JP5076142B2 - 蛍光光度計 - Google Patents
蛍光光度計 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5076142B2 JP5076142B2 JP2006356894A JP2006356894A JP5076142B2 JP 5076142 B2 JP5076142 B2 JP 5076142B2 JP 2006356894 A JP2006356894 A JP 2006356894A JP 2006356894 A JP2006356894 A JP 2006356894A JP 5076142 B2 JP5076142 B2 JP 5076142B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fluorometer
- sample
- light
- fluorescence
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Optical Measuring Cells (AREA)
Description
試料測定部2の上面図を図2に、また試料測定部2の断面図を図3に示す。図1〜3に示すように、試料測定部2は測定用試料9を充填する試料セル10と、この試料セル10の底面外側であって、測定用試料9に光照射可能な光源13と、光源13からの光により励起された試料により、出射した蛍光を受光する光検出器12とを有する。
さらに、試料測定部2はセルホルダ11を有する。セルホルダ11の材質は、黄銅、ステンレス、アルミニウム等の金属、および塩化ビニル等のプラスチック等であって、少なくとも内側は黒色であることが好ましい。これにより、セルホルダ11の内外の光が透過することを防ぎ、セルホルダ11内を暗室空間とできる。また、実施例のセルホルダ11は円筒形状を成しており、その径は試料セル10の径よりも大きく、内部に試料セル10を収容して固定できる。図3に示すように、試料セル10は、セルホルダ11内であって、セルホルダの底面21と試料セルの底面17とが平行で、且つ離間された位置に保持される。必然的に試料セルの側面18とセルホルダの側面22は平行に配置される。また、セルホルダの側面22の円周上であって、保持された試料セル10の充填目盛り16よりも下側(図3における下側)に、セルホルダの底面21と平行になるよう複数の光検出器12が設置されている。つまり、光検出器12は試料セル10に充填された測定用試料9の液面よりも下側に位置する。複数の光検出器12を備える構造とすることで、感度が上昇してS/N比が向上する。また測定値を平均化させることがきるため安定した計測が可能であり、測定用試料9から発せられる蛍光強度を効率よく測定することができる。これにより測定用試料9の計測可能な濃度域を幅広とできる。
また、図2、3に示すように、セルホルダ11の内側であって、セルホルダ11の底面21上には光源13が搭載される。光源13は試料セルの底面17と離間されており、これにより光源13からの熱が試料セル10に伝導することなくほぼ断熱状態とできる。実施例では光源13と試料セル10との間に、シリコンチューブ23を上下で挟んだ2枚のカバーグラス24を介した。よって、2枚のカバーグラス24間に空気層Aが形成され、これにより断熱効果を得た。ただ、断熱法はこれに限定されず、ガラス繊維、発泡スチロール、コルク質の類等を両者間に狭むこともできる。
上記の構造を有する試料測定部2は、図3に示すように、測定用試料9の下面側から光照射し、発生した蛍光を測定用試料9の側面側から測定する構造を有する。したがって、光源13からの照射軸と、受光素子の受光面の法線方向とがほぼ90°に配置されているため、励起光の信号が蛍光の信号に付加して測定されることを低減できる。また、セルの形状が円筒であるため、照射軸と90°の角度を維持しながら、かつ光源13からの距離をほぼ同一にする条件を備える受光素子12aの搭載位置が十分に確保できる。すなわち受光素子12aの搭載個数を自由に決定することができ、これにより高感度で精密な蛍光光度計1を実現できる。
(酵素)
図1に示す蛍光光度計1を使用した微生物の活性評価は、微生物の特異的な酵素活性を利用したものである。微生物が保有する酵素と、蛍光酵素基質との反応で生成された蛍光物質の蛍光強度を測定することで、微生物の活性状態を調べることができる。一例として、活性状態が未知である麹あるいは酵母が含有された試料と、4−メチルウンベリフェリル−α−D−グルコピラノシド(0.1mM)を蛍光基質として混合したものを測定用試料9とし、例えば37℃で30分間反応させる。麹あるいは酵母の微生物が保有する特異酵素のα−グルコシダーゼは蛍光酵素基質と反応すると、蛍光物質である4−メチルウンベリフェロン(4MU)を生成する。この蛍光物質は約365nmの励起光により励起され約450nmの蛍光を発する。この蛍光強度を測定することで微生物の活性状態を調べることができる。同様の方法で、E.coli(大腸菌)または大腸菌群の濃度や数量を測定できる。大腸菌が含有した試料に蛍光基質として4−メチルウンベリフェリル−β−D−グルクロニドを添加したものを測定用試料9とする。この蛍光基質と、大腸菌の特異酵素であるβ−D−グルクロニダーゼとの反応により生成された蛍光物質(4MU)を、約365nmの励起光でもって励起し、この蛍光強度を測定することで大腸菌の数量や濃度を判定できる。一方、大腸菌群の場合は、4−メチルウンベリフェリル−β−D−グルコピラノシドを蛍光基質とする。これと大腸菌群の特異酵素であるβ−ガラクトシダーゼとの反応により生成された蛍光物質(4MU)が、約365nmの励起光により励起された際の蛍光強度を測定することで、同様の判定を行うことができる。
