JP5007879B2 - Yeast strain releasing mannan protein and method for producing mannan protein - Google Patents
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Description
本発明は、酵母細胞壁構成成分、特にマンナンタンパク質、とりわけα-マンナンを含むマンナンタンパク質を培地中に放出する酵母株、並びにこの株を用いたマンナンタンパク質、特にα-マンナンを含むマンナンタンパク質の製造法に関する。また、本発明は、マンナン、特にα-マンナンの製造方法にも関する。 The present invention relates to a yeast strain that releases yeast cell wall components, particularly mannan proteins, particularly mannan proteins containing α-mannan, into a medium, and a method for producing mannan proteins, particularly mannan proteins containing α-mannan, using this strain. About. The present invention also relates to a method for producing mannan, particularly α-mannan.
（背景技術）
酵母の利用はその高い安全性から長い歴史があり、パンの製造、ビール等アルコール類の発酵のみならず、酵母自身もエキスとして、あるいは酵母細胞壁としてさまざまな用途に用いられてきた。細胞壁は不溶性グルカンを主体としており、主に食物繊維として利用されてきた。グルカンには免疫賦活等の機能があることも知られており、近年の健康食品ブームの中で、注目される食品素材のひとつとなっている。一方、細胞壁中にはマンナンタンパク質を主体とする水溶性多糖類も存在する。マンナンタンパク質は細胞壁に局在するタンパク質にN-グリコシド結合あるいはO-グリコシド結合とよばれる結合様式でマンナン鎖が結合した物質の総称である。酵母細胞壁由来の水溶性多糖類の機能性についても多くの研究がなされており、制癌作用（特公昭58−57153号）、抗腫瘍作用（特開昭58−109423号、特公昭64−3479号）、抗感染作用（特開昭58−109423号）、抗高血圧作用（特開昭63−101327号）、抗植物ウイルス作用（特公昭59−40126号）等が報告されている。また特にマンナン部分に着目した研究でも、インターフェロン誘導活性（Acta Virology, 1970;14:1-7）、マクロファージ遊走阻止活性（Jpn. J. of Microbiol., 1975;19:355-362）、TNFα産生の増強（Microbiol. Immunol., 2002;46(7):503-12）など多くの機能性が報告されている。(Background technology)
The use of yeast has a long history because of its high safety, and not only the production of bread and the fermentation of alcohol such as beer, but also yeast itself has been used for various uses as an extract or as a yeast cell wall. The cell wall is mainly composed of insoluble glucan and has been mainly used as dietary fiber. Glucan is also known to have functions such as immunostimulation, and has become one of the food materials attracting attention in the recent health food boom. On the other hand, water-soluble polysaccharides mainly composed of mannan protein are also present in the cell wall. Mannan protein is a general term for substances in which mannan chains are bound to proteins located in the cell wall in a binding mode called N-glycoside bond or O-glycoside bond. Many studies have also been made on the functionality of water-soluble polysaccharides derived from the yeast cell wall, including anticancer activity (Japanese Patent Publication No. 58-57153), antitumor action (Japanese Patent Publication No. 58-109423, Japanese Patent Publication No. 64-3479). No.), anti-infective action (JP-A 58-109423), anti-hypertensive action (JP-A 63-101327), anti-plant virus action (JP-B 59-40126), and the like have been reported. In particular, research focusing on the mannan moiety also showed interferon-inducing activity (Acta Virology, 1970; 14: 1-7), macrophage migration inhibitory activity (Jpn. J. of Microbiol., 1975; 19: 355-362), TNFα production Many functionalities have been reported, such as enhancement of (Microbiol. Immunol., 2002; 46 (7): 503-12).
これらで報告されているマンナンの抽出方法は大別すると3つに分類することが出来る。（１）熱水（希アルカリを含む）抽出（特公昭64−3479号、特開昭58−109423号）（２）自己消化（特公昭58−57153号）（３）細胞壁溶解酵素による消化（特公昭59−40126号）、である。これら方法により得た粗抽出液は、マンナン−銅複合体を形成させ脱銅する、塩酸により除タンパク質する、アルコール沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、プロテアーゼ処理などを適宜組み合わせることにより機能性画分を回収していた。これらの方法における精製ステップは煩雑であり、また、培地１Lあたりの回収量は100mg程度であった。 The mannan extraction methods reported in these can be broadly classified into three. (1) Extraction with hot water (including dilute alkali) (JP-B 64-3479, JP-A 58-109423) (2) Autolysis (JP-B 58-57153) (3) Digestion with cell wall lytic enzyme ( No. 59-40126). The crude extract obtained by these methods can function by appropriately combining a mannan-copper complex to remove copper, deproteinize with hydrochloric acid, alcohol precipitation, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, protease treatment, etc. The sex fraction was collected. The purification steps in these methods are complicated, and the recovered amount per liter of the medium is about 100 mg.
またマンナンの生合成に関する種々の酵母株を用いて、マンナン構造を改変する技術が報告されている（特開平2-419，特開平6-277086，特開平6-296482，特開平9-135689，特開平9-266792）。マンナンの構造の違いによっても直鎖状マンナンの抗腫瘍活性（特開昭54-97692）、リン含有マンナンの腹水型腫瘍に対する抗腫瘍活性（特開昭58-121216）などの機能が報告されている。
これらの知見を生かすためにも、効率的なマンナンタンパク質製造法の開発が望まれていた。
マンナンを菌対外に分泌する酵母としては、Rhodotorula mucilaginosa YR-2株が知られている（日本栄養・食糧学会誌、55巻、33-39（2002）、特開2002-095492）。この酵母の分泌するマンナンはβ1,3-、β1,4-結合の繰り返しよりなるいわゆるβ-マンナンであり、細胞壁成分であるマンナンタンパク質に含まれるα-マンナンとは異なる。Further, techniques for modifying the mannan structure using various yeast strains relating to biosynthesis of mannan have been reported (Japanese Patent Laid-Open Nos. 2-419, 6-277086, 6-296482, and 9-135689, JP 9-266792). Functions such as the antitumor activity of linear mannan (JP-A-54-97692) and the antitumor activity of phosphorus-containing mannan against ascites tumors (JP-A-58-121216) have also been reported depending on the structure of mannan. Yes.
In order to make use of these findings, development of an efficient mannan protein production method has been desired.
Rhodotorula mucilaginosa YR-2 strain is known as a yeast that secretes mannan out of bacteria (Japanese Journal of Nutrition and Food, 55, 33-39 (2002), JP 2002-095492). The mannan secreted by this yeast is so-called β-mannan composed of repeated β1,3- and β1,4-linkages, and is different from α-mannan contained in mannan protein which is a cell wall component.
（発明の開示）
本発明の目的は、できる限り酵母が本来持つ状態に近いマンナンタンパク質、特にα-マンナンを含むマンナンタンパク質を放出する酵母株、および、そのようなマンナンタンパク質、特にα-マンナンを含むマンナンタンパク質を効率よく製造する方法を提供することである。
また本発明の別の目的は、本発明の酵母株および／または本発明の方法を用いて製造される、天然状態に近い、マンナンタンパク質、特にα-マンナンを含むマンナンタンパク質を提供することである。ここで、α-マンナンとは、α1,6-、α-1,2-またはα1,3-結合からなるD-マンノースの重合体である。
本発明のまた別の目的は、マンナン、特にα-マンナンを効率的に製造する方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、本発明の方法を用いて製造される、天然状態に近いマンナン、特にα-マンナンを提供することである。
本発明において、特に断らない限り、マンナンタンパク質およびマンナンは、それぞれ酵母由来のマンナンタンパク質（酵母マンナンタンパク質）および酵母由来のマンナン（酵母マンナン）である。(Disclosure of the Invention)
It is an object of the present invention to efficiently produce a mannan protein, particularly a mannan protein containing α-mannan, and a mannan protein containing α-mannan. It is to provide a well-manufactured method.
Another object of the present invention is to provide a mannan protein, particularly a mannan protein containing α-mannan, which is produced using the yeast strain of the present invention and / or the method of the present invention and which is close to the natural state. . Here, α-mannan is a polymer of D-mannose composed of α1,6-, α-1,2- or α1,3-linkage.
Yet another object of the present invention is to provide a method for efficiently producing mannan, especially α-mannan.
It is a further object of the present invention to provide mannans, particularly α-mannans, which are produced using the method of the present invention and are close to the natural state.
In the present invention, unless otherwise specified, mannan protein and mannan are yeast-derived mannan protein (yeast mannan protein) and yeast-derived mannan (yeast mannan), respectively.
