JP4925236B2 - Vaccine containing tick cement protein - Google Patents

Abstract

The invention relates to the use of tick cement proteins in the production of vaccines for protecting animals against the bite of blood-sucking ectoparasites and against the transmission of viruses, bacteria and other pathogens by such ectoparasites. When used as vaccine components, the tick cement proteins of the invention confer broad cross-reactivity against a variety of species of ectoparasite.

Description

である。
【００１０】
上記の外寄生生物の全ての間で共通のものは、それらの寄生生物が血液、リンパを摂取するか、またはそれらが宿主皮膚産物上で摂食する、すなわち、その宿主に存在する任意の抗体がその外寄生生物内に自動的に内在化されるということのいずれかである。これによって抗体の投与の有利でかつ自動的な経路が提供される。そして抗体が外寄生生物のタンパク質に対して反応性であれば、このことは、十分組織化された免疫レジメンが、意図される領域内で寄生生物の完全な根絶を生じ得ることを意味する。血液を摂食する外寄生生物は、本発明のワクチンの特に好ましい標的である。
【００１１】
本発明は、多数の異なるダニセメントタンパク質を発見した。そして多くの場合、そのコード遺伝子をクローニングした。例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９８／０３３９７（その内容は本明細書において参考として援用されている）は、多数の組織セメントタンパク質の単離を記載しており、そして皮膚手術および創傷治癒における使用のための組織セメントの成分としての医薬におけるそのタンパク質の使用、ならびにお互いに対するまたは他の生体物質に対するヒトまたは動物組織の一過性または永続的な結合について考察している。
【００１２】
マダニ（硬性）ダニは、ダニ唾液腺のＩＩ型腺房およびＩＩＩ型腺房に起源する、「セメント円錐体（セメントコーン）（ｃｅｍｅｎｔ ｃｏｎｅ）」によって、自分自体を脊椎動物宿主に付着させる吸血性寄生生物である（Ｋｅｍｐら、１９８２；Ｗａｌｋｅｒら、１９８５）。
【００１３】
円錐（コーン）（ｃｏｎｅ）を形成するセメントは、乳白色の分泌物であり、これはこれらの寄生生物が摂食する動物の皮膚中に注入される。このセメントは多数の相互作用するタンパク質および炭水化物成分を含む。このセメントは咬傷部位に広がり、そして皮膚にまたがり、そして硬化の際、口器が摂食期間（これは代表的には４〜８日続く）の間、宿主に固く固定されたままであることを確実にする。このセメント円錐（セメントコーン）は、さらにガスケットとして機能して、摂食の間、咬傷部位からの液体の漏出を防ぐ。
【００１４】
マダニのセメント円錐は、２つの主要な型のセメントからなる、層状構造である。セメントの第１の型は、咬傷部位の樹立のほんの数分後に生成され、そして迅速に固化して、円錐の剛性の「コア」を形成する。セメントの第２の型は、後に（付着の約２４時間後）分泌され、そしてよりゆっくりと固化して、より可撓性の「皮質」を形成する。成虫のマダニにおいて、セメントの生成は、代表的に、付着の３日後または４日後まで継続する（Ｋｅｍｐら、１９８２；Ｓｏｎｎｅｎｓｈｉｎｅら、１９９１）。
【００１５】
マダニセメントの組成は、異なるマダニ（Ｉｘｏｄｉｄ）のマダニ種の間で類似するようである。例えば、ブラウンイヤーマダニ（ｂｒｏｗｎ ｅａｒ ｔｉｃｋ）（Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）の９０ｋＤの唾液タンパク質に対して惹起される抗血清は、唾液腺由来のポリペプチド、ならびにアメリカイヌカクマダニ（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｄｏｇ ｔｉｃｋ）（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｅｒ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ローンスターマダニ（ｌｏｎｅ ｓｔａｒ ｔｉｃｋ）（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）、およびクリイロコイタマダニ（ｂｒｏｗｎ ｄｏｇ ｔｉｃｋ）（Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ）のセメントタンパク質を認識することが示された（Ｊａｗｏｒｓｋｉら、１９９２）。
【００１６】
精製されていないセメント成分は、宿主耐性の誘発因子として以前に試験された（Ｂｒｏｗｎら、１９８６；Ｓｈａｐｉｒｏら、１９８９）が、これらのタンパク質に基づく信頼性のあるワクチンは、開発されていない。ある意味では、このことは驚くことではない。なぜなら、配列の関係は、最もありそうには宿主の天然の免疫防御機構による皮膚のマダニの付着に対する拒絶を回避する目的で、セメントタンパク質が宿主の皮膚タンパク質に類似して設計されたことを示すからである。特定のマダニタンパク質の、それらの周囲の組織との組成的類似はまた、セメント円錐と周囲の皮膚組織との間の密接な結合を容易にし得る。
【００１７】
本発明のワクチンへの組み込みに適切なマダニセメントタンパク質は、任意の適切なマダニ種（例えば、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ、Ｉ．ｒｉｃｉｎｕｓ、Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｅｒ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｓ、Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｅｒ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ａｍｂｌｙｏｍｍａ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ、Ａｍｂｌｙｏｍｍａ ｖａｒｉｅｇａｔｕｍ、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ、およびＨａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓ ｌｅａｃｈｉｉ種）由来であり得る。好ましい実施形態において、マダニセメントタンパク質は、マダニＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ由来である。
【００１８】
本発明のワクチンへの含有に特に適したマダニセメントタンパク質の例は、本明細書中およびまた特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９８／０３３９７に与えられる。これらのセメントタンパク質としては、クローン２１、クローン３３、ＣｅｍＡ、クローン２４、クローン６８、クローン６４、およびクローンＩと称されるタンパク質が挙げられる。これらのタンパク質の推定アミノ酸配列を、本明細書中の図１に同定する。
【００１９】
好ましくは、本発明のワクチン組成物において使用されるマダニセメントタンパク質、そのフラグメントまたはその機能的等価物は、免疫原性セメントタンパク質、フラグメントまたは機能的等価物が由来するマダニ種以外の吸血性（ｂｌｏｏｄ−ｆｅｅｄｉｎｇ）外寄生生物種の１つ以上の定向進化タンパク質に存在する、免疫原性エピトープを含むべきである。このことは、単一のワクチン組成物が、共通のエピトープを含むタンパク質を産生する外寄生生物種の全てに対する広範なスペクトルのワクチンとして有効であり得ることを意味する。例えば、特定の地域においては、多数の異なるマダニ種が地方病性であり、そして農産業に対して重大なペストの問題を引き起こす。多数の異なるマダニ種に対して有効な単一のワクチンのアベイラビリティは、そのワクチンを投与する費用を削減し、従って、現在利用可能なワクチンより有利である。
【００２０】
従って、本発明のこの局面のワクチンは、特に有利である。なぜなら、炎症応答が刺激され、これは、ワクチン接種された動物の免疫状態をブーストし、そしてさらに、隠蔽された抗原を標的化し、これによってマダニ自体の損傷を生じるからである。
【００２１】
特定のマダニセメントタンパク質、およびこれらのタンパク質のフラグメントは、本発明の１つの局面に従って、外寄生生物種の腸および血液リンパに存在するタンパク質にもまた存在するエピトープを含むことが発見された。この交差反応性は、本発明のこの実施形態のワクチンを特に有利にする。なぜなら、血液、および従って宿主抗体の、外寄生生物への摂取は、この寄生生物への活性薬剤の送達を保証するからである。この様式で、本発明のワクチンは、一時的に食餌する種（例えば、カおよびウマバエ）を、それらの宿主に十分な時間付着したままである種（例えば、マダニ）と同程度に効率的に標的化する。