また、微生物の数や濃度を評価することもできる。具体的には、微生物のDNAを特定の試薬と結合させ、この結合部分に所定の励起光を照射させることで発する蛍光強度を測定する。例えば、試料である微生物をメタノール(100%)で固定しPBS緩衝液で洗浄する。この試料にDAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole(dihydrochloride))染色を施す。実施例では1μg/mlの濃度のDAPIで30分間染色した。DAPIはDNAのAT領域に特異的に結合する核染色であって、この結合部は紫外線(約365nm)により励起され青色(約450nm)の蛍光を出す。DNAにおけるDAPIと非結合な領域は蛍光を発しない。したがって蛍光強度を測定することで微生物の数や濃度を評価することができる。図6は、1〜4個の受光素子数における、DAPI染色したヤクルト(登録商標、株式会社ヤクルト本社製)菌の濃度と、その蛍光強度との関係を示すグラフである。グラフより、受光素子の個数が多いほど感度良く測定可能であることがわかる。また、ヤクルト菌の濃度が低い場合でも、受光素子の個数が多ければ精度良く測定できることがわかる。上記の方法を利用すれば、例えば大腸菌群が含有された試料にDAPI染色を施し、発光する蛍光強度を測定することで大腸菌群数やその濃度を評価することも可能となる。上記のDNA染色法及びDNA染色性色素は、当業者に既知のいずれのものを使用してもよく、例えば微小物質を効率よく検出できる発光系の色素(化学発光色素、蛍光色素、生物発光色素、生物蛍光色素など)を用いるのが好ましい。例えばヘキスト33258や、生きたまま微生物のDNA染色が可能なヘキスト33342等を好適に使用できる。
ATP法は、蛍の酵素を主とするルシフェリン・ルシフェラーゼを試薬とする。ルシフェリン・ルシフェラーゼは、全ての生細胞中に存在する生体エネルギーのATP(アデノシン三リン酸)と反応すると発光する。ATP法では、生細胞の数に比例してその発光量も増加するので、発光強度を測定することにより生細胞の数等を評価できる。この蛍光は励起光を必要としないため、光源13を点灯せずして蛍光強度を測定できる。
(1)ローダミン123(励起光507nmで蛍光529nm)を用いた単離ミトコンドリア膜電位の測定。
(2)FITC(励起光495nmで蛍光520nm)やローダミン(励起光520nmで蛍光580nm)を用いた蛍光シリカナノ粒子の測定。
(3)蛍光指示薬DAF−2(励起光495nmで蛍光515nm)を用いた一酸化窒素(NO)の測定。
これを利用すれば、例えば微生物から産生される一酸化窒素をリアルタイムに測定できる。また、LPS刺激によるマクロファージからの一酸化窒素の産生測定も可能となる。
(4)FITC(励起光495nmで蛍光520nm)やローダミン(励起光520nmで蛍光580nm)を用いた蛍光ラベルワクチンの測定。
これにより例えばコイヘルペスワクチンの測定が可能となる。
(5)FITC(励起光495nmで蛍光520nm)やローダミン(励起光520nmで蛍光580nm)を用いた微粒子蛍光ラテイックスビーズの測定。
例えば好中球及びテトラヒメナの貪食能の測定が可能となる。
次に蛍光光度計1を使用して蛍光光度を測定する手順を、図11のフローチャートに基づき説明する。まずステップS1で試料をセットする。ここでは特定の試薬を含有させた液状の測定用試料9を、少なくともその上位面である液面が試料セル10の充填目盛り16に位置するよう充填させる。測定用試料9はあらかじめメンブレンフィルター等で濾過するのが好適である。これにより精密な蛍光強度を測定できる。次にステップS2で測定のインターバルを設定する。ここでは信号処理部3に設けられ、かつ図9(a)、(b)の回路図に示したスイッチSW2、SW3を操作して、測定のインターバルを1分から99分の分刻みで設定する。なお、「00」を指定した場合は1秒間隔で設定されたものとする。さらにステップS3で測定を開始する。ここでは図10(a)のスイッチSW4を押下することで測定開始が信号処理部3から指示され、光源13の点灯及び受光素子12aによる光信号の検出が開始される。
(内部割り込み処理)
(外部割り込み処理)
2…試料測定部
3…信号処理部
4…データ解析部
5…表示窓
6…ボタン類
7…AND回路
8a…可変抵抗
8b…抵抗
9…測定用試料
10…試料セル
11…セルホルダ
12…光検出器
12a…受光素子
13…光源
13a…UVLED
13b…可視光線LED
16…充填目盛り
17…試料セルの底面
18…試料セルの側面
19…セル蓋
21…セルホルダの底面
22…セルホルダの側面
23…シリコンチューブ
24…カバーグラス
25…ホルダ蓋
26…A/D変換器
