JP4956715B2 - Measuring method of target substance - Google Patents
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本発明は、サンプル中の目的物質の測定方法に関する。より詳細には、電界効果トランジスタセンサを利用した、抗体に特異的に結合する目的物質（抗原）の測定方法に関する。 The present invention relates to a method for measuring a target substance in a sample. More specifically, utilizing the electric field effect transistor sensor, method for measuring a target substance (antigen) that specifically binds to the antibody.
電界効果トランジスタ（Field Effect Transistor, FET）は、ｐ型半導体上にｎ型半導体でドレインとソースを形成し、ｐ型半導体のチャネル上をケイ素酸化物で絶縁してゲートを形成したもので、ゲートに与える電位によってチャネルに電子空乏層を生じ、ドレインとソースの間に流れる電流を変化させることができる。 A field effect transistor (FET) is an n-type semiconductor drain and source formed on a p-type semiconductor, and a p-type semiconductor channel is insulated with silicon oxide to form a gate. An electron depletion layer is generated in the channel by the potential applied to the channel, and the current flowing between the drain and source can be changed.
抗原抗体反応を検出するFETセンサ（Immuno-FET）は、従来、ゲート絶縁膜表面に抗体もしくは抗原を固定化し、抗原抗体複合体が形成されるとゲート絶縁膜表面の電荷が変化し、ソース・ドレイン間の電気伝導性の変化が生じる。通常は、ドレイン電流の変化、もしくはソース・ドレイン間にチャネルが形成される時のゲート電圧（しきい値電圧Vth）の変化が計測される。 Conventional FET sensors that detect antigen-antibody reactions (Immuno-FETs) have immobilized antibodies or antigens on the surface of the gate insulating film, and when the antigen-antibody complex is formed, the charge on the surface of the gate insulating film changes, A change in electrical conductivity occurs between the drains. Usually, a change in drain current or a change in gate voltage (threshold voltage Vth) when a channel is formed between the source and drain is measured.
抗原抗体反応を検出するFETセンサについてはこれまでにも研究がなされているが、良好な結果は得られていない。その主な要因は、抗体などの蛋白質の大きさと溶液／ゲート絶縁膜表面の電気二重層の幅（デバイ長）に関係している。抗体の典型的な大きさは約１０nmであるのに対し、生理学的塩溶液中でのデバイ長は約１nmである。抗体をゲート絶縁膜表面に固定化する場合、溶液中の抗原は電気二重層の外で抗体と結合することになり、抗原の電荷はカウンターイオンによって遮蔽され、原理的にFETで検出することが困難となっている。 The FET sensor that detects the antigen-antibody reaction has been studied so far, but good results have not been obtained. The main factors are related to the size of proteins such as antibodies and the width (Debye length) of the electric double layer on the surface of the solution / gate insulating film. The typical size of an antibody is about 10 nm, while the Debye length in physiological salt solution is about 1 nm. When the antibody is immobilized on the surface of the gate insulating film, the antigen in the solution binds to the antibody outside the electric double layer, and the charge of the antigen is shielded by the counter ion and can be detected by FET in principle. It has become difficult.
そのため、免疫測定法で一般的に利用されるサンドイッチ法では、「固定化抗体―抗原―二次抗体」複合体の形成を直接FETで検出することは困難な場合は多く、特許文献１に開示されているように、二次抗体に標識した酵素の酵素反応により生成した電気化学的に活性な化合物を検出する方法を採用する場合が多い。しかし、この方法では、発色や化学発光により抗原量を検出する従来のELISA法と原理的には同じであり、洗浄工程や酵素標識した二次抗体を必要とするという問題点がある。 For this reason, it is often difficult to directly detect the formation of the “immobilized antibody-antigen-secondary antibody” complex by FET in the sandwich method generally used in immunoassay methods, which is disclosed in Patent Document 1. As described above, a method of detecting an electrochemically active compound generated by an enzyme reaction of an enzyme labeled with a secondary antibody is often employed. However, this method is in principle the same as the conventional ELISA method in which the amount of antigen is detected by color development or chemiluminescence, and has a problem that a washing step or an enzyme-labeled secondary antibody is required.
上記の通り、Immuno-FETは、原理的には、タンパク質に色素などの検出用シグナル分子の標識や洗浄工程を必要とせず、小型化も可能な優れた検出方法であるが、従来の抗体サンドイッチ法では、その分子の大きさが問題となるため、良好な検出方法は開発されていない。 As described above, Immuno-FET is an excellent detection method that, in principle, does not require labeling or washing steps of detection signal molecules such as dyes on proteins, and can be miniaturized. In the method, since the size of the molecule becomes a problem, a good detection method has not been developed.
一方、特許文献２には、抗原を特異的に認識する抗体のＶＨ領域ポリペプチドおよびＶＬ領域ポリペプチドを調製し、一方のポリペプチドをレポーター分子で標識して標識化ポリペプチドとし、他方のポリペプチドを固相に固定して固定化ポリペプチドとし、抗原含有試料および標識化ポリペプチドを固相に接触させ、固定化ポリペプチドに結合した標識化ポリペプチドのレポーター分子の量を測定する方法において、レポーター分子が酵素または蛍光色素であることを特徴とする抗原濃度測定方法が記載されている。 On the other hand, in Patent Document 2, a VH region polypeptide and a VL region polypeptide of an antibody that specifically recognizes an antigen are prepared, one polypeptide is labeled with a reporter molecule to form a labeled polypeptide, and the other polypeptide is labeled. In a method in which a peptide is immobilized on a solid phase to form an immobilized polypeptide, an antigen-containing sample and a labeled polypeptide are brought into contact with the solid phase, and the amount of the reporter molecule of the labeled polypeptide bound to the immobilized polypeptide is measured. A method for measuring an antigen concentration is described in which the reporter molecule is an enzyme or a fluorescent dye.
上記の通り、電界効果トランジスタ（FET）はゲート絶縁膜表面の電荷密度変化に敏感である性質を持ち、様々なセンサに応用されている。FETと抗原-抗体反応を組み合わせた免疫FETセンサは、ゲート絶縁表面に抗体を固定化し、抗原-抗体反応に伴う電荷の変化を検出するデバイスであるが、実現が困難であると考えられている。その原因は、抗体の大きさがゲート絶縁膜界面の電気二重層の幅（デバイ長）よりも大きく、抗原抗体反応がデバイ長の外側で起こることにある。また、電荷的に中性な抗原や電荷の小さな低分子を検出することは困難である。本発明は、これらの問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、サンドイッチ式免疫測定方法において、抗原・抗体の複合体を、二次抗体などを使用することなく直接、電界効果トランジスタ（FET）を用いて検出することが可能となる測定方法を提供することを解決すべき課題とした。 As described above, a field effect transistor (FET) has a property of being sensitive to a change in charge density on the surface of a gate insulating film, and is applied to various sensors. ImmunoFET sensors that combine FET and antigen-antibody reactions are devices that immobilize antibodies on the gate insulating surface and detect changes in charge associated with antigen-antibody reactions, but are considered difficult to realize . The cause is that the size of the antibody is larger than the width (Debye length) of the electric double layer at the interface of the gate insulating film, and the antigen-antibody reaction occurs outside the Debye length. Also, it is difficult to detect charge neutral antigens and small molecules with small charges. The present invention has made it a problem to be solved to solve these problems. That is, the present invention provides a sandwich immunoassay method in which an antigen / antibody complex can be directly detected using a field effect transistor (FET) without using a secondary antibody or the like. It was set as the problem which should be solved to provide.
