JP5163999B2 - DNA microarray for identification of similar plants and herbal medicines - Google Patents
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Description
本発明は、遺伝子多型に基づく簡便な類似植物群および類似植物体を基原とする生薬の同定に関し、特に人参類生薬の同定に好適な同定用DNAマイクロアレイに係る。 The present invention relates to identification of herbal medicines based on simple similar plant groups and similar plant bodies based on genetic polymorphisms, and particularly to an identification DNA microarray suitable for identification of ginseng herbal medicines.
生薬の同定は、従来、経験に基づく五感による鑑別や、外部形態、内部組織形態の観察や、成分化学的方法により行われている。
これらの方法は植物体の表現形質に基づいているのであり、環境や植物の生育段階による影響が避けられない。
また、形態学的同定法は、同定者の経験や主観的判断に左右される。
一方、遺伝子情報に基づく生薬の同定法は、客観的で、上記のような影響を受けない特徴がある。
分子生物学的手法を用いた客観的な生薬同定法の開発には過去１０年間、Random amplified polymorphic DNA (RAPD)、Restriction fragment length polymorphism (RFLP)、Direct sequencing、Polymerase chain reaction (PCR)-RFLP、Amplification refractory mutation system (ARMS)など、さまざまな試みが行われてきた。
しかし、生薬の場合、加工や貯蔵の過程において、DNAの断片化が顕著であるため、RAPD、RFLPなどの方法は適用できない。
Panax属植物及び人参類生薬について、遺伝子レベルの同定法の研究は、過去１０年間に数報が報告された。
核のInternal transcribed spacer (ITS)領域（非特許文献１）、18S rRNA遺伝子領域、葉緑体trnK遺伝子領域の塩基配列（非特許文献２）を決定する方法、さらに、これらの塩基配列の違いを利用したPCR-RFLP法、ARMS法（非特許文献３）、Multiplex ARMS法（非特許文献４）が報告されている。
最近、人参と西洋人参を区別するため、ITS領域に特異的なプライマーを設計して、Pyrosequencing法を利用する方法（特許文献１）、また、薬用人参の品種（会津産）を識別するための合成オリゴヌクレオチド及び塩基配列が公表された（特許文献２）。
一方、DNA マイクロアレイは、遺伝子発現を網羅的に解析することやSNPsを大量かつ迅速に検出できる画期的な技術である。
生薬や薬用植物の同定用DNAマイクロアレイの開発研究はこれまでに３件の報告があった。
（１）26S rRNA遺伝子の塩基配列に基づいて６種類のプローブを含むDNAマイクロアレイを作成し、貝母の同定を試みた研究（非特許文献５）。
（２）１６種のDendrobium属植物のITS領域のPCR産物をプローブとし、スライド上に固定化してマイクロアレイを作成し、石斛の同定に応用した研究（非特許文献６）。
（３）5S rRNA遺伝子のスぺーサー領域の配列に基づいて19プローブ（14‐31 bp）を設計してマイクロアレイを作成し、１９種の有毒中薬の同定に応用した研究（非特許文献７）。
しかし、これらのマイクロアレイは、薬用植物または生薬１種につき１プローブのみを設計し、スライド上に配置したものであるため、相同性の高い近縁種由来のターゲットとは非特異的に結合する恐れがあり、確実性の上で問題があった。
The identification of crude drugs has been conventionally carried out by discrimination based on the five senses based on experience, observation of external forms and internal tissue forms, and component chemical methods.
These methods are based on the phenotypes of the plant body, and the influence of the environment and the growth stage of the plant is inevitable.
The morphological identification method depends on the experience and subjective judgment of the identifier.
On the other hand, the crude drug identification method based on genetic information is objective and has the characteristic of not being affected by the above.
In the past decade, Random amplified polymorphic DNA (RAPD), Restriction fragment length polymorphism (RFLP), Direct sequencing, Polymerase chain reaction (PCR) -RFLP, Various attempts have been made such as Amplification refractory mutation system (ARMS).
