JP5108854B2 - 緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対するファージ治療 - Google Patents

緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対するファージ治療 Download PDF

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Description

本発明は、バクテリオファージＭＰＫ６またはその子孫バクテリオファージ及び緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)感染症の治療用薬剤学的組成物に関する。
緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)は、様々な生命または非生命の環境に遍在し、人間の免疫体系が弱くなった時にのみ発生する病原菌である。これは、嚢胞性線維症、中耳炎、角膜炎及び火傷の感染にかかった患者からしばしば分離されて、また免疫が低下された患者において、敗血症の病因になったりもする。このバクテリアは、３歳以下の子供たちに感染され、肺の機能に深刻な影響を与えることもある28,33。しかも、P. aeruginosaは、盲腸破裂後、二次的に発生する敗血症、腹膜炎症状の健康な子供たちからも発見される4。P. aeruginosaによる腹膜炎は、腹膜透析(continous ambulatory peritoneal dialysis, CAPD)を受けている患者に深刻な脅威(約10%の致死率)になる可能性がある17。このような場合、バクテリアによる感染は、しばしば高い死亡率、ＣＡＰＤの失敗及び合併症を誘発するようになる16,17,19。腹膜炎の病理生理学的複雑性を理解するために、P. aeruginosaによる腹膜炎にかかったげっ歯類モデルが開発された38。病理学的結果は、一般に菌血症を伴い、感染された肝では、感染６時間内にインターロイキン−６の血清レベルが増加して、P. aeruginosa種及び感染量によって異なるが、４８時間内に最終的に死亡した5。
たとえバクテリアの感染を調節するに使用される抗生物質が多様に存在するとても、抗生物質に対する抵抗性が余儀なく発生しえるため、その抗生物質が効果的ではない場合がしばしばある。バクテリア間の固有なまたは獲得した抗生物質に対する抵抗性メカニズムの選択及び普及は、今まで明かされた多様な抗生物質を含む化学的治療方法を妨害して、多数の抗生物質抵抗性を有するバクテリア種の発生を増進させる。このような理由で、最近バクテリアによる感染患者の死亡率が増加している26,34。したがって、バクテリアによる感染を調節できる新しい治療及び予防戦略の開発が強く求められている。
抗生物質−抵抗性微生物により引き起こされる感染と闘うための大体的な及び/または追加的な抗−感染方法として、特異的に宿主バクテリアの感染を目標とできるバクテリオファージが再び注目を浴びているが、これがファージ治療方法と呼ばれる35。ファージ治療方法は、ファージを生体物質として使用する方法であって、最初の抗生物質であるペニシリンが発見される前の１９１６年Ｆｅｌｉｘ ｄ’Ｈｅｒｅｌｌｅにより最初に紹介された36。ファージは、旧ソ連及び東ヨーロッパでバクテリア感染の治療に抗生物質に代わって使用されてきた30。最近、さらに多いバクテリアが抗生物質の抵抗に対して速い速度で進化しているため、ファージ治療方法に多い関心をおいている。したがって、ファージ治療方法は、抗生物質に対し、価値のある代案になりえて、特定な場合では、抗生物質より医学的に優越であることが証明された3,22。
P. aeruginosaは、伝統的な抗生物質治療方法の存在にもかかわらず、生態学的な適性を増進させる環境に対する適応力が非常に強いバクテリアである。速い速度で新しいP. aeruginosa種が発生し、抗生物質−抵抗性の臨床分離バクテリア株が持続的に増加するにつれて、P. aeruginosa−媒介性感染を治療するためのファージ治療方法のような代案が強く台頭されている。最近、遺伝的に変形されたフィラメント型ファージＰｆ３Ｒ10、溶解性ファージ分離集団またはファージカクテルを利用したファージ治療方法の効能が、火傷感染23及び腸−由来敗血症37を始めとし、P. aeruginosaにより感染された多様な実験用マウスに対して研究が進行中にある。P. aeruginosaによる病原生理学的メカニズムは、非常に複雑であるため、抗バクテリア治療方法の効能及び関連性に対して、さらに多い感染モデルに対するテストが必要である。
本明細書全体にかけて多数の特許文献及び論文が参照されて、その引用が表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
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本発明者らは、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)感染症、例えば緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)−誘導性腹膜炎に対するバクテリオファージ治療方法を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、P.aeruginosaストレインＰＡ０１の腹腔内感染によるマウス腹膜炎−敗血症に対抗するCaudovirals目に属する新規なバクテリオファージ種であるＭＰＫ６(寄託番号:KCCM 11044P)を分離して、哺乳動物及び非哺乳動物感染モデルを利用し、ＭＰＫ６及びその子孫バクテリオファージの抗バクテリア効能を確認することにより、本発明を完成した。
したがって、本発明の目的は、バクテリオファージＭＰＫ６またはその子孫バクテリオファージを提供することにある。
本発明の他の目的は、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)感染症の治療用薬剤学的組成物を提供することにある。
本発明のまた他の目的は、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)感染症の治療用方法を提供することにある。