【００２２】
本発明によるワクチンへの含有に特に適切なタンパク質は、例えば、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ以外の種から単離された、クローン６４タンパク質（本明細書中以下において６４Ｐ）、そのフラグメント、またはその機能的等価物である。このタンパク質は、構造的タンパク質に代表的な配列を有し、そしてマダニの唾液中に分泌されるようである。このセメントタンパク質の最初の４０アミノ酸を含む配列は、非常にコラーゲン様であり、一方でこの配列の残りの部分は、ケラチンに類似する。このタンパク質の配列に対して実施された相同性検索は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）において検索された全ての配列に対する相同性の最高のレベルが、マウス表皮ケラチンサブユニットＩに対する５１％であったことを明らかにする。
【００２３】
このタンパク質はグリシンリッチであり、そしてＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（クチクラタンパク質）および他の昆虫卵殻由来の構造的タンパク質、ならびに脊椎動物サイトケラチン（哺乳動物ケラチン複合体２基本タンパク質、マウスケラチン、ヒトケラチン、コラーゲンＩＶα型、およびＩＰＩＢ２前駆体が挙げられる）に類似のモチーフ（Ｃ／Ｓ）１−４（Ｙ／Ｆ）のいくつかの反復を含む。
【００２４】
本発明の１つの実施形態において、マダニタンパク質の機能的等価物は、ワクチン組成物に含まれ得る。用語「機能的等価物」とは、本明細書中において、クローン２１、クローン３３、ＣｅｍＡ、クローン２４、クローン６８、クローン６４、およびクローンＩと称されるセメントタンパク質に類似の機能を有するタンパク質を記載するために使用される。機能的に等価なタンパク質は、これらのタンパク質と同じタンパク質ファミリーに属し得る。タンパク質ファミリーとは、共通の機能を共有し、そしてポリペプチド配列に存在するモチーフ間で共通の配列相同性を示す、ポリペプチドの群を意味する。
【００２５】
「配列相同性」とは、ポリペプチド配列が共通の祖先からの発散によって関連することを意味する。特に、本明細書中において同定されるタンパク質および部分タンパク質はこのタンパク質の配列にわたって数回反復される特定の配列を、共通して有する。好ましくは、同じタンパク質ファミリーにおけるポリペプチド配列間の相同性は、このタンパク質のアミノ酸配列全体にわたって少なくとも３０％である。より好ましくは、相同性は、このタンパク質のアミノ酸配列全体にわたって、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％である。なおより好ましくは、相同性は、このタンパク質配列全体にわたって、８０％より大きく、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。
【００２６】
「類似の機能」とは、第１に、少なくとも他のセメントタンパク質と共に存在する場合に、タンパク質がセメントを形成する能力を維持していることを意味する。従って、他の必要なセメント構築物と組み合わせると、このようなタンパク質は、経時的に硬化して、固体の塊または接着剤を形成し得る。第２に、この用語は、セメントタンパク質に構造的に類似しており、従って類似かまたは同一のエピトープを含む、タンパク質をいい得る。
【００２７】
組織セメントタンパク質の機能的等価物は、野生型配列からのアミノ酸の置換、挿入、または欠失を含む（但し、免疫原性は維持される）、変異を含む。野生型タンパク質配列の免疫原性から改善された免疫原性を有する機能的等価物はまた、タンパク質配列における特定の残基の合成または指向された変異を介して設計され得る。
【００２８】
機能的等価物としては、タンパク質の機能または活性に不利な様式で影響を及ぼさない、保存的アミノ酸置換を含むタンパク質が挙げられる。この用語はまた、天然の生物学的改変体（例えば、組織セメントタンパク質が由来する種における対立遺伝子改変体または地理的な改変体）を含むことが意図される。
【００２９】
本発明によれば、マダニセメントタンパク質のフラグメントもまた、ワクチン組成物への含有に適した成分として意図される。例えば、マダニセメントタンパク質の免疫原性部分由来のペプチドの短い伸長は、免疫原として特に有用であり得る。このようなポリペプチド配列の短い伸長は、合成的にかまたは組換え手段を介してかのいずれかで、多量に産生することが簡単である。タンパク質フラグメントは、多くの例において、本発明のワクチンにおける使用に適切であり得る。なぜなら、これらのフラグメントは、全長野生型配列によって採用されないコンホメーションに折り畳まれるようであるからである。いくらかのセメントタンパク質は、宿主の皮膚の組織に類似するように、従ってマダニに対する宿主の免疫応答を誘発することを回避するように、進化したようであるので、このようなマダニセメントタンパク質の非天然の形態は、本発明のワクチンにおいて特に有用であるようである。
【００３０】
本発明のワクチン組成物における封入のために有用なマダニセメントタンパク質のフラグメントの例としては、本発明者らによって組換え産生された６４Ｐタンパク質の種々のフラグメント、およびこれらのフラグメントの機能的等価物（例えば、上に議論される種類の密接なホモログおよび変異体）が挙げられる。当業者に明らかなように、本明細書中に明確に開示されるタンパク質に類似のフラグメントは、マダニ種Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ以外の外寄生生物種から調製され得る。
【００３１】
本明細書中に記載されるＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓフラグメントの詳細は、以下の通りである。
【００３２】
６４ｔｒｐ１と呼ばれるフラグメントは、約３０ｋＤａの分子量を有するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／ヒスチジンタグ融合タンパク質としてクローン化される２９アミノ酸からなる６４Ｐタンパク質の小さなＣ末端フラグメントである。
【００３３】
６４ｔｒｐ２と呼ばれるフラグメントとは、約３３ｋＤａの分子量を有するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／ヒスチジンタグ融合タンパク質としてクローン化される５１アミノ酸からなる６４Ｐタンパク質の小さなＮ末端フラグメントをいう。
【００３４】
６４ｔｒｐ３と呼ばれるフラグメントとは、約３６ｋＤａの分子量を有するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／ヒスチジンタグ融合タンパク質としてクローン化される７０アミノ酸からなる６４Ｐタンパク質のより大きなＮ末端フラグメントをいう。
【００３５】
６４ｔｒｐ６と呼ばれるフラグメントとは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／ヒスチジンタグ融合タンパク質としてクローン化される１３３アミノ酸からなる６４Ｐタンパク質の全長クローンをいう。このフラグメントは、約４２ｋＤａの分子量を有する。
【００３６】
６４ｔｒｐ４と呼ばれるフラグメントとは、約３５ｋＤａの分子量を有するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／ヒスチジンタグ融合タンパク質としてクローン化される６３アミノ酸からなる６４Ｐタンパク質のＣ末端フラグメントをいう。
【００３７】
６４ｔｒｐ５と呼ばれるフラグメントとは、ＧＳＴ融合タンパク質（すなわち、ヒスチジンタグを欠く）としてクローン化される１３３アミノ酸からなる６４Ｐタンパク質の全長クローンをいう。このタンパク質は、４１ｋＤａの分子量を有する。
【００３８】
これらのタンパク質フラグメント、およその機能的等価物は、本発明のワクチンに組み込むために特に好ましい成分である。これらのフラグメントは、可溶性タンパク質として発現され得るか、あるいは、封入体において発現され得、そして変性条件下で精製され得る。例えば、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓから単離されるような構築物６４ｔｒｐ６は、封入体において発現される変性タンパク質として調製されており、この形態で免疫原性であることが実証されている。
【００３９】
これらのタンパク質フラグメントを用いる免疫化、続く外寄生生物の付着は、付着部位での炎症を生じ、続いて、外寄生生物の死を生じる。当業者は、異種ＧＳＴおよびＨＩＳ ｔａｇ配列の存在が、純粋にタンパク質産生の便宜のためであることを理解する。これらの配列のストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）は、本発明のこの局面に対して必須であるとは考えられない。
【００４０】
便利には、本発明に従うワクチンは、組換え形態で発現される、マダニセメントタンパク質、そのフラグメントまたはその機能的等価体を含む。組換え的に発現されるタンパク質は、産生が安価であり、遺伝子工学の現在の標準技術を使用して、遺伝子配列の単純な操作により所望のタンパク質産物を与えることを可能にする。
