JP5022657B2 - Enzyme electrode and manufacturing method thereof - Google Patents
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Description
本発明は、酵素電極に関し、より詳細には、酵素反応によって生成した酵素/金属粒子複合体を用いた酵素電極およびその製造方法、並びにその用途に関する。 The present invention relates to an enzyme electrode, and more particularly to an enzyme electrode using an enzyme / metal particle complex produced by an enzyme reaction, a method for producing the same, and an application thereof.
生細胞内で作られる蛋白質性の生体触媒である酵素は、通常の触媒と比べて温和な条件下で強力に作用する。また、基質の特異性が高く、一般に各酵素は、一定基質の一定反応のみを触媒する。酵素の中でも、酸化還元酵素と呼ばれる酵素は、基質の酸化還元反応を触媒する。この酸化還元酵素の反応で生成する電荷を、導電性部材に取出すことができれば、酵素の特徴を生かした、低過電圧、高選択性の電極が作成可能である。しかし、多くの酸化還元酵素の酸化還元中心は、蛋白質の3次元構造の奥深いところに閉じ込められた形態である。そのため、導電性部材との間で効果的な電子の授受を行うには、酸化還元中心と導電性部材間の距離が大きく、その結果、酸化還元酵素の活性部位と導電性部材との間で、直接の電子移動を行うことは、一般に困難であった。 Enzymes, which are proteinaceous biocatalysts produced in living cells, act strongly under milder conditions than ordinary catalysts. Moreover, the specificity of a substrate is high, and generally each enzyme catalyzes only a certain reaction of a certain substrate. Among enzymes, an enzyme called an oxidoreductase catalyzes a redox reaction of a substrate. If the electric charge generated by the reaction of this oxidoreductase can be taken out to the conductive member, it is possible to create a low overvoltage and high selectivity electrode utilizing the characteristics of the enzyme. However, the redox center of many oxidoreductases is a form confined in the deep part of the three-dimensional structure of protein. Therefore, in order to effectively exchange electrons with the conductive member, the distance between the redox center and the conductive member is large, and as a result, between the active site of the oxidoreductase and the conductive member. It has been generally difficult to perform direct electron transfer.
そこで、酵素と導電性部材間をメディエータと呼ばれる物質によって電気的に繋ぐ手法が広く用いられてきた(例えば、非特許文献1)。メディエータ分子は、酵素の蛋白内部に入りこみ、酵素の酸化還元中心に充分に近い距離まできた時に、初めて酵素の酸化還元中心との間で電子の授受を行う。その後、酵素の活性部位、すなわち酸化還元中心と電子の授受を行ったメディエータが、拡散、電子ホッピング等を通して導電性部材へと電荷を輸送することで、酵素反応の電荷は導電性部材に取出されることになる。 Therefore, a method of electrically connecting an enzyme and a conductive member with a substance called a mediator has been widely used (for example, Non-Patent Document 1). When the mediator molecule enters the protein of the enzyme and reaches a distance sufficiently close to the redox center of the enzyme, the mediator molecule exchanges electrons with the redox center of the enzyme for the first time. After that, the mediator that exchanged electrons with the active site of the enzyme, that is, the redox center, transports the charge to the conductive member through diffusion, electron hopping, etc., so that the charge of the enzyme reaction is taken out to the conductive member. Will be.
ところで、近年のナノテクノロジーの進歩に伴い、多くの金属粒子の調製法が報告されている。この中で、酵素であるグルコースオキシダーゼの触媒反応により金粒子を生成させる手法が、非特許文献2に記載されている。本文献中においては、生成した金粒子に酵素が固定化されていることが赤外スペクトル、ゼータ電位測定により示唆されている。さらに、円二色スペクトル測定から酵素が変性していることが示唆されている。これとは別に、グルコースオキシダーゼの酵素反応で生成した過酸化水素による金粒子の成長と、この成長によるプラズモン吸収の増大を利用した光学的グルコースセンサも非特許文献3に記載されている。
By the way, with recent advances in nanotechnology, many methods for preparing metal particles have been reported. Among them, Non-Patent
一方、酵素と金属の複合体に関して、非特許文献4には、一般的に、酵素を含む機能性タンパク質は、金、シリカ等の粒子等に吸着することで、その活性が大幅に低下することが開示されている。
前記非特許文献1には、メディエータを用いた酵素電極が開示されている。メディエータ分子は、通常、その分子サイズが小さいために、酵素の蛋白中の酸化還元中心近傍に容易に進入することができる。そして、酵素反応によって酵素の酸化還元中心に生じた電荷は、適当な酸化還元電位を持つメディエータ分子へ移動し、さらに、このメディエータ分子の拡散、もしくは、メディエータ分子間の電子ホッピングにより導電性部材近傍に輸送される。最後に導電性部材とメディエータ間の電子移動によって導電性部材に取出される。
Non-Patent
ここで、酵素内部の酸化還元中心近傍へのメディエータの拡散は、酵素の蛋白の空隙が小さいために遅くなる。つまり、このメディエータの拡散速度が、酵素の酸化還元中心で生成した電荷のメディエータを介した電荷の取出しにおける律速段階となっている。従って、電荷の取り出し速度を更に向上させて電流値を上げるには、このメディエータのみを用いた酵素電極では限界があると考えられる。すなわち、より高度な性能を得る上で、メディエータを用いた酵素電極を使用したセンサの感度、この酵素電極を使用した生物燃料電池の出力には限界があった。 Here, the diffusion of the mediator to the vicinity of the redox center inside the enzyme is slowed because the protein protein gap is small. That is, the diffusion rate of the mediator is a rate-limiting step in the extraction of charges via the mediator of charges generated at the redox center of the enzyme. Therefore, it is considered that there is a limit to the enzyme electrode using only this mediator in order to further improve the charge extraction speed and increase the current value. That is, in order to obtain higher performance, there is a limit to the sensitivity of a sensor using an enzyme electrode using a mediator and the output of a biofuel cell using this enzyme electrode.
本発明の目的は、酵素の酸化還元中心からの電荷の取出しが高速化された酵素電極及びその製造方法を提供することにある。本発明の他の目的は、かかる酵素電極を用いたセンサ及び生物燃料電池を提供することにある。本発明の他の目的は、かかる酵素電極を用いた検出対象物質の検出及び定量方法を提供することにある。本発明の他の目的は、かかる酵素電極の構成材料として有用な酵素/金属粒子複合体の製造方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide an enzyme electrode and a method for producing the same, in which the charge extraction from the redox center of the enzyme is accelerated. Another object of the present invention is to provide a sensor and a biofuel cell using such an enzyme electrode. Another object of the present invention is to provide a method for detecting and quantifying a substance to be detected using such an enzyme electrode. Another object of the present invention is to provide a method for producing an enzyme / metal particle composite useful as a constituent material of such an enzyme electrode.
第1の本発明に係る導電性部材と酵素とを有する酵素電極は、導電性部材と酵素と金属粒子を有する酵素電極において、前記酵素は、該酵素の内部に該金属粒子を含み、前記金属粒子は、前記酵素と該酵素に対する基質となる物質との反応に伴って金属を形成し得る金属前駆体の存在下に、前記酵素と前記基質とを反応させることによって粒子形成されていることを特徴とする。第2の本発明に係る燃料電池は、アノード電極とカソード電極との間に電解液を保持し得る領域が設けられており、該アノード電極と該カソード電極の少なくとも一方は、前記第1の本発明における酵素電極で構成されていることを特徴とする。 Enzyme electrode having a conductive member and an enzyme according to the first invention, the enzyme electrode having an electrically conductive member and an enzyme and a metal particle, the enzyme comprises the metal particles within the enzyme, the metal The particles are formed by reacting the enzyme with the substrate in the presence of a metal precursor capable of forming a metal with the reaction between the enzyme and a substance serving as a substrate for the enzyme. Features. In the fuel cell according to the second aspect of the present invention, a region capable of holding an electrolyte is provided between the anode electrode and the cathode electrode, and at least one of the anode electrode and the cathode electrode is formed of the first electrode. It is comprised by the enzyme electrode in invention.
第3の本発明に係る金属粒子の製造方法は、
多孔質材料の孔中に酵素を導入し、
前記酵素の基質と、金属粒子の前駆体との存在下、
前記酵素と前記基質との反応によって、前記金属粒子の前駆体から金属粒子を析出させることを特徴とする多孔質材料の孔中に金属粒子を製造する方法である。
The method for producing metal particles according to the third aspect of the present invention includes:
Introducing an enzyme into the pores of the porous material,
In the presence of a substrate of the enzyme and a precursor of metal particles,
A method for producing metal particles in pores of a porous material, wherein metal particles are precipitated from a precursor of the metal particles by a reaction between the enzyme and the substrate.
第4の本発明に係る酵素電極の製造方法は、酵素と金属粒子を有する酵素電極の製造方法であって、
酵素を用意する工程と、
前記酵素と該酵素の基質との反応によって金属を形成し得る金属前駆体の存在下、前記酵素と前記基質とを反応させることにより、前記酵素内に金属粒子を備えている、酵素/金属粒子複合体を得る工程と、
を有することを特徴とする酵素電極の製造方法である。
A method for producing an enzyme electrode according to a fourth aspect of the present invention is a method for producing an enzyme electrode having an enzyme and metal particles,
Preparing an enzyme;
The presence of the metal precursor capable of forming a metal by reaction with a substrate for the enzyme and the enzyme, by reacting the said enzyme substrate, and a metal particle in said enzyme, enzyme / metal particles Obtaining a complex;
It is a manufacturing method of the enzyme electrode characterized by having.
第5の本発明に係る酵素電極の製造方法は、酵素と金属粒子を有する酵素電極の製造方法であって、
導電性を有する多孔質材料の孔中に酵素を導入する工程と、
前記酵素と該酵素の基質との反応によって金属を形成し得る金属前駆体の存在下、前記多孔質材料の孔中の酵素と前記基質とを反応させることにより、前記酵素内に金属粒子を備えている、酵素/金属粒子複合体を前記多孔質材料の孔中に得る工程と、
を有することを特徴とする酵素電極の製造方法である。
The method for producing an enzyme electrode according to the fifth aspect of the present invention is a method for producing an enzyme electrode having an enzyme and metal particles,
Introducing an enzyme into the pores of the conductive porous material;
In the presence of a metal precursor capable of forming a metal by reaction between the enzyme and the enzyme substrate, the enzyme in the pores of the porous material is reacted with the substrate to provide metal particles in the enzyme. Obtaining an enzyme / metal particle complex in the pores of the porous material;
It is a manufacturing method of the enzyme electrode characterized by having.