27…飽和検出用LED
29…ホトカプラ
30a、30b、30c、30d、30e…出力
31…安全装置
200…蛍光分光光度計
201…光源部
202…励起分光器
203…モニタ部
204…試料室
205…蛍光分光器
206…キセノンランプ
207…集光ミラー
208…スリット
209…平面鏡
210…グレーティング
211…ビームスプリッター
212…レンズ
213…フローセル
214…フォトセル
215…レンズ
216…スリット
217…グレーティング
218…スリット
219…光電子増倍管
221…断熱材
222…ヒーティング・クーリングブロック
223…ヒーター
224…ペルチェ素子
225…白金抵抗体
226…温度制御回路
227…導入管
228…フローセル
229、230…レンズ
231…フィン
232…ファン
233…熱交換部
300…試料セル
301…入射スリット
302…光入射面
303…試料流路
304…光出射面
305…蛍光側スリット
306…ハーフミラー
307…励起光回折格子
308…蛍光側回折格子
309…スリット
310…光学検知器
A…空気層
L…光
OP1、OP2…オペアンプ
P…蛍光
SW1、SW2、SW3、SW4、SW5、SW6…スイッチ
Vref…基準電圧
Claims (10)
- 測定用試料に励起光を照射し、測定用試料の蛍光強度を測定する蛍光光度計であって、
測定用試料(9)を充填可能な試料セル(10)と、
前記試料セル(10)を内部に収容可能な内部収納空間を形成しており、該内部収納空間に前記試料セル(10)を収納した状態で閉塞して暗室状態とできるセルホルダ(11)と、
前記セルホルダ(11)内の底面(21)上であって、前記試料セル(10)の底面(17)を照射可能に載置される1つ又は2つ以上の光源(13)と、
前記セルホルダ(11)の前記内部収納空間の側面上であって、前記試料セル(10)内に充填された測定用試料(9)の上位面よりも底面側で、前記試料セル(10)を取り囲むように載置され、前記測定用試料(9)からの蛍光を受光可能な複数の光検出器(12)と、
前記光検出器(12)より得られる電気信号を用いて、測定用試料(9)中の蛍光強度を演算する信号処理部(3)と、
を備えることを特徴とする蛍光光度計。 - 請求項1に記載の蛍光光度計であって、
前記測定用試料(9)の蛍光強度は、前記光源(13)の照射軸とほぼ直交する、前記試料セル(10)の側面(18)側より、複数の光検出器(12)によって検知され、前記検知された光信号により得られた前記演算値でもって、前記測定用試料(9)の蛍光強度を評価できることを特徴とする蛍光光度計。 - 請求項1又は2に記載の蛍光光度計であって、
前記セルホルダ(11)の内部収納空間が円筒形状であることを特徴とする蛍光光度計。 - 請求項1〜3に記載の蛍光光度計であって、
前記光検出器(12)はCdSからなる受光素子であることを特徴とする蛍光光度計。 - 請求項1〜4に記載の蛍光光度計であって、
前記光源(13)が半導体発光素子であることを特徴とする蛍光光度計。 - 請求項1〜5のいずれか一に記載の蛍光光度計であって、
前記光源(13)の少なくとも一つは、出射光のピーク波長が350nm〜390nmであることを特徴とする蛍光光度計。 - 請求項1〜6のいずれか一に記載の蛍光光度計であって、
前記電気信号を解析可能なデータ解析部(4)を有することを特徴とする蛍光光度計。 - 請求項1〜7のいずれか一に記載の蛍光光度計であって、
前記測定のインターバルを設定することが可能であることを特徴とする蛍光光度計。 - 請求項1〜8のいずれか一に記載の蛍光光度計であって、
前記信号処理部(3)が、前記光検出器(12)で受光した光信号により得られる複数の電気信号の平均値を演算可能であることを特徴とする蛍光光度計。 - 請求項1〜9のいずれか一に記載の蛍光光度計であって、
前記セルホルダ(11)の内部収納空間が密閉状態にあることを検知した上で、光源(13)から励起光を照射可能に構成してなることを特徴とする蛍光光度計。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006356894A JP5076142B2 (ja) | 2006-12-29 | 2006-12-29 | 蛍光光度計 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006356894A JP5076142B2 (ja) | 2006-12-29 | 2006-12-29 | 蛍光光度計 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008164550A JP2008164550A (ja) | 2008-07-17 |
JP5076142B2 true JP5076142B2 (ja) | 2012-11-21 |
Family
ID=39694246