【００４１】
本発明のワクチンが、外寄生生物の成体形態および未熟形態の両方に対して効果的であることが好ましい。用語「未熟」とは、外寄生生物の若虫形態および幼虫形態の両方を含むことを意味する。これは、外寄生生物集団全体がワクチンを使用して標的化され得、外寄生生物根絶の効率を増加することを意味する。
【００４２】
ワクチンは、外寄生生物の成体形態または未熟形態を特異的に標的化し得るが、好ましくは、ライフサイクルの全ての寄生的段階を標的化する。従って、本明細書中に具体的に例示されるフラグメントのうち、マダニの種類およびこれらのフラグメントに依存して、マダニ若虫または成体マダニあるいは若虫および成体の両方において有意な死亡率をもたらす、６４ｔｒｐ２−、６４ｔｒｐ３−、６４ｔｒｐ５−、および６４ｔｒｐ６−免疫動物は、特に好ましい。６４ｔｒｐ２＋６４ｔｒｐ６のカクテルは、マダニ外寄生生物の成体形態および未熟形態の両方に対して効果的であった；従って、組み合わせて使用される特定のフラグメントは、本発明に従ってワクチンに封入するために特に好ましい。
【００４３】
本発明のさらなる実施形態に従って、２つ以上のマダニセメントタンパク質、フラグメント、または機能的等価体、を必要に応じてアジュバントと組み合わせて含む、カクテルワクチンが提供される。任意の２つの免疫原性マダニセメントタンパク質、タンパク質フラグメントまたは機能的等価体は、カクテルワクチンのような成分として使用され得、そして異なるかマダニ種由来かまたは同じマダニ種由来であり得る。例えば、１つより多くの外寄生生物を特異的に標的化するか、または同じ外寄生生物由来の異なるタンパク質を標的化するワクチンを作製することが望ましくあり得る。この様式において、より広い種の範囲を有するより効率的なワクチンを作製することが可能であり得る。成分の特に好ましい組み合わせとしては、６４ｔｒｐ２、６４ｔｒｐ３、６４ｔｒｐ５、および６４ｔｒｐ６の組み合わせ、６４ｔｒｐ２および６４ｔｒｐ６の組み合わせ、ならびに６４ｔｒｐ３および６４ｔｒｐ６の組み合わせが挙げられる。これらの組み合わせは、成体マダニおよび未熟マダニの両方を標的化する際、および交差種耐性を与える際に特定の効力を有することが本明細書中において実証される。
【００４４】
本発明に従うワクチン組成物はまた、さらなる因子（例えば、外寄生生物が、病原体伝達を促進するために使用する分子（例えば、インターフェロン調節因子、補体インヒビター、ケモカイン調節因子および免疫グロブリン結合タンパク質））を含み得る。このように、外寄生生物の唾液腺から放出される他の生物活性な分子は、宿主免疫系によって外来として認識され得、免疫応答が生じ得る。
【００４５】
本発明のさらなる局面は、別の分子（例えば、標識、毒素または他の生物活性分子または免疫原性分子）に融合されたマダニセメントタンパク質を含むワクチンを含む。融合のための特に適切な候補は、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼまたはヒスチジンタグのような分子であり得るが、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質または西洋ワサビペルオキシダーゼがまた適切であり得る。ストレプトアビジンまたはビオチンのようなリンカー分子もまた、例えば、セメントタンパク質の精製を促進するために使用され得る。
【００４６】
融合タンパク質は、化学的架橋のような方法を使用して化学的に作製され得る。このような方法は、当業者に周知であり、例えば、システイン残基のチオール基の架橋を含み得る。化学的架橋は、ほとんどの場合、組織セメントタンパク質を非タンパク質分子（例えば、標識）に融合するために使用される。
【００４７】
組織セメントタンパク質を別のタンパク質分子に融合することが望ましい場合、選択方法は、一般的に、分子を遺伝的に融合することである。組換え融合タンパク質を産生するために、目的のタンパク質またはタンパク質フラグメントをコードする遺伝子または遺伝子部分は、２つの遺伝子配列がインフレームで転写されるように配置された１つの連続した遺伝子を形成するように、操作される。
【００４８】
特定の抗原をコードする裸のプラスミドＤＮＡを用いる免疫化は、最近、哺乳動物の免疫系に抗原を提示し、強力な体液性免疫応答および細胞免疫応答を生じる有効な方法として認識されている（Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９３、２５９、１７４５〜１７４９）。この技術（ＤＮＡワクチン化（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）とも呼ばれる）は、以下のウイルス、寄生虫、および細菌由来の数種のタンパク質に対して指向される抗体を産生するために首尾良く適用されている：ウイルス（Ｕｌｍｅｒら、ｌｏｃ ｃｉｔ．；Ｃｏｘら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９３、６７、５６６４−５６６７；Ｆｙｎａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９３、９０、１１４７８−１１４８２；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ １９９３、１１、９５７−９６０；Ｗａｎｇら、１９９３、ＤＮＡ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９３、１２、７９９−８０５；Ｄａｖｉｓら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９９３、２、１８４７−１８５１；Ｘｉａｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９４、１９９、１３２−１４０；Ｘｉａｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９５、２０９、５６９−５７９；およびＪｕｓｔｅｗｉｃｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９５、６９、７７１２−７７１７）；寄生虫（Ｓｅｄｅｇａｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９４、９１、９８６６−９８７０；Ｍｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５、１５５、２０３９−２０４６；およびＹａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９９５、２１２、１０２９−１０３９）、ならびに細菌（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９６、６４、３１６８−３１７３）。いくつかの場合において、有意な保護応答は、宿主によって惹起される。これらのＤＮＡワクチンは、連続的に、免疫応答を刺激し、免疫を増幅し、これにより、追加免疫注入を必要としないので、産生および送達の費用が抑えられる。
【００４９】
利用可能な証拠に基づいて、ウイルスマダニセメントタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡを用いる刺激は、それらの抗マダニワクチン効果をさらに改善するための有用な技術であるようである。この方法は、真核生物発現ベクターを含む宿主の直接的な注入を包含し、１種以上のセメントタンパク質は、ワクチン化した宿主（ヒト、家畜、または他の動物）内の対応する配列のインビボ転写、続く翻訳により発現される。
【００５０】
本発明の上記の局面のいずれか一つのワクチンは、さらにアジュバンドを含み得る。本発明に従う免疫原性タンパク質の効果を増強するための適切なアジュバンドとしては、例えば、（ａ）ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１４８３７に記載される処方物のような、水中油エマルジョン処方物（必要に応じて、ムラミルペプチドまたは細菌の細胞壁の成分のような他の特定の免疫刺激因子を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。他の適切なアジュバンドは、当該分野で公知であり、Ｓａｐｏｎｉｎアジュバンド（例えば、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ^ＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ））、ＩＳＡ Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ５０、サイトカイン（例えば、インターロイキン、インターフェロン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ））を含む。
【００５１】
