JP4930735B2 - 比内地鶏を識別するためのツールおよびその利用 - Google Patents

Description

本発明は、比内地鶏と他の鶏とを識別するツールおよびその利用に関するものであり、特に、ゲノム配列内の特定領域を利用して比内地鶏を検出するためのツールおよびその利用に関する。

秋田県北東部比内地方の原産種である比内鶏は、もともと食用として珍重されていたが、個体数が減少したために、天然記念物として保護されるようになった。そこで、比内地鶏が、比内鶏に代わる流通可能な肉用鶏として、秋田県畜産試験場において作出された。

比内地鶏は、比内鶏の雄とロードアイランドレッド種等の雌との一代交雑鶏である、秋田県の地域特産鶏（地鶏）である。安全面、品質面に優れた商品である地鶏肉の需要が近年高まっており、比内地鶏もまた関東圏を中心として供給量が増えてきている。

比内地鶏の供給量が増加するにつれて、流通過程における比内鶏肉以外の鶏肉の混入が懸念されるようになった。しかし、外見で比内鶏肉を他の鶏肉と区別することは難しい。そのため、消費者のみならず、生産者からも科学的根拠に基づいた地鶏肉の識別手法の開発が求められている。「ＢＴ戦略大綱」においても、「食品に関する表示項目を科学的に検証するため、品種・産地判別技術を開発する」と謳われており、地鶏肉判別技術の開発は、積極的に取り組むべき重要課題といえる。

さて、品種間の識別方法としてはＤＮＡを用いる技術が知られており、以下のような品種に適用されている：黒毛和種（特許文献１）；鹿児島黒豚（特許文献２、特許文献３）；イチゴ（特許文献４、特許文献５）；レタス（特許文献６）；大麦または麦芽（特許文献７）；イグサ（特許文献８、特許文献９、特許文献１０）；イネ（特許文献１０）；および名古屋コーチン（非特許文献１）。

非特許文献１に記載の名古屋コーチンのＤＮＡ識別法では、名古屋コーチンにおいて遺伝的に固定されているマイクロサテライトマーカーを用いて、鶏が名古屋コーチンであるか否かを判断している。マイクロサテライトマーカーは、マイクロサテライトＤＮＡマーカーとも呼ばれ、ゲノム中に散在する、単純な塩基配列の繰り返し領域のことである。この領域の長さは繰り返し数に依存して多様であることが知られている。なお、非特許文献１にて用いられているマイクロサテライトマーカーは、公知のマイクロサテライトマーカーから選定されたものである（非特許文献２参照）。

近年、鶏ゲノムの解析により、多くのマイクロサテライトが同定されており、マイクロサテライト部位の両側に位置する特異的な塩基配列を含むマイクロサテライトマーカーが開発された。鶏のマイクロサテライトマーカーをＰＣＲ等の遺伝子増幅法で検出するための特異的な塩基配列が、プライマー配列として公開されている（非特許文献２および非特許文献３参照）。

特開２００２−２０９５８１号公報（平成１４年７月３０日公開） 特開２０００−３５０５８６号公報（平成１２年１２月１９日公開） 特開２００４−１５４０２４号公報（平成１６年６月３日公開） 特開２００５−１０２５３５号公報（平成１７年４月２１日公開） 特開２００５−２７８４７７号公報（平成１７年１０月１３日公開） 特開平７−２３７８５号公報（平成７年１月２７日公開） 特開平８−８９２９８号公報（平成８年４月９日公開） 特開２００５−１６８３０９号公報（平成１７年６月３０日公開） 特開２００３−２４５０７１号公報（平成１５年９月２日公開） 特開２００５−１６８３１０号公報（平成１７年６月３０日公開）

中村明弘、「名古屋コーチンのＤＮＡ識別法を開発」、鶏卵肉情報、２００６年５月２５日号、ｐ１６−１９ Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． "Ａ ｃｈｉｃｋｅｎ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅｄ ｏｎ ａ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｇａｍｅ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ Ｌｅｇｈｏｒｎ ｃｒｏｓｓ" Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２００５， ｖｏｌ．３６， ｐｐ．４６３−４６７ Ｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ． "Ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｃｈｉｃｋｅｎｓ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ＤＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ： Ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｂｒｅｅｄｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ Ｋｏｃｈｉ Ｐｒｅｆｅｃｔｕｒｅ， Ｊａｐａｎ" Ａｓｉａｎ−ａｕｓｔｒａｌａｓｉａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００５， ｖｏｌ．１８， ｎｏ．６， ｐｐ．７５５−７６１

しかしながら、上述した方法はすべて、純粋品種を識別する方法である。例えば、特許文献１に記載の方法は、黒毛和種（純粋品種）と、黒毛和種およびホルスタインの雑種とを識別する方法であり、非特許文献１に記載の方法は、名古屋コーチン（純粋品種）とその他の鶏とを識別する方法である。

純粋品種であれば、遺伝的に固定しているマーカーを品種識別に利用することが可能である。しかし、比内地鶏は、前述したように一代交雑鶏であり、一代交雑鶏の場合、そもそも、該交雑鶏から次世代の交雑鶏が生み出されないので、遺伝的に固定しているマーカーというものが存在しない。よって、純粋品種を識別する方法を比内地鶏の識別にそのまま利用することはできない。

本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、比内地鶏を他の鶏と識別する技術を提供することにある。

一代交雑鶏である比内地鶏では、該交雑鶏から次世代の交雑鶏が生み出されるわけではなく、遺伝的に固定しているマーカーというものは存在しない。また、片方の親の品種において遺伝的に固定されているマーカーが存在しても、もう一方の親の遺伝子を有しているので、子において検出されるマーカーは固定されない。

本発明者らは、鋭意検討の結果、一代交雑鶏である比内地鶏の検出に用いることができるＤＮＡマーカーを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明に係るプライマーセットは、比内地鶏を検出するためのＤＮＡマーカーを増幅する、第９のプライマーおよび第１０のプライマーからなる第５のプライマーセットであって、第９のプライマーは、配列番号１４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるか、または配列番号１４の相補配列にハイブリダイズし得かつＴｍ値が５０℃以上であるオリゴヌクレオチドであり、第１０のプライマーは、配列番号１５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるか、または配列番号１５の相補配列にハイブリダイズし得かつＴｍ値が５０℃以上であるオリゴヌクレオチドであることを特徴としている。

本発明に係るプライマーセットにおいて、第９のプライマーは、配列番号１４に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよく、第１０のプライマーは、配列番号１５に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよい。

本発明に係るＤＮＡマーカーは、比内地鶏を検出するためのＤＮＡマーカーであって、（Ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または（Ｂ）鶏のゲノムＤＮＡから、第５のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチド、を含む、長さが１０００塩基以下のポリヌクレオチドであることを特徴としている。