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006356894A Active JP5076142B2 (ja) | 2006-12-29 | 2006-12-29 | 蛍光光度計 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5076142B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104126113A (zh) * | 2012-02-16 | 2014-10-29 | 泰尔茂株式会社 | 荧光传感器和感应系统 |
KR101755117B1 (ko) * | 2015-09-30 | 2017-07-07 | (주)제이엠이엔비 | 생존 플랑크톤 검사장치 |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5208774B2 (ja) * | 2009-01-08 | 2013-06-12 | 株式会社マルコム | 蛍光分光光度計 |
KR101415948B1 (ko) | 2012-10-29 | 2014-07-04 | 한국광해관리공단 | 형광생물체를 이용한 휴대용 광산배수 오염도 측정 장치 및 방법 |
JP2015010836A (ja) * | 2013-06-26 | 2015-01-19 | 栗田工業株式会社 | 溶存成分の濃度測定装置 |
WO2017077653A1 (ja) * | 2015-11-06 | 2017-05-11 | 株式会社資生堂 | 蛍光検出装置、分析方法、及び蛍光検出システム |
CN109682785B (zh) * | 2019-01-04 | 2023-07-21 | 齐鲁工业大学 | 一种用于研究酶在皮革中湍流传质的实验装置及使用方法 |
JP7322593B2 (ja) * | 2019-08-23 | 2023-08-08 | 株式会社サタケ | 微生物の検査装置及びその方法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH04348258A (ja) * | 1991-05-27 | 1992-12-03 | Kowa Co | 多チャンネル光学測定装置 |
JPH07146236A (ja) * | 1993-11-24 | 1995-06-06 | Ykk Kk | 木材のヤニ検出方法 |
JP3004558B2 (ja) * | 1995-01-23 | 2000-01-31 | 株式会社東邦計測研究所 | 水質測定装置 |
JP3113909B2 (ja) * | 1997-12-22 | 2000-12-04 | 株式会社日本水処理技研 | 菌類の即時判別装置 |
JP2000146825A (ja) * | 1998-11-05 | 2000-05-26 | Meidensha Corp | 微弱発光計測装置 |
JP2003169695A (ja) * | 2001-12-10 | 2003-06-17 | Nippon Mizushori Giken:Kk | 微生物計測方法及び装置 |
-
2006
- 2006-12-29 JP JP2006356894A patent/JP5076142B2/ja active Active
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104126113A (zh) * | 2012-02-16 | 2014-10-29 | 泰尔茂株式会社 | 荧光传感器和感应系统 |
CN104126113B (zh) * | 2012-02-16 | 2016-10-19 | 泰尔茂株式会社 | 荧光传感器和感应系统 |
KR101755117B1 (ko) * | 2015-09-30 | 2017-07-07 | (주)제이엠이엔비 | 생존 플랑크톤 검사장치 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2008164550A (ja) | 2008-07-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5076142B2 (ja) | 蛍光光度計 | |
US6197254B1 (en) | Self-contained assaying apparatus | |
US5266486A (en) | Method and apparatus for detecting biological activities in a specimen | |
O’Toole et al. | Photometric detection in flow analysis systems using integrated PEDDs | |
Clarke et al. | Characterisation and deployment of an immobilised pH sensor spot towards surface ocean pH measurements | |
Zhao et al. | Luminescence ratiometric oxygen sensor based on gadolinium labeled porphyrin and filter paper | |