本発明のまた他の目的は、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)に対する抗生剤をスクリーニングする方法を提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
本発明の一様態によると、本発明は、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)に対して溶解活性を有するバクテリオファージＭＰＫ６(寄託番号:KCCM 11044P)を提供する。

本発明の他の様態によると、本発明は、(ａ)上記バクテリオファージの薬剤学的有効量、及び(ｂ)薬剤学的に許容される担体を含む緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)感染症の治療用薬剤学的組成物を提供する。
本発明のまた他の様態によると、本発明は、バクテリオファージを含む薬剤学的組成物を対象(subject)に投与する段階を含む緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)感染症の治療用方法を提供する。
本発明のまた他の様態によると、本発明は、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)に対する抗生剤をスクリーニングする方法を提供する。
本発明者らは、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)感染症、例えば緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)−誘導性腹膜炎に対するバクテリオファージ治療方法を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、P.aeruginosaストレインＰＡ０１の腹腔内感染によるマウス腹膜炎−敗血症に対抗するCaudovirals目に属する新規なバクテリオファージ種であるＭＰＫ６(寄託番号:KCCM 11044P)を分離して、哺乳動物及び非哺乳動物感染モデルを利用し、ＭＰＫ６及びその子孫バクテリオファージの抗バクテリア効能を確認した。
バクテリオファージは、複雑な溶解サイクルを通じて内部複製及びバクテリア溶解により宿主細胞を溶解するバクテリアウイルスである。ファージは、それらのターゲットバクテリアを攻撃するという点で非常に特異的である。しかし、多様な病原菌に対して効果的に作用できる広いスペクトルを有した抗生剤に比べ、ファージは安全ではあるものの、病原菌に対して狭いスペクトルを有するため、だんだんその利用頻度が低くなった。最近、ファージに対する理解が高くなるにつれて、ファージ治療方法も新たに注目を浴びている。多様な動物から誘発される疾病に対する治療を含む実質的なファージの利用にもかかわらず、臨床適用、飲食安全−関連利用及び環境汚染の改善などの様々な分野で新しいファージの発見、特異的な具体的適用のための最適のファージ選択及びファージを利用する方法の開発などが要求されている。また、人間及び動物においてバクテリア−誘発疾患、疾病または状態、即ち、抗生剤−抵抗性バクテリアによる疾患を予防または治療するために、新しいファージ及び同定方法が必要である。
本発明によると、本発明で分離されたバクテリオファージＭＰＫ６、または前記バクテリオファージＭＰＫ６と同一なＲＦＬＰ ＤＮＡプロファイルを有するその子孫バクテリオファージは、バクテリア(例えば、緑膿菌)に対する強力な溶解活性を有する。
緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)は、プロテオバクテリア(Proteobacteria)に属するグラム陰性バクテリアである。プロテオバクテリアは、大腸菌、サルモネラ(Salmonella)、シゲラ(Shigella)及び他のエンテロバクテリア(Enterobacteriaceae)、Pseudomonas、Moraxella、Helicobacter、Stenotrophomonas、Bdellovibrio、アルファ−プロテオバクテリアなどを含む。医学的に、これらは、Hemophilus influenzae、Klebsiella pneumoniae、Legionella pneumophila、Pseudomonas aeruginosaなどによる呼吸器障害、大腸菌(Escherichia coli)、Proteus mirabilis、Enterobacter cloacae、Serratia marcescensなどによる泌尿器障害及びHelicobacter pylori、Salmonella enteritidis、Salmonella typhiなどによる胃腸系統障害を起こす。
緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)は、様々な生命または非生命の環境に遍在し、人間の免疫体系が弱くなった時にのみ発生する病原菌であって、植物、虫及び昆虫のような多数の系統背景の宿主に感染できる。
本発明の好ましい具現例によると、本発明の薬剤学的組成物により治療される緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)感染症は、嚢胞性線維症、中耳炎、角膜炎、内眼球炎(endophthalmitis)、菌血症、火傷の感染、肺炎、脳膜炎、腹膜炎または敗血症を含み、より好ましくは、肺炎、脳膜炎、腹膜炎または敗血症であって、最も好ましくは、腹膜炎または敗血症である。
本発明によると、本発明で分離された新規なファージＭＰＫ６またはその子孫バクテリオファージは、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)感染症を治療することができる。