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、抗体を、ＶＨ領域とＶＬ領域とに分割して使用し、ＶＨ領域を含むペプチドとＶＬ領域を含むペプチドと目的物質とからなる複合体を形成させ、この複合体を電界効果トランジスタセンサにより測定することによって、抗原・抗体の複合体を、二次抗体などを使用することなく直接、電界効果トランジスタを用いて検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors divided and used an antibody into a VH region and a VL region, and consisted of a peptide containing the VH region, a peptide containing the VL region, and a target substance. to form a complex, by measuring this complex electric field effect transistor sensors, it found that a complex of antigen-antibody can be detected using direct field effect transistors without using such secondary antibodies The present invention has been completed.
即ち、本発明によれば、目的物質の測定方法において、
（ａ）目的物質を特異的に認識する抗体のＶＨ領域を含むポリペプチド、目的物質を特異的に認識する抗体のＶＬ領域を含むポリペプチド、及び目的物質からなる複合体を形成させる工程：及び
（ｂ）工程（ａ）で形成された複合体を電界効果トランジスタセンサにより測定する工程：
を含む上記の測定方法が提供される。
That is, according to the present invention, in the method for measuring a target substance,
(A) forming a polypeptide comprising a VH region of an antibody that specifically recognizes a target substance, a polypeptide containing a VL region of an antibody that specifically recognizes the target substance, and a complex comprising the target substance; and (b) step (a) the formed step is measured by the electric field effect transistor sensor complex:
Is provided.
好ましくは、工程（ａ）において、目的物質を特異的に認識する抗体のＶＨ領域を含むポリペプチド、又は目的物質を特異的に認識する抗体のＶＬ領域を含むポリペプチドの何れか一方を固定化した固相に、目的物質を特異的に認識する抗体のＶＨ領域を含むポリペプチド、又は目的物質を特異的に認識する抗体のＶＬ領域を含むポリペプチドの何れか他方、及び目的物質を接触させることによって、目的物質を特異的に認識する抗体のＶＨ領域を含むポリペプチド、目的物質を特異的に認識する抗体のＶＬ領域を含むポリペプチド、及び目的物質からなる複合体を形成させる。 Preferably, in the step (a), either a polypeptide containing a VH region of an antibody that specifically recognizes a target substance or a polypeptide containing a VL region of an antibody that specifically recognizes a target substance is immobilized. The target substance is contacted with either the polypeptide containing the VH region of the antibody specifically recognizing the target substance, or the polypeptide containing the VL region of the antibody specifically recognizing the target substance, and the solid phase. As a result, a complex comprising the polypeptide containing the VH region of the antibody specifically recognizing the target substance, the polypeptide containing the VL region of the antibody specifically recognizing the target substance, and the target substance is formed.
好ましくは、目的物質を特異的に認識する抗体のＶＨ領域を含むポリペプチド、又は目的物質を特異的に認識する抗体のＶＬ領域を含むポリペプチドの何れか一方が、共有結合により固相に固定化されている。 Preferably, either a polypeptide containing a VH region of an antibody that specifically recognizes a target substance or a polypeptide containing a VL region of an antibody that specifically recognizes a target substance is immobilized on a solid phase by covalent bonding. It has become.
好ましくは、目的物質を特異的に認識する抗体のＶＨ領域を含むポリペプチド、又は目的物質を特異的に認識する抗体のＶＬ領域を含むポリペプチドの何れか一方が、該ポリペプチドを認識するペプチドまたはタンパク質により固相に固定化されている。 Preferably, any one of a polypeptide containing a VH region of an antibody that specifically recognizes a target substance or a polypeptide containing a VL region of an antibody that specifically recognizes a target substance recognizes the polypeptide Alternatively, it is immobilized on a solid phase by a protein.
好ましくは、目的物質を特異的に認識する抗体のＶＨ領域を含むポリペプチド、又は目的物質を特異的に認識する抗体のＶＬ領域を含むポリペプチドの何れか一方が、ビオチンと、アビジン又はストレプトアビジンとの結合を介して固相に固定されている。 Preferably, any one of a polypeptide containing a VH region of an antibody that specifically recognizes a target substance or a polypeptide containing a VL region of an antibody that specifically recognizes a target substance is biotin and avidin or streptavidin It is fixed to the solid phase through a bond.
本発明による目的物質の測定方法によれば、サンドイッチ式免疫測定方法において、抗原・抗体の複合体を、二次抗体などを使用することなく直接、電界効果トランジスタ（FET）を用いて検出することが可能である。従って、本発明によれば、抗原などの目的物質を簡便かつ迅速に測定することができる。 According to the method for measuring a target substance according to the present invention, in a sandwich immunoassay method, an antigen / antibody complex is detected directly using a field effect transistor (FET) without using a secondary antibody or the like. Is possible. Therefore, according to the present invention, a target substance such as an antigen can be measured easily and rapidly.
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明による目的物質の測定方法は、
（ａ）目的物質を特異的に認識する抗体のＶＨ領域を含むポリペプチド、目的物質を特異的に認識する抗体のＶＬ領域を含むポリペプチド、及び目的物質からなる複合体を形成させる工程：及び
（ｂ）工程（ａ）で形成された複合体を電界効果トランジスタセンサにより測定する工程：
を含むことを特徴とする。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
The method for measuring a target substance according to the present invention includes:
(A) forming a polypeptide comprising a VH region of an antibody that specifically recognizes a target substance, a polypeptide containing a VL region of an antibody that specifically recognizes the target substance, and a complex comprising the target substance; and (b) step (a) the formed step is measured by the electric field effect transistor sensor complex:
It is characterized by including.
本発明で言う目的物質の測定方法とは、目的物質の存在の有無の検出、又は目的物質の量の測定などを含む、全ての測定を意味するものである。 The target substance measurement method referred to in the present invention means all measurements including detection of the presence or absence of the target substance or measurement of the amount of the target substance.
