JP5106743B2

JP5106743B2 - Identification method of rice varieties using microsatellite markers

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Publication number: JP5106743B2
Application number: JP2003168197A
Authority: JP
Inventors: 浩松本; 史子戸澤; 光伸島津; 聖一神保; 博昭石古
Original assignee: LSI Medience Corp
Current assignee: LSI Medience Corp
Priority date: 2002-06-13
Filing date: 2003-06-12
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2023-06-12
Also published as: JP2004065251A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、イネの品種を識別する方法に関する。この方法は、種子の純度管理や流通しているコメの品種識別に利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
日本で栽培されている粳米は温帯ジャポニカに分類される品種であり、現在２００種を越える品種が栽培されている。イネの科学的な品種識別法としては、アイソザイム法、制限酵素断片長多型（RFLP）法、RAPD法、マイクロサテライト法などが知られているが、サティバ種に属し、ジャポニカ亜種に分類される日本で栽培されている粳米を識別することは容易ではなく、品種を特定する有効な方法は知られていない。さらに、精米が対象となる場合には、発芽能力もなく、酵素活性が高い糖層もなく、イネの品種判別法として報告されている交配稔実性・草型による方法や酵素多型による方法を適用することはできず、精米によって粒形を変えることも可能なため粒形による類別による方法を適用することも困難である。
【０００３】
現在お米の流通段階で品種を識別する方法として用いられているものは、平成１２年４月に施行された改正JAS法の「玄米及び精米品質表示基準」である。この基準においても、農作物検査官による肉眼の検査が実施されているのみであり、科学的な検証のもとに品種の鑑定が実施されている訳ではない。イネもしくはお米の科学的な品種識別を困難にしている理由は、日本において栽培されているジャポニカに分類される極めて多数の品種が、数種の在来品種をベースとした極近縁種間の交配によって育成されてきたものであり、これらの遺伝的背景が極めて類縁していることによる。
【０００４】
真核生物のマイクロサテライトとは、ゲノム中に散在する単純な塩基配列の繰り返し領域のことであり、繰り返し数に依存するこの領域の長さは極めて多型性に富むことが知られている。近年、イネゲノムの解析により多くのマイクロサテライトが同定されており、該マイクロサテライト両側に位置する特異的な塩基配列を含むマイクロサテライトマーカーが開発された。マイクロサテライトマーカーを遺伝子増幅法で検出することができる特異的な塩基配列が、プライマー配列として非特許文献１〜４に公開されている。最近の文献（例えば、非特許文献５参照）では、イネのマイクロサテライトマーカーの2740個が染色体上にマップされており、平均して157kbpに1つ存在することが報告されている。また同文献の図１において、モチーフ種別の存在割合はpoly（GA）が36%、poly（AT）が15%、poly（CCG）が8%となっている。これらのマイクロサテライトマーカーを特異的に増幅するプライマー（オリゴヌクレオチド）を利用することにより、イネの野生種と栽培種であるサティバ種およびグラベリマ種が識別できるのみならず、サティバ種のインディカとジャポニカの亜種も識別できることが知られている。また、ATまたはTAが５回以上繰り返された配列を有するマイクロサテライトマーカーを用いると、日本で栽培される５９品種の識別が可能なことが示されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
しかしながら、日本で栽培されている極近縁なジャポニカ種の品種間において、この他のどのマイクロサテライトマーカーが多型性に富み、品種の識別・特定に有効なマイクロサテライトマーカーとなりえるか否かについては全く不明であった。さらに、品種の識別・特定に有効なマイクロサテライトマーカーを選択し、繰り返し数に依存する多型性に基づくデータベースを作成し品種識別に利用する試みはなされていなかった。
【０００６】
【特許文献１】
特開平10−57073号公報
【非特許文献１】
H.Akagi et.al、「Theoretical and Applied Genetics」、(1996年)、 vol.93、 p1071-1077
【非特許文献２】
X.Chen et.al、「Theoretical and Applied Genetics」、(1997年)、 vol.95、 p553-567
【非特許文献３】
S.Temnykh et.al、「Theoretical and Applied Genetics」、(2000年)、 vol.100、 p697-712
【非特許文献４】
コーネル大学（ウェブサイト提供元）、“マイクロサテライトマーカー（Microsatellite Markers）”、［online］、（2002年）、[平成15年6月11日検索]、インターネット<URL: http://www.gramene.org/microsat>
【非特許文献５】
S.R.McCouchら、「DNA Research」、(2002年)、 vol.9、 p199-207
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、従来、熟練と経験を要する検査で行われてきたイネまたは玄米等の品種識別に科学的で客観的な方法を導入することである。さらに、日本で広く流通している温帯型ジャポニカ間の交雑によって育種されているイネの極近縁品種を識別する方法を提供することである。また、本発明の課題は、イネの品種の識別を支援するプログラムを提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
日本において広く流通しているジャポニカに分類される極めて多数の品種は、数種の品種から極近縁種間の交配によって育成されてきたものであり、これらの遺伝的類縁性は極めて高い。本発明者らは、遺伝的類縁性は極めて高く、遺伝的多型性の低い温帯型ジャポニカの品種識別を可能にする方法について鋭意検討を加えたところ、特定のマイクロサテライトマーカーを多数用いて、それらの単純な塩基配列の繰り返し数を計測することによって、品種識別が困難とされていた温帯型ジャポニカの品種識別が可能になることを見出した。
【０００９】
すなわち、既知のマイクロサテライトマーカーから温帯型ジャポニカの品種識別に有用な多型性に富むマイクロサテライトマーカーを選別し、これらのマーカーを組み合わせて用いることによって、日本で広く流通している温帯型ジャポニカ、日本型品種を科学的且つ客観的に識別できることを見出した。さらに、マイクロサテライトマーカーの多型性に基づくデータベースを作成することによって、選択すべきマイクロサテライトマーカーの選択が容易となり、困難であった温帯型ジャポニカの品種識別が簡便に行えることを見出した。これらの知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
（１）イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースを準備する工程、品種を識別すべきイネの組織から抽出したＤＮＡを、前記データベースに含まれるマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を前記データベースと照合する工程を含み、マイクロサテライトマーカーの少なくとも一つ以上が、GA、ATT、CTT、GT、(AT及びGT)、(TAT及びCTT)、(TAT及びATT)、GAA、AAG、ATAC、TTA、TATG、ATAG、TTA、ATA、TCTA、ATCT、TACAまたはTATCの繰り返しをモチーフに含むものである、イネの品種を識別する方法。
【００１１】
（２）イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースに基づいて、前記品種から選ばれる１以上の品種の識別に必要十分なマイクロサテライトマーカーを選択する工程、品種を識別すべきイネの組織から抽出したＤＮＡを、選択されたマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を、前記データベースの選択されたマイクロサテライトマーカーに対応する部分と照合する工程を含み、マイクロサテライトマーカーの少なくとも一つ以上が、GA、ATT、CTT、GT、(AT及びGT)、(TAT及びCTT)、(TAT及びATT)、GAA、AAG、ATAC、TTA、TATG、ATAG、TTA、ATA、TCTA、ATCT、TACAまたはTATCの繰り返しをモチーフに含むものである、イネの品種を識別する方法。
【００１２】
（３）イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースを準備する工程、品種を識別すべきイネの組織から抽出したＤＮＡを、前記データベースに含まれる一部のマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を前記データベースと照合する工程、照合により多型の型が全て一致した品種を検索する工程、検索された品種内で多型の型が異なるマイクロサテライトマーカーを検索する工程、前記ＤＮＡを、検索されたマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を前記データベースと照合する工程を含み、マイクロサテライトマーカーの少なくとも一つ以上が、GA、ATT、CTT、GT、(AT及びGT)、(TAT及びCTT)、(TAT及びATT)、GAA、AAG、ATAC、TTA、TATG、ATAG、TTA、ATA、TCTA、ATCT、TACAまたはTATCの繰り返しをモチーフに含むものである、イネの品種を識別する方法。
【００１３】
（４）前記データベースが、第１表に示す品種と、第２表に示すマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けた第３表に示すデータベースである（１）〜（３）のいずれかの方法。
【００１４】
（５）マイクロサテライトマーカーの多型の分析を、試料から抽出したＤＮＡを鋳型とし、第２表に示すプライマー対を用いてＰＣＲにより増幅した産物の断片長の測定により行う（４）の方法。
【００１５】
【表１】

