80V/cmではレベル111及び89に(パネルB)、そして100V/cmではレベル138及び127に達した(パネルC)。また、これらの写真は、LV電場強度によらず蛍光「光学面」が同一であることも示している(パネルD、E及びF)。蛍光の増大は、各線維の蛍光の増大によるものであるが、電気的導入の作用を受ける組織の体積は同じであった。線維内に電気的導入されたプラスミド数は、個々の線維について観察された蛍光増大を説明している。
本実験に使用された発現ベクターを、Trochon-Joseph V.他、2004に従って調製した。
電気的導入は下記のように行った。
図6及び図7は、各々異なるHVパルス(200〜1800V/cm、100μ秒)と、それに続くHVから1秒後(図6)又はHV直後(図7)のLVパルス1つ(80V/cm;400m秒)との組み合わせを用いて、マウス脛骨筋内にDNA電気的導入を行なった後のルシフェラーゼ発現を示す。これらの実験は、ルシフェラーゼ・プロトコルについては実施例1と同様に行ない、各群6匹のマウスを用い、パルス刺激の送達にはCLINIPORATOR(登録商標)を用い、ルシフェラーゼ活性は筋肉1mg当たりのpgで表わした。
腫瘍実験:従来の手順を用い、100U/mlのペニシリン、100mg/mlのストレプトマイシン、及び8%のウシ胎仔血清を追加したMEM培地を使用して、B16 F10メラノーマ細胞をインビトロで培養した。若い(6〜8週齢)C57Bl/6雌マウスの左脇腹に、1×106個の同系B16細胞(MEM培地100μl中)を皮下接種した。腫瘍が平均直径6〜7mmに達したら(接種から7〜8日後)、腫瘍を処理した。
−材料及び方法
プラスミドDNA
マウス・ウロキナーゼ分泌信号の制御下にあるヒトRDD遺伝子を、pVAX-RDDプラスミドを発生させるために、サイトメガロウィルス(CMV)プロモーターと、ウシ成長ホルモンポリアデニル化信号を含有するpVAX1プラスミド(Invitrogen、V260-20)内に挿入した。空のベクターpVAX1を陰性対照として使用した。プラスミドは、EndoFree NucleoSpin Plasmid Kit(Macherey Nagel)を使用して、滅菌0.9%NaCl中で調製した。
雌Wistarラットに、麻酔薬ケタミン(40mg/kg)及びキシラジン(5.5mg/kg)を腹腔内投与して麻酔を施した。雌New Zealandウサギを、まずカルミヴェット(1ml/lg)の皮下注射で処理し、次いでペントバルビタールを静脈内注射して麻酔を施した。実験前に電気かみそりで脚を剃毛した。
穿刺性針電極を、ウサギについては薄筋内に、ラットについては臀筋内に導入した。100μlの0.9%NaCl中で調製した100μgの各プラスミドDNAを、電極線間に3回で注入した。筋内DNA注射の直後に、CLINIPORATOR(登録商標)による筋肉電気的導入を前述のように、すなわち700V/cm、100μ秒(1Hz)の電気パルス1つ、1000m秒の休止、そして電極を動かさずに100V/cm、400m秒の電気パルス1つを加えて実施した。この処置を各動物の両脚に対して、ウサギについては1筋肉当たり2回(すなわち動物1匹当たり4回の注射)、ラットについては1筋肉当たり1回(すなわち動物1匹当たり注射2回)実施した。0週目、6週目、及び12週目に、動物に免疫性付与を行なった。
初回の免疫性付与前に、その後は4週目、9週目(ウサギの屠殺時)、及び16週目(ラットの屠殺時)に、血液を採取した。遠心分離で血清を回収した。下記の手順でELISAにより抗RDD抗体(IgG)を測定した。96ウェル・マイクロタイタープレート(Nunc Maxisorb、Roskilde、デンマーク)の各ウェルに、E.coliによって産生された組み換えRDD100ngを塗布した。4℃で一晩インキュベーションした後、ウェルをTBST(Tris緩衝生理食塩水TBS、0.02%Tween 20)で6回洗浄し、次いで震盪条件下で3時間、室温でTBST−5%ミルクと一緒にインキュベートした。