本発明にさらなる実施形態に従って、マダニセメントタンパク質と反応性であるモノクローナル抗体を提供する。「反応性（の）」とは、少なくとも１０^−８Ｍ、好ましくは、少なくとも１０^−９Ｍ、より好ましくは、少なくとも１０^−１０Ｍの親和性で、抗体が１以上のマダニエピトープと結合することを意味する。本発明のこの局面の好ましい実施形態に従って、抗体または抗血清は、具体的に上に記載されている、セメントタンパク質、フラグメント、または機能的等価物の任意の１以上に対して反応性である。本発明のこの局面は、抗体または抗血清を産生する方法を含み、この方法は、本発明の上記の局面のいずれか１つに列挙されるような、マダニセメントタンパク質、そのフラグメント、またはその機能的等価物を用いて動物を刺激する工程を包含する。
【００５２】
本発明のなおさらなる局面に従って、ワクチン組成物の処方のためのプロセスを提供し、このプロセスは、マダニタンパク質、そのフラグメント、またはその機能的等価物を、必要に応じてアジュバンドと共に薬学的キャリアと会合させる工程を包含する。
【００５３】
本発明のなおさらなる局面に従って、外寄生生物伝達疾患、または血液供給外寄生生物に対して哺乳動物を免疫化する方法を提供し、この方法は、本発明の上記の局面のいずれか１つに従うワクチンを動物に投与する工程を包含する。
【００５４】
本発明はまた、マダニセメントタンパク質、そのフラグメント、またはその機能的等価物を、ワクチンの使用のために提供する。本発明は、ワクチンの成分として、マダニセメントタンパク質の使用をさらに提供する。
【００５５】
ここで、本発明の種々の局面および実施形態を、特に、マダニから単離されたマダニセメントタンパク質、そして特に、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓから単離されたマダニセメントタンパク質に関して、例示によってより詳細に記載している。細部の改変は、本発明の範囲から逸脱することなく達成され得ることが、理解される。
【００５６】
（実施例）
（実施例１：細菌中での短縮セメントタンパク質（６４ＴＲＰ）の発現）
バキュロウイルス系での６４Ｐの全長クローンを発現するための試みが失敗したので、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細菌細胞中での６４Ｐの短縮バージョンの発現のために、いくつかの戦略を研究した。
【００５７】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＤ４９４細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）中でのこのタンパク質の発現のために、ｐＥＴ２３ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｍａｒｃｉａ）原核生物発現ベクター中にセメントタンパク質（シグナル配列を含まない、すなわち１４４アミノ酸長）（６４Ｐと名付ける）の全コード領域を挿入するための、いくつかの失敗した試みがなされた。この構築物の構造が、細菌細胞に対して毒性であり得ると結論付けられた。
【００５８】
従って、Ｎ末端領域で開始する、６４Ｐクローンの短縮領域の連続的クローニングを含むクローニング戦略を採用した（図２）。オリゴヌクレオチドを、このｃＤＮＡ由来の６４Ｐの異なるフラグメントのＰＣＲクローニングを可能にするように、適切な制限酵素部位と共に設計した。これらの構築物は、以下の通りである：
６４ｔｒｐ１＝２９アミノ酸Ｃ末端フラグメント
６４ｔｒｐ２＝５１アミノ酸Ｎ末端フラグメント
６４ｔｒｐ３＝７０アミノ酸Ｎ末端フラグメント
６４ｔｒｐ４＝６３アミノ酸Ｃ末端フラグメント
６４ｔｒｐ５＝９ＸＨＩＳ．ＴＡＧを有さない１３３アミノ酸フラグメント
この配列の末端の３アミノ酸を含まない全長６４Ｐクローン
６４ｔｒｐ６＝９ＸＨＩＳ．ＴＡＧを有する１３３アミノ酸。
【００５９】
製造者の指示に従って、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−ＢＬＵＥ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にこのプラスミドを形質転換した。ＧＳＴ−融合／ヒスチジン−タグ化された発現された６４ＴＲＰタンパク質を、製造者の指示に従って、ＧＳＴ精製方法（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって精製した。封入体として発現され得る６４ＴＲＰタンパク質の精製の容易さのために、この９ＸＨＩＳ．ＴＡＧを含めた（なぜなら、このＧＳＴ精製方法は、溶解性タンパク質のみに適用可能であるためである）。
【００６０】
他のＧＳＴ／９ＸＨＩＳ．ＴＡＧ化された短縮６４Ｐタンパク質（すなわち、６４ｔｒｐ１、６４ｔｒｐ２、６４ｔｒｐ３および６４ｔｒｐ４）とは異なり、６４ｔｒｐ６タンパク質（９ＸＨＩＳ．ＴＡＧを有する１３３アミノ酸）は、溶解性タンパク質の代わりに封入体の形成を生じた。従って、６４ｔｒｐ６タンパク質を、製造者の推奨に従って、ＴＡＬＯＮ金属親和性ビーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、変性条件下で精製した。
【００６１】
６４ＴＲＰタンパク質を、ＮｕＰＡＧＥ Ｔｒｉｓ．Ｂｉｓ４〜１２％勾配のクマシーブルー染色ゲル（Ｎｏｖｅｘ）によって、製造者の推奨に従って分析した（図３Ａ）。図３Ｂおよび３Ｃは、製造者の指示に従って、１：５００希釈のＧＳＴモノクローナル抗体（ＧＳＴ ｍＡｂ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および１：２，０００希釈の６ＸＨＩＳ．ＴＡＧモノクローナル抗体（６ＸＨＩＳ．ＴＡＧ ｍＡｂ／ＡＰＣ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用する、図３Ａからの同様のゲルのウエスタンブロットである。
【００６２】
推定６４ＴＲＰタンパク質バンドを、以下の分子量で、クマシーブルー染色ゲル（図３Ａ）において観察した：６４ｔｒｐ１＝３０ｋＤａ；６４ｔｒｐ２＝３３ｋＤａ；６４ｔｒｐ３＝３６ｋＤａ；６４ｔｒｐ４＝３５ｋＤａ；６４ｔｒｐ５＝４１ｋＤａ；６４ｔｒｐ６＝４２ｋＤａ。
【００６３】
発現を、ウエスタンブロットで確認した（図３Ｂおよび３Ｃ）。２６ｋＤａのＧＳＴタンパク質バンドを、コントロールマーカーとして使用した。
【００６４】
予期されるように、各々が９ＸＨＩＳ．ＴＡＧを欠いた６４ｔｒｐ５およびＧＳＴタンパク質のバンドは、６ＸＨＩＳ．ＴＡＧ ｍＡｂとの反応物を与えなかった（図３Ｃ、それぞれレーン７および２）。
【００６５】
６４Ｐクローンのフラグメントまたは完全Ｎ末端配列のいずれかを含む６４ＴＲＰ構築物（すなわち、６４ｔｒｐ２、６４ｔｒｐ３および６４ｔｒｐ５）は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−ＢＬＵＥ細胞中で発現される場合、分解産物を生じる（図３Ａ、レーン４、５および７）。これを、分解したタンパク質バンドのアミノ末端配列分析（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ，（１９８７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６２：１００３５−１００３８）によって確認した。産物の分解の問題を試みそして解決するために、この構築物を、プロテアーゼをコードするｏｍｐＴ遺伝子が欠失したＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１菌株に形質転換した。
【００６６】
予想したように、６４ｔｒｐ６タンパク質の分解は、６４ｔｒｐ５タンパク質と比較して、より少なかった。なぜなら、６４ｔｒｐ６タンパク質は、封入体として発現され、それによって、細胞性プロテアーゼによる分解から保護されたからである。
【００６７】
（実施例２：６４ＴＲＰに対する抗血清を用いた免疫組織化学的研究）
個々の精製組換え６４ｔｒｐタンパク質を用いて、Ｄｕｎｋｉｎ Ｈａｒｔｌｅｙモルモットへの等容量の各タンパク質およびＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５０の皮下注射によってポリクローナル抗血清を惹起させた。
【００６８】
６つの異なる抗６４ｔｒｐ抗血清を用いて免疫組織化学的研究を行った。この抗血清を、正常なハムスターの皮膚の切片（マダニに暴露されていない動物由来）およびＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニに感染させたハムスターのセメントコーン（ｃｅｍｅｎｔ ｃｏｎｅ）および周囲の皮膚を通った切片の両方と反応させた。免疫組織化学的方法は、以前（Ｃｏｌｉｇａｎら，１９９１）に記載された通りであった。
【００６９】
これらの研究のうちの２つ（抗６４ｔｒｐ２血清および抗６４ｔｒｐ３血清を用いた場合）の結果は、以下を示す。
【００７０】
（２．１ 正常な皮膚）
抗６４ｔｒｐ２血清または抗６４ｔｒｐ３血清のいずれかで処理した正常な皮膚切片の比較は、抗６４ｔｒｐ３血清が、表皮組織および真皮組織（特に、表皮のケラチノサイトおよび角質層ならびに真皮の膠原線維）と強く反応することを明らかにした（図４Ａ）。比較によって、抗６４ｔｒｐ２血清で処理した切片は、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で処理したコントロール切片と区別できなかった（それぞれ、図４Ｂおよび図４Ｃ）。