本発明によれば、金属粒子の少なくとも一部が酵素の内部に入り込んだ酵素/金属粒子複合体を得ることができる。そして、これを酵素電極として使用することで、酵素からの電子の取出しの高速化が可能となり、触媒電流を向上させることができる。なお、この酵素/金属粒子複合体を多孔質材料の孔中に固定化した場合は、環境に対する安定性の向上した酵素電極を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to obtain an enzyme / metal particle complex in which at least part of the metal particles has entered the inside of the enzyme. And by using this as an enzyme electrode, it becomes possible to speed up the extraction of electrons from the enzyme, and the catalytic current can be improved. When this enzyme / metal particle complex is immobilized in the pores of the porous material, an enzyme electrode with improved environmental stability can be provided.
本発明においては、課題を解決するための手段として、酵素電極の有する酵素として、金属粒子の一部が酵素の内部に入り込んだ酵素/金属粒子複合体を使用する。 In the present invention, as a means for solving the problem, an enzyme / metal particle complex in which a part of metal particles enters the inside of the enzyme is used as the enzyme of the enzyme electrode.
一般的に、酵素を含む機能性タンパク質は、金、シリカ等の粒子等に吸着することで、その活性が大幅に低下することが知られている(非特許文献4)。また、非特許文献2においても、安定化剤を用いない金粒子に吸着した酵素の変性が円二色スペクトルから示唆されている。これらの背景から、金属粒子と酵素を、修飾剤を用いずに相互作用させた複合体を通常、物質の検知、あるいは、エネルギーの発生デバイスとして用いることはない。ただし例外として、プラズモン吸収に代表される、金属粒子に固有の特性を利用した生物デバイスを作製する場合はある。これらの従来の知見に対して、本発明者等は、金属粒子を酵素反応によりその前駆体から酵素の活性中心近傍を基点として生成させる方法を採用して、必然的に酵素の酸化還元中心との間で電子が授受のできる距離に金属を得ることができるとの知見を得た。更に、本発明者等は、この金属が酵素の酸化還元中心からの電荷を引き出す、いわばリードとして機能できるとの知見を得た。そこで、酵素反応によって酵素/金属粒子複合体を調製し、この複合体を用いて酵素電極を調製し、金属粒子と複合していない酵素を用いて調製した酵素電極との特性の比較を行なった。その結果、酵素/金属粒子複合体を用いた酵素電極は、金属粒子と複合していない酵素を用いて調製した酵素電極と比較して高い特性を示すことを確認し、本発明を完成させた。
次に、本発明の好ましい実施の形態について詳細に説明する。
In general, it is known that the activity of a functional protein containing an enzyme is greatly reduced by adsorbing to a particle such as gold or silica (Non-Patent Document 4). Also in Non-Patent
Next, a preferred embodiment of the present invention will be described in detail.
本発明の酵素電極は、導電性部材と酵素と金属粒子を有する酵素電極において、これらの金属粒子と酵素が、金属粒子の一部が酵素の内部に入りこんだ酵素/金属粒子複合体を形成していることを特徴とするものである。ここで、金属粒子が酵素の内部に入りこんだ酵素/金属粒子複合体とは、図1(A)及び(B)に示すような構造を有する。すなわち、その断面形状を観察したときに、酵素1、金属粒子2とそれらを取り囲む溶液の3物質が交わる点を結んだ線(図中一点鎖線で記入)を金属粒子がまたいで存在するものである。これには、図1(A)のように、酵素1の微小な空隙に金属粒子の一部3が入り込んだものや、図1(B)のように粒子2の一部3が酵素1の外縁を長い範囲にわたって入り込んだものが含まれる。
The enzyme electrode of the present invention is an enzyme electrode having a conductive member, an enzyme, and metal particles, and these metal particles and enzyme form an enzyme / metal particle complex in which a part of the metal particles enters the inside of the enzyme. It is characterized by that. Here, the enzyme / metal particle complex in which the metal particles enter the inside of the enzyme has a structure as shown in FIGS. 1 (A) and 1 (B). That is, when the cross-sectional shape is observed, the metal particles straddle the line connecting the points where the
図1に示すような酵素と金粒子の位置関係は、たとえば透過型電子顕微鏡で酵素/金粒子複合体を観察することによって検証ができる。 The positional relationship between the enzyme and the gold particles as shown in FIG. 1 can be verified, for example, by observing the enzyme / gold particle complex with a transmission electron microscope.
金属粒子の一部が酵素の内部に入り込んだ構造は、酵素とその酵素の基質との作用(酵素反応)との相互作用により金属を形成し得る金属前駆体の存在下において、酵素反応を行うことにより得ることができる。金属前駆体の存在下で酵素反応を行うことで、酵素の活性部位(活性中心)を含む酵素内部で基質が反応し、それに伴って金属前駆体から金属が形成される。これらの反応が進行すると、酵素の内部を起点として金属が成長し、場合によっては酵素の外側で形成された金属と酵素内部の金属が合体して金属粒子が得られる。こうして得られた金属粒子はその一部が酵素の内部に入り込んだ形状となる。 The structure in which some of the metal particles enter the inside of the enzyme performs an enzyme reaction in the presence of a metal precursor capable of forming a metal by the interaction between the enzyme and the enzyme substrate (enzyme reaction). Can be obtained. By performing the enzyme reaction in the presence of the metal precursor, the substrate reacts inside the enzyme including the active site (active center) of the enzyme, and a metal is formed from the metal precursor accordingly. As these reactions proceed, the metal grows starting from the inside of the enzyme, and in some cases, the metal formed outside the enzyme and the metal inside the enzyme combine to obtain metal particles. The metal particles obtained in this way have a shape in which some of them enter the interior of the enzyme.
ここで、酵素の基質としては、酵素の作用による化学的変化が金属前駆体から金属を生じさせることができるものが利用される。好ましい酵素と基質の組合せとしては、酵素の基質への作用によって酸化還元酵素の酸化還元中心に電荷を与えることができる酵素と基質の組合せを挙げることができる。このような酵素の基質としては、酵素の本来の基質(例えばグルコースオキシダーゼに対するグルコース、アルコールデヒドロゲナーゼに対するエタノール)のほかに、酵素が反応の基質として酵素反応を起こしうる、天然、人工の化合物が含まれる。 Here, as the substrate of the enzyme, a substrate capable of generating a metal from a metal precursor by a chemical change due to the action of the enzyme is used. As a preferable combination of an enzyme and a substrate, a combination of an enzyme and a substrate that can give a charge to the redox center of the redox enzyme by the action of the enzyme on the substrate can be mentioned. Such enzyme substrates include natural and artificial compounds that can cause an enzyme reaction as a reaction substrate, in addition to the enzyme's original substrate (eg, glucose for glucose oxidase, ethanol for alcohol dehydrogenase). .
また、金属前駆体からの金属粒子の形成には、酵素、酵素の基質及び金属前駆体を含む溶液を調製し、酵素反応の進行に伴って金属前駆体から金属粒子が生成されると同時に、金属粒子と酵素とを複合体化する手法が好適に用いられる。また、このときの金属粒子とは、酵素の基質への作用によって直接生成する金属粒子だけでなく、酵素の基質への作用によって生成する生成物が金属前駆体に作用して副次的に生成する金属粒子を含む。 In addition, for the formation of metal particles from the metal precursor, a solution containing an enzyme, an enzyme substrate and a metal precursor is prepared, and at the same time as the metal particles are generated from the metal precursor as the enzyme reaction proceeds, A technique of complexing metal particles and an enzyme is preferably used. In addition, the metal particles at this time are not only the metal particles directly generated by the action of the enzyme on the substrate, but also the products generated by the action of the enzyme on the substrate act on the metal precursor to form a secondary product. Containing metal particles.
具体的な例としては、グルコースオキシダーゼ、グルコース、塩化金酸塩を加えた溶液を挙げることができる。この場合、グルコースオキシダーゼにおけるグルコースの酸化反応によって生成したグルコースオキシダーゼの酸化還元中心であるFADH2によって、塩化金酸が還元される。それだけでなく、グルコースオキシダーゼにおける、グルコースと酸素の反応よって生じる過酸化水素による塩化金酸の還元が生じる。上記の反応にはこのような場合を含むことが挙げられる。なお、このことは、本発明の酵素電極に酵素/金属粒子複合体に加えて金属粒子と複合していない酵素や、酵素と複合していない金属粒子を含むことを排除するものではない。 Specific examples include a solution to which glucose oxidase, glucose and chloroaurate are added. In this case, chloroauric acid is reduced by FADH 2 which is the redox center of glucose oxidase produced by the oxidation reaction of glucose in glucose oxidase. In addition, the reduction of chloroauric acid by hydrogen peroxide, which occurs due to the reaction of glucose and oxygen in glucose oxidase, occurs. It is mentioned that the above reaction includes such a case. This does not exclude that the enzyme electrode of the present invention includes an enzyme that is not complexed with metal particles or a metal particle that is not complexed with an enzyme in addition to the enzyme / metal particle complex.
酵素/金属粒子複合体に用いる酵素としては、酸化還元酵素が好適に使用できる。この酵素は基質の酸化還元反応を触媒する酵素である。 As the enzyme used for the enzyme / metal particle complex, an oxidoreductase can be preferably used. This enzyme is an enzyme that catalyzes a redox reaction of a substrate.
酵素電極には、目的とする特性を得る上で、1種の酵素を固定しても、複数の異なる酵素を固定してもよい。更に、1つの金属粒子に複合させる酵素についても、1種の酵素を複合化しても、複数の異なる酵素を複合化してもよい。 In order to obtain desired properties, one type of enzyme or a plurality of different enzymes may be fixed to the enzyme electrode. Furthermore, as for the enzyme to be complexed with one metal particle, one kind of enzyme may be complexed or a plurality of different enzymes may be complexed.
本発明に用い得る酵素の例としては、グルコースオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼが挙げられる。
その他にも、シトクロムオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼが挙げられる。更に、蟻酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、チオレドキシンレダクターゼが挙げられる。また、酸化還元酵素でない酵素と酸化還元酵素を同時に用いることも可能である。この場合、例えば、酸化還元酵素でない酵素の生成物を酸化還元酵素で検出するといったことも可能である。
Examples of enzymes that can be used in the present invention include glucose oxidase, bilirubin oxidase, laccase, pyruvate oxidase, cholesterol oxidase, lactate oxidase, and ascorbate oxidase.
Other examples include cytochrome oxidase, alcohol dehydrogenase, cholesterol dehydrogenase, and aldehyde dehydrogenase. Further examples include formate dehydrogenase, glucose dehydrogenase, lactate dehydrogenase, diaphorase, catalase, peroxidase, and thioredoxin reductase. It is also possible to use an enzyme that is not an oxidoreductase and an oxidoreductase simultaneously. In this case, for example, a product of an enzyme that is not an oxidoreductase can be detected by an oxidoreductase.
酵素/金属粒子複合体に用いる金属としては、水溶液中、電極が使用される条件において充分な電気化学安定性を有する材料が好適に使用でき、同一電極中に、目的とする特性を得る上で、複数の異なる金属の組合せを用いることもできる。例としては、Au、Pt、Ag、Co、Pd、Rh、Ni、Cr、Fe、Mo、Ti、Cu及びW、ならびにこれらの2種以上を含む合金があげられる。 As the metal used in the enzyme / metal particle composite, a material having sufficient electrochemical stability in an aqueous solution and the conditions under which the electrode is used can be suitably used. A combination of a plurality of different metals can also be used. Examples include Au, Pt, Ag, Co, Pd, Rh, Ni, Cr, Fe, Mo, Ti, Cu and W, and alloys containing two or more of these.
酵素/金属粒子複合体の調製に用いる金属前駆体としては、水溶液中でも急速には反応せず、緩やかな金属粒子の生成が可能な化合物が好適に使用できる。例えば、金属の塩化物塩、クエン酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、蟻酸塩、酢酸塩、亜硫酸塩が挙げられる。 またこれらの塩から中間体を経由して金属粒子を生成してもよい。 As the metal precursor used for the preparation of the enzyme / metal particle composite, a compound that does not react rapidly even in an aqueous solution and can generate gradual metal particles can be preferably used. For example, metal chloride salts, citrate salts, phosphate salts, borate salts, formate salts, acetate salts, and sulfites. Moreover, you may produce | generate a metal particle from these salts via an intermediate body.
酵素/金属粒子複合体の金属粒子は、一次粒子の分散体が最も好適に用いられるが、それらが凝集した二次粒子であっても良い。金属粒子の一次粒子の粒径は、2nm〜50nmの範囲にあることが好ましく、2nm〜20nmの範囲にあることがより好ましい。金属粒子が二次粒子を形成しているときは、その粒径が、200nmを超えないことが好ましく、50nmを超えないことがより好ましい。二次粒子径の下限については、二次粒子径が2nm以上であることが好ましい。なお、金属粒子は、金属微粒子ということもできる。 As the metal particles of the enzyme / metal particle complex, a dispersion of primary particles is most preferably used, but secondary particles in which they are aggregated may be used. The primary particle size of the metal particles is preferably in the range of 2 nm to 50 nm, and more preferably in the range of 2 nm to 20 nm. When the metal particles form secondary particles, the particle size preferably does not exceed 200 nm, and more preferably does not exceed 50 nm. As for the lower limit of the secondary particle diameter, the secondary particle diameter is preferably 2 nm or more. The metal particles can also be referred to as metal fine particles.
導電性部材は、酵素反応で生成した電荷を外部回路に取出す働きを担う。この導電性部材の構成材料としては、導電性が高く、電極が使用される条件において充分な電気化学安定性を有する材料が好適に使用できる。このような導電性部材の構成材料の例としては、金属、導電性高分子、金属酸化物、及び炭素材料などを挙げることができる。金属の例としては、Au、Pt、Ag、Ni、Cr、Fe、Mo、Ti、Al、Cu、V、In、Ga、Wの元素を含むものがあげられ、これらは、合金であっても、めっきを施したものであってよい。導電性高分子の例としては、ポリアセチレン類、ポリアリーレン類、ポリアリーレンビニレン類、ポリアセン類、ポリアリールアセチレン類、ポリジアセチレン類、ポリナフタレン類、ポリピロール類、ポリアニリン類、ポリチオフェン類が挙げられる。その他にも導電性高分子の例として、ポリチエニレンビニレン類、ポリアズレン類、ポリイソチアナフテン類のうち少なくともひとつの化合物を含むものが挙げられる。金属酸化物の例としては、In、Sn、Zn、Ti、Al、Si、Zr、Nb、Mg、Ba、Mo、W、V、Srのうち、少なくとも一種類の元素を含むものがあげられる。炭素材料の例としては、グラファイト、カーボンブラック、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン、フラーレン化合物およびこれらの誘導体が挙げられる。 The conductive member plays a role of taking out the electric charge generated by the enzyme reaction to an external circuit. As a constituent material of the conductive member, a material having high conductivity and sufficient electrochemical stability under the conditions in which the electrode is used can be suitably used. Examples of the constituent material of such a conductive member include metals, conductive polymers, metal oxides, and carbon materials. Examples of metals include those containing elements of Au, Pt, Ag, Ni, Cr, Fe, Mo, Ti, Al, Cu, V, In, Ga, and W, which may be alloys. It may be plated. Examples of the conductive polymer include polyacetylenes, polyarylenes, polyarylene vinylenes, polyacenes, polyarylacetylenes, polydiacetylenes, polynaphthalenes, polypyrroles, polyanilines, and polythiophenes. Other examples of the conductive polymer include those containing at least one compound among polythienylene vinylenes, polyazulenes, and polyisothianaphthenes. Examples of the metal oxide include those containing at least one element among In, Sn, Zn, Ti, Al, Si, Zr, Nb, Mg, Ba, Mo, W, V, and Sr. Examples of the carbon material include graphite, carbon black, carbon nanotube, carbon nanohorn, fullerene compound and derivatives thereof.
メディエータは、酵素/金属粒子複合体と導電性部材間の電子の受け渡しを促進させるものであり、必要に応じて用いることができる。このメディエータの例としては、金属錯体、キノン類、複素環式化合物、ニコチンアミド誘導体、フラビン誘導体、導電性高分子が挙げられる。この金属錯体としては、中心金属に遷移金属を用いたものが挙げられる。例としては、Os、Fe、Ru、Co、Cu、Ni、V、Mo、Cr、Mn、Pt、Rh、Pd、Irが挙げられる。また、この金属錯体の配位子としては、窒素、酸素、リン、硫黄、炭素原子を含有し、少なくともこれらの原子を介して中心金属と錯体形成するもの、または、シクロペンタジエニル環を骨格として有する物が挙げられる。ピロール、ピラゾール、イミダゾール、1、2、3−または1、2、4−トリアゾール、テトラゾール、2、2'−ビイミダゾール、ピリジン、2、2'−ビチオフェン、2、2'−ビピリジン、2、2':6'、2"−ターピリジンなどである。更に、エチレンジアミン、ポルフィリン、フタロシアニン、アセチルアセトン、キノリノール、アンモニア、シアンイオン、トリフェニルホスフィンオキサイドおよびそれらの誘導体が挙げられる。キノン類の例としては、キノン、ベンゾキノン、アントラキノン、ナフトキノン、ピロロキノリンキノン、テトラシアノキノジメタン、およびそれらの誘導体が挙げられる。複素環式化合物の例としては、フェナジン、フェノチアジン、ビオローゲン、およびそれらの誘導体が挙げられる。ニコチンアミド誘導体の例としては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸が挙げられる。フラビン誘導体の例としては、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)が挙げられる。ここで、導電性高分子の例としては、ポリアセチレン類、ポリアリーレン類、ポリアリーレンビニレン類、ポリアセン類、ポリアリールアセチレン類が含まれる。更にポリジアセチレン類、ポリナフタレン類、ポリピロール類、ポリアニリン類、ポリチオフェン類、ポリチエニレンビニレン類、ポリアズレン類、ポリイソチアナフテン類適用し得る。 The mediator promotes the transfer of electrons between the enzyme / metal particle complex and the conductive member, and can be used as necessary. Examples of the mediator include metal complexes, quinones, heterocyclic compounds, nicotinamide derivatives, flavin derivatives, and conductive polymers. Examples of the metal complex include those using a transition metal as a central metal. Examples include Os, Fe, Ru, Co, Cu, Ni, V, Mo, Cr, Mn, Pt, Rh, Pd, and Ir. In addition, the ligand of this metal complex contains nitrogen, oxygen, phosphorus, sulfur, carbon atoms and forms a complex with the central metal via at least these atoms, or a cyclopentadienyl ring as a skeleton. The thing which has as is mentioned. Pyrrole, pyrazole, imidazole, 1, 2, 3- or 1, 2, 4-triazole, tetrazole, 2, 2'-biimidazole, pyridine, 2, 2'-bithiophene, 2, 2'-bipyridine, 2, 2 ': 6', 2 "-terpyridine, etc. Further examples include ethylenediamine, porphyrin, phthalocyanine, acetylacetone, quinolinol, ammonia, cyanide, triphenylphosphine oxide and derivatives thereof. Examples of quinones are quinones. Benzoquinone, anthraquinone, naphthoquinone, pyrroloquinoline quinone, tetracyanoquinodimethane, and derivatives thereof Examples of heterocyclic compounds include phenazine, phenothiazine, viologen, and derivatives thereof. Examples of conductors include nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, and examples of flavin derivatives include flavin adenine dinucleotide (FAD), where the conductivity is high. Examples of molecules include polyacetylenes, polyarylenes, polyarylene vinylenes, polyacenes, polyarylacetylenes, and polydiacetylenes, polynaphthalenes, polypyrroles, polyanilines, polythiophenes, polythienylenes. Vinylenes, polyazulenes, and polyisothianaphthenes can be applied.
担体は、酵素/金属粒子複合体とメディエータの少なくとも一方を導電性部材に固定化するものであり、必要に応じて用いることができる。例としては、(1)高分子化合物、(2)無機化合物、及び(3)分子内に複数の結合基を有する有機化合物が挙げられる。 The carrier immobilizes at least one of the enzyme / metal particle complex and the mediator on the conductive member, and can be used as necessary. Examples include (1) a polymer compound, (2) an inorganic compound, and (3) an organic compound having a plurality of bonding groups in the molecule.
