JP5162619B2

JP5162619B2 - 麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定方法及び泡持ち判定用マーカー

Info

Publication number: JP5162619B2
Application number: JP2010099654A
Authority: JP
Inventors: 隆飯牟礼; 潔蛸井; 一敏伊藤; 和義武田
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 2010-04-23
Filing date: 2010-04-23
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2027-03-07
Also published as: JP2010169695A

Description

本発明は、麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定方法及び泡持ち判定用マーカーに関する。

ビール等の麦芽発酵飲料の泡は、薄い液体の膜に包まれた炭酸ガスの気泡の集合体であり、気が抜けたり、香味が変化したりするのを防ぐ蓋の役目をするほか、香り立ちを向上させる働きがある。このため、麦芽発酵飲料の泡持ちは、麦芽発酵飲料の品質を判断する重要な要素の１つとされ、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くするための研究がされている。

麦芽発酵飲料の泡持ちの良さは、２０℃の麦芽発酵飲料を泡注ぎ出し機で標準グラスに注いで生じる泡の高さが３０ｍｍ降下するのに要する時間（秒）を判定基準とし、この時間（秒）のことをＮＩＢＥＭ値と呼んでいる。

これまでに、大麦に含まれるＬＴＰ−１やホルデインが麦芽発酵飲料の泡持ちに関与するタンパク質として報告されている（非特許文献１及び２）。

最近では、ゲノム情報を基にタンパク質を網羅的に解析するプロテオミクスを利用した研究が行われており、麦芽発酵飲料の原料となる大麦においては、麦芽特性と二次元電気泳動パターンとを比較して、標的とする麦芽特性に関与するタンパク質を絞り込む試みがなされている（非特許文献３〜５）。

Ｂａｍｆｏｒｔｈら、２００４年、Ｊ．Ｓｃｉ．ＦｏｏｄＡｇｒｉｃ．、８４巻、ｐ．１００１−１００４ＶａｎＮｉｅｒｏｐら、２００４年、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．、５２巻、ｐ．３１２０−３１２９Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄら、２００４年、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、４巻、ｐ．２４３７−２４４７ＳａｓｓＢａｋ−Ｊｅｎｓｅｎら、２００４年、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、４巻、ｐ．７２８−７４２ＦｉｎｎｉｅとＳｖｅｎｓｓｏｎ、２００４年、Ｐｒｏｃ．９ｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＢａｒｌｅｙＧｅｎｅｔｉｃｓＳｙｍｐｏｓｉｕｍ、ｐ．４３１−４３６

しかしながら、麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定基準であるＮＩＢＥＭ値は、温度、天候、さらには人為的な要因が大きく影響するため、異なる条件で測定されたＮＩＢＥＭ値を相互に比較して泡持ちの良さを判定することは困難である。

また、大麦中のＬＴＰ−１やホルデインは、麦芽発酵飲料の泡持ちに関連することが報告されているが、ＮＩＢＥＭ値との相関関係については明らかとされておらず、泡持ちを判定する汎用性のあるマーカーとして実用化されるには至っていない。

さらに、大麦においてもプロテオミクス研究は推進されているが、麦芽発酵飲料の泡持ちに関連する新たなタンパク質は見出されていない。

そこで、本発明の目的は、麦芽発酵飲料の泡持ちを直接測定することなく、麦芽発酵飲料又はその発酵前原料液若しくは発酵中原料液に含まれる所定のタンパク質の濃度から泡持ちの良さを判定可能とすることにある。本発明の目的はまた、麦芽発酵飲料の泡持ち判定用マーカーを提供することにある。

上記目的を達成するため、本発明は、麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定方法であって、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵中原料液の酵母チオレドキシン濃度（Ｍ_Ｔ）を泡持ちに対する負の要因とし、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液のプロテインＺ濃度（Ｍ_Ｚ）を泡持ちに対する正の要因として、泡持ちの良さを判定する判定方法を提供する。