上述のように洗浄したら、TBST−5%ミルク中の血清の連続希釈液100μl(1:125から1:8000)と一緒にウェルをインキュベートした。ペプチド免疫性付与によって生成された抗RDDウサギ・ポリクローナル血清(Neosystem)を陽性対照として使用した。震盪させながら2時間インキュベートした後、ウェルを洗浄し、そしてTBST−5%ミルク中1:5000に希釈した100μlのペルオキシダーゼ抱合抗体と一緒に1時間インキュベートし、結合されたウサギ抗体をペルオキシダーゼ抱合抗ウサギIgG(照会番号NA934、Amersham)で検出し、結合されたラット抗体を、ヤギF(ab’)2断片ラットIgG(H+L)ペルオキシダーゼ(照会番号IM0825、Beckman Immunotech)で検出した。上述のように洗浄した後、ウェルを200μlの基質0−フェニレンジアミン二塩酸塩(Sigma Fast OPDペルオキシダーゼ基質錠剤セット)と一緒に30分間にわたってインキュベートした。3N HCL50μlを加えて反応を停止させ、490nmで分光光度測定値を得た。
図10に示すように、筋肉への電気的導入によってウサギ及びラットに免疫性を付与した後、9週目に抗RDDIgG抗体が生成された。電気的導入によるこの免疫性付与は、ウサギへのペプチド注射による従来の免疫性付与(対照ウサギ曲線参照)よりも効率的に抗RDD抗体生成を誘発した。同じ結果が16週目のラットに関しても得られた。
Claims (45)
- 核酸を含む薬剤を組織細胞内にインビボ(in vivo)で導入するための電気パルス発生器の作動方法であって、前記薬剤と接触された組織細胞を刺激するための電気パルスとして、電極間に、第1に、200〜2000ボルト/cmの高電圧場強度からなる少なくとも1のパルスを発生し、第2に、50〜200ボルト/cmの低電圧場強度及び300〜2000m秒の持続時間からなる単一パルスを発生することを含む方法。
- 核酸を組織細胞内へエレクトロポレーションで導入するための電気パルス発生器の作動方法であって、前記核酸を間質的に含有する組織を刺激するための電気パルスとして、前記組織の近傍に皮膚と接触した状態で配置される電極間に、第1に、200〜2000ボルト/cmの高電圧(HV)場強度からなる少なくとも1のパルスを発生し、第2に、50〜140ボルト/cmの低電圧(LV)場強度及び300〜2000m秒の持続時間からなる単一パルスを発生することを含む方法。
- 分子を発現し得る核酸を組織細胞に送達するための電気パルス発生器の作動方法であって、前記核酸を注入された前記組織を刺激するための電気パルスとして、電極間に、第1に、200〜2000ボルト/cmの高電圧(HV)場強度からなる少なくとも1のパルスを発生し、第2に、50〜200ボルト/cmの低電圧(LV)場強度及び300〜2000m秒の持続時間からなる単一パルスを発生することを含む方法。
- 前記の低電圧単一パルスの電場強度が50〜140ボルト/cmである、請求項1〜3の何れか一項に記載の方法。
- 前記の低電圧単一パルスの電場強度が80〜120ボルト/cmである、請求項4に記載の方法。
- 前記の低電圧単一パルスの電場強度が90〜110ボルト/cmである、請求項5に記載の方法。
- 前記の低電圧単一パルスの電場強度が100ボルト/cmである、請求項6に記載の方法。
- 200〜1400ボルト/cmの高電圧場強度が使用される、請求項1〜7の何れか1項に記載の方法。
- 400〜1200ボルト/cmの高電圧場強度が使用される、請求項8に記載の方法。
- 600〜800ボルト/cmの高電圧場強度が使用される、請求項9に記載の方法。
- 700ボルト/cmの高電圧場強度が使用される、請求項10に記載の方法。
- 前記組織が筋肉である、請求項1〜11の何れか1項に記載の方法。
- 前記の低電圧単一パルスの電場強度が100〜200ボルト/cmである、請求項1〜3の何れか一項に記載の方法。