【００７１】
６４ｔｒｐ２タンパク質配列および６４ｔｒｐ３タンパク質配列は両方とも、６４Ｐタンパク質のコラーゲン様領域を含む。しかし、６４ｔｒｐ３タンパク質はまた、６４Ｐタンパク質のケラチン様配列のうちのいくつかを含む。従って、抗６４ｔｒｐ３抗血清と抗６４ｔｒｐ２抗血清との間での、ハムスター皮膚切片との免疫反応性の差は、それぞれのタンパク質配列フラグメント内の反応性エピトープの利用可能性におそらく関連する。このことはさらに、６４Ｐセメントタンパク質が、特定のその宿主組織（例えば、表皮および真皮のコラーゲン、特にケラチン様タンパク質）の構造を模倣するという仮説を確認する。
【００７２】
（２．２ マダニ感染皮膚）
Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニを飼育したハムスターの皮膚において、個々のセメントコーンの切片は、抗６４ｔｒｐ３血清と反応した。この反応は主に、表皮に付着したセメントコーンの最も外側の層および内層との反応であった（図５Ａ）。反応は、抗６４ｔｒｐ２血清で処理した切片（図５Ｃ）においても、一次抗体の代わりにコントロールとしてＰＢＳを用いた切片（図５Ｂ）においても、観察されなかった。
【００７３】
セメントコーンとの抗６４ｔｒｐ３血清の反応パターンは、６４Ｐが、おそらく、セメントコーンを周囲の表皮組織および真皮組織へと付着させる接着剤として作用する、セメントコーンを並べるセメントタンパク質であることを示し得る。セメントコーン内に染色が存在しないことは、抗６４ｔｒｐ３血清（およびおそらく抗６４ｔｒｐ２抗血清）によって認識されるエピトープが、セメントコーン内に露出していないことを示し得る。このことは、６４Ｐタンパク質が重合してセメントコーンを形成する場合に生じ得る。
【００７４】
宿主の皮膚に埋め込まれるのと同様に、セメントコーンの最も外側の層もまた、先細りになり、そして宿主皮膚の表皮に融合し（データは示さず）、その結果、マダニセメントコーンがどこで終わるかおよび宿主組織がどこで始まるかを識別することは困難である。この観察はさらに、セメントタンパク質が、宿主の皮膚上の付着セメントコーンを介したマダニの拒絶を回避するために、宿主の真皮および表皮の皮膚タンパク質（すなわち、コラーゲンおよびケラチン）に似るように設計されているという仮説を支持する。
【００７５】
（実施例３：ワクチン接種試行）
Ｄｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモットを、免疫および抗原投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）試行のために用いた。使用した１０匹のモルモットのうち、各々２匹を、６４ｔｒｐ１、６４ｔｒｐ２、６４ｔｒｐ３および６４ｔｒｐ６で免疫し、そして２匹をコントロールタンパク質ＧＳＴで免疫した。各群の免疫モルモットをさらに、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニの成虫飼育段階および若虫飼育段階当り、各々１匹のモルモットに分けた。約５０ミリグラムの各６４ＴＲＰタンパク質（依然としてＧＳＴビーズに付着している、すなわち、溶出していない）またはコントロールのＧＳＴタンパク質を、ＩＳＡ Ｍｏｎｔａｎｉｄｅアジュバントと混合し、そして皮下注射した；第一および第二の追加免疫注射をそれぞれ、２週間の間隔で与えた。
【００７６】
免疫に対する宿主の免疫応答を、ＧＳＴタンパク質および個々の６４ＴＲＰタンパク質の免疫ブロットに対する、６４ＴＲＰおよびＧＳＴ免疫モルモット抗血清の反応性によって決定した。
【００７７】
抗血清力価が１：５，０００に到達した場合、モルモットに成虫段階または若虫段階のＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニで抗原投与した。抗原投与感染のために、所定数のマダニ（１匹のモルモットあたり、５０〜２００匹の若虫マダニまたは２０匹の成虫マダニ）を、各モルモットの背中上の保持チャンバ内に入れ（図７）、１週間後、二回目の追加免疫注射を行った。
【００７８】
６４ＴＲＰ誘導免疫の効果を分析するために、毎日の目視試験を、モルモットのマダニ感染の２４時間後に開始して行った。付着率、飼育持続期間、付着部位での炎症反応、および取り外した満腹雌性マダニの卵の孵化能力（ｈａｔｃｈａｂｉｌｉｔｙ）を記録した。成虫雌性マダニの満腹重量（ｅｎｇｏｒｇｅｍｅｎｔ ｗｅｉｇｈｔ）、ならびに成虫段階および若虫段階の両方のマダニの死亡率を、実験の終了後に決定した。
【００７９】
表１は、モルモットにおけるマダニ飼育に対する６４ＴＲＰタンパク質のワクチン効果の結果をまとめる。コントロールのＧＳＴ免疫群および６４ＴＲＰ免疫群の付着率に差は存在しなかった；同様に、飼育持続期間は、成虫段階および若虫段階の両方のマダニについて同様であった。
【００８０】
沈静化前に２４時間〜４８時間持続した炎症反応が、飼育の後期段階（６日目〜７日目）の間に、６４ＴＲＰ免疫モルモットの皮膚上の、若虫が付着した部位で観察された。この反応は、紅斑、浮腫、リンパ節腫脹および嗜眠を含んでいた（図６）。
【００８１】
【表１】

（表１の注）
ｉ＝炎症−および＋は、それぞれ、炎症がマダニの付着部位に存在しないことまたは存在することを示す；炎症の程度は、以下によって示される：＋＝軽度、＋＋＝中程度および＋＋＋＝重度；^１および^２＝外寄生前および外寄生後の抗体力価；ｎｄ＝行わず；ｎ／ａ＝該当なし；ｈ＝孵化した；^＊は、６４ｔｒｐ２タンパク質で免疫したモルモットで飼育したＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ群由来の２匹の成虫雌性マダニによって産卵された、孵化しなかった２／９バッチの卵をいう；^δは、一元分割表を用いるχ二乗検定によって決定され、６４ｔｒｐ６免疫モルモットで飼育したＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ若虫マダニの群からの、より高い死亡率を示す（χ^２，_６＝９６．５、ｐ＜０．００１）；^§は、Ｇ検定によって決定され、６４ｔｒｐ２タンパク質、６４ｔｒｐ３タンパク質および６４ｔｒｐ５タンパク質で免疫されたモルモットで飼育したＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニの群からの成虫雌性マダニにおいて観察された死亡率は、他の群由来のマダニについてよりも有意に高かった（Ｇ，_６，＝３３、ｐ＜０．００１）；^εは、Ｆ比によって決定され、６４ｔｒｐ２、６４ｔｒｐ４および６４ｔｒｐ５で免疫されたモルモットで飼育したＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ群由来の成虫雌性マダニについての平均満腹重量は、他の群由来のマダニについての満腹重量によりも有意に少なかった（Ｆ，_ｌ，６２＝１５．８８、ｐ＜０．００１）；^‡は、Ｆ比によって決定され、他の群由来の雌性マダニと比較して、６４ｔｒｐ５免疫モルモットで飼育した雌性Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニについての有意に低い平均卵塊重量を示す（Ｆ，_ｌ，４４＝５．６４６、ｐ＜０．０２２）。
【００８２】
（３．１ 若虫マダニ）
分離された若虫は、みかけは正常であった。炎症は、ＧＳＴ免疫モルモットの皮膚の若虫接着部位において明らかではなかった。
【００８３】
分離された若虫を、Ｊｏｎｅｓら（１９８８）Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３９，９９−１０６に従って、培養した。コントロールタンパク質免疫モルモット（６．７％）と比較した場合、１８％および４８％の比較的高い死亡率が、６４ｔｒｐ２および６４ｔｒｐ６で免疫したモルモットを摂食した分離された若虫について観察された。これらの結果は、２×２分割表を使用するカイ２乗試験によって決定されるように、それぞれ統計学的に有意なｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１であった。
【００８４】
６４ｔｒｐ２および６４ｔｒｐ６免疫モルモットを摂食した若虫の死は、若虫段階のＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓダニが６４ＴＲＰ免疫モルモットを摂食した場合に、免疫応答が刺激されたことを示唆する。この応答は、摂食には直接影響しないが、若虫の生存に影響する。免疫保護エピトープが、６４ｔｒｐ２タンパク質（６４Ｐタンパク質の小さいＮ末端フラグメント）ならびに６４ｔｒｐ６タンパク質（６４Ｐタンパク質の１３３アミノ酸フラグメント、変性された抗原のような）（これらは、若虫の関連したセメントタンパク質において保存され得る）中に存在することは可能である。このことは、若虫組織抽出物に対する抗６４ｔｒｐ抗血清を使用する免疫ブロッティングによってさらに調査される。
【００８５】
（３．２ 成虫ダニ）