本明細書で新規なファージＭＰＫ６を言及しながら使用される用語‘子孫(progeny)’は、寄託されたバクテリオファージの継代培養または当業界によく知られた方法により生産される、寄託されたバクテリオファージの子孫(descendents)を含むバクテリオファージの複製物(replicates)または寄託されたバクテリオファージのＲＦＬＰ ＤＮＡプロファイルと実質的に同一な(substantially equivalent)ＲＦＬＰを有するバクテリオファージを意味する。前記‘実質的に同一なまたは同一なRFLPを有する’とは、Ｔｅｎｏｖｅｒらにより提示された方法(Tenover, F. C. et al. Interpreting Chromosomal DNA Restriction Patterns Produced by Pulsed-Field Gel Electrophoresis: Criteria for Bacterial Strain Typing. J. Clin. Microbiol. 33:2233-2239(1995))によって有機体間の変異性(variability)を示すために使用された表現である。Ｔｅｎｏｖｅｒらは、同一な派生有機体(identical propagated organisms)のゲノムを制限酵素で切断して電気泳動した場合に現れるパターンで変異性の受容可能なレベルを提示している。Ｔｅｎｏｖｅｒらが提示した基準によって、同一なＲＦＬＰ ＤＮＡプロファイルを有する子孫は、バクテリオファージＭＰＫ６と同一なバクテリオファージとして扱われる。
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)に詳細に記載されている。
本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因により様々である。
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口で投与することができ、非経口で投与される場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などにより投与できる。一方、本発明の薬剤学的組成物の好ましい投与量は、１日当たり、１０1〜１０10ＰＦＵ/ｋｇ(体重)である。
本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び/または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、または多用量容器内に入れて製造できる。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
本発明によると、本発明は、下記の段階を含む抗−緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)抗生剤のスクリーニング方法を提供する：
(ａ)緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)をショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)に感染させる段階；
(ｂ)前記感染されたショウジョウバエに、スクリーニングしようとする物質を投与する段階；
(ｃ)前記ショウジョウバエの死亡率または前記ショウジョウバエ破砕物のＣＦＵ(colony forming unit)を測定する段階。
ショウジョウバエ全身性感染(systemic infection)基盤スクリーニングを通じて同定された病原性要因がマウスの腹膜炎に必要であるという事実に基づき18、本発明者らは、ファージ治療法を評価するために、ショウジョウバエモデルを本発明で最初に確立して、このような非哺乳動物感染モデル及びマウスモデルを利用して、ＭＰＫ１及びＭＰＫ６(寄託番号:KCCM 11044P)の抗バクテリア効能を立証した。
本発明は、人間及び動物において、バクテリア−感染症を予防または治療するための新しい抗−緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)抗生剤を同定できるスクリーニング方法として、本発明者らは、ショウジョウバエモデルを最初に確立した。
本発明の好ましい具現例によると、前記段階(ａ)において、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)の感染数は、１０〜１０００ＣＦＵ、より好ましくは、２０〜７００ＣＦＵ、さらに好ましくは、３０〜４００、及び最も好ましくは５０〜２００ＣＦＵである。したがって、本発明で利用される緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)の感染数は、非常に少ない量であって、本発明は、これを利用して効果的にスクリーニングを行うことができるという長所を有する。
前記段階(ａ)でスクリーニングしようとする物質の投与は、口腔(例えば、摂取(feeding)を通じて１次的に腸内に注入する方法)または非口腔(例えば、背側胸部(dorsal thorax)のような身体部位に直接刺すか(pricking)または注入する方法)により投与することができて、好ましくは、非口腔投与である。
本発明の好ましい具現例によると、前記段階(ａ)は、ショウジョウバエの背側胸部(dorsal thorax)に直接緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)を注入して行う。
本発明の好ましい具現例によると、前記段階(ｂ)は、スクリーニングしようとする物質を、ショウジョウバエに口腔投与して行う。
本発明の方法によると、最終的にショウジョウバエの死亡率または前記ショウジョウバエ破砕物のＣＦＵ(colony forming unit)を測定して、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)抗生剤をスクリーニングする。
試験物質の処理により緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)に感染されたショウジョウバエの死亡率が減少するか、ショウジョウバエ破砕物のＣＦＵが減少するとして示されたら、試験物質が緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)を溶解する活性を有すると判定されて、結局試験物質は、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)感染症を治療できる能力を有する候補物質として決定される。
本発明の好ましい具現例によると、前記スクリーニングしようとする物質は、単一化合物、混合物またはファージであり、より好ましくはファージである。
本発明のスクリーニング方法により分析される試験物質は、合成または天然化合物のライブラリまたは天然材料から得られる。合成または天然化合物のライブラリを得る方法は、当業界に公知されている。合成化合物ライブラリは、 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA)及びSigma-Aldrich(USA)から商業的に購入可能であり、天然化合物のライブラリは、Pan Laboratories(USA)及びMycoSearch(USA)から商業的に購入可能である。
試験物質は、当業界に公知された多様な組み合わせライブラリ方法により得られて、例えば、生物学的ライブラリ、空間addressable parallel固相または液相ライブラリ、デコンボリューションが要求される合成ライブラリ方法、‘１−ビート１−化合物’ライブラリ方法、そして親和性クロマトグラフィー選別を利用する合成ライブラリ方法により得られる。分子ライブラリの合成方法は、DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994などに開示されている。
本発明の特徴及び利点を要約すると、以下のようである：
(ａ)本発明は、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)感染症を治療できる新規なファージＭＰＫ６またはその子孫バクテリオファージを提供する。
(ｂ)本発明は、哺乳動物及び非哺乳動物感染モデルを利用して、ＭＰＫ６またはその子孫バクテリオファージの抗バクテリア効能を提示する。
(ｃ)本発明によると、本発明のＭＰＫ６またはその子孫バクテリオファージは、P.aeruginosa−誘導性腹膜炎−敗血症を治療するに非常に効果的である。
ウラニルアセテートでネガティブ染色されたＭＰＫ６のビリオン構造の透過電子顕微鏡写真を示す。バーは、１００ｎｍを示す。 多様なＬＰＳ突然変異において、ＭＰＫ６によるプラーク形成を示す。約３×１０2ＰＦＵを含むＭＰＫ６ファージの溶解物をＰＡＯ１(WT)のバクテリアローン及びそのコンジェニック(congenic)ＬＰＳ突然変異にスポッティングした：ｒｍｄ(A-B+core+)、ｗｂｐＭ(A+B-core+)及びｒｍｌＣ(A-B-core-)。 インビトロでＭＰＫ６の溶解活性を示す。ＰＡＯ１培養懸濁液をＬＢでＭＰＫ６(■)のファージ溶解物(MOI=1)と混合して培養した。生きているバクテリアの数(CFU)は、適宜希釈して約１０2ＣＦＵ程度になるように測定した。 マウスにおいてＭＰＫ６の薬物動力学を示す。ＭＰＫ６(A、B及びC；□及び■)のＰＢＳに溶けているファージ試料(5×107PFU)を、感染されなかったマウスの腹腔内(i.p.ソリッドシンボル)または筋肉内(i.m.オープンシンボル)にそれぞれ注射した。マウスグループ(n=3)は、感染後０．５、１２、２４、３６及び４８時間に犠牲されて、血液(A)、肝(B)及び肺(C)を抽出して、それぞれの粉砕物を、ユニット容量(ml)当たりＰＦＵを測定するに使用した。ＰＦＵ/ｍｌは、ログスケールで示した。 マウスにおいて、ＭＰＫ６の保護効果を示す。Ａ及びＢは、ＰＡ０１−感染マウスにＭＰＫ６(四角形；□及び■)を、それぞれＭＯＩが１(オープンシンボル；□)または１０(ソリッドシンボル；■)になるように処理した時の死亡率を示し、これはそれぞれ感染６時間後にｉ．ｍ．(Ａ)またはｉ．ｐ．経路(Ｂ)を通じて注射された。ファージを処理しなかったＰＡ０１−感染マウス(◇)は、４８時間内に全部死亡した。ログランクテストに基づいた統計学的有意性：**, p < 0.01；***, p < 0.001。Ｃは、ＭＯＩが１０になるように腹腔内にファージを処理するか処理しないマウスにおいて、Ｂのように肺、脾臓及び肝のバクテリア量を示したものである。生きているバクテリアの数(CFU)は、感染２４時間後に生きているマウスの器官から測定した。ユニット容量(ml)当たりＣＦＵは、ログスケールで測定した。シンボル：ファージを処理しなかったもの、◇；ＭＰＫ６、□。 D.melanogasterの全身感染に対するバクテリアファージ治療法を示す。Ａは、ＭＰＫ１及びＭＰＫ６の薬物動力学を示す。 ＭＰＫ１(A;○及び●)またはＭＰＫ６(B;□及び■)のＰＢＳに溶けているファージ試料(5×107PFU)をショウジョウバエ培養液の表面に敷いておく。ショウジョウバエグループ(n=5)は、０．５、１２、２４、３６及び４８時間で収集し、それぞれの粉砕物を、ショウジョウバエ当たりＰＦＵを測定するために除去した。Ｂは、ファージを摂取させたＰＡ０１−感染ショウジョウバエの死亡率を示す。感染されたショウジョウバエは、何もないか(◇)、ＭＰＫ１(●)またはＭＰＫ６(■)のＰＢＳに溶けているファージ試料(5×107 PFU in PBS)が敷かれた新しい培地に移転した。点線は、５０％の死亡率に到達するに必要な時間を意味する。Ｔログランクテストに基づいた統計学的優位性: ***, p < 0.001。Ｃは、Ａのようにファージを摂取させたショウジョウバエの粉砕物からバクテリアの量を測定したものである。生きているバクテリアの数(CFU)は、感染０．５、１２、２４または４８時間後に、それぞれ生きているか(オープンシンボル)、死んだ(ソリッドシンボル)ショウジョウバエの粉砕物から測定した。ショウジョウバエ当たりＣＦＵは、ログスケールで示した。シンボル:ファージを処理しなかったもの、◇及び◆；ＭＰＫ１、○及び●; ＭＰＫ６、□及び■。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
実験材料及び実験方法
使用菌株及び培養条件
本発明で使用した菌株は、P. aeruginosaストレインＰＡ０１であり12、リポポリサッカライド突然変異体(rmd, wbpM及びrmlC)は、Joe Lam博士(University of Guelph, Canada)から入手した27。バクテリアは、Luria-Bertani(LB; 1%トリプトン、0.5%酵母抽出物及び1% NaCl)培地に空気注入をするか、２％のバクト・アガー(Difco)またはセトリミドアガー(Pseudomonas分離用アガー、Fluka)を入れてプレートを作り、３７℃で培養した。