高分子化合物は、酵素を静電的に固定する担体として用いられるものであってもよく、その場合は、電極の使用条件下で酵素/金属粒子複合体が持つ表面電荷と反対の電荷を有していることが好ましい。この高分子の例として、導電性高分子の例としては、ポリアセチレン類、ポリアリーレン類、ポリアリーレンビニレン類、ポリアセン類、ポリアリールアセチレン類がある。更に、ポリジアセチレン類、ポリナフタレン類、ポリピロール類、ポリアニリン類、ポリチオフェン類、ポリチエニレンビニレン類、ポリアズレン類、ポリイソチアナフテン類がある。なお、その他の高分子の例としては、ポリスチレンスルホン酸、ポリビニル硫酸、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリマレイン酸、ポリフマル酸、ポリエチレンイミンなどである。また、ポリアリルアミン塩酸塩、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド、ポリビニルピリジン、ポリビニルイミダゾール、ポリリシン、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ペクチンも適用できる。更に、シリコーン樹脂、セルロース、アガロース、デキストラン、キチン、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ナイロンも適用できる。 The polymer compound may be used as a carrier for electrostatically immobilizing an enzyme. In this case, the polymer compound has a charge opposite to the surface charge of the enzyme / metal particle complex under the use conditions of the electrode. It is preferable. Examples of this polymer include polyacetylenes, polyarylenes, polyarylene vinylenes, polyacenes, and polyarylacetylenes as examples of conductive polymers. Furthermore, there are polydiacetylenes, polynaphthalenes, polypyrroles, polyanilines, polythiophenes, polythienylene vinylenes, polyazulenes, and polyisothianaphthenes. Examples of other polymers include polystyrene sulfonic acid, polyvinyl sulfate, dextran sulfate, chondroitin sulfate, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polymaleic acid, polyfumaric acid, and polyethyleneimine. Polyallylamine hydrochloride, polydiallyldimethylammonium chloride, polyvinyl pyridine, polyvinyl imidazole, polylysine, deoxyribonucleic acid, ribonucleic acid, and pectin can also be applied. Furthermore, silicone resin, cellulose, agarose, dextran, chitin, polystyrene, polyvinyl alcohol, and nylon are also applicable.
担体用の無機化合物の例としては、In、Sn、Zn、Ti、Al、Si、Zr、Nb、Mg、Ba、Mo、W、V、Srから選択される少なくとも1つの元素を含む金属カルコゲナイド化合物が挙げられる。この分子内に複数の結合基を有する有機化合物の例としては、少なくとも以下に示される官能基を含む化合物が該当する。ここでいう官能基には、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、ヒドラジノ基、チオシアネート基、エポキシ基、ビニル基、ハロゲン基、酸エステル基、リン酸基、チオール基、ジスルフィド基が含まれる。更に、ジチオカルバメート基、ジチオホスフェート基、ジチオホスホネート基、チオエーテル基、チオ硫酸基、チオ尿素基のうちから選択される官能基を含む化合物があげられる。代表例としては、グルタルアルデヒド、 ポリエチレングリコールジグリシデルエーテル、塩化シアヌール、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジメチルー3、3'−ジチオプロピオニミデート塩酸塩である。更に、3、3'−ジチオ−ビス(サルホスクシンイミジルプロピオネート)、シスタミン、アルキルジチオール、ビフェニレンジチオール、ベンゼンジチオールなども挙げられる。 Examples of inorganic compounds for carriers include metal chalcogenide compounds containing at least one element selected from In, Sn, Zn, Ti, Al, Si, Zr, Nb, Mg, Ba, Mo, W, V, and Sr Is mentioned. Examples of the organic compound having a plurality of bonding groups in the molecule include compounds containing at least the functional groups shown below. The functional group here includes hydroxyl group, carboxyl group, amino group, aldehyde group, hydrazino group, thiocyanate group, epoxy group, vinyl group, halogen group, acid ester group, phosphate group, thiol group, disulfide group. It is. Furthermore, compounds containing a functional group selected from a dithiocarbamate group, a dithiophosphate group, a dithiophosphonate group, a thioether group, a thiosulfate group, and a thiourea group can be given. Typical examples are glutaraldehyde, polyethylene glycol diglycidyl ether, cyanuric chloride, N-hydroxysuccinimide ester, dimethyl-3,3′-dithiopropionimidate hydrochloride. Furthermore, 3,3′-dithio-bis (sulfosuccinimidyl propionate), cystamine, alkyldithiol, biphenylenedithiol, benzenedithiol and the like can be mentioned.
本発明の酵素電極は、前記酵素/金属粒子複合体を多孔質材料の孔中に固定化した構造を有してもよい。この多孔質体の孔は、一次元、二次元、もしくは三次元的に連結したもので、これらの連結形態の2以上が混在しているものであってもよい。一次元に連結した空隙の例としては柱状の空隙、二次元に連結した空隙の例としては、網状の空隙、三次元に連結した空隙の例としては、スポンジ状、微小粒子を接合した後に生じる空隙、またそれらをテンプレートにして作成した構造材料の空隙が挙げられる。この多孔質体の材料としては、導電性を有し、保存、測定時に充分な剛性を有し、電極が使用される条件において充分な電気化学安定性を有する材料であれば用いることができる。この多孔質体は、他の導電性材料によって導電性が向上したものであるか、もしくは、導電性が付与されたものであってもよい。多孔質材料の例としては、In、Sn、Zn、Ti、Al、Si、Zr、Nb、Mg、Ba、Mo、W、V、Srのうち、少なくとも一種類の元素を含む金属酸化物があげられる。また、導電性材料の例としては、金属、導電性高分子、炭素材料が挙げられる。これらの代表的な例としては、酸化スズのメソポーラス材料や導電処理を施した陽極酸化アルミナ等が挙げられる。この多孔質材料の孔径は、酵素が導入できる程度に大きい、2〜50nm程度の材料が好ましく用いられる。 The enzyme electrode of the present invention may have a structure in which the enzyme / metal particle complex is immobilized in pores of a porous material. The pores of the porous body are connected one-dimensionally, two-dimensionally or three-dimensionally, and two or more of these connected forms may be mixed. Examples of voids connected in one dimension are columnar voids, examples of voids connected in two dimensions are mesh-like voids, examples of voids connected in three dimensions are spongy, formed after joining fine particles Examples include voids and voids of structural materials created using them as templates. As the material for the porous body, any material can be used as long as it is conductive, has sufficient rigidity during storage and measurement, and has sufficient electrochemical stability under the conditions in which the electrode is used. This porous body may have improved conductivity by other conductive materials, or may have conductivity. Examples of porous materials include metal oxides containing at least one element of In, Sn, Zn, Ti, Al, Si, Zr, Nb, Mg, Ba, Mo, W, V, and Sr. It is done. Examples of the conductive material include metals, conductive polymers, and carbon materials. Typical examples of these include tin oxide mesoporous materials and anodized alumina subjected to conductive treatment. A material having a pore size of about 2 to 50 nm, which is large enough to introduce an enzyme, is preferably used.
また、本発明で用いられる金属前駆体からの金属粒子の形成方法によれば、微細空間内に金属粒子を温和な条件で、高密度に、少ない工程で調製することができる。一般的に微細空間内に金属粒子を導入する手法としては、金属の塩化物塩等の金属前駆体の溶液を微細空間内に導入し、その後に、この前駆体を還元剤で処理するか、もしくは加熱還元することで金属を微細空間内に析出させる方法が行われている。この場合、金属前駆体の微細空間内への導入工程と還元工程を同時に行うと、多孔質材料の孔の内外を問わず溶液中に金属粒子が析出してしまうために、金属前駆体の導入工程と還元工程を別工程として行う必要がある。このため、一サイクルの金属前駆体溶液の導入工程で微細空間内へ導入できる金属量には限界があり、高密度に金属粒子を固定化するには、サイクルを繰り返す必要がある。本発明においては、基質として、金属前駆体とは容易に反応しないものを選択し、この基質に対応する酵素を多孔体細孔内部に導入または固定化した上で、基質と金属前駆体を細孔内に添加する。これにより、酵素の存在する位置でのみ選択的に金属を析出させて金属粒子を形成することが可能である。つまり、金属前駆体の導入と、金属粒子を形成するための金属の析出工程を同時に進行させることを可能とする。また、このときの反応時間を変化させることで、金属粒子のサイズを制御でき、粒径の大きな粒子も1サイクルで調製することを可能となる。 In addition, according to the method for forming metal particles from the metal precursor used in the present invention, the metal particles can be prepared in a fine space at a high density and in a small number of steps under mild conditions. In general, as a technique for introducing metal particles into a fine space, a solution of a metal precursor such as a metal chloride salt is introduced into the fine space, and then this precursor is treated with a reducing agent, Alternatively, a method in which metal is deposited in a fine space by performing heat reduction has been performed. In this case, if the introduction process of metal precursor into the fine space and the reduction process are performed at the same time, metal particles will be precipitated in the solution regardless of the inside or outside of the pores of the porous material. It is necessary to perform the process and the reduction process as separate processes. For this reason, there is a limit to the amount of metal that can be introduced into the fine space in one cycle of introducing the metal precursor solution, and it is necessary to repeat the cycle in order to immobilize the metal particles at a high density. In the present invention, a substrate that does not easily react with the metal precursor is selected, an enzyme corresponding to this substrate is introduced or immobilized in the pores of the porous body, and then the substrate and the metal precursor are finely divided. Add into the pores. Thereby, metal particles can be formed by selectively depositing metal only at the position where the enzyme exists. That is, the introduction of the metal precursor and the metal deposition step for forming the metal particles can be performed simultaneously. In addition, by changing the reaction time at this time, the size of the metal particles can be controlled, and particles having a large particle diameter can be prepared in one cycle.