Deepa et al. | Sol–gel based portable optical sensor for simultaneous and minimal invasive measurement of pH and dissolved oxygen | |
Mills | Optical sensors for carbon dioxide and their applications | |
Carvajal et al. | Hand-held optical instrument for CO2 in gas phase based on sensing film coating optoelectronic elements | |
IE901660A1 (en) | Apparatus for detection of microorganisms | |
Nakamura et al. | An optical sensor for CO2 using thymol blue and europium (III) complex composite film | |
García Campaña et al. | Quimioluminiscencia: una interesante alternativa para la detección analítica en sistemas de flujo | |
Chen et al. | A practical portable photometer using LEDs as inspection light source | |
Würth et al. | Polymer-and glass-based fluorescence standards for the near infrared (NIR) spectral region | |
Liu et al. | A benzocoumarin-based fluorescent probe for highly specific ultra-sensitive fast detecting endogenous/exogenous hypochlorous acid and its applications | |
McLamore et al. | Development and validation of an open source O2-sensitive gel for physiological profiling of soil microbial communities | |
Wang et al. | A biochemical system of rapidly detecting bacteria based on ATP bioluminescence technology | |
Chen et al. | A smartphone-based absorbance device extended to ultraviolet (365 nm) and near infrared (780 nm) regions using ratiometric fluorescence measurement | |
US9207180B2 (en) | Detection of microorganisms with a fluorescence-based device | |
Chen et al. | A sensitive portable fluorometer coupled with miniaturized integrating sphere | |
JP2009103480A (ja) | マイクロプレートリーダー | |
RU159783U1 (ru) | Прибор для мобильного обнаружения взрывчатых и наркотических веществ | |
Simães et al. | Drinking water quality monitoring: an alternative approach to microbial contamination events | |
Tang et al. | Low-cost and portable colorimetric platform for simultaneous detection of Fe, methanol, and total phenols in wine | |
CN111094942B (zh) | 样品分析方法、分析装置及计算机程序 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20091110 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20111014 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20111025 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111226 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120731 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |