JP5032303B2 - 細胞観察支援器具 - Google Patents

Description

本発明は、細胞の観察に用いられる細胞観察支援器具に関する。

細胞を光学的に観察するための細胞観察支援器具が存在する（非特許文献１）。この器具は、例えば、ガラス板と、エッチングにより彫り込みを設けたシリコンチップとを対向させ、両者の対向面間に細胞収容領域を構成したものである。細胞収容空間内に、細胞を平面的に分散させて、ガラス板を通して、顕微鏡などの光学観察装置により観察できるように構成される。

この細胞観察支援器具を用いることにより、例えば、細胞の運動能力、刺激物質に対する反応、刺激物質の濃度勾配による影響等の観察を行うことができる。

ところで、細胞観察を行う際、細胞が観察視野内に分散配置され、且つ、それぞれの位置で固定された状態に置かれて観察することが要望されている。そのための装置として、特許文献１に挙げられる技術がある。この技術は、細胞収容空間を構成する面部材の一方に、吸引用の貫通孔を設け、各貫通孔を吸引装置につないで吸引させることで、細胞を観察面上に配置、固定するものである。

Kanegasaki S et al., (2003)J. Immunol. Methods 282, 1-11 特許2747304号公報

ところで、細胞の観察に際しては、細胞を傷つけない状態で、位置を変えず観察を継続することが求められる場合がある。非特許文献１に記載される技術は、細胞が、細胞を収容している空間を満たす液体の動きに応じて動いてしまうこと、また、刺激物質の存在に応じて、細胞が特定の方向に移動してしまうことなどの場合に、細胞の固定が難しい。一方、特許文献１に記載される技術は、細胞を貫通孔において吸引することで、観察面に分散することができる。さらに細胞収納空間の深さが細胞の径よりも十分に浅ければ、摩擦によって細胞を細胞収納空間の内部ないし端部に固定することもできる。しかし、細胞を２次元的に分散させようとすると、細胞がランダムに配置されてしまう。細胞の分散を制御することは困難であるため、繰り返し実験をする場合などにおいては、実験ごとに細胞の配置が異なってしまう。さらに、細胞収納空間に細胞の刺激物質を投与する場合、その刺激物質の拡散や流動性は、細胞の分布によって影響を受ける。このため、細胞の配置がランダムであると、各細胞に作用する刺激物質の濃度を予測することが非常に困難となる。また、摩擦抵抗のある空間で細胞を吸引により移動させるため細胞に大きな負荷がかかる、という問題も考えられる。

本発明は、細胞を収容する空間を満たす液体の流れや物質の拡散に影響与えずに、また、細胞に大きな負荷を与えずに、細胞を所望の位置に再現性よく配置した状態で観察ができるよう支援する技術を提供することを目的とする。

下記発明により、上記目的が達成される。
対向する第１の面部材および第２の面部材と、
前記第１の面部材および第２の面部材間に位置し、細胞の移動を阻止するストッパと、を有し、
前記第１の面部材と第２の面部材とは、それらの対向する面の間に、複数個の細胞を移動可能に収容する細胞収容空間を構成し、
前記第１の面部材と第２の面部材のうち少なくとも一方は、外部から前記細胞収容空間を光学的に観察できる部材であり、
前記ストッパは、１つの細胞を捕捉する第２階層のストッパと、その入口側に存在し１つの細胞を捕捉する第１階層のストッパを有し、
前記第２階層のストッパの入口は、前記第１階層のストッパの出口より狭く、
前記第１階層のストッパと前記第２階層のストッパとの間、および、前記第２階層のストッパの底に相当する部分には、細胞が通過することは困難であるが液体は通過できるスリットがある
ことを特徴とする細胞観察支援器具。

対向する第１の面部材および第２の面部材と、
前記第１の面部材および第２の面部材間に位置し、細胞の移動を阻止するストッパと、を有し、
前記第１の面部材と第２の面部材とは、それらの対向する面の間に、複数個の細胞を移動可能に収容する細胞収容空間を構成し、
前記第１の面部材と第２の面部材のうち少なくとも一方は、外部から前記細胞収容空間を光学的に観察できる部材であり、
前記ストッパは、各々、１つの細胞を捕捉する大きさであり、底に相当する部分に細胞が通過することは困難であるが液体は通過できるスリットを備え、かつ、アーチ形状に複数連結したストッパ連結体をなし、
前記ストッパ連結体は千鳥状に配列されている
ことを特徴とする細胞観察支援器具。

対向する第１の面部材および第２の面部材と、
前記第１の面部材および第２の面部材間に位置し、細胞の移動を阻止するストッパと、を有し、
前記第１の面部材と第２の面部材とは、それらの対向する面の間に、複数個の細胞を移動可能に収容する細胞収容空間を構成し、
前記第１の面部材と第２の面部材のうち少なくとも一方は、外部から前記細胞収容空間を光学的に観察できる部材であり、
細胞保持領域にスリットを備えるストッパを第１の傾斜角で複数連結した第１のストッパ連結体と、
細胞保持領域にスリットを備えるストッパを、前記第１の傾斜角に向き合う第２の傾斜角で複数連結した第２のストッパ連結体とを有し、
前記第１のストッパ連結体と前記第２のストッパ連結体とが交互に並列しており、
前記ストッパは、各々、１つの細胞を捕捉する大きさであり、
前記スリットは、底に相当する部分に細胞が通過することは困難であるが液体は通過できる大きさである
ことを特徴とする細胞観察支援器具。

本発明の実施形態について図１（ａ）および図１（ｂ）を参照して説明する。図１（ａ）は本発明の原理を示す図である。一方、図１（ｂ）は比較例を示す図である。

図１（ａ）に示すように、本実施形態では、複数の細胞が配置された空間に、細胞の反応を見るための特定の物質についての濃度勾配を形成する。そのため、細胞観察支援器具１００により、細胞を収容する空間として細胞収容空間１１０が形成される。図１（ａ）に示す細胞収容空間１１０は、原理の説明をするため、その構造を模式的に示す。具体的な構成については後述する。

この細胞収容空間１１０に、細胞に無害な液体１２０を満たし、この中に、観察したい細胞２００を、複数個（細胞群）、分散させて配置する。この状態で、細胞の反応を見るための物質（以下、刺激物質という）１３０を、細胞収容空間１１０の一方であるソース領域１１１から注入する。この例では、細胞収容空間１１０内にソース領域１１１側からドレイン領域１１２側に向かって、刺激物質の濃度が低下する濃度勾配１３１を形成させる。例えば、化合物等の刺激物質１３０を溶解した溶液を注入し、細胞収容空間１１０に特定の刺激物質１３０の濃度勾配１３１が形成された状況において、各細胞２００の状態を、顕微鏡３１０を介して、ディジタルカメラ（例えば、ＣＣＤカメラ）３２０により撮像する。なお、本実施形態では、細胞収容空間１１０をシリコンウェハ上にフォトリソグラフ技術を用いて複数個（例えば、１２個）形成する。そして、それぞれの細胞収容空間１１０における濃度勾配の各位置における細胞の応答性を計測する。この方法により、化合物の細胞に対する作用の比較を容易に行うことが可能となる。

刺激物質に対する細胞の応答性は、濃度に応じて異なる。細胞が示す応答として、例えば、遺伝子発現、形態変化、生理活性物質の放出など、様々な細胞現象が考えられる。こられの応答として、細胞は、外部から観察できる何らかの特徴量を示す場合がある。本発明では、この性質を利用して、細胞群が示す特徴量を細胞群の画像を解析することにより抽出して、刺激物質に関する細胞の応答に関する情報を、取得する。本発明の場合、同じ画面内に、濃度勾配が形成される。このため、濃度を変えては、実験を繰り返すといった試行錯誤による手間を要しない。１回の実験で濃度の違いによる応答を観察することができる。

あるいは別の実施形態として、ソース領域１１１ないしドレイン領域１１２より液体に対して加圧ないし減圧の制御を加えることにより、細胞収納空間１１０内の液体１２０を連続的、断続的あるいは単発的に流すことができる。これにより細胞周辺の液体を循環させることで長時間細胞を観察することができる。あるいは細胞収納空間に流入する液体に対して適当な物質を混入させることで、時間を指定して、細胞に対して物質による刺激を与えることができる。本発明では、これらの場合における細胞群の画像を取得し、解析することも可能とする。

ここで、図１（ａ）と図１（ｂ）とを比較する。図１（ａ）に示す細胞観察支援器具１００では、細胞収容空間１１０内に、ストッパ１５０が適当な間隔で複数個配置されている。そのため、いくつかの細胞２００がストッパ１５０によりその位置から移動しないように、移動が阻止されている。図１（ａ）の場合には、図面左側のソース領域１１１からドレイン領域１１２に向かって細胞が移動する途中で、細胞群のいずれかが、いずれかのストッパ１５０に当接して、ドレイン領域１１２側への移動を阻止される状態が示されている。

一方、図１（ｂ）に示す細胞観察支援器具１００では、ストッパ１５０が設けられていない。その他の構成は、図１（ａ）に示すものと同じである。両者を比較すると、図１（ａ）に示す細胞観察支援器具においては、一部の細胞２００の移動がストッパ１５０により阻止され、細胞収容空間１１０内での細胞の分布に違いがみられることが分かる。

次に、ストッパの構造について、図２（ａ）から図３（ｃ）を参照して説明する。なお、本実施形態では、図１（ａ）に示すように、細胞観察支援器具１００の下方側から顕微鏡により観察する構造としたものを例としている。ただし、図示の便宜上、以下の説明では、底面を上に向けた状態のストッパについて説明する。

図２（ａ）および図２（ｂ）に示すように、対向する第１の面部材１１５および第２の面部材１１７との間にストッパ１５０が配置される。本実施形態の場合、第１の面部材１１５にストッパ１５０が設けられる。ストッパ１５０と若干の空間を保って、第２の面部材１１７が配置される。第１の面部材１１５は、例えば、半導体ウェハ、より具体的には、シリコンウェハにより構成される。シリコンウェハをエッチング等の加工技術を使って彫り込み、ストッパ１５０その他の突起物を残して、彫り込み部分を形成する。この彫り込み部分が、細胞収容空間１１０の多くの部分を構成する。従って、本実施形態では、ストッパ１５０は、第１の面部材１１５と一体に構成されている。もちろん、ストッパと、第１面部材１１５および第２面部材１１７のいずれとも別体に形成して、いずれかの面、例えば、第１面部材１１５に貼り付けるなどによって固定することにより、形成することができる。

第１の面部材１１５、第２の面部材１１７およびストッパ１５０は、いずれも、他の材料により形成することができる。例えば、ガラス、プラスチックが挙げられる。第１の面部材１１５および第２の面部材１１７のうち、いずれかが透明で、光学的観察が可能であればよい。

ストッパ１５０は、典型的な構造として、図２（ａ）および図２（ｂ）に示すように、細胞が通過できない幅の液体通過部を構成するスリット１５１ｃと、これを挟んで、細胞を保持する柱構造体１５１ａおよび１５１ｂとを有する。柱構造体１５１ａおよび１５１ｂの高さは、第１面部材１１５と第２面部材１１７との間隔と等しいか、これより短い。柱構造体１５１ａおよび１５１ｂの高さを、第１面部材１１５と第２面部材１１７との間隔より短くすると、細胞収容空間１１０での液体の流れを阻害しにくい。また、第１面部材１１５と第２面部材１１７との間隔は、細胞の直径と同程度か、これより大きい。また、柱構造体１５１ａおよび１５１ｂは、第１面部材１１５上面と平行な面で見て、全体として湾曲する構造となっている。湾曲は、細胞が流れる方向の上流側に向かって凹となる向きに湾曲している。柱構造体１５１ａおよび１５１ｂの端から端までの長さ、例えば、湾曲している弧の長さまたは弦の長さは、想定する細胞の直径を超える程度の大きさを想定している。その結果、細胞が捕捉されて、外れにくい細胞保持領域１５１ｔが構成される。スリット１５１ｃは、細胞が通過することは困難であるが、液体は通過できる幅となるように設けられている。スリッ１５１は、開口断面が長方形である必要はない。

これにより、液の流れを確保すると共に、細胞の捕捉を容易にしている。すなわち、図３（ａ）から図３（ｃ）に示すように、細胞懸濁液を通過させると、液体はストッパ１５１のスリット１５１ｃの間を通過するが、細胞２００は通過できないため、細胞２００はスリット１５１ｃに吸い付けられ、ストッパ１５１に保持される。この場合、液の流れに乗って、細胞が移動し、柱構造体１５１ａおよび１５１ｂに近接して、細胞が柱構造体１５１ａおよび１５１ｂに接触寸前になっても、細胞と柱構造体１５１ａおよび１５１ｂとの間の液体が、スリット１５１ｃから外に流れるため、液体による細胞の捕捉の阻害が生じず、捕捉を容易にしている。

一方、一つの細胞がストッパ１５０に捕捉されると、その細胞がスリット１５１ｃをふさぐことによって、ストッパ１５１の細胞保持領域１５１ｔへの液体の流れをある程度遮断することから、第２の細胞が該ストッパ１５１にさらに吸い寄せられることを抑制する効果が生まれる。これにより、細胞を各ストッパに一つずつ配置するのを助ける効果が生まれる。なお、ストッパの形状、細胞の大きさによっては、同一のストッパに、複数の細胞が捕捉されることが起こり得る。

なお、液体通過部としては、前述したスリットに限られない。貫通孔、切り欠き等により構成することができる。

次に、ストッパの構造のバリエーションについて、図４（ａ）から図５（ｂ）を参照して説明する。

図４（ａ）に示すストッパは、前述した図２（ａ）から図３（ｃ）に示すものと同じであり、両手を拡げて物を受け取る構造となっている。この場合には、半円形状を基本としている。

図４（ｂ）に示すストッパ１５２は、細胞保持領域１５２ｔが、図４（ａ）に示すストッパ１５１の細胞保持領域１５１ｔよりも浅いという特徴がある。その結果、ストッパの底面積を小さくすることができる。構造としては、柱構造体１５２ａ、１５２ｂ、およびスリット１５２ｃとを有する。

図４（ｃ）に示すストッパ１５３は、柱構造体１５３ａおよび１５３ｂと、スリット１５３ｃとを有し、基本的な構造は、図４（ａ）に示すものと同様である。ただ、本例のストッパ１５３は、柱構造体１５３ａおよび１５３ｂの両端間の幅が長く、さらに、深く湾曲した状態になっている。そのため、一旦捕捉した細胞が外れにくいという利点がある。ただし、細胞保持領域１５３ｔが大きくなるため、複数の細胞を捕捉することが起こる可能性がある。

図４（d）に示すストッパ１５４は、柱構造体１５４ａおよび１５４ｂと、スリット１５４ｃとを有し、基本的な構造は、図４（ｃ）に示すものと同様である。ただ、本例のストッパ１５４は、柱構造体１５４ａおよび１５４ｂの両端間の長さが長く、さらに、深く湾曲した状態になっている。そのため、細胞の入口も狭くなっており、捕捉した細胞が外れにくいという利点がある。

図４（ｅ）に示すストッパ１５５は、柱構造体１５５ａおよび１５５ｂと、スリット１５５ｃとを有し、基本的な構造は、図４（ａ）に示すものと同様である。ただ、本例のストッパ１５５は、柱構造体１５５ａおよび１５５ｂが、湾曲していない点に特徴がある。湾曲していないため、細胞の捕捉に際し、細胞の大きさに依存しにくい。そのため、サイズの異なる複数種の細胞に対して適用することができるという、汎用性が高いものである。一方、捕捉した細胞が逃げやすいという面もある。しかし、これは、洗浄した際、細胞が外れやすいので、洗浄が容易という利点にもなる。さらに柱構造体１５５ａおよび１５５ｂと細胞とが接する面が少ないため、細胞表面が観察しやすいという利点もある。

次に、図５（ａ）および図５（ｂ）に示す２段構成のストッパの例について説明する。これまでに説明したストッパは、細胞保持領域１５１ｔから１５５ｔまで、細胞を１つ保持乃至捕捉することを想定した例である。しかし、観察に置いては、サイズの異なる細胞を混在させる場合がある。例えば、ある細胞と他の細胞とを融合させること等の実験を行う場合がある。このような場合に、複数の細胞を連続的に捕捉する、すなわち、両者が接触可能な状態で捕捉できるストッパが必要となる。図５（ａ）および図５（ｂ）に示すものは、そのためのものである。

このストッパは、第２階層のストッパ１５７と、その入口側に存在する第１階層のストッパ１５６とを有する。第１階層のストッパ１５６は入口側の間口が広く、また、出口が広くなる構造となっている。第２階層のストッパ１５７は、第１階層のストッパ１５６の出口後方に置かれた状態となっている。そして、それより間口の狭い構造となっている。

第２階層のストッパ１５７は、柱構造体１５７ａおよび１５７ｂと、スリット１５７ｃとを有し、基本的な構造は、図４（ａ）に示すものと同様である。ただ、本例のストッパ１５７は、柱構造体１５７ａおよび１５７ｂが、Ｌ字形状に曲げられている点に特徴がある。これは、第１階層のストッパ１５６の配置と、スリット１５６ｄおよび１５６ｅを形成することを容易にするためである。第２階層のストッパ１５７は、比較的小型の細胞２００Ｓを捕捉することが可能な構造となっている（図５（ｂ）参照）。

一方、第１階層のストッパ１５６は、柱構造体１５６ａおよび１５６ｂと、スリット１５６ｄ、１５６ｅとを有し、基本的な構造は、図４（ａ）に示すものと同様である。ただ、間口が非常に広くなっており、小さな細胞２００Ｓを通過させることはもとより、大きな細胞２００Ｌを捕捉することも可能となっている。スリットは、スリット１５６ｄとスリット１５６ｅの２箇所も受けられている。これは、出口に、第２階層のストッパ１５７を配置する結果、柱構造体１５６ａと柱構造体１５７ａとの間、および、柱構造体１５６ｂと柱構造体１５７ｂとの間に、スリット１５６ｄとスリット１５６ｅを構成している。

この２段構成のストッパによれば、図５（ｂ）に示すように、小型細胞２００Ｓを先に細胞保持領域１５７ｔに捕捉し、そこに、大型細胞２００Ｌを細胞捕捉領域１５６ｔに捕捉して、両者を接触させて、融合等の影響を観察することが可能となる。

次に、ストッパを第１面部材１１５上に複数配置する際の、分布パターンについて説明する。

図６（ａ）に示すパターンは、図４（ａ）に示すストッパ１５１を複数行、複数列千鳥配置したパターンである。パターンの要素を構成するストッパ１５１は、すべて同一方向に向きを揃えている。その理由は、液体の流れが一方向になることを想定しているからである。千鳥配置とした理由は、捕捉されずに抜ける細胞を減らして、細胞を効率よく捕捉するためである。

図６（ａ）に示すように、第１面部材１１５の全面にストッパ１５１を配置することによって、各種の細胞刺激応答の検出に用いることができる。例えば、図１（ａ）に示したように、濃度勾配を設ける場合に、濃度勾配の各所に複数ずつ細胞を固定して、濃度勾配による細胞に対する影響を一度に調べることが可能となる。また、前述した第５図（ａ）に示すような２段構成のストッパ１５６を配置することによって、刺激物質の濃度による細胞の融合への影響を一度に観察することが可能となる。

図６（ｂ）および図６（ｃ）は、ストッパ１５１の数を減らし、ドレイン領域側となる位置に集中配置した例である。このような配置は、例えば、細胞を配置させた後に、細胞が特定の方向に移動する様子を観察したい場合に適している。一例を挙げると走化性因子の影響を調べる場合が挙げられる。

なお、図６（ａ）から図６（ｃ）に示す分布では、ストッパ１５１を用いる例を示したが、これに限られない。細胞のサイズ、性質に応じて、他の構造のストッパ、例えば、ストッパ１５２から１５６を配置することも可能である。また、異なるサイズの細胞が混在している場合に、それぞれのサイズに適したストッパを混在させることもできる。同様に、細胞の、変形の仕方の違いによっても、ストッパの構造を選択して、複数種を混在させることもできる。

図２０（ｂ）に示すように、同図２０（ａ）に示す形態のストッパを千鳥配置することも考えられる。

次に、複数個のストッパを連結した状態のストッパ連結体を配置する例について説明する。

図７（ａ）に示す例は、基本要素として、図４（ａ）に示すストッパと同様の構造のストッパ１５８を用い、これを６個連結したものである。その結果、細胞保持領域１５８ｔとスリット１５８ｃとが６個、アーチ形状に並んで配置される。本実施形態のストッパ連結体１５８は、要素ストッパをただ、連結しただけではなく、全体として、湾曲した、いわゆるアーチ構成する形状となるように連結している。

図７（ｂ）に示す例は、基本要素として、図４（ａ）に示すストッパと同様の構造のストッパ１５９を用い、これを５個連結したものである。その結果、細胞保持領域１５９ｔとスリット１５９ｃとが５個、斜めに並んで配置される。本実施形態のストッパ連結体１５９は、要素ストッパをただ、連結しただけではなく、全体として、斜めになるように連結した点に特徴がある。

図８（ａ）から図８（ｂ）に、ストッパ連結体１５８を複数個並べた例を示す。また、図８（ｃ）にストッパ連結体１５９を複数個配置した例を示す。

細胞収容空間１１０は、具体的には、図９から図１３に示すような、様々な形態の細胞観察支援器具１００により実現することができる。この細胞収容空間１１０は、細胞群を平面上に、分散配置させて、外部から顕微鏡等を介して観察することができるようにするためのものである。そのため、扁平な構造となっている。厚さは、例えば、細胞の大きさ程度である。なお、図９から図１３に示す例では、細胞主要空間が微細であるため、ストッパについての図示を省略している。

図９に示すものは、第１面部材１１５としてのシリコンウェハに、フォトリソグラフ技術を用いて、細胞収容空間１１０となる扁平な彫り込みと、その一端側に位置し、細胞収容空間１１０に刺激物質を流入させるソース領域１１１、および、細胞収容空間１１０の他端側に位置し、細胞収容空間１１０から刺激物質を排出させるドレイン領域１１２となる彫り込みとが形成される。シリコンウェハ（第１面部材）１１５は、第２面部材１１７としてのガラス基盤上に載せられる。これにより、シリコンウェハ（第１面部材）１１５とガラス基盤（第２面部材）１１７に挟まれる、彫り込まれた空間が、細胞収容空間１１０、ソース領域１１１およびドレイン領域１１２を構成する。細胞収容空間１１０は、細胞が重ならない程度の深さの扁平な空間（チャネル）となるように形成される。なお、ソース領域１１１およびドレイン領域１１２は、あくまでも、刺激物質の注入側と排出側とを便宜上名付けているにすぎない。対称的な細胞観察支援器具の場合、ソース領域とドレイン領域とがいずれの側になっても差し支えない。

シリコンウェハ（第１面部材）１１５の上面側には、液溜を構成する液溜構成部材１１６が設けられる。液溜構成部材１１６は、例えば、ステンレススチール等の金属で構成される。この液溜構成部材１１６により、第１液溜空間１１３ａおよび第３液溜空間１１３ｂと、第２液溜空間１１４ａおよび第４液溜空間１１４ｂとが形成される。第１液溜空間１１３ａおよび第３液溜空間１１３ｂは、ソース領域１１１に連通している。一方、第２液溜空間１１４ａおよび第４液溜空間１１４ｂは、ドレイン領域１１２に連通している。このような構造であることにより、液体１２０は、細胞収容空間１１０を通じて、第１液溜空間１１３ａおよび第３液溜空間１１３ｂと、第２液溜空間１１４ａおよび第４液溜空間１１４ｂとの間で行き来することができる。ただし、液体自体は、本実施形態では、流れを作らない方が観察には都合がよいため、液溜構成部材１１６の上方において、第１液溜空間１１３ａおよび第３液溜空間１１３ｂと、第２液溜空間１１４ａおよび第４液溜空間１１４ｂとを連通させる連通部１１８が設けてある。液体１２０を連通部１１８まで達するように入れることによって、液体１２０に圧力差による流れができることを抑制することができる。

細胞、刺激物質等は、注射器などを用いて注入する。この際、注射針を、ソース領域１１１に達する状態とすることによって、細胞収容空間１１０に確実に注入することができる。細胞注入後にドレイン領域１１２より液体１２０を吸引することにより、注入した細胞を細胞収納空間１１０へ導入することができる。さらに細胞収納空間１１０に適当なストッパがあれば、細胞はそこへ固定される。

図１０に、図９に示す構成とほぼ同等の構成を有する細胞観察支援器具１００を示す。この細胞観察支援器具１００は、第１面部材１１５としてのシリコンウェハにおいて形成される彫り込み構造に相違がある他は、前述した図９に示すものと同様の構造を有し、同様に機能する。

図１１に示す細胞観察支援器具は、前述した図９および図１０に示す細胞観察支援器具において設けられている第３液溜空間１１３ｂおよび第４液溜空間１１４ｂを持たない構造となっている。すなわち、第１液溜空間１１３と、第２液溜空間１１４と、ソース領域１１１と、細胞収容空間１１０と、ドレイン領域１１２と、を有する構造となっている。

なお、図９および図１０の細胞観察支援器具１００において、第３液溜空間１１３ｂおよび第４液溜空間１１４ｂを設けている理由は、注入されている液体の揺れを吸収するためである。特に、ソース領域１１１から離れた位置で、刺激物質を、注射器などを用いて注入する場合に、刺激物質を押し出す際に生じる圧力の一部を逃がす働きを果たすためである。

図１２および図１３に示す細胞観察支援器具は、前述した図９から図１１に示すものと異なるタイプのものである。すなわち、図１２に示す細胞観察支援器具と図１３に示す細胞観察支援器具とは、液溜空間の構成と、細胞収容空間１１０の構成の仕方において相違がある。第１液溜空間１１３は、開放されていて、液体の注入、細胞の注入、刺激物質の注入等に用いられる。一方、第２液溜空間１１４は、開放されていない。また、細胞収容空間１１０を構成する部材１１９として、シリコンではなく、ステンレススチールを用いている。このようにすることによって、細胞観察支援器具の生産を簡単化して、製造原価を低下する効果がある。

図１２は、横置き型、すなわち、水平に置くタイプの例である。一方、図１３に示す例は、縦置き型である。図１３に示す例では、粘着性のある細胞の場合、ガラス基盤１１７に付着してしまうため、細胞が落下することはない。

図１２ないし図１３に示したタイプでは、細胞をソース領域１１１に注入した後に、重力や遠心力などを用いて細胞を細胞収納空間１１０へ導入することができる。

ここで、濃度勾配の形成方法について、説明する。

前述した図１１に示す細胞観察支援器具の場合には、細胞収容空間（チャネル）１１０と、第１液溜空間１１３と、第２液溜空間１１４とによって構成される空間に、適当な液体を満たす。また、第１液溜空間１１３および第２液溜空間１１４のいずれかの管中に、濃度勾配を形成させる目的の物質を含む溶液を注入する。これにより、ソース領域１１１からドレイン領域１１２に向かって物質が細胞収容空間１１０中に拡散する。なお、上部の連通部１１８間にも、液体１２０を満たすことによって、振動や傾きなどの影響で細胞収容空間１１０内を液体が激しく移動することによる濃度勾配の乱れを大幅に軽減することができる。これによって安定的な濃度勾配を維持することが可能となる。

図９および図１０に示すように、第１液溜空間１１３ａに分岐路として第３液溜空間１１３ｂを設け、また、第２液溜空間１１４ａに分岐路として第４液溜空間１１４ｂを設けた細胞観察支援器具を用いることもできる。これらの場合には、それぞれ、第１液溜空間１１３ａまたは第２液溜空間１１４ａから、目的の刺激物質１３０を含む液体が投入される。なお、第１液溜空間１１３ａ側から刺激物質１３０の液体を注入した場合、ソース領域１１１から細胞収容空間１１０を経てドレイン領域に向けて刺激物質が拡散する。一方、第２液溜空間１１４ａ側から刺激物質の液体を投入した場合、図に示すドレイン領域１１２が、実質的にソース領域となり、反対側のソース領域１１１が実質的にドレイン領域となる。従って、ソース領域とドレイン領域とは、図９、図１０および図１１に示す細胞観察支援器具の場合には、便宜上の名称である。

なお、図１２および図１３に示す細胞観察支援器具を用いて濃度勾配を形成することもできる。この場合には、開放されている第１液溜空間１１３から刺激物質１３０を含む液体を投入して、ソース領域１１１から細胞収容空間１１０を経てドレインに向けて、刺激物質１３０の濃度勾配を形成される。

図２１に、本発明の細胞観察支援器具を用いて観察を行う際に用いる細胞計測システムの構成の一例を示す。図２１に示す細胞計測システムは、細胞収容空間１１０に収容されている細胞の撮像を行うための撮像装置と、入力装置３３０と、表示装置３４０と、撮像された画像について処理し、目的とする情報を得るための画像処理を行うコンピュータ３５０と、を備える。

撮像装置は、本実施形態では、顕微鏡３１０、ＣＣＤカメラ３２０、ステージ３１６、および、ステージ駆動装置３１５により構成される。

コンピュータ３５０は、中央演算ユニット（ＣＰＵ）３５１と、メモリ３５２と、補助記憶装置３５３とを有する。補助記憶装置３５３には、当該ＣＰＵ３５１の動作プログラム３６０と、データ３７０とが格納される。プログラム３６０としては、図示していないＯＳの他、細胞計測システムにおける計測動作を制御する撮像シーケンス３６１と、ステージを制御するステージ制御３５２と、撮像を制御する撮像制御３６３と、得られた画像データの解析を行うデータ解析３６４とが含まれる。これらのプログラムは、記憶媒体、ネットワークなどから補助記憶装置３５３にインストールされたものである。データとしては、画像データ３７１が代表的なものである。

細胞についての撮像は、前述した細胞観察支援器具により観察用細胞群を用意しておき、コンピュータ３５０の制御により、測定を行う。測定は、予め定めた撮像シーケンス３６１に従って行う。すなわち、コンピュータ３５０は、ステージ制御プログラム３６２により、ステージ駆動装置３１５を駆動制御して、細胞観察支援器具の複数箇所、例えば、１２箇所を、１分おき等の一定のタイミングで、撮像するようにステージの位置決めを行う。撮像シーケンス３６１は、ＸＹステージ３１６による位置決めと共に、撮像制御プログラム３６３により、一定タイミングで、細胞収容空間１１０における細胞群の撮像を行うようＣＣＤカメラ３２０に指示する。そして、予め定めたタイミングで、ＣＣＤカメラ３２０が撮像した画像をメモリ３５２に取り込む。

取り込んだ画像データについて、データ解析プログラム３６４により解析処理を行う。まず、撮像データを、撮像条件と共に、補助記憶装置３５３に格納する。

この後、得られた画像について、指定された処理を行う。この際、予めストッパの画像を除去する処理を行うことができる。

以下実施例に基づいて、さらに説明する。
（実施例１）
図６に示すストッパ配置パターンを有する、図９に示す細胞観察支援器具を用いて細胞の捕捉を行った。細胞観察支援器具１００は、第２面部材１１７としてガラス基盤を用い、第１面部材１１５およびストッパとしてシリコンウェハを用いて構成されている。

細胞観察支援器具の空間に、細胞に影響を与えない液体を注入しておく。次に、細胞を、ソース領域１１１に導入し、ドレイン領域１１２側から注射器により吸引する。用いた細胞はラット腹腔より採取したマスト細胞である。この状況で、顕微鏡で第２面部材を介して観察し、撮像した。

図１４（ａ）に示す写真は、細胞投入前の状態である。図１４（ｂ）は、細胞を投入した後の状態である。確かに細胞がストッパに保持されることが確認された。
（実施例２〜５）
ストッパの構造が異なる他は、実施例１と同様にして、細胞の捕捉を調べた。その結果、それぞれ、図１５（ａ）、図１６（ａ）、図１７（ａ）、図１８（ａ）に示すように、細胞等入前の状態から、図１５（ｂ）、図１６（ｂ）、図１７（ｂ）、図１８（ｂ）に示すように、それぞれのストッパに細胞が捕捉されていることが分かる。
（実施例６）
ストッパとして、図５（ａ）に示すものを用いると共に、細胞をサイズの小さい細胞を先に導入した後、サイズの大きい細胞を導入した場合における細胞捕捉について調べら。図１９（ａ）および図１９（ｂ）に結果を示す。図１９（ａ）にしめすよう、導入前には何も捕捉されていない状態から、図１９（ｂ）に示すように、大小２種類の細胞が捕捉されていることが確認された。

以上述べたように、本発明によれば、細胞を容易に平面上に設けたストッパの位置に配置することができる。その結果、次のことが期待できる。

配置した細胞の様子を直接観察することができる。

配置した細胞の存在する環境に対して、化合物を導入することができる。

配置した細胞の存在する環境に対して、化合物の濃度勾配を形成することができる。

複数の細胞間における、接触による相互作用を容易に観察することができる。

図１（ａ）は本発明の一実施形態に係る細胞観察支援器具の概略構成示す説明図、図１（ｂ）は本実施形態の機能を明確にするための比較例を示す説明図である。 図２（ａ）および図２（ｂ）は本発明の実施形態における細胞をトラップするためのストッパの一例を底面側から見た状態の斜視図。 図３（ａ）から図３（ｃ）は、本発明の実施形態において、ストッパによる細胞移動阻止の原理を示す説明図である。 図４（ａ）から図４（ｅ）は、本発明の実施形態において用いられるストッパの各種形態を示す平面図である。 図５（ａ）は、本発明の実施形態において用いられる、ストッパの他の形態を示す説明図、図５（ｂ）は、そのストッパによる２個の細胞の捕捉状態を示す説明図である。 図６（ａ）から図６（ｃ）は、複数個のストッパの配置を示す説明図である。 図７（ａ）および図７（ｂ）は、連結型ストッパの例を示す説明図である 図８（ａ）から図８（ｃ）は、連結型ストッパの配置例を示す説明図である。 図９は、本発明の実施に用いることができる細胞観察支援器具の第１の例を示す断面図である。 図１０は、本発明の実施に用いることができる細胞観察支援器具の第２の例を示す断面図である。 図１１は、本発明の実施に用いることができる細胞観察支援器具の第３の例を示す断面図である。 図１２は、本発明の実施に用いることができる細胞観察支援器具の第４の例を示す断面図である。 図１３は、本発明の実施に用いることができる細胞観察支援器具の第５の例を示す断面図である。 図１４（ａ）および図１４（ｂ）は、本実施形態の細胞観察支援器具を用いた実施例における細胞投入前後の観察写真を示す説明図である。 図１５（ａ）および図１５（ｂ）は、本実施形態の細胞観察支援器具を用いた実施例における細胞投入前後の観察写真を示す説明図である。 図１６（ａ）および図１６（ｂ）は、本実施形態の細胞観察支援器具を用いた実施例における細胞投入前後の観察写真を示す説明図である。 図１７（ａ）および図１７（ｂ）は、本実施形態の細胞観察支援器具を用いた実施例における細胞投入前後の観察写真を示す説明図である。 図１８（ａ）および図１８（ｂ）は、本実施形態の細胞観察支援器具を用いた実施例における細胞投入前後の観察写真を示す説明図である。 図１９（ａ）および図１９（ｂ）は、本実施形態の細胞観察支援器具を用いた実施例における細胞投入前後の観察写真を示す説明図である。 図２０（ａ）は、図４（e）に示すストッパの拡大図、図２０（ｂ）は、そのストッパを複数個配置した分布を示す説明図である。 図２１は、本発明の細胞観察支援器具を用いて観察を行う際に用いることができる細胞計測システムの構成の一例を示すブロック図である。

符号の説明

１００…細胞観察支援器具、１１０…細胞収容空間（チャネル）、１１１…ソース領域、１１２…ドレイン領域、１１３、１１３ａ…第１液溜空間、１１４、１１４ａ…第２液溜空間、１１３ｂ…第３液溜空間、１１４ｂ…第４液溜空間、１１５…シリコンウェハ、１１７…ガラス基盤、１２０…液体、１３０…刺激物質（刺激剤）、１５０…ストッパ、１５１ａ、１５１ｂ…柱構造体、１５１ｃ…スリット、２００…細胞、３１０…顕微鏡、３２０…ディジタルカメラ（ＣＣＤカメラ）、３５０…コンピュータ。

Claims (3)

1. 対向する第１の面部材および第２の面部材と、
   前記第１の面部材および第２の面部材間に位置し、細胞の移動を阻止するストッパと、を有し、
   前記第１の面部材と第２の面部材とは、それらの対向する面の間に、複数個の細胞を移動可能に収容する細胞収容空間を構成し、
   前記第１の面部材と第２の面部材のうち少なくとも一方は、外部から前記細胞収容空間を光学的に観察できる部材であり、
   前記ストッパは、１つの細胞を捕捉する第２階層のストッパと、その入口側に存在し１つの細胞を捕捉する第１階層のストッパを有し、
   前記第２階層のストッパの入口は、前記第１階層のストッパの出口より狭く、
   前記第１階層のストッパと前記第２階層のストッパとの間、および、前記第２階層のストッパの底に相当する部分には、細胞が通過することは困難であるが液体は通過できるスリットがある
   ことを特徴とする細胞観察支援器具。
2. 対向する第１の面部材および第２の面部材と、
   前記第１の面部材および第２の面部材間に位置し、細胞の移動を阻止するストッパと、を有し、
   前記第１の面部材と第２の面部材とは、それらの対向する面の間に、複数個の細胞を移動可能に収容する細胞収容空間を構成し、
   前記第１の面部材と第２の面部材のうち少なくとも一方は、外部から前記細胞収容空間を光学的に観察できる部材であり、
   前記ストッパは、各々、１つの細胞を捕捉する大きさであり、底に相当する部分に細胞が通過することは困難であるが液体は通過できるスリットを備え、かつ、アーチ形状に複数連結したストッパ連結体をなし、
   前記ストッパ連結体は千鳥状に配列されている
   ことを特徴とする細胞観察支援器具。
3. 対向する第１の面部材および第２の面部材と、
   前記第１の面部材および第２の面部材間に位置し、細胞の移動を阻止するストッパと、を有し、
   前記第１の面部材と第２の面部材とは、それらの対向する面の間に、複数個の細胞を移動可能に収容する細胞収容空間を構成し、
   前記第１の面部材と第２の面部材のうち少なくとも一方は、外部から前記細胞収容空間を光学的に観察できる部材であり、
   細胞保持領域にスリットを備えるストッパを第１の傾斜角で複数連結した第１のストッパ連結体と、
   細胞保持領域にスリットを備えるストッパを、前記第１の傾斜角に向き合う第２の傾斜角で複数連結した第２のストッパ連結体とを有し、
   前記第１のストッパ連結体と前記第２のストッパ連結体とが交互に並列しており、
   前記ストッパは、各々、１つの細胞を捕捉する大きさであり、
   前記スリットは、底に相当する部分に細胞が通過することは困難であるが液体は通過できる大きさである
   ことを特徴とする細胞観察支援器具。

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