本発明の酵素電極の用途として好ましいひとつの形態であるセンサは、酵素電極を、物質を検知するための検知部位として用いることを特徴とする。代表的な構成としては、酵素電極を作用電極として、対極と組合せ、必要に応じて参照電極を使用する。電極に固定した酵素の基質認識能、酵素触媒作用により発生する電流を検知して、これらの電極が接している液体中の物質の定性的検出、濃度の測定に利用する構成を挙げることができる。センサの構成は、酵素電極での検知が可能であるものであれば特に制限されない。このセンサは、酵素に起因する基質の高い選択性に加え、酵素/金属粒子複合体の適用に起因する、高い電流密度によって、検出可能な濃度領域の拡大、検出装置の簡略化、検知部位の小型化が可能となる。 A sensor which is one preferred form for use of the enzyme electrode of the present invention is characterized in that the enzyme electrode is used as a detection site for detecting a substance. As a typical configuration, an enzyme electrode is used as a working electrode, combined with a counter electrode, and a reference electrode is used as necessary. The substrate recognition ability of the enzyme fixed to the electrode, the current generated by the enzyme catalysis can be detected, and the structure used for the qualitative detection and concentration measurement of the substance in the liquid in contact with these electrodes can be mentioned . The configuration of the sensor is not particularly limited as long as it can be detected by the enzyme electrode. In addition to the high substrate selectivity caused by the enzyme, this sensor expands the concentration range that can be detected, simplifies the detection device, and the detection site due to the high current density resulting from the application of the enzyme / metal particle complex. Miniaturization is possible.
本発明の好ましいひとつの形態である生物燃料電池は、酵素電極を、アノードまたはカソードの少なくとも一方として用いることを特徴とする。代表的な構成としては、燃料となる物質を含む電解液を貯溜し得る反応槽と、反応槽中に電気的に隔離して配置されたアノードとカソードとを有し、このアノード及びカソードの少なくとも一方に本発明にかかる酵素電極を用いた構成を挙げることができる。なお、この生物燃料電池は電解液を補充するタイプ、循環させるタイプや、電解液の補充や循環をしないタイプとすることができる。この生物燃料電池は、酵素電極が使用できるものであれば、燃料の種類、構造、機能などは制限されない。この生物燃料電池は、電極反応の触媒として用いる酵素に特有の高い触媒作用によって、物質を低い過電圧で酸化還元できることにより、高い駆動電圧を得ることが可能であり、また、酵素/金属粒子複合体の適用に起因する高い電流密度を得ることが可能である。その結果、高出力密度を得ることが可能となる。 A biofuel cell which is one preferred embodiment of the present invention is characterized in that an enzyme electrode is used as at least one of an anode and a cathode. A typical configuration includes a reaction tank that can store an electrolyte containing a substance that serves as a fuel, and an anode and a cathode that are electrically isolated from each other in the reaction tank. On the other hand, the structure using the enzyme electrode concerning this invention can be mentioned. The biofuel cell can be of a type that replenishes electrolyte, a type that circulates, or a type that does not replenish or circulate electrolyte. As long as the biofuel cell can use an enzyme electrode, the type, structure, function, etc. of the fuel are not limited. This biofuel cell can obtain a high driving voltage by being able to oxidize and reduce a substance with a low overvoltage by a high catalytic action peculiar to an enzyme used as a catalyst for an electrode reaction. Also, an enzyme / metal particle complex can be obtained. It is possible to obtain a high current density resulting from the application of. As a result, a high power density can be obtained.
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明の方法は、これらの実施例のみに限定されるものではない。また、以下の実施例の実験温度は、特に記載がない限り室温(25℃)である。実施例に先立って、実施例で使用される錯体ポリマーの調製例について記述する。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the method of the present invention is not limited to these examples. The experimental temperatures in the following examples are room temperature (25 ° C.) unless otherwise specified. Prior to the examples, preparation examples of the complex polymers used in the examples are described.
調製例1
以下の式(1)に示す錯体ポリマーの合成法を記述する。
Preparation Example 1
A method for synthesizing the complex polymer represented by the following formula (1) will be described.
還流管をつけた100mLのナスフラスコに、以下の成分を加えた。
・20mLのエチレングリコール、0.08gの(NH4)2[OsCl6]・0.38gの4,4'−dimethyl−2,2'−bipyridine。
The following components were added to a 100 mL eggplant flask equipped with a reflux tube.
20 mL ethylene glycol, 0.08 g (NH 4 ) 2 [OsCl 6 ] 0.38
スターラ攪拌し、窒素気流下マイクロ波合成器(Milestone microsynth)で300Wを20分間照射した。得られた溶液を室温までさました後、0.4gのNa2S2O4を溶解させた25mLの水を加えた。室温で1時間攪拌した後に生じた黒紫沈殿をろ過、水洗して過剰の塩を除いた後に、ジエチルエーテルで洗浄し、未反応の配位子を除き、減圧下、60℃に加熱した。こうして、乾燥、Os(4,4'−dimethyl−2,2'−bipyridine)2Cl2を得た。 The mixture was stirred with a stirrer, and irradiated with 300 W for 20 minutes with a microwave synthesizer under a nitrogen stream. After the obtained solution was cooled to room temperature, 25 mL of water in which 0.4 g of Na 2 S 2 O 4 was dissolved was added. The black purple precipitate produced after stirring at room temperature for 1 hour was filtered, washed with water to remove excess salt, washed with diethyl ether, removed unreacted ligand, and heated to 60 ° C. under reduced pressure. Thus, drying and Os (4,4′-dimethyl-2,2′-bipyridine) 2 Cl 2 were obtained.
温度計、還流管を取り付けた100mLの三口フラスコに15mLの水、2.63gのアクリルアミド、0.403mLの1−ビニルイミダゾール、0.069mLのN,N,N',N'−tetramethylethylnediamineを加えた。更に、窒素気流下、0.06gの過硫酸アンモニウムを加えた。ウォーターバスで40℃,30分間加温し、その後、反応容器を空冷した。生じた粘調な液体を強攪拌下の500mLのメタノールに滴下し沈降させ、沈降物を遠心分離で回収した。沈降物を溶かしうる最小量の水を加えて溶かし、さらに強攪拌下の500mLのメタノールにこの水溶液を滴下し沈降させた。沈降物を再び遠心分離で回収し、減圧下、60℃に加熱することで乾燥、ポリアクリルアミドーポリビニルイミダゾールの7.49/1共重合体を得た。分子の生成、ユニット比は、1HNMR測定(D2O)によって決定した。 To a 100 mL three-necked flask equipped with a thermometer and a reflux tube, 15 mL of water, 2.63 g of acrylamide, 0.403 mL of 1-vinylimidazole, 0.069 mL of N, N, N ′, N′-tetramethylethylenediamine were added. . Further, 0.06 g of ammonium persulfate was added under a nitrogen stream. The mixture was heated at 40 ° C. for 30 minutes in a water bath, and then the reaction vessel was air-cooled. The resulting viscous liquid was dropped into 500 mL of methanol with strong stirring and allowed to settle, and the precipitate was collected by centrifugation. A minimum amount of water capable of dissolving the precipitate was added to dissolve, and the aqueous solution was added dropwise to 500 mL of methanol under strong stirring to cause precipitation. The precipitate was collected again by centrifugation, dried by heating to 60 ° C. under reduced pressure, and a polyacrylamide-polyvinylimidazole 7.49 / 1 copolymer was obtained. The formation of molecules and the unit ratio were determined by 1 HNMR measurement (D 2 O).
還流管をつけた100mLのナスフラスコに以下の成分を加えた。
・25mLのエチレングリコール、17.5mLのエタノール
・先に調製した0.19gのOs(4,4'−dimethyl−2,2'−bipyridine)2Cl2,0.22gのポリアクリルアミドーポリビニルイミダゾールの共重合体。
The following components were added to a 100 mL eggplant flask equipped with a reflux tube.
• 25 mL of ethylene glycol, 17.5 mL of ethanol • 0.19 g of Os (4,4′-dimethyl-2,2′-bipyridine) 2 Cl 2 prepared previously, 0.22 g of polyacrylamide-polyvinylimidazole Copolymer.
スターラ攪拌し、窒素気流下マイクロ波合成器で400Wを2時間照射した。得られた溶液を室温までさました後、20mLのエタノールを加えた溶液を、強攪拌下の500mLのジエチルエーテル溶液に滴下した。こうして生じる粘調な沈殿にさらに20mLのエタノールを加えた。これを再び、強攪拌下の500mLのジエチルエーテル溶液に滴下した。得られた粘調な沈殿を減圧下、60℃に過熱することで乾燥し、目的とする式(1)に記載の錯体ポリマーを得た。 The mixture was stirred with a stirrer and irradiated with 400 W for 2 hours with a microwave synthesizer under a nitrogen stream. After the obtained solution was cooled to room temperature, a solution containing 20 mL of ethanol was added dropwise to a 500 mL diethyl ether solution with strong stirring. An additional 20 mL of ethanol was added to the resulting viscous precipitate. This was again added dropwise to 500 mL of diethyl ether solution with strong stirring. The viscous precipitate obtained was dried by heating to 60 ° C. under reduced pressure to obtain the target complex polymer described in the formula (1).
調製例2
以下の式(2)に示す錯体ポリマーの合成法を記述する。
Preparation Example 2
A method for synthesizing the complex polymer represented by the following formula (2) will be described.
還流管をつけた100mLのナスフラスコに3gの2,2'−bipyridyl−N,N'−dioxideを入れ、ここに、氷浴上、濃硫酸6mL、発煙硫酸3mLを加えた。スターラで攪拌を行い2,2'−bipyridyl−N,N'−dioxideを溶解させた。更に、発煙硝酸(1.52)6mLを加え、その後100℃に昇温、4時間保持した。反応溶液を空冷後、砕氷上に注ぎ、生じた黄色い粉末をろ過で回収した。粉末を水で洗浄し、減圧下、60℃に過熱乾燥することで、4,4'−dinitro−2,2'−bipyridyl−N,N'−dioxideを得た。 3 g of 2,2′-bipyridyl-N, N′-dioxide was placed in a 100 mL eggplant flask equipped with a reflux tube, and 6 mL of concentrated sulfuric acid and 3 mL of fuming sulfuric acid were added thereto on an ice bath. The mixture was stirred with a stirrer to dissolve 2,2′-bipyridyl-N, N′-dioxide. Further, 6 mL of fuming nitric acid (1.52) was added, and then the temperature was raised to 100 ° C. and held for 4 hours. The reaction solution was air-cooled, poured onto crushed ice, and the resulting yellow powder was collected by filtration. The powder was washed with water and dried at 60 ° C. under reduced pressure to obtain 4,4′-dinitro-2,2′-bipyridyl-N, N′-dioxide.