【００１６】
【表２】

【００１７】
【表３】

【００１８】
【表４】

【００１９】
（６）イネの組織から抽出したＤＮＡを、第４表のマーカー欄に示す少なくとも一つのマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を、第４表の該マーカーに対応する型欄に示す型と照合する工程を含む、イネの品種の識別方法。
【００２０】
【表５】

【００２１】
（７）識別するイネのジャポニカ種の品種の候補の範囲の入力を受ける手段、前記範囲から選ばれる識別するイネのジャポニカ種の品種の入力を受ける手段、
イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースにおいて、入力された候補の範囲内で、入力された品種が識別されるのに必要十分なマイクロサテライトマーカーを検索する手段、
検索されたマイクロサテライトマーカーを出力する手段
として機能させるための、イネの品種識別支援プログラム。
【００２２】
（８）識別するイネのジャポニカ種の品種の入力を受ける手段、
イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースにおいて、入力された品種が識別されるのに必要十分なマイクロサテライトマーカーを検索する手段、
検索されたマイクロサテライトマーカーを出力する手段
として機能させるための、イネの品種識別支援プログラム。
【００２３】
（９）識別するイネのジャポニカ種の品種の候補の入力を受ける手段、
識別するイネのジャポニカ種のマイクロサテライトマーカーの多型の型の入力を受ける手段、
イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースにおいて、入力された品種の候補を検索する手段、
検索された候補内で、入力されたマイクロサテライトマーカーの多型の型と一致する型を有する候補を検索する手段、
検索された候補が１つである場合には、検索された候補の品種名を出力し、検索された候補が１つでない場合には、検索された候補の品種名のリストとともに、情報が入力されたマイクロサテライトマーカーの多型以外であって、検索された候補に於いて多型の型が一致しないマイクロサテライトマーカーとその多型の型を出力する手段、
として機能させるための、イネの品種識別支援プログラム。
【００２４】
（１０）前記データベースが、第１表に示す品種と、第２表に示すマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けた第３表に示すデータベースである（７）〜（９）のいずれかのプログラム。
【００２５】
（１１）（７）〜（１０）のいずれかのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【００２６】
【発明の実施の形態】
本発明の、イネの品種を識別する方法は、イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースを準備する工程、イネの品種を識別すべき試料から抽出したＤＮＡを、データベースに含まれるマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を前記データベースと照合する工程を含む。
【００２７】
本発明においては、マイクロサテライトマーカーの少なくとも一つ以上が、GA、ATT、CTT、GT、(AT及びGT)、(TAT及びCTT)、(TAT及びATT)、GAA、AAG、ATAC、TTA、TATG、ATAG、TTA、ATA、TCTA、ATCT、TACAまたはTATCの繰り返しをモチーフに含むものである。また、マイクロサテライトマーカーの少なくとも一つ以上が、GA、ATT、CTTまたはGTの繰り返しをモチーフに含むものであってもよい。なお、前記の(AT及びGT)はATとGTがランダムに繰り返されることを示し、(TAT及びCTT)、(TAT及びATT)についても同様である。マイクロサテライトマーカーのモチーフとは、マイクロサテライトマーカーを特徴付ける繰り返し配列を意味する。このような、特定の配列をモチーフに含むマイクロサテライトマーカーは、公知のものから選択可能である（例えば、従来の技術の欄で引用したTheor. Appl. Genet. (2000) 100:697-712等参照）。上記の特定のマイクロサテライトマーカーのモチーフにおける繰り返し配列の繰り返し数は、通常には５〜４０である。本発明において好ましいマイクロサテライトマーカーは、イネのジャポニカ種間でより多くの多型を有するマイクロサテライトマーカーであり、より好ましくは第２表に挙げられたRM9、RM48、RM144、RM223、RM247、RM253、RM257、RM259、RM264、RM320、RM335及びRM336、並びにその他のマイクロサテライトマーカーである。
【００２８】
本発明のデータベースには、上記の特定のマイクロサテライトマーカーが１以上含まれていればよく、そのほかのマイクロサテライトマーカーも含まれていてもよい。
【００２９】
イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースとしては、品種毎のレコードに、各サテライトマーカーの多型の型を格納したデータベースが挙げられる。
【００３０】
本発明において用いられるデータベースは、好ましくは、前記データベースが、第１表に示す品種と、第２表に示すマイクロサテライトマーカーとを関連付けた第３表に示すデータベースである。
【００３１】
本発明においては、識別すべき品種によってあるいは識別すべき品種の数によっては、識別に必要十分のマイクロサテライトマーカーの数が少なくてもよいこともある。このような場合、多数の品種に関して準備されたデータベースの一部を用いて品種の識別を行ってもよい。従って、本発明は、イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースに基づいて、前記品種から選ばれる１以上の品種の識別に必要十分なマイクロサテライトマーカーを選択する工程、品種を識別すべきイネの組織から抽出したＤＮＡを、選択されたマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を、前記データベースの選択されたマイクロサテライトマーカーに対応する部分と照合する工程を含む、イネの品種を識別する方法も提供する。
【００３２】
例えば、データーベースとして第３表のデーターベースが準備された場合、このデーターベースによれば、第１表に示した品種内においてコシヒカリを識別するためには、第２表に示したマイクロサテライトマーカーの、例えばRM9, RM223, RM247, RM253, RM257, RM48の組合せ、RM253, RM153, MRG6545, MRG6288, MRG4653, MRG4931の組合せ、またはRM253, RM153, MRG6508, MRG5929の組合せを用いれば良いことが判るので、これらのマイクロサテライトマーカーについて多型の分析を行えばよい。また同様にアキタコマチを識別するには、例えばRM253, RM153, RM333, MRG6545の組合せ、またはRM253, RM153, RM264, MRG6545の組合せを用いれば良いことが判るので、これらのマイクロサテライトマーカーについて多型の分析を行えばよい。上記マイクロサテライトマーカーの組合せは、はえぬきを識別する場合においても同様である。また同様にひとめぼれを識別するには、例えばRM253, RM153, RM320, MRG6545の組合せ、RM253, RM48, RM264, MRG6545の組合せ、RM253, RM153, RM72, MRG5929の組合せ、またはRM253, RM153, MRG4851, MRG5929の組合せを用いれば良いことが判るので、これらのマイクロサテライトマーカーについて多型の分析を行えばよい。また同様にきらら397を識別するには、例えばRM253, MRG4653, MRG6545の組合せ、RM253, MRG5929, MRG6545の組合せ、またはRM253, MRG6237, MRG6545の組合せを用いれば良いことが判るので、これらのマイクロサテライトマーカーについて多型の分析を行えばよい。