However, in the case of herbal medicine, methods such as RAPD and RFLP cannot be applied because DNA fragmentation is remarkable during processing and storage.
In the past decade, several reports have been published on genetic level identification methods for Panax genus plants and ginseng herbs.
A method for determining the nucleotide sequence of the nuclear internal transcribed spacer (ITS) region (Non-patent document 1), 18S rRNA gene region, chloroplast trnK gene region (Non-patent document 2), and the differences between these nucleotide sequences Utilized PCR-RFLP method, ARMS method (Non-patent document 3), and Multiplex ARMS method (Non-patent document 4) have been reported.
Recently, in order to distinguish ginseng from western ginseng, a method that uses a pyrosequencing method by designing a primer specific to the ITS region (patent document 1), and for identifying a variety of medicinal carrots (Aizu) Synthetic oligonucleotides and base sequences have been published (Patent Document 2).
On the other hand, DNA microarray is a revolutionary technology that can comprehensively analyze gene expression and detect SNPs in large quantities and rapidly.
There have been three reports on the development of DNA microarrays for identification of crude drugs and medicinal plants.
(1) A study in which a DNA microarray containing six types of probes was created based on the base sequence of the 26S rRNA gene to attempt to identify shellfish (Non-patent Document 5).
(2) A study in which microarrays were prepared by immobilizing on 16 slides of ITS region PCR products of Dendrobium genus plants as probes and applied to the identification of sarcophagus (Non-patent Document 6).
(3) A 19-probe (14-31 bp) designed based on the sequence of the spacer region of 5S rRNA gene to create a microarray and applied to the identification of 19 toxic drugs (Non-patent Document 7) ).
However, these microarrays are designed so that only one probe for each medicinal plant or herbal medicine is designed and placed on a slide, so that it may bind nonspecifically to a target derived from a closely related species with high homology. There was a problem on certainty.
高齢化社会を迎えた日本において、認知症、心血管疾患などの慢性、難治性老年疾患に漢方薬の有効性が証明されつつあり、その構成成分である生薬の需要が増加している。
天然物由来の生薬の有効性や安全性を保障するには、基原の同定を始めとする品質管理が重要であり、客観的かつ効率的な同定技術の開発が必要である。
人参類生薬はウコギ科 (Araliaceae) のオタネニンジン属（Panax属）植物の地下部に由来する１０数種の生薬を包括し、強壮、補気薬として有名な「薬用人参」、「アメリカ人参」、止血、心血管疾患、肝疾患に用いられる「三七人参」などを始めとする薬用価値が極めて高い生薬群である。
各人参類生薬は図７に示すようにそれぞれ異なる薬効をもち、含有される主な活性成分であるサポニン成分の組成も各々特徴的である。
また、同じ人参類に属していても薬効に逆作用があるものも不在する。
しかし、図８に基原植物群の葉の形態及び地下部の外観写真を示すように植物の外部形態は類似するため、分類が難しく、その地下部を加工した生薬では同定がさらに困難になる。
また、強壮、抗疲労などの作用を持つ薬用人参はいわゆる健康食品としても需要が高いが、高価であるため偽品が出回る可能性がある一方、粉末、錠剤又はカプセル剤として売られるため、その鑑定は困難を極める。
そこで、本発明は人参類生薬の基原植物および人参類生薬のSNPｓ（Single nucleotide polymorphisms）情報に基づいた人参類生薬同定用DNAマイクロアレイ及びそれを用いた客観的且つ迅速な同定方法の提供を目的とする。
In Japan, which has entered an aging society, the effectiveness of Kampo medicines is being proven for chronic and intractable geriatric diseases such as dementia and cardiovascular diseases, and the demand for herbal medicines, which are constituents, is increasing.
In order to guarantee the effectiveness and safety of herbal medicines derived from natural products, quality control including identification of the base is important, and the development of an objective and efficient identification technique is necessary.
