JP5058536B2 - Method for producing hydrogen - Google Patents
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Description
本発明は、水素発生嫌気性超好熱菌を用いた水素の製造方法及び水素製造装置に関する。 The present invention relates to a hydrogen production method and hydrogen production apparatus using hydrogen-producing anaerobic hyperthermophilic bacteria.
嫌気性超好熱菌の中には、細胞分裂の過程で水素を産生する性質を有する水素発生嫌気性超好熱菌がある。このような水素発生嫌気性超好熱菌の例として、サーモコッカス コダカラエンシス(Thermococcus kodakaraensis)が挙げられる。このTkを培養して水素を生物学的に製造する技術が、従来から提案されている(例えば、特許文献1参照)。この特許文献1には、サーモコッカス属の微生物を培養することにより、菌体に水素を産生させる水素の製造方法が記載されている。また、前記サーモコッカス属の微生物が、 サーモコッカス コダカラエンシスであることが記載されている。また、前記培養を、光照射することなく、嫌気性雰囲気及び元素硫黄の非存在下で、温度60〜105℃で行うことが記載されている。
なお、微生物名はイタリック体で表すべきであるが、本明細書においては通常の字体で表示する。また、本発明においては、「水素発生嫌気性超好熱菌」を、細胞分裂の過程で水素を産生する性質を有する嫌気性超好熱菌と定義する。また、サーモコッカス コダカラエンシスの詳細については、非特許文献1〜5に記載されている。
Among the anaerobic hyperthermophilic bacteria are hydrogen-producing anaerobic hyperthermophilic bacteria that have the property of producing hydrogen during cell division. An example of such a hydrogen-producing anaerobic hyperthermophilic bacterium is Thermococcus kodakaraensis. A technique for biologically producing hydrogen by culturing Tk has been conventionally proposed (see, for example, Patent Document 1).
In addition, although the microorganism name should be expressed in italics, it is displayed in normal font in this specification. In the present invention, “hydrogen-producing anaerobic hyperthermophilic bacterium” is defined as an anaerobic hyperthermophilic bacterium having a property of producing hydrogen in the process of cell division. The details of Thermococcus kodakaraensis are described in
また、サーモコッカス コダカラエンシス以外の水素発生嫌気性超好熱菌を用いた水素供給設備が提案されている(例えば、特許文献2参照)。この特許文献2には、常温より高い温度の嫌気性雰囲気内で有機物を栄養源として水素発生嫌気性超好熱菌を培養する培養装置と、排熱源から排出させる80℃以上の排熱保有媒体から給熱されて前記培養装置を前記水素発生嫌気性超好熱菌の増殖に適した温度に維持する培養温度維持機構と、前記水素発生嫌気性超好熱菌の増殖に必要な前記有機物を前記培養装置内に供給する有機物供給機構と、前記水素発生嫌気性超熱菌の増殖により前記培養装置内で発生する水素を、前記培養装置から取り出して貯蔵する水素貯蔵器とを備え、前記水素貯蔵器から水素を取り出し可能に構成した水素供給設備が記載されている。また、前記水素発生嫌気性超好熱菌がピロコッカス フリオサス(Pyrococcus furiosus)またはサーモトガ マリティマ(Thermotoga maritima)であり、前記増殖に適した温度が80 〜 103℃であることが記載されている。
In addition, hydrogen supply equipment using hydrogen-producing anaerobic hyperthermophilic bacteria other than Thermococcus kodakaraensis has been proposed (see, for example, Patent Document 2). This
一方、メタン菌によるメタン発酵において、メタン菌を含有する反応槽内部にセラミックやプラスチックを充填し、その表面においてメタン菌を培養することにより、菌体を高密度化し、メタン発酵を高速化する方法(嫌気性固定床法)が提案されている(例えば、非特許文献6参照)。また、メタン菌の自己集塊作用を利用してグラニュール(粒状汚泥)を調製し、このグラニュールを反応槽に充填してメタン菌を高密度化した後、メタン発酵を行う上向流嫌気性汚泥ブランケット(Upflow Anaerobic Sludge Blanket, UASB)法が実用化している。
しかしながら、特許文献1に係る水素の製造方法及び特許文献2に係る水素供給設備には、水素生産速度が遅く、水素の生産性が低いという問題があった。また、非特許文献1には、サーモコッカス コダカラエンシスの嫌気性固定床法への適用可能性に関する記載がなく、また、サーモコッカス コダカラエンシスには自己集塊作用がないため、その高密度化方法が確立されていないという問題があった。
However, the hydrogen production method according to
本発明は、上記従来技術の問題点に鑑み、サーモコッカス コダカラエンシス等の水素発生嫌気性超好熱菌の高密度培養によって水素の生産速度及び生産性が向上した水素の製造方法を提供することを目的とする。また、この水素の製造方法に好適な水素製造装置を提供することを目的とする。 The present invention provides a method for producing hydrogen in which hydrogen production rate and productivity are improved by high-density culture of a hydrogen-producing anaerobic hyperthermophilic bacterium such as Thermococcus kodakaraensis in view of the above-mentioned problems of the prior art. For the purpose. It is another object of the present invention to provide a hydrogen production apparatus suitable for this hydrogen production method.
かかる課題を解決するため、
本発明の第1の態様は、支持体と、アミノ酸源及び炭素源を含む培養液とを用いて、水素発生嫌気性超好熱菌であるサーモコッカス コダカラエンシスを培養することにより、前記支持体を核としてバイオフィルムを形成し、当該バイオフィルムの状態で前記菌体を培養することによって、水素を製造する水素の製造方法である。具体的には、支持体と、水素発生嫌気性超好熱菌と、アミノ酸源及び炭素源を含む培養液とを培養槽内に供給する工程と、該培養液中で水素発生嫌気性超好熱菌を培養することにより、水素を製造する工程とを含む水素の製造方法である。
To solve this problem,
In the first aspect of the present invention, the support is obtained by culturing Thermococcus kodakaraensis, which is a hydrogen-producing anaerobic hyperthermophilic bacterium , using a culture medium containing an amino acid source and a carbon source. the body to form a biofilm as nuclei, by culturing the cells in the state of the biofilm is a method for producing hydrogen for producing hydrogen. Specifically, a step of supplying a support, a hydrogen-producing anaerobic hyperthermophilic bacterium, and a culture solution containing an amino acid source and a carbon source into the culture vessel, and a hydrogen-producing anaerobic hyperphilic organism in the culture solution. And a step of producing hydrogen by culturing thermophilic bacteria.
本発明の水素の製造方法においては、前記支持体が多孔質であることが好ましい。また、前記支持体が、天然スポンジ、合成スポンジ、活性炭、セラミック、イオン交換樹脂、ゼオライト、発泡れん石、溶融スラグ、酢酸セルロース繊維、ガラスビーズ、カーボン、シリカゲル、砂、アルミナ、モレキュラーシーブ、及びチタン酸化物からなる群から選ばれる1種または2種以上であることが好ましい。また、前記炭素源が、ピルビン酸、ビルビン酸塩、及びでんぷん系多糖類からなる群から選ばれる1種又は2種以上であることが好ましい。また、前記サーモコッカス コダカラエンシスが、サーモコッカス コダカラエンシス KOD1(寄託機関:独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室、受託番号:JCM 12380号;又は、寄託機関:American Type Culture Collection (ATCC)、受託番号:ATCC BAA−918)であることが好ましい。 In the hydrogen production method of the present invention, the support is preferably porous. The support is made of natural sponge, synthetic sponge, activated carbon, ceramic, ion exchange resin, zeolite, foamed stone, molten slag, cellulose acetate fiber, glass beads, carbon, silica gel, sand, alumina, molecular sieve, and titanium. One or more selected from the group consisting of oxides are preferred. Moreover, it is preferable that the said carbon source is 1 type (s) or 2 or more types chosen from the group which consists of pyruvic acid, a birubic acid salt, and a starch-type polysaccharide . Also, the Thermococcus kodakaraensis is, Thermococcus kodakaraensis KOD1 (depositary institution: RIKEN Bioresource Center microorganisms Engineering Division, accession number: JCM 12380 issue; or, depositary institution: American Type Culture Collection (ATCC), accession number: ATCC BAA-918).
本発明によれば、サーモコッカス コダカラエンシス等の水素発生嫌気性超好熱菌が支持体に吸着されるとともに培養されるため、水素発生嫌気性超好熱菌の固定化及び高密度化を容易に達成することができる。また、高密度化された水素発生嫌気性超好熱菌を用いて水素を製造することにより、水素の生産速度及び生産性を向上することができる。 According to the present invention, since the hydrogen-producing anaerobic hyperthermophilic bacteria such as Thermococcus kodakaraensis are adsorbed to the support and cultured, the immobilization and densification of the hydrogen-producing anaerobic hyperthermophilic bacteria can be achieved. Can be easily achieved. Moreover, the production rate and productivity of hydrogen can be improved by producing hydrogen using a densified hydrogen-producing anaerobic hyperthermophilic bacterium.
以下、水素発生嫌気性超好熱菌として、サーモコッカス コダカラエンシスを用いた本発明の一実施形態について、詳しく説明する。 Hereinafter, an embodiment of the present invention using Thermococcus kodakaraensis as a hydrogen-producing anaerobic hyperthermophilic bacterium will be described in detail.
(水素の製造方法)
本発明で用いられるサーモコッカス コダカラエンシス(以下、単に「菌体」ということがある。)は、上述のように、細胞分裂しながら水素を産生する性質を有する。よって、菌体濃度の増加と水素生産量は比例関係にある。また、菌体は炭素源を代謝した際に多糖類を排泄する。この多糖類は粘着性であり、所定量凝集すると、菌体を取り込んで固定化する作用を有する。このようにして形成された多糖類及び菌体の凝集体は、一般にバイオフィルムと呼ばれている。
なお、サーモコッカス コダカラエンシスは、上記以外にも以下の特徴1)〜4)を有する。
1)培養温度が60〜105℃であるため、他の菌の繁殖による汚染を回避できる。
2)水素産生量を温度変化により制御できる。
3)栄養源として有機性廃棄物を利用した場合、有機性廃棄物(特にデンプン系多糖類)の可溶化と水素生産反応を同時に進行させることができる。
4)産生された水素を燃料電池の水素源とする場合、高温発酵水素生産のため、発電起電力が高くなる。
(Method for producing hydrogen)
Thermococcus kodakaraensis (hereinafter sometimes simply referred to as “bacteria”) used in the present invention has the property of producing hydrogen while cell division, as described above. Therefore, the increase in the bacterial cell concentration is proportional to the hydrogen production amount. In addition, bacterial cells excrete polysaccharides when they metabolize carbon sources. This polysaccharide is sticky, and has a function of capturing and immobilizing bacterial cells when a predetermined amount is aggregated. The thus formed polysaccharide and bacterial aggregates are generally called biofilms.
In addition to the above, Thermococcus kodakaraensis has the following characteristics 1) to 4).
1) Since the culture temperature is 60 to 105 ° C., contamination due to the propagation of other bacteria can be avoided.
2) Hydrogen production can be controlled by temperature change.
3) When organic waste is used as a nutrient source, solubilization of organic waste (especially starch-based polysaccharides) and hydrogen production reaction can proceed simultaneously.
4) When the produced hydrogen is used as the hydrogen source of the fuel cell, the generated electromotive force is high due to the high-temperature fermented hydrogen production.
そこで、本発明の水素の製造方法は、先ず、支持体と、サーモコッカス コダカラエンシスと、アミノ酸源及び炭素源を含む培養液とを培養槽内に供給する。
サーモコッカス コダカラエンシスとしては、サーモコッカス コダカラエンシス KOD1(以下、「KOD1株」と略記する。)、並びにKOD1株の遺伝子組換え体及び変異体が挙げられ、いずれも本発明の好適な対象である。その中でもKOD1株が特に好適である。その理由を以下に記載する。
Therefore, in the method for producing hydrogen of the present invention, first, a support, Thermococcus kodakaraensis, and a culture solution containing an amino acid source and a carbon source are supplied into the culture tank.
Examples of Thermococcus kodakaraensis include Thermococcus kodakaraensis KOD1 (hereinafter abbreviated as “KOD1 strain”), and genetic recombinants and mutants of KOD1 strain, both of which are suitable targets of the present invention. It is. Of these, the KOD1 strain is particularly suitable. The reason is described below.
KOD1株は、寄託機関:独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室(受託番号:JCM 12380号)、又は、寄託機関:American Type Culture Collection (ATCC)(受託番号:ATCC BAA-918)に寄託されているため、入手が容易である。また、KOD1株の全塩基配列は決定されており、遺伝子組換え操作を行い易い。また、KOD1株の細胞抽出液には、高いヒドロゲナーゼ(水素生産に関与する生体触媒)の活性が存在することが判明している。また、KOD1株は、炭素源としてデンプンを利用できるため、有機性廃棄物を培養液に使用することができる。また、KOD1株の培養条件及び水素生産条件が既に判明している。また、KOD1株は野生株であるため、増殖能力が安定している。 The KOD1 strain is registered with the Depositary Organization: RIKEN BioResource Center, Microbial Materials Development Office (Accession No .: JCM 12380), or Depositor: American Type Culture Collection (ATCC) (Accession No .: ATCC BAA-918). Since it is deposited, it is easy to obtain. Further, the entire base sequence of the KOD1 strain has been determined, and gene recombination is easy to perform. Further, it has been found that the cell extract of the KOD1 strain has a high hydrogenase (biocatalyst involved in hydrogen production) activity. Moreover, since KOD1 strain can utilize starch as a carbon source, organic waste can be used for the culture solution. Moreover, the culture conditions and hydrogen production conditions of the KOD1 strain have already been clarified. In addition, since the KOD1 strain is a wild strain, its growth ability is stable.
酵母や各種の菌類には自己集塊性を持つものがあり、放置しても自然に塊となるが、本発明の対象となる菌体は自己集塊性がない。よって、水素を効率良く発生させるには、自己集塊性を擬似的に実現する必要がある。これは種々考究して発明者が見出した事実である。そして、自己集塊性を擬似的に実現する手段として支持体を利用する。支持体は菌体に自己集塊作用(すなわちバイオフィルム形成作用)を付加するものである。 Some yeasts and various fungi have a self-aggregation property, and even if left undisturbed, they spontaneously agglomerate. However, the fungus bodies targeted by the present invention do not have a self-aggregation property. Therefore, in order to generate hydrogen efficiently, it is necessary to artificially realize self-aggregation. This is a fact found by the inventors through various studies. Then, a support is used as a means for realizing the self-aggregation property in a pseudo manner. The support adds a self-aggregating action (that is, a biofilm forming action) to the bacterial cells.
具体的には、支持体は菌体を吸着するものである。この支持体は多孔質であることが好ましい。多孔性支持体における孔の孔径の分布は一定ではなく、統計学的分散が大きいものが大部分である。一方、菌体の大きさは、例えばKOD1株が成熟した場合において約1μmである。よって、多孔性支持体の孔の孔径は1μm以上であることが好ましい。これにより、菌体が多孔性支持体の内部に侵入して吸着され易くなる。 Specifically, the support is one that adsorbs bacterial cells. This support is preferably porous. The distribution of pore diameters in the porous support is not constant, and most of them have a large statistical dispersion. On the other hand, the cell size is about 1 μm when the KOD1 strain matures, for example. Therefore, the pore diameter of the porous support is preferably 1 μm or more. This makes it easier for the bacterial cells to enter the porous support and be adsorbed.
また、多孔性支持体の孔の孔径は20μm以上であることがより好ましい。これにより、増殖した菌体を多孔性支持体の内部において保持することができる。結果、菌体を高密度化することができる。また、多孔性支持体の孔の孔径は100μm以上であることがさらに好ましい。これにより、多孔性支持体の内部に吸着されている菌体に培養液を効率的に供給するとともに、消費された培養液(廃液)を多孔性支持体の外部に効率的に排出することができる。結果、多孔性支持体内の菌体の増殖を促進することができる。その他にも、多孔性支持体の内部においてバイオフィルムを形成することができるため、多孔性支持体内の菌体をより固定化することができる。 Further, the pore diameter of the porous support is more preferably 20 μm or more. Thereby, the proliferated microbial cells can be held inside the porous support. As a result, the cell density can be increased. The pore diameter of the porous support is more preferably 100 μm or more. Thereby, while supplying a culture solution efficiently to the microbial cells adsorbed inside the porous support, the consumed culture solution (waste solution) can be efficiently discharged to the outside of the porous support. it can. As a result, it is possible to promote the growth of microbial cells in the porous support body. In addition, since a biofilm can be formed inside the porous support, the cells in the porous support can be more immobilized.
なお、多孔性支持体の孔の孔径は300μm以下であることが好ましい。これにより、多孔性支持体の表面積を十分に広くし、菌体の吸着量を増加することができる。
支持体の形状は特に限定されないが、体積は小さいことが好ましい。体積が小さいと、培養槽内に支持体を所定量充填した際、培養槽の容量体積に対する全支持体の表面積が広がり、菌体が固定化し易くなるとともに、支持体を核としてバイオフィルムを形成することができる。
In addition, it is preferable that the hole diameter of the hole of a porous support body is 300 micrometers or less. Thereby, the surface area of a porous support body can be made sufficiently wide, and the adsorption amount of a microbial cell can be increased.
The shape of the support is not particularly limited, but the volume is preferably small. When the volume is small, when a predetermined amount of the support is filled in the culture tank, the surface area of the entire support increases with respect to the volume of the culture tank, making it easier to immobilize the cells and forming a biofilm with the support as the core. can do.
また、支持体には、吸着剤のコーティングや表面処理を施すことが好ましい。これにより、菌体の吸着量をさらに増加することができる。この吸着剤や表面処理としては、微生物を吸着し、かつ、菌体の培養温度において安定であるものが好適に用いられる。
例えば、キリンビール・酒伊エンジニヤリング社製のセルロース・キャリア(商品名:CellsnowTM)が挙げられる。
The support is preferably subjected to adsorbent coating or surface treatment. Thereby, the adsorption amount of a microbial cell can further be increased. As this adsorbent and surface treatment, those that adsorb microorganisms and are stable at the culture temperature of the cells are preferably used.
For example, there is a cellulose carrier (trade name: Cellsnow ™ ) manufactured by Kirin Beer / Sake Engineering Co., Ltd.
支持体の材質は、菌体を吸着する機能を有すればよく、例えば、天然スポンジ、合成スポンジ、活性炭、セラミック、イオン交換樹脂、ゼオライト、発泡れん石、溶融スラグ、酢酸セルロース繊維、ガラスビーズ、カーボン、シリカゲル、砂、アルミナ、モレキュラーシーブ、及びチタン酸化物からなる群から選ばれる1種または2種以上であることが好ましい。これらの支持体は、入手が容易であり、かつ加工が容易であるため、本発明に好適に用いることができる。 The material of the support only needs to have a function of adsorbing bacterial cells, for example, natural sponge, synthetic sponge, activated carbon, ceramic, ion exchange resin, zeolite, foam stone, molten slag, cellulose acetate fiber, glass beads, It is preferably one or more selected from the group consisting of carbon, silica gel, sand, alumina, molecular sieve, and titanium oxide. Since these supports are easily available and easy to process, they can be suitably used in the present invention.
本発明で用いられる培養液は、アミノ酸源及び炭素源を含んでいる。このアミノ酸源は、菌体の培養に一般に用いられるものであればよい。
炭素源としては、ピルビン酸、ピルビン酸塩、及びデンプン系多糖類等が挙げられる。これらの炭素源は、単独で又は複数を組み合わせて用いられる。
The culture solution used in the present invention contains an amino acid source and a carbon source. This amino acid source may be any one that is generally used for culturing bacterial cells.
Examples of the carbon source include pyruvic acid, pyruvate, and starch-based polysaccharides. These carbon sources are used alone or in combination.
ピルビン酸は酸性であるため、このピルビン酸を高濃度で用いると、培養液のpHが低下する。よって、炭素源としてピルビン酸を高濃度で用いる場合には、pH調整剤を用いて培養液のpHを5〜9に調整することが好ましい。これにより、菌体を良好に培養することができる。
なお、ピルビン酸の代わりにピルビン酸塩を用いると、培養液のpHが低下しないので、pH調整剤を用いる必要がなくなる。このピルビン酸塩としては、ピルビン酸ナトリウム等が挙げられる。このピルビン酸ナトリウムは、グルコースを原料として用いる発酵法により製造できる。また、化学合成によっても製造できる。
Since pyruvic acid is acidic, when this pyruvic acid is used at a high concentration, the pH of the culture solution decreases. Therefore, when pyruvic acid is used as a carbon source at a high concentration, it is preferable to adjust the pH of the culture solution to 5 to 9 using a pH adjuster. Thereby, a microbial cell can be cultured favorably.
In addition, when pyruvate is used instead of pyruvic acid, the pH of the culture solution does not decrease, so there is no need to use a pH adjuster. Examples of the pyruvate include sodium pyruvate. This sodium pyruvate can be produced by a fermentation method using glucose as a raw material. It can also be produced by chemical synthesis.
デンプン系多糖類としては、とうもろこしデンプン、馬鈴薯デンプン、甘藷デンプン、小麦デンプン、キャッサバデンプン、サゴデンプン、タピオカデンプン、米デンプン、豆デンプン、くずデンプン、わらびデンプン、はすデンプン、ひしデンプン等の生デンプン;α−デンプン、分別アミロース、湿熱処理デンプン等の物理的変性デンプン;加水分解デキストリン、酵素分解デキストリン、アミロース等の酵素変性デンプン;化学分解変性デンプン;化学変性デンプンなどが挙げられる。 As starch-based polysaccharides, raw starch such as corn starch, potato starch, sweet potato starch, wheat starch, cassava starch, sago starch, tapioca starch, rice starch, bean starch, waste starch, warabi starch, lotus starch, diamond starch; Physically modified starch such as α-starch, fractionated amylose, wet heat-treated starch; hydrolyzed dextrin, enzymatically modified dextrin, enzyme modified starch such as amylose; chemically degraded starch; chemically modified starch and the like.
デンプン系多糖類は、培養液に添加する際に可溶性であることが好ましいが、水と加熱することにより容易に可溶化するので、特に限定しなくてもよい。超好熱菌を用いて培養を行う場合には、約85℃の高温で培養することが多いので、常温で不溶性のデンプンであっても容易に可溶化できるという利点がある。デンプンは、周知のように、貯蔵用炭水化物として高等植物の種子、根茎等に多量に含まれる。 The starch-based polysaccharide is preferably soluble when added to the culture solution, but is not particularly limited because it is easily solubilized by heating with water. When culturing using a hyperthermophilic bacterium, since it is often cultured at a high temperature of about 85 ° C., there is an advantage that even starch that is insoluble at room temperature can be easily solubilized. As is well known, starch is contained in a large amount in seeds, rhizomes and the like of higher plants as storage carbohydrates.
培養液におけるピルビン酸、ピルビン酸塩、及びデンプン系多糖類の濃度は、菌体の培養に適した値であればよく、例えば、0.01〜20重量%の範囲が挙げられる。なお、ピルビン酸塩の濃度に関しては、塩基の重量を無視して計算するものとする。 The concentration of pyruvic acid, pyruvate, and starch-based polysaccharide in the culture solution may be any value that is suitable for culturing cells, and includes, for example, a range of 0.01 to 20% by weight. The pyruvate concentration is calculated by ignoring the weight of the base.
上述したアミノ酸源及び炭素源の他に、必要に応じて、培養槽内における培養液の液面を安定させる消泡剤や、ビタミン源である乾燥酵母エキス等の添加物を培養液内に添加することが好ましい。なお、培養液を培養槽内に供給する際には、予め培養液内の溶存酸素を窒素、アルゴン等の不活性ガスで置換させる。これにより、酸素によって培養が阻害されることを防止することができる。
なお、上述した培養液は、上記成分を人工的に調製してもよいが、アミノ酸源及び炭素源が豊富な、工場排水又は生活排水を、培養液の原料として利用してもよい。これにより、培養液の作製とともに廃棄物処理を同時に達成することができる。
In addition to the above-mentioned amino acid source and carbon source, additives such as an antifoaming agent that stabilizes the liquid level of the culture solution in the culture tank and a dry yeast extract that is a vitamin source are added to the culture solution as necessary. It is preferable to do. In addition, when supplying a culture solution in a culture tank, the dissolved oxygen in a culture solution is substituted by inert gas, such as nitrogen and argon, beforehand. Thereby, it can prevent that culture | cultivation is inhibited by oxygen.
In addition, although the culture solution mentioned above may prepare the said component artificially, you may utilize the factory wastewater or domestic wastewater with abundant amino acid sources and carbon sources as a raw material of a culture solution. Thereby, waste processing can be achieved simultaneously with preparation of a culture solution.
支持体、菌体、及び培養液を培養槽内に導入する方法としては、公知のものを用いることができる。例えば、予め滅菌処理を施した培養液を培養槽内に供給し、次いで培養槽内に支持体と菌体を添加してもよい。また、培養槽内に支持体及び培養液を供給し、滅菌処理を行った後、培養液に菌体を添加してもよい。さらに、菌体を培養液に植菌して前培養し、この前培養した培養液を予め滅菌処理を施した支持体及び培養液を有する培養槽内に添加することにより、本培養を開始してもよい。
なお、菌体を培養槽内に導入する際には、予め培養槽内の空気を不活性ガスで置換させることが好ましい。この不活性ガスとして、例えば、窒素又はアルゴンが挙げられる。これにより、酸素によって培養が阻害されることを防止することができる。
As a method for introducing the support, the fungus body, and the culture solution into the culture tank, known methods can be used. For example, a culture solution that has been sterilized in advance may be supplied into the culture tank, and then the support and the cells may be added to the culture tank. Moreover, after supplying a support body and a culture solution in a culture tank and performing a sterilization process, you may add a microbial cell to a culture solution. Further, the cells are inoculated into a culture solution and pre-cultured, and the pre-cultured culture solution is added to a culture tank having a sterilized support and a culture solution to start main culture. May be.
In addition, when introduce | transducing a microbial cell in a culture tank, it is preferable to replace the air in a culture tank with an inert gas previously. Examples of the inert gas include nitrogen or argon. Thereby, it can prevent that culture | cultivation is inhibited by oxygen.
このようにして、菌体を培養液中で培養する。培養温度は、菌体の培養に適した値であればよく、例えば、60〜105℃が挙げられる。サーモコッカス コダカラエンシスの最適生育温度は、約85℃であるので、この温度に近い程好ましい。また、培養液のpHも、菌体の培養に適した値であればよく、例えば、6.0〜7.0が挙げられる。サーモコッカス コダカラエンシスの最適生育pHは6.4付近であるので、このpH値に近い程好ましい。 In this way, the cells are cultured in the culture solution. The culture temperature should just be a value suitable for culture | cultivation of a microbial cell, for example, 60-105 degreeC is mentioned. The optimum growth temperature of Thermococcus kodakaraensis is about 85 ° C., and it is preferable that the temperature is closer to this temperature. Moreover, the pH of a culture solution should just be a value suitable for culture | cultivation of a microbial cell, for example, 6.0-7.0 are mentioned. Since the optimal growth pH of Thermococcus kodakaraensis is around 6.4, the closer to this pH value, the better.
培養が進行すると、培養槽内の菌体濃度が増加し、栄養源の需要も増加する。そこで、培養槽内の培養液の量、培養液の供給速度、及び供給する培養液の培地組成濃度を菌体濃度に応じて調整することが好ましい。これにより、菌体の増殖速度を最適に保持することができる。
なお、後述する実施例に記載の通り、炭素源及びアミノ酸源の濃度と、菌体濃度には比例関係がある。よって、培地組成の成分のうち炭素源とアミノ酸源を、菌体濃度に応じて調整することが好ましい。
As the culture progresses, the bacterial cell concentration in the culture tank increases and the demand for nutrients also increases. Therefore, it is preferable to adjust the amount of the culture solution in the culture tank, the supply rate of the culture solution, and the medium composition concentration of the supplied culture solution according to the bacterial cell concentration. Thereby, the growth rate of a microbial cell can be hold | maintained optimally.
In addition, as described in Examples described later, the concentration of the carbon source and the amino acid source is proportional to the bacterial cell concentration. Therefore, it is preferable to adjust the carbon source and amino acid source among the components of the medium composition according to the bacterial cell concentration.
菌体は、支持体の存在下で培養されると、支持体に吸着されるとともに炭素源由来の多糖類を排泄しながら増殖する。結果、多糖類が支持体において凝集するとともに菌体を取り込むことにより、バイオフィルムが形成される。バイオフィルムは菌体が吸着し易い化学的性質を有しており、このバイオフィルム内で菌体はさらに培養される。結果、菌体の固定化及び高密度化が達成される。 When the cells are cultured in the presence of a support, they are adsorbed on the support and proliferate while excreting the polysaccharide derived from the carbon source. As a result, a biofilm is formed by the polysaccharides aggregating on the support and taking up the cells. Biofilms have chemical properties that facilitate the adsorption of bacterial cells, and the bacterial cells are further cultured in the biofilm. As a result, fixation and densification of the bacterial cells are achieved.
このように、バイオフィルムには、菌体が高密度に固定化されているため、培養液中に分散されている場合と比較して、高い水素生産能が備わっている。従って、バイオフィルムの状態で菌体を培養することにより、水素を効率的に製造することができる。 Thus, since the microbial cells are fixed with high density in the biofilm, the biofilm has a higher hydrogen production ability than in the case where it is dispersed in the culture solution. Therefore, hydrogen can be efficiently produced by culturing cells in the state of a biofilm.
(水素製造装置)
本発明の水素製造装置の一例を図1に示す。
培養槽10は菌体が培養されるところである。この培養槽10は、支持体11、菌体12、及び培養液を有する。培養液の液面上には、不活性ガス及び菌体12により産生された水素が存在している。また、培養槽10の周囲(例えば側面及び底面)には、加熱手段13が設けられており、培養槽10内の温度を60〜105℃に制御可能になっている。加熱手段13の具体例としては、シリコンラバーヒーターやマントルヒーターが挙げられる。
なお、図1において、支持体11は四角形、菌体12は丸、バイオフィルムは六角形で表されている。
(Hydrogen production equipment)
An example of the hydrogen production apparatus of the present invention is shown in FIG.
The
In FIG. 1, the
培養槽10は、超好熱菌であるサーモコッカス コダカラエンシスを培養することから、約100℃の温度に耐えられるものである必要がある。また、サーモコッカス コダカラエンシスは嫌気性であるため、酸素透過率は小さいものである必要がある。また、培養槽10内に供給される培養液には高濃度の塩が使用されることがあり、かつ、超好熱菌の培養時に硫化水素が発生することがあるため、培養槽10は、耐腐食性が高いものである必要がある。従って、培養槽10の材質としては、上記特性を有する、アルミニウム、ステンレス鋼、ハステロイなどの耐酸性金属が用いられる。前記ステンレス鋼の中では、安価であり、かつ、入手が容易であることから、オーステナイト系ステンレス鋼が好ましく、SUS316L、SUS304等が特に好ましい。
The
先に例示された材質には、樹脂をコーティング又はライニングすることが好ましい。これにより、耐腐食性をさらに向上することができる。この樹脂としては、炭素と水素のみからなる樹脂(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン)が挙げられるが、耐熱性が高いことから、フッ素樹脂が好ましい。このフッ素樹脂の中でも、特にポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリクロロトリフルオロエチレン(PCTFE)、テトラフルオロエチレン−パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体(PFA)、テトラフルオロエチレン−ヘキサフルオロプロピレン共重合体(FEP)などが特に好ましい。
なお、培養槽10の形状は、培養に適したものであればよく、例えば円筒形が挙げられる。
The material exemplified above is preferably coated or lined with a resin. Thereby, corrosion resistance can further be improved. Examples of this resin include resins consisting only of carbon and hydrogen (for example, polyethylene and polypropylene), but a fluororesin is preferred because of its high heat resistance. Among these fluororesins, polytetrafluoroethylene (PTFE), polychlorotrifluoroethylene (PCTFE), tetrafluoroethylene-perfluoroalkyl vinyl ether copolymer (PFA), tetrafluoroethylene-hexafluoropropylene copolymer ( FEP) and the like are particularly preferable.
In addition, the shape of the
培養槽10の底部には、培養液貯槽21と、該培養液貯槽21内の培養液を培養槽10に供給する培養液供給管22とから構成される培養液供給手段20が設けられている。培養槽10と培養液貯槽21は培養液供給管22を介して接続されている。この培養液供給手段20により、上記培養液が培養槽10に供給される。
なお、本発明において「底部」とは、重力方向における培養槽10の端部をいい、後述する「頂部」とは、重力方向に対して逆方向における培養槽10の端部をいう。
At the bottom of the
In the present invention, the “bottom” refers to the end of the
培養槽10の側面には、培養槽10内の培養液を廃液として回収可能な廃液回収管32と、該廃液回収管32に接続する廃液回収槽31とから構成される廃液回収手段30が設けられている。培養槽10と廃液回収槽31は廃液回収管32を介して接続されている。この廃液回収手段30により、培養槽10内において発生する廃液が回収される。
なお、本発明において、「廃液」とは、アミノ酸源及び炭素源が菌体12によって消費され、かつ菌体12の排泄物を含む培養液をいう。
Provided on the side surface of the
In the present invention, the “waste liquid” refers to a culture liquid in which an amino acid source and a carbon source are consumed by the
廃液回収管32には、pH電極33が取り付けられており、このpH電極33は、制御装置34と通信可能に接続されている。菌体12は炭素源を代謝して酢酸等の酸を排泄するため、培養液のpHは通常低下している(酸性の度合いが強くなっている。)。そこで、pH電極33及び制御装置34を用いて廃液のpHを測定することにより、培養液の利用状況を評価することができる。
なお、回収した廃液はそのまま廃棄してもよい。また、pHの測定及び調整を行った後、培養槽10に再供給してもよい。このように廃液を再利用することにより、培養液の利用効率を向上することができる。
A
The recovered waste liquid may be discarded as it is. Moreover, after measuring and adjusting pH, you may supply to the
培養槽10の頂部には、培養槽10内の水素を含むガスを回収可能な水素ガス回収管42と、該水素ガス回収管42に接続する水素ガス回収槽41とから構成される水素ガス回収手段40が設けられている。培養槽10と水素ガス回収槽41は水素ガス回収管42を介して接続されている。この水素ガス回収手段40により、不活性ガス及び菌体12が産生する水素等の培養槽10内におけるガスが回収される。なお、水素ガス回収手段41には、ガスクロマトグラフ分析計を取り付けてもよい。これにより、回収したガスの成分を測定することができる。
At the top of the
培養槽10の底部には、アルカリ溶液貯槽51と、該アルカリ溶液貯槽51内のアルカリ溶液を培養槽10に供給するアルカリ溶液供給管52とから構成されるアルカリ溶液供給手段50が設けられている。培養槽10とアルカリ溶液貯槽51はアルカリ溶液供給管52を介して接続されている。アルカリ溶液供給手段50は、アルカリ溶液を培養槽10に供給するものである。アルカリ溶液は特に限定されず、例えば水酸化ナトリウム水溶液が挙げられる。
上述のように、菌体12の代謝により培養液のpHが低下するので、培養液供給手段20からの培養液の供給及び廃液回収手段30への廃液の排出により、培養液のpHを高めて菌体の代謝を維持する必要がある。新規の培養液供給でもpHが好適な範囲を下回る場合には、アルカリ溶液供給手段50からアルカリ溶液を培養槽10に供給して、培養液のpHを調整する。
なお、アルカリ溶液を培養槽10内に供給する際には、予めアルカリ溶液内の溶存酸素を窒素、アルゴン等の不活性ガスで置換させる。これにより、酸素によって培養が阻害されることを防止することができる。
At the bottom of the
As described above, since the pH of the culture solution decreases due to the metabolism of the
In addition, when supplying an alkaline solution into the
図2に、本発明の水素製造装置の培養槽10内における支持体11及び菌体12によるバイオフィルムの形成過程を示す。図2においても、図1と同様に、支持体11は四角形、菌体12は丸、バイオフィルムは六角形で表されている。
図2(A)は、培養の初期段階における培養槽10内の状態を示している。培養槽10内では、支持体11及び菌体12が分散しており、底部から供給される培養液によって、例えば、図の矢印方向に沿って還流する。すなわち、流動床が形成される。なお、菌体12の一部は、支持体11に吸着されている。
In FIG. 2, the formation process of the biofilm by the
FIG. 2A shows a state in the
図2(B)は、培養の中期段階における培養槽10内の状態を示している。培養の進行とともに、支持体11上においてバイオフィルムが形成される。このバイオフィルムは他のバイオフィルムと接着し、自重によって培養槽10の下部に堆積する。一方、培養槽10の上部においては、培養液内に分散している支持体11及び菌体12が、図の矢印方向に沿って還流している。すなわち、固定床と流動床の両方が形成される。
FIG. 2B shows a state in the
図2(C)は、培養の後期段階における培養槽10内の状態を示している。この段階では、バイオフィルムが培養液の液面の近くにまで堆積する。すなわち、固定床が形成される。菌体12は、固定床においてさらに培養されて高密度化される。
このように、本発明の水素製造装置によれば、菌体12の固定化及び高密度化を容易に達成することができる。また、高密度に固定化された菌体12を用いることにより、水素を高い生産速度及び高い生産性で製造することができる。
FIG. 2C shows a state in the
Thus, according to the hydrogen production apparatus of the present invention, it is possible to easily achieve the immobilization and densification of the
以下、実施例により、本発明をさらに詳しく説明する。本発明は、下記実施例に何ら制限されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. The present invention is not limited to the following examples.
(実施例1)支持体11を用いた菌体12の固定化
実施例1では、支持体11を用いて菌体12の固定化を行った。
(1)KOD1株の培養
先ず、内容積が約1,000mlの密閉ガラス容器内に、培地組成Aの培養液800mlを充填し、高圧蒸気滅菌処理(121℃、20分)を行った。その後、嫌気性培養装置(型式:EAN−140、タバイエスペック社製)を用い、嫌気性雰囲気下で植菌量が1体積%になるようにKOD1株(種菌溶液を8.0ml)を添加し、次いで、乾燥機(プログラムオーブン、型式:MOV−212P、三洋電機株式会社製)で、85℃、14時間回分培養を行った。
(Example 1) Immobilization of
(1) Culture of KOD1 strain First, 800 ml of culture solution of medium composition A was filled in a sealed glass container having an internal volume of about 1,000 ml and subjected to high-pressure steam sterilization (121 ° C., 20 minutes). Then, using an anaerobic culture device (model: EAN-140, manufactured by Tabai Espec), add KOD1 strain (8.0 ml of the seed solution) so that the inoculum is 1% by volume under anaerobic atmosphere. Subsequently, the cells were cultured at 85 ° C. for 14 hours in a dryer (program oven, model: MOV-212P, manufactured by Sanyo Electric Co., Ltd.).
培地組成Aは、マリンアートSF−1試験研究用人工海水(富田製薬株式会社製)30.4g/l(規定量0.8倍希釈)、微生物培地用特製乾燥酵母エキス5g/l(ナカライテスク株式会社製)、微生物培地用特製トリプトン5g/l(ナカライテスク株式会社製)、ピルビン酸ナトリウム5g/l(ナカライテスク株式会社製)、及び水を有する。なお、マリンアートは海水と同じ成分を含む塩類の混合物、トリプトンはタンパク質をトリプシンで部分加水分解したものである。 Medium composition A consists of 30.4 g / l of artificial seawater for marine art SF-1 test research (manufactured by Tomita Pharmaceutical Co., Ltd.) (diluted 0.8 times the specified amount), 5 g / l of special dry yeast extract for microorganism medium (Nacalai Tesque Co., Ltd.), special tryptone for microorganism medium 5 g / l (manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd.), sodium pyruvate 5 g / l (manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd.), and water. Marine art is a mixture of salts containing the same components as seawater, and tryptone is obtained by partially hydrolyzing protein with trypsin.
なお、培地組成Aにおける炭素源(ピルビン酸ナトリウム)及びアミノ酸源(トリプトン)の濃度を2倍にした培養液を用いてKOD1株を従来の方法で連続培養したところ、培地組成Aの培養液と比較して、菌体濃度が28%、水素発生速度が56%向上した。また、培地組成Aにおける炭素源をマルトデキストリン5g/l(商品名:アミコールNo.3−L、日澱化学株式会社製)に変更した培地組成Bにおいて、炭素源(マルトデキストリン)及びアミノ酸源(トリプトン)の濃度を2倍にした培養液を用いてKOD1株を従来の方法で連続培養したところ、培地組成Bの培養液と比較して、菌体濃度が27%、水素発生速度が52%向上した。また、炭素源(マルトデキストリン)及びアミノ酸源(トリプトン)の濃度を3倍にした培養液を用いた場合には、培地組成Aの培養液と比較して、菌体濃度が40%、水素発生速度が83%向上した。この結果から、水素生産に関与するサーモコッカス コダカラエンシスの必須成分は炭素源及びアミノ酸源であることが判明した。 The KOD1 strain was continuously cultured by a conventional method using a culture solution in which the concentration of the carbon source (sodium pyruvate) and the amino acid source (tryptone) in the medium composition A was doubled. In comparison, the bacterial cell concentration was improved by 28% and the hydrogen generation rate was improved by 56%. Further, in the medium composition B in which the carbon source in the medium composition A was changed to maltodextrin 5 g / l (trade name: Amicol No. 3-L, manufactured by Nissho Chemical Co., Ltd.), the carbon source (maltodextrin) and amino acid source ( When the KOD1 strain was continuously cultured by a conventional method using a culture solution in which the concentration of tryptone) was doubled, the cell concentration was 27% and the hydrogen generation rate was 52% compared to the culture solution of medium composition B. Improved. In addition, when a culture solution in which the concentration of the carbon source (maltodextrin) and amino acid source (tryptone) is tripled is used, the cell concentration is 40% compared to the culture solution of the medium composition A, and hydrogen is generated. Speed increased by 83%. From these results, it was found that the essential components of Thermococcus kodakaraensis involved in hydrogen production are a carbon source and an amino acid source.
種菌溶液は、培養液でKOD1株を85℃の乾燥機(プログラムオーブン、型式:MOV−212P、三洋電機株式会社製)で10時間、回分培養した菌体保存用溶液である。この培養液は、培地組成がマリンアートSF−1試験研究用人工海水(富田製薬株式会社製)30.4g/l(規定量0.8倍希釈)、微生物培地用特製乾燥酵母エキス5g/l(ナカライテスク株式会社製)、微生物培地用特製トリプトン5g/l(ナカライテスク株式会社製)、硫黄粉末5g/l(和光純薬工業株式会社製)であって、硫黄以外を高圧蒸気滅菌処理(121℃、20分)したものである。なお、硫黄は、滅菌処理後の培養液に添加した。 The inoculum solution is a cell-preserving solution obtained by culturing the KOD1 strain with a culture solution in a 85 ° C. dryer (program oven, model: MOV-212P, manufactured by Sanyo Electric Co., Ltd.) for 10 hours. This culture solution is composed of 30.4 g / l of artificial seawater for marine art SF-1 test and research (manufactured by Tomita Pharmaceutical Co., Ltd.) (diluted 0.8 times the specified amount), and 5 g / l of special dry yeast extract for microbial medium. (Manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd.), special tryptone for microorganism culture medium 5 g / l (manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd.), sulfur powder 5 g / l (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and high-pressure steam sterilization treatment other than sulfur ( 121 ° C., 20 minutes). Sulfur was added to the culture solution after sterilization.
高圧蒸気滅菌処理は、オートクレーブSX−500(株式会社トミー精工製)を用い、121℃、20分、0.1MPa加圧の条件で行った。
嫌気性培養装置(型式:EAN−140、タバイエスペック社製)における嫌気性雰囲気は、窒素ガスベース、水素3%の混合ガス(ジャパン・エア・ガシズ株式会社製)を用いて調製された。
The autoclave sterilization process was performed using an autoclave SX-500 (manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.) under the conditions of 121 ° C., 20 minutes, and 0.1 MPa pressure.
The anaerobic atmosphere in the anaerobic culture apparatus (model: EAN-140, manufactured by Tabai Espec) was prepared using a nitrogen gas base and a 3% hydrogen mixed gas (manufactured by Japan Air Gases Co., Ltd.).
(2)支持体11を含む培養液の調製
内容積約300mlの密閉ガラス容器内に、培地組成Aの培養液80mlを充填したものを6本用意し、高圧蒸気滅菌処理(121℃、20分)した。その後、嫌気性培養装置を用いた嫌気性雰囲気下で、5本の密閉ガラス容器に支持体Aから支持体Eを1本につき1種類添加した。図3に、支持体Aから支持体Eを示す。なお、残り1本の密閉ガラス容器には支持体11を添加しなかった。6本の密閉ガラス容器を、インキュベーター(型式:MIR−162、三洋電機株式会社製)内に60℃、2時間入れ、支持体11を培養液内で平衡化した。
(2) Preparation of culture
支持体Aは市販スポンジ、材質はポリウレタンフォームである。支持体Bは排水処理用スポンジ(株式会社バイオキャリアテクノロジー製、流動床用担体リガンドキャリア使用、BOD処理等の微生物群固定化用)である。支持体Cは活性炭(ナカライテスク株式会社製、粒状(歴青炭製)、粒径:8〜30メッシュ)である。支持体Dはイオン交換樹脂,ダイヤイオンHP20(三菱化学株式会社製、有効径0.25mm以上、粒径分布250μmが90%以上)である。支持体Eはセラミック(株式会社クボタ製、オリジナル商品)である。
なお、支持体Bの処理能力は13g−担体量/L−排水量であり、密閉ガラス容器の体積や支持体11への菌体12の吸着特性を経時的に把握することを考慮し、支持体11の量を1.0g とした。
The support A is a commercially available sponge and the material is polyurethane foam. The support B is a sponge for wastewater treatment (manufactured by Biocarrier Technology Co., Ltd., using fluidized bed carrier ligand carrier, for immobilizing microorganisms such as BOD treatment). The support C is activated carbon (manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd., granular (manufactured by bituminous coal), particle size: 8 to 30 mesh). The support D is an ion exchange resin, Diaion HP20 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation, effective diameter 0.25 mm or more, particle size distribution 250 μm is 90% or more). The support E is ceramic (manufactured by Kubota Corporation, original product).
In addition, the processing capacity of the support B is 13 g-carrier amount / L-drainage amount, and it is necessary to grasp the volume of the sealed glass container and the adsorption characteristics of the
(3)支持体11を含む培養液を用いたKOD1株の培養
嫌気性培養装置を用いた嫌気性雰囲気下で、14時間回分培養した(1)の培養液を、(2)で調製した6本のサンプルにメスシリンダーで120mlずつ添加した。その後、支持体11と菌体12を含む培養液を馴染ませるために、乾燥機で85℃、2時間、回分培養を行った。
(3) Culture of KOD1 strain using culture
(4)菌体濃度の測定
(3)における回分培養の後、6本のサンプルを室温に放置し、菌体12の増殖を停止させた。8時間に1回程度、各サンプルを攪拌し、支持体11と菌体12を含む培養液を馴染ませた。定期的に嫌気性培養装置を用いた嫌気性雰囲気下で、各サンプルの上清を5mlサンプリングし、デジタル比色計簡易ODモニター(型式:mini photo 518R、タイテック株式会社製)を用いて波長660nmの吸光度(absorbance)を測定した。これにより、菌体濃度を測定した。
(4) Measurement of bacterial cell concentration After batch culture in (3), 6 samples were left at room temperature to stop the growth of
菌体濃度は次式で求めた。
菌体濃度[g/l]=波長660nmの吸光度値[−]×0.35[g/l] (培地組成Aの場合)
定期的にサンプルの上清の菌体濃度を測定することで、菌体12が支持体11に固定化(吸着)される経時変化を把握し、支持体11の評価を行った。
The bacterial cell concentration was determined by the following formula.
Cell concentration [g / l] = absorbance value at a wavelength of 660 nm [−] × 0.35 [g / l] (in the case of medium composition A)
By periodically measuring the cell concentration of the supernatant of the sample, changes over time in which the
図4に、培養時間に対する菌体濃度のグラフを示す。図4から、支持体11を有するサンプルの上清における菌体12の濃度が、培養開始から50時間後に低下していることがわかった。特に、支持体Aと支持体Bを用いた場合に、上清における菌体12の濃度が50%以上低下していることがわかった。この結果は、支持体11に菌体12が、時間の経過とともに、固定化されていることを示している。
FIG. 4 shows a graph of the cell concentration against the culture time. From FIG. 4, it was found that the concentration of the
支持体Bの排水処理用スポンジには、素材の表面に微生物(活性汚泥)を吸着して固定化を促す機能を持つ微生物吸着剤がコーティングされているため、優れた固定化能を示したものと考えられる。 The sponge for wastewater treatment of the support B is coated with a microbial adsorbent that has the function of adsorbing microorganisms (activated sludge) on the surface of the material and promoting immobilization, so that it has excellent immobilization ability it is conceivable that.
(実施例2)支持体11を用いたバイオフィルム及び水素の製造
実施例2では、支持体11を用いてバイオフィルム及び水素を製造した。
(1)支持体11の準備
支持体11として、耐熱温度が約90℃、材質がメラミン樹脂であるスポンジ(以下、単に「スポンジ」という。)を用いた。このスポンジを約5mm角に細かく切断して表面積を広げた。これにより、菌体12を固定化し易くするとともに、スポンジを核にバイオフィルムを形成し易くした。
Example 2 Production of Biofilm and
(1) Preparation of
(2)培養装置の説明
培養装置としては、大陽日酸株式会社製の卓上型嫌気性好熱菌培養装置(培養槽内積:1.0L、側面ヒーター及び底面ヒーターの加熱手段付き)を用いた。
(2) Description of the culture apparatus As the culture apparatus, a table type anaerobic thermophilic culturing apparatus manufactured by Taiyo Nippon Sanso Co., Ltd. (culture tank inner product: 1.0 L, with heating means for side and bottom heaters) is used. Using.
(3)培養液の組成
培養液としては、培地組成Bを有するものを用いた。
培地組成Bは、マリンアートSF−1試験研究用人工海水30.4g/l(規定量0.8倍希釈)、微生物培地用特製乾燥酵母エキス5g/l、微生物培地用特製トリプトン5g/l、マルトデキストリン5g/l(商品名:アミコールNo.3−L、日澱化学株式会社製)、1%アデカノール水溶液0.5ml/l−培養液、(原液はアデカノールLG−109、旭電化工業株式会社製)、及び水を有する。なお、1%アデカノール水溶液は消泡剤であり、連続培養時に、菌体12がバイオガスを産生し、培養液が泡立つことにより、液面制御装置が誤作動することを防止する効果を有する。
(3) Composition of culture solution As the culture solution, one having medium composition B was used.
Medium composition B is 30.4 g / l of artificial seawater for marine art SF-1 test and research (normal amount 0.8-fold dilution), 5 g / l of special dry yeast extract for microbial medium, 5 g / l of special tryptone for microbial medium, Maltodextrin 5 g / l (trade name: Amicol No. 3-L, manufactured by Nissho Chemical Co., Ltd.), 1% adecanol aqueous solution 0.5 ml / l-culture solution (stock solution is Adecanol LG-109, Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.) Product), and water. Note that the 1% adecanol aqueous solution is an antifoaming agent, and has an effect of preventing the liquid level control device from malfunctioning when the
(4)培養準備
培地組成Bに示す培養液500mlを培養装置の培養槽に充填した。この培養槽を高圧蒸気滅菌処理(121℃、20分)した後、(1)で準備したスポンジ0.5gを培養槽に添加した。その後、スポンジや培養液中の溶存酸素を低減し、培養槽内を嫌気性雰囲気下にするため、不活性ガス供給手段(培養装置付属のデジタルマスフローコントローラー型式:SEC−E40、株式会社エステック製)から培養液中に窒素を100ml/minにて通気した。窒素としては、工業用窒素(大陽日酸株式会社製)を使用した。
スポンジを培養液で平衡化させ、馴染ませるために、培養装置付属の攪拌翼を用いて、攪拌速度50rpmで培養槽内を攪拌した。攪拌翼にSUS網(材質:18−8ステンレス鋼)を装着することで、攪拌翼による物理的影響(例えば、せん断応力)を防止し、スポンジを核にバイオフィルムを形成し易くした。植菌しやすい環境、スポンジの殺菌のために、培養装置付属の側面ヒーター、底面ヒーター、温度センサー(側温抵抗体)を用いて培養槽内温度を85℃に制御した。
(4) Culture preparation 500 ml of the culture solution shown in the medium composition B was filled in the culture tank of the culture apparatus. This culture tank was autoclaved (121 ° C., 20 minutes), and 0.5 g of the sponge prepared in (1) was added to the culture tank. After that, in order to reduce dissolved oxygen in the sponge and culture medium and to make the inside of the culture tank under an anaerobic atmosphere, an inert gas supply means (digital mass flow controller model attached to the culture apparatus: SEC-E40, manufactured by ESTEC Co., Ltd.) Then, nitrogen was aerated at 100 ml / min into the culture solution. As nitrogen, industrial nitrogen (manufactured by Taiyo Nippon Sanso Corporation) was used.
In order to equilibrate and adapt the sponge with the culture solution, the inside of the culture vessel was stirred at a stirring speed of 50 rpm using a stirring blade attached to the culture apparatus. By attaching a SUS net (material: 18-8 stainless steel) to the stirring blade, physical influence (for example, shear stress) by the stirring blade was prevented, and a biofilm was easily formed using a sponge as a core. In order to sterilize the sponge-friendly environment and sponge, the temperature in the culture tank was controlled at 85 ° C. using the side heater, bottom heater, and temperature sensor (side temperature resistor) attached to the culture apparatus.
(5)前培養操作
前培養は、内容積約300mlの密閉ガラス容器内に、培地組成Bの培養液200mlを充填し、高圧蒸気滅菌処理(121℃、20分)した。その後、嫌気性培養装置を用いた嫌気性雰囲気下で植菌量が1体積%になるようにKOD1株(種菌溶液を2.0ml)を添加し、次いで、乾燥機で85℃、11時間、回分培養を行った。
(5) Pre-culture operation In pre-culture, 200 ml of culture solution of medium composition B was filled in a sealed glass container having an internal volume of about 300 ml and subjected to high-pressure steam sterilization (121 ° C., 20 minutes). Then, KOD1 strain (2.0 ml of inoculum solution) was added so that the inoculation amount was 1% by volume in an anaerobic atmosphere using an anaerobic culture apparatus, and then 85 ° C. for 11 hours in a dryer. Batch culture was performed.
(6)回分培養操作
(5)の前培養した培養液150mlを(4)で準備したスポンジ0.5gと培地組成Bの培養液500mlが充填した培養槽中に植菌した(30体積%植菌を実施)。植菌後も(4)の培養準備と同様の条件下で回分培養を2時間行った。
回分培養の間、定期的に培養装置付属のポンプを用いて培養槽内の培養液を約5〜20mlサンプリングし、デジタル比色計簡易ODモニターを用いて、波長660nmの吸光度を測定した。これにより、培養液の菌体濃度を測定した。
(6) Batch culture operation 150 ml of the pre-cultured culture solution of (5) was inoculated into a culture tank filled with 0.5 g of the sponge prepared in (4) and 500 ml of culture medium of medium composition B (30% by volume planting). Conduct fungus). Even after inoculation, batch culture was performed for 2 hours under the same conditions as the culture preparation in (4).
During batch culture, about 5 to 20 ml of the culture solution in the culture tank was sampled periodically using the pump attached to the culture apparatus, and the absorbance at a wavelength of 660 nm was measured using a digital colorimeter simple OD monitor. Thereby, the cell density | concentration of the culture solution was measured.
菌体濃度は次式で求めた。
菌体濃度[g/l]=波長660nmの吸光度値[−]×0.53[g/l](培地組成Bの場合)
回分培養の間、定期的に培養槽内を通過したガスの一部をガスクロマトグラフ分析計(GC−TCD熱伝導式検出器:GC−8A型、株式会社島津製作所製)に送り、その成分を測定した。
The bacterial cell concentration was determined by the following formula.
Cell concentration [g / l] = absorbance value at a wavelength of 660 nm [−] × 0.53 [g / l] (in the case of medium composition B)
During batch culture, part of the gas that periodically passed through the culture tank is sent to a gas chromatograph analyzer (GC-TCD thermal conductivity detector: GC-8A type, manufactured by Shimadzu Corporation), and its components are It was measured.
(7)連続培養操作
回分培養を2時間行った後、連続培養を開始した。具体的には、マスターフレックスデジタル送液ポンプ(7524−40型、ヤマト科学株式会社製)を用いて、高圧蒸気滅菌処理(121℃、20分)後の培地組成Bの培養液を、培養槽内に連続的に供給した。培養装置付属の液面センサーと定量送液ポンプ(RP−1000型、東京理科化器械株式会社製)を用いて培養槽内の培養液を500mlに液面制御した。なお、回分培養終了後における培養槽内の培養液の菌体濃度は0.1g/l以上であった。
(7) Continuous culture operation After performing batch culture for 2 hours, continuous culture was started. Specifically, the culture solution of the medium composition B after high-pressure steam sterilization (121 ° C., 20 minutes) using a master flex digital liquid pump (7524-40 type, manufactured by Yamato Scientific Co., Ltd.) Was continuously fed into. Using a liquid level sensor attached to the culture apparatus and a quantitative liquid feeding pump (RP-1000 type, manufactured by Tokyo Science Instruments Co., Ltd.), the culture liquid in the culture tank was controlled to a liquid level of 500 ml. In addition, the cell density | concentration of the culture solution in a culture tank after completion | finish of batch culture was 0.1 g / l or more.
連続培養の開始と同時に、培養装置付属のpH複合電極(型式:DPZ−220、株式会社丸菱バイオエンジ製)を用いて、酸(0.2〜0.4N HCl水溶液を使用)供給、アルカリ(0.2〜0.4mol/l NaOH水溶液を使用)供給を行い、pH6.4に制御した。なお、HCl水溶液、NaOH水溶液は、窒素ガスで脱気した。窒素としては、工業用窒素(大陽日酸株式会社製)を使用した。窒素ガスの供給流量は約50 ml/minであった。連続培養の間も、(6)の回分培養操作と同様に、定期的に菌体濃度とガス分析を実施した。 Simultaneously with the start of continuous culture, acid (using 0.2 to 0.4N HCl aqueous solution) is supplied using a pH composite electrode (model: DPZ-220, manufactured by Maruhishi Bio-Engine Co., Ltd.), alkaline (0.2-0.4 mol / l NaOH aqueous solution was used) was supplied and controlled to pH 6.4. The aqueous HCl solution and aqueous NaOH solution were degassed with nitrogen gas. As nitrogen, industrial nitrogen (manufactured by Taiyo Nippon Sanso Corporation) was used. The supply flow rate of nitrogen gas was about 50 ml / min. During the continuous culture, the bacterial cell concentration and gas analysis were periodically performed in the same manner as the batch culture operation of (6).
培地組成Bの培養液も、デジタルマスフローコントローラー(型式CMQ0002、株式会社山武製)を用いて、窒素ガスで通気した。窒素ガスの供給流量は100ml/minであった。また、通気とともに、HCl水溶液、NaOH水溶液、及び培養液を混合した。
連続培養条件としては、温度85℃、攪拌速度50rpm、pH6.4、培養槽供給用窒素ガス流量200ml/minを選択した。この培養条件下で連続培養を行った。菌体12が産生した水素は菌体12の増殖を阻害するため、窒素ガス供給流量は回分培養時と比較して2倍にした。
The culture solution of medium composition B was also aerated with nitrogen gas using a digital mass flow controller (model CMQ0002, manufactured by Yamatake Corporation). The supply flow rate of nitrogen gas was 100 ml / min. Moreover, HCl aqueous solution, NaOH aqueous solution, and culture solution were mixed with aeration.
As continuous culture conditions, a temperature of 85 ° C., a stirring speed of 50 rpm, pH 6.4, and a nitrogen gas flow rate of 200 ml / min for supplying the culture tank were selected. Continuous culture was performed under these culture conditions. Since the hydrogen produced by the
連続培養開始から約55時間後に菌体濃度が安定した。そこで、この時点で、バイオフィルム及び水素の製造量を高めるため、供給する培養液の組成を培地組成Bから培地組成Cに変更した。 The cell concentration became stable after about 55 hours from the start of continuous culture. Therefore, at this time, the composition of the culture solution to be supplied was changed from the medium composition B to the medium composition C in order to increase the production amount of biofilm and hydrogen.