死亡率はまた、６４ｔｒｐ２（死亡率５５．５％）タンパク質および６４ｔｒｐ３（死亡率７０％）タンパク質で免疫したモルモットを摂食した成虫雌性ダニの間で、有意であった。図７Ａ（１）は、６４ｔｒｐ２免疫モルモットを摂食した成虫ダニのいくつかを示す。これらは、他の６４ｔｒｐおよびＧＳＴ免疫モルモットと比較してより低いうっ積重量を有した（表２；平均重量＝３３６ｍｇ）。さらに、この群由来の二匹のダニは、孵化しない少量の卵を産み；そして摂食の後期の間に、充分摂食した分離された成虫ダニのいくつかは、分離の２日後に死亡した。
【００８６】
同様に、６４ｔｒｐ３免疫モルモット由来の十分にうっ積した摂食後の成体ダニは、分離後最初の週内に死亡した（図７Ｂ）。これらのダニは、コントロールのダニと比較して、血粉で膨張し、色が暗く、そして死亡において強い一貫性を発生する。ダニに対するこのワクチン効果は、ダニの腸に対する損傷ならびにダニ唾液腺の機能である浸透圧調整の妨害を示す。
【００８７】
コントロールタンパク質免疫モルモット由来の全ての正常な成虫ダニは、正常のようであり、そして生存して卵を産んだ（図７Ｃ）。
【００８８】
剖検研究を、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ成体ダニでの摂食後に、６４ＴＲＰタンパク質で免疫したモルモット由来の皮膚生検から行なった。コントロールタンパク質免疫モルモット由来の皮膚生検（図８ＤおよびＥ）と比較して、紅斑性丘疹状外傷を、ダニ接着部位において観察した（図８Ａ、ＢおよびＣ、番号３）。
【００８９】
皮膚および壊死外傷の肥厚によって示されるように、６４ｔｒｐ２免疫モルモット由来の生検中に、外傷を標識した（図８Ｃ）。
【００９０】
これらの結果は、６４ＴＲＰ免疫モルモットに対する摂食後の成虫ダニにおいて観察される高い死亡率と相関する。従って、ダニ摂食は、成虫ダニの摂食の後期段階に対する６４ＴＲＰワクチン接種モルモットによる免疫応答を刺激したようである。
【００９１】
これらの知見を確かめるために、組織学的研究を、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を使用する皮膚生検由来の切片に関して行なった（Ｂａｎｃｒｏｆｔ Ｊ．Ｄ．およびＳｔｅｖｅｎｓ，Ａ．編（１９９０）．Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．第３版）。結果は、コントロールタンパク質免疫モルモットの成虫ダニの摂食後由来の皮膚生検切片で予期された正常な組織学的プロフィールを示す（図９．１）。
【００９２】
対照的に、６４ＴＲＰ免疫モルモット由来の皮膚生検切片の組織学的研究は、特に、表皮の以前のダニ接着部位に近い真皮における白血球浸潤の存在（これは、低い拡大率（図９．２および９．３）ならびに高い拡大率（図９．７および９．８）の両方において観察された）によって見られるように、成虫ダニの摂食に対する免疫学的応答を確かめる。慢性炎症反応の証拠である表皮の肥厚もまた、存在する。
【００９３】
さらなる組織学的研究を、製造業者の指示に従って、Ｈｅｍａ「Ｇｕｒｒ」Ｒａｐｉｄ Ｂｌｏｏｄ Ｓｍｅａｒ染料（ＢＤＨ）（すなわち、ライト染料）を使用して、これらの同一の切片ならびにコントロールサンプルに対して行なった。結果は、６４ｔｒｐ免疫モルモット由来の皮膚生検切片における好酸球および好塩基球多型である白血球浸潤（図９．５および９．６）（これは、コントロールサンプルにおいて存在しない（図９．４））を確認した。
【００９４】
（３．３ 卵生産および生存度）
Ｆ比によって決定される卵生産の統計学的分析は、他の群の雌性ダニと比較して、６４ｔｒｐ５免疫モルモットを節食した雌性Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓダニについて有意に低い平均卵重量（Ｆ，_１，４４＝５．６４６，ｐ＜０．０２２）を示した。さらに、９分の２の卵が孵化しなかった。これらは、６４ｔｒｐ２タンパク質で免疫したモルモットを節食したＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓダニの群由来の二匹の雌性成虫ダニによって産まれた。この結果により、特定の構築物が、免疫動物を節食する雌性成虫ダニの生殖生産量に有意な影響を与えたことが示される。これは、所望されるワクチン効果である。
【００９５】
ワクチン試験の結果により、成虫および若虫のＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓダニに対するワクチンとしての６４ｔｒｐ２、６４ｔｒｐ３、６４ｔｒｐ５および６４ｔｒｐ６タンパク質の使用が支持される。
【００９６】
観察された免疫炎症性応答は、放棄されたダニ摂食部位において激しい紅斑、浮腫（ｅｏｄｅｍａ）、壊死、肥厚および紅斑性丘疹を含む二次ダニ侵襲（ＢｒｏｗｎおよびＡｓｋｅｎａｓｅ，１９８１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：２１６３−２１６７；ＢｒｏｗｎおよびＡｓｋｅｎａｓｅ，１９８３ Ｆｅｄｅｒａｌ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ４２，１７４４−１７４９）と共に検出される免疫応答を思い起こさせる。二次侵襲における局在化した細胞応答（好塩基球および好酸球多型）および組織応答は、細胞媒介性免疫として公知であり、そしてダニ免疫動物における拒絶の主要な機構であると広範に見なされている。従って、接着部位における局在化した細胞媒介性応答ならびに体液性エフェクター機構および補体依存エフェクター機構を含む、複雑な免疫機構が存在する。
【００９７】
抗体の力価を、それぞれ６４ｔｒｐまたはＧＳＴ抗原で免疫したモルモット由来の抗６４ｔｒｐ血清または抗ＧＳＴ血清を用いて、ＥＬＩＳＡにより決定した（Ｄｅｓａｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１２２，１０９−１１６）。マダニ外寄生の前後の力価の比較は、６４ｔｒｐ１、６４ｔｒｐ２、６４ｔｒｐ３、６４ｔｒｐ５、または６４ｔｒｐ６で免疫したモルモットの抗体力価において一貫した増加を示した。観察された増加は、免疫された動物のマダニ侵入がブースター効果を有しており、既往性応答を誘導することを示す。この応答は、天然のマダニ侵入がさらなる免疫に対する必要性を取り除くことを示す。なぜならば、マダニの摂食は、ワクチン防御を維持するために必要な免疫刺激を提供するからである。従って、１度の免疫のみを必要とする単発ワクチン（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｈｏｔ ｖａｃｃｉｎｅ）が、適切なアジュバントおよび単一６４ｔｒｐ構築物またはそれらのカクテルを用いて調製され得る。
【００９８】
（６４Ｐセメントタンパク質についての研究の要旨）
Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓにより産生されるセメントコーンは、アンカーとして作用し、その宿主の皮膚の表皮および真皮にマダニの口部（ｍｏｕｔｈｐａｒｔ）を固定する。セメントコーンと周囲の宿主組織との間の連結は、漏出耐性シール（ｌｅａｋ−ｐｒｏｏｆ ｓｅａｌ）を形成する。マダニに対する宿主の拒絶応答を引き起こすことを回避するために、セメントタンパク質は、コラーゲンおよびケラチンの構造に類似する構造を取り入れている。セメントタンパク質（６４Ｐ）の短縮形態は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そして抗血清がこのタンパク質に対して惹起された。この結果の要約を、以下の表２に示す。
【００９９】
（表２：６４ＴＲＰタンパク質の性質の要約）
【０１００】
【表２】

ワクチン効果：＋＝６４ｔｒｐ１免疫モルモットでの摂食後のＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ若虫マダニに対する穏やかな強度の効果；＋＋＋＝６４ｔｒｐ２免疫モルモットでの摂食後のＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ若虫マダニおよび成虫マダニに対する非常に強力な効果；＋＋^ａ＝６４ｔｒｐ３免疫モルモットでの摂食後のＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ成虫マダニに対する非常に強力な効果；＋＋^ｎ＝６４ｔｒｐ６免疫モルモットでの摂食後のＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ若虫マダニに対する非常に強力な効果；６４ｔｒｐ４免疫モルモットでの摂食後のＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ成虫マダニおよび若虫マダニに対して効果なし
^＊融合タンパク質の分子量（すなわち、２６ｋＤ ＧＳＴタンパク質＋１ｋＤ ９ＸＨＩＳ．ＴＡＧを含む）
φ融合タンパク質の分子量（すなわち、２６ｋＤ ＧＳＴタンパク質を含む）
（実施例４：Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓセメントタンパク質６４ｔｒｐに対して惹起された抗血清の交差反応性）
（４．１ マダニセメントワクチンの作用機構）