本発明者らは、プロテオミクスをツールとしてビール中のタンパク質を網羅的に解析し、ＮＩＢＥＭ値の高い泡持ちの良いビールでは、酵母チオレドキシン濃度が低く、プロテインＺ濃度及びＢａｒｌｅｙｄｉｍｅｒｉｃａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（以下、ＢＤＡＩ−１）濃度が高いことを明らかにした。さらに、酵母チオレドキシン濃度及びプロテインＺ濃度とＮＩＢＥＭ値との重相関関係を統計的に解析した結果、これらの濃度を麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定に利用できることを見出した。

上記判定方法では、麦芽発酵飲料等の酵母チオレドキシン濃度及びプロテインＺ濃度を測定すれば、ＮＩＢＥＭ値を測定することなく泡持ちの良さを判定することができる。また、酵母チオレドキシン濃度及びプロテインＺ濃度の測定は、温度、天候、さらには人為的な要因の影響を排除して行うことができるため、ＮＩＢＥＭ値の測定と比べて汎用性があり、かつ、正確な泡持ちの良さの判定を実現できる。

上記判定方法は、酵母チオレドキシン濃度（Ｍ_Ｔ）に負の係数を乗じたものと、プロテインＺ濃度（Ｍ_Ｚ）に正の係数を乗じたものとの総和が大きい方の麦芽発酵飲料を泡持ちが良い麦芽発酵飲料であると判定することが好ましい。

この総和は、ａ−ｂ×Ｍ_Ｔ＋ｃ×Ｍ_Ｚ（但し、ａは正の数、負の数又は０であり、ｂ及びｃは正の数である。）として算出することがより好ましく、ＮＩＢＥＭ値と比例関係にある値として麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定に使用できる。

さらに上記ａ、ｂ及びｃは、Ｍ_Ｔ及びＭ_Ｚを変数としたときの、麦芽発酵飲料のＮＩＢＥＭ値を予測する重回帰式の偏回帰係数であることが好ましい。

この場合には、ＮＩＢＥＭ値測定用の専用装置及び標準グラス等を使用してＮＩＢＥＭ値を直接測定することなく、酵母チオレドキシン濃度（Ｍ_Ｔ）及びプロテインＺ濃度（Ｍ_Ｚ）からＮＩＢＥＭ値を予測することが可能となる。また、この判定方法で測定した泡持ちの良さは、既に従来法で測定されたＮＩＢＥＭ値と比較することもできる。

上記判定方法は、さらに、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液のＢＤＡＩ−１濃度（Ｍ_Ｂ）を泡持ちに対する正の要因として、泡持ちの良さを判定することが好ましい。

麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵中原料液の酵母チオレドキシン濃度、及び麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液のプロテインＺ濃度に、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液のＢＤＡＩ−１濃度を泡持ちに対する正の要因として加えれば、麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定をより正確に行うことができる。

上記判定方法は、酵母チオレドキシン濃度（Ｍ_Ｔ）に負の係数を乗じたものと、プロテインＺ濃度（Ｍ_Ｚ）及びＢＤＡＩ−１濃度（Ｍ_Ｂ）に正の係数をそれぞれ乗じたものとの総和が大きい方の麦芽発酵飲料を泡持ちが良い麦芽発酵飲料であると判定することが好ましく、この総和は、ａ−ｂ×Ｍ_Ｔ＋ｃ×Ｍ_Ｚ＋ｄ×Ｍ_Ｂ（但し、ａは正の数、負の数又は０であり、ｂ、ｃ及びｄは正の数である。）として算出することがより好ましい。

さらにａ、ｂ、ｃ及びｄは、Ｍ_Ｔ、Ｍ_Ｂ及びＭ_Ｚを変数としたときの、麦芽発酵飲料のＮＩＢＥＭ値を予測する重回帰式の偏回帰係数であることが好ましい。

この場合には、ＮＩＢＥＭ値測定用の専用装置及び標準グラスを使用してＮＩＢＥＭ値を直接測定することなく、酵母チオレドキシン濃度（Ｍ_Ｔ）、プロテインＺ濃度（Ｍ_Ｚ）及びＢＤＡＩ−１濃度（Ｍ_Ｂ）からより正確にＮＩＢＥＭ値を予測することが可能となり、既に従来法で測定されたＮＩＢＥＭ値と比較することもできる。

また本発明は、酵母チオレドキシンからなる、麦芽発酵飲料の泡持ち判定用マーカーを提供する。

酵母チオレドキシンは、麦芽発酵飲料の泡持ちに対して負の要因として捉えることができ、麦芽発酵飲料の酵母チオレドキシン濃度を高めると麦芽発酵飲料の泡持ちは悪くなるため、泡持ち判定用マーカーとして利用でき、泡持ちの良い麦芽発酵飲料に使用する酵母系統の選抜マーカーとしても使用できる。

また本発明は、ＢＤＡＩ−１からなる、麦芽発酵飲料の泡持ち判定用マーカーを提供する。

ＢＤＡＩ−１は、麦芽発酵飲料の泡持ちに対して正の要因として捉えることができ、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液のＢＤＡＩ−１濃度を高めると麦芽発酵飲料の泡持ちは良くなるため、泡持ち判定用マーカーとして利用でき、泡持ちの良い麦芽発酵飲料に使用する大麦品種の選抜マーカーとしても使用できる。

本発明によれば、ＮＩＢＥＭ値を直接測定することなく泡持ちの良さの判定をすることができ、ＮＩＢＥＭ値を予測することもできる。また、本発明の泡持ちの良さの判定方法は、温度、天候、さらには人為的な要因の影響を排除して行うことができるため、ＮＩＢＥＭ値の測定と比べて汎用性があり、かつ、正確な泡持ちの良さの判定を実現できる。

さらに本発明の泡持ち判定用マーカーは、泡持ちの良い麦芽発酵飲料に使用する酵母系統の選抜マーカー又は大麦品種の選抜マーカーとして使用できる。

泡持ちの良いビールと泡持ちの悪いビールとの間でスポット濃度に有意な差が認められ、泡持ちの良いビールで濃度が高かったプロテインＺのスポットを示す二次元電気泳動の写真である。泡持ちの良いビールと泡持ちの悪いビールとの間でスポット濃度に有意な差が認められ、泡持ちの良いビールで濃度が低かった酵母チオレドキシンのスポットを示す二次元電気泳動の写真である。泡持ちの良いビールと泡持ちの悪いビールとの間でスポット濃度に有意な差が認められ、泡持ちの良いビールで濃度が高かったＢＤＡＩ−１のスポットを示す二次元電気泳動の写真である。ＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、プロテインＺ濃度及び酵母チオレドキシン濃度を説明変数として用いた場合のＮＩＢＥＭ予測値とＮＩＢＥＭ実測値との関係を示したグラフである。ＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、プロテインＺ濃度、酵母チオレドキシン濃度及びＢＤＡＩ−１濃度を説明変数として用いた場合のＮＩＢＥＭ予測値とＮＩＢＥＭ実測値との関係を示したグラフである。

以下に、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。

本発明の判定方法は、麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定方法であって、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵中原料液の酵母チオレドキシン濃度（Ｍ_Ｔ）を泡持ちに対する負の要因とし、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液のプロテインＺ濃度（Ｍ_Ｚ）を泡持ちに対する正の要因として、泡持ちの良さを判定することを特徴とする。

本明細書における「泡持ち」とは、麦芽発酵飲料をグラスに注いだときに生じる泡が消えるまでに要する時間のことをいい、「泡持ちが良い」とは、この時間が長いことを意味し、「泡持ちが悪い」とはこの時間が短いことを意味する。また、「泡持ちの良さ」とは、泡持ちが良い又は悪いといった泡持ちの程度のことであって、対象とする麦芽発酵飲料と泡持ちを比較するときの基準のことである。「泡持ちの良さの判定方法」とは、複数の麦芽発酵飲料の泡持ちを比較して泡持ちの良し悪しを判定することをいう。

「麦芽発酵飲料」とは、麦芽を原料に用いて醸造した飲料のことをいい、例えば、ビール、発泡酒又は原料に麦芽を含有する雑酒が挙げられる。ビールとは、麦芽、ホップ及び水を原料として発酵させたもの又は麦芽、ホップ、水及び麦その他の政令で定める物品（麦、米、とうもろこし、こうりゃん、ばれいしょ、でんぷん、糖類、又は財務省で定める苦味料若しくは着色料）を原料として発酵させたものであって、麦芽使用率が２／３以上のものをいい、発泡酒とは、麦芽又は麦を原料の一部とした酒類で発泡性を有する酒類であって、麦芽使用率が２／３未満のものをいう。