- 前記の低電圧単一パルスの電場強度が120〜160ボルト/cmである、請求項13に記載の方法。
- 前記の低電圧単一パルスの電場強度が140ボルト/cmである、請求項14に記載の方法。
- 400〜2000ボルト/cmの高電圧場強度が使用される、請求項1〜3及び13〜15の何れか1項に記載の方法。
- 800〜1600ボルト/cmの高電圧場強度が使用される、請求項16に記載の方法。
- 900〜1200ボルト/cmの高電圧場強度が使用される、請求項17に記載の方法。
- 1000ボルト/cmの高電圧場強度が使用される、請求項18に記載の方法。
- 前記組織が腫瘍組織である、請求項1〜3及び13〜19の何れか1項に記載の方法。
- 前記の低電圧単一パルスの持続時間が300〜800m秒である、請求項1〜20の何れか1項に記載の方法。
- 前記の低電圧単一パルスの持続時間が350〜600m秒である、請求項21に記載の方法。
- 前記の低電圧単一パルスの持続時間が400m秒である、請求項22に記載の方法。
- 前記の低電圧単一パルスが、前記の高電圧パルスの極性とは反対の極性を有している、請求項1〜23の何れか1項に記載の方法。
- 単一の高電圧パルスが使用される、請求項1〜24の何れか1項に記載の方法。
- 持続時間が10〜1000μ秒の高電圧場パルスが使用される、請求項1〜25の何れか1項に記載の方法。
- 持続時間が50〜200μ秒の高電圧場パルスが使用される、請求項26に記載の方法。
- 持続時間が100μ秒の高電圧場パルスが使用される、請求項27に記載の方法。
- 前記の高電圧パルスと前記の低電圧パルスとが、ラグによって分離されている、請求項1〜28の何れか1項に記載の方法。
- 前記ラグが300m秒〜3000秒である、請求項29に記載の方法。
- 前記ラグが500m秒〜1000秒である、請求項30に記載の方法。
- 前記ラグが1000m秒である、請求項31に記載の方法。
- 前記核酸が、組織細胞内で1又は複数の治療活性分子を生成し得る、請求項1〜32の何れか1項に記載の方法。
- それぞれ異なる治療活性分子を組織細胞内で生成し得る、2種又は3種以上の核酸が使用される、請求項1〜33の何れか1項に記載の方法。
- 前記核酸がRDDタンパク質又はその有効断片をコード化する、請求項1〜34の何れか1項に記載の方法。
- 前記治療活性分子が腫瘍血管形成を有効に低減又は抑制する、請求項33に記載の方法。
- 前記治療活性分子が腫瘍の成長を低減又は抑制する、請求項33に記載の方法。
- 前記治療活性分子が転移を阻害する、請求項33に記載の方法。
- 前記治療活性分子が抗癌性である、請求項33に記載の方法。
- 前記組織が筋肉であり、前記核酸が1種又は数種の免疫原をコード化する、請求項1〜12及び請求項21〜34の何れか1項に記載の方法。
- 前記免疫原がHIV免疫原である、請求項40に記載の方法。
- 前記組織が筋肉である、請求項1〜12及び21〜39の何れか1項に記載の方法。
- 抗体を製造する方法であって、
免疫原コード化核酸を、生きている非ヒト動物の組織に注入する工程と、
前記組織を第1に、200〜2000ボルト/cmの高電圧(HV)場強度からなる少なくとも1のパルスで、第2に、50〜140ボルト/cmの低電圧(LV)場強度及び300〜2000m秒の持続時間からなる単一パルスで電気的に刺激し、前記の電気的刺激によって、前記核酸を前記組織の細胞内に導入し、宿主の免疫応答を誘発し得る免疫原を前記核酸に前記宿主内で発現させる工程と、
抗体を回収する工程とを含んでなる、方法。 - 抗体がポリクローナル抗体である、請求項43に記載の方法。
- 前記組織が筋肉である、請求項43又は44に記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
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