実施例３で試みられたように、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ ６４ｔｒｐの特定のフラグメントを用いたモルモットの免疫は、マダニが摂食を完了した後に成虫雌マダニおよび若年マダニにおいて高い死亡率を生じた。マダニは黒変し、硬直したが、これはマダニの内臓に対する損傷および内臓から体腔への乾燥血液（ｂｌｏｏｄｍｅａｌ）の漏出を示す。
【０１０１】
この仮説を試験するために、免疫ブロットを実施して、マダニセメントフラグメントに対する抗体が内臓の中の抗原および成虫マダニの血リンパと交差反応するか否か、ならびに若虫および幼虫の全体抽出物中の抗原と交差反応するか否かを決定した。
【０１０２】
（４．２ 結果）
抗６４ｔｒｐ２血清は、セメントコーン抽出物中の２２ｋＤおよび２５ｋＤのタンパク質バンドと反応した（図１０Ａ）。この抗血清は、唾液腺（２２、２５ｋＤ）、血リンパ（２２、５２ｋＤ）、若虫抽出物（５２、９８ｋＤ）および幼虫抽出物（５２ｋＤ）（図１０Ａ）、ならびに中腸抽出物（５２ｋＤ）（図１１Ｂ）におけるタンパク質バンドと交差反応性を示した。
【０１０３】
抗６４ｔｒｐ５血清は、セメントコーン抽出物中の３１ｋＤおよび４８〜７０ｋＤのタンパク質バンドと反応した（図１１Ｄ）。この抗血清は、食事を与えられていないマダニの唾液腺抽出物（１５、２２、および３１；図１１Ｃ）および２日間食事を与えられたマダニの唾液腺抽出物（２５、３１ｋＤ；図１１Ｄ）中のタンパク質バンドと交差反応した。交差反応性はまた、中腸（５２〜７０ｋＤ；図１１Ｃ）および血リンパ（３１、４８ｋＤ；図１１Ｄ）のタンパク質バンドを用いても検出されたが、若虫および幼虫抽出物を用いて検出されなかった（図１１Ｄ）。同様の交差反応が、抗６４ｔｒｐ３血清を用いて観察された（示していない）。
【０１０４】
抗６４ｔｒｐ６血清は、セメントコーン抽出物中の２２、２５ｋＤおよび４８〜７０ｋＤのタンパク質バンドと反応した（図１０Ｂ）。この抗血清は、唾液腺（２２、２５ｋＤ）、血リンパ（２２、４８ｋＤ）、および幼虫抽出物（１２０ｋＤ）におけるタンパク質バンド（図１０Ｂ）と、および中腸抽出物（６５〜７０ｋＤ；図１０Ａ）と交差反応したが、若虫抽出物との明らかな交差反応は示さなかった（図１０Ｂ）。
【０１０５】
（４．３ 結論）
ケラチン様タンパク質、６４ｔｒｐ、のＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニセメントフラグメントに対して惹起された抗体は、成虫雌Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓの唾液腺、中腸、および血リンパ中の抗原性エピトープと明らかな交差反応をする。免疫された動物に対して摂取されたマダニの乾燥血液中の抗体によるこれらのエピトープとの反応は、おそらく、中腸に対する損傷を引き起こし、マダニの死の原因となる。冒された雌マダニの中の１匹の解剖は、体腔内に分散した凝血を明らかにした（これは中腸の破裂に一致する）。従って、このワクチンは、マダニの分泌タンパク質（すなわち、「曝露された」抗原）を含むが、中腸（ならびに血リンパおよび唾液腺も可能性がある）における「潜伏した」抗原を標的化する（すなわち、正常な生理学的機能に影響をおよぼす）ことにより、高い死亡率を引き起こす。従って、このセメントフラグメントは：
（ｉ）ワクチン接種した動物の免疫状態をブーストする炎症応答を刺激し、そして
（ｉｉ）潜伏性の抗原を標的化してマダニに対する損傷を引き起こす
二重作用ワクチンを提供する。
【０１０６】
（実施例５：免疫ブロットを用いた他のマダニ種との交差反応性）
Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓセメントタンパク質に対して惹起された抗体が、他のマダニ種の抗原性エピトープと反応するか否かを決定するために、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ（イヌのマダニ）、Ａｍｂｌｙｏｍｍａ ｖａｒｉｅｇａｔｕｍ（アフリカ、南アメリカ、およびカリブのウシの経済的に重要なペスト）およびＩｘｏｄｅｓ ｒｉｃｉｎｕｓ（欧州においてヒトにライム病およびダニ性脳炎を伝染するヒツジまたは木のマダニ）の組織抽出物を用いて免疫ブロットを実施した。
【０１０７】
（５．１ 結果）
抗４ｔｒｐ５血清は、Ａ．ｖａｒｉｅｇａｔｕｍ唾液腺（１８０ｋＤ）および中腸（２５、５２ｋＤ）抽出物ならびに血リンパ（８５ｋＤ）のタンパク質バンドと交差反応した（図１２Ａ）。Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ唾液腺、血リンパまたは中腸を用いて検出された交差反応はなかった（示されていない）。
【０１０８】
抗６５ｔｒｐ６血清は、Ａ．ｖａｒｉｅｇａｔｕｍ血リンパの５０ｋＤバンドと交差反応したが、唾液腺および中腸調製物との活性は示さなかった（図１２Ｂ）。Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓを用いると、数種の唾液腺タンパク質バンド（５１、５３〜５５、６５、１２０ｋＤ）および中腸（２５、５２、および５５ｋＤ）と交差反応が生じたが、血リンパとは交差反応を生じなかった（図１２Ｃ）。不鮮明に現れた交差反応するバンドはおそらくグリコシル化タンパク質である。
【０１０９】
６４ｔｒｐ３抗血清（図１３Ａ）を使用して、２つの明白なバンド（ａおよびｂ）および１つのかすかなバンド（ｃ）を、若虫（ｎｙｍｐｈａｌ）抽出物中で検出し、そして成熟血リンパ、中腸および唾液腺との交差反応性もまた存在した。
【０１１０】
６４ｔｒｐ２に対する抗血清（図１３Ｂ）は、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ抽出物中でいくらかのバンド（全抽出物中に存在する１つの強力なバンド（ｊ）を含む）を検出した。
【０１１１】
ＧＳＴに対して惹起されるコントロール抗血清は、セメントコーンおよび唾液腺において交差反応バンドを検出した（図１４）。唾液腺における交差反応は、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｃｒｏｐｌｕｓについて報告されるように、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ ＧＳＴを示し得、そしてセメントコーンにおける交差反応は、部分的に食物を与えられたマダニから得られた宿主タンパク質ヘモグロビン／ＩｇＧ汚染セメントコーン抽出物との非特異的反応におそらく起因する。
【０１１２】
６４ｔｒｐ２および６４ｔｒｐ５の各々に対する抗血清は、セメントコーン、腸およびＩ．ｒｉｃｉｎｕｓの全若虫抽出物と交差反応した。対照的に、非交差反応は、抗６４ｔｒｐ３を用いて検出された。この観察は、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓおよびＡ．ｖａｒｉｅｇａｔｕｍの組織抽出物を用いて観察された交差反応とは異なった。抗６４ｔｒｐ６血清のＩ．ｒｉｃｉｎｕｓの腸および若虫との交差反応もまた存在した。
【０１１３】
これらの結果を、表３に要約する。
【０１１４】
（５．２ 結論）
Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓセメントタンパク質６４ｔｒｐ構築物に対して惹起される抗体は、３つの他のマダニ種の唾液腺、中腸および血リンパ中で抗原性エピトープと交差反応した。これらの結果は、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓセメント由来の候補ワクチンが、多数の異なるマダニ種に対して有効な広範なスペクトルワクチンを提供することを示唆する。
【０１１５】
観察された高さ反応に基づいて、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓの６４ｔｒｐ６を、ワクチン試行のための免疫原として選択した。上記のように、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓを用いたワクチン試行において（表２を参照のこと）、６４ｔｒｐ６は、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ若虫に対して有効であったが、成熟に対しては有効でなかった。従って、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓを用いたワクチン試行において、成熟Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓに対して有効な２つの構築物のうちの一方（６４ｔｒｐ３または６４ｔｒｐ２のいずれか）は、以下の節に記載されるように、６４ｔｒｐ６と共に含まれた。
表３：６４ｔｒｐ組換え抗原で免疫化されたモルモット由来の血清を用いた、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓとＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓとＡｍｂｌｙｏｍｍａ ｖａｒｉｅｇａｔｕｍとＩｘｏｄｅｓ ｒｉｃｉｎｕｓマダニ抗原との間の交差反応についての結果の要約。
【０１１６】
【表３】

（表３について使用されるコード）
ＣＣ＝マダニセメントコーン抽出物、ＳＧ＝（食物を与えられていないマダニ由来の）唾液腺抽出物、ｇｕｔ＝中腸抽出物、Ｈ＝血リンパ、Ｎ＝若虫マダニ抽出物、Ｌ＝幼生マダニ抽出物。