「麦芽発酵飲料の発酵前原料液」とは、麦芽から麦汁を得る途中の仕込工程から麦汁を得るまでの間の原料液若しくは煮沸前の麦汁、又は、麦汁を煮沸し、引き続き冷却し、酵母を投入する前の冷麦汁ができるまでの間の麦汁若しくは冷麦汁のことをいう。「麦芽発酵飲料の発酵中原料液」とは、上記冷麦汁に酵母を投入した後、発酵工程を経て麦芽発酵飲料となるまでの全ての発酵液のことをいう。

「酵母チオレドキシン」とは、種々の酵素のジスルフィド結合を酸化還元し、その酵素の活性を調節するタンパク質であり、酵母から麦芽発酵飲料中に溶出される酵母由来のタンパク質である（ＮＣＢＩＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮＰ＿０１１７２５）。

麦芽発酵飲料の酵母チオレドキシン濃度（Ｍ_Ｔ）は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、二次元電気泳動で分画したタンパク質を染色して得られる染色領域（以下、スポット）の画像解析、プロテインチップによる解析、アフィニティークロマトグラフィーによる定量分析等によって測定できる。

ＥＬＩＳＡ法又はウエスタンブロッティング法で使用する抗酵母チオレドキシン抗体は、発酵に使用する酵母の酵母チオレドキシンを特異的に認識できる抗体であればよく、例えば、酵母チオレドキシンのアミノ酸配列を基に合成したペプチドを抗原として使用し、ウサギやマウス等に免疫して作成できる。

また、二次元電気泳動で分画したタンパク質を染色して得られるスポットの画像解析では、酵母チオレドキシンのスポットを画像化し、その単位面積当たりの染色度合いを数値化し（例えば、ピクセル強度）、この数値を酵母チオレドキシンのスポット全体について合計することで、酵母チオレドキシンの濃度を算出できる。

また、「プロテインＺ」とは、大麦の種子又はビール中に存在するセリンプロテアーゼインヒビターであり、プロテインＺ４とプロテインＺ７の２種類のタンパク質を合わせたもののことをいう。プロテインＺ４（ＮＣＢＩＡｃｃｅｓｓｉｏｎＣＡＡ６６２３２）とプロテインＺ７（ＮＣＢＩＡｃｃｅｓｓｉｏｎＣＡＡ６４５９９）は、いずれも大麦セリンプロテアーゼインヒビターのサブファミリーの一員であり、両者のアミノ酸配列は、約７３％の相同性を有している。

麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液のプロテインＺ濃度（Ｍ_Ｚ）は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、二次元電気泳動で分画したタンパク質を染色して得られるスポットの画像解析、プロテインチップによる解析、アフィニティークロマトグラフィーによる定量分析等によって測定できる。

ＥＬＩＳＡ法又はウエスタンブロッティング法で使用する抗プロテインＺ抗体は、発酵に使用する大麦のプロテインＺ４及び７の双方を認識できる抗体が好ましく、例えば、プロテインＺ４及び７のアミノ酸配列の共通領域を基に合成したペプチドを抗原として使用し、ウサギやマウス等に免疫して作成できる。プロテインＺ４及び７の双方を認識できる抗体が入手できない場合には、プロテインＺ４のみを特異的に認識する抗体でプロテインＺ４を定量し、プロテインＺ７のみを特異的に認識する抗体で、プロテインＺ７を定量し、これらの総和からプロテインＺの濃度を見積もってもよい。

また二次元電気泳動で分画したタンパク質を染色して得られるスポットの画像解析では、プロテインＺのスポットを画像化し、その単位面積当たりの染色度合いを数値化し（例えば、ピクセル強度）、この数値をプロテインＺのスポット全体について計算することで、プロテインＺの濃度を算出できる。

上記判定方法は、酵母チオレドキシン濃度（Ｍ_Ｔ）に負の係数を乗じたものと、プロテインＺ濃度（Ｍ_Ｚ）に正の係数を乗じたものとの総和が大きい方の麦芽発酵飲料を泡持ちが良い麦芽発酵飲料であると判定することが好ましく、例えば、この総和を、ａ−ｂ×Ｍ_Ｔ＋ｃ×Ｍ_Ｚ（但し、ａは正の数、負の数又は０であり、ｂ及びｃは正の数である。）として算出できる。このａ、ｂ及びｃは、Ｍ_Ｔ及びＭ_Ｚを変数としたときの、麦芽発酵飲料のＮＩＢＥＭ値を予測する重回帰式の偏回帰係数であれば、さらに好ましく使用できる。

麦芽発酵飲料のＮＩＢＥＭ値を予測する重回帰式の偏回帰係数は、ＮＩＢＥＭ値を測定した複数の麦芽発酵飲料等について、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵中原料液の酵母チオレドキシン濃度（Ｍ_Ｔ）及び麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液のプロテインＺ濃度（Ｍ_Ｚ）を測定し、各麦芽発酵飲料のＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、上記酵母チオレドキシン濃度（Ｍ_Ｔ）及びプロテインＺ濃度（Ｍ_Ｚ）をそれぞれ説明変数として重回帰式分析をすれば求めることができる。

また、上記判定方法は、さらに、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液のＢＤＡＩ−１濃度（Ｍ_Ｂ）を泡持ちに対する正の要因として、泡持ちの良さを判定することが好ましい。

「ＢＤＡＩ−１」とは、Ｂａｒｌｅｙｄｉｍｅｒｉｃａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒのことであり（ＮＣＢＩＡｃｃｅｓｓｉｏｎＣＡＡ０８８３６）、大麦由来のα−ａｍｙｌａｓｅを阻害しないが、昆虫由来のα−ａｍｙｌａｓｅを阻害することが知られている（Ｍｅｎａら、１９９２年、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０巻、ｐ．４５１−４５８）。

麦芽発酵飲料のＢＤＡＩ−１濃度（Ｍ_Ｂ）は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、二次元電気泳動で分画したタンパク質を染色して得られるスポットの画像解析、プロテインチップによる解析、アフィニティークロマトグラフィーによる定量分析等によって測定できる。

ＥＬＩＳＡ法又はウエスタンブロッティング法で使用する抗ＢＤＡＩ−１抗体は、発酵に使用する麦芽又は大麦のＢＤＡＩ−１を特異的に認識できる抗体であればよく、例えば、ＢＤＡＩ−１のアミノ酸配列を基に合成したペプチドを抗原として使用し、ウサギやマウス等に免疫して作成できる。

また、二次元電気泳動で分画したタンパク質を染色して得られるスポットの画像解析では、ＢＤＡＩ−１のスポットを画像化し、その単位面積当たりの染色度合いを数値化し（例えば、ピクセル強度）、この数値をＢＤＡＩ−１のスポット全体について合計することで、ＢＤＡＩ−１の濃度を算出できる。

上記判定方法は、酵母チオレドキシン濃度（Ｍ_Ｔ）に負の係数を乗じたものと、プロテインＺ濃度（Ｍ_Ｚ）及びＢＤＡＩ−１濃度（Ｍ_Ｂ）に正の係数をそれぞれ乗じたものとの総和が大きい方の麦芽発酵飲料を泡持ちが良い麦芽発酵飲料であると判定することが好ましく、例えば、この総和を、ａ−ｂ×Ｍ_Ｔ＋ｃ×Ｍ_Ｚ＋ｄ×Ｍ_Ｂ（但し、ａは正の数、負の数又は０であり、ｂ、ｃ及びｄは正の数である。）として算出できる。上記ａ、ｂ、ｃ及びｄは、Ｍ_Ｔ、Ｍ_Ｂ及びＭ_Ｚを変数としたときの、麦芽発酵飲料のＮＩＢＥＭ値を予測する重回帰式の偏回帰係数であれば、さらに好ましく使用できる。

麦芽発酵飲料のＮＩＢＥＭ値を予測する重回帰式の偏回帰係数は、ＮＩＢＥＭ値を測定した複数の麦芽発酵飲料について、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵中原料液の酵母チオレドキシン濃度（Ｍ_Ｔ）、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液のプロテインＺ濃度（Ｍ_Ｚ）及びＢＤＡＩ−１濃度（Ｍ_Ｂ）を測定し、各麦芽発酵飲料のＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、上記酵母チオレドキシン濃度（Ｍ_Ｔ）、プロテインＺ濃度（Ｍ_Ｚ）及びＢＤＡＩ−１濃度（Ｍ_Ｂ）を説明変数として重回帰式分析をすれば求めることができる。