還流管をつけた100mLのナスフラスコに4.3mLの氷酢酸、2.9mLのアセチルクロライド、0.27gの4,4'−dinitro−2,2'−bipyridyl−N,N'−dioxideを入れ、湯浴上70℃で4時間加熱した。反応溶液を空冷後、砕氷上に注ぎ、30%NaOHで中和し、生じた白色沈殿をろ過で回収した。粉末を水で洗浄し、減圧下、60℃に加熱して乾燥させた。こうして、4,4'−dichloro−2,2'−bipyridyl−N,N'−dioxideを得た。 In a 100 mL eggplant flask equipped with a reflux tube, 4.3 mL of glacial acetic acid, 2.9 mL of acetyl chloride, and 0.27 g of 4,4′-dinitro-2,2′-bipyridyl-N, N′-dioxide were placed. The mixture was heated at 70 ° C. for 4 hours in a hot water bath. The reaction solution was air-cooled, poured onto crushed ice, neutralized with 30% NaOH, and the resulting white precipitate was collected by filtration. The powder was washed with water and dried by heating to 60 ° C. under reduced pressure. Thus, 4,4′-dichloro-2,2′-bipyridyl-N, N′-dioxide was obtained.
還流管をつけた100mLのナスフラスコに2mLのクロロホルム、0.326mLの三塩化リン、0.082gの4,4'−dichloro−2,2'−bipyridyl−N,N'−dioxideを入れ、湯浴上75分還流させた。反応溶液を氷冷後、砕氷上に注ぎ、25%NaOHでpH7以上に中和する。この溶液から減圧溜去でクロロホルムを除去、析出した白色粉末をろ過で回収、さらに水で洗浄した。これを少量の石油エーテルに溶かし、冷凍庫で一晩再結晶を行い、白色針状結晶を得た。そして、減圧下、60℃に加熱して乾燥させた。こうして、4,4'−dichloro−2,2'−bipyridineを得た。
Into a 100 mL eggplant flask equipped with a reflux tube, add 2 mL of chloroform, 0.326 mL of phosphorus trichloride, 0.082 g of 4,4′-dichloro-2,2′-bipyrylyl-N, N′-dioxide, Refluxed on the bath for 75 minutes. The reaction solution is ice-cooled, poured onto crushed ice, and neutralized to
還流管をつけた100mLのナスフラスコに20mLのエチレングリコール、0.08gの(NH4)2[OsCl6],0.082gの4,4'−dichloro−2,2'−bipyridineを加えた。スターラ攪拌、窒素気流下マイクロ波合成器で300Wを20分間照射した。溶液を室温までさました後、0.1gのNa2S2O4を溶解させた10mLの水を加えた。室温で1時間攪拌した後に生じた黒紫沈殿をろ過、水洗して過剰の塩を除いた後に、ジエチルエーテルで洗浄し、未反応の配位子を除き、減圧下、60℃に加熱して乾燥させた。こうして、乾燥、Os(4,4'−dichloro−2,2'−bipyridine)2Cl2を得た。 To a 100 mL eggplant flask equipped with a reflux tube, 20 mL of ethylene glycol, 0.08 g of (NH 4 ) 2 [OsCl 6 ], 0.082 g of 4,4′-dichloro-2,2′-bipyridine was added. 300W was irradiated for 20 minutes with a microwave synthesizer under stirring with a stirrer and nitrogen flow. After the solution was cooled to room temperature, 10 mL of water in which 0.1 g of Na 2 S 2 O 4 was dissolved was added. The black purple precipitate formed after stirring for 1 hour at room temperature was filtered, washed with water to remove excess salts, then washed with diethyl ether to remove unreacted ligands, and heated to 60 ° C. under reduced pressure. Dried. Thus, drying and Os (4,4′-dichloro-2,2′-bipyridine) 2 Cl 2 were obtained.
還流管をつけた100mLのナスフラスコに以下の成分を加えた。
・13mLのエチレングリコール、9mLのエタノール。
・先に調製した0.02gのOs(4,4'−dichloro−2,2'−bipyridine)2Cl2。
・調製例1で調製した0.019gのポリアクリルアミドーポリビニルイミダゾールの共重合体。
The following components were added to a 100 mL eggplant flask equipped with a reflux tube.
-13 mL ethylene glycol, 9 mL ethanol.
- destination prepared 0.02g of Os (4,4'-dichloro-2,2'- bipyridine) 2
-0.019 g of polyacrylamide-polyvinylimidazole copolymer prepared in Preparation Example 1.
スターラ攪拌、窒素気流下マイクロ波合成器で300Wを2時間照射した。溶液を室温までさました後、これに20mLのエタノールを加えた溶液を、強攪拌下の500mLのジエチルエーテル溶液に滴下した。こうして生じる粘調な沈殿にさらに20mLのエタノールを加え、これを再び、強攪拌下の500mLのジエチルエーテル溶液に滴下、得られた粘調な沈殿を減圧下、60℃に加熱して乾燥させた。こうして、目的とする式(2)に記載の錯体ポリマーを得た。 300W was irradiated for 2 hours with a microwave synthesizer under stirring with a stirrer and nitrogen flow. After the solution was cooled to room temperature, a solution obtained by adding 20 mL of ethanol thereto was added dropwise to a 500 mL diethyl ether solution with vigorous stirring. An additional 20 mL of ethanol was added to the resulting viscous precipitate, which was again added dropwise to 500 mL of diethyl ether solution with strong stirring, and the resulting viscous precipitate was dried by heating to 60 ° C. under reduced pressure. . Thus, the target complex polymer described in the formula (2) was obtained.
実施例に先立って、実施例で使用される多孔質材料の調製法について記述する。 Prior to the examples, the method for preparing the porous material used in the examples is described.
調製例3
カーボン被覆アルミナナノホールの調製法について記述する。10-2Ωcmの抵抗値を有する鏡面研磨されたn型のリンドープ単結晶Si基板上に、RFスパッタ法によりに厚さ100nmのNb膜を成膜する。その後、Alを500nm成膜する。Siの裏側全面から電極を取り0.3Mの硫酸水溶液中、3℃で、電圧DC25Vを印加することで陽極酸化を行う。この工程中、陽極酸化がAl表面から進行しNb膜まで到達したことを示す電流を検知するため、陽極酸化電流をモニターしながら酸化を行う。反応が進行するに連れてAlが酸化され、絶縁層のアルミナになっていくのと同時に、ホールが成長し、最終的には下地Nbが導電パスで上部と導通する。陽極酸化処理後、純水、およびイソプロピルアルコールによる洗浄を行うことでアルミナナノホールを調製する。このときのホール径は走査型電子顕微鏡像から約20nmであることがわかる。調製したアルミナナノホールを管状炉内に入れ、設定温度まで毎分5℃ずつ上昇させる。熱処理中は、常に2%H2/98%He(容量比)を33sccmで流し、炭化水素ガスとして1%C2H2/99%He、1%C2H4/99%He(容量比)を66sccmで流して使用する。炭化水素熱分解時は、合計100sccmのガスが流れ、混合比はC2H4:H2:He=1:1:1×102である。2%H2/98%He(容量比)雰囲気で1000℃まで3時間20分かけて加熱し、10分間1000℃で保持する。その後1%C2H2/99%He(容量比)を10分間流す。その後、1000℃で1時間保持した後、3時間20分かけて冷却させる。その結果、図2に示すようなカーボン被覆アルミナナノホールが形成される。
Preparation Example 3
A method for preparing carbon-coated alumina nanoholes is described. An Nb film having a thickness of 100 nm is formed by RF sputtering on a mirror-polished n-type phosphorus-doped single crystal Si substrate having a resistance value of 10 −2 Ωcm. Thereafter, Al is deposited to a thickness of 500 nm. Anodization is performed by removing the electrode from the entire back side of Si and applying a voltage of DC25V at 3 ° C. in a 0.3 M sulfuric acid aqueous solution. During this step, oxidation is performed while monitoring the anodic oxidation current in order to detect a current indicating that the anodic oxidation has progressed from the Al surface and reached the Nb film. As the reaction proceeds, Al is oxidized and becomes alumina of the insulating layer. At the same time, holes grow and finally the base Nb is electrically connected to the upper part through a conductive path. After the anodizing treatment, alumina nanoholes are prepared by washing with pure water and isopropyl alcohol. It can be seen that the hole diameter at this time is about 20 nm from a scanning electron microscope image. The prepared alumina nanohole is placed in a tubular furnace and raised to 5 ° C. per minute up to the set temperature. During the heat treatment, 2% H 2 /98% He (volume ratio) is always supplied at 33 sccm, and 1% C 2 H 2 /99% He, 1% C 2 H 4 /99% He (volume ratio) is used as the hydrocarbon gas. ) At 66 sccm. During hydrocarbon pyrolysis, a total of 100 sccm of gas flows and the mixing ratio is C 2 H 4 : H 2 : He = 1: 1: 1 × 10 2 . Heat to 1000 ° C. over 3 hours and 20 minutes in a 2% H 2 /98% He (volume ratio) atmosphere and hold at 1000 ° C. for 10 minutes. Thereafter, 1% C 2 H 2 /99% He (volume ratio) is allowed to flow for 10 minutes. Then, after hold | maintaining at 1000 degreeC for 1 hour, it is made to cool over 3 hours and 20 minutes. As a result, carbon-coated alumina nanoholes as shown in FIG. 2 are formed.
実施例1
グルコースオキシダーゼ/金粒子複合体を用いた酵素電極と、これを用いたグルコースセンサ、生物燃料電池について記述する。
Example 1
An enzyme electrode using a glucose oxidase / gold particle complex, a glucose sensor using the same, and a biofuel cell will be described.
まず、アノードの調製について記述する。10mLのサンプル瓶に以下の成分を加えた。
・2mLの0.1Mリン酸緩衝液(pH6.5)。
・50mMのグルコース、10mgmL-1のグルコースオキシダーゼ(以降GODと表記)Aspergillus niger(190Umg-1,Sigma)、
・0(ゼロ:NaAuCl4添加なし)、4.8または8.0、64mgmL-1のNaAuCl4
これを3日間放置して、GOD/金粒子複合体を調製した。直径3mmのグラッシーカーボン電極(BAS)をアルミナペーストで研磨し、超音波水洗後、調製例1の錯体ポリマーの10mgmL-1水溶液を6μL滴下した。乾燥後、先に調製したGOD/金粒子複合体を1.2μL、更には、2.5mgmL-1のポリエチレングリコールジグリシデルエーテル(以降PEGDGEと表記)1.6μLを滴下し、一晩乾燥させた。その後、調製した電極を0.15MのNaClを加えた20mMリン酸緩衝液pH7.0(以降PBSと表記)で洗浄した。調製サンプルをそれぞれのNaAuCl4濃度(なし、4.8または8.0mgmL-1)に対し次のようにいう。即ち、比較例のアノード(NaAuCl4 なし:アノードA)、実施例のアノード(NaAuCl4 濃度 4.8 mg mL-1: アノードB、8.0 mg mL-1: アノードC)である。
First, preparation of the anode will be described. The following ingredients were added to a 10 mL sample bottle.