【００３３】
また、本発明においては、識別に必要十分なマイクロサテライトマーカーが判明していない場合には、一部のマイクロサテライトマーカーについて多型の分析を行い、その結果をデータベースと照合して、さらに分析すべきマイクロサテライトマーカーを選択するようにしてもよい。従って、本発明は、イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースを準備する工程、品種を識別すべきイネの組織から抽出したＤＮＡを、前記データベースに含まれる一部のマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を前記データベースと照合する工程、照合により多型の型が全て一致した品種を検索する工程、検索された品種内で多型の型が異なるマイクロサテライトマーカーを検索する工程、前記ＤＮＡを、検索されたマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を前記データベースと照合する工程を含む、イネの品種を識別する方法も提供する。
【００３４】
第２表に示すマイクロサテライトマーカーには、その多型の型が、第１表に示す品種の内の一つの品種に固有であるものが存在する。第４表に、一つの品種に固有の型を有するマイクロサテライトマーカーとその型を示す。このようなマイクロサテライトマーカーの型が存在する品種を識別する場合には、第１表に示す品種の内の２種以上が候補であるとき、そのマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析し、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型が、品種に固有のものであれば、そのマイクロサテライトマーカーのみの多型の分析で、品種を識別することができる。例えば、RM72の多型を分析する場合には、その型がCであれば、山田錦であると識別でき、MRG336の多型を分析する場合には、その型がCであれば山田錦、Eであればコガネマサリであると識別できる。
【００３５】
従って、本発明は、イネの組織から抽出したＤＮＡを、第４表のマーカー欄に示す少なくとも一つのマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を、第４表の該マーカーに対応する型欄に示す型と照合する工程を含む、イネの品種の識別方法も提供する。
【００３６】
DNAを抽出するための組織としては、イネの根、葉、種子など植物体のあらゆる部分を利用でき、また玄米、精米、炊飯米も用いることができる。DNAの抽出方法としてはそれ自体公知のどの様な方法も用いることができ、粗精製のDNAを用いることもできる。
【００３７】
抽出されたＤＮＡを、マイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する方法としては、公知の方法が採用できる。通常には、抽出されたDNAを鋳型としてマイクロサテライトマーカーをＰＣＲ法によって増幅する。ＰＣＲの方法は公知の方法が採用できる。ＰＣＲに用いるプライマー対はマイクロサテライトマーカーに応じて適宜選択される。第２表に挙げたマイクロサテライトマーカーの場合には、第２表に示したプライマー対が好ましいものとして挙げられる。さらに、増幅されたＤＮＡ断片の分子サイズを電気泳動等によって測定し、その分子サイズによってイネ品種を識別・特定する。このとき、分子サイズを測定する電気泳動方法として、アガロースゲル、変性および非変性のポリアクリルアミドゲルを用いる方法が行える。また、蛍光色素を利用する方法も用いることができる。
【００３８】
本発明の方法は、データベースの作成に用いたイネ品種、好ましくは第１表に示されたイネ品種であれば、イネまたは玄米等コメの流通段階における品種識別ばかりでなく、ハイブリッドライスに用いられた親品種の識別やイネの種子の純度検定にも同様な方法で利用することができる。分子サイズと本数から雑種種子と雑種以外の種子を容易に識別できる。この分析結果を基に、雑種種子の集団に対する雑種以外の種子の混入率を検査することができる。
【００３９】
また、本発明は、本発明の方法の実施を支援するためのプログラムも提供する。
本発明の第１のプログラムは、識別するイネのジャポニカ種の品種の候補の範囲の入力を受ける手段、
前記範囲から選ばれる識別するイネのジャポニカ種の品種の入力を受ける手段、
イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースにおいて、入力された候補の範囲内で、入力された品種が識別されるのに必要十分なマイクロサテライトマーカーを検索する手段、
検索されたマイクロサテライトマーカーを出力する手段
として機能させるための、イネの品種識別支援プログラムである。
【００４０】
上記プログラムのフローチャートを図４に示す。
入力を受ける手段は、キーボード、タッチパネル等の入力装置からの信号を受信する手段により構成できる。ディスプレイ、液晶などの表示装置に品種や多型の候補を表示し、その候補から選択させるように構成することが好ましい。
【００４１】
データベースは、イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とが関連付けられている限り、その構成は制限されず、例えば、品種毎のレコードを有し、各レコードにその品種の各多型の型の情報が格納されているデータベースが挙げられる。データベースにおける検索は公知の方法により行うことができる。検索手段としては、例えば、マイクロソフト社の表計算ソフト「Excel」によりデータベースが用意された場合、そのオートフィルター機能を用いることができる。
【００４２】
出力手段としては、ディスプレイ、液晶表示装置などの表示装置に信号を送信する手段により構成できる。
【００４３】
第３表のデータベースを用いた場合を例に挙げて、さらに具体的に説明する。このデータベースでは、６２品種と、３３種のマイクロサテライトマーカーの多型の型とが関連付けられている。マイクロサテライトマーカーの多型は断片長であるが、第１表に示した６２品種の中で認められる断片長の相違（多型の型）について、それぞれの断片長を記号化（例えば、６種の断片長が有る場合はそれぞれA〜Fの記号を付与）した。また、０はマイクロサテライトマーカーの増幅が確認されなかったことを示している。
【００４４】
候補として第３表に記載の全ての６２品種を入力する。次に、識別すべき品種としてコシヒカリを入力する。６２品種からコシヒカリを識別するのに必要十分なマイクロサテライトマーカーの組み合わせの一つとして、RM9、RM233、RM247、RM253、RM257及びRM48が検索される。この結果、３３種のマイクロサテライトマーカーの多型を分析しなくとも６種の分析のみでコシヒカリを識別でき、イネの品種の識別が効率化される。
【００４５】
また、２種の品種の混合物について品種を識別する場合について説明する。コシヒカリ及びアキタコマチを候補の範囲と入力する。次に識別すべき品種としてコシヒカリを入力する。２品種からコシヒカリを識別するのに必要十分なマイクロサテライトマーカーとしてRM257が検索される。この結果、１種のマイクロサテライトマーカーの分析のみでコシヒカリを識別でき、イネの品種の識別が効率化される。
【００４６】
本発明の第１のプログラムにおいては、データベースを、識別する品種の候補の範囲内で準備し、候補の範囲の入力を受ける手段を省略することもできる。すなわち、識別するイネのジャポニカ種の品種の入力を受ける手段、イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースにおいて、入力された品種が識別されるのに必要十分なマイクロサテライトマーカーを検索する手段、検索されたマイクロサテライトマーカーを出力する手段として機能させるための、イネの品種識別支援プログラムとしてもよい。
【００４７】
本発明の第２のプログラムは、識別するイネのジャポニカ種の品種の候補の入力を受ける手段、
識別するイネのジャポニカ種のマイクロサテライトマーカーの多型の型の入力を受ける手段、
イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースにおいて、入力された品種の候補を検索する手段、
検索された候補内で、入力されたマイクロサテライトマーカーの多型の型と一致する型を有する候補を検索する手段、
検索された候補が１つである場合には、検索された候補の品種名を出力し、検索された候補が１つでない場合には、検索された候補の品種名のリストとともに、情報が入力されたマイクロサテライトマーカーの多型以外であって、検索された候補に於いて多型の型が一致しないマイクロサテライトマーカーとその多型の型を出力する手段、
として機能させるための、イネの品種識別支援プログラムである。
【００４８】
上記プログラムのフローチャートを図５に示す。
入力手段及び出力手段は、入力情報及び出力情報が異なる他は上記第１のプログラムと同様に構成できる。データベースにおける検索は公知の方法により行うことができる。検索手段としては前記と同様に、例えば、マイクロソフト社の表計算ソフト「Excel」によりデータベースが用意された場合、そのオートフィルター機能を用いることができる。
【００４９】
このプログラムによれば、識別すべき品種が不明な場合に、分析すべきマイクロサテライトマーカーを効率的に絞り込むことができる。
【００５０】
本発明のプログラムは、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されていてもよい。コンピュータ読み出し可能な媒体としては、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭなどの記録媒体が挙げられる。
【００５１】
【実施例】
以下に本発明を実施例に基づき詳細に説明する。
【００５２】
【実施例１】
第１表に示す６２品種の日本で流通している温帯ジャポニカの種子または玄米を農業生物資源研究所及び下記の農業試験場等より入手した。これらをそれぞれの品種を代表する基準品種として用いた。
【００５３】
北海道立植物遺伝資源センター
青森県農業試験場
岩手県農業研究センター
山形県立農業試験場
新潟県農業総合研究所
群馬県農業試験場
千葉県農業総合研究センター
石川県農業総合研究センター
愛知県農業総合試験場
岡山県農業総合センター
熊本県農業研究センター
福岡県農業総合試験場
【００５４】
第１表に示す品種の種子または玄米（試料）を１粒ずつ2ml容のチューブに入れ、さらに滅菌超純水を300μl加え、98℃で15分間加温した。その後、これにジルコニアビーズを加え、ミキサーミルMM300（レッチェ製）を用いて粉砕した。50μlの5%キレックス100（Chelex 100、Biorad社）水溶液に粉砕物5μlを加え、激しく振とう混和した後、60℃で30分及び95℃で5分の処理を行い、遠心分離により上清画分を得、DNA粗精製物とした。これをPCRにおける鋳型DNAとして用いた。上記操作を各品種試料に対して、5粒ずつ実施した。
【００５５】
第２表に示すマイクロサテライトマーカーに対応するプライマーを用いてPCRを行った。PCRの条件は、GeneAmp9600システム（Roche diagnostics社）を使用し、30μlの反応液量で行った。反応液30μl中には1μl鋳型DNA，0.75 units AmpliTaq Gold（ロッシュ社）、6 nmole dNTP、 6 pmole 各プライマー、10 mM Tris-Cl（pH 8.3）、50 mM KCl及び2.0 mM MgCl_２が含まれる。PCR条件は、95℃で10分の後、95℃で30秒及び60℃で１分を１サイクルとし、35サイクル反応させた。反応終了後、変性液（40% ホルムアミド、5.6 M尿素）とPCR反応終了液を４：１(容量比)で混合し、95℃で10分間処理後、その5μlを変性ゲル（6％変性ポリアクリルアミドゲル, 50% 尿素, アクリルアミド（モノマー：ビス＝19：1））にて電気泳動に付した。電気泳動終了後、Gelstar（宝酒造）で染色し、それぞれの品種の増幅断片長を測定した。第１表に示した品種内で認められる断片長の相違（多型の型）について、それぞれの断片長を記号化（例えば、６種の断片長がある場合はそれぞれＡ〜Ｆの記号を付与）してデータベース（第３表）を作成した。ここで、０はマイクロサテライトマーカーの増幅が確認されなかったことを示している。
【００５６】
【実施例２】
蛍光標識したプライマーを用いた品種識別方法について以下に示す。
各マイクロサテライトマーカーに対するPCR増幅断片長の異なる品種から抽出したDNAを鋳型にプライマーの5'末端をTexas Redで標識したフォワード(forward)プライマーと未標識のリバース(reverse)プライマーとを用いたPCRを行い、得られた増幅産物の濃度を測定後、各増幅産物を同濃度となるように混合し、各マイクロサテライトマーカーのPCR増幅断片長の分子量マーカーを作製した。
【００５７】
実施例１で用いたものと同じコシヒカリを用いて１粒ずつ、計6粒から実施例１と同様な方法でDNAを抽出した。データベース（第３表）によれば、第１表に示した品種内においてコシヒカリを識別するためには、第２表に示したマイクロサテライトマーカーのRM9、RM223、RM247、RM253、RM257及びRM48を用いれば良いことが判る。また、RM153、RM253、MRG5929及びMRG6508を用いることによってもコシヒカリを識別することができる。これらコシヒカリを識別するに足るプライマーを用いて、実施例１と同様にPCRを行い、反応終了後、変性液（40% ホルムアミド、5.6 M尿素）とPCR反応終了液を４：１(容量比)で混合し、95℃で10 分間処理後、その5μlを変性ゲル（6％変性ポリアクリルアミドゲル, 50% 尿素,アクリルアミド（モノマー：ビス＝19：1）、40cm長）にて電気泳動に付した。上記分子量マーカーについても同様な処理を行い、同時に泳動した。電気泳動終了後、FMBIO（日立ソフトウェアエンジニアリング製）にて反応産物の断片長を解析した。解析結果を図１に示す。断片長測定の結果判定は、データベースに示した結果と同じであり、蛍光プライマーを用いても十分な解析ができることが判明した。
【００５８】
【実施例３】
実施例１で用いたものと同じコシヒカリ及びアキタコマチから実施例１と同様な方法で抽出して得られたDNAの濃度をPICO Green試薬を用いて測定し、濃度比が4:1(20%)、9:1(10%)、19:1(5%)となるように混合した。コシヒカリとあきたこまちを識別できるマイクロサテライトマーカーはデータベース（第３表）よりRM257であることから、これを増幅するプライマーの5'末端をTexas Redで標識したforwardプライマーと未標識のreverseプライマーとを用いたPCRを行い、実施例２と同様に解析した。図２に示す解析結果から明らかなようにコシヒカリとアキタコマチを識別できるマイクロサテライトマーカーRM257を用いることにより、コシヒカリへのアキタコマチの混合率が20%、10%及び5%の全ての場合でアキタコマチ由来蛍光シグナルを検出できた。さらに、コシヒカリ由来蛍光シグナルとアキタコマチ由来蛍光シグナルはFMBIO（日立ソフトウェアエンジニアリング製）付属のソフトウェアを用いて、定量した結果を下記の表に示した。これにより、品種が混合している場合にも本法が有用であることが解った。
【００５９】
【表６】

【００６０】
【実施例４】
流通米を用いて本法による品種識別を試みた。
きらら397が50%、ほしのゆめが50%と表示されている流通米（きらら397 50%、ほしのゆめ50% 伊藤米穀（株））を50g計り取り、ミルを用いて、パウダー状になるまで粉砕した。この粉砕物から、0.5gを15 ml容のチューブに計り取り、2580μlの抽出溶液（10 mM トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、150 mM NaCl、10 mM EDTA pH 8.0、オートクレーブで滅菌）、30μlの10% SDS、300μlの5 M塩酸グアニジン、120μlの20 mg/ml プロテイナーゼKを加え、撹拌しながら56℃で3時間加温した。次に3,000rpmで15分間遠心を行い、上清を2 ml容のマイクロチューブに移した後、再度15,000rpmで5分間遠心を行った。この上清0.5 mlをWizard DNA Clean Up system（プロメガ社）を用いて精製し、粉砕物由来鋳型DNAとした。さらに１粒ずつ、計10粒についても実施例１と同様な方法でDNAを抽出した。
【００６１】
データベース(第３表)より、きらら397とほしのゆめを識別するに足るマイクロサテライトマーカー（RM336）及びそれに対応するプライマーを選択した。プライマーの5'末端をTexas Redで標識したforwardプライマーと未標識のreverseプライマーを用いたPCRを実施例２と同様に実施した。反応終了後、変性液（40%ホルムアミド、5.6 M尿素）とPCR反応終了液を４：１(容量比)で混合し、95℃で10 分間処理後、その5μlを変性ゲル（6％変性ポリアクリルアミドゲル, 50% 尿素, アクリルアミド（モノマー：ビス＝19：1）にて電気泳動に付した。電気泳動終了後、FMBIO（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて蛍光シグナルを検出し、定量した。きらら397由来増幅産物とほしのゆめ由来増幅産物の蛍光シグナルの比は54：46であった。さらに、同時に解析した１粒ずつの解析結果は、図３に示すように、解析した10粒のうち、きらら397と判定されたものは5粒、ほしのゆめと判定されたものは5粒であった。これにより、混合米であっても本法が有用であることが判明した。
【００６２】
【発明の効果】
本発明によれば、ＤＮＡレベルで近縁品種の識別が可能となり、科学的なイネ種子の純度管理や流通しているコメの品種識別が可能になる。また、イネの新品種の育成にも寄与できる。
【００６３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】コシヒカリ基準米のマイクロサテライトマーカーの分析結果を示す。
【図２】マイクロサテライトマーカーの分析結果を示す。
【図３】マイクロサテライトマーカーの分析結果を示す。
【図４】第１の態様の、イネの品種の識別支援プログラムのフローチャートを示す。
【図５】第２の態様の、イネの品種の識別支援プログラムのフローチャートを示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for identifying rice varieties. This method can be used for seed purity control and rice variety identification.
[0002]
[Prior art]
Sticky rice cultivated in Japan is a variety classified as temperate japonica, and over 200 varieties are currently cultivated. Known methods for identifying rice varieties are the isozyme method, restriction fragment length polymorphism (RFLP) method, RAPD method, microsatellite method, etc., but it belongs to the Sativa species and is classified into the Japonica subspecies. It is not easy to identify sticky rice cultivated in Japan, and an effective method for identifying varieties is not known. Furthermore, when milled rice is the target, there is no germination ability, no sugar layer with high enzyme activity, and the method based on cross fertilization / grass type or the method based on enzyme polymorphism, which has been reported as a method for discriminating rice varieties. Can not be applied, and it is also difficult to apply a method based on classification by grain shape because it is possible to change the grain shape by milled rice.
[0003]
The method currently used as a method for identifying varieties at the rice distribution stage is the “Brown Rice and Milled Rice Quality Labeling Standard” of the revised JAS Law, which was enforced in April 2000. Even in this standard, only a visual inspection is carried out by a crop inspector, and varieties are not verified based on scientific verification. The reason why it is difficult to identify rice or rice cultivars is that a very large number of varieties classified as japonica cultivated in Japan are closely related to each other based on several conventional varieties. This is due to the fact that these genetic backgrounds are closely related.
[0004]
A eukaryotic microsatellite is a repetitive region of a simple base sequence scattered in the genome, and the length of this region depending on the number of repeats is known to be extremely polymorphic. In recent years, many microsatellites have been identified by analysis of the rice genome, and microsatellite markers including specific base sequences located on both sides of the microsatellite have been developed. Non-patent documents 1 to 4 disclose specific base sequences that can detect microsatellite markers by gene amplification. In recent literature (for example, see Non-Patent Document 5), 2740 rice microsatellite markers are mapped on the chromosome, and it is reported that one exists at 157 kbp on average. Also, in FIG. 1 of the same document, the presence ratio of the motif type is 36% for poly (GA), 15% for poly (AT), and 8% for poly (CCG). By using primers (oligonucleotides) that specifically amplify these microsatellite markers, not only can we discriminate between wild and cultivated rice species, Sativa and Graberima, but also Sativa Indica and Japonica. It is known that subspecies can also be identified. Further, it has been shown that when a microsatellite marker having a sequence in which AT or TA is repeated 5 times or more is used, 59 varieties cultivated in Japan can be identified (see, for example, Patent Document 1).
[0005]
However, among the closely related japonica cultivars cultivated in Japan, which other microsatellite markers are rich in polymorphisms and can be useful microsatellite markers for variety identification and identification Was completely unknown. Furthermore, no attempt has been made to select a microsatellite marker effective for identifying and specifying a variety, creating a database based on polymorphism depending on the number of repetitions, and utilizing it for variety identification.
[0006]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Laid-Open No. 10-57073
[Non-Patent Document 1]
H. Akagi et.al, `` Theoretical and Applied Genetics '' (1996), vol. 93, p1071-1077
[Non-Patent Document 2]
X. Chen et.al, `` Theoretical and Applied Genetics '' (1997), vol. 95, p553-567
[Non-Patent Document 3]
S. Temnykh et.al, `` Theoretical and Applied Genetics '' (2000), vol. 100, p697-712
[Non-Patent Document 4]
Cornell University (website provider), “Microsatellite Markers”, [online], (2002), [Search June 11, 2003], Internet <URL: http://www.gramene.org/microsat>
[Non-Patent Document 5]
SRMcCouch et al., “DNA Research” (2002), vol. 9, p199-207
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to introduce a scientific and objective method for identification of varieties such as rice or brown rice, which has heretofore been performed by inspections requiring skill and experience. Another object of the present invention is to provide a method for identifying very close varieties of rice bred by crossing between temperate japonicas widely distributed in Japan. Another object of the present invention is to provide a program that supports identification of rice varieties.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
A very large number of varieties classified as japonica widely distributed in Japan have been cultivated by crossing between several varieties and closely related species, and their genetic affinity is extremely high. The inventors of the present invention have made extensive studies on a method that enables cultivar identification of temperate japonica with extremely high genetic affinity and low genetic polymorphism, and using a number of specific microsatellite markers, By measuring the number of repeats of these simple base sequences, it was found that varieties of temperate japonica, which had been difficult to identify, could be identified.
[0009]
That is, by selecting microsatellite markers rich in polymorphism useful for identifying temperate japonica varieties from known microsatellite markers, and using these markers in combination, temperate japonica widely distributed in Japan, We found that Japanese-type varieties can be identified scientifically and objectively. Furthermore, by creating a database based on the polymorphisms of microsatellite markers, it was found that the selection of microsatellite markers to be selected was facilitated, and it was possible to easily identify temperate japonica varieties that were difficult to select. Based on these findings, the present invention has been completed.
[0010]
That is, the present invention provides the following.
(1) A step of preparing a database in which a plurality of rice japonica varieties are associated with polymorphic types of microsatellite markers having polymorphisms within the varieties, and the varieties are extracted from the rice tissue to be identified Analyzing at least one of the microsatellite markers, comprising analyzing the microsatellite marker polymorphism included in the database and comparing the analyzed microsatellite marker polymorphism with the database. The above are GA, ATT, CTT, GT, (AT and GT), (TAT and CTT), (TAT and ATT), GAA, AAG, ATAC, TTA, TATG, ATAG, TTA, ATA, TCTA, ATCT, TACA Or a method for identifying rice varieties that contain TATC repeats as motifs.
[0011]
(2) Identification of one or more varieties selected from the varieties based on a database in which a plurality of rice japonica varieties are associated with polymorphic types of microsatellite markers having polymorphisms in the varieties. Selecting necessary and sufficient microsatellite markers, analyzing DNA extracted from the rice tissue whose cultivar should be identified for polymorphisms of the selected microsatellite markers, and analyzing the number of microsatellite markers analyzed. Collating the type of the mold with a portion of the database corresponding to the selected microsatellite marker, wherein at least one of the microsatellite markers is GA, ATT, CTT, GT, (AT and GT), ( (TAT and CTT), (TAT and ATT), GAA, AAG, ATAC, TTA, TATG, ATAG, TTA, ATA, TCTA, ATCT, TACA or TATC A method for identifying rice varieties.
[0012]
(3) A step of preparing a database in which a plurality of rice japonica varieties are associated with polymorphic types of microsatellite markers having polymorphisms within the varieties, and the varieties are extracted from the rice tissue to be identified Analyzing the polymorphisms of some of the microsatellite markers contained in the database, and comparing the polymorphic types of the analyzed microsatellite markers with the database, Searching for varieties that all match, searching for microsatellite markers having different polymorphic types in the searched varieties, analyzing the DNA for polymorphisms of the searched microsatellite markers, and Including the step of matching the analyzed microsatellite marker polymorphism with the database, At least one of the cross satellite markers is GA, ATT, CTT, GT, (AT and GT), (TAT and CTT), (TAT and ATT), GAA, AAG, ATAC, TTA, TATG, ATAG, TTA, A method for identifying rice varieties that contain ATA, TCTA, ATCT, TACA or TATC repeats as motifs.
[0013]
(4) Any of (1) to (3), wherein the database is a database shown in Table 3 in which the varieties shown in Table 1 are associated with the polymorphic types of microsatellite markers shown in Table 2. the method of.
[0014]
(5) The method according to (4), wherein the polymorphism of the microsatellite marker is analyzed by measuring the fragment length of the product amplified by PCR using the DNA extracted from the sample as a template and the primer pairs shown in Table 2.
[0015]
[Table 1]

[0016]
[Table 2]

[0017]
[Table 3]

[0018]
[Table 4]

[0019]
(6) Analyzing DNA extracted from rice tissue for at least one microsatellite marker polymorphism shown in the marker column of Table 4, and analyzing the analyzed microsatellite marker polymorphism type 4. A method for identifying rice varieties, comprising a step of collating with a type indicated in a type column corresponding to the marker in Table 4.
[0020]
[Table 5]

[0021]
(7) means for receiving input of a range of candidate rice japonica varieties for identification, means for receiving input of a variety of rice japonica varieties for identification selected from the range;
In a database in which multiple varieties of rice japonica varieties are associated with polymorphism types of microsatellite markers having polymorphisms within the varieties, the entered varieties are identified within the range of input candidates. A means of searching for microsatellite markers necessary and sufficient to
Means to output searched microsatellite markers
Rice variety identification support program to function as
[0022]
(8) Means for receiving input of rice japonica variety to be identified,
Microsatellite markers that are necessary and sufficient to identify input varieties in a database in which multiple varieties of rice japonica varieties are associated with polymorphism types of microsatellite markers having polymorphisms in the varieties Means to search,
Means to output searched microsatellite markers
Rice variety identification support program to function as
[0023]
(9) Means for receiving input of candidate rice japonica varieties to be identified,
Means for receiving an input of a polymorphic type of a microsatellite marker of rice japonica species to identify,
Means for searching for a candidate of the input variety in a database in which a plurality of varieties of rice japonica varieties are associated with polymorphic types of microsatellite markers having polymorphisms within the variety;
Means for searching for candidates having a type that matches the polymorphic type of the input microsatellite marker among the searched candidates;
If the number of searched candidates is one, the name of the searched candidate type is output. If the number of searched candidates is not one, information is input together with a list of searched candidate type names. Microsatellite marker other than the polymorphic type of the microsatellite marker that has been searched and the polymorphic type does not match among the searched candidates, and means for outputting the polymorphic type,
Rice variety identification support program to function as
[0024]
(10) Any of (7) to (9), wherein the database is a database shown in Table 3 in which the varieties shown in Table 1 are associated with polymorphic types of microsatellite markers shown in Table 2. Program.
[0025]
(11) A computer-readable recording medium recording the program according to any one of (7) to (10).
[0026]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The method for identifying rice varieties according to the present invention comprises a step of preparing a database in which a plurality of rice japonica varieties are associated with polymorphic types of microsatellite markers having polymorphisms in the varieties, Analyzing DNA extracted from a sample for identifying rice varieties for polymorphisms of microsatellite markers contained in the database, and comparing the polymorphism types of the analyzed microsatellite markers with the database Including.
[0027]
In the present invention, at least one of the microsatellite markers is GA, ATT, CTT, GT, (AT and GT), (TAT and CTT), (TAT and ATT), GAA, AAG, ATAC, TTA, TATG. , ATAG, TTA, ATA, TCTA, ATCT, TACA or TATC repeats as motifs. Further, at least one of the microsatellite markers may include a repeat of GA, ATT, CTT, or GT as a motif. The above (AT and GT) indicates that AT and GT are repeated at random, and the same applies to (TAT and CTT) and (TAT and ATT). The microsatellite marker motif means a repetitive sequence characterizing the microsatellite marker. Such a microsatellite marker including a specific sequence as a motif can be selected from known ones (for example, Theor. Appl. Genet. (2000) 100: 697-712 etc. cited in the column of conventional technology). reference). The number of repeating sequences in the motif of the specific microsatellite marker is usually 5 to 40. Preferred microsatellite markers in the present invention are microsatellite markers having more polymorphism among rice japonica species, and more preferably RM9, RM48, RM144, RM223, RM247, RM253, listed in Table 2. RM257, RM259, RM264, RM320, RM335 and RM336, and other microsatellite markers.
[0028]
The database of the present invention only needs to include one or more of the above specific microsatellite markers, and may also include other microsatellite markers.
[0029]
As a database that associates multiple varieties of rice japonica varieties with the polymorphic types of microsatellite markers that have polymorphisms within the varieties, the polymorphic type of each satellite marker is included in the record for each cultivar. Examples include stored databases.
[0030]
The database used in the present invention is preferably the database shown in Table 3 in which the database shown in Table 1 is associated with the microsatellite markers shown in Table 2.
[0031]
In the present invention, depending on the type to be identified or the number of types to be identified, the number of microsatellite markers necessary and sufficient for identification may be small. In such a case, the product type may be identified using a part of a database prepared for a large number of product types. Therefore, the present invention is based on a database in which a plurality of rice japonica varieties are associated with polymorphic types of microsatellite markers having polymorphisms within the varieties, and one or more selected from the varieties. Selecting a microsatellite marker necessary and sufficient for the identification of the variety, analyzing the DNA extracted from the rice tissue from which the variety is to be identified for polymorphism of the selected microsatellite marker, and the analyzed microsatellite Also provided is a method for identifying rice varieties comprising the step of matching the polymorphic type of the marker with the portion of the database corresponding to the selected microsatellite marker.
[0032]
For example, when the database shown in Table 3 is prepared as a database, the microsatellite marker shown in Table 2 is used to identify Koshihikari in the varieties shown in Table 1. Of RM9, RM223, RM247, RM253, RM257, RM48, RM253, RM153, MRG6545, MRG6288, MRG4653, MRG4931, or RM253, RM153, MRG6508, MRG5929. Polymorphism analysis may be performed on these microsatellite markers. Similarly, in order to identify Akita Komachi, for example, a combination of RM253, RM153, RM333, MRG6545 or a combination of RM253, RM153, RM264, MRG6545 can be used. Can be done. The combination of the microsatellite markers is the same in the case of identifying the engraving. Similarly, to identify a pupil, for example, a combination of RM253, RM153, RM320, MRG6545, a combination of RM253, RM48, RM264, MRG6545, a combination of RM253, RM153, RM72, MRG5929, or RM253, RM153, MRG4851, MRG5929 Since it is understood that a combination may be used, polymorphism analysis may be performed on these microsatellite markers. Similarly, in order to identify Kirara 397, for example, a combination of RM253, MRG4653, MRG6545, a combination of RM253, MRG5929, MRG6545, or a combination of RM253, MRG6237, MRG6545 may be used. A polymorphism analysis may be performed on.
[0033]
In the present invention, when microsatellite markers necessary and sufficient for identification are not known, polymorphism analysis is performed for some microsatellite markers, and the results are collated with a database for further analysis. You may make it select the microsatellite marker which should be. Therefore, the present invention provides a process for preparing a database in which a plurality of rice japonica varieties are associated with polymorphic types of microsatellite markers having polymorphisms in the rice varieties, Analyzing DNA extracted from the tissue for polymorphisms of some of the microsatellite markers contained in the database, and collating the analyzed polysatellite marker polymorphisms with the database. A step of searching for varieties having the same type of type, a step of searching for microsatellite markers having different polymorphic types in the searched varieties, and a step of analyzing the DNA for the polymorphism of the searched microsatellite marker And collating the analyzed microsatellite marker polymorphic type with the database Including also provides a method for identifying a variety of rice.
[0034]
Some of the microsatellite markers shown in Table 2 have a polymorphic type that is unique to one of the varieties shown in Table 1. Table 4 shows a microsatellite marker having a type unique to one variety and its type. When identifying a variety having such a microsatellite marker type, when two or more of the varieties shown in Table 1 are candidates, the polymorphism of the microsatellite marker is analyzed and analyzed. If the polymorphic type of the microsatellite marker is unique to the breed, the breed can be identified by analyzing the polymorphism of only the microsatellite marker. For example, when analyzing the polymorphism of RM72, if the type is C, it can be identified as Yamada Nishiki, and when analyzing the MRG336 polymorphism, if the type is C, Yamada Nishiki, If it is E, it can be identified as a koganesari.
[0035]
Accordingly, the present invention comprises a step of analyzing DNA extracted from rice tissue for at least one microsatellite marker polymorphism shown in the marker column of Table 4, and the analyzed microsatellite marker polymorphism type. Is also provided with a method for identifying rice varieties, including the step of matching the pattern with the type shown in the type column corresponding to the marker in Table 4.
[0036]
As a tissue for extracting DNA, all parts of the plant body such as rice roots, leaves and seeds can be used, and brown rice, polished rice and cooked rice can also be used. As the DNA extraction method, any method known per se can be used, and crudely purified DNA can also be used.
[0037]
As a method for analyzing the extracted DNA with respect to the polymorphism of the microsatellite marker, a known method can be adopted. Usually, a microsatellite marker is amplified by PCR using the extracted DNA as a template. A known method can be adopted as the PCR method. The primer pair used for PCR is appropriately selected according to the microsatellite marker. In the case of the microsatellite markers listed in Table 2, the primer pairs shown in Table 2 are preferable. Further, the molecular size of the amplified DNA fragment is measured by electrophoresis or the like, and rice varieties are identified and specified by the molecular size. At this time, as an electrophoresis method for measuring the molecular size, a method using an agarose gel, a denatured and nondenatured polyacrylamide gel can be performed. A method using a fluorescent dye can also be used.
[0038]
The method of the present invention can be used not only for rice varieties in the distribution stage of rice or brown rice but also for hybrid rice as long as it is the rice varieties used in the creation of the database, preferably the rice varieties shown in Table 1. It can also be used in the same way for identification of parent varieties and purity testing of rice seeds. Hybrid seeds and seeds other than hybrids can be easily distinguished from the molecular size and number. Based on this analysis result, the mixing rate of seeds other than the hybrid to the hybrid seed population can be examined.
[0039]
The present invention also provides a program for supporting the implementation of the method of the present invention.
