JP5105348B2 - Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼホスファターゼの特異的阻害剤 - Google Patents
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項1. 式(1)〜式(6)で表される化合物からなる群より選択される少なくとも1種を含む、Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼホスファターゼ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase phosphatase(CaMKP))及び/または核局在型のCaMKP(CaMKP-N)の阻害剤。
項2. 式(1)〜式(6)で表される化合物からなる群より選択される少なくとも1種を有効成分として含む、CaMKP及び/またはCaMKP-NによるCaMKの不活性化に起因する疾患の治療剤。
rat CaMKPの基質としてCaMKIIの自己リン酸化部位周辺配列のアミノ酸を模した12個のアミノ酸からなるリン酸化ペプチドpp10(YGGMHRQET(p)VDC)を用いて活性測定を行った。反応液(50μl)は50 mM Tris-HCl(pH 8.0)、2 mM MnCl2、0.1 mM EGTA、0.01% Tween 20、20μM pp10とCaMKPからなっている。反応はrat CaMKPを加えることで開始し、30℃、6分間、反応を行った。その後マラカイトグリーン反応停止液を加え、反応液中の遊離リン酸はマラカイトグリーンアッセイにより測定した(Baykov, A., Evtushenko, O. and Avaeva, S. (1988) A malachite green procedure for orthophosphate determination and its use in alkaline phosphatase-based enzyme immunoassay. Anal. Biochem. 171, 266-270)。
rat PP2C alphaの活性測定はrat CaMKPの条件を模して行った。2 mM MnCl2の代わりに5 mM MgCl2を使用した。
zCaMKP-Nの活性測定はrat CaMKPの条件を模して行った。20μM pp10の代わりに40μM pp10を使用した。
実施例1:英国トクリス社の化合物ライブラリーからのスクリーニング
トクリス社の化合物ライブラリー合計817種類について、最終濃度が10μM乃至40μMとなるようにそれぞれ酵素反応液に添加し、rat CaMKPとrat PP2C alphaへの影響を調べた。その結果、rat CaMKPを特異的に阻害する化合物が2種類見いだされた。2つの化合物はエバンスブルーとシカゴスカイブルー6Bであった。rat CaMKPに対するIC50値はエバンスブルーは4.1 ± 0.2μM、シカゴスカイブルー6Bは4.1 ± 0.3μMと、ほぼ同程度の阻害活性を示した。両化合物共にrat PP2C alphaへの阻害活性は認められなかった(表1)。
エバンスブルーやシカゴスカイブルー 6Bの類似化合物でも阻害活性を有しているかどうかを調べるために、オキサミンブルーBとアゾブルーを用いてrat CaMKPとrat PP2C alphaの活性測定を行った。その結果、これら2つの化合物はrat CaMKPに対しては阻害活性を有していたが、rat PP2C alphaはほとんど阻害しなかった。rat CaMKPに対するIC50値はオキサミンブルーは7.9 ±0.3μM、アゾブルーは16.1 ± 1.2μMであった(表1)。
実施例3:エバンスブルーの部分構成ユニットの阻害活性
エバンスブルー、シカゴスカイブルー 6B、オキサミンブルーB及びアゾブルーの色素化合物の構造は、大きく分けて、中央部分のユニット、左右の対称なユニットの二つの部分構成ユニットから形成される。これらの色素化合物のCaMKPへの阻害活性に必要な部分構成ユニットを明らかにする事にした。そこで、エバンスブルーの両端の構造に似た1-アミノ-8-ナフトール-2,4-ジスルホン酸、1-アミノ-8-ナフトール-4-スルホン酸を用いてrat CaMKPとrat PP2C alphaの活性測定を行った。その結果、これら2つの化合物はいずれもrat CaMKPに対し阻害活性を示した。これらのrat CaMKPに対するIC50値は、1-アミノ-8-ナフトール-2,4-ジスルホン酸は5.2 ± 0.8μM、1-アミノ-8-ナフトール-4-スルホン酸は3.3 ± 0.2μMであった。一方、rat PP2C alphaに対してはどの化合物も阻害活性を示さなかった。
実施例4:zCaMKP-Nに対する阻害活性
rat CaMKPに相同性が高いzCaMKP-Nを用いて、上記の化合物が阻害活性を示すかどうか調べた。その結果、rat CaMKPの場合と同様に阻害活性を示した(表1)。さらにエバンスブルー、シカゴスカイブルー 6B、オキサミンブルーB及びアゾブルーはrat CaMKPより強くzCaMKP-Nを阻害した。各化合物のzCaMKP-Nに対するIC50値はエバンスブルーは0.9 ± 0.1μM、シカゴスカイブルー 6Bは1.0 ± 0.1μM、オキサミンブルーBは2.2 ± 0.3μM、アゾブルーは3.0 ± 0.3μM、1-アミノ-8-ナフトール-2,4-ジスルホン酸は6.6 ± 0.8μM、1-アミノ-8-ナフトール-4-スルホン酸は3.8 ± 0.8μMであった。
比較例
エバンスブルーの両端の構造に似た1-ナフトール-5-スルホン酸、4-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸、5-アミノ-1-ナフトールと、中央の構造に似た3,3’-ジヒドロキシベンジジン、3,3’-ジメトキシベンジジン、3,3’-ジメチルベンジジンジヒドロクロリドを用いてrat CaMKPとrat PP2C alphaの活性測定を行った。その結果、これらの化合物はいずれもrat CaMKP及びrat PP2C alphaに対して阻害活性を示さなかった。
rat CaMKIVをNeuro2a細胞で発現させてIonomycinを作用させると、カルシウムイオン濃度の上昇によりrat CaMKIVのリン酸化レベルが上昇するが、そこにzCaMKP-Nを共発現させると、rat CaMKIVのリン酸化レベルは有意に低下する(非特許文献9)。そこで、エバンスブルー、シカゴスカイブルー6Bが、細胞レベルでも効果的に作用するかどうか調べた。rat CaMKIVを単独で発現させ、Ionomycin刺激した細胞に比べ、さらにzCaMKP-Nを共発現させた細胞ではrat CaMKIVのリン酸化レベルの低下が確認された(図4、レーン2と5の比較)。一方、rat CaMKIVとzCaMKP-Nを共発現させた細胞にエバンスブルー(図4、レーン6)またはシカゴスカイブルー6B(図4、レーン7)を取り込ませ、Ionomycin刺激すると、これらの阻害剤を添加しないとき(図4、レーン5)と比べてリン酸化レベルが上昇した。また、これらの阻害剤は、rat CaMKIVを単独で発現させてIonomycin刺激したときにCaMKIVのリン酸化レベルに影響を及ぼさなかった(図4、レーン2-4)。これらの結果より、エバンスブルー及びシカゴスカイブルー 6Bはいずれも細胞の中に取り込まれて阻害活性を発揮出来ることが示された。
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