-2 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5).
50 mM glucose, 10 mgmL −1 glucose oxidase (hereinafter referred to as GOD) Aspergillus niger (190 Umg −1 , Sigma),
0 (zero: no NaAuCl 4 added), 4.8 or 8.0, 64 mg mL −1 NaAuCl 4
This was left for 3 days to prepare a GOD / gold particle composite. A glassy carbon electrode (BAS) having a diameter of 3 mm was polished with an alumina paste, washed with ultrasonic water, and 6 μL of 10 mg mL −1 aqueous solution of the complex polymer of Preparation Example 1 was dropped. After drying, 1.2 μL of the previously prepared GOD / gold particle composite was added dropwise, and 1.6 μL of 2.5 mg mL −1 polyethylene glycol diglycidel ether (hereinafter referred to as PEGDGE) was dropped and dried overnight. . Thereafter, the prepared electrode was washed with 20 mM phosphate buffer pH 7.0 (hereinafter referred to as PBS) to which 0.15 M NaCl was added. The prepared sample is referred to as follows for each NaAuCl 4 concentration (none, 4.8 or 8.0 mg mL −1 ). That is, the anode of Comparative Example (without NaAuCl 4 : Anode A) and the anode of Example (NaAuCl 4 concentration 4.8 mg mL −1 : Anode B, 8.0 mg mL −1 : Anode C).
次に、カソードの調製について記述する。マイクロチューブに以下の成分を混合した。
・10mgmL-1の調製例2に記載の錯体ポリマーの水溶液:10.3μL。
・20mMリン酸緩衝液(pH7.0):2μL。
・55mgmL-1のビリルビンオキシダーゼ(以降BODと表記)。
・Myrothecium verrucaria(15−65Umg-1、シグマ)の20mMリン酸緩衝液(pH7.0)溶液:1.7μL。
・7mgmL-1のPEGDGE水溶液:2μL。
溶液をアルミナペーストで研磨、超音波水洗した直径3mmのグラッシーカーボン電極上に6μL滴下し、一晩乾燥させた。その後、調製した電極をPBSで洗浄した。
Next, the preparation of the cathode is described. The following components were mixed in a microtube.
10 mg mL −1 aqueous solution of complex polymer as described in Preparation Example 2 10.3 μL.
-20 mM phosphate buffer (pH 7.0): 2 μL.
55 mg mL -1 bilirubin oxidase (hereinafter referred to as BOD).
-20 mM phosphate buffer (pH 7.0) solution of Myrothecerium verrucaria (15-65 Umg −1 , Sigma): 1.7 μL.
7 mg mL -1 aqueous PEGDGE solution: 2 μL.
6 μL of the solution was dropped onto a glassy carbon electrode having a diameter of 3 mm, which was polished with an alumina paste and washed with ultrasonic water, and dried overnight. Thereafter, the prepared electrode was washed with PBS.
調製したGOD/金粒子複合体の透過型電子顕微鏡写真を図3に示す。生成した金粒子は、添加したNaAuCl4濃度によって、一次粒子のときと、一次粒子が会合した二次粒子を形成している場合があった。本実施例の実施条件では、NaAuCl4濃度が8.0 mg mL-1のときに一次粒子(図3A)、4.8 mg mL-1のときに二次粒子(図3B)を形成した。金粒子の平均粒径は、それぞれ18nm(一次粒径)、45nm(二次粒径)であった。また、透過型電子顕微鏡観測によって、金属粒子の一部が酵素の内部に入りこんだ酵素/金属粒子複合体を形成していることが確認できた。(図3C) 64 mg mL-1 のNaAuCl4 濃度で調製したサンプルは、溶液に金属光沢が見られ、粒子がおおよそ 300 nm 以上のサイズになっていることが推測された。 A transmission electron micrograph of the prepared GOD / gold particle composite is shown in FIG. Depending on the added NaAuCl 4 concentration, the generated gold particles may be primary particles or may form secondary particles in which the primary particles are associated. Under the working conditions of this example, primary particles (FIG. 3A) were formed when the NaAuCl 4 concentration was 8.0 mg mL −1 and secondary particles (FIG. 3B) were formed when the NaAuCl 4 concentration was 4.8 mg mL −1 . The average particle size of the gold particles was 18 nm (primary particle size) and 45 nm (secondary particle size), respectively. Further, it was confirmed by observation with a transmission electron microscope that an enzyme / metal particle complex was formed in which some of the metal particles entered the inside of the enzyme. (FIG. 3C) A sample prepared with a NaAuCl 4 concentration of 64 mg mL −1 had a metallic luster in the solution, and it was estimated that the particles had a size of approximately 300 nm or more.
次に、調製した酵素電極を用いた基質センサについての詳細を記述する。図4に示すように、調製したアノードを作用電極19、白金線を対電極18、銀/塩化銀電極を参照電極21として3電極セルを構成し、ポテンショスタット12に接続することで、基質センサとした。電解液20としてPBSを使用し、30分以上N2ガスを吹き込むことで電解液から酸素を除去した。作用電極19に300mV vs Ag/AgClの電位を印加して定常電流(触媒電流)を観測する。アノードA、B及びCをそれぞれ個々に作用電極19として用いて観測される定常電流の5mMのグルコース濃度における、それぞれのアノードから観測される定常電流値は、アノードA、B及びCに対し、それぞれ1.1μA、2.6μA及び4.0μAであった。また、64mg mL-1 のNaAuCl4 から生成した酵素を含む金粒子を用いて調製したアノードからは、有意の酵素電流は観測されなかった。これにより、適当な条件でGOD/金粒子複合体を用いることで、電流が4倍近くになることが観測された。
Next, details of the substrate sensor using the prepared enzyme electrode will be described. As shown in FIG. 4, a three-electrode cell is constructed using the prepared anode as the working
この金属粒子と複合した酵素を用いて作製した酵素電極の触媒電流は、金属粒子と複合していない酵素を用いて調製した酵素電極と比較して、高い値を示した。これは、酵素反応によって生成した金属粒子によって、酵素の酸化還元中心からの電荷の取り出し速度が向上したためと考えられる。 The catalytic current of the enzyme electrode prepared using the enzyme combined with the metal particles was higher than that of the enzyme electrode prepared using the enzyme not combined with the metal particles. This is presumably because the metal particles generated by the enzymatic reaction have improved the charge extraction rate from the redox center of the enzyme.
この酵素の酸化還元中心からの電荷の取り出し速度が向上した酵素電極を用いることで、測定可能な濃度範囲の広い(測定濃度範囲の上限が高く、下限が低い)センサを調製することができる。この理由は以下のように説明できる。 By using an enzyme electrode with an improved charge extraction rate from the redox center of the enzyme, a sensor having a wide measurable concentration range (the upper limit of the measured concentration range is high and the lower limit is low) can be prepared. The reason for this can be explained as follows.
一般に酵素電極を用いたセンサにおいては、酵素電流値の基質濃度依存性を観測したときに、基質濃度の増大と共に、酵素反応が律速となる領域が現れ、電流値が基質濃度の増大と比例して増大しない現象が観測される。ここで、金属粒子と複合した酵素を用いて作製した酵素電極では、金属粒子が酵素の酸化還元中心から電荷を取り出し速度を向上させる。そのため、金属粒子と複合していない酵素電極を用いた場合(例えば比較例)と比較して、酵素の活性中心から導電性部材への電荷輸送の高速化が可能となる。この活性中心から導電性部材への高速の電荷輸送によって、酵素反応が律速となる基質の濃度を向上させ、酵素電極を用いたセンサの測定可能な濃度範囲の上限を向上させることができる。 In general, in a sensor using an enzyme electrode, when the dependence of the enzyme current value on the substrate concentration is observed, a region where the enzyme reaction becomes rate-limiting appears as the substrate concentration increases, and the current value is proportional to the increase in the substrate concentration. A phenomenon that does not increase is observed. Here, in an enzyme electrode produced using an enzyme combined with metal particles, the metal particles take out charges from the redox center of the enzyme and improve the speed. Therefore, it is possible to speed up the charge transport from the active center of the enzyme to the conductive member as compared with a case where an enzyme electrode not combined with metal particles is used (for example, a comparative example). The high-speed charge transport from the active center to the conductive member can improve the concentration of the substrate at which the enzyme reaction is rate-determined, and can improve the upper limit of the measurable concentration range of the sensor using the enzyme electrode.
一般に酵素電極においては、測定下限を決定する主要な指標として、酵素電流/バックグラウンド電流比が挙げられる。このバックグラウンド電流は、一般的に導電性部材の面積に比例する。このため、バックグラウンド電流を低減するためには、導電性部材の面積を小さくすることが有効である。さらに、導電性部材の面積の低減は、基質の拡散律速の影響を低下させるが、全体の酵素電流も同時に低下させてしまう。ここで、金属粒子と複合した酵素を用いて作製した電極では、金属粒子が、酵素の酸化還元中心からの電荷を取り出し速度を向上させる。そのため、金属粒子と複合していない酵素電極を用いた場合(例えば比較例)と比較して、酵素の活性中心から導電性部材への電荷の輸送の高速化が可能となる。これによって、酵素電極の酵素電流密度(導電性部材の単位面積あたりの電流値)を向上させることで、同じ酵素電流値を、より小さな導電性部材の面積で与えることが可能となる。その結果、酵素電流/バックグラウンド電流比を向上させ、測定下限を低下させることができる。 In general, in an enzyme electrode, an enzyme current / background current ratio can be mentioned as a main index for determining a measurement lower limit. This background current is generally proportional to the area of the conductive member. For this reason, in order to reduce the background current, it is effective to reduce the area of the conductive member. Furthermore, the reduction of the area of the conductive member reduces the influence of the substrate diffusion rate control, but also reduces the overall enzyme current. Here, in the electrode produced using the enzyme combined with the metal particles, the metal particles take out the charge from the redox center of the enzyme and improve the speed. Therefore, it is possible to speed up the transport of charges from the active center of the enzyme to the conductive member as compared with a case where an enzyme electrode not combined with metal particles is used (for example, a comparative example). Thus, by improving the enzyme current density (current value per unit area of the conductive member) of the enzyme electrode, the same enzyme current value can be given with a smaller area of the conductive member. As a result, the enzyme current / background current ratio can be improved and the measurement lower limit can be lowered.
実施例のアノードまたは比較例アノードを用いて観測される定常電流の溶液中グルコース濃度依存性の傾向を図5に示す。それぞれのアノードにおいては、あるグルコース濃度まで直線的に定常電流が増大し、その後飽和傾向となる。この直線性の範囲は、実施例の酵素電極において、比較例の酵素電極よりも上下限共に広く、グルコースセンサのグルコース濃度の測定可能範囲が拡大する。 FIG. 5 shows a trend of the steady-state current dependence on the glucose concentration in the solution observed using the anode of the example or the comparative example anode. At each anode, the steady-state current increases linearly up to a certain glucose concentration and then saturates. This linearity range is wider in both the upper and lower limits in the enzyme electrode of the example than in the enzyme electrode of the comparative example, and the measurable range of the glucose concentration of the glucose sensor is expanded.
次に、調製した実施例のアノード、比較例のアノードとカソードを組み合わせて用いた生物燃料電池についての詳細を記述する。図6に示すように、調製したアノードを作用電極19、カソードを対電極23として生物燃料電池とする。グルコース10mMを含むPBSを電解液20として使用し、空気をバブリングしながら、アノードA、B及びCをそれぞれ個々に作用電極19として用いて生物燃料電池特性を測定する。電池の最大出力は、電圧、電流、フィルファクターの積であらわされる。
Next, the details of the biofuel cell using the prepared anode of the example and the anode and cathode of the comparative example in combination will be described. As shown in FIG. 6, the prepared anode is a working
ここで、金属粒子と複合した酵素を用いて作製した電極では、金属粒子と複合していない酵素電極を用いた場合(例えば比較例)と比較して、金属粒子が、酵素の酸化還元中心から電荷を取り出し速度を向上させるため、高い電流と出力を得ることができる。 Here, in the electrode produced using the enzyme combined with the metal particle, the metal particle is separated from the redox center of the enzyme as compared with the case where the enzyme electrode not combined with the metal particle is used (for example, comparative example). A high current and output can be obtained because the charge extraction speed is improved.
図8に、実施例の酵素電極を用いた場合と、比較例の酵素電極を用いた場合の生物燃料電池の電流−電位曲線について特性の傾向を示す。その結果、実施例の酵素電極を用いた生物燃料電池では、比較例の酵素電極を用いた生物燃料電池よりも、電流値が高いために、高い出力がえられる。 FIG. 8 shows the tendency of the characteristics of the current-potential curve of the biofuel cell when the enzyme electrode of the example is used and when the enzyme electrode of the comparative example is used. As a result, the biofuel cell using the enzyme electrode of the example has a higher current value than the biofuel cell using the enzyme electrode of the comparative example, and thus a high output can be obtained.
実施例2
調製例3のカーボン被覆アルミナナノホール基板を1cm角に切断し、UV−オゾン処理を行って親水化した後に、サンプル瓶中、1mgmL-1のGODのPBS溶液に24時間浸漬を行う。基板を引き上げ、0.1Mリン酸緩衝液(pH6.5)で10回洗浄を行った。更に、基板を0(NaAuCl4添加なし)もしくは8mgmL-1のNaAuCl4の0.1Mリン酸緩衝液(pH6.5)溶液に浸漬し、50mMのグルコースを加え3日間静置する。基板を引き上げPBSで10回洗浄を行った後、カーボンペースト(旭化学研究所)を用いてリードとなる銅線とのコンタクトを取る。カーボンペースト、銅線等の導電部位のうち溶液に接触する部位には、シリコーンゴム(信越シリコーン)を塗布し絶縁する。実施例2において、調製サンプルをそれぞれのNaAuCl4濃度(なし、8.0mgmL-1)に対し比較例のアノード、実施例のアノードと呼称する。
Example 2
The carbon-coated alumina nanohole substrate of Preparation Example 3 is cut into 1 cm square and hydrophilized by UV-ozone treatment, and then immersed in a PBS solution of 1 mg mL −1 GOD for 24 hours in a sample bottle. The substrate was pulled up and washed 10 times with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5). Further, the substrate is immersed in 0 (no addition of NaAuCl 4 ) or 8 mg mL −1 NaAuCl 4 in 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5), and 50 mM glucose is added and left for 3 days. After the substrate is pulled up and washed 10 times with PBS, contact is made with the copper wire to be the lead using carbon paste (Asahi Chemical Research Laboratories). Silicone rubber (Shin-Etsu Silicone) is coated and insulated on conductive parts such as carbon paste and copper wire that come into contact with the solution. In Example 2, the prepared samples are referred to as comparative anodes and example anodes for each NaAuCl 4 concentration (none, 8.0 mg mL −1 ).
次に、調製した酵素電極を用いた基質センサについての詳細を記述する。図4に示すように、調製したアノードを作用電極19、白金線を対電極18、銀/塩化銀電極を参照電極21としてポテンショスタットに接続することで、基質センサとする。電解液20としてPBSを使用し、30分以上N2ガスを吹き込むことで電解液から酸素を除去する。作用電極19に600mV vsAg/AgCl の電位を印加して定常電流(酵素触媒電流)を観測する。アノードD及びFをそれぞれ個々に作用電極19として用いて観測される定常電流の溶液中グルコース濃度依存性の傾向を図7に示す。その結果、比較例のアノードを用いた場合には、酵素触媒電流が小さい、もしくは、観測されないのに対し、実施例のアノードを用いた場合には、電流値が大きく、一定のグルコース濃度範囲で、グルコース濃度に対して直線的に増大する。この結果は、アルミナナノホール中に酵素が担持されただけで金粒子が生成されない比較例のアノードでは、酵素の酸化還元中心と、基材の壁面のカーボンが効果的には、電気的に接続されないことを示している。そして、このためにグルコースの酸化に起因する酵素触媒電流を外部回路に効果的に取り出すことが困難なこと示している。一方、実施例のアノードでは、GOD/金粒子複合体がカーボン被覆アルミナナノホール中で形成されることにより、酵素の酸化還元中心と基材の壁面のカーボンが電気的に接続され、酵素触媒電流が観測される。また、多孔質材料の孔中に酵素を導入し、酵素の基質と金属前駆体の存在下、酵素における酵素の基質の関与する反応によって、金属前駆体から金属粒子を析出させることができる。
Next, details of the substrate sensor using the prepared enzyme electrode will be described. As shown in FIG. 4, the prepared anode is connected to a potentiostat using the working
本発明は、新規な酵素電極、およびそれを用いたセンサ、生物燃料電池を提供でき、例えば、バイオセンサ、酵素の基質を燃料として用いる燃料電池に使用可能な部材として極めて有用である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can provide a novel enzyme electrode, a sensor using the same, and a biofuel cell. For example, the present invention is extremely useful as a member that can be used in a fuel cell using a biosensor or an enzyme substrate as a fuel.
1 酵素
2 金属微粒子
3 酵素の内部に入りこんだ金属微粒子
4 陽極酸化アルミナ
5 カーボン
6 Nb(導電パス)
7 Nb膜
8 Si基板
9 参照電極のリード
10 作用電極のリード
11 対電極のリード
12 ポテンショスタット
13 ガス供給口
14 温調セルのカバー
15 ガス供給管
16 温調セル
17 温調水供給口
18 白金対電極
19 アノード
20 電解液
21 参照電極
22 温調水排出口
23 カソード
DESCRIPTION OF
7
Claims (11)
前記酵素は、該酵素の内部に該金属粒子を含み、
前記金属粒子は、前記酵素と該酵素に対する基質となる物質との反応に伴って金属を形成し得る金属前駆体の存在下に、前記酵素と前記基質とを反応させることによって粒子形成されている
ことを特徴とする酵素電極。 In an enzyme electrode having a conductive member, an enzyme, and metal particles,
The enzyme includes the metal particles inside the enzyme ,
The metal particles are formed by reacting the enzyme and the substrate in the presence of a metal precursor capable of forming a metal in association with a reaction between the enzyme and a substance serving as a substrate for the enzyme. An enzyme electrode characterized by the above.
前記酵素の基質と、金属粒子の前駆体との存在下、
前記酵素と前記基質との反応によって、前記金属粒子の前駆体から金属粒子を析出させることを特徴とする
多孔質材料の孔中に金属粒子を製造する方法。 Introducing an enzyme into the pores of the porous material,
In the presence of a substrate of the enzyme and a precursor of metal particles,
A method for producing metal particles in pores of a porous material, wherein metal particles are precipitated from a precursor of the metal particles by a reaction between the enzyme and the substrate.
酵素を用意する工程と、
前記酵素と該酵素の基質との反応によって金属を形成し得る金属前駆体の存在下、前記酵素と前記基質とを反応させることにより、前記酵素内に金属粒子を備えている、酵素/金属粒子複合体を得る工程と、
を有することを特徴とする酵素電極の製造方法。 A method for producing an enzyme electrode having an enzyme and metal particles,
Preparing an enzyme;
Enzyme / metal particles comprising metal particles in the enzyme by reacting the enzyme with the substrate in the presence of a metal precursor capable of forming a metal by reaction of the enzyme with a substrate of the enzyme Obtaining a complex;
A method for producing an enzyme electrode, comprising:
導電性を有する多孔質材料の孔中に酵素を導入する工程と、
前記酵素と該酵素の基質との反応によって金属を形成し得る金属前駆体の存在下、前記多孔質材料の孔中の酵素と前記基質とを反応させることにより、前記酵素内に金属粒子を備えている、酵素/金属粒子複合体を前記多孔質材料の孔中に得る工程と、
を有することを特徴とする酵素電極の製造方法。 A method for producing an enzyme electrode having an enzyme and metal particles,
Introducing an enzyme into the pores of the conductive porous material;
In the presence of a metal precursor capable of forming a metal by reaction between the enzyme and the enzyme substrate, the enzyme in the pores of the porous material is reacted with the substrate to provide metal particles in the enzyme. Obtaining an enzyme / metal particle complex in the pores of the porous material;
A method for producing an enzyme electrode, comprising:
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