培地組成Cは、微生物培地用特製トリプトンとマルトデキストリンをそれぞれ10g/l有することを除いては、培地組成Bと同じである。培地組成Cは培地組成Bと比較して、マルトデキストリンとトリプトンの濃度を2倍にした。培地組成Cの培養液も高圧蒸気滅菌処理(121℃、20分)した後にデジタルマスフローコントローラーを用いて、窒素ガスで脱気・培養液を混合しながら、培養槽に供給した。窒素ガスの供給流量は約100ml/minであった。 The medium composition C is the same as the medium composition B except that it has 10 g / l each of a special tryptone for microorganism medium and maltodextrin. The medium composition C was twice the concentration of maltodextrin and tryptone compared to the medium composition B. The culture medium of medium composition C was also subjected to high-pressure steam sterilization (121 ° C., 20 minutes) and then supplied to the culture tank using a digital mass flow controller while mixing the degassed / cultured liquid with nitrogen gas. The supply flow rate of nitrogen gas was about 100 ml / min.
希釈率は単位時間に平均何回培養槽の培養液が新鮮な培地(栄養源) と入れ換わるかを表す。希釈率の値が大きいほど培養槽内の菌体12の希釈度が増加する。希釈率Dは次式で求めた。
希釈率D[hr−1]=新鮮な培地(栄養源)供給速度[L/hr]/培養液量[L]
希釈率を高めると、菌体の細胞分裂が活発化され、水素生産量が向上するだけでなく、炭素源を代謝した際の多糖類の生成量も向上する。よって、バイオフィルムが形成され易くなる。したがって、希釈率とバイオフィルムのサイズは比例関係にある。そこで、培地組成Cの希釈率を高めることで、菌体12の増殖速度も高め、バイオフィルム製造量、水素製造量を高めた。具体的には、希釈率を先ず0.3に設定し、次いで0.6、1.2[hr−1]に順番に高めた。
The dilution rate represents the average number of times the culture medium in the culture tank is replaced with a fresh medium (nutrient source) per unit time. The greater the dilution rate, the greater the dilution of the
Dilution rate D [hr −1 ] = fresh medium (nutrient source) supply rate [L / hr] / culture liquid amount [L]
Increasing the dilution rate not only activates cell division of the cells and improves the amount of hydrogen production, but also increases the amount of polysaccharide produced when the carbon source is metabolized. Therefore, a biofilm is easily formed. Therefore, the dilution rate and the biofilm size are in a proportional relationship. Therefore, by increasing the dilution rate of the medium composition C, the growth rate of the
(8)バイオフィルムの観察
電界放出形走査電子顕微鏡(S−4700形、株式会社日立製作所製)を用いて、産生されたバイオフィルムを観察し、バイオフィルム内に菌体12が固定化されているかどうかを確認した。
(8) Observation of biofilm Using a field emission scanning electron microscope (S-4700, manufactured by Hitachi, Ltd.), the produced biofilm was observed, and the
(9)結果1(バイオフィルムの製造)
スポンジを用いた連続培養(実施例2の(1)〜(7)の操作)を行った結果、バイオフィルムを製造することができた。図5及び図6に、得られたバイオフィルムの写真を示す。なお、植菌から連続培養終了までの全培養時間は162時間であった。
比較例としてスポンジを用いない従来の連続培養(実施例2のスポンジを利用しない(2)〜(7)の操作)を行ったところ、図5及び図6に示すような形状のバイオフィルムは製造できなかった。
よって、スポンジを利用することで、バイオフィルムを特異的に製造することができることが明らかとなった。
(9) Result 1 (Manufacture of biofilm)
As a result of continuous culture (operations (1) to (7) in Example 2) using a sponge, a biofilm could be produced. 5 and 6 show photographs of the obtained biofilm. The total culture time from the inoculation to the end of continuous culture was 162 hours.
As a comparative example, a conventional continuous culture without using a sponge (the operation of (2) to (7) without using the sponge of Example 2) was performed, and a biofilm having a shape as shown in FIGS. 5 and 6 was produced. could not.
Therefore, it became clear that a biofilm can be produced specifically by using a sponge.
(10)結果2(バイオフィルムの観察・菌体12の固定化確認)
図7に、支持体11として使用したスポンジの電界放出形走査電子顕微鏡画像を示す。また、図8に、図5のバイオフィルム(2)(肉眼の観察ではスポンジにバイオフィルムが形成されていないサンプル)の電界放出形走査電子顕微鏡画像を示す。また、図9に、図5のバイオフィルム(3)(肉眼の観察でスポンジを核として、バイオフィルムが形成されているサンプル)の電界放出形走査電子顕微鏡画像を示す。
(10) Result 2 (observation of biofilm, confirmation of immobilization of bacterial cells 12)
FIG. 7 shows a field emission scanning electron microscope image of the sponge used as the
図7及び図8の比較から、スポンジに菌体12が固定化されていることが確認された。また、図7〜図9の比較から、スポンジを核としてバイオフィルムが成長していくことが確認された。培養時間と比例して菌体12の固定化及び高密度化が進行し、菌体濃度が高まっていくことが明らかとなった。
From the comparison between FIG. 7 and FIG. 8, it was confirmed that the
図10に、希釈率に対する菌体濃度のグラフを示す。
図10から、スポンジを用いない従来の連続培養を行った場合、栄養源供給速度上昇による希釈の影響により、培養槽内の培養液の菌体濃度は低下した。一方、スポンジを用いた連続培養を行った場合、培養槽内の培養液の菌体濃度は変化せず、スポンジを用いない従来の連続培養と比較して高かった。なお、スポンジを用いた場合の菌体濃度は、見かけ上安定しているが、バイオフィルム内に菌体12が固定化されているため、培養槽内の菌体濃度は実質上高いと推測される。
FIG. 10 shows a graph of the bacterial cell concentration against the dilution rate.
From FIG. 10, when the conventional continuous culture which does not use sponge was performed, the microbial cell density | concentration of the culture solution in a culture tank fell by the influence of the dilution by a nutrient source supply rate raise. On the other hand, when continuous culture using a sponge was performed, the bacterial cell concentration in the culture solution in the culture tank did not change, and was higher than that of conventional continuous culture without using a sponge. In addition, although the microbial cell density | concentration at the time of using sponge is apparently stable, since the
(11)結果3(水素の製造)
図11に、希釈率に対する水素発生速度のグラフを示す。
図11から、スポンジを用いた連続培養を行った場合、希釈率Dが1.1[hr−1]のとき、水素発生速度が0.5L−H2/hr・l−培養液であることが明らかとなった。また、スポンジを用いた連続培養を行った場合における単位時間・単位体積当りの水素発生速度は、スポンジを用いない従来の連続培養を行った場合と比較して、D=1.1[hr−1]の条件下で、57%上昇したことが明らかとなった。
(11) Result 3 (production of hydrogen)
FIG. 11 shows a graph of the hydrogen generation rate against the dilution rate.
From Figure 11, when subjected to continuous culture using a sponge, when the dilution rate D is 1.1 [hr -1], that hydrogen generation rate is 0.5L-H 2 / hr · l- culture Became clear. In addition, the hydrogen generation rate per unit time and unit volume when performing continuous culture using a sponge is D = 1.1 [hr − as compared with the case of performing conventional continuous culture without using a sponge. 1 ] was found to increase by 57%.
本結果から、支持体11のスポンジ量を増加すれば、バイオフィルムの製造量及び菌体濃度が高くなり、水素製造量(水素発生速度)も高くなることが示された。また、培養液における栄養源濃度又は/及び希釈率を高めることにより、菌体12の増殖速度は高まり、バイオフィルムの製造量及び菌体濃度が高くなり、水素製造量(水素発生速度)も高くなることが示された。
From this result, it was shown that if the sponge amount of the
本発明によれば、サーモコッカス コダカラエンシス等の水素発生嫌気性超好熱菌を用いた水素の製造において、生産速度及び生産性を向上することができる。この水素は、燃料電池等の発電装置で使用されるエネルギー源として有用である。また、培養液の原料として、アミノ酸源及び炭素源が豊富な、工場排水又は生活排水を利用することができる。よって、本発明は廃棄物処理産業においても有用である。 According to the present invention, the production rate and productivity can be improved in the production of hydrogen using hydrogen-producing anaerobic hyperthermophilic bacteria such as Thermococcus kodakaraensis. This hydrogen is useful as an energy source used in power generators such as fuel cells. Moreover, as a raw material of the culture solution, factory waste water or domestic waste water rich in amino acid sources and carbon sources can be used. Thus, the present invention is also useful in the waste treatment industry.
10・・・培養槽、11・・・支持体、12・・・水素発生嫌気性超好熱菌(菌体)、20・・・培養液供給手段、30・・・廃液回収手段、40・・・水素ガス回収手段、50・・・アルカリ溶液供給手段
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