ファージ溶解物の準備
P. aeruginosaストレインPAO1を宿主として使用し、プレート溶解物によるファージMPK6を豊かにする方法は、従来の技術に従った13。培養懸濁液を4℃及び8,000×gで10分間遠心分離して細胞残骸を除去し、パージパーティクルを10%のポリエチレングリコール及び1MのNaClの存在下で培養上澄み液から沈殿させて、これをファージバッファ[10mM MgSO4, 10mM Tris(pH 7.6)及び1mM EDTA] 5mlに溶かした。ファージパーティクルは、4℃及び110,000×gで3時間超高速遠心分離をして濃縮し、これをファージバッファに再懸濁した。ファージ懸濁を、不連続的濃度のCsCl(1.45, 1.50 及び1.70g/ml)の上層に載せて、4℃及び87,000×gで2時間遠心分離した後、ファージバンドを収得して透析過程を行った。
透過電子顕微鏡
ファージMPK6のビリオン形態は、従来の技術にしたがって透過電子顕微鏡を利用して確認した13。簡単に説明すると、ビリオン形態でコーティングされたTEMグリッドを親水性処理を10分間行って、1/100希釈されたCsCl-精製ファージ試料20μlを漂流させて、すぐに20μlの2%ウラニルアセテート(pH 4.0)を使用してネガティブ染色をした。グリッドを30分間空気中で乾燥して、透過電子顕微鏡(JEM 1010 EM; JEOL Ltd)を利用して120〜500Kの倍率で観察した。
ファージ感染
ファージ感染は、普遍的なプラークアッセイまたはスポッティングアッセイ方法を使用した12。約102プラーク形成単位(plaque forming unit, PFU)のファージを含む10μlの溶解物を、107コロニ形成単位(colony forming unit, CFU)の指数成長後半期まで育った(OD600 = 0.7)P. aeruginosaと混合した後、100μlのファージバッファに再懸濁した。10分間培養した後、3mlのトップアガーを添加して混合した後、混合液を塗抹した。37℃で16〜24時間培養した後、プラークを確認した。
マウス感染
マウス感染は、4週齢の雄性ICEマウスを使用して、ソカン大学校(韓国)の動物実験倫理委員会の許可を得て、標準プロトコールによって行った。バクテリア細胞は、停滞期(OD600=3.0)まで成長させてハーベストし、PBSバッファー(2.7mM KCl, 137mM NaCl, 10mM Na2HPO4及び2mM KH2PO4, pH 7.0)で2回洗浄した後、2×107 CFU/mlになるようにPBSバッファに再懸濁した。腹膜炎を誘導させるために100μlのバクテリア懸濁液(約2×106CFU)をマウスに腹腔内感染させて、10%のムチンは使用しなかった。ファージ治療方法のために、感染を施して6〜12時間後にPBSバッファー内に2×106(1のMOI)及び2×107(10のMOI)PFUを含むファージ溶液を腹腔内または筋肉内に注射した。マウス組織からバクテリアの存在量を計算するために、感染されたマウスは、指定された時間(感染後、0.5, 12, 24, 36及び48時間)でエーテルを吸入させて麻酔させた。肺、肝及び脾臓試料を無菌状態で得て、1mlのPBSバッファーに組織ホモゲナイザ(Yamato Scientific Co., Ltd., Tokyo, Japan)で粉砕した。血液及び粉砕された組織試料の一部をセトリミドアガーに塗抹した後、37℃で24時間培養した。ファージの薬物動力学を測定するために、ファージを、感染されなかったマウスに腹腔内または筋肉内注射して、血液、肺及び肝試料を得て、指定された時間(感染後0.5, 12, 24, 36及び48時間)で粉砕した。組織粉砕物はろ過して、ろ過物は、プラークアッセイを通じてPFU測定に使用した。
ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)実験
ショウジョウバエOregon Rは、従来技術20を少し変形して、25℃でコーンミール-デキストローズ培地[0.93%アガー、6.24%乾燥酵母, 4.08%コーンミール, 8.62%デキストローズ, 0.1%メチルパラベン及び0.45%(v/v)プロピオン酸]を使用して成長させた。簡単に説明すると、ショウジョウバエの感染は、5日齢の成体ショウジョウバエを選んで、背側胸部に10μm針(Ernest F Fullam)を使用して行った。停滞期(OD600=3.0)まで成長させた培養菌から、107CFU/mlを含むPBSで希釈されたバクテリア懸濁液を針の中間まで到達するように刺した。前記希釈で動物当たり50〜200のバクテリアを導入した。感染されたショウジョウバエは、5×107 PFUが含まれた100μlのファージ溶液が敷かれた新しい培地に移した。ショウジョウバエの死亡率は、感染後48時間まで測定した。前記条件で15時間内に死んだショウジョウバエ(5%未満)は、生存率決定に含めなかった。死亡率は、少なくとも5回以上繰り返して測定した。バクテリアの存在量を計算するために、感染されたショウジョウバエは、指定された時間でCO2を利用して麻酔させて、LBに粉砕した。それぞれの感染されたショウジョウバエの粉砕物は、LBアガーに塗抹して、ショウジョウバエ当たりCFUを測定するために、37℃で24時間培養した。D. melanogasterでファージの薬物動力学を測定するために、12時間ファージを摂取させた後、ファージのない新しい培地にショウジョウバエを移しておいた。ショウジョウバエを指定された時間(0.5, 12, 24, 36及び48時間)で粉砕し、組織粉砕物は、ろ過してプラークアッセイによりPFUを測定するに使用した。
統計分析
死亡率において、対照群及び実験群間の差の統計学的有意性を決定するには、カプラン-マイヤログランク統計値を使用した。血液及び器官から回収された生存したバクテリアの数に対する統計学的有意性は、Mann-WhitneyUテストを通じて確認した。
実験結果
P. aeruginosaに対する新しいCaudovirals目に属するファージ種の確認
P. aeruginosaに特異的なファージは、下水試料から最初に分離されて、ソウル及びソウル近郊で数回分離した。ファージの最初分離時、溶解性ファージの特徴である識別できる大きいプラークの形成有無に基づいて、それらの溶解活性をスクリーニングした。本発明者らは、MPK1乃至MPK6と命名したP. aeruginosaストレインPAO1に対する6種の潜在的な溶解性ファージをプラークの大きさ(37℃で18時間培養して直径3mm以上であるもの)及び透明度に基づいて選別した(図2)。本発明者らは、これらの6種のファージを、透過電子顕微鏡を使用して形態を観察した。ビリオン構造に基づいて、MPK1乃至MPK5は、約70nm直径のicosahedralヘッド及び約110nm長さの収縮性繊維質のテイルを有したことを確認した(結果を示さない)。MPK6は、Myoviridae family(Caudovirales目)に属するファージと類似したヘッドを有するが、10nm以下の長さの短いテイルを有していたため(図1)、これは、形態タイプCのPodoviridae family(Caudovirales目)のサブデビジョンC1に属することを確認した1,2,8。結論的に、本発明者らが分離したファージは、P. aeruginosaに対して溶解性を示した。本発明者らは、前記ファージMPK1及びMPK6を選択して次の実験に使用して、MPK6をPodoviridae MPK6と命名した。この中、MPK6を寄託機関韓国微生物保存センターに2009年1月21日付にて寄託して、寄託番号KCCM 11044Pを付与された。以後、上述のMPK6を、国際出願のために2009年10月12日付にて転換し、寄託番号KCCM 11044Pを付与された。
ファージMPK6の受容体
P. aeruginosaの表面受容体の多い数は、バクテリオファージ受容体と関連がある。特に、タイプIVピライ(TFP)は、フィラメント型ファージPf6、単一鎖RNAファージPP78、ブラドリB-タイプファージP04及びMP22のような潜在性形質導入ファージ13を含んだ多様なP. aeruginosaファージの主要受容体として機能をすると知られている。
リポポリサッカライド(LPS)は、ファージ受容体として作用する分子であって、LPS内の詳細な分子的成分は、まだ明確に明かされていない状態である。但し、LPSの核心部位がファイ(phi)PLS27及びファイCTXのファージ受容体として作用するという事実だけが知られている15,39。LPSがMPK6の受容体として作用できるかどうかを確認するために、本発明者らは、PAO1ストレイン由来のLPS突然変異体を使用した：rmd(A-ポリサッカライドの欠乏)、wbpM(B-ポリサッカライドの欠乏)及びrmlC(核心-ポリサッカライドの欠乏、及びA-及びB-ポリサッカライドの欠乏)。図2から分かるように、ファージMPK6は、全て野生型及びrmd バクテリアで鮮明なプラークを形成したが、rmlCバクテリアでは、プラークを形成できなかった。じたがって、LPSのB-ポリサッカライドは、MPK6がPAO1バクテリア内に入るに最も重要な受容体であると考えられる。
インビトロでファージMPK6の溶解活性
ファージMPK6の溶解活性は、ファージ生活周期においてシングルステップ生長曲線に基づいて調べた。感染比(multiplicity of infection, MOI)が1であるMPK6が含まれた培地でP. aeruginosa PAO1(約107CFU)を培養した。生存したバクテリアの数は、120分間MPK6と培養後、約103CFUに漸次的に減少したが(図3)、これは、ファージMPK6がP. aeruginosa PAO1に対して潜在的な溶解活性を有していることを意味する。したがって、ファージMPK6によるインビトロで生長阻害の能力は、P. aeruginosaによる実験的な感染(インビボ)に対抗した抗バクテリア効能を評価できるようにする結果である。
マウスにおいてファージMPK6の薬物動力学(pharmacokinetics)
治療効能を評価する前に、本発明者らは、腹腔内または筋肉内経路の中、どの経路がマウスにおいてファージを運搬するによりよいかを決定するために、ファージMPK6の薬物動力学を調べた。5×107 PFUのファージを、感染されなかったマウスに腹腔内または筋肉内経路を通じて注入した。ファージ試料を腹腔内または筋肉内に注入されたグループからそれぞれ3匹のマウスを感染後、0.5, 12, 24, 36及び48時間で安楽死させた。器官(肝及び肺)及び血液(ml当たり)からファージの数を計算した(図4)。調査した組織において、他の経路によりファージMPK6を注射後、相対的なPFUレベルのパターンが一貫されたことを観察することができたが(筋肉内>腹腔内)、これは、P. aeruginosaによる火傷感染に対して108 PFUのファージカクテルを使用した従来の研究とも一致した23。全ての条件において、ファージ注射直後(30分)にはほぼ等しい数のファージが運搬された。しかし、MPK6が筋肉内経路により運搬された場合は、血液からほとんど回収されなかった(図4A)。このような結果から、P. aeruginosaファージMPK6は、マウスにおいて類似した薬物動力学を有しているということを確認することができる。
マウス腹膜感染に対するMPK6の治療効能
ファージMPK6を、P. aeruginosaストレインPAO1の感染6時間後に腹腔内または筋肉内経路により、互いに異なる量(MOIが1または10)になるように注射した。バクテリアを処理しなかったマウスと比較すると、感染されたマウスにおいてMOIが10の場合に著しく保護されることを確認することができた(図5A及び図5B)。筋肉内経路を通じてMOIが1になるように注射したMPK6では、バクテリアに対して非常に保護されていることを観察することができなかった(図4A; p=0.316)。図4から分かるように、マウスでは筋肉内注射の薬物動力学がさらによい効果を示した。本発明者らは、腹膜炎モデルを使用したため、これは、腹腔内注射が感染部位に直接的でより効果的にファージを運搬できることを示す。腹膜炎は、感染された動物の肝においてバクテリアの浸透を伴うため5、ファージの注射がバクテリアの増殖を阻害するかどうかを確認するために、本発明者らは、脾臓、肺及び肝を含んだマウス器官においてバクテリアの存在量を確認した。感染24時間後に生きている動物から器官試料を採取した。図5Cから分かるように、ファージの処理は、バクテリアの存在量を非常に減少させた；MPK6の処理は、肝、脾臓及び感染24時間後の生きているマウスから採取した肝において、バクテリアの量が少し減少(約2ログ程度)した。このような結果は、ファージMPK6がインビボでバクテリアの増殖を阻害することにより、P. aeruginosa-誘導性腹膜炎を調節するに非常に効果的であることを示す。
ショウジョウバエにおいてMPK1及びMPK6ファージの薬物動力学及び治療効能
ショウジョウバエの全身感染モデルは、バクテリア感染性メカニズムを研究するためのよいシステムであって、Murine腹膜炎モデル(107CFU)に比べ、少ない量のP. aeruginosa バクテリア(50〜200 CFU)でも感染させることができる。本発明者らの最適化された実験条件下で約107CFUまでのバクテリアの増殖による全身感染の結果で、48時間内に死亡を誘導する18,20。P. aeruginosaに対してファージ治療方法を評価するためのD. melanogasterモデルを設立するために、本発明者らは、5×107PFUを含むファージ試料を、2.5mlのコーンミール培地を含んだショウジョウバエバイアルに敷いて、ショウジョウバエバイアル内のショウジョウバエグループ(n=50)にファージを摂取させた。
本発明者らは、まずショウジョウバエ組織からファージの持続性及び潜在的な毒性を測定するために、ショウジョウバエに摂取させた両ファージの薬物動力学を調べた。感染されていないショウジョウバエは、各ファージ(5×107PFU)を摂取させて、ファージのない新しい培地に移した。図6Aから分かるように、ファージはファージを摂取したショウジョウバエから回収されて、これは、前記条件でファージが成功的にショウジョウバエに感染されたことを示す。約104PFUの量のMPK1及びMPK6ファージが単なる12時間の摂取により移転された。また、48時間でPFUが約3ログ程度に漸次的に減少したにもかかわらず、MPK1は、新しい培地に移された後、48時間まで持続された。興味深いことに、MPK6は、ほとんど回収されず、新しい培地に移した後、バクテリアの感染がない状態で12時間以前に消えた。しかも、MPK1及びMPK6ファージは全て、12時間摂取によっても全く毒性がなかった。72時間以上ファージを摂取させても、死んだショウジョウバエは発見されなかった。このような結果は、ショウジョウバエ感染に対するファージ治療方法において、ファージを摂取させることが、ファージを注入する代案として使用できることを示す。
次は、ショウジョウバエ感染モデルにおいて、PAO1-誘導死亡率及び増殖からの保護効果に基づいて、両ファージの抗バクテリア効能を評価した。50 PAO1-感染ショウジョウバエを収容できるショウジョウバエバイアルに5×107PFUのバクテリアを投与して、MPK1及びMPK6ファージを注入した(即ち、一匹のショウジョウバエに対して106 ファージを摂取させた)。ファージを摂取しなかったショウジョウバエと比較すると、感染されたショウジョウバエは、各ファージにより非常に保護されたことを確認することができた(図6B)。ショウジョウバエ組織においてMPK1の薬物動力学がよりよいことが観察されたにもかかわらず、両ファージで類似した効能を観察することができた(p=0.637)。
本発明者らは、ファージを摂取したショウジョウバエ組織において、バクテリアの増殖に対する保護効果を調べた。図6から分かるように、MPK6及びMPK1が前記感染条件でバクテリアの増殖を阻害した。感染されたショウジョウバエが死ぬP. aeruginosaの107CFU(即ち、5ログ増加)に到達したため20、PAO1-誘導性致死に抵抗するに、ショウジョウバエが死に始める2ログ以上の阻害だけでも十分であった。このような結果は、MPK1及びMPK6ファージがインビボでバクテリアの増殖を阻害することにより、P. aeruginosaにより誘導されたショウジョウバエの致死を調節するに非常に効果的であることを提示する。
論議事項
ファージを利用した治療方法は、80余年前に最初に紹介されたが14、効果的なファージ治療システムの開発において、ファージに対するバクテリアの抵抗可能性が障害となってきた21。しかし、Smithグループは、以前研究で腸疾患性大腸菌及びその父母のファージ-抵抗性突然変異体により生成された感染は、父母バクテリアに対して活動性があるファージ由来のファージ突然変異体を使用して成功的に調節することができると明かした31,32。バクテリアがファージ抵抗性を獲得するとしても、新しいこれらのバクテリアに効果的に作用するファージ突然変異体は、下水処理植物及び病原汚水またはUV露出のような実験的操作を通じて研究者らに容易に接近が可能である22。ファージ処理の間に抵抗性が発生することを防ぐためのファージカクテルのような互いに異なるファージ種の混合物は、既によく知られた方法である。したがって、ファージ治療方法は、抗生剤抵抗性の時代においてバクテリア感染を調節できる容易で且つ重要な方法と言える。
マウスにおいて、P. aeruginosaによる腸由来敗血症及び火傷感染を含んだ実験的感染に対するファージ治療方法の多様なケースが既に報告されている23,26。最近ピオシン(pyocin)治療方法の研究は、マウス腹膜炎モデルに基づいている29。このような実験的感染モデルは、P. aeruginosa感染による複雑な病理生理学的メカニズムを考慮すると、非常に適切である。さらに重要なことは、P. aeruginosaが哺乳動物、昆虫、虫及び植物など系統学的に多様な宿主を感染させることができる多宿主病原菌であるということである。したがって、抗微生物剤の抗バクテリア効能を確認して評価するためには、多様な感染モデルが開発される必要がある。本発明者らは、腹腔内または筋肉内に注射されたMPK6の抗バクテリア効能を評価するために、P. aeruginosaの鼻腔注入によるマウスにおける急性肺感染について試験した。しかし、前記試験で肺感染由来の死亡は全く防ぐことができず、これは、血液または肝を通じての注射経路に比べ、肺へのファージ運搬程度が低かったからだと考えられる。したがって、P. aeruginosaによる特別な感染条件は、最適の抗バクテリア効能を保障するための治療用ファージの薬物動力学的程度に根拠した特別な注入条件を必要とする。
たとえ現在のファージ治療方法がファージのバクテリアを溶解できる活性を含んでいるが、ある溶原性ファージは、近い将来に病原性を調節する代替モデルとして潜在的に考慮され得る。Zegansグループは、溶原性形態として宿主たんぱく質と反応し、P. aeruginosaの潜在性ファージであるMS3が群集移動及びバイオフィルム形成を含んだ集団行動をするように変形するということを報告した40。バイオフィルム形成及びクオラムセンシングのような群集行動は、P. aeruginosaの生存メカニズム及び/または病原性において重要であるため11、このような性質を有する溶原性ファージを開発するファージ治療方法の可能性は、生きている動物感染モデルを使用して試験してみる必要がある。抗バクテリア治療方法のための潜在性ファージを利用するに最も大きい障害物は、それらが宿主のDNAに相対的に無作為的に挿入されるということであって、潜在的にバクテリアの病原性特質に予想できなかった結果が出る場合があるということである24。しかし、これに対する直接的な証拠は、まだ明かされておらず、本発明者らは、感染された宿主において潜在的ファージまたは溶原性ファージ及びバクテリア間の機能的及び複雑な相互作用がそれぞれにおいて有利か不利かを予想することができない。したがって、本発明者らは、予想できなかった突然変異(潜在的ファージ)及び細胞溶解由来のエンドトキシン生成(溶解性ファージ)から出る潜在的な副作用に対して気遣いながら、潜在的ファージ及び溶解性ファージまたは両方の混合の抗バクテリア効能を評価し始めた。
抗バクテリア治療方法のための潜在性ファージを利用するに最も大きい障害物は、それらが宿主のDNAに相対的に無作為的に挿入されるということであって、潜在的にバクテリアの病原性特質に予想できなかった結果が出る場合があるということである24。しかし、これに対する直接的な証拠は、まだ明かされておらず、本発明者らは、感染された宿主において潜在的ファージまたは溶原性ファージ及びバクテリア間の機能的及び複雑な相互作用がそれぞれにおいて有利か不利かを予想することができない。したがって、本発明者らは、予想できなかった突然変異(潜在的ファージ)及び細胞溶解由来のエンドトキシン生成(溶解性ファージ)から出る潜在的な副作用に対して気遣いながら、潜在的ファージ及び溶解性ファージまたは両方の混合の抗バクテリア効能を評価し始めて、これは、C. elegans及びショウジョウバエのような非哺乳動物性の生きている動物感染モデルを広く使用することにより容易にできる。P.aeruginosaの感染に対する多様なファージの抗バクテリア効能を測定するためのショウジョウバエモデルの最適化は、抗微生物治療に対してさらに広い視野を持たせて、バクテリアの病原性及び宿主免疫間の特別な連絡体系を調律するプラットフォームを提供するだろう。
本発明の特徴の一つは、本発明者らがインビボで抗バクテリア活性を評価するための新しい治療用動物モデルとして、非哺乳動物モデルであるショウジョウバエを利用したということである。本発明者らは、現在ファージが注射される方法及びショウジョウバエ組織内でどの部位に特異的に位置するかなど、このモデルを最適化するための後続研究を続けている。最近の研究で、線虫を利用した非哺乳動物の生きている動物感染モデル、即ち、Enterococcus faecalisまたはCandida albicansに対する新しい抗微生物化合物を分離するために、超高速スクリーン(high through-put screen)によるCaenorhabditis elegans感染モデルが成功的に開発された9,25。非哺乳動物モデル宿主を利用する最も大きい長所は、研究費及び実験スケールが著しく減ったということである。これは、非哺乳動物モデル動物の小さい大きさが、実験のセッティングにおいて病原菌及び抗非生物の量及び空間を少なく占めて、結果的に化学物ライブラリから超高速分析を可能にするからである。また他の長所は、目標微生物の成長を阻害しないが、病原性経路を緩和させて、または宿主の免疫反応を増進させる新しい抗微生物化合物が分離できるということである。たとえ現在のファージ治療方法がファージのバクテリアを溶解できる活性を含んでいるが、ある溶原性ファージは、近い将来に病原性を調節する代替モデルとして潜在的に考慮され得る。Zegansグループは、溶原性形態として宿主たんぱく質と反応し、P. aeruginosaの潜在性ファージであるMS3が群集移動及びバイオフィルム形成を含んだ集団行動をするように変形するということを報告した40。バイオフィルム形成及びクオラムセンシングのような群集行動は、P. aeruginosaの生存メカニズム及び/または病原性において重要であるため11、このような性質を有する溶原性ファージを開発するファージ治療方法の可能性は、生きている動物感染モデルを使用して試験してみる必要がある。

Claims (4)

  1. 緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)に対して溶解活性を有する、バクテリオファージＭＰＫ６(寄託番号:KCCM 11044P)。
  2. (ａ)請求項１に記載のバクテリオファージＭＰＫ６の薬剤学的有効量、及び(ｂ)薬剤学的に許容される担体を含む緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)感染症の治療用薬剤学的組成物。
  3. 前記緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)感染症は、嚢胞性線維症、中耳炎、角膜炎、内眼球炎(endophthalmitis)、菌血症、火傷の感染、肺炎、脳膜炎、腹膜炎または敗血症であることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)感染症は、肺炎、脳膜炎、腹膜炎または敗血症であることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
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