The ginseng herbal medicine includes more than 10 kinds of herbal medicines derived from the underground part of the Panaxaceae family (Aranaceae), and is known as a medicinal carrot, American ginseng, This is a group of herbal medicines with extremely high medicinal value, including “Ginseng Ginseng” used for hemostasis, cardiovascular disease and liver disease.
As shown in FIG. 7, each ginseng crude drug has a different medicinal effect, and the composition of the saponin component which is the main active ingredient contained therein is also characteristic.
In addition, even if they belong to the same carrot, there are no drugs that have adverse effects on medicinal effects.
However, as shown in the photograph of the leaves of the original plant group and the external appearance of the underground part in FIG. 8, the external form of the plant is similar, so it is difficult to classify, and identification with a crude drug processed from the underground part becomes more difficult. .
In addition, ginseng with tonic and anti-fatigue effects is also in high demand as a so-called health food, but because it is expensive, there is a possibility that counterfeit goods will be available, but it is sold as powder, tablets or capsules. Appraisal is extremely difficult.
Therefore, the present invention aims to provide a DNA microarray for identifying ginseng crude drugs based on ginseng crude drug base plants and SNPs (Single nucleotide polymorphisms) information of ginseng crude drugs, and an objective and quick identification method using the same. And
本発明に係る類似植物群から特定の植物体を同定するためのDNAマイクロアレイは、類似植物群の遺伝子一塩基多型(SNP)情報に基づいて、同定に有効である特異的な塩基置換を検出するために、複数の区画に区分してそれぞれオリゴヌクレオチドからなるプローブを支持体に固定してあり、前記各区分に固定したオリゴヌクレオチドは類似植物群の遺伝子に特異的な塩基を識別できるような塩基配列になっていて、被同定植物体または生薬から抽出したtotal DNAを鋳型としてPCR法で増幅した後に蛍光標識した遺伝子の部分配列をターゲットとして、前記支持体に固定してある複数のプローブにハイブリダイズさせることで得られる蛍光パターンをバーコードとして解析同定するものであることを特徴とする。
実験条件による検出される蛍光強度のばらつきを補正するため、各プローブを３スポットずつ設置し、それらを平均したデータを取るようにした。
解析結果をバーコードとして表示し、簡単に識別できるようになる。
これにより、例えば同定したいPanax属植物及び人参類生薬（葉又は地下部）からtotal DNAを抽出し、それらを鋳型として18S rRNA遺伝子の部分領域（800 bp）をPCR法で増幅した後、Cy5で蛍光ラベル化する。
蛍光標識した18S rRNA遺伝子の部分配列をターゲットとし、DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせ、アレイ上に固定されたプローブとの特異的な結合による蛍光パターンを測定することでバーコード判断ができる。
The DNA microarray for identifying a specific plant body from the similar plant group according to the present invention detects a specific base substitution effective for identification based on the gene single nucleotide polymorphism (SNP) information of the similar plant group. In order to achieve this, the probes composed of oligonucleotides are divided into a plurality of sections and fixed to the support, and the oligonucleotides fixed in the respective sections can identify bases specific to genes of similar plant groups. A plurality of probes that are base sequences and are immobilized on the support using a partial sequence of a fluorescently labeled gene after amplification by PCR using the total DNA extracted from the identified plant or herbal medicine as a template. The fluorescent pattern obtained by hybridization is analyzed and identified as a barcode.
In order to correct the variation in the detected fluorescence intensity depending on the experimental conditions, three spots of each probe were installed, and the data obtained by averaging them was taken.
The analysis result is displayed as a barcode so that it can be easily identified.
Thus, for example, total DNA is extracted from Panax genus plants and ginseng crude drugs (leaves or underground) to be identified, and a partial region (800 bp) of 18S rRNA gene is amplified by PCR using them as a template. Label with fluorescence.
A barcode can be judged by targeting a partial sequence of a fluorescently labeled 18S rRNA gene, hybridizing it to a DNA microarray, and measuring a fluorescence pattern due to specific binding to a probe immobilized on the array.