工程（ａ）に記載されるように、抗体のＶＨ領域を含むポリペプチド、抗体のＶＬ領域を含むポリペプチド、及び目的物質からなる複合体を形成させるイムノアッセイは、一般に、オープンサンドイッチイムノアッセイとも称される。オープンサンドイッチイムノアッセイは、抗体の可変領域ドメインＶＨ及びＶＬが抗原依存的に会合するという現象を利用するアッセイ方法である。オープンサンドイッチイムノアッセイでは、一種類の抗体のみで測定可能であることや、特に通常のサンドイッチ法では測定不可能な低分子抗原（ハプテン）の非競合的測定を可能にする点が特徴である。従来から知られている通常のオープンサンドイッチイムノアッセイでは、ＶＨもしくはＶＬのいずれかに酵素標識し、もう一方を固定化することでELISA法によって、もしくは、ＶＨおよびＶＬの両者に蛍光分子を標識することでFRET法などによって、抗原を定量することが行われている。それに対して、本発明においては、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）センサを利用することによって、ＶＨもしくはＶＬのいずれかを固定化し、ゲート絶縁膜表面上に形成したＶＨ、ＶＬ、抗原から成る三者複合体の形成を電荷分布の変化として検出することによって、目的物質（即ち、抗原）の測定を行うことができる。従って、本発明の方法においては、ＶＨおよびＶＬを標識する必要がない。しかも、この三者（ＶＨ、ＶＬ、抗原）の複合体のサイズは、ほぼゲート表面からデバイ長と一致するために、高感度に検出することができる。固定相上での複合体形成を非標識的に検出する方法としてSPRやQCMなどが挙げられるが、それらと比較してもFETはより高感度化を達成することができ、さらに半導体加工技術によりゲート面積も数ミリ単位で作製可能であるために、集積化や多機能化が実現できる。以下、本発明の特徴である（１）オープンサンドイッチイムノアッセイ、及び（２）電界効果トランジスタセンサについて説明する。 As described in step (a), an immunoassay that forms a complex consisting of a polypeptide containing the VH region of an antibody, a polypeptide containing the VL region of an antibody, and a target substance is generally also referred to as an open sandwich immunoassay. The The open sandwich immunoassay is an assay method that utilizes the phenomenon that antibody variable region domains VH and VL are associated in an antigen-dependent manner. The open sandwich immunoassay is characterized in that it can be measured with only one kind of antibody, and particularly allows non-competitive measurement of a small molecule antigen (hapten) that cannot be measured by a normal sandwich method. In the conventional open sandwich immunoassay known from the past, either VH or VL is enzyme-labeled, and the other is immobilized by ELISA, or both VH and VL are labeled with fluorescent molecules. The antigen is quantified by the FRET method or the like. In contrast, in the present invention, by utilizing the electric field effect transistor (FET) sensor, to immobilize either the VH or VL, VH formed in the gate insulating film on the surface, VL, tripartite consisting antigen By detecting the formation of the complex as a change in charge distribution, the target substance (ie, antigen) can be measured. Therefore, in the method of the present invention, it is not necessary to label VH and VL. In addition, the size of the complex of these three (VH, VL, antigen) almost coincides with the Debye length from the gate surface, so that it can be detected with high sensitivity. SPR and QCM are examples of methods to detect complex formation on the stationary phase in a non-labeled manner, but FETs can achieve higher sensitivity than those, and semiconductor processing technology can also be used. Since the gate area can be manufactured in units of several millimeters, integration and multi-function can be realized. Hereinafter, (1) an open sandwich immunoassay and (2) a field effect transistor sensor, which are features of the present invention, will be described.
（１）オープンサンドイッチイムノアッセイ
蛋白質性の抗原は、サンドイッチ法と呼ばれる２種類の抗体を使う方法で測定されることが一般的である。サンドイッチ法は、抗原に同時に結合できる２種類の抗体を用意する必要があるが、特異性と感度が高いという利点を有している。しかし、分子量1000以下の小分子は小さすぎて、二種類の抗体でサンドイッチすることが困難である。即ち、分子量1000以下の小分子は抗原決定基が一つしかない単価抗原であるため、二種類の抗体でサンドイッチすることが困難となる。そのためこのような小分子は通常、競合法と呼ばれる方法で測定される。しかし競合法は、条件設定が難しく、感度が低い、測定操作にかなりの注意深さが必要、といった難点を有している。
(1) Open sandwich immunoassay Proteinaceous antigens are generally measured by a method using two types of antibodies called a sandwich method. The sandwich method needs to prepare two types of antibodies that can simultaneously bind to an antigen, but has the advantage of high specificity and sensitivity. However, small molecules with a molecular weight of 1000 or less are too small to be sandwiched between two types of antibodies. That is, since a small molecule having a molecular weight of 1000 or less is a unitary antigen having only one antigenic determinant, it is difficult to sandwich between two types of antibodies. For this reason, such small molecules are usually measured by a method called a competitive method. However, the competitive method has the drawbacks that it is difficult to set conditions, the sensitivity is low, and the measurement operation requires considerable attention.
このような欠点のない、小分子でも非競合的に測定できる方法として、本発明者らは、オープンサンドイッチイムノアッセイという免疫測定法を報告している。この方法は基本的に、「抗体の可変領域（抗原結合部位）は抗原がないと不安定だが、抗原が結合すると安定化される」という原理を利用した方法である。抗体はH鎖とL鎖の２本の鎖で構成されるが、それぞれの抗原結合部位は ＶＨ, ＶＬと呼ばれこれらが抗原を認識できる最小単位である可変領域Fvを構成する。最近ではファージ提示法などを用いて容易にＶＨとＶＬをコードする遺伝子断片をクローニングすることができるが、ＶＨとＶＬの間の結合は非共有的で多くの場合不安定であり、これらをペプチドで結んで一本鎖抗体(scFv)として使われる場合がほとんどである。 The present inventors have reported an immunoassay called an open sandwich immunoassay as a method capable of non-competitively measuring even a small molecule without such drawbacks. This method basically uses the principle that “the variable region (antigen-binding site) of an antibody is unstable without an antigen but is stabilized when an antigen binds”. An antibody is composed of two chains, an H chain and an L chain, and each antigen-binding site is called VH and VL, and these constitute a variable region Fv which is the smallest unit capable of recognizing an antigen. Recently, gene fragments encoding VH and VL can be easily cloned using a phage display method or the like, but the binding between VH and VL is non-covalent and unstable in many cases. In most cases, it is used as a single chain antibody (scFv).