本発明は、酵母細胞壁成分、特にマンナンタンパク質、とりわけα-マンナンを含むマンナンタンパク質を培地中に放出することを特徴とする酵母株である。より具体的には、本発明は、糖鎖合成系遺伝子に変異を持つことにより、α-マンナンを含むマンナンタンパク質を培地中に放出する酵母である。さらに具体的には、本発明は、その変異がマンナンタンパク質を細胞壁にとどまらせる機構にかかわるタンパク質をコードする遺伝子内にあることを特徴とする、マンナンタンパク質を培地中に放出する酵母株である。
特に本発明はα1,2-マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子内に変異を有する、α-マンナンを含むマンナンタンパク質を放出する酵母である。さらに具体的には、本発明はα1,2-マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子内に変異を有する、α-マンナンを含むマンナンタンパク質を放出する酵母株であって、前記α1,2-マンノシルトランスフェラーゼが配列番号17記載の配列のヌクレオチド番号234〜2081の配列（この領域によってGPI10タンパク質（Gpi10p）がコードされる）を有する核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る核酸によってコードされる、前記酵母株である。
特に本発明の酵母は、受託番号FERM BP-10390またはFERM BP-10391で特定される酵母である。The present invention is a yeast strain characterized by releasing yeast cell wall components, particularly mannan proteins, particularly mannan proteins containing α-mannan, into a medium. More specifically, the present invention is a yeast that releases a mannan protein containing α-mannan into a medium by having a mutation in a sugar chain synthesis gene. More specifically, the present invention is a yeast strain that releases mannan protein into a culture medium, characterized in that the mutation is in a gene encoding a protein involved in the mechanism that causes the mannan protein to remain in the cell wall.
In particular, the present invention is a yeast that releases a mannan protein containing α-mannan having a mutation in the gene encoding α1,2-mannosyltransferase. More specifically, the present invention relates to a yeast strain that releases a mannan protein containing α-mannan having a mutation in the gene encoding α1,2-mannosyltransferase, wherein the α1,2-mannosyltransferase is a sequence. In the yeast strain encoded by a nucleic acid capable of hybridizing under stringent conditions with a nucleic acid having the sequence of nucleotide numbers 234 to 2081 of the sequence described in No. 17 (this region encodes the GPI10 protein (Gpi10p)) is there.
In particular, the yeast of the present invention is a yeast specified by the accession number FERM BP-10390 or FERM BP-10391.
また本発明は、細胞壁成分を培地中に放出することを特徴とする酵母、特にマンナンタンパク質、とりわけα-マンナンを含むマンナンタンパク質を培地中に放出する酵母を液体培地で培養し、培地中に放出されたマンナンタンパク質、とりわけα-マンナンを含むマンナンタンパク質を回収することを含む、マンナンタンパク質、とりわけα-マンナンを含むマンナンタンパク質の製造方法である。
また、本発明は前記方法によって製造される、細胞壁に天然に存在するマンナンタンパク質に近い状態にある（天然状態に近い）単離マンナンタンパク質、特にα-マンナンを含む単離マンナンタンパク質でもある。
更に、本発明は、本発明によって得られるおよび／または本発明のマンナンタンパク質、特にα-マンナンを含むマンナンタンパク質から、タンパク質部分を除去することを含む、細胞壁に天然に存在するマンナンタンパク質に含まれる状態に近い（天然状態に近い）マンナン、特にα-マンナンの製造方法、および、前記方法によって得られるマンナン、特にα-マンナンである。The present invention also provides a yeast characterized in that cell wall components are released into the medium, in particular, a yeast that releases mannan protein, particularly mannan protein containing α-mannan, into the medium. A method for producing a mannan protein, particularly a mannan protein comprising α-mannan, which comprises recovering the prepared mannan protein, particularly a mannan protein comprising α-mannan.
The present invention is also an isolated mannan protein produced by the above method, which is in a state close to (near the natural state) a mannan protein naturally present in the cell wall, particularly an isolated mannan protein containing α-mannan.
Furthermore, the present invention is included in a mannan protein naturally present in the cell wall comprising removing a protein moiety obtained from the present invention and / or from a mannan protein of the present invention, in particular a mannan protein comprising α-mannan. Mannan close to the state (close to the natural state), in particular α-mannan, and mannan obtained by the method, in particular α-mannan.
（発明を実施するための最良の形態）
本発明において、細胞壁構成成分、特にマンナンタンパク質を培地中に放出する酵母が作製および使用される。このような酵母は、酵母を変異誘発処理し、マンナンタンパク質を細胞壁にとどまらせることが出来なくなった酵母株を選抜することによって得ることができる。変異処理する酵母は特に限定されないが、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、サッカロミセス・パラドキサス(Saccharomyces paradoxus)、サッカロミセス・ミカタエ(Saccharomyces mikatae)、サッカロミセス・バヤヌス(Saccharomyces bayanus)、サッカロミセス・クドリアヴゼヴィイ(Saccharomyces kudriavzevii)、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、カンジダ・ウチリス（Candida utilis）、カンジダ・アリビカンス(Candida albicans)が好ましく、Saccharomyces cerevisiaeがより好ましい。変異誘発処理は一般的な方法、たとえばEMS等の変異原処理、UV照射、放射線照射によって行うことができる。これらの方法による酵母の変異誘発手順は当業者にはよく知られたものである（石川ら、微生物遺伝学実験法、共立出版；Kaiser. C.ら、1994 Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory）。(Best Mode for Carrying Out the Invention)
In the present invention, yeast that releases cell wall components, particularly mannan protein, into the medium is produced and used. Such a yeast can be obtained by mutagenesis treatment of the yeast and selecting a yeast strain that is unable to retain the mannan protein on the cell wall. The yeast to be mutated is not particularly limited. Saccharomyces kudriavzevii, Kluyveromyces lactis, Candida utilis and Candida albicans are preferred, and Saccharomyces cerevi is preferred. Mutagenesis treatment can be performed by a general method, for example, mutagen treatment such as EMS, UV irradiation, and radiation irradiation. The procedures for mutagenesis of yeast by these methods are well known to those skilled in the art (Ishikawa et al., Microbial Genetics Experimental Method, Kyoritsu Shuppan; Kaiser. C. et al., 1994 Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory. ).
例えば、EMSによって変異誘発を行う場合、マンナンタンパク質をほとんど放出しない酵母株、例えば野生型酵母株をYPD培地にて培養し、集菌した後4mlの2％グルコースを含む適切なバッファー、例えば0.2Mリン酸バッファー（pH8.0）に懸濁し、最終濃度１％〜５％，好ましくは約３％程度でエチルメタンスルホネート（EMS）を添加する。この懸濁液を更に30℃にて30分間〜90分間振とうし、変異処理する。EMSの濃度および処理時間は生存率が15％〜60％、好ましくは20〜30％程度になるように適宜変動させることができる。変異処理後6%チオ硫酸ナトリウム溶液にてEMSを中和し、菌体を適切な培地、例えばYPD培地に塗布する。 For example, when mutagenesis is performed by EMS, a yeast strain that hardly releases mannan protein, such as a wild-type yeast strain, is cultured in YPD medium and collected, and then a suitable buffer containing 4 ml of 2% glucose, such as 0.2 M Suspend in phosphate buffer (pH 8.0), and add ethylmethanesulfonate (EMS) at a final concentration of 1% to 5%, preferably about 3%. This suspension is further shaken at 30 ° C. for 30 minutes to 90 minutes to carry out mutation treatment. The concentration and treatment time of EMS can be appropriately changed so that the survival rate is 15% to 60%, preferably about 20 to 30%. After the mutation treatment, EMS is neutralized with a 6% sodium thiosulfate solution, and the cells are applied to an appropriate medium, for example, YPD medium.
本発明の酵母は、マンナンタンパク質を細胞壁にとどまらせるのに必要な部位の合成酵素、たとえばグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカーの生合成にかかわるα1,2-マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、例えばGPI10に変異を有し、マンナンタンパク質を細胞壁にとどまらせることが出来なくなった株であることが好ましい。GPI10によってコードされるGPIタンパク質（Gpi10p）は616アミノ酸からなり、複数の膜貫通領域を持つ膜タンパク質である。この遺伝子の欠損は一般に致死性であり、生存に必須の役割を担っていると考えられる。本発明の一態様において、本発明の酵母はGPI10に変異を有するが、生存に必須な機能を残しつつ、マンナンタンパク質を細胞壁中にとどまらせることができない酵母である。したがって、本発明の酵母は、α1,2-マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、例えば、GPI10を標的とした部位特異的、またはランダム変異導入法によっても得ることが出来る。そのような分子生物学的手法も当業者にはよく知られている。本発明の特に好ましい一態様において、本発明の酵母は、GPI10遺伝子内に、配列番号18記載のアミノ酸配列中の498番のプロリン残基がロイシン残基へ置換されるような変異を有する酵母である。 The yeast of the present invention is mutated to a gene encoding an α1,2-mannosyltransferase involved in biosynthesis of a synthetic enzyme such as a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor at a site necessary for allowing a mannan protein to remain in the cell wall, such as GPI10. It is preferable that the strain has a mannose and can no longer allow the mannan protein to remain on the cell wall. GPI protein (Gpi10p) encoded by GPI10 is a membrane protein consisting of 616 amino acids and having a plurality of transmembrane regions. This gene deficiency is generally lethal and is thought to play an essential role in survival. In one embodiment of the present invention, the yeast of the present invention is a yeast that has a mutation in GPI10 but cannot retain the mannan protein in the cell wall while remaining essential for survival. Therefore, the yeast of the present invention can also be obtained by a site-specific or random mutagenesis method targeting a gene encoding α1,2-mannosyltransferase, for example, GPI10. Such molecular biology techniques are also well known to those skilled in the art. In a particularly preferred embodiment of the present invention, the yeast of the present invention is a yeast having a mutation such that the 498th proline residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 is substituted with a leucine residue in the GPI10 gene. is there.