本発明は、DNAマイクロアレイにターゲットをハイブリダイズさせて得られる蛍光パターンをバーコードとして検出し、解析することにあり、以下、人参類生薬の同定に適用した例に基づいて説明する。
まず図２に示すように、人参類生薬の基原植物群であるPanax属１３分類群の18Sr RNA遺伝子の塩基配列を明らかにした。
その結果、５’側から、１９１位、２３３位、４９７位、４９９位、５０１位、６８３位、７１２位、７１４位、７２５位、７２９位等に種特異的な塩基が存在していることが判明した。
その特異的な塩基置換をマトリックスにしたのが図３に示した説明である。
この特異的な塩基を検出するために設計した各プローブを図４に示す。
この表でＡ：アデニン，Ｃ：シトシン，Ｇ：グアニン，Ｔ：チミンを表し、小文字で表した塩基が図３に示した特異的な塩基に相当する。
図４に示した３５のプローブを（２３〜２７bp）を、支持体としてスライドグラスを用いて、そのスライドグラス上に１１７スポット×２組を固定したレイアウト例が図５である。
下記にプローブ名とその塩基配列を示す。
配列番号１（プローブ名：PNX-18S-191-1）GCATCCCTTCCAgAAGTCGGGGTTT
配列番号２（プローブ名：PNX-18S-191-2）GCATCCCTTCCAaAAGTCGGGGTTT
配列番号３（プローブ名：PNX-18S-233-1）GCAACGGGCAGaaGCCCGCGTCGA
配列番号４（プローブ名：PNX-18S-233-2）GCAACGGGCAGaGCCCGCGTCGA
配列番号５（プローブ名：PNX-18S-233-3）GCAACGaGCAtaGCCCGCGTCGA
配列番号６（プローブ名：PNX-18S-282-1）TCGCCGGCACGAgGGCCGTGCGAT
配列番号７（プローブ名：PNX-18S-282-2）TCGCCGGCACGAaGGCCGTGCGAT
配列番号８（プローブ名：PNX-18S-497-1）ACAATACCGGGCTgAtTcAGTCTGGT
配列番号９（プローブ名：PNX-18S-497-2）CAATACCGGGCTcAtTgAGTCTGGT
配列番号１０（プローブ名：PNX-18S-497-3）CAATACCGGGCTcAgTgAGTCTGG
配列番号１１（プローブ名：PNX-18S-497-4）CAATACCGGGCTcAaTgAGTCTGGT
配列番号１２（プローブ名：PNX-18S-497-5）CAATACCGGGCTcAcTgAGTCTGG
配列番号１３（プローブ名：PNX-18S-499-1）AATACCGGGCTgAtTcAGTCTGGTAA
配列番号１４（プローブ名：PNX-18S-499-2）ATACCGGGCTcAtTgAGTCTGGTAA
配列番号１５（プローブ名：PNX-18S-499-3）ATACCGGGCTcAgTgAGTCTGGTA
配列番号１６（プローブ名：PNX-18S-499-4）ATACCGGGCTcAaTgAGTCTGGTAA
配列番号１７（プローブ名：PNX-18S-499-5）ATACCGGGCTcAcTgAGTCTGGTAA
配列番号１８（プローブ名：PNX-18S-501-1）TACCGGGCTgAtTcAGTCTGGTAATT
配列番号１９（プローブ名：PNX-18S-501-2）ACCGGGCTcAtTgAGTCTGGTAATT
配列番号２０（プローブ名：PNX-18S-501-3）ACCGGGCTcAgTgAGTCTGGTAAT
配列番号２１（プローブ名：PNX-18S-501-4）ACCGGGCTcAaTgAGTCTGGTAATT
配列番号２２（プローブ名：PNX-18S-501-5）ACCGGGCTcAcTgAGTCTGGTAATT
配列番号２３（プローブ名：PNX-18S-683-1）GGTGTGCACCGaTCGTCTCGTCC
配列番号２４（プローブ名：PNX-18S-683-2）GGTGTGCACCGgTCGTCTCGTCC
配列番号２５（プローブ名：PNX-18S-712-1）CGGCGATGCGcTcCTGTCCTTAA
配列番号２６（プローブ名：PNX-18S-712-2）CGGCGATGCGtTcCTGTCCTTAA
配列番号２７（プローブ名：PNX-18S-712-3）CCGGCGATGCGaTtCTGTCCTTAA
配列番号２８（プローブ名：PNX-18S-714-1）CGGCGATGCGcTcCTGTCCTTAACT
配列番号２９（プローブ名：PNX-18S-714-2）CGGCGATGCGaTtCTGTCCTTAACT
配列番号３０（プローブ名：PNX-18S-725-1）TCCTGTCCTTAAcTGGCCGGGTCGT
配列番号３１（プローブ名：PNX-18S-725-2）TCCTGTCCTTAAtTGGCCGGGTCGT
配列番号３２（プローブ名：PNX-18S-729-1）TCCTTAACTGGcCGGGTCGTGCCT
配列番号３３（プローブ名：PNX-18S-729-2）TCCTTAACTGGtCGGGTCGTGCCT
配列番号３４（プローブ名：Positive Control ）atcatcg cagcaacggg cagaagcccg