また、本発明の泡持ち判定用マーカーは、酵母チオレドキシン又はＢＤＡＩ−１からなることを特徴とする。

「泡持ち判定用マーカー」とは、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液中での濃度がＮＩＢＥＭ値と相関性を示すタンパク質のことをいい、麦芽発酵飲料の泡持ちの良さを判定又は予測するために指標となるタンパク質のことをいう。これまで、酵母チオレドキシン及びＢＤＡＩ−１が、麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定に利用できることについては全く知られていなかった。

酵母チオレドキシンは、麦芽発酵飲料の泡持ちに対して負の要因として捉えることができ、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵中原料液の酵母チオレドキシン濃度を高めると麦芽発酵飲料の泡持ちは悪くなるため、泡持ち判定用マーカーとして利用でき、泡持ちの良い麦芽発酵飲料に使用する酵母系統の選抜マーカーとしても使用できる。一方、ＢＤＡＩ−１は、麦芽発酵飲料の泡持ちに対して正の要因として捉えることができ、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液のＢａｒｌｅｙｄｉｍｅｒｉｃａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＢＤＡＩ−１）濃度を高めると麦芽発酵飲料の泡持ちは良くなるため、泡持ち判定用マーカーとして利用でき、泡持ちの良い麦芽発酵飲料に使用する大麦品種の選抜マーカーとしても使用できる。

酵母チオレドキシンは、発酵に使用した酵母から麦芽発酵飲料中に溶出され、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、二次元電気泳動で分画したタンパク質を染色して得られるスポットの画像解析、プロテインチップによる解析、アフィニティークロマトグラフィーによる定量分析等によって測定できる。

また、ＢＤＡＩ−１は、麦芽又は大麦から麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液中に溶出され、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、二次元電気泳動で分画したタンパク質を染色して得られるスポットの画像解析、プロテインチップによる解析、アフィニティークロマトグラフィーによる定量分析等によって測定できる。

本発明を以下の実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）ビールの泡持ちに影響を与えるタンパク質の同定
泡持ちの良いビールに含まれるタンパク質及び泡持ちの悪いビールに含まれるタンパク質をそれぞれ二次元電気泳動で分画し、ゲル中のタンパク質を銀染色することにより検出される各染色領域（以下、スポット）の画像解析を行い、泡持ちの良いビールと泡持ちの悪いビールとの間で含有濃度に有意な差が認められたタンパク質を質量解析により同定した。以下に詳細に記載する。

まず、泡持ちの良いビール（ＮＩＢＥＭ値２７５〜３２１）及び泡持ちの悪いビール（ＮＩＢＥＭ値２３８〜２５４）をそれぞれ脱気し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法でタンパク質濃度を定量後、このうち３ｍＬをＭｉｌｉＱ水で平衡化したＰＤ−１０カラム（アマシャムバイオサイエンス社）にアプライし、４ｍＬのＭｉｌｉＱ水で溶出することにより脱塩した。こうして得られた脱塩後の各ビールサンプルを、再度Ｂｒａｄｆｏｒｄ法でタンパク質濃度を定量し、全量をそれぞれ凍結乾燥した。

その後、凍結乾燥した各ビールサンプルは、ローディングバッファー（８Ｍ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、０．２８％ＤＴＴ）に溶解し、各ビールサンプル中に含有されるタンパク質（１００μｇ）を二次元電気泳動で分画した。二次元電気泳動は、ＭｕｌｔｉｐｈｏｒＩＩシステム（アマシャムバイオサイエンス社）を用い、同社のプロトコルに従って行った。

二次元電気泳動後には、分画されたゲル中のタンパク質をアマシャムバイオサイエンス社のＳｉｌｖｅｒＳｔａｉｎｉｎｇＫｉｔ，Ｐｒｏｔｅｉｎを用いて銀染色した。但し、泡持ちの良いビールと泡持ちの悪いビールとの間で含有濃度に大きな差が認められたスポットを質量解析する際には、和光社の銀染色ＭＳキットを用いて銀染色した。

銀染色後のゲルは、ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ２−Ｄｐｌａｔｉｎｕｍ（アマシャムバイオサイエンス社）で画像解析した。各スポットのタンパク質濃度（以下、スポット濃度）は、まず、デンシトメーターを用いて各スポットの染色の程度をｖｏｌ％を単位として定量し、この値にＢｒａｄｆｏｒｄ法で定量した脱塩前のビールサンプルのタンパク質濃度を乗じて算出した。

画像解析によって、泡持ちの良いビールと泡持ちの悪いビールとの間でスポット濃度に大きな差が認められたスポットについては、質量分析を行うためにゲルからゲルスポット切り出し、銀染色ＭＳキット（和光社）に添付されている脱色液に浸漬することにより脱色した。脱色後のゲルスポットには、Ｔｒｙｐｓｉｎを含むトリスバッファー（ｐＨ８．０）を加え、３５℃で、２０時間、酵素処理した。その後、ゲルから消化後のタンパク質を溶出し、脱塩後に自然乾燥し、ＭＡＬＤＩＴＯＦ−ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥＳＴＲ；ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で質量分析した。タンパク質データベースは、ＮＣＢＩｎｒ及びＢａＥＳＴ０２０８０８を使用し、ＭＳ−ＦｉｔＳｅａｒｃｈで検索した。

但し、酵母チオレドキンの質量分析は、脱色後のゲルスポットにＬｙｓｙｌｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅを含むトリスバッファー（ｐＨ８．０）を加え、３５℃、３時間の酵素処理を行い、引き続き、Ｔｒｙｐｓｉｎを加えさらに３５℃、２０時間の酵素処理を行い、その後のサンプル溶液をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ＭＡＧＩＣ２００２、ＭｉｃｈｒｏｍＢｉｏｒＲｅｓｏｕｒｓｅｓ，Ｉｎｃ，ＵＳＡ）で分析することによって行った。

その結果、泡持ちの良いビールと泡持ちの悪いビールとの間でスポット濃度に差が認められたタンパク質を同定できたが、実施例２以降で示す重回帰分析において、ＮＩＢＥＭ値との相関関係に寄与したタンパク質は、プロテインＺ、酵母チオレドキシン及びＢＤＡＩ−１の３つのみであった。

図１は、泡持ちの良いビールと泡持ちの悪いビールとの間でスポット濃度に有意な差が認められ、泡持ちの良いビールで濃度が高かったプロテインＺのスポットを示す二次元電気泳動の写真である。図２は、泡持ちの良いビールと泡持ちの悪いビールとの間でスポット濃度に有意な差が認められ、泡持ちの良いビールで濃度が低かった酵母チオレドキシンのスポットを示す二次元電気泳動の写真である。図３は、泡持ちの良いビールと泡持ちの悪いビールとの間でスポット濃度に有意な差が認められ、泡持ちの良いビールで濃度が高かったＢＤＡＩ−１のスポットを示す二次元電気泳動の写真である。

（実施例２）ＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、泡持ちの良いビールと泡持ちの悪いビールとの間でスポット濃度に有意な差が認められたタンパク質を説明変数として用いた場合の重回帰分析
市販されている１０種類の麦芽発酵飲料（ビール、発泡酒）のＮＩＢＥＭ値と、実施例１で同定したタンパク質の各麦芽発酵飲料中での濃度をそれぞれ測定し、各麦芽発酵飲料のＮＩＢＥＭ値と各タンパク質の濃度との間における単回帰分析を行ったところ有意な相関関係は認められなかった。

そこで、上記タンパク質のうちの２つの濃度を説明変数として用いた場合の重回帰分析を行った。

ＮＩＢＥＭ値は、ＨＡＦＦＭＡＮＳ社のＮＩＢＥＭ−Ｔ装置、ＩＮＰＡＣＫ２０００及びＮＩＢＥＭ値測定用の標準グラスを用いて測定した。具体的には、上記の麦芽発酵飲料をそれぞれ２０℃の状態にし、泡注ぎ出し機により炭酸ガスを用いて標準グラスに注ぎ出し、生じた泡の高さの降下をＮＩＢＥＭ−Ｔ装置で追尾し、ＮＩＢＥＭ値を測定した。ＮＩＢＥＭ値は、泡の高さが３０ｍｍ降下するのに要した時間（秒）とした。

各タンパク質の濃度は、実施例１で記載したように、１０種類の麦芽発酵飲料に含有されるタンパク質を二次元電気泳動で分画し、銀染色後のゲルをＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ２−Ｄｐｌａｔｉｎｕｍで画像解析し、目的とするタンパク質のスポットの染色の程度（単位はｖｏｌ％）をデンシトメーターで測定し、この値にＢｒａｄｆｏｒｄ法で定量した各麦芽発酵飲料のタンパク質濃度を乗じて算出した。

その結果、ＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、プロテインＺ濃度及び酵母チオレドキシン濃度を説明変数とした場合にのみ危険率１％で有意な相関関係が認められた。重回帰式は、ＮＩＢＥＭ値＝２２９．９３＋（−０．９２３８×酵母チオレドキシン濃度）＋（０．００４０×プロテインＺ濃度）となり、標準化した重回帰式は、ＮＩＢＥＭ値＝（−０．６８９×酵母チオレドキシン濃度）＋（０．６４１×プロテインＺ濃度）となった（補正Ｒ^２＝０．７０９）。

図４は、ＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、プロテインＺ濃度及び酵母チオレドキシン濃度を説明変数として用いた場合のＮＩＢＥＭ予測値とＮＩＢＥＭ実測値との関係を示したグラフである。

以上の結果より、プロテインＺ及び酵母チオレドキシンは、麦芽発酵飲料の泡持ち判定用マーカーとして使用でき、酵母チオレドキシン濃度を泡持ちに対する負の要因とし、プロテインＺ濃度を泡持ちに対する正の要因として、泡持ちの良さを判定できることが明らかとなった。

次に、ＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、プロテインＺ濃度及び酵母チオレドキシン濃度に、実施例１で同定したタンパク質の濃度を説明変数にさらに加えて、重回帰分析を行った。

その結果、ＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、プロテインＺ濃度、酵母チオレドキシン濃度及びＢＤＡＩ−１濃度を説明変数とした場合にのみ危険率１％で有意な相関関係が認められた。重回帰式は、ＮＩＢＥＭ値＝１９６．７４＋（−０．９２９９×酵母チオレドキシン濃度）＋（０．００５７×プロテインＺ濃度）＋（０．１１６９×ＢＤＡＩ−１濃度）となり、標準化した重回帰式は、ＮＩＢＥＭ値＝（−０．６９４×酵母チオレドキシン濃度）＋（０．８９５×プロテインＺ濃度）＋（０．４４１×ＢＤＡＩ−１濃度）となった（補正Ｒ^２＝０．８５６）。

図５は、ＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、プロテインＺ濃度、酵母チオレドキシン濃度及びＢＤＡＩ−１濃度を説明変数として用いた場合のＮＩＢＥＭ予測値とＮＩＢＥＭ実測値との関係を示したグラフである。

以上の結果より、ＢＤＡＩ−１についても麦芽発酵飲料の泡持ち判定用マーカーとして使用でき、酵母チオレドキシン濃度を泡持ちに対する負の要因とし、プロテインＺ濃度及びＢＤＡＩ−１濃度を泡持ちに対する正の要因として、泡持ちの良さを判定できることが明らかとなった。

Claims

Ｂａｒｌｅｙｄｉｍｅｒｉｃａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＢＤＡＩ−１）からなる、麦芽発酵飲料の泡持ち判定用マーカー。
麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定方法であって、
前記麦芽発酵飲料又は前記麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液のＢａｒｌｅｙｄｉｍｅｒｉｃａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＢＤＡＩ−１）濃度（Ｍ_Ｂ）を前記泡持ちに対する正の要因として、
前記泡持ちの良さを判定する判定方法。
前記Ｂａｒｌｅｙｄｉｍｅｒｉｃａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＢＤＡＩ−１）濃度（Ｍ_Ｂ）が高い方の麦芽発酵飲料を泡持ちが良い麦芽発酵飲料であると判定する、請求項２に記載の判定方法。