また、本発明の別の一態様において、本発明の酵母は配列番号17記載の配列のヌクレオチド番号234〜2081の配列（この領域によってGpi10pがコードされる）を有する核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る核酸によってコードされるα1,2-マンノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質内およびそのタンパク質をコードする遺伝子内に変異を有する酵母である。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが実質的に形成されない条件を言う。例えば、ストリンジェントな条件とは高い相同性を有するDNA、例えば70％以上、好ましくは80％以上の相同性を有するDNA同士が優先的にハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士が有意にはハイブリダイズしない条件、あるいは50℃、２ｘSSC、0.1％ SDS、好ましくは１ｘSSC、0.1％ SDS、より好ましくは0.1ｘSSC、0.1％ SDSに相当する温度および塩濃度でハイブリダイズする条件である。これらと同等な条件も当業者には容易に理解できるであろう（例えば、Sambrookら、 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)参照。）。
また、アミノ酸配列については、配列番号１８記載のアミノ酸配列と40％以上の相同性を示す配列を有するポリペプチドも本発明においてはα1,2-マンノシルトランスフェラーゼ候補として考慮することができ、このポリペプチドをコードする遺伝子をα1,2-マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子として考えることができる。核酸またはアミノ酸の相同性は、NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankOverview.html）やDDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html）にて利用可能なBLASTNまたはBLASTP、FASTA等を利用することによって計算することが出来る。In another embodiment of the present invention, the yeast of the present invention hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid having the sequence of nucleotide numbers 234 to 2081 of the sequence shown in SEQ ID NO: 17 (Gpi10p is encoded by this region). A yeast having mutations in a protein having α1,2-mannosyltransferase activity encoded by a nucleic acid capable of soybean and in a gene encoding the protein. Here, stringent conditions refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not substantially formed. For example, DNA having high homology with stringent conditions, for example, DNA having homology of 70% or more, preferably 80% or more preferentially hybridizes, and DNA having lower homology is significant. For hybridization at 50 ° C., 2 × SSC, 0.1% SDS, preferably 1 × SSC, 0.1% SDS, more preferably 0.1 × SSC, 0.1% SDS. Conditions equivalent to these will be readily apparent to those skilled in the art (eg, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)).
As for the amino acid sequence, a polypeptide having a sequence having 40% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 can also be considered as a candidate for α1,2-mannosyltransferase in the present invention. Can be considered as a gene encoding α1,2-mannosyltransferase. Nucleic acid or amino acid homology can be determined by NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankOverview.html) or DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j .html) can be calculated using BLASTN, BLASTP, FASTA, etc.
例えばSaccharomyces cerevisiaeのみならず、Saccharomyces paradoxus、Saccharomyces mikatae、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces kudriavzevii、Kluyveromyces lactis、にも上述したプログラムを用いて高いホモロジーを有する遺伝子が見出されている。さらにNeurospora crassa:ncu00193.1, Schizosaccharomyces pombe_972h:SPCC16A11.06c、Candida albicans:ca4431がGpi10pに相同性を有するタンパク質として挙げられている。またSaccharomyces cerevisiaeにおいてもGpi10pと相同性を有するタンパク質として例えばSMP3、ALG9が見出されている。
例えば、Saccharomyces paradoxus gb:AABY01000142.1では88％、Saccharomyces mikatae gb:AABZ01000054.1では86％、Saccharomyces bayanus gb:AACG01000485.1では85％、Saccharomyces kudriavzevii gb:AACI01000185.1では84％、Kluyveromyces lactis gi:49643748では68％、Neurospora crassa ref-NW_04710.1では50％、Schizosaccharomyces pombe ref-NC_003421.1では41％、Candida albicans gb:AACQ01000012.1では49％のホモロジーを配列番号１８記載のアミノ酸配列に対して有している。またSMP3、ALG9の配列番号１８記載のアミノ酸配列に対するホモロジーはそれぞれ40％、43％である。For example, not only Saccharomyces cerevisiae but also Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces mikatae, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces kudriavzevii, and Kluyveromyces lactis, genes having high homology have been found. Further, Neurospora crassa: ncu00193.1, Schizosaccharomyces pombe_972h: SPCC16A11.06c, Candida albicans: ca4431 are mentioned as proteins having homology to Gpi10p. In Saccharomyces cerevisiae, for example, SMP3 and ALG9 have been found as proteins having homology with Gpi10p.
For example, 88% for Saccharomyces paradoxus gb: AABY01000142.1, 86% for Saccharomyces mikatae gb: AABZ01000054.1, 85% for Saccharomyces bayanus gb: AACG01000485.1, 84% for Saccharomyces kudriavzevii gb: AACI01000185.1, lactose: Kluisvery The homology of 68% for 49643748, 50% for Neurospora crassa ref-NW_04710.1, 41% for Schizosaccharomyces pombe ref-NC_003421.1, and 49% for Candida albicans gb: AACQ01000012.1 Have. Moreover, the homology with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 of SMP3 and ALG9 is 40% and 43%, respectively.
本配列番号１７記載の配列のヌクレオチド番号234〜2081の配列（この領域によってGpi10pがコードされる）を有する核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、および、配列番号１８記載の配列と40％以上の配列相同性を示すタンパク質がα1,2-マンノシルトランスフェラーゼ活性を有していることは、一般に入手可能なα1,2-マンノシルトランスフェラーゼ欠損酵母株（例えば、Euroscarf Y24509）にその核酸を適切なプロモーターおよびその他の発現に必要な配列と共に導入して、欠損株のα1,2-マンノシルトランスフェラーゼが相補されること（特に致死性の相補）により確認することが出来る。
なお、本明細書においては、α1,2-マンノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を総称してα1,2-マンノシルトランスフェラーゼともいう。A protein encoded by a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid having the sequence of nucleotide numbers 234 to 2081 of the sequence described in SEQ ID NO: 17 (which encodes Gpi10p by this region); and SEQ ID NO: 18 A protein having a sequence homology of 40% or more with the above sequence has α1,2-mannosyltransferase activity in a generally available α1,2-mannosyltransferase-deficient yeast strain (eg, Euroscarf Y24509). It can be confirmed by introducing a nucleic acid together with an appropriate promoter and other sequences necessary for expression and complementing the α1,2-mannosyltransferase of the defective strain (particularly lethal complementation).
In the present specification, proteins having α1,2-mannosyltransferase activity are also collectively referred to as α1,2-mannosyltransferase.
また、本発明の別の好ましい一態様において、本発明の酵母は、配列番号17記載の配列のヌクレオチド番号234〜2081の配列（この領域によってGpi10pがコードされる）を有する核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る核酸のヌクレオチド配列を有するα1,2-マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子内に、配列番号18記載の配列の498番プロリン残基に相当するプロリン残基がロイシン残基に置換される変異を有する酵母である。配列番号18記載の配列の498番プロリン残基に相当するプロリン残基は、アミノ酸配列のアラインメントを行うことによって明らかにすることができる。 Further, in another preferred embodiment of the present invention, the yeast of the present invention comprises a nucleic acid having a sequence of nucleotide numbers 234 to 2081 of the sequence shown in SEQ ID NO: 17 (Gpi10p is encoded by this region) and stringent conditions The α1,2-mannosyltransferase gene having a nucleotide sequence of a nucleic acid capable of hybridizing with a leucine residue is substituted with a proline residue corresponding to the 498th proline residue of the sequence shown in SEQ ID NO: 18 Yeast. The proline residue corresponding to the 498th proline residue in the sequence shown in SEQ ID NO: 18 can be clarified by aligning amino acid sequences.
このような候補酵母株のマンナン放出性に関しては、候補株を適切な培地、例えば、合成培地（Difco社 Yeast Nitrogen Base w/o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%, アミノ酸0.13%）で約30℃にて例えば２〜４日培養し、上清を必要に応じて約２〜３倍量のエタノールを加えて沈殿させ（エタノール沈殿法）、SDS-PAGE（SDS-ポリアクリルアミド電気泳動）にかけ、PAS染色等により分析することが出来る。培地および培養温度は酵母の増殖を阻害しない、好ましくは酵母の増殖に適していればよい。次に、親株である野生型株よりも多くマンナンタンパク質を培地中に放出していることが確認できた株を本発明の酵母として選択し、利用することが出来る。 Regarding the mannan-releasing properties of such candidate yeast strains, the candidate strains can be used in an appropriate medium, for example, a synthetic medium (Difco Yeast Nitrogen Base w / o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%, amino acid 0.13%). For example, incubate at about 30 ° C for 2-4 days, and add about 2-3 times the amount of ethanol as needed to precipitate (ethanol precipitation method), SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide electrophoresis) And can be analyzed by PAS staining or the like. The culture medium and culture temperature do not inhibit yeast growth, and preferably are suitable for yeast growth. Next, a strain that has been confirmed to release more mannan protein into the medium than the wild-type strain that is the parent strain can be selected and used as the yeast of the present invention.
また、本発明の酵母を戻し交配する、または変異酵母株又は野生型酵母株と接合させること等により、更に他の性質を付加、除去することが出来る。例えば、本発明の酵母株の一つを接合の親に用いることにより、マンナンタンパク質の放出量、生育速度および栄養要求性が改善された、あるいは、更に他の特性が付与または改善された、または二倍体の、マンナンタンパク質放出酵母を作製することができる。酵母の掛け合わせの方法および条件は当業者にはよく知られたものである（Ausubelら、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)）。 Further, other properties can be added or removed by backcrossing the yeast of the present invention, or by mating with a mutant yeast strain or a wild type yeast strain. For example, by using one of the yeast strains of the present invention as a mating parent, mannan protein release, growth rate and auxotrophy have been improved, or other properties have been imparted or improved, or A diploid, mannan protein-releasing yeast can be made. Yeast crossing methods and conditions are well known to those skilled in the art (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)).
実際に本発明者らはMTY9を出発材料として、マンナンタンパク質、特にα-マンナンタンパク質を放出する種々の派生株を作製している（図４）。
本発明の、および、本発明で使用し得る、マンナンタンパク質、特にα-マンナンを含むマンナンタンパク質を放出する酵母の典型的な例として、以下の受託番号で特定される酵母が挙げられる：
S.cerevisiae MTY9
[MATa gpi10 ura3 trp1]
受託番号FERM BP-10391、および、
S.cerevisiae AB9 （ホモ二倍体株）
[MATa/a gpi10/gpi10 ura3/URA3 leu2/LEU2]
受託番号FERM BP-10390
AB9株はマンナンタンパク質、特にα-マンナンを含むマンナンタンパク質の放出量も多く、生育も良好であり、栄養要求性もないので、特に好ましい。MTY9、AB9はいずれもマンナンタンパク質、特にα-マンナンを含むマンナンタンパク質を放出する酵母を作製するための出発材料として使用することが出来る。In fact, the present inventors have produced various derivatives using MTY9 as a starting material and releasing mannan proteins, particularly α-mannan proteins (FIG. 4).
Typical examples of yeasts that release mannan proteins of the present invention and that may be used in the present invention, particularly mannan proteins including α-mannan, include yeasts identified by the following accession numbers:
S.cerevisiae MTY9
[MATa gpi10 ura3 trp1]
Accession number FERM BP-10391, and
S. cerevisiae AB9 (Homodiploid strain)
[MATa / a gpi10 / gpi10 ura3 / URA3 leu2 / LEU2]
Accession number FERM BP-10390
The AB9 strain is particularly preferable because it releases a large amount of mannan protein, particularly mannan protein containing α-mannan, has good growth, and has no auxotrophy. Both MTY9 and AB9 can be used as starting materials for producing yeast that releases mannan proteins, particularly mannan proteins including α-mannan.
得られた酵母を液体培地、例えば合成培地（Difco社 Yeast Nitrogen Base w/o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%, アミノ酸0.13%）で約30℃にて、好ましくは24時間以上、より好ましくは24時間〜96時間、更に好ましくは24時間〜72時間、好気条件にて生育させ、遠心分離および／又はフィルターろ過により酵母細胞を取り除いた培養上清を回収し、限外ろ過膜でろ過した残液又はエタノール／水溶液、例えば2:1（エタノール濃度66.7%(v/v)）の沈殿物としてマンナンタンパク質を回収することができる。限外ろ過は、分子量約１万、好ましくは約５万を閾値として行うのが好ましい。培地および培養温度は酵母の増殖を阻害しなければよく、好ましくは酵母の増殖に適していればよい。 The obtained yeast is placed in a liquid medium, for example, a synthetic medium (Difco Yeast Nitrogen Base w / o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%, amino acid 0.13%) at about 30 ° C., preferably 24 hours or more. The culture supernatant is preferably grown for 24 hours to 96 hours, more preferably 24 hours to 72 hours under aerobic conditions, and the yeast cells are removed by centrifugation and / or filter filtration. Mannan protein can be recovered as a filtered residue or ethanol / water solution, eg, 2: 1 (ethanol concentration 66.7% (v / v)) precipitate. The ultrafiltration is preferably performed with a molecular weight of about 10,000, preferably about 50,000 as a threshold value. The medium and the culture temperature need not inhibit the growth of the yeast, and preferably are suitable for the growth of the yeast.
限外ろ過により回収したマンナンタンパク質は、適当量の水を加え希釈した後に乾燥工程を行っても良い。エタノール沈殿回収物について水で溶解した後、乾燥工程、たとえば凍結乾燥等を行っても良い。エタノール沈殿法で得られた乾燥マンナンタンパク質は白色の水溶性が高い粉末であり、約10％程度のタンパク質を含む。本発明の酵母、および本発明の方法に依れば、培養条件に依存して典型的な合成培地を使用した場合24時間〜72時間の培養で培地中にマンノース換算で少なくとも150mg/l〜900mg/l、好ましくは200mg/l〜880mg/lのマンナンタンパク質を得ることができる。より具体的には培養条件に依存して、マンノース換算で、24時間の培養により少なくとも150mg/l〜300mg/l、72時間の培養により少なくとも150mg/l〜900mg/l、好ましくは200mg/l〜880mg/lのマンナンタンパク質を得ることができる。
本発明の酵母は、その性質上増殖に伴って、すなわち、細胞壁合成が進むに従って、培地中にマンナンタンパク質を放出するため、培養条件を検討することにより更に培養上清中のマンナンタンパク質の濃度および総量を増加させることも可能である。The mannan protein recovered by ultrafiltration may be subjected to a drying step after dilution by adding an appropriate amount of water. After the ethanol precipitate recovery product is dissolved in water, a drying step such as freeze-drying may be performed. The dried mannan protein obtained by the ethanol precipitation method is a white, highly water-soluble powder and contains about 10% protein. According to the yeast of the present invention and the method of the present invention, when a typical synthetic medium is used depending on the culture conditions, at least 150 mg / l to 900 mg in terms of mannose in the medium after 24 hours to 72 hours of culture. Mannan protein of / l, preferably 200 mg / l to 880 mg / l can be obtained. More specifically, depending on the culture conditions, in terms of mannose, at least 150 mg / l to 300 mg / l by 24 hours of culture, at least 150 mg / l to 900 mg / l, preferably 200 mg / l to 72 hours of culture. 880 mg / l of mannan protein can be obtained.
Since the yeast of the present invention releases mannan protein into the medium as it grows, that is, as cell wall synthesis proceeds, by examining the culture conditions, the concentration of mannan protein in the culture supernatant and It is also possible to increase the total amount.
このような方法により得られたマンナンタンパク質は化学的および／又は物理的処理が一切加えられていない、細胞壁に天然に存在するマンナンタンパク質に近い状態にあり、食品や飲料といった食品産業への利用が可能である。
更に、本発明により、または、本発明の酵母が放出するマンナンタンパク質、特にα-マンナンを含むマンナンタンパク質からタンパク質部分を除去することにより、天然状態に近い単離マンナンを得ることが出来る。あるいは、種々の構造を有するマンナンタンパク質からタンパク質部分を除去することにより、更に有用な単離マンナンを得ることもできる。
マンナンタンパク質からのタンパク質部分の除去は当業者に知られたどのような方法でも良いが、マンナン部分の構造を著しく改変しない方法を用いるのが特に好ましい。マンナンタンパク質からのタンパク質部分の除去は、例えば糖鎖切り出し酵素、例えばエンドグリコシダーゼによる部分分解、酸処理、またはアルカリ処理によって行うことが出来る。The mannan protein obtained by such a method is not subjected to any chemical and / or physical treatment and is in a state close to that of a mannan protein that is naturally present in the cell wall, and can be used in the food industry such as food and beverages. Is possible.
Furthermore, an isolated mannan close to the natural state can be obtained by removing the protein portion from the mannan protein released by the yeast of the present invention, particularly the mannan protein containing α-mannan, according to the present invention. Alternatively, a more useful isolated mannan can be obtained by removing a protein portion from a mannan protein having various structures.
Any method known to those skilled in the art may be used to remove the protein portion from the mannan protein, but it is particularly preferable to use a method that does not significantly alter the structure of the mannan portion. The removal of the protein portion from the mannan protein can be performed, for example, by partial degradation with a sugar chain cleaving enzyme such as endoglycosidase, acid treatment, or alkali treatment.
（実施例）
実施例１．マンナンタンパク質を放出する酵母の作製
１）変異誘発
野生型酵母株YNN27をYPD培地にて培養し、集菌した後4mlの2％グルコースを含む0.2Mリン酸バッファー（pH8.0）に懸濁し、3%となるようにエチルメタンスルホネート（EMS）に懸濁した。30℃で70分間振とうし、変異処理した。変異処理後6%チオ硫酸ナトリウム溶液にてEMSを中和し、菌体をYPD培地に塗布した。生育してきた酵母129株を候補株とした。(Example)
Example 1. Production of yeast that releases mannan protein 1) Mutagenesis Wild type yeast strain YNN27 is cultured in YPD medium, collected, and then suspended in 0.2 M phosphate buffer (pH 8.0) containing 4 ml of 2% glucose. It was suspended in ethyl methanesulfonate (EMS) so as to be 3%. It was shaken at 30 ° C. for 70 minutes for mutation treatment. After the mutation treatment, EMS was neutralized with a 6% sodium thiosulfate solution, and the cells were applied to a YPD medium. The 129 yeast strains that had grown were used as candidate strains.
２）スクリーニング
候補酵母株を単離後、それぞれを10 mlの合成培地（Difco社 Yeast Nitrogen Base w/o Amino acid 0.67%, Glucose 2%, アミノ酸0.13%）中で、３晩30℃で振とう培養した。培養液は6000rpm 5分間遠心分離した後、培養上清を0.45 μmのディスクフィルターによるろ過で完全に酵母を除去した。ろ過済みの培養上清に20mlのエタノールを加え、-30℃で一晩放置した。翌日7000rpm 15分間遠心分離を行い、上澄み液を捨てた。沈殿は一度66.7％エタノールにて洗浄した後、100μlの水に懸濁した。これを培養液由来エタノール沈殿試料（以下、「試料Ａ」と記載する。）とした。
得られた各試料を、それぞれ等量の２x SDS-PAGEサンプルバッファー（15%グリセロール, 0.125 mM Tris/Cl pH6.8, 5 mM Na2EDTA, ２% SDS, 0.1% BPB, １% 2-メルカプトエタノール）と混合し、100℃湯浴中にて３分間煮沸した後試験に使用した。2) Screening After isolation of candidate yeast strains, shake each in 10 ml synthetic medium (Difco Yeast Nitrogen Base w / o Amino acid 0.67%, Glucose 2%, amino acid 0.13%) for 3 nights at 30 ° C. Cultured. The culture solution was centrifuged at 6000 rpm for 5 minutes, and then the yeast was completely removed by filtering the culture supernatant through a 0.45 μm disk filter. 20 ml of ethanol was added to the filtered culture supernatant and left overnight at -30 ° C. The next day, centrifugation was performed at 7000 rpm for 15 minutes, and the supernatant was discarded. The precipitate was washed once with 66.7% ethanol and then suspended in 100 μl of water. This was used as a culture solution-derived ethanol precipitation sample (hereinafter referred to as “sample A”).
Each sample obtained was aliquoted with 2x SDS-PAGE sample buffer (15% glycerol, 0.125 mM Tris / Cl pH 6.8, 5 mM Na 2 EDTA, 2% SDS, 0.1% BPB, 1% 2-mercapto Ethanol) and boiled in a 100 ° C. water bath for 3 minutes and then used for the test.
得られたサンプルは、SIGMA社Glycoprotein Detection Kit(Cat# GLYCO-PRO)添付のプロトコールに従って分析した。
サンプルバッファーと混合済みの試料Ａ 10μlをTEFCO社プレキャストSDS-PAGEゲル4-12％グラジエントゲル(Cat.No.01 032)によりゲル１枚あたり18 mAで約２時間電気泳動を行った。電気泳動終了後、アクリルアミドゲルをアッセンブリからはずし、50%メタノール中で１時間振とうし固定を行った。メタノール水を捨て、新たに水を加え、20分間振とうした。この操作を再度繰り返した後、酸化液に置換し、１時間振とうした。再び水で２回各20分間振とうし洗浄した後、発色液に置換し、１時間振盪し、発色を行った。結果は目視により判定した。The obtained samples were analyzed according to the protocol attached to SIGMA Glycoprotein Detection Kit (Cat # GLYCO-PRO).
10 μl of sample A mixed with the sample buffer was electrophoresed at 18 mA per gel for about 2 hours using a TEFCO precast SDS-PAGE gel 4-12% gradient gel (Cat. No. 01 032). After completion of electrophoresis, the acrylamide gel was removed from the assembly, and fixed by shaking in 50% methanol for 1 hour. The methanol water was discarded, fresh water was added and shaken for 20 minutes. After repeating this operation again, it was replaced with an oxidizing solution and shaken for 1 hour. After washing again with water twice for 20 minutes each time, the solution was replaced with a color developing solution and shaken for 1 hour for color development. The result was judged visually.
その結果、試験した129種の酵母株のうち、明らかにマンナンタンパク質を放出する株が３株得られた。また、野生型株でも僅かにマンナンタンパク質が培地中に放出されることが観察された。得られたマンナンタンパク質放出酵母株のうちの１株、MTY9株を用いて更に種々の派生株を作製した。 As a result, among the 129 yeast strains tested, 3 strains that clearly release mannan protein were obtained. It was also observed that mannan protein was slightly released into the medium even in the wild type strain. Various derived strains were further prepared using one of the obtained mannan protein-releasing yeast strains, MTY9 strain.
３）マンナンの定量
マンナンタンパク質中のマンナンの定量は以下のようにDIONEXイオンクロマトグラフィーによって行った。
２）に記載した培養液由来エタノール沈殿試料（試料A）を調製した。また、培養物をろ過して得られた培養上清（試料B）についても分析を行った。
試料A 50-60 μlに対し、２mlの２Nトリフルオロ酢酸（Riedel-de-Haen 61030）を加え、凍結、減圧させた後、加水分解管で100℃ 16時間分解を行った。試料B 2mlに対し12N TFAを400μl加え、凍結、減圧させた後、加水分解管で100℃ 16時間分解を行った。
分解終了後室温まで冷却し、15mlディスポーザブル遠心管に移し、遠心エバポレーターで乾燥させた。乾燥後5mlの水に溶解し、Waters社Sep-pakプラスC18（WAT020515: 5 mlのメタノール及び5mlの水で平衡化したもの）及び0.45mmのサンプルフィルターを通し、イオンクロマトグラフィー用試料とした。3) Quantification of mannan The quantification of mannan in mannan protein was performed by DIONEX ion chromatography as follows.
The culture solution-derived ethanol precipitation sample (sample A) described in 2) was prepared. In addition, the culture supernatant (sample B) obtained by filtering the culture was also analyzed.
2 ml of 2N trifluoroacetic acid (Riedel-de-Haen 61030) was added to 50-60 μl of sample A, frozen and decompressed, and then digested in a hydrolysis tube at 100 ° C. for 16 hours. 400 μl of 12N TFA was added to 2 ml of sample B, frozen and decompressed, and then digested in a hydrolysis tube at 100 ° C. for 16 hours.
After completion of the decomposition, the mixture was cooled to room temperature, transferred to a 15 ml disposable centrifuge tube, and dried with a centrifugal evaporator. After drying, the sample was dissolved in 5 ml of water, passed through a Waters Sep-pak plus C18 (WAT020515: equilibrated with 5 ml of methanol and 5 ml of water) and a 0.45 mm sample filter to obtain a sample for ion chromatography.
グルコース及びマンノース各20，40，60ppmの単糖標準液を定量用の標準として用い、この検量線に入らなかった場合は適宜希釈して分析を行った。
装置はダイオネクス社のイオンクロマトグラフィー装置GP-50を用い、検出器にはアンペロメトリー検出器ED-40を使用した。移動相はＡ液をMilliQ水、Ｄ液を200 mM水酸化ナトリウム溶液とし、Ａ：Ｄを分析開始から30分まで95:5とし、30分から45分まで0:100、45分から70分までを95:5とした。標準液を用いた検量線より定量値を求め、各試料中の含量を算出した。A monosaccharide standard solution of glucose, mannose 20, 40, and 60 ppm was used as a standard for quantification, and when this standard curve was not entered, analysis was performed by appropriately diluting.
The instrument used was an ion chromatography instrument GP-50 manufactured by Dionex, and the amperometric detector ED-40 was used as the detector. The mobile phase is MilliQ water for solution A, 200 mM sodium hydroxide solution, and A: D is 95: 5 from the start of analysis to 95: 5, 0: 100 from 30 to 45 minutes, and from 45 to 70 minutes. 95: 5. A quantitative value was obtained from a calibration curve using a standard solution, and the content in each sample was calculated.
グルコース及びマンノースのピークはそれぞれ18分、20分に出現し、この濃度範囲での直線性は相関係数0.999程度と概ね良好であった。
マンナンタンパク質放出酵母株MTY9由来の試料Aを分析したところ、主な構成単糖はマンノースであり、マンノース対グルコースは90:10程度であった。同様にこの株の試料Bを分析したところ、マンノース対グルコースは35:65程度であった。
培地中のマンノース濃度は13.4mg/lであり、これは野生株の培養上清中の濃度の約４倍であった。Glucose and mannose peaks appeared at 18 minutes and 20 minutes, respectively, and the linearity in this concentration range was generally good with a correlation coefficient of about 0.999.
When the sample A derived from the mannan protein-releasing yeast strain MTY9 was analyzed, the main constituent monosaccharide was mannose, and the ratio of mannose to glucose was about 90:10. Similarly, when the sample B of this strain was analyzed, mannose vs. glucose was about 35:65.
The mannose concentration in the medium was 13.4 mg / l, which was about 4 times the concentration in the culture supernatant of the wild strain.
４）種々の派生株の作製
変異原処理により直接得られたMTY9と野生型株AH22と掛け合わせることで、マンナンタンパク質放出性の改善、および、マンナンタンパク質放出に関係する変異以外の変異を外すことを試みた。定法に従い掛け合わせた２倍体株を減数分裂させ、顕微鏡下でミクロマニピュレーターにより子嚢胞子を分離し、それぞれの子嚢胞子に由来する酵母株のマンナンタンパク質放出性を調べた。
こうして得られたMT26-14Cを元に、YNN27あるいはAH22を掛け合わせ、最終的にMT39-6A及びMT41-10Dを得た。これらの株は1倍体であり、栄養要求性を持っていたが、生育、マンナンタンパク質放出は良好であった。さらにこれらを掛け合わせることで、栄養要求性のない２倍体株AB9株を作製した。AB9株は栄養要求性がなく、生育も良好でマンナンタンパク質を安定的に放出することの出来る工業用に特に適した株である。
これらの酵母株の由来を図４に模式的に示した。これらの酵母株のうち、MTY9およびホモ二倍体株であるAB9は、独立行政法人産業技術研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1-1-1 中央第6、郵便番号 305-8566）に寄託されており、それぞれ受託番号は次のとおりである：4) Preparation of various derivative strains MTY9 obtained directly by mutagen treatment and wild-type strain AH22 are crossed to improve mannan protein release and eliminate mutations other than those related to mannan protein release. Tried. The diploid strains crossed according to a conventional method were meiotically divided, and ascospores were separated with a micromanipulator under a microscope, and the mannan protein releasing ability of the yeast strains derived from each ascospore was examined.
Based on MT26-14C obtained in this way, YNN27 or AH22 was multiplied to finally obtain MT39-6A and MT41-10D. These strains were haploid and auxotrophic but had good growth and mannan protein release. Furthermore, by multiplying these, a diploid strain AB9 without auxotrophy was produced. The AB9 strain is particularly suitable for industrial use because it has no auxotrophy, grows well, and can stably release mannan protein.
The origin of these yeast strains is schematically shown in FIG. Among these yeast strains, MTY9 and AB9, which is a homodiploid strain, are the patent biological deposit center of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-1-1, Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japan, postal code 305- 8566) and the deposit numbers are as follows:
AB9は2004年７月13日付けで独立行政法人産業技術研究所 特許生物寄託センターに原寄託され、受託番号FERM P-20116が付与されており、2005年８月３日付けで国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-10390が付与された。MTY9は、2004年７月13日付けで独立行政法人産業技術研究所 特許生物寄託センターに原寄託され、受託番号FERM P-20117が付与されており、2005年８月３日付けで国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-10391が付与された。 AB9 was originally deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on July 13, 2004, and was assigned the deposit number FERM P-20116. It was transferred to the international deposit on August 3, 2005. And was given accession number FERM BP-10390. MTY9 was originally deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on July 13, 2004, and was assigned the deposit number FERM P-20117. It was made an international deposit on August 3, 2005. Transferred and given accession number FERM BP-10391.
実施例２．変異遺伝子および変異部位の特定
１）変異遺伝子の特定
マンナン放出酵母MTY9にYCp50由来酵母染色体ライブラリーATCC37415を導入し、マンナン放出性を失った株をスクリーニングした。酵母染色体ライブラリーの酵母細胞への導入は定法（Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)）に従って行った。
酵母染色体断片を含むプラスミド依存的にマンナン放出性を失った株から、Q-BIOgene社RPM Yeast Plasmid Isolation Kit(2069-400)を用いてプラスミドを回収し、挿入断片を含む領域のDNA配列を決定した。ヌクレオチド配列の解析はApplied Biosystems社のPrism3100Avantを用い、同社のBig Dye Terminator Kit ver.3.0（4390242）を用いて行った。
用いたプライマーの配列はCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCT（フォワードプライマー）（配列番号１）および、GTCGGCGATATAGGCGCCAGC（リバースプライマー）（配列番号２）である。ヌクレオチド配列についてサッカロミセス・ゲノムデータベース（Saccharomyces Genome Database） (http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/)のBlastnプログラムを用いて相同性検索を行った結果、７番染色体のDNA断片であることが明らかになった。図１にプラスミド依存的にマンナン放出性を失った株から回収されたプラスミドYCp50-Chr.VIIの構造を示した。 Example 2 Identification of mutant gene and mutation site 1) Identification of mutant gene The YCp50-derived yeast chromosome library ATCC37415 was introduced into the mannan-releasing yeast MTY9, and a strain that lost the mannan-releasing ability was screened. The yeast chromosome library was introduced into yeast cells according to a conventional method (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)).
From a strain that has lost its mannan-releasing property in a plasmid-dependent manner, including yeast chromosome fragments, use the Q-BIOgene RPM Yeast Plasmid Isolation Kit (2069-400) to recover the plasmid and determine the DNA sequence of the region containing the inserted fragment. did. Nucleotide sequence analysis was performed using Applied Biosystems' Prism 3100Avant and its Big Dye Terminator Kit ver.3.0 (4390242).
The sequences of the primers used were CCCAGTCCTGCTCGCTTCGCT (forward primer) (SEQ ID NO: 1) and GTCGGCGATATAGGCGCCAGC (reverse primer) (SEQ ID NO: 2). As a result of homology search using the Blastn program of the Saccharomyces Genome Database (http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/) for nucleotide sequences, it is a DNA fragment of chromosome 7. It became clear. FIG. 1 shows the structure of plasmid YCp50-Chr.VII recovered from a strain that has lost its mannan-releasing property in a plasmid-dependent manner.
この断片に含まれるタンパク質コード領域（ORF）はYGL141とYGL142の二つのみであった。制限酵素を用いてこの領域の断片を作製し、どちらのORFが変異を相補するか確認したところ、相補性を示すORFはYGL142すなわちGPI10遺伝子であることが明らかになった（図２）。
GPI10はGPIアンカーの生合成に関与しており、MTY9株およびその派生株においてマンナンタンパク質はGPIアンカーが十分に生合成されないために細胞壁にとどまることができず、培地中に放出されていくものと考えられた。The protein coding region (ORF) contained in this fragment was only two, YGL141 and YGL142. A fragment of this region was prepared using restriction enzymes, and it was confirmed which ORF complemented the mutation. As a result, it was revealed that the ORF showing complementarity was YGL142, that is, GPI10 gene (FIG. 2).
GPI10 is involved in the biosynthesis of GPI anchor, and in MTY9 strain and its derivatives, mannan protein cannot be retained in the cell wall because GPI anchor is not sufficiently biosynthesized and released into the medium. it was thought.
２）変異部位の特定
マンナンタンパク質放出株MT37-2B(MTY9を戻し交配して作製した株)と野生型株からそれぞれGPI10遺伝子を回収し、変異個所の特定を行った。
遺伝子の回収はApplied Biosystems社のAmpliTaq Goldを用いたPCRで行った。第一回目のPCR反応では変異誘発した酵母株、野生型株の染色体DNAを鋳型とし、F1及びR1のプライマーセットでGPI10 ORFの上流1000ベース及び下流300ベースを含む断片（3141bp）を増幅し、500 bp間隔で設定したF1,F2,F3,F4,F5,F6,F7,R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7を用いて全長のヌクレオチド配列を決定した。
各プライマーの配列は下記のとおり：2) Identification of mutation site The GPI10 gene was recovered from the mannan protein releasing strain MT37-2B (strain produced by backcrossing MTY9) and the wild type strain, and the mutation site was identified.
Genes were collected by PCR using Applied Biosystems AmpliTaq Gold. In the first PCR reaction, mutagenized yeast strain, wild-type chromosomal DNA as a template, F1 and R1 primer set to amplify a fragment (3141bp) containing GPI10 ORF upstream 1000 base and downstream 300 base, The full-length nucleotide sequence was determined using F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 set at 500 bp intervals.
The sequence of each primer is as follows:
F1: GGAGCAATATGATTGTTGAAGTTTGG （配列番号３）
F2: AATAGATTAATTTGCCCC （配列番号４）
F3: ATGGCTCACGAGGTTCAT （配列番号５）
F4: ACTTGATAAGAGAAACGA （配列番号６）
F5: TTTCTTTCAAAGCTTACC （配列番号７）
F6: CATTTACTTGGAGACCCA （配列番号８）
F7: TCTGTACTAGGCTGAGTA （配列番号９）
R1: TTGTTCTGCTCTACGAACTTTTCA （配列番号10）
R2: GGCTGTATGTTTTACCTG （配列番号11）
R3: ACAGATTCAACAAGATAG （配列番号12）
R4: TCAAAAGAGTTGATGAAC （配列番号13）
R5: CAATGTGCCGGCTCCAAT （配列番号14）
R6: AGATAAGCTCAAAGAAGA （配列番号15）
R7: TACTTGCCGAAAGAAACC （配列番号16）F1: GGAGCAATATGATTGTTGAAGTTTGG (SEQ ID NO: 3)
F2: AATAGATTAATTTGCCCC (SEQ ID NO: 4)
F3: ATGGCTCACGAGGTTCAT (SEQ ID NO: 5)
F4: ACTTGATAAGAGAAACGA (SEQ ID NO: 6)
F5: TTTCTTTCAAAGCTTACC (SEQ ID NO: 7)
F6: CATTTACTTGGAGACCCA (SEQ ID NO: 8)
F7: TCTGTACTAGGCTGAGTA (SEQ ID NO: 9)
R1: TTGTTCTGCTCTACGAACTTTTCA (SEQ ID NO: 10)
R2: GGCTGTATGTTTTACCTG (SEQ ID NO: 11)
R3: ACAGATTCAACAAGATAG (SEQ ID NO: 12)
R4: TCAAAAGAGTTGATGAAC (SEQ ID NO: 13)
R5: CAATGTGCCGGCTCCAAT (SEQ ID NO: 14)
R6: AGATAAGCTCAAAGAAGA (SEQ ID NO: 15)
R7: TACTTGCCGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 16)
親株のYNN27はデータベース上のGPI10遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号17のヌクレオチド番号234〜2081の配列（この領域によってGpi10pがコードされる））と100%一致し、変異誘発した酵母株でのみ違うヌクレオチド配列は2箇所見つかった。一箇所はORF上流78ベースにある1塩基置換で、もう一箇所はORF中の変異であった。
そこで、これらのうちどちらの変異がマンナンタンパク質放出に関与するのかを確認するため、回収した遺伝子をサブクローニングし、プラスミドシャフリングを行った。遺伝子の回収はTOYOBOのKOD+を用い、添付のプロトコールどおり反応を行った。ヌクレオチド配列を確認し、他の変異が入っていないことを確認し、サブクローニングによりシャフリング用のプラスミドを作製した。The parent strain YNN27 is 100% identical to the nucleotide sequence of the GPI10 gene in the database (SEQ ID NO: 17 from nucleotide numbers 234 to 2081 (this region encodes Gpi10p)) and differs only in the mutagenized yeast strain. Two sequences were found. One was a single base substitution in the ORF upstream 78 base, and the other was a mutation in the ORF.
Therefore, in order to confirm which of these mutations is involved in mannan protein release, the recovered gene was subcloned and subjected to plasmid shuffling. Gene recovery was performed using TOYOBO's KOD + according to the attached protocol. The nucleotide sequence was confirmed, it was confirmed that no other mutation was introduced, and a shuffling plasmid was prepared by subcloning.
これらプラスミドを定法に従い本発明の酵母株（MT37-2B）に再導入し、PAS染色でマンナンタンパク質放出性を検討した。結果ORF上流にのみ変異を持つプラスミドではマンナンタンパク質放出性が野生型株並に抑えられたのに対し、ORF中の変異を持つプラスミドではマンナンタンパク質が放出されており、このORF中の変異がマンナン放出に関与していることが明らかとなった。
Gpi10pはアミノ酸配列から複数回膜貫通する膜タンパク質と考えられているが、MTY9株の変異はC末端ドメインに存在するプロリンがロイシンに置換する変異であることが明らかになった（図３）。なお、野生型Gpi10pのアミノ酸配列を配列番号18に示した。配列番号18記載のアミノ酸配列は配列番号17記載のヌクレオチド番号234〜2081によってコードされる配列である。These plasmids were reintroduced into the yeast strain of the present invention (MT37-2B) according to a conventional method, and mannan protein release was examined by PAS staining. As a result, the release of mannan protein was suppressed in the plasmid with the mutation only upstream of the ORF, as compared to the wild type strain, whereas the mannan protein was released in the plasmid with the mutation in the ORF. It was revealed that it was involved in the release.
Although Gpi10p is considered to be a membrane protein that transmembranes multiple times from the amino acid sequence, it was revealed that the mutation in the MTY9 strain is a mutation that replaces proline in the C-terminal domain with leucine (FIG. 3). The amino acid sequence of wild type Gpi10p is shown in SEQ ID NO: 18. The amino acid sequence described in SEQ ID NO: 18 is a sequence encoded by nucleotide numbers 234 to 2081 described in SEQ ID NO: 17.
実施例３．本発明の酵母株からのマンナンタンパク質の回収Ｉ
マンナン放出酵母株MTY9を1 Lの合成培地（Difco社 Yeast Nitrogen Base w/o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%, アミノ酸0.13%）中で30℃にて10日間三角フラスコにて回転培養し、経時的にサンプリングを行い実施例１に示したSDS-PAGE法でマンナンタンパク質の放出を調べた。培養開始後40時間ごろ細胞の増殖が対数増殖期から定常期に入ったが、マンナンタンパク質量は細胞の増殖に伴い増加することが明らかになった。実施例１に記載した方法を用いて定量したところ、培養終了後にマンノース換算で培養上清１Lあたり約150 mg程度のマンナンタンパク質が回収されることが示された。 Example 3 FIG. Recovery of mannan protein from the yeast strain of the present invention I
Mannan-releasing yeast strain MTY9 in a 1 L synthetic medium (Difco Yeast Nitrogen Base w / o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%, Amino Acid 0.13%) Rotated in an Erlenmeyer flask at 30 ° C for 10 days Then, sampling was performed over time, and the release of mannan protein was examined by the SDS-PAGE method shown in Example 1. Although cell growth entered the stationary phase from the logarithmic growth phase around 40 hours after the start of culture, it was revealed that the amount of mannan protein increased with cell growth. When quantified using the method described in Example 1, it was shown that about 150 mg of mannan protein was recovered per liter of culture supernatant in terms of mannose after completion of the culture.
実施例４．本発明の酵母株からのマンナンタンパク質の回収II
マンナンタンパク質放出株AB9を2Lの合成培地（Difco社 Yeast Nitrogen Base w/o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%, アミノ酸0.13%）でジャー培養（30℃, pH5.5, 通気量1 vvm, 攪拌200rpm、72時間）し、培養液から実施例３と同様にしてマンナンタンパク質を定量した。これにより培養上清１Lあたりマンノース換算で約230 mgのマンナンタンパク質が回収されることが示された。 Example 4 Recovery of mannan protein from the yeast strain of the present invention II
Mannan protein-releasing strain AB9 was jar-cultured (30 ° C, pH5.5,
実施例５．本発明の酵母株からのマンナンタンパク質の回収III
マンナンタンパク質放出株AB9を2Lの合成培地（Difco社 Yeast Nitrogen Base w/o Amino acid and Ammonium sulfate 0.51%,Glucose 6%,アミノ酸0.4%）でジャー培養（30℃, pH5.5, 通気量1 vvm, 攪拌200rpm、72時間）し、培養液から実施例３と同様にしてマンナンタンパク質を定量した。これにより培養上清１Lあたりマンノース換算で約880mgのマンナンタンパク質が回収されることが示された。 Example 5 FIG. Recovery of mannan protein from the yeast strain of the present invention III
Mannan protein-releasing strain AB9 was jar-cultured (30 ° C, pH5.5,
実施例６．放出されたマンナンタンパク質の分析
１）マンナンタンパク質からのマンナンの切り出し
回収したマンナンタンパク質からの糖鎖切出し酵素によるマンナンの切り出しの可能性を調べるため、回収したマンナンタンパク質をEndoglycosidase H（EndoH）で処理し、電気泳動後、PAS染色を行った。
実施例１に記載した方法によってMTY9の培養液からエタノール沈殿試料を調製した。New England Biolabs社のEndoH（P0702S）を用い、同社の推奨するプロトコールに従ってこのエタノール沈殿試料の酵素処理を行った。すなわち36μLのA液に４μLの10x変性バッファー（5% SDS, 10% β-ME）を加え、100℃で10分間煮沸した。試料に５μlの10x G5バッファー（0.5M クエン酸ナトリウム pH5.5）を加えて攪拌した後、25μLと20μLに分けた。25μLは陰性対象としてそのまま37℃にて１時間保温した。残りの20μLには5μL（2500 unit）のEndoHを加え、37℃にて１時間保温した。保温後、等量の2x SDS-PAGEサンプルバッファーを添加し、実施例１と同様な方法に従って電気泳動およびPAS染色した。
その結果、PAS染色で染まるマンナンタンパク質の移動度はEndoH処理で大きく変化し、マンナンの切り出しによりタンパク質の質量が小さくなったことが確認された。 Example 6 Analysis of released mannan protein 1) Mannan excision from mannan protein In order to examine the possibility of excision of mannan by the glycosylation enzyme from the recovered mannan protein, the recovered mannan protein was treated with Endoglycosidase H (EndoH). After electrophoresis, PAS staining was performed.
An ethanol precipitation sample was prepared from the culture medium of MTY9 by the method described in Example 1. Using an EndoH (P0702S) manufactured by New England Biolabs, the ethanol-precipitated sample was subjected to enzyme treatment according to the protocol recommended by the company. That is, 4 μL of 10 × denaturing buffer (5% SDS, 10% β-ME) was added to 36 μL of solution A and boiled at 100 ° C. for 10 minutes. 5 μl of 10 × G5 buffer (0.5 M sodium citrate pH 5.5) was added to the sample and stirred, and then divided into 25 μL and 20 μL. 25 μL was kept as it was as a negative target at 37 ° C. for 1 hour. To the remaining 20 μL, 5 μL (2500 unit) of EndoH was added and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After incubation, an equal volume of 2x SDS-PAGE sample buffer was added, and electrophoresis and PAS staining were performed in the same manner as in Example 1.
As a result, it was confirmed that the mobility of the mannan protein stained by PAS staining was greatly changed by the EndoH treatment, and the mass of the protein was reduced by cutting out the mannan.
２）マンナンタンパク質のタンパク質含量およびアミノ酸組成
マンナン放出酵母株MT36-4D（MATa ura3、図４参照）を6Lの合成培地（Difco社 Yeast Nitrogen Base w/o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%, アミノ酸0.13%）で培養した培養上清からエタノール沈殿によって回収したマンナンタンパク質水溶液を、凍結乾燥機にて乾燥して試料を調製した(1.05 g)。
試料に0.5 mlの12 N塩酸を加え110℃にて22時間加水分解を行い、アミノ酸分析計（日本電子データムJLC-500/V）にてアミノ酸組成の分析を行った。結果を表１に示す。エタノール沈殿にて回収されたマンナンタンパク質中のタンパク質含量は約10%程度であった。構成アミノ酸ではセリンやスレオニンが比較的多いことが示された。2) Protein content and amino acid composition of mannan protein Mannan-releasing yeast strain MT36-4D (MATa ura3, see Fig. 4) in 6 L of synthetic medium (Difco Yeast Nitrogen Base w / o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2% , Amino acid 0.13%), a mannan protein aqueous solution recovered by ethanol precipitation from the culture supernatant was dried with a freeze dryer to prepare a sample (1.05 g).
0.5 ml of 12 N hydrochloric acid was added to the sample and hydrolyzed at 110 ° C. for 22 hours, and the amino acid composition was analyzed with an amino acid analyzer (JEOL Datum JLC-500 / V). The results are shown in Table 1. The protein content in the mannan protein recovered by ethanol precipitation was about 10%. It was shown that serine and threonine are relatively large among the constituent amino acids.
表１．アミノ酸組成
実施例７．マンナンタンパク質の回収条件の最適化
１）限外ろ過におけるカットオフ分子量
マンナン放出株MT36-4Dを6Lの合成培地（Difco社 Yeast Nitrogen Base w/o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%, アミノ酸0.13%）で三角フラスコにて実施例３に記載したように培養し、培養物から酵母菌体をろ過により除去した培養上清を試料とした。2 mlの試料をMillipore社製限外ろ過カラムCentricon（YM50，YM10，YM-3）に装荷し、指定条件（YM-50:5000 x g 15分,YM-10:5000 x g 1時間,YM-3:7500 x g 2時間）にて遠心分離することにより限外ろ過を行った。ろ液及び残留液を別々に回収し、それぞれを２mlにメスアップし、12N TFAを400μl加え、凍結、減圧したのち、加水分解管中で100℃、16時間加水分解を行った。加水分解後遠心エバポレーターにより乾燥し、分析試料として調製後、イオンクロマトグラフィーにより分析した。試験結果を表２に示す。マンノースは90%以上が分子量１万以上の画分に存在し、グルコースは広い分子量の範囲で存在していた。大部分のマンナンタンパク質は分子量５万以上の画分に回収されたが、効率的にマンナンタンパク質を回収するためには分子量１万以上を分取するように限外ろ過を行うのが適切であることが示された。 Example 7 Optimization of mannan protein recovery conditions 1) Cut-off molecular weight in ultrafiltration Mannan-releasing strain MT36-4D in 6 L synthetic medium (Difco Yeast Nitrogen Base w / o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%, amino acids 0.13%) was cultured in an Erlenmeyer flask as described in Example 3, and a culture supernatant obtained by removing yeast cells from the culture by filtration was used as a sample. Load a 2 ml sample into a Millipore ultrafiltration column Centricon (YM50, YM10, YM-3) and specify the conditions (YM-50: 5000 xg 15 minutes, YM-10: 5000
表２．マンノース画分の分子量分布
２）エタノール沈殿におけるエタノール濃度
マンナン放出株MT36-4D（図４）を6Lの合成培地（Difco社 Yeast Nitrogen Base w/o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%, アミノ酸0.13%）で三角フラスコを用いて実施例３に記載したように培養し、培養物から酵母菌体をろ過により除去した培養上清10mlに100%エタノール（和光純薬）をそれぞれ最終濃度33%,50%,60%,66.7%,80%（体積濃度）となるように加え、-30℃で一晩放置した。翌日7000rpmにて15分間遠心分離を行い、上澄み液を捨て、沈殿を一度66.7％エタノールにて洗浄した後、100μlの水に懸濁し、それぞれについてSDS-PAGE及びPAS染色を行った。
その結果、マンノースの収率はエタノール濃度60%以上で良好であり、特にエタノール濃度66.7%または80%の場合に効率よく回収できることが示された。2) Ethanol concentration in ethanol precipitation Mannan-releasing strain MT36-4D (Fig. 4) in 6L synthetic medium (Difco Yeast Nitrogen Base w / o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%, amino acid 0.13%) Erlenmeyer flask And 100% ethanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to 10 ml of the culture supernatant obtained by filtering the yeast cells from the culture by filtration. The final concentrations were 33%, 50%, and 60%, respectively. 66.7% and 80% (volume concentration), and allowed to stand at −30 ° C. overnight. The next day, centrifugation was performed at 7000 rpm for 15 minutes, the supernatant was discarded, the precipitate was washed once with 66.7% ethanol, suspended in 100 μl of water, and each was subjected to SDS-PAGE and PAS staining.
As a result, it was shown that the yield of mannose was good when the ethanol concentration was 60% or more, and that the mannose could be efficiently recovered particularly when the ethanol concentration was 66.7% or 80%.
本発明により、マンナンタンパク質、特にα-マンナンを含むマンナンタンパク質を培地中に放出する酵母及びその製造方法、また本方法によって製造された天然状態に近い単離マンナンタンパク質が提供される。すなわち、本発明により、１）マンナンタンパク質、特にα-マンナンを含むマンナンタンパク質を培地中に放出する酵母、２）従来はマンナンタンパク質を物理的あるいは化学的処理により回収してきたのに対し、前述の酵母を培養した培地中からマンナンタンパク質を回収することを特徴とする、マンナンタンパク質の効率的な製造方法が提供される。
特に、本発明の酵母は連続培養可能であるので、本発明によりマンナンタンパク質、特にα-マンナンを含むマンナンタンパク質を連続的に提供することもできる。本発明の、マンナンタンパク質を培地中に放出する酵母は有用な酵母株を育種するためにも利用できる。例えば、本発明の酵母を戻し交配する、または変異酵母株又は野生型酵母株と接合させること等により、更に他の性質を付加、除去された新たな酵母株を作製するための親株として利用することもできる。
さらに、本発明の酵母を培養することによって得られる天然状態に近いマンナンタンパク質からタンパク質部分を除去することにより、天然状態に近い単離マンナンを提供することができる。The present invention provides yeast that releases mannan protein, particularly mannan protein containing α-mannan, into the medium, a method for producing the same, and an isolated mannan protein that is produced by the method and is close to the natural state. That is, according to the present invention, 1) yeast that releases mannan protein, particularly mannan protein containing α-mannan, into the culture medium, and 2) mannan protein has been recovered by physical or chemical treatment, whereas There is provided an efficient method for producing mannan protein, which comprises recovering mannan protein from a medium in which yeast is cultured.
In particular, since the yeast of the present invention can be continuously cultured, a mannan protein, particularly a mannan protein containing α-mannan, can also be provided continuously according to the present invention. The yeast of the present invention that releases mannan protein into the medium can be used for breeding useful yeast strains. For example, the yeast of the present invention can be used as a parent strain to produce a new yeast strain to which other properties have been added or removed by backcrossing or mating with a mutant yeast strain or a wild type yeast strain. You can also.
Furthermore, an isolated mannan close to the natural state can be provided by removing the protein portion from the mannan protein close to the natural state obtained by culturing the yeast of the present invention.
（参考文献）
１．特開2002-095492号公報
２．日本栄養・食糧学会誌、55巻、33-39（2002）(References)
1. JP 2002-095492 A2. Journal of Japanese Society of Nutrition and Food, 55, 33-39 (2002)
配列番号１〜１６：PCRプライマー SEQ ID NOs: 1-16: PCR primers
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