配列番号３５（プローブ名：Negative Control）AGTCAGCCAGTCAGGCACTTCGATA
The present invention is to detect and analyze a fluorescent pattern obtained by hybridizing a target to a DNA microarray as a barcode, and will be described below based on an example applied to identification of ginseng crude drugs.
First, as shown in FIG. 2, the nucleotide sequence of the 18S rRNA gene of Panax genus 13 taxonomic group, which is the basic plant group of ginseng herbal medicine, was clarified.
As a result, there are species-specific bases from the 5 ′ side, such as positions 191, 233, 497, 499, 501, 501, 683, 712, 714, 725, and 729. There was found.
The specific base substitution in the matrix is the explanation shown in FIG.
Each probe designed to detect this specific base is shown in FIG.
In this table, A: adenine, C: cytosine, G: guanine, T: thymine, and the bases represented by lowercase letters correspond to the specific bases shown in FIG.
FIG. 5 shows a layout example in which 35 probes shown in FIG. 4 (23 to 27 bp) are used as a support and a slide glass is used as a support, and 117 spots × 2 sets are fixed on the slide glass.
The probe name and its base sequence are shown below.
Sequence number 1 (probe name: PNX-18S-191-1) GCATCCCTTCCAgAAGTCGGGGTTT
Sequence number 2 (probe name: PNX-18S-191-2) GCATCCCTTCCAaAAGTCGGGGTTT
Sequence number 3 (probe name: PNX-18S-233-1) GCAACGGGCAGaaGCCCGCGTCGA
Sequence number 4 (probe name: PNX-18S-233-2) GCAACGGGCAGaGCCCGCGTCGA
Sequence number 5 (probe name: PNX-18S-233-3) GCAACGaGCAtaGCCCGCGTCGA
Sequence number 6 (probe name: PNX-18S-282-1) TCGCCGGCACGAgGGCCGTGCGAT
Sequence number 7 (probe name: PNX-18S-282-2) TCGCCGGCACGAaGGCCGTGCGAT
Sequence number 8 (probe name: PNX-18S-497-1) ACAATACCGGGCTgAtTcAGTCTGGT
Sequence number 9 (probe name: PNX-18S-497-2) CAATACCGGGCTcAtTgAGTCTGGT
Sequence number 10 (probe name: PNX-18S-497-3) CAATACCGGGCTcAgTgAGTCTGG
Sequence number 11 (probe name: PNX-18S-497-4) CAATACCGGGCTcAaTgAGTCTGGT
Sequence number 12 (probe name: PNX-18S-497-5) CAATACCGGGCTcAcTgAGTCTGG
Sequence number 13 (probe name: PNX-18S-499-1) AATACCGGGCTgAtTcAGTCTGGTAA
Sequence number 14 (probe name: PNX-18S-499-2) ATACCGGGCTcAtTgAGTCTGGTAA
Sequence number 15 (Probe name: PNX-18S-499-3) ATACCGGGCTcAgTgAGTCTGGTA
Sequence number 16 (probe name: PNX-18S-499-4) ATACCGGGCTcAaTgAGTCTGGTAA
Sequence number 17 (probe name: PNX-18S-499-5) ATACCGGGCTcAcTgAGTCTGGTAA
Sequence number 18 (probe name: PNX-18S-501-1) TACCGGGCTgAtTcAGTCTGGTAATT
Sequence number 19 (probe name: PNX-18S-501-2) ACCGGGCTcAtTgAGTCTGGTAATT
Sequence number 20 (probe name: PNX-18S-501-3) ACCGGGCTcAgTgAGTCTGGTAAT
Sequence number 21 (probe name: PNX-18S-501-4) ACCGGGCTcAaTgAGTCTGGTAATT
Sequence number 22 (probe name: PNX-18S-501-5) ACCGGGCTcAcTgAGTCTGGTAATT
Sequence number 23 (probe name: PNX-18S-683-1) GGTGTGCACCGaTCGTCTCGTCC
Sequence number 24 (probe name: PNX-18S-683-2) GGTGTGCACCGgTCGTCTCGTCC
Sequence number 25 (probe name: PNX-18S-712-1) CGGCGATGCGcTcCTGTCCTTAA
Sequence number 26 (probe name: PNX-18S-712-2) CGGCGATGCGtTcCTGTCCTTAA
Sequence number 27 (probe name: PNX-18S-712-3) CCGGCGATGCGaTtCTGTCCTTAA
Sequence number 28 (probe name: PNX-18S-714-1) CGGCGATGCGcTcCTGTCCTTAACT
Sequence number 29 (probe name: PNX-18S-714-2) CGGCGATGCGaTtCTGTCCTTAACT
Sequence number 30 (probe name: PNX-18S-725-1) TCCTGTCCTTAAcTGGCCGGGTCGT
Sequence number 31 (probe name: PNX-18S-725-2) TCCTGTCCTTAAtTGGCCGGGTCGT
Sequence number 32 (probe name: PNX-18S-729-1) TCCTTAACTGGcCGGGTCGTGCCT
Sequence number 33 (probe name: PNX-18S-729-2) TCCTTAACTGGtCGGGTCGTGCCT
Sequence number 34 (probe name: Positive Control) atcatcg cagcaacggg cagaagcccg
Sequence number 35 (probe name: Negative Control) AGTCAGCCAGTCAGGCACTTCGATA
図６は前記３５プローブに基づいて蛍光パターンがバーコードとして出現する説明図である。
特異的な塩基を検出するために１９１位、２３３位、２８２位、４９７位、４９９位、５０１位、６８３位、７１２位、７１４位、７２５位、７２９位の１１区画に区分し、各区分はそのオリゴヌクレオチドの塩基配列にて図３に示した種特異的な塩基が検出できるようになっている。
バーコード化するために配列番号１〜３３の３３プローブの両端にPositive Control(PC)２列とNegative Control(NC)１列を配置してある。
FIG. 6 is an explanatory diagram in which a fluorescent pattern appears as a barcode based on the 35 probes.
In order to detect specific bases, it is divided into 11 sections of 191, 233, 282, 497, 499, 501, 683, 712, 714, 725, and 729. Is capable of detecting the species-specific base shown in FIG. 3 from the base sequence of the oligonucleotide.
In order to perform bar coding, two rows of Positive Control (PC) and one row of Negative Control (NC) are arranged at both ends of 33 probes of SEQ ID NOS: 1-33.
本発明においては、植物体の一塩基多型情報に基づいて、種特異的な塩基を検出するためのオリゴヌクレオチドをプローブとして支持体に固定したマイクロアレイとしたので、基原種と一致する特異的な蛍光パターンがバーコードとして表示され、全てが簡便に同定できる。
本発明は、Panax属植物や人参類生薬のみならず、Rheum属植物や大黄類生薬など市場に氾濫する基原植物や生薬を利用した健康食品にも応用可能である。
従って、生薬や健康食品の適正使用、安全性確保のレギュレーションに有用である。
In the present invention, a microarray in which an oligonucleotide for detecting a species-specific base is immobilized on a support as a probe based on single nucleotide polymorphism information of a plant is used. The fluorescent pattern is displayed as a barcode, and everything can be easily identified.
The present invention can be applied not only to Panax genus plants and ginseng herbal medicines, but also to health foods using basic plants and herbal medicines that flood the market, such as Rheum genus plants and Crimson herbal medicines.
Therefore, it is useful for the regulation of proper use and safety assurance of crude drugs and health foods.
本発明の実施例を図１に基づいて説明する。
薬用人参（P. ginseng）、西洋人参（P. quinquefolius）、三七人参（P. notoginseng）、竹節人参（日本産P. japonicus）からtotal DNAを抽出し、ユニバーサルプライマー対(18S5’F: 5’-CAA CCT GGT TGA TCC TGC CAG T-3’; 18SR800: 5’-TGT ATC CAG AGC GTA GGC TTG C-3’)で、18S rRNA遺伝子の部分配列を増幅する。
得られたPCR産物を精製後、Cy5で蛍光ラベル化し、その産物をターゲットとする。
ターゲットをDNAマイクロアレイPNX-arrayに６８℃でハイブリダイズさせ、洗浄後、その蛍光パターンをDNAマイクロアレイスキャナーで測定する。
薬用人参の蛍光ラベル化したPCR産物をターゲットとした場合、マイクロアレイ上の１１区画において、全て左から１番目のプローブに特異的な結合が確認され、P. ginsengに特異的なパターン「11111111111」と一致した。
アメリカ人参のPCR産物をターゲットとした場合、18S rRNA遺伝子の上流から４９７， ４９９， ５０１番目の塩基置換を検出する区画において、３番目のプローブに蛍光シグナルが検出され、そのパターンは「11133311111」となり、P. quinquefolius と同定できた。
三七人参のPCR産物をターゲットとした場合、１９１番目の塩基置換を検出する区画において２番目のプローブに、また４９７、４９９及び５０１番目の塩基置換を検出する区画において３番目のプローブに蛍光シグナルが検出され、そのパターンは「21133311111」となり、P. notoginseng と同定された。
竹節人参のPCR産物をターゲットとした場合、４９７、４９９、５０１及び７１２番目の塩基置換を検出する区画において２番目のプローブに蛍光シグナルが検出され、また７１４番目の区画ではほとんどシグナルが検出されず、日本産P. japonicus「11122212101」と同定された。
また、薬用人参、西洋人参及び三七人参を含有する錠剤、カプセル剤についても同定できた。
An embodiment of the present invention will be described with reference to FIG.
Total DNA was extracted from ginseng (P. ginseng), western ginseng (P. quinquefolius), ginseng (P. notoginseng), bamboo ginseng (Japanese P. japonicus), and a universal primer pair (18S5'F: 5 '-CAA CCT GGT TGA TCC TGC CAG T-3'; 18SR800: 5'-TGT ATC CAG AGC GTA GGC TTG C-3 ') is used to amplify a partial sequence of the 18S rRNA gene.
The resulting PCR product is purified, then fluorescently labeled with Cy5, and the product is targeted.
The target is hybridized to the DNA microarray PNX-array at 68 ° C. After washing, the fluorescence pattern is measured with a DNA microarray scanner.
When targeting a ginseng fluorescently labeled PCR product, specific binding to the first probe from the left was confirmed in 11 compartments on the microarray, and the pattern “11111111111” specific to P. ginseng Matched.
When an American ginseng PCR product is targeted, a fluorescence signal is detected in the third probe in the section detecting the 497, 499, and 501st base substitution from the upstream of the 18S rRNA gene, and the pattern becomes “11133311111”. And P. quinquefolius.
When targeting the PCR product of Ginseng, the fluorescent signal is sent to the second probe in the section detecting the 191st base substitution, and to the third probe in the section detecting the 497, 499 and 501th base substitutions. Was detected, and the pattern was "21133311111", which was identified as P. notoginseng.
When targeting the bamboo ginseng PCR product, a fluorescence signal was detected in the second probe in the sections detecting the 497, 499, 501 and 712th base substitutions, and almost no signal was detected in the 714th section. , P. japonicus "11122212101" produced in Japan.
In addition, tablets and capsules containing ginseng, western ginseng and 37 ginseng could be identified.
Claims (2)
同定に有効である特異的な塩基置換を検出するために、複数の区画に区分してそれぞれオリゴヌクレオチドからなるプローブを支持体に固定してあり、
前記各区分に固定したオリゴヌクレオチドは類似植物群の遺伝子に特異的な塩基を識別できるような塩基配列になっていて、
被同定植物体から抽出したtotal DNAを鋳型としてPCR法で増幅した後に蛍光標識した遺伝子の部分配列をターゲットとして、前記支持体に固定してある複数のプローブにハイブリダイズさせることで得られる蛍光パターンをバーコードとして解析同定するものであり、
前記固定する類似植物群は、オタネニンジン類（Panax属植物）であり、人参類の18S rRNA遺伝子の部分配列をターゲットとして下記塩基配列からなるプローブを支持体に固定してあることを特徴とするDNAマイクロアレイ。
（１）配列番号１で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２）配列番号２で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（３）配列番号３で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（４）配列番号４で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（５）配列番号５で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（６）配列番号６で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（７）配列番号７で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（８）配列番号８で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（９）配列番号９で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１０）配列番号１０で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１１）配列番号１１で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１２）配列番号１２で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１３）配列番号１３で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１４）配列番号１４で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１５）配列番号１５で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１６）配列番号１６で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１７）配列番号１７で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１８）配列番号１８で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１９）配列番号１９で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２０）配列番号２０で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２１）配列番号２１で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２２）配列番号２２で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２３）配列番号２３で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２４）配列番号２４で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２５）配列番号２５で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２６）配列番号２６で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２７）配列番号２７で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２８）配列番号２８で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２９）配列番号２９で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（３０）配列番号３０で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（３１）配列番号３１で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（３２）配列番号３２で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（３３）配列番号３３で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（３４）配列番号３４で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（３５）配列番号３５で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 Based on genetic single nucleotide polymorphism (SNP) information of similar plants,
In order to detect specific base substitution that is effective for identification, probes composed of oligonucleotides are immobilized on a support divided into a plurality of compartments,
The oligonucleotides fixed in the respective sections have base sequences that can identify bases specific to genes of similar plant groups,
Fluorescence pattern obtained by hybridizing to a plurality of probes immobilized on the support, targeting a partial sequence of a fluorescently labeled gene after amplification by PCR using total DNA extracted from the plant to be identified as a template Is analyzed and identified as a barcode ,
Similar vegetation for the fixation, a ginseng compound (Panax genus plants), DNA, characterized in that is fixed a probe having the following nucleotide sequence a partial sequence of 18S rRNA gene of Panax ginseng as a target on a support Microarray.
(1) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(2) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(3) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
(4) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4.
(5) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.
(6) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 6.
(7) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 7.
(8) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 8.
(9) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 9.
(10) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 10.
(11) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 11.
(12) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 12.
(13) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 13.
(14) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 14.
(15) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 15.
(16) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 16.
(17) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 17.
(18) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 18.
(19) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 19.
(20) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 20.
(21) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 21.
(22) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 22.
(23) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 23.
(24) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 24.
(25) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 25.
(26) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 26.
(27) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 27.
(28) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 28.
(29) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 29.
(30) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 30.
(31) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 31.
(32) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 32.
(33) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 33.
(34) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 34.
(35) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 35.
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