本発明に係る比内地鶏の検出方法は、第５のプライマーセットを用いて鶏のゲノムＤＮＡを増幅する増幅工程を包含することを特徴としている。

本発明に係る比内地鶏の検出方法はまた、上記増幅工程によって得られたポリヌクレオチドと、配列番号５に示される塩基配列からなる参照用ポリヌクレオチドとを比較する比較工程を包含することが好ましい。

上記本発明に係る比内地鶏の検出方法において、上記比較工程は、上記増幅工程によって得られたポリヌクレオチドの中に、上記参照用ポリヌクレオチドと塩基数が等しいポリヌクレオチドが存在するか否かを判定するサブ工程を包含してもよい。

本発明に係る比内地鶏の検出キットはまた、第５のプライマーセットを備えていることを特徴としている。

本発明に係る比内地鶏の検出キットはまた、配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに備えていてもよい。

本発明に係るプライマーセットはまた、比内地鶏を検出するためのＤＮＡマーカーを増幅する、第１のプライマーおよび第２のプライマーからなる第１のプライマーセットであってもよく、第１のプライマーは、配列番号６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるか、または配列番号６の相補配列にハイブリダイズし得かつＴｍ値が５０℃以上であるオリゴヌクレオチドであり、第２のプライマーは、配列番号７に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるか、または配列番号７の相補配列にハイブリダイズし得かつＴｍ値が５０℃以上であるオリゴヌクレオチドであることを特徴としている。

本発明に係るプライマーセットにおいて、第１のプライマーは、配列番号６に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよく、第２のプライマーは、配列番号７に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよい。

本発明に係るＤＮＡマーカーはまた、比内地鶏を検出するためのＤＮＡマーカーであって、（Ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または（Ｂ）鶏のゲノムＤＮＡから、第１のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチド、を含む、長さが１０００塩基以下のポリヌクレオチドであってもよい。

本発明に係る比内地鶏の検出方法は、第１のプライマーセットを用いて鶏のゲノムＤＮＡを増幅する増幅工程を包含する方法であってもよい。

本発明に係る比内地鶏の検出方法は、上記増幅工程によって得られたポリヌクレオチドと、配列番号１に示される塩基配列からなる参照用ポリヌクレオチドとを比較する比較工程をさらに包含することが好ましい。

本発明に係る比内地鶏の検出方法において、上記比較工程は、上記増幅工程によって得られたポリヌクレオチドの中に、上記参照用ポリヌクレオチドと塩基数が等しいポリヌクレオチドが存在するか否かを判定するサブ工程を包含してもよい。

本発明に係る比内地鶏の検出キットはまた、第１のプライマーセットを備えているキットであってもよい。

本発明に係る比内地鶏の検出キットは、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに備えていてもよい。

本発明に係るプライマーセットはまた、比内地鶏を検出するためのＤＮＡマーカーを増幅する、第３のプライマーおよび第４のプライマーからなる第２のプライマーセットであってもよく、第３のプライマーは、配列番号８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるか、または配列番号８の相補配列にハイブリダイズし得かつＴｍ値が５０℃以上であるオリゴヌクレオチドであり、第４のプライマーは、配列番号９に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるか、または配列番号９の相補配列にハイブリダイズし得かつＴｍ値が５０℃以上であるオリゴヌクレオチドであることを特徴としている。

本発明に係るプライマーセットにおいて、第３のプライマーは、配列番号８に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよく、第４のプライマーは、配列番号９に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよい。

本発明に係るＤＮＡマーカーはまた、比内地鶏を検出するためのＤＮＡマーカーであって、（Ａ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または（Ｂ）鶏のゲノムＤＮＡから、第２のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチド、を含む、長さが１０００塩基以下のポリヌクレオチドであってもよい。

本発明に係る比内地鶏の検出方法は、第２のプライマーセットを用いて鶏のゲノムＤＮＡを増幅する増幅工程を包含する方法であってもよい。

本発明に係る比内地鶏の検出方法はまた、上記増幅工程によって得られたポリヌクレオチドと、配列番号２に示される塩基配列からなる参照用ポリヌクレオチドとを比較する比較工程をさらに包含することが好ましい。

本発明に係る比内地鶏の検出方法において、上記比較工程は、上記増幅工程によって得られたポリヌクレオチドの中に、上記参照用ポリヌクレオチドと塩基数が等しいポリヌクレオチドが存在するか否かを判定するサブ工程を包含してもよい。

本発明に係る比内地鶏の検出キットはまた、第２のプライマーセットを備えているキットであってもよい。

本発明に係る比内地鶏の検出キットはまた、配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに備えていてもよい。

本発明に係るプライマーセットはまた、比内地鶏を検出するためのＤＮＡマーカーを増幅する、第５のプライマーおよび第６のプライマーからなる第３のプライマーセットであってもよく、第５のプライマーは、配列番号１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるか、または配列番号１０の相補配列にハイブリダイズし得かつＴｍ値が５０℃以上であるオリゴヌクレオチドであり、第６のプライマーは、配列番号１１に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるか、または配列番号１１の相補配列にハイブリダイズし得かつＴｍ値が５０℃以上であるオリゴヌクレオチドであることを特徴としている。

本発明に係るプライマーセットにおいて、第５のプライマーは、配列番号１０に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよく、第６のプライマーは、配列番号１１に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよい。

本発明に係るＤＮＡマーカーはまた、比内地鶏を検出するためのＤＮＡマーカーであって、（Ａ）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または（Ｂ）鶏のゲノムＤＮＡから、第３のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチド、を含む、長さが１０００塩基以下のポリヌクレオチドであってもよい。

本発明に係る比内地鶏の検出方法は、第３のプライマーセットを用いて鶏のゲノムＤＮＡを増幅する増幅工程を包含する方法であってもよい。

本発明に係る比内地鶏の検出方法はまた、上記増幅工程によって得られたポリヌクレオチドと、配列番号３に示される塩基配列からなる参照用ポリヌクレオチドとを比較する比較工程をさらに包含することが好ましい。

上記本発明に係る比内地鶏の検出方法において、上記比較工程は、上記増幅工程によって得られたポリヌクレオチドの中に、上記参照用ポリヌクレオチドと塩基数が等しいポリヌクレオチドが存在するか否かを判定するサブ工程を包含してもよい。

本発明に係る比内地鶏の検出キットはまた、第３のプライマーセットを備えているキットであってもよい。

本発明に係る比内地鶏の検出キットはまた、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに備えていてもよい。

本発明に係るプライマーセットはまた、比内地鶏を検出するためのＤＮＡマーカーを増幅する、第７のプライマーおよび第８のプライマーからなる第４のプライマーセットであってもよく、第７のプライマーは、配列番号１２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるか、または配列番号１２の相補配列にハイブリダイズし得かつＴｍ値が５０℃以上であるオリゴヌクレオチドであり、第８のプライマーは、配列番号１３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるか、または配列番号１３の相補配列にハイブリダイズし得かつＴｍ値が５０℃以上であるオリゴヌクレオチドであることを特徴としている。

本発明に係るプライマーセットにおいて、第７のプライマーは、配列番号１２に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよく、第８のプライマーは、配列番号１３に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよい。

本発明に係るＤＮＡマーカーはまた、比内地鶏を検出するためのＤＮＡマーカーであって、（Ａ）配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または（Ｂ）鶏のゲノムＤＮＡから、第４のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチド、を含む、長さが１０００塩基以下のポリヌクレオチドであってもよい。

本発明に係る比内地鶏の検出方法は、第４のプライマーセットを用いて鶏のゲノムＤＮＡを増幅する増幅工程を包含する方法であってもよい。

本発明に係る比内地鶏の検出方法はまた、上記増幅工程によって得られたポリヌクレオチドと、配列番号４に示される塩基配列からなる参照用ポリヌクレオチドとを比較する比較工程をさらに包含することが好ましい。

上記本発明に係る比内地鶏の検出方法において、上記比較工程は、上記増幅工程によって得られたポリヌクレオチドの中に、上記参照用ポリヌクレオチドと塩基数が等しいポリヌクレオチドが存在するか否かを判定するサブ工程を包含してもよい。

本発明に係る比内地鶏の検出キットはまた、第４のプライマーセットを備えているキットであってもよい。

本発明に係る比内地鶏の検出キットはまた、配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに備えていてもよい。

本発明に係るＤＮＡマーカーは、その長さが比内鶏において遺伝的に固定している。すなわち、本発明に係る比内地鶏の検出方法および検出キットは、検出対象となる鶏ではなく、その親となる鶏の品種において遺伝的に固定しているＤＮＡマーカーを利用している。非特許文献１に記載の方法は、遺伝的に固定しているマーカーではないＤＮＡマーカーが検出された場合に、検査した鶏が目的の鶏ではないと判定する方法である。一方、本発明に係る比内地鶏の検出方法および検出キットは、遺伝的に固定しているマーカーが全く検出されない場合に、検査した鶏が目的の鶏ではないと判定する方法である。なお、本発明に係るＤＮＡマーカーは、本発明に係るプライマーキットを用いることにより取得し得る。

また、本発明に係るＤＮＡマーカーは、非特許文献１に記載の方法とは異なり、公知のマーカーではなく、新規に見出されたマーカーである。本発明に係るＤＮＡマーカーは、Ｚ染色体上に存在する領域を増幅することによって取得されるので、雌の鶏についての識別率を向上させることができる。

このように、本発明を用いれば、比内地鶏を他の鶏とを識別することができる。

〔１：プライマーセット〕
一つの局面において、本発明はプライマーセットを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「プライマーセット」は、増幅される塩基配列の５’末端とハイブリダイズするフォワードプライマーと、増幅されるその配列の３’末端の相補物とハイブリダイズするリバースプライマーとを含む一組のプライマーが意図される。用語「プライマー」は、ヌクレオシド三リン酸やＤＮＡポリメラーゼ等（ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素であってもよい。）の存在下で、ＤＮＡ合成の開始点として作用し得る一本鎖オリゴヌクレオチドが意図される。プライマーとして適切な長さは、典型的には、１５〜３０ヌクレオチドであり得るが、使用される態様によって異なり得る。また、プライマーおよび鋳型が安定な複合体を形成するためには、典型的には低い温度が必要とされる。なお、当業者は、採用される態様に応じて適切な長さのプライマーを容易に設計し得る。

本発明に係るプライマーセットを用いて鶏のゲノムＤＮＡを増幅することにより、後述する本発明に係るＤＮＡマーカーを取得することができる。得られるべきＤＮＡマーカーは、比内鶏ではその長さが遺伝的に固定されており、他の鶏ではその長さは多様である。本発明によって提供される技術は、上記ＤＮＡマーカーが所望の長さを有しているか否かに基づくものであり、増幅された配列におけるミスマッチの有無は考慮される必要がない。

鶏のゲノムＤＮＡは、鶏の組織または血液から調製することができる。鶏の組織は、例えば、鶏肉、骨付きの手羽および各種の内臓等であり得るが、これらに限られず、ゲノムＤＮＡを抽出可能な体組織であればよい。

鶏の組織からゲノムＤＮＡを調製する場合は、例えば、以下のような方法を用いることができる。まず、組織をハサミ等で細かく切断し、ポッターホモジナイザー等によりホモジナイズした後、遠心分離機を用いて核を沈殿させる。沈殿した核にＳＤＳおよびプロテイナーゼＫを加えた後インキュベートする。続いて、周知のフェノールクロロホルム抽出法を用いてゲノムＤＮＡを抽出する。

また、鶏の血液からゲノムＤＮＡを調製する場合は、例えば、以下のような方法を用いることができる。まず血液に、生理的ＮａＣｌ濃度（約０．９％）より、低張な赤血球溶解液（例えば、０．５％ＮａＣｌ）を加えてインキュベートし、遠心分離した後に上清を取り除く。沈殿した核にＳＤＳおよびプロテイナーゼＫを加えインキュベートする。続いて、周知のフェノールクロロホルム抽出法を用いてゲノムＤＮＡを抽出する。

本発明に係るプライマーセットを用いて鶏のゲノムＤＮＡを増幅することは、例えば、周知のＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応により行うことができるが、これに限られない。

ＰＣＲ反応は、市販のサーマルサイクラー（例えば、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（アプライドバイオシステムズ）、あるいは、ｉＣｙｃｌｅｒサーマルサイクラー（バイオ・ラド））を用いて行うことができる。また、ＰＣＲ用の試薬も市販されたものを用いることができる。上記サーマルサイクラーの操作は、添付された指示書に従えばよいが、例えば、ＤＮＡを変性させる温度として９４℃、ＤＮＡをアニーリングさせる温度として５０〜６０℃、ＤＮＡの伸展反応をさせる温度として６８℃を用いることができる。

本発明は、第１、第２、第３、第４および第５のプライマーセットを提供する。上述したように、本発明に係るプライマーセットは目的の領域を増幅し得るものであればよく、目的の領域中の配列を正確に増幅する必要がない。よって、本発明に係るプライマーセットに含まれるプライマーは、ハイブリダイズすべき塩基配列に対して完全に相補である必要はなく、目的の領域を増幅し得る限りミスマッチを含んでいてもよい。よって、上記プライマーは、Ｔｍ値が５０℃以上であることが好ましく、５５℃以上であることがより好ましく、６０℃以上であることがさらに好ましく、６５℃以上であってもよい。

第１のプライマーセットは、第１のプライマーおよび第２のプライマーからなる。一つの実施形態において、第１のプライマーは、配列番号６に示される塩基配列の相補配列にハイブリダイズし得、かつＴｍ値が５０℃以上であるオリゴヌクレオチドであってもよく、第２のプライマーは、配列番号７に示される塩基配列の相補配列にハイブリダイズし得、かつＴｍ値が５０℃以上であるオリゴヌクレオチドである。好ましくは、第１のプライマーは配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第２のプライマーは配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり得る。

第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いて、鶏のゲノムＤＮＡを増幅することにより、〔２〕において後述する第１のＤＮＡマーカーを取得することができる。

第２のプライマーセットは、第３のプライマーおよび第４のプライマーからなる。一つの実施形態において、第３のプライマーは、配列番号８に示される塩基配列の相補配列にハイブリダイズし得、かつＴｍ値が５０℃以上であるオリゴヌクレオチドであってもよく、第４のプライマーは、配列番号９に示される塩基配列の相補配列にハイブリダイズし得、かつＴｍ値が５０℃以上であるオリゴヌクレオチドである。好ましくは、第３のプライマーは配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第４のプライマーは配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり得る。

第３のプライマーおよび第４のプライマーを用いて、鶏のゲノムＤＮＡを増幅することにより、〔２〕において後述する第２のＤＮＡマーカーを取得することができる。

第３のプライマーセットは、第５のプライマーおよび第６のプライマーからなる。一つの実施形態において、第５のプライマーは、配列番号１０に示される塩基配列の相補配列にハイブリダイズし得、かつＴｍ値が５０℃以上であるオリゴヌクレオチドであってもよく、第６のプライマーは、配列番号１１に示される塩基配列の相補配列にハイブリダイズし得、かつＴｍ値が５０℃以上であるオリゴヌクレオチドである。好ましくは、第５のプライマーは配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第６のプライマーは配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり得る。

第５のプライマーおよび第６のプライマーを用いて、鶏のゲノムＤＮＡを増幅することにより、〔２〕において後述する第３のＤＮＡマーカーを取得することができる。

第４のプライマーセットは、第７のプライマーおよび第８のプライマーからなる。一つの実施形態において、第７のプライマーは、配列番号１２に示される塩基配列の相補配列にハイブリダイズし得、かつＴｍ値が５０℃以上であるオリゴヌクレオチドであってもよく、第８のプライマーは、配列番号１３に示される塩基配列の相補配列にハイブリダイズし得、かつＴｍ値が５０℃以上であるオリゴヌクレオチドである。好ましくは、第７のプライマーは配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第８のプライマーは配列番号１３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり得る。

第７のプライマーおよび第８のプライマーを用いて、鶏のゲノムＤＮＡを増幅することにより、〔２〕において後述する第４のＤＮＡマーカーを取得することができる。

第５のプライマーセットは、第９のプライマーおよび第１０のプライマーからなる。一つの実施形態において、第９のプライマーは、配列番号１４に示される塩基配列の相補配列にハイブリダイズし得、かつＴｍ値が５０℃以上であるオリゴヌクレオチドであってもよく、第８のプライマーは、配列番号１５に示される塩基配列の相補配列にハイブリダイズし得、かつＴｍ値が５０℃以上であるオリゴヌクレオチドである。好ましくは、第９のプライマーは配列番号１４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第１０のプライマーは配列番号１５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。

第９のプライマーおよび第１０のプライマーを用いて、鶏のゲノムＤＮＡを増幅することにより、後述する第５のＤＮＡマーカーを取得することができる。

当業者は、本明細書中に示される塩基配列を参照すれば上記各オリゴヌクレオチドを容易に取得し得る。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４）３９２型シンセサイザーなどを用いれば、所定の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成することができる。

また、上述したプライマーが、ハイブリダイズすべき塩基配列に対して完全に相補である必要がないという観点から、本発明に係るプライマーセットに含まれるプライマーは、目的の領域を増幅し得るプライマーであって、配列表に示された塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。

すなわち、第１のプライマーは、配列番号６に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよく、第２のプライマーは、配列番号７に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよく、第３のプライマーは、配列番号８に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよく、第４のプライマーは、配列番号９に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよく、第５のプライマーは、配列番号１０に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよく、第６のプライマーは、配列番号１１に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよく、第７のプライマーは、配列番号１２に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよく、第８のプライマーは、配列番号１３に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよく、第９のプライマーは、配列番号１４に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよく、第１０のプライマーは、配列番号１５に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよい。

本明細書中に記載の技術および周知慣用技術を用いれば、当業者は、示された塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを、容易に作製することができる。また、当業者は、明細書中に記載の手法に従えば、作製したオリゴヌクレオチドが所望の性質を有しているか否かを容易に調べることができる。

〔２：ＤＮＡマーカー〕
一つの局面において、本発明は比内地鶏を検出するためのＤＮＡマーカーを提供する。

本明細書において「比内地鶏の検出」とは、検査すべき鶏または鶏由来の物質が比内地鶏または比内地鶏由来の物質であるか否かを判定することが意図される。

本発明に係るＤＮＡマーカーは、比内鶏ではその長さが遺伝的に固定しているものであることを特徴とする。すなわち、鶏の本発明に係るＤＮＡマーカーを取得することにより、検査した鶏が、比内鶏を先祖に持つ可能性があるか否かを判別することができる。

本発明に係るＤＮＡマーカーはまた、該ＤＮＡマーカーに対応する領域が、鶏のＺ染色体上に存在することを特徴としている。なお、本明細書において「ＤＮＡマーカーに対応する領域」とは、ゲノムＤＮＡ上において、ＤＮＡマーカーの有する塩基配列と同じ塩基配列を有する領域が意図される。

鶏のＺ染色体は性染色体であり、雌は一つしか有していない。そのため、雌の鶏は本発明に係るＤＮＡマーカーを一種類のみ有する。したがって、より効率的に比内地鶏の検出をすることができる。なお、Ｚ染色体上のＤＮＡマーカーを用いることは本発明者ら独自の観点に基づくものである。

なお、以上に述べた比内地鶏の検出に関する事項は、後述する比内地鶏の検出方法の説明において詳細に記述する。

本発明は、第１、第２、第３、第４および第５のＤＮＡマーカーを提供する。

第１のＤＮＡマーカーは、鶏のゲノムＤＮＡから、第１のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドを含む、長さが１０００塩基以下のポリヌクレオチドである。好ましくは、鶏のゲノムＤＮＡから、第１のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドである。より好ましくは、第１のＤＮＡマーカーは、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、比内鶏のゲノムＤＮＡから、第１のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドであり得る。

後述する実施例に示すように、鶏のゲノムＤＮＡから、第１のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドは、比内鶏においては、同じ長さを示し、他の鶏においては様々な長さを示す。したがって、上記ポリヌクレオチドを一部に含むポリヌクレオチドも、比内鶏においては、同じ長さを示し、他の鶏においては様々な長さを示す蓋然性が高い。このようなポリヌクレオチドであれば、本発明に係るＤＮＡマーカーとして好適に用いることができる。上記ポリヌクレオチドは、例えば、鶏のゲノムＤＮＡにおいて、第１のプライマーセットによって挟まれた領域の外側に位置する塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることにより増幅することができる。本明細書の記載および鶏のゲノムシーケンス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｇａｌｌｕｓ＿ｇａｌｌｕｓ／およびｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｅｓｅ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ？ｏｒｇ＝Ｃｈｉｃｋｅｎ＆ｄｂ＝０＆ｈｇｓｉｄ＝３０９４８９０８にて公開）を参照すれば上記プライマーを容易に設計することができることを、当業者は容易に理解する。ただし、上記ＤＮＡマーカーの長さが１０００塩基を超えると、該ＤＮＡマーカーの長さを正確に測定することができない。そのため、第１のＤＮＡマーカーの長さは、１０００塩基以下であることが好ましい。

第２のＤＮＡマーカーは、鶏のゲノムＤＮＡから、第２のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドを含む、長さが１０００塩基以下のポリヌクレオチドである。好ましくは、鶏のゲノムＤＮＡから、第２のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドである。より好ましくは、第２のＤＮＡマーカーは、配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、比内鶏のゲノムＤＮＡから、第２のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドであり得る。

第３のＤＮＡマーカーは、鶏のゲノムＤＮＡから、第３のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドを含む、長さが１０００塩基以下のポリヌクレオチドである。好ましくは、鶏のゲノムＤＮＡから、第３のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドである。より好ましくは、第３のＤＮＡマーカーは、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、比内鶏のゲノムＤＮＡから、第３のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドであり得る。

第４のＤＮＡマーカーは、鶏のゲノムＤＮＡから、第４のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドを含む、長さが１０００塩基以下のポリヌクレオチドである。好ましくは、鶏のゲノムＤＮＡから、第４のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドである。より好ましくは、第４のＤＮＡマーカーは、配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、比内鶏のゲノムＤＮＡから、第４のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドであり得る。

第５のＤＮＡマーカーは、鶏のゲノムＤＮＡから、第５のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドを含む、長さが１０００塩基以下のポリヌクレオチドである。好ましくは、鶏のゲノムＤＮＡから、第５のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドである。より好ましくは、第５のＤＮＡマーカーは、配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、比内鶏のゲノムＤＮＡから、第５のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドであり得る。

〔３：検出方法〕
一つの局面において、本発明は、比内地鶏の検出方法を提供する。

本発明に係る比内地鶏の検出方法は、鶏のゲノムＤＮＡを、上述したプライマーセットを用いて増幅する工程を包含することを特徴としている。

一つの実施形態において、本発明に係る比内地鶏の検出方法は、第１のプライマーセットを用いて鶏のゲノムＤＮＡを増幅する増幅工程を包含する。上記増幅工程により、第１のＤＮＡマーカーを取得することができる。そのため、本実施形態に係る検出方法は、比内地鶏の検出に好適に用いることができる。

本実施形態に係る検出方法は、該増幅工程によって得られたポリヌクレオチドと、配列番号１に示される塩基配列からなる参照用ポリヌクレオチドとを比較する比較工程をさらに包含することが好ましい。上記参照用ポリヌクレオチドは、比内鶏のゲノムＤＮＡから、第１のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドであり得る。なお、前述したように、比内鶏のゲノムＤＮＡから、第１のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドは、遺伝的に固定されており、常に一定の長さを有している。なお、上記比較工程は、両ポリヌクレオチドの長さが一致するか否かを判定することが好ましいが、両ポリヌクレオチドの配列が一致するか否かを判定するものであってもよい。

前述したように、比内地鶏は、比内鶏の雄とロードアイランドレッド種の鶏の雌との一代交雑鶏である。したがって、比内地鶏は、比内鶏のＺ染色体を一本受け継いでいる。そのため、比内地鶏のゲノムＤＮＡから第１のプライマーセットを用いて増幅されたポリヌクレオチドは、上記参照用ポリヌクレオチドを同じ長さのポリヌクレオチドを必ず含む。したがって、ゲノムＤＮＡから第１のプライマーセットを用いて増幅されたポリヌクレオチドに、上記参照用ポリヌクレオチドを同じ長さのポリヌクレオチドを全く含まない鶏は、比内地鶏ではないと否定することができる。さらに、鶏が雌であれば、Ｚ染色体は一本しか有していないため、比内鶏ではない鶏のゲノムＤＮＡから第１のプライマーセットを用いて増幅されたポリヌクレオチドに、上記参照用ポリヌクレオチドを同じ長さのポリヌクレオチドが偶然含まれる確率は、Ｚ染色体を２本有している雄の半分以下となる。

なお、上記比較工程において、両ポリヌクレオチドを比較する場合、上記参照用ポリヌクレオチド自体が存在する必要はなく、必要なデータ、例えば、ポリヌクレオチドの長さや塩基配列などを利用し得る状態であればよい。

他の実施形態において、本発明に係る比内地鶏の検出方法は、第２のプライマーセットを用いて鶏のゲノムＤＮＡを増幅する増幅工程を包含する。上記増幅工程により、第２のＤＮＡマーカーを取得することができる。そのため、本実施形態に係る検出方法は、比内地鶏の検出に好適に用いることができる。

本実施形態に係る検出方法は、該増幅工程によって得られたポリヌクレオチドと、配列番号２に示される塩基配列からなる参照用ポリヌクレオチドとを比較する比較工程をさらに包含することが好ましい。上記参照用ポリヌクレオチドは、比内鶏のゲノムＤＮＡから、第２のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドであり得る。なお、前述したように、比内鶏のゲノムＤＮＡから、第２のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドは、遺伝的に固定されており、常に一定の長さを有している。なお、上記比較工程は、両ポリヌクレオチドの長さが一致するか否かを判定することが好ましいが、両ポリヌクレオチドの配列が一致するか否かを判定するものであってもよい。

さらに他の実施形態において、本発明に係る比内地鶏の検出方法は、第３のプライマーセットを用いて鶏のゲノムＤＮＡを増幅する増幅工程を包含する。上記増幅工程により、第３のＤＮＡマーカーを取得することができる。そのため、本実施形態に係る検出方法は、比内地鶏の検出に好適に用いることができる。

本実施形態に係る検出方法は、該増幅工程によって得られたポリヌクレオチドと、配列番号３に示される塩基配列からなる参照用ポリヌクレオチドとを比較する比較工程をさらに包含することが好ましい。上記参照用ポリヌクレオチドは、比内鶏のゲノムＤＮＡから、第３のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドであり得る。なお、前述したように、比内鶏のゲノムＤＮＡから、第３のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドは、遺伝的に固定されており、常に一定の長さを有している。なお、上記比較工程は、両ポリヌクレオチドの長さが一致するか否かを判定することが好ましいが、両ポリヌクレオチドの配列が一致するか否かを判定するものであってもよい。

なおさらに他の実施形態において、本発明に係る比内地鶏の検出方法は、第４のプライマーセットを用いて鶏のゲノムＤＮＡを増幅する増幅工程を包含する。上記増幅工程により、第４のＤＮＡマーカーを取得することができる。そのため、本実施形態に係る検出方法は、比内地鶏の検出に好適に用いることができる。

本実施形態に係る検出方法は、該増幅工程によって得られたポリヌクレオチドと、配列番号４に示される塩基配列からなる参照用ポリヌクレオチドとを比較する比較工程をさらに包含することが好ましい。上記参照用ポリヌクレオチドは、比内鶏のゲノムＤＮＡから、第４のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドであり得る。なお、前述したように、比内鶏のゲノムＤＮＡから、第４のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドは、遺伝的に固定されており、常に一定の長さを有している。なお、上記比較工程は、両ポリヌクレオチドの長さが一致するか否かを判定することが好ましいが、両ポリヌクレオチドの配列が一致するか否かを判定するものであってもよい。

別の実施形態において、本発明に係る比内地鶏の検出方法は、第５のプライマーセットを用いて鶏のゲノムＤＮＡを増幅する増幅工程を包含する。上記増幅工程により、第２のＤＮＡマーカーを取得することができる。そのため、本実施形態に係る検出方法は、比内地鶏の検出に好適に用いることができる。

本実施形態に係る検出方法は、該増幅工程によって得られたポリヌクレオチドと、配列番号５に示される塩基配列からなる参照用ポリヌクレオチドとを比較する比較工程をさらに包含することが好ましい。上記参照用ポリヌクレオチドは、比内鶏のゲノムＤＮＡから、第５のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドであり得る。なお、前述したように、比内鶏のゲノムＤＮＡから、第５のプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドは、遺伝的に固定されており、常に一定の長さを有している。なお、上記比較工程は、両ポリヌクレオチドの長さが一致するか否かを判定することが好ましいが、両ポリヌクレオチドの配列が一致するか否かを判定するものであってもよい。

本発明に係る検出方法を用いることにより、本発明に係るＤＮＡマーカーを取得することができるので、検査対象の鶏が比内地鶏であるか否かを判別することができる。なお、本発明に係る検出方法において、用いられるべきプライマーセットは第１〜第５のプライマーセットの少なくとも１つであればよく、２つ以上を組み合わせて用いることにより、比内地鶏であるか否かの判別についての信憑性をより向上させることができる。

〔４：検出キット〕
一つの局面において、本発明は比内地鶏の検出キットを提供する。

本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは該材料を使用するための指示書を備える。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、本発明に係るキットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であり得、ここで、組成物の形態は上述したような形態であり得、溶液形態の場合は容器中に内包されていてもよい。本発明に係るキットは、物質Ａおよび物質Ｂを同一の容器に混合して備えても別々の容器に備えてもよい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。本発明に係るキットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。さらに、本発明に係るキットは、ＰＣＲ反応を実施するために必要な器具をあわせて備えてもよい。

本発明に係る比内地鶏の検出キットは、上述したプライマーセットを備えていることを特徴としている。一つの実施形態において、本発明に係る比内地鶏の検出キットは、第１のプライマーセットを備えている。上記プライマーセットを用いることにより、第１のＤＮＡマーカーを取得することができる。そのため、本実施形態に係るキットは、比内地鶏の検出に好適に用いることができる。本実施形態に係る検出キットは、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに備えていていてもよい。これにより、取得した第１のＤＮＡマーカーの長さと配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの長さとを迅速に比較することができる。

他の実施形態において、本発明に係る比内地鶏の検出キットは、第２のプライマーセットを備えている。上記プライマーセットを用いることにより、第２のＤＮＡマーカーを取得することができる。そのため、本実施形態に係るキットは、比内地鶏の検出に好適に用いることができる。本実施形態に係る検出キットは、配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに備えていていてもよい。これにより、取得した第２のＤＮＡマーカーの長さと配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの長さとを迅速に比較することができる。

さらに他の実施形態において、本発明に係る比内地鶏の検出キットは、第３のプライマーセットを備えている。上記プライマーセットを用いることにより、第３のＤＮＡマーカーを取得することができる。そのため、本実施形態に係るキットは、比内地鶏の検出に好適に用いることができる。本実施形態に係る検出キットは、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに備えていていてもよい。これにより、取得した第３のＤＮＡマーカーの長さと配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの長さとを迅速に比較することができる。

なおさらに他の実施形態において、本発明に係る比内地鶏の検出キットは、第４のプライマーセットを備えている。上記プライマーセットを用いることにより、第４のＤＮＡマーカーを取得することができる。そのため、本実施形態に係るキットは、比内地鶏の検出に好適に用いることができる。本実施形態に係る検出キットは、配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに備えていていてもよい。これにより、取得した第４のＤＮＡマーカーの長さと配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの長さとを迅速に比較することができる。

別の実施形態において、本発明に係る比内地鶏の検出キットは、第５のプライマーセットを備えている。上記プライマーセットを用いることにより、第５のＤＮＡマーカーを取得することができる。そのため、本実施形態に係るキットは、比内地鶏の検出に好適に用いることができる。本実施形態に係る検出キットは、配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに備えていていてもよい。これにより、取得した第５のＤＮＡマーカーの長さと配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの長さとを迅速に比較することができる。

本発明に係る検出キットを用いることにより、本発明に係るＤＮＡマーカーを取得することができるので、検査対象の鶏が比内地鶏であるか否かを判別することができる。なお、本発明に係る検出キットにおいて、用いられるべきプライマーセットは第１〜第５のプライマーセットの少なくとも１つであればよく、２つ以上を組み合わせて用いることにより、比内地鶏であるか否かの判別についての信憑性をより向上させることができる。

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

〔実施例１：比内鶏のゲノムＤＮＡの調製〕
秋田県農林水産技術センター畜産試験場にて飼育されていた比内鶏３６０羽からゲノムＤＮＡを得た。

具体的には、上記比内鶏の各個体から血液を採取し、フェノールクロロホルム抽出法を用いて該血液からゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡの濃度を分光光度計（ＧｅｎｅＱｕａｎｔ ｐｒｏ、アマシャムバイオサイエンス）を用いて測定し、最終的な濃度が１０ｍｇ／μｌになるようにゲノムＤＮＡ溶液を希釈した。

〔実施例２：プライマーセットの選定〕
（Ａ）および（Ｂ）の条件を満たすプライマーセットを公知のプライマーセット（非特許文献２参照）より選定した：
（Ａ）Ｚ染色体上に存在するマイクロサテライト領域を含む塩基配列からなるポリヌクレオチドを増幅するために用いることができる；および
（Ｂ）増幅された該ポリヌクレオチドの長さが、比内鶏において遺伝的に固定している。

なお、マイクロサテライト領域とは、短い配列（２〜５塩基）が多数繰り返されている領域である。また、プライマーセットとは、フォワードプライマーとリバースプライマーのセットを意味する。

まず、（Ａ）の条件を満たすプライマーセットを、非特許文献２を参照して設計した。

次に、上記プライマーセットを用いて、実施例１で取得したゲノムＤＮＡをＰＣＲ反応により増幅した。

具体的には、まず、３８４ウェルプレート上に、上記ゲノムＤＮＡ溶液３．０μｌ、１０×ＰＣＲバッファー０．６μｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰミックス０．６μｌ、２５ｍＭ ＭｇＳＯ_４ ０．２８８μｌ、２００μＭ プライマー各０．０１２５μｌ、１Ｕ／μｌ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ、東洋紡）０．１２５μｌおよび滅菌蒸留水 １．３６２μｌからなるＰＣＲ反応液を調製した。なお、ＰＣＲ反応により増幅した断片をキャピラリー電気泳動において検出できるように、フォワードプライマーは、３種類の色素（ＮＥＤ、６−ＦＡＭあるいはＨＥＸ（すべてアプライドバイオシステムズ））のいずれかで蛍光標識したものを用いた。

上記ＰＣＲ反応液に対し、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（アプライドバイオシステムズ）、あるいは、ｉＣｙｃｌｅｒサーマルサイクラー（バイオ・ラド））を用いてＰＣＲ反応を実施した。

ＰＣＲ反応は、９４℃にて７５秒間の熱変性を行った後、熱変性（９４℃、１５秒間）、アニーリング（６０℃、３０秒）および伸長反応（６８℃、６０秒）を１０サイクル行い、その後、熱変性（９４℃、１５秒間）、アニーリング（５５℃、３０秒）および伸長反応（６８℃、６０秒）を１０サイクル行い、その後、熱変性（９４℃、１５秒間）、アニーリング（５０℃、３０秒）および伸長反応（６８℃、６０秒）を１０サイクル行い、その後、６８℃で９分間の伸長反応を行った。

上記ＰＣＲ反応の結果物を各２μｌ採取し、ホルムアミドにて４００倍に希釈した。希釈した上記結果物２μｌをサイズスタンダード（ＧｅｎｅＳｃａｎ ４００ＨＤ ＲＯＸ Ｓｉｚｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ、アプライドバイオシステムズ）を含むホルムアルデヒド１３μｌに更に希釈して、熱変性（９４℃、２分）させた後、ＤＮＡ自動分析装置（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ、アプライドバイオシステムズ）を用いてキャピラリー電気泳動を行った。

キャピラリー電気泳動の結果をコンピューターソフトウェア（ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ ｖｅｒ．２．０、アプライドバイオシステムズ）を用いて解析し、ＰＣＲ反応により増幅された断片の長さを検出した。なお、検出したバンドのピークが一本ならホモ型、ピークが二本ならヘテロ型と判断した。すべての比内鶏において同じ長さの一本のバンドが検出されるプライマーセットを、比内地鶏の検出に用いることができるプライマーセットの候補とした。

〔実施例３：他の鶏のゲノムＤＮＡの増幅〕
実施例２において選択したプライマーセットを用いて、他の鶏のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅断片長を測定した。なお、上記他の鶏とは、比内鶏または比内地鶏でない鶏を意味し、本実施例においては、９つの純粋品種（大軍鶏、薩摩、名古屋、白色レグホン、ロードアイランドレッド、ニューハンプシャ、白色プリマスロック、横斑プリマスロックおよびレッドコーニッシュ）、市場にて購入した肉専用種および卵専用種の合計３３４羽を用いた。

まず、実施例１と同様の方法を用いて、他の鶏のゲノムＤＮＡを調製した。

次に、実施例２において選定したプライマーセットを用いて、他の鶏のゲノムＤＮＡを増幅した。ゲノムＤＮＡを増幅する方法および増幅した断片の長さを測定する方法は、実施例２と同様の方法を用いた。

そして、それぞれのプライマーセットについて、比内鶏のゲノムＤＮＡから増幅した断片の長さと同長の断片が、他の鶏のゲノムＤＮＡから増幅した断片の中に含まれる頻度を算定した。

その結果、実施例２において選定したプライマーセットのうち、上記頻度が低く、実用的であると判断できたのは、配列番号１４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマー（第９のプライマー）および配列番号１５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマー（第１０のプライマー）からなるプライマーセット（第５のプライマーセット、対応するマーカー名はＡＢＲ０３１１）のみであった。

〔実施例４：新規プライマーセットの選定〕
さらなるプライマーセットを取得するため、公開された鶏のゲノムシーケンス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｇａｌｌｕｓ＿ｇａｌｌｕｓ／およびｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｅｓｅ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ？ｏｒｇ＝Ｃｈｉｃｋｅｎ＆ｄｂ＝０＆ｈｇｓｉｄ＝３０９４８９０８にて公開）から、Ｚ染色体上のマイクロサテライト領域を推定し、該領域を含む塩基配列からなるポリヌクレオチドを増幅するために用いることができる新規プライマーセットを設計した。

上記新規プライマーセットについて、該プライマーセットを用いて増幅した断片の長さが、比内鶏において遺伝的に固定しているものを選定した。選定の方法は、実施例２と同様の方法を用いた。

さらに、選定したプライマーセットについて、比内鶏のゲノムＤＮＡから増幅した断片の長さと同長の断片が、他の鶏のゲノムＤＮＡから増幅した断片の中に含まれる頻度を算定した。上記頻度の算定の方法は、実施例３と同様の方法を用いた。

その結果、新規プライマーセットのうち、上記頻度が低く、実用的であると判断できたプライマーセットとして、配列番号６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマー（第１のプライマー）および配列番号７に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマー（第２のプライマー）からなるプライマーセット（第１のプライマーセット、対応するマーカー名はＡＢＲＺ１００３）、配列番号８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマー（第３のプライマー）および配列番号９に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマー（第４のプライマー）からなるプライマーセット（第２のプライマーセット、対応するマーカー名はＡＢＲＺ１０１２）、配列番号１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマー（第５のプライマー）および配列番号１１に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマー（第６のプライマー）からなるプライマーセット（第３のプライマーセット、対応するマーカー名はＡＢＲ０２４１）および配列番号１２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマー（第７のプライマー）および配列番号１３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマー（第８のプライマー）からなるプライマーセット（第４のプライマーセット、対応するマーカー名はＡＢＲＺ１００８）が得られた。

ＡＢＲ０３１１を含む５つのマーカーについて、比内鶏において遺伝的に固定されているマーカーの他の鶏における出現頻度および想定される識別率を表１に示す。表１に示されるように、雌においては、三つのマーカー（ＡＢＲＺ１００３、ＡＢＲＺ１０１２、ＡＢＲ０２４１）、雄においては五つのマーカー（ＡＢＲ０３１１、ＡＢＲＺ１００３、ＡＢＲＺ１０１２、ＡＢＲ０２４１およびＡＢＲＺ１００８）を用いれば、９９％以上の否定確率を得ることができる。

〔実施例５：比内地鶏の検出〕
実施例３および実施例４にて得られた五つのプライマーセットを用いて、実際にサンプルの鶏が比内地鶏であるか否かを識別した。サンプルとして、実施例３に記載の他の鶏３３４羽を用いた。したがって、すべてのサンプルに対して比内地鶏ではないと否定できれば成功となる。なお、原理的に比内地鶏は必ず比内地鶏であると判定される。

まず、サンプルの鶏からゲノムＤＮＡを調製した。ゲノムＤＮＡを調製する方法は実施例１と同様の方法を用いた。

次に、ゲノムＤＮＡから第１のプライマーセットを用いてＤＮＡ断片を増幅し、該ＤＮＡ断片の長さを測定した。ＤＮＡ断片の増幅は、実施例２と同様の方法によりおこなった。そして、上記ＤＮＡ断片に、比内鶏に対して第１のプライマーセットを用いて増幅される断片（配列番号１に示される塩基配列からなるポリペプチド）と同長のＤＮＡ断片が含まれていない場合、比内地鶏ではないと否定した。

同様に、ゲノムＤＮＡから第２のプライマーセットを用いてＤＮＡ断片を増幅し、該ＤＮＡ断片の長さを測定した。そして、上記ＤＮＡ断片に、比内鶏に対して第１のプライマーセットを用いて増幅される断片（配列番号２に示される塩基配列からなるポリペプチド）と同長のＤＮＡ断片が含まれていない場合、比内地鶏ではないと否定した。

同様に、ゲノムＤＮＡから第３のプライマーセットを用いてＤＮＡ断片を増幅し、該ＤＮＡ断片の長さを測定した。そして、上記ＤＮＡ断片に、比内鶏に対して第１のプライマーセットを用いて増幅される断片（配列番号３に示される塩基配列からなるポリペプチド）と同長のＤＮＡ断片が含まれていない場合、比内地鶏ではないと否定した。

同様に、ゲノムＤＮＡから第４のプライマーセットを用いてＤＮＡ断片を増幅し、該ＤＮＡ断片の長さを測定した。そして、上記ＤＮＡ断片に、比内鶏に対して第１のプライマーセットを用いて増幅される断片（配列番号４に示される塩基配列からなるポリペプチド）と同長のＤＮＡ断片が含まれていない場合、比内地鶏ではないと否定した。

同様に、ゲノムＤＮＡから第５のプライマーセットを用いてＤＮＡ断片を増幅し、該ＤＮＡ断片の長さを測定した。そして、上記ＤＮＡ断片に、比内鶏に対して第１のプライマーセットを用いて増幅される断片（配列番号５に示される塩基配列からなるポリペプチド）と同長のＤＮＡ断片が含まれていない場合、比内地鶏ではないと否定した。

その結果、すべてのサンプルについて比内地鶏ではないと否定することができた。すなわち、１００％の確率で比内地鶏と他の鶏を識別することができた。鶏の品種間の遺伝的距離は非常に近しいことが知られており（非特許文献１および非特許文献３参照）、さらに、交雑鶏であるにも拘らず、五つのマーカーのみで比内地鶏の検出を高精度で行うことができた。

本発明を用いれば、比内地鶏を検出することができるため、比内地鶏として偽装表示された鶏肉の流通を監視することができる。これにより、安全面、品質面において信頼に足りる比内地鶏肉を消費者に供給することができる。また、本発明を用いれば偽装を簡単に見破ることができることを周知させることによって、比内地鶏の偽装表示を予防することができる。このように、本発明は食品関連分野に大いに寄与する。

さらに、本発明に係るＤＮＡマーカーの簡易検出キット等、簡易判定のための商品開発に寄与する。

Claims (8)

1. 比内地鶏を検出するためのＤＮＡマーカーであって、（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドを含む、長さが１０００塩基以下のポリヌクレオチドであることを特徴とするＤＮＡマーカー：
   （Ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
   （Ｂ）比内鶏のゲノムＤＮＡから、第９のプライマーおよび第１０のプライマーからなるプライマーセットを用いて増幅されるポリヌクレオチドであって、第９のプライマーは、配列番号１４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第１０のプライマーは、配列番号１５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、ポリヌクレオチド。
2. 鶏のゲノムＤＮＡを、第５のプライマーセットを用いて増幅する工程を包含し、
   第５のプライマーセットは、第９のプライマーおよび第１０のプライマーからなり、
   第９のプライマーは、配列番号１４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第１０のプライマーは、配列番号１５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする比内地鶏の検出方法。
3. 鶏のゲノムＤＮＡを、第２、第３および第４のプライマーセットからなる群より選ばれる少なくとも一つのプライマーセットを用いて増幅する工程をさらに包含し、
   第２のプライマーセットは、第３のプライマーおよび第４のプライマーからなり、
   第３のプライマーは、配列番号８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
   第４のプライマーは、配列番号９に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
   第３のプライマーセットは、第５のプライマーおよび第６のプライマーからなり、
   第５のプライマーは、配列番号１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
   第６のプライマーは、配列番号１１に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
   第４のプライマーセットは、第７のプライマーおよび第８のプライマーからなり、
   第７のプライマーは、配列番号１２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
   第８のプライマーは、配列番号１３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである
   ことを特徴とする請求項２に記載の比内地鶏の検出方法。
4. 鶏のゲノムＤＮＡを、第５のプライマーセットを用いて増幅する増幅工程、および該増幅工程によって得られたポリヌクレオチドと、配列番号５に示される塩基配列からなる参照用ポリヌクレオチドとを比較する比較工程を包含する比内地鶏の検出方法であって、
   第５のプライマーセットは、第９のプライマーおよび第１０のプライマーからなり、
   第９のプライマーは、配列番号１４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
   第１０のプライマーは、配列番号１５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである
   ことを特徴とする検出方法。
5. 上記比較工程は、上記増幅工程によって得られたポリヌクレオチドの中に、上記参照用ポリヌクレオチドと塩基数が等しいポリヌクレオチドが存在するか否かを判定するサブ工程を包含していることを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. 第５のプライマーセットを備えており、
   第５のプライマーセットは、第９のプライマーおよび第１０のプライマーからなり、
   第９のプライマーは、配列番号１４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
   第１０のプライマーは、配列番号１５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである
   ことを特徴とする比内地鶏の検出キット。
7. 第２、第３および第４のプライマーセットからなる群より選ばれる少なくとも一つのプライマーセットをさらに備え、
   第２のプライマーセットは、第３のプライマーおよび第４のプライマーからなり、
   第３のプライマーは、配列番号８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
   第４のプライマーは、配列番号９に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
   第３のプライマーセットは、第５のプライマーおよび第６のプライマーからなり、
   第５のプライマーは、配列番号１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
   第６のプライマーは、配列番号１１に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
   第４のプライマーセットは、第７のプライマーおよび第８のプライマーからなり、
   第７のプライマーは、配列番号１２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
   第８のプライマーは、配列番号１３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
   ことを特徴とする請求項６に記載の比内地鶏の検出キット。
8. 第５のプライマーセット、および配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを備えていることを特徴とする比内地鶏の検出キットであって、
   第５のプライマーセットは、第９のプライマーおよび第１０のプライマーからなり、
   第９のプライマーは、配列番号１４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
   第１０のプライマーは、配列番号１５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである
   ことを特徴とする検出キット。