The first program of the present invention comprises means for receiving an input of a range of candidate rice japonica varieties to be identified,
Means for receiving input of rice japonica varieties that are selected from the range;
In a database in which multiple varieties of rice japonica varieties are associated with polymorphism types of microsatellite markers having polymorphisms within the varieties, the entered varieties are identified within the range of input candidates. A means of searching for microsatellite markers necessary and sufficient to
Means to output searched microsatellite markers
It is a rice variety identification support program to function as
[0040]
A flowchart of the above program is shown in FIG.
The means for receiving input can be constituted by means for receiving a signal from an input device such as a keyboard or a touch panel. It is preferable that the display device such as a display or a liquid crystal display a product type or polymorphism candidate to be selected from the candidates.
[0041]
As long as multiple varieties of rice japonica varieties are associated with polymorphic types of microsatellite markers having polymorphisms within the varieties, the configuration of the database is not limited. There is a database that has records, and each record stores information of each polymorphic type of the product type. Search in the database can be performed by a known method. As a search means, for example, when a database is prepared by Microsoft's spreadsheet software “Excel”, its auto filter function can be used.
[0042]
The output means can be constituted by means for transmitting a signal to a display device such as a display or a liquid crystal display device.
[0043]
A more specific explanation will be given by taking the case of using the database in Table 3 as an example. In this database, 62 varieties are associated with 33 types of microsatellite marker polymorphisms. The microsatellite marker polymorphism is the fragment length, but the fragment length differences (polymorphism types) found in the 62 varieties shown in Table 1 are symbolized (for example, 6 types). (A to F are given to each of the fragments). Moreover, 0 has shown that amplification of the microsatellite marker was not confirmed.
[0044]
All 62 types listed in Table 3 are entered as candidates. Next, Koshihikari is input as a variety to be identified. RM9, RM233, RM247, RM253, RM257 and RM48 are searched as one of the combinations of microsatellite markers necessary and sufficient for identifying Koshihikari from 62 varieties. As a result, Koshihikari can be identified by only 6 types of analysis without analyzing 33 types of microsatellite marker polymorphisms, and rice variety can be identified more efficiently.
[0045]
A case where a variety is identified for a mixture of two types is described. Enter Koshihikari and Akita Komachi as candidate ranges. Next, Koshihikari is input as a variety to be identified. RM257 is searched as a microsatellite marker necessary and sufficient to distinguish Koshihikari from the two varieties. As a result, Koshihikari can be identified only by analyzing one kind of microsatellite marker, and rice variety can be identified more efficiently.
[0046]
In the first program of the present invention, it is possible to prepare a database within the range of candidates for the type to be identified and omit means for receiving input of the range of candidates. That is, in a database that associates a variety of rice japonica varieties with a plurality of varieties of rice japonica varieties and a polymorphic type of a microsatellite marker having polymorphism within the variety, It may be a rice variety identification support program for functioning as a means for searching for a microsatellite marker necessary and sufficient to identify the input variety and a means for outputting the searched microsatellite marker.
[0047]
The second program of the present invention comprises means for receiving input of candidate rice japonica varieties to be identified,
Means for receiving an input of a polymorphic type of a microsatellite marker of rice japonica species to identify,
Means for searching for a candidate of the input variety in a database in which a plurality of varieties of rice japonica varieties are associated with polymorphic types of microsatellite markers having polymorphisms within the variety;
Means for searching for candidates having a type that matches the polymorphic type of the input microsatellite marker among the searched candidates;
If the number of searched candidates is one, the name of the searched candidate type is output. If the number of searched candidates is not one, information is input together with a list of searched candidate type names. Microsatellite marker other than the polymorphic type of the microsatellite marker that has been searched and the polymorphic type does not match among the searched candidates, and means for outputting the polymorphic type,
It is a rice variety identification support program to function as
[0048]
A flowchart of the above program is shown in FIG.
The input unit and the output unit can be configured in the same manner as the first program except that the input information and the output information are different. Search in the database can be performed by a known method. As the search means, for example, when a database is prepared by spreadsheet software “Excel” of Microsoft Corporation, the auto filter function can be used.
[0049]
According to this program, the microsatellite markers to be analyzed can be efficiently narrowed down when the variety to be identified is unknown.
[0050]
The program of the present invention may be recorded on a computer-readable recording medium. Examples of the computer readable medium include a recording medium such as a flexible disk and a CD-ROM.
[0051]
【Example】
The present invention will be described in detail below based on examples.
[0052]
[Example 1]
The 62 varieties of temperate japonica seeds or brown rice circulated in Japan shown in Table 1 were obtained from the National Institute of Agrobiological Sciences and the following agricultural test stations. These were used as standard varieties representing each variety.
[0053]
Hokkaido Plant Genetic Resource Center
Aomori Agricultural Experiment Station
Iwate Agricultural Research Center
Yamagata Agricultural Experiment Station
Niigata Agricultural Research Institute
Gunma Agricultural Experiment Station
Chiba Agricultural Research Center
Ishikawa Agricultural Research Center
Aichi Prefectural Agricultural Experiment Station
Okayama Agricultural Research Center
Kumamoto Agricultural Research Center
Fukuoka Agricultural Research Center
[0054]
The seeds or brown rice (sample) of the varieties shown in Table 1 were put into a 2 ml tube one by one, 300 μl of sterilized ultrapure water was further added, and the mixture was heated at 98 ° C. for 15 minutes. Thereafter, zirconia beads were added thereto, and the mixture was pulverized using a mixer mill MM300 (manufactured by Lecce). Add 5 μl of the pulverized product to 50 μl of 5% Chelex 100 (Chelex 100, Biorad) aqueous solution, mix vigorously with shaking, treat at 60 ° C for 30 minutes and 95 ° C for 5 minutes, and centrifuge to remove the supernatant. To obtain a crude DNA product. This was used as template DNA in PCR. The above operation was carried out on each cultivar sample by 5 grains.
[0055]
PCR was performed using primers corresponding to the microsatellite markers shown in Table 2. PCR conditions were performed using a GeneAmp9600 system (Roche diagnostics) with a reaction volume of 30 μl. In 30 μl of the reaction solution, 1 μl template DNA, 0.75 units AmpliTaq Gold (Roche), 6 nmole dNTP, 6 pmole each primer, 10 mM Tris-Cl (pH 8.3), 50 mM KCl and 2.0 mM MgCl ₂ Is included. PCR conditions were 95 minutes at 95 ° C., 35 seconds at 95 ° C. for 30 seconds and 1 minute at 60 ° C. for 35 cycles. After completion of the reaction, the denaturing solution (40% formamide, 5.6 M urea) and the PCR reaction finishing solution are mixed at a ratio of 4: 1 (volume ratio), treated at 95 ° C. for 10 minutes, and then 5 μl of the denaturing gel (6% It was subjected to electrophoresis using acrylamide gel, 50% urea, acrylamide (monomer: bis = 19: 1)). After completion of electrophoresis, the gel was stained with Gelstar (Takara Shuzo), and the length of the amplified fragment of each variety was measured. For the fragment length differences (polymorphic types) found in the varieties shown in Table 1, each fragment length is encoded (for example, if there are 6 fragment lengths, the symbols A to F are given respectively) ) To create a database (Table 3). Here, 0 indicates that amplification of the microsatellite marker was not confirmed.
[0056]
[Example 2]
A method for identifying a variety using a fluorescently labeled primer is described below.
PCR amplification for each microsatellite marker PCR using DNA extracted from varieties with different fragment lengths as a template and using a forward primer labeled with Texas Red at the 5 'end of the primer and an unlabeled reverse primer Then, after measuring the concentration of the obtained amplification product, each amplification product was mixed so as to have the same concentration, and a molecular weight marker of the PCR amplified fragment length of each microsatellite marker was prepared.
[0057]
DNA was extracted in the same manner as in Example 1 from 6 grains one by one using the same Koshihikari as used in Example 1. According to the database (Table 3), the microsatellite markers RM9, RM223, RM247, RM253, RM257 and RM48 shown in Table 2 are used to identify Koshihikari in the varieties shown in Table 1. I know that it is good. Koshihikari can also be identified by using RM153, RM253, MRG5929, and MRG6508. PCR was performed in the same manner as in Example 1 using primers sufficient to identify these Koshihikari, and after completion of the reaction, a denaturing solution (40% formamide, 5.6 M urea) and a PCR reaction completion solution were used at 4: 1 (volume ratio). After mixing at 95 ° C for 10 minutes, 5 μl of the solution was subjected to electrophoresis on a denaturing gel (6% denaturing polyacrylamide gel, 50% urea, acrylamide (monomer: bis = 19: 1), 40 cm length). . The same treatment was performed on the molecular weight marker, and electrophoresis was performed at the same time. After completion of electrophoresis, the fragment length of the reaction product was analyzed by FMBIO (manufactured by Hitachi Software Engineering). The analysis results are shown in FIG. The determination of the result of fragment length measurement was the same as the result shown in the database, and it was found that sufficient analysis could be performed using fluorescent primers.
[0058]
[Example 3]
The concentration of DNA obtained by extracting the same Koshihikari and Akita Komachi as used in Example 1 by the same method as in Example 1 was measured using PICO Green reagent, and the concentration ratio was 4: 1 (20%). 9: 1 (10%) and 19: 1 (5%). The microsatellite marker that can distinguish between Koshihikari and Akitakomachi is RM257 from the database (Table 3). Therefore, a forward primer labeled with Texas Red on the 5 'end of the primer that amplifies it and an unlabeled reverse primer were used. PCR was performed and analyzed in the same manner as in Example 2. As is clear from the analysis results shown in FIG. 2, by using the microsatellite marker RM257 that can distinguish Koshihikari and Akita Komachi, the fluorescence derived from Akita Komachi is used in all cases of 20%, 10%, and 5%. The signal could be detected. Furthermore, the results of quantification of the fluorescence signal derived from Koshihikari and the fluorescence signal derived from Akita Komachi using the software attached to FMBIO (manufactured by Hitachi Software Engineering) are shown in the following table. As a result, it was found that this method is useful even when varieties are mixed.
[0059]
[Table 6]

[0060]
[Example 4]
We tried to identify varieties by using this method using rice.
Weigh 50g of Kirara 397 50% and Hoshino Yume 50% (Kirara 397 50%, Hoshino Yume 50% Ito Rice Co., Ltd.) and grind it into a powder using a mill. did. From this ground product, 0.5 g is weighed into a 15 ml tube, and 2580 μl of extraction solution (10 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA pH 8.0, autoclaved), 30 μl of 10 % SDS, 300 μl of 5 M guanidine hydrochloride and 120 μl of 20 mg / ml proteinase K were added, and the mixture was heated at 56 ° C. for 3 hours with stirring. Next, centrifugation was performed at 3,000 rpm for 15 minutes, the supernatant was transferred to a 2 ml microtube, and then centrifuged again at 15,000 rpm for 5 minutes. 0.5 ml of this supernatant was purified using Wizard DNA Clean Up system (Promega) to obtain pulverized product-derived template DNA. Furthermore, DNA was extracted in the same manner as in Example 1 for each 10 grains in total.
[0061]
From the database (Table 3), a microsatellite marker (RM336) and a primer corresponding to it were selected to distinguish between Kirara 397 and Hoshino Yume. PCR was performed in the same manner as in Example 2 using a forward primer labeled with Texas Red at the 5 ′ end of the primer and an unlabeled reverse primer. After completion of the reaction, the denaturing solution (40% formamide, 5.6 M urea) and the PCR reaction finishing solution are mixed at a ratio of 4: 1 (volume ratio), treated at 95 ° C. for 10 minutes, and then 5 μl of the denaturing gel (6% The gel was subjected to electrophoresis with acrylamide gel, 50% urea, acrylamide (monomer: bis = 19: 1), and after completion of the electrophoresis, the fluorescence signal was detected and quantified using FMBIO (Hitachi Software Engineering). The ratio of the fluorescence signal of the derived amplification product to the Hoshino Yume derived amplification product was 54: 46. Furthermore, as shown in FIG. The number determined to be 397 was 5 and the number determined to be hoshinoyume was 5. This proved that this method is useful even for mixed rice.
[0062]
【Effect of the invention】
According to the present invention, it is possible to identify closely related varieties at the DNA level, and it is possible to scientifically manage the purity of rice seeds and identify the variety of rice in circulation. It can also contribute to the cultivation of new rice varieties.
[0063]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the analysis results of microsatellite markers of Koshihikari standard rice.
FIG. 2 shows the analysis results of microsatellite markers.
FIG. 3 shows the analysis results of microsatellite markers.
FIG. 4 shows a flowchart of a rice variety identification support program according to the first embodiment.
FIG. 5 shows a flowchart of a rice variety identification support program according to a second embodiment.

Claims

Analyzing DNA extracted from rice tissue for at least one microsatellite marker polymorphism shown in the marker column of Table 4, and analyzing the microsatellite marker polymorphism analyzed in Table 4 A method for identifying rice varieties, comprising a step of collating with a type indicated in a type column corresponding to the marker.