本発明者らは、この不安定なFvが、抗原が結合すると安定化する場合があり、それを利用すれば抗原濃度を従来より簡便かつ迅速に、さらに感度よく測定できることを見い出した。すなわち、ＶＬ断片をプレートに固定化しておき、これにＶＨ断片にファージあるいはアルカリフォスファターゼを結合させたものと抗原（この場合鶏卵白リゾチーム）を含むサンプルとを混ぜて一回洗浄した後にプレートに固定化されたファージあるいは酵素の量を測定すれば、それば抗原量と非常によい相関を示すことを見いだしたのである(UEDA, H. et al. Nature Biotechnol. 14, 1714-1718(1996))。 The present inventors have found that this unstable Fv may be stabilized when an antigen is bound, and that the concentration of the antigen can be measured more easily and more quickly and with higher sensitivity than before. That is, a VL fragment is immobilized on a plate, mixed with a sample containing a phage or alkaline phosphatase bound to a VH fragment and an antigen (in this case, chicken egg white lysozyme), washed once, and then immobilized on the plate. It was found that measuring the amount of conjugated phage or enzyme shows a very good correlation with the amount of antigen (UEDA, H. et al. Nature Biotechnol. 14, 1714-1718 (1996)). .
さらに、本発明者らは、手持ちの抗体がサープンサンドイッチ法に向いているか向いていないかを簡便に調べるための方法を開発した(Aburatani, T. et al., Anal. Chem. 75,
4057-4064 (2003)；上田 宏. 小分子を非競合的に測定可能な新しい免疫測定法 Bio Medical Quick Review Nets No.027 (2004)；及び上田 宏. "競合法によらない小分子の免疫測定". 生化学, 76(7), 670-674 (2004))。市販のファージ抗体システムに良く似たこの方法（split Fvシステム）を用いれば、手持ちのハイブリドーマの抗体可変領域の抗原結合能とＶＨ/ＶＬ相互作用の強弱の両方を、ファージを作る大腸菌を変えることで手軽に調べることができ、またより良い性質の抗体の選択ができる。
Furthermore, the present inventors have developed a method for easily examining whether the antibody on hand is suitable for the Serpen Sandwich method (Aburatani, T. et al., Anal. Chem. 75,
4057-4064 (2003); Hiroshi Ueda. New immunoassay that can measure small molecules non-competitively Bio Medical Quick Review Nets No.027 (2004); and Hiroshi Ueda. Measurement ". Biochemistry, 76 (7), 670-674 (2004)). Using this method (split Fv system), which is very similar to a commercially available phage antibody system, changes both the antigen-binding ability of the antibody variable region of the hybridoma on hand and the strength of the VH / VL interaction by changing the Escherichia coli producing the phage. Can be easily examined, and antibodies with better properties can be selected.
本発明の方法においては、測定対象となる目的物質（即ち、抗原）を特異的に認識する抗体のＶＨ領域を含むポリペプチドと、上記抗体のＶＬ領域を含むポリペプチドを別々に調製する。各ポリペプチドの長さは、それらが対合した状態で、測定対象の目的物質と結合することのできる長さであれば特に限定されず、抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域よりも長くても短くてもよい。 In the method of the present invention, a polypeptide containing a VH region of an antibody that specifically recognizes a target substance (that is, an antigen) to be measured and a polypeptide containing the VL region of the antibody are prepared separately. The length of each polypeptide is not particularly limited as long as it is a length capable of binding to the target substance to be measured in a paired state, and shorter or longer than the VH region and VL region of the antibody. May be.
抗体のＶＨ領域を含むポリペプチド、及び抗体のＶＬ領域を含むポリペプチドは、例えば、以下の通り調製することができる。 The polypeptide containing the antibody VH region and the polypeptide containing the antibody VL region can be prepared, for example, as follows.
すなわち、目的物質を特異的に認識するモノクローナル抗体を公知の方法 (例えば、Kohler, G. and Milstein, C. Nature 256, 495-496, 1975などを参照)によって作製し、この抗体の可変領域をコードする遺伝子を特定し、この遺伝子をクローニングする。そして、この組換え体ベクターからＶＨおよび／またはＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列を取得し、これをクローニングして、宿主細胞内で発現させることにより、必要量のＶＨ領域を含むポリペプチドおよびＶＬ領域を含むポリペプチドを取得することができる。抗体遺伝子からＶＨ又はＶＬをコードする塩基配列を得るためには、所望の配列領域を制限酵素で切り出し、これをクローニングベクターで増幅させてもよく、あるいは所望の配列をＰＣＲ法で増幅してもよい。ＶＨおよび／またはＶＬを宿主細胞で発現させる場合には、任意のレポーター分子をコードする遺伝子をも発現ベクターにクローニングし、ＶＨおよび／またはＶＬをレポーター分子との融合蛋白またはキメラ蛋白として発現させることができる。 That is, a monoclonal antibody that specifically recognizes a target substance is prepared by a known method (see, for example, Kohler, G. and Milstein, C. Nature 256, 495-496, 1975, etc.), and the variable region of this antibody is determined. Identify the encoding gene and clone this gene. Then, a DNA sequence encoding a VH and / or VL region is obtained from this recombinant vector, cloned and expressed in a host cell, so that a polypeptide containing the necessary amount of VH region and a VL region are obtained. Can be obtained. In order to obtain a nucleotide sequence encoding VH or VL from an antibody gene, a desired sequence region may be excised with a restriction enzyme and amplified with a cloning vector, or a desired sequence may be amplified with a PCR method. Good. When VH and / or VL are expressed in a host cell, a gene encoding any reporter molecule is also cloned into an expression vector, and VH and / or VL is expressed as a fusion protein or a chimeric protein with the reporter molecule. Can do.
本発明における工程（ａ）、即ち、目的物質を特異的に認識する抗体のＶＨ領域を含むポリペプチド、目的物質を特異的に認識する抗体のＶＬ領域を含むポリペプチド、及び目的物質からなる複合体を形成させる工程においては、好ましくは、目的物質を特異的に認識する抗体のＶＨ領域を含むポリペプチド、又は目的物質を特異的に認識する抗体のＶＬ領域を含むポリペプチドの何れか一方を固定化した固相に、目的物質を特異的に認識する抗体のＶＨ領域を含むポリペプチド、又は目的物質を特異的に認識する抗体のＶＬ領域を含むポリペプチドの何れか他方、及び目的物質を接触させることによって、目的物質を特異的に認識する抗体のＶＨ領域を含むポリペプチド、目的物質を特異的に認識する抗体のＶＬ領域を含むポリペプチド、及び目的物質からなる複合体を形成させることができる。 Step (a) in the present invention, that is, a polypeptide comprising a VH region of an antibody specifically recognizing a target substance, a polypeptide comprising a VL region of an antibody specifically recognizing the target substance, and a composite comprising the target substance In the step of forming a body, preferably, either a polypeptide containing a VH region of an antibody that specifically recognizes a target substance or a polypeptide containing a VL region of an antibody that specifically recognizes a target substance Either the polypeptide containing the antibody VH region specifically recognizing the target substance or the polypeptide containing the antibody VL region specifically recognizing the target substance on the immobilized solid phase, and the target substance A polypeptide containing a VH region of an antibody that specifically recognizes a target substance by contacting, a polypeptide containing a VL region of an antibody that specifically recognizes the target substance, Thereby forming a complex of microcrystal target substance.
ポリペプチドの固相への固定化方法は、公知の方法を採用することができる。例えば、ポリペプチドは、共有結合により固相に固定化されていてもよいし、該ポリペプチドを認識するペプチドまたはタンパク質により固相に固定化されていてもよいし、あるいはビオチンと、アビジン又はストレプトアビジンとの結合を介して固相に固定されていてもよい。例えば、固相に固定化すべきポリペプチドをビオチン化しておけば、アビジン又はストレプトアビジンを吸着させた固相（測定用プレート）に容易に固定することができる。 As a method for immobilizing a polypeptide on a solid phase, a known method can be adopted. For example, the polypeptide may be immobilized on the solid phase by a covalent bond, may be immobilized on the solid phase by a peptide or protein that recognizes the polypeptide, or biotin and avidin or streptoid It may be fixed to the solid phase via a bond with avidin. For example, if a polypeptide to be immobilized on a solid phase is biotinylated, it can be easily immobilized on a solid phase (measuring plate) on which avidin or streptavidin is adsorbed.
（２）電界効果トランジスタセンサ
電界効果トランジスタ（Field Effect Transistor, FET）は、ｐ型半導体上にｎ型半導体でドレインとソースを形成し、ｐ型半導体のチャネル上をケイ素酸化物で絶縁してゲートを形成したもので、金属酸化半導体（Metal Oxide Semiconductor, MOS）構造を持ったトランジスタの一種である。FETは、ゲートに与える電位によってチャネルに電子空乏層を生じ、ドレインとソースの間に流れる電流を変化させることができる。1970年にBergveldは，MOS−FETのゲート金属を取り去って溶液中に浸すと，ゲート絶縁物／溶液界面にイオン濃度に依存した電位が発生することを見い出し(BERGVEID, P. Development of an ion-sensitive solid-state device for neurophysiological measurements, IEEE Trans. Biomed. Eng., 17: 70-71 (1970))、Ion Sensitive Field Effect Transistorと名付けた。さらにBergveldは、1972年に、このFETがNa+とH+に感受性があることを報告した(BERGVELD, P. Development operation, and application of the ion-sensitive field effect transistor as a tool for electrophysiology, IEEE Trans. Biomed. Eng., 19: 342-352 (1972))。その後、窒化シリコンをゲート表面上に蒸着することにより，水素イオンだけに感受性をもつFETが開発されて，Ion Selective Field Effect Transistor（ISFET）と呼ばれ、pHメーター等に応用されるようになった。
(2) Field Effect Transistor (Field Effect Transistor, FET) is a gate formed by forming a drain and a source with an n-type semiconductor on a p-type semiconductor and insulating the channel of the p-type semiconductor with silicon oxide. This is a type of transistor having a metal oxide semiconductor (MOS) structure. In the FET, an electron depletion layer is generated in the channel by the potential applied to the gate, and the current flowing between the drain and the source can be changed. In 1970, Bergveld found that when the gate metal of a MOS-FET was removed and immersed in a solution, a potential depending on the ion concentration was generated at the gate insulator / solution interface (BERGVEID, P. Development of an ion- Sensitive solid-state device for neurophysiological measurements, IEEE Trans. Biomed. Eng., 17: 70-71 (1970)), named Ion Sensitive Field Effect Transistor. Bergveld also reported in 1972 that this FET was sensitive to Na + and H + (BERGVELD, P. Development operation, and application of the ion-sensitive field effect transistor as a tool for electrophysiology, IEEE Trans Biomed. Eng., 19: 342-352 (1972)). Later, by depositing silicon nitride on the gate surface, an FET sensitive only to hydrogen ions was developed, called the Ion Selective Field Effect Transistor (ISFET), and applied to pH meters and the like. .
ISFETは，種々のバイオセンサのトランスデューサとしても応用可能であり、抗原抗体反応を検出するFETセンサ（Immuno-FET）は，1978年にその概念がSchenckらによって紹介された(SCHENCK, J.F., 1978. In: Cheung, P.W.(ed.), Theory, Design and Biomedical Application of Solid State Chemical Sensors. CRC press, Boca Raton, FL, pp.165-173)。Immuno-FETでは、ゲート絶縁膜表面に抗体もしくは抗原を固定化し、抗原抗体複合体が形成されるとゲート絶縁膜表面の電荷が変化し、ソース・ドレイン間の電気伝導性の変化が生じる。通常は、ドレイン電流の変化、もしくはソース・ドレイン間にチャネルが形成される時のゲート電圧（しきい値電圧Vth）の変化が計測される。1982年にCollinsとJanataによって免疫センサが報告されている（COLLINS, S. and J. JANATA, A critical evaluation of the mechanism of potential response of antigen po1ymer membranes to the corresponding antiserum, Anal. Chem., 136: 93-99 (1982)）。 ISFET can also be applied as a transducer for various biosensors, and the concept of FET sensor (Immuno-FET) for detecting antigen-antibody reaction was introduced in 1978 by Schenck et al. (SCHENCK, JF, 1978. In: Cheung, PW (ed.), Theory, Design and Biomedical Application of Solid State Chemical Sensors. CRC press, Boca Raton, FL, pp.165-173). In Immuno-FET, when an antibody or an antigen is immobilized on the surface of a gate insulating film and an antigen-antibody complex is formed, the charge on the surface of the gate insulating film changes, and the electrical conductivity between the source and the drain changes. Usually, a change in drain current or a change in gate voltage (threshold voltage Vth) when a channel is formed between the source and drain is measured. An immunosensor was reported in 1982 by Collins and Janata (COLLINS, S. and J. JANATA, A critical evaluation of the mechanism of potential response of antigen po1ymer membranes to the corresponding antiserum, Anal. Chem., 136: 93 -99 (1982).
ISFETを利用したバイオセンサは、酵素を固定化したEnzyme-FETが盛んに研究されている。Enzyme-FET では、酵素反応によって生じた生成物によって電気二重層内のpHやイオン濃度が変化する現象を利用している。CarasとJanataは，1980年にISFETゲート表面上にペニシリナーゼを固定化し，ペニシリンの濃度を測定することに成功した(CARAS, S. and J. JANATA, Field effect transistor sensitive to penici11in, Anal. Chem., 52: 1935-1937 (1980))。さらに、1983年に鈴木らは，ウレアーゼを固定化した尿素センサ(宮原裕二他：半導体技術と酵素固定化技術を組み合わせた小型尿素センサ．日本化学会誌，1983：823−830（1983）；及びANZAI, J., et al Urea sensor based on ion sensitive field effect transistor coated with cross-1inked urease-albumin membrane, Bunseki Kagaku, 33: E131-E136 (1983))、Nakakoらがリパーゼを用いた中性脂肪センサ(NAKAKO, M., et al, Neutral lipid enzyme electrode based on ion sensitive field effect transistors, Anal. Chim. Acta., 185: 179-185 (1986))、軽部らがATPaseを用いたATPセンサ(GOTOH, M., et al. A microsensor for adenosine-5'-triphosphate pH-sensitive field effect transistors, Anal. Chim. Acta., 187: 287-291 (1986))，1987年に富田らがグルコキナーゼを用いたグルコースセンサ(川辺 健 他：好熱蘭の耐熱性酵素グルコキナーゼを用いるISFET型グルコースセンサ．日本化学会誌，1987：1719−1724（1987）)やグルタミンシンテターゼを用いたL-グルタミン酸センサ(飯田武揚 他：好熱繍の耐熱性酵素グルタミナンシンテターゼを用いるISFET型L−グルタミン酸センサ，日本化学会誌，1987：1817−1821（1987）)，軽部らがアセチルコリンレセプタを用いたアセチルコリンセンサ(GOTOH, M., E, et al., Acetylcholine sensor based on ion sensitive field effect transistor and acetylcholine receptor, Anal. Lett., 20: 857-870 (1987)），微生物を用いたアルコールセンサ(KITAGAWA, Y, et al., Microbial-FET alcohol sensor, Anal. Lett., 20: 81-96 (1987)）をそれぞれ報告している。また、最近では一本鎖DNAをゲート絶縁膜表面に固定化し、相補的な非標識DNAを高感度に検出するDNAセンサが報告されている(SAKATA, T., M. KAMAHORI and Y. MIYAHARA, DNA Analysis Chip Based on Field Effect Transistors, Japanese J. Appl. Phys., 44 No. 4B, 2854-2859, (2005)；SAKATA, T., and Y. MIYAHARA, Potentiometric detection of single nucleotide polymorphism using genetic field effect transistor, ChemBioChem, 6: 703-710, (2005)； SAKATA, T., M. KAMAHORI and Y. MIYAHARA, Immobilization of oligonucleotide probes on Si3N4 surface and its application to genetic field effect transistor, Mat. Sci. Eng. C, 24: 827-832, (2004)；特開２００６−２７５６７０号公報；特開２００５−３３７７７１号公報；特開２００５−２１８３１０号公報；及び特開２００５−７７２１０号公報など） As for biosensors using ISFET, Enzyme-FET with immobilized enzyme has been actively studied. Enzyme-FET uses the phenomenon that the pH and ion concentration in the electric double layer change due to the product generated by the enzyme reaction. Caras and Janata succeeded in measuring penicillin concentration by immobilizing penicillinase on the ISFET gate surface in 1980 (CARAS, S. and J. JANATA, Field effect transistor sensitive to penici11in, Anal. Chem., 52: 1935-1937 (1980)). In 1983, Suzuki et al., Urea Sensors Immobilized Urease (Yuji Miyahara et al .: Small Urea Sensor Combining Semiconductor Technology and Enzyme Immobilization Technology. Journal of Chemical Society of Japan, 1983: 823-830 (1983); and ANZAI , J., et al Urea sensor based on ion sensitive field effect transistor coated with cross-1inked urease-albumin membrane, Bunseki Kagaku, 33: E131-E136 (1983)), Nakako et al. NAKAKO, M., et al, Neutral lipid enzyme electrode based on ion sensitive field effect transistors, Anal. Chim. Acta., 185: 179-185 (1986)), Mitsuka et al. ATP sensor using ATPase (GOTOH, M , et al. A microsensor for adenosine-5'-triphosphate pH-sensitive field effect transistors, Anal. Chim. Acta., 187: 287-291 (1986)), Tomita et al. Sensor (Ken Kawabe et al .: ISFET glucose sensor using thermophilic enzyme glucokinase from thermophilic orchid. Journal, 1987: 1719-1724 (1987)) and L-glutamate sensor using glutamine synthetase (Takenobu Iida et al .: ISFET-type L-glutamate sensor using thermophilic enzyme glutaminin synthetase, Journal of Chemical Society of Japan, 1987 , 1817-1821 (1987)), and Kanabe et al., Acetylcholine sensor based on ion sensitive field effect transistor and acetylcholine receptor, Anal. Lett., 20 : 857-870 (1987)), and alcohol sensors using microorganisms (KITAGAWA, Y, et al., Microbial-FET alcohol sensor, Anal. Lett., 20: 81-96 (1987)) . Recently, DNA sensors that immobilize single-stranded DNA on the surface of the gate insulating film and detect complementary unlabeled DNA with high sensitivity have been reported (SAKATA, T., M. KAMAHORI and Y. MIYAHARA, DNA Analysis Chip Based on Field Effect Transistors, Japanese J. Appl. Phys., 44 No. 4B, 2854-2859, (2005); SAKATA, T., and Y. MIYAHARA, Potentiometric detection of single nucleotide polymorphism using genetic field effect transistor, ChemBioChem, 6: 703-710, (2005); SAKATA, T., M. KAMAHORI and Y. MIYAHARA, Immobilization of oligonucleotide probes on Si3N4 surface and its application to genetic field effect transistor, Mat. Sci. Eng. C , 24: 827-832, (2004); JP-A-2006-275670; JP-A-2005-337771; JP-A-2005-218310; and JP-A-2005-77210)
本発明では、上記したような電界効果トランジスタセンサを用いることができる。 In the present invention, it may be used effect transistor sensor electric field as described above.
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。 The following examples further illustrate the present invention, but the present invention is not limited to the examples.
実施例１：抗Bisphenol A抗体のＶＨの調製
抗Bisphenol A抗体のＶＨは以下のように調製した。まず、ＶＨはマルトース結合蛋白質（以下、MBP）との融合蛋白質として発現させるために、そのcDNAをpMAL-P2G（New England Biolab社）のマルチクローニングサイト(EcoRI-HindIIIサイト間)に挿入した。その後，VH cDNAをその分泌シグナルを含むMBP遺伝子とともにPCR法で増幅した後、pET32ベクター（ノバジェン社）のNdeI-NotIサイト間に挿入した(pET-MBP-VH)。この融合蛋白質は、ＶＨがMBPのC末端にAsn-Ser-Ser-Ser-Asn-Asn-Asn-Asn-Asn-Asn-Asn-Asn-Leu-Gly-Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr-Valのアミノ酸配列を持つリンカーを介して融合されており、さらにＶＨのC末端にはHis-tagが付与されている。次に、pET-MBP-VH は、大腸菌BL21(DE3)pLysSケミカルコンピテントセル（ノバジェン社）にノバジェン社のプロトコールに従って導入された。形質変換された大腸菌は、４ml LB培地（100μg/mlアンピシリンおよび30 μg/mlクロラムフェニコール入り）中で一晩30℃にて培養後、800 ml LB培地（100μg/mlアンピシリンおよび30 μg/mlクロラムフェニコール入り）に植菌し、30℃にて培養した。600 nmにおける吸光度が0.6−0.7に達した時点で、Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosideを最終濃度0.4 mMになるように添加し、さらに25℃にて約10時間培養した。その後、培養上清及びペリプラズム画分から、それぞれ硫安沈殿及びスクロース浸透圧ショックによって回収されたMBP-ＶＨ融合蛋白質を、クロンテック社のコバルトキレートカラム、TALONを使いて精製を行った。蛋白質溶液は、50 mM Tris-HCl緩衝液（200 mM NaCl, 10% sucrose, pH8）へと溶媒を置換した後、容積800 μl、濃度約300 μg/mlと調節した。そこに5 μg genenase I（New England Biolabs）を加えて、20℃2時間反応させることで、MBP-ＶＨ間のリンカー部分を切断した。反応後ＶＨは、TALONを使いて精製を行い、さらに10% sucroseを含むPBSへと溶媒置換し、小分けして測定まで-80℃にて保存した。
Example 1: Preparation of anti-Bisphenol A antibody VH Anti-Bisphenol A antibody VH was prepared as follows. First, VH was inserted into a multicloning site (between EcoRI and HindIII sites) of pMAL-P2G (New England Biolab) for expression as a fusion protein with maltose binding protein (hereinafter referred to as MBP). Thereafter, VH cDNA was amplified by PCR together with the MBP gene containing the secretion signal, and then inserted between NdeI-NotI sites of pET32 vector (Novagen) (pET-MBP-VH). In this fusion protein, VH is at the C-terminus of MBP Asn-Ser-Ser-Ser-Asn-Asn-Asn-Asn-Asn-Asn-Asn-Asn-Leu-Gly-Pro-Gly-Ala-Ala-His- It is fused via a linker having the amino acid sequence of Tyr-Val, and a His-tag is added to the C-terminal of VH. Next, pET-MBP-VH was introduced into E. coli BL21 (DE3) pLysS chemical competent cell (Novagen) according to Novagen's protocol. The transformed E. coli was cultured in 4 ml LB medium (with 100 μg / ml ampicillin and 30 μg / ml chloramphenicol) at 30 ° C. overnight, and then with 800 ml LB medium (100 μg / ml ampicillin and 30 μg / ml). Inoculated ml chloramphenicol) and cultured at 30 ° C. When the absorbance at 600 nm reached 0.6-0.7, Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside was added to a final concentration of 0.4 mM and further cultured at 25 ° C. for about 10 hours. Thereafter, the MBP-VH fusion protein recovered from the culture supernatant and the periplasm fraction by ammonium sulfate precipitation and sucrose osmotic shock, respectively, was purified using a Clontech cobalt chelate column and TALON. The protein solution was adjusted to a volume of 800 μl and a concentration of about 300 μg / ml after replacing the solvent with 50 mM Tris-HCl buffer (200 mM NaCl, 10% sucrose, pH 8). 5 μg genenase I (New England Biolabs) was added thereto and reacted at 20 ° C. for 2 hours to cleave the linker part between MBP and VH. After the reaction, VH was purified using TALON, further solvent-replaced with PBS containing 10% sucrose, subdivided, and stored at −80 ° C. until measurement.
実施例２：抗Bisphenol A抗体のＶＬの調製
抗Bisphenol A抗体のＶＬとMBPの融合蛋白質の調製は、pET-MBP-VHのVH遺伝子部分をVL遺伝子と置き換えた発現ベクターであるpET-MBP-VLを用いてMBP-ＶＨ融合蛋白質と同様に行い、10% sucroseを含むPBSへと溶媒置換し、小分けして測定まで-80℃にて保存した。
Example 2 Preparation of VL of Anti-Bisphenol A Antibody Preparation of a fusion protein of VL and MBP of anti-Bisphenol A antibody was performed by pET-MBP-, an expression vector in which the VH gene part of pET-MBP-VH was replaced with the VL gene. This was performed in the same manner as the MBP-VH fusion protein using VL, and the solvent was replaced with PBS containing 10% sucrose, which was subdivided and stored at −80 ° C. until measurement.
実施例３：n-チャネルデプレッション型FETの作製
本実施例に用いたn-チャネルデプレッション型FETの作製過程を以下に示す。まず、６−１２Ωcmの抵抗率を有するN型シリコンにBF2+を注入エネルギー60 keV、ドーズ量2 x 1012 atom cm-2の条件でイオン注入することで、P型ウェルを形成し、さらに加湿条件下において８５０℃に加熱することによりゲート酸化膜を成長させた。次に、ソース及びドレイン領域をP+を注入エネルギー40 keV、ドーズ量5 x 1015 atom cm-2の条件下でイオン注入によって形成した。その後、厚さ１４０nm のSi3N4を７９０℃で減圧化学蒸着法によって蒸着した。さらに、ソース及びドレイン接点をAl-Cu-Siスパッタリングによって作製した。このウエハーは、水素雰囲気下で４５０℃、３０分間アニールさせた後、５ mm x ５ mmのチップを切り出し、フレキシブルプリント回路基盤上に設置し、側面を防水加工するためにエポキシ樹脂（ZC-203, ペルノックス株式会社）でコーティングした。
Example 3 Fabrication of n-Channel Depletion Type FET The fabrication process of the n-channel depletion type FET used in this example is described below. First, BF2 + is ion-implanted into N-type silicon having a resistivity of 6-12 Ωcm under the conditions of an implantation energy of 60 keV and a dose of 2 x 1012 atom cm-2 to form a P-type well. The gate oxide film was grown by heating to 850 ° C. in FIG. Next, source and drain regions were formed by ion implantation under conditions of P + implantation energy of 40 keV and a dose of 5 × 10 15 atom cm −2. Thereafter, Si 3 N 4 having a thickness of 140 nm was deposited at 790 ° C. by a low pressure chemical vapor deposition method. In addition, source and drain contacts were fabricated by Al-Cu-Si sputtering. This wafer was annealed in a hydrogen atmosphere at 450 ° C. for 30 minutes, then a 5 mm × 5 mm chip was cut out, placed on a flexible printed circuit board, and epoxy resin (ZC-203) for waterproofing the side. , Pernox Co., Ltd.).
本実施例で用いたFETは、ｎチャネルデプレッション型、そのゲート絶縁膜はSi3N4/SiO2であるものを用い(図１）、Si3N4層とSiO2層の厚さは、それぞれ140、35 nmであった。FETチップは、ゲート領域を除いて、エポシキ樹脂（ZC-203, Nippon Pelnox）で被膜した。FETの電気特性測定には、半導体パラメーターアナライザー（Agilent, 4155C）を用い、VG（ゲート電流）-ID（ドレイン/ソース間電流）伝達特性を評価した。電気的特性の評価には、Ag/AgCl参照電極と塩橋を用いてゲート電圧を印加した。 The FET used in this example is an n-channel depletion type, and its gate insulating film is Si 3 N 4 / SiO 2 (FIG. 1). The thickness of the Si 3 N 4 layer and the SiO 2 layer is They were 140 and 35 nm, respectively. The FET chip was coated with epoxy resin (ZC-203, Nippon Pelnox) except for the gate region. The electrical characteristic measuring the FET, using a semiconductor parameter analyzer (Agilent, 4155C), were evaluated V G (gate current) -I D (drain / source current) transfer characteristics. For evaluation of electrical characteristics, a gate voltage was applied using an Ag / AgCl reference electrode and a salt bridge.
実施例４：FETのゲート絶縁膜表面（Si3N4）へのＶＨ断片の固定化
FETのゲート絶縁膜表面（Si3N4）へのＶＨ断片の固定化は以下のように行った。まず、Si3N4絶縁膜表面を洗浄するために、プラズマ表面処理を行った。その後、2質量％ 3-amino-propyltriethoxysilane (Sigma-Aldrich)を含む純水溶液に室温下で4時間浸漬し、さらに純水でリンスした後、110℃で1時間乾燥させ、ゲート表面にアミノ基を導入した。そこに、150μg/ml ＶＨと10 mg/ml 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (WSC)を含むPBSバッファーを加え、ゲート表面のアミノ基とＶＨ表面のアスパラギン酸とグルタミン酸に由来するカルボキシル基との間でカップリング反応を室温で一晩行った。反応後、脱イオン水で洗浄した後にBovine Serum Albumin (BSA)溶液を加えてブロッキングを行った。また、参照実験用として、ＶＨの代わりにBSAを固定化したゲートを同様に作製した。
Example 4: Immobilization of VH fragments on the gate insulating film surface (Si 3 N 4 ) of an FET
Immobilization of VH fragments on the gate insulating film surface (Si 3 N 4 ) of FET was performed as follows. First, plasma surface treatment was performed to clean the surface of the Si 3 N 4 insulating film. After that, it is immersed in a pure aqueous solution containing 2% by mass of 3-amino-propyltriethoxysilane (Sigma-Aldrich) at room temperature for 4 hours, rinsed with pure water, dried at 110 ° C. for 1 hour, and amino groups are formed on the gate surface. Introduced. A PBS buffer containing 150 μg / ml VH and 10 mg / ml 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride (WSC) was added to the amino group on the gate surface, aspartic acid and glutamic acid on the VH surface. The coupling reaction with the derived carboxyl group was carried out overnight at room temperature. After the reaction, it was washed with deionized water and then blocked by adding a Bovine Serum Albumin (BSA) solution. In addition, for reference experiments, a gate in which BSA was immobilized instead of VH was similarly produced.
実施例５：オープンサンドイッチFETによる測定
オープンサンドイッチ反応では、あらかじめMBP-ＶＬ溶液（約150μg/ml）に抗原であるBisphenol Aを最終濃度が0.1もしくは1 mMとなるように加えた後に、ＶＨもしくはBSAを固定化したゲート表面に添加した。約1時間反応させた後に、25 mMリン酸バッファーで洗浄し、FETのVG-ID伝導特性を計測した。その結果、図２に示すようなVG-ID特性が得られ、ID一定（700μA）条件下では、抗原100μM存在下でのオープンサンドイッチ反応前後で、しきい値電圧VTが正方向に約+7.7 mVシフトしていることがわかる。正方向へのシフトからゲート絶縁膜表面には負電荷が誘起されていることがわかる。これは、MBPがマイナス電荷に帯電していることと一致する。また、より抗原濃度が高い時には、しきい値電圧変化はより大きく（約+40 mV）、MBP-ＶＬの代わりにBSAを固定化した場合には、ほとんど有意なしきい値電圧変化が観測されなかった（図３）。これらの結果から、抗原濃度としきい値電圧変化に良好な相関関係が示され、オープンサンドイッチ・イムノアッセイのFETによる検出の妥当性が明らかとなった。
Example 5: Measurement with open sandwich FET In the open sandwich reaction, Bisphenol A, an antigen, was added to an MBP-VL solution (about 150 μg / ml) in advance to a final concentration of 0.1 or 1 mM, and then VH or BSA. Was added to the immobilized gate surface. After about 1 hour of reaction, and washed with 25 mM phosphate buffer was measured V G -I D conduction characteristics of the FET. As a result, obtained V G -I D characteristic as shown in FIG. 2, the I D constant (700μA) conditions, before and after the open sandwich reaction in the presence of an antigen 100 [mu] M, the threshold voltage V T is positive It can be seen that the shift is about +7.7 mV. It can be seen from the shift in the positive direction that negative charges are induced on the surface of the gate insulating film. This is consistent with the negative charge of MBP. When the antigen concentration is higher, the threshold voltage change is larger (about +40 mV). When BSA is immobilized instead of MBP-VL, almost no significant threshold voltage change is observed. (FIG. 3). These results showed a good correlation between antigen concentration and threshold voltage change, and the validity of open sandwich immunoassay detection with FETs became clear.
Claims (5)
（ａ）目的物質を特異的に認識する抗体のＶＨ領域を含むポリペプチド（Ａ）又は目的物質を特異的に認識する抗体のＶＬ領域を含むポリペプチド（Ｂ）の何れか一方が固定化された、電界効果トランジスタのゲート部に、ポリペプチド（Ａ）又はポリペプチド（Ｂ）の何れか他方、及び目的物質を接触させることによって、ポリペプチド（Ａ）、ポリペプチド（Ｂ）、及び目的物質からなる複合体を形成させる工程：及び
（ｂ）工程（ａ）で形成された複合体を電界効果トランジスタセンサにより測定する工程：
を含む上記の測定方法。 In the measurement method of the target substance,
( A) Either a polypeptide (A) containing an antibody VH region specifically recognizing a target substance or a polypeptide (B) containing an antibody VL region specifically recognizing a target substance is immobilized. and, to the gate of the field effect transistor, the other of the polypeptide (a) or polypeptide (B), and by contacting the target substance, polypeptide (a), polypeptide (B), and the target substance step to form a complex consisting of: and (b) steps (a) the formed step is measured by the electric field effect transistor sensor complex:
A measurement method as described above.
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