【０１１７】
免疫ブロットにおいて使用される抗血清に対して、それぞれ、＋＝陽性反応、および−＝陰性反応、ａｂ’＝抗血清；ｎｄ＝なされない。
【０１１８】
＋^＊および＋^δ＝１００℃でＳＤＳサンプル緩衝液中に溶解したＣＣ抽出物およびＳＧ抽出物の不溶性画分由来の抗ＧＳＴ抗血清に対する陽性反応。
【０１１９】
＋^＊（部分的に食物を与えられたマダニ由来のＣＣ）＝免疫陽性バンドは、抗ＧＳＴａｂ’のセメントコーンに結合された宿主ＩｇＧ／ヘモグロビン（ｈａｅｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）画分との非特異的結合におそらく起因する。＋^δ＝（食物を与えられていないマダニ由来のＳＧ）＝免疫陽性バンドは、抗ＧＳＴａｂ’の等価ＧＳＴタンパク質との特異的結合におそらく起因する（Ｒｅｆ．Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ ＧＳＴタンパク質）。
【０１２０】
＋^∞ ＳＤＳ／２メルカプトエタノールサンプル緩衝液中に可溶化された、Ａ．ｖａｒｉｅｇａｔｕｍ不溶性腸抽出物、−^＊ 若虫マダニ抽出物抗原のＧＳＴ抗血清との非特異的結合に起因する非常にかすかな免疫陽性バンド。
【０１２１】
（実施例６：交差保護性ワクチン試行：Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓセメントタンパク質６４ｔｒｐ構築物で免疫化され、かつＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ成熟でチャレンジされたモルモット）
（６．１ ワクチン試行のための処置）
１群：組換え６４ｔｒｐ６＋６４ｔｒｐ２＋Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ（４匹のモルモット）
２群：組換え６４ｔｒｐ６＋６４ｔｒｐ３＋Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ（４匹のモルモット）
３群：ＧＳＴ（コントロール）（２匹のモルモット）
全動物数＝１０
経路および用量：
抗原を単一部位内へか、または各抗原を異なる部位内へかのいずれかに結合させるような前肩甲骨領域における皮下接種。
【０１２２】
用量：５０μｇ抗原／動物
ワクチン接種スキーム：
１．プライマー接種
２．第一ブースト
３．接種後１０〜１２日後に試験出血
４．２回目のブースト（抗体力価が１／５０００未満の場合）
５．接種後１０〜１２日後に試験出血
６．抗体力価が１／５０００より大きい：１０対のＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ成体でチャレンジ
７．マダニの摂食効率、生存、生殖結果を評価。
【０１２３】
（６．２ 結果）
この結果を表４にまとめる。全体的に、この結果は、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓのセメントタンパク質６４ｔｒｐに対して誘導された推定ワクチンは、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓの成体および若虫と交差保護性であったことを示す。以前のＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓの観察とは著しい差異があった。
【０１２４】
【表４】

表４注
＊は、６４ｔｒｐタンパク質カクテル（すなわち、６４ｔｒｐ２／６または６４ｔｒｐ３／６の組合わせ）のいずれかを組合わせた抗原として、単一の皮下部位（Ｃ）か、または別々の皮下部位（Ｓ）へ、個々に免疫したモルモットを示す。Ｉは、マダニ摂食部位での、紅斑、浮腫、引っかき、およびリンパ節腫脹として観察された局所炎症皮膚反応（一過性、２〜３日）事象をいう。ｎｄは、行っていないことをいう。ＭおよびＦは、それぞれオス成体マダニおよびメス成体マダニをいう。Ｅは、孵化した卵を示す。†は、この群において生存していた、産卵しなかった２匹のメスを示す。
【０１２５】
（（ｉ）付着に対する効果）
Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓとは違って、試験（しかし、コントロールではない）Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓの成虫の付着速度は影響を受けた。外寄生の２４時間後、４つの試験動物上のこのマダニの殆どが、付着しておらず、そして保持しているガーゼ上を宿主から離れるように這うところを観察した。続いて、飼育の初期（第１日目〜第５日目）の間、８１のうちの１６体の死んだ成虫（１２体のメスと４体のオス）の全体を、この試験動物から取り除いた；これらのマダニのうち１体を除いた全ては、食物を与えられていないようであった（図１５）。コントロール動物上にいる、１８のマダニの全ては、外寄生から２４時間以内に付着した。
【０１２６】
（（ｉｉ）オスに対する効果）
再度、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓとは違って、オスの生存に関する効果を観察した。上述のように、４体の死んだオスを飼育の初期で除去した。
【０１２７】
（（ｉｉｉ） 炎症応答）
全ての８匹の試験モルモットが、抗原播種部位において炎症応答を示し、そしてまたマダニの生息領域において炎症応答を示した。炎症を、外寄生後６〜７日間で初めて観察し、そして飼育の第９〜１０日目までには小康状態となった。コントロール動物において、炎症は、観察されなかった。
【０１２８】
（（ｉｖ）飼育後の致死率）
Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓで観察されるように、殆どのメス（２９／４１）は充血を完遂した。しかし、これらのうちで、７体は離れてから２日以内で死んだ。これらは、腸に対する損傷および破裂と相反しない、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓに対する類似の効果（過度の膨張および黒色化）を示した（図１６）。試験動物からの若虫で観察される、中程度の致死率は、コントロールの場合に匹敵した。
【０１２９】
（（ｖ）再現的な出力）
試験動物からの、２２体の生き残った充血したメスのうち、１９体は産卵した。これらの統計的な解析が、目下決定される。
【０１３０】
（６．３ 結論）
１．６４ｔｒｐタンパク質に対して惹起された抗体は、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ マダニの唾液腺および中腸中の、免疫原性エピトープとイムノブロットにおいて、交差反応する。
【０１３１】
２．マダニＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ由来の分泌されたセメントタンパク質（すなわち、「露出された」抗原）から構築された異なった６４ｔｒｐタンパク質を含むワクチンのカクテルは、別のマダニの種 Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓに対する交差保護（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を、高い致死率を生じる、成虫のマダニの中腸および唾液腺に「潜伏した（ｃｏｎｃｅａｌｅｄ）」抗原を標的化することによって、提供した。
【０１３２】
３．カクテルワクチンは、ワクチン接種した動物の免疫状態をブーストする局所的な炎症性免疫応答を刺激する。
【０１３３】
（実施例７：Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ セメントタンパク質６４ｔｒｐ構築物に対する抗血清を使用した、イムノブロットによって検出された、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓとＢｏｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｒｏｐｌｕｓとの間の抗原性交差反応性）
（７．１ Ｂ．ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ マダニ抽出物の調製）
Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｃｒｏｐｌｕｓの成虫および若虫を、ウシから採取した。若虫を飼育し、従って、宿主タンパク質に起因する非特異的交差反応性の増大したレベルを示し得る。
【０１３４】
（７．２ 結果）
（７．２．１ ６４ｔｒｐ２抗血清および６４ｔｒｐ３抗血清との交差反応性）
イムノブロッティングを使用した６４ｔｒｐ３抗血清との交差反応研究（図１７Ａ）は、いくつかのＢ．ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ セメントコーンタンパク質（ｃ，ｉ、ｊ、ｋおよびｌ）を検出した；類似サイズの２つのバンド（ｃおよびｈ）を、中腸および唾液腺で検出した。多くのバンドを、飼育した若虫の抽出物中で検出し、そのいくつかは、おそらく非特異的であった（以下を参照のこと）。
【０１３５】
６４ｔｒｐ２抗血清（図１７Ｂ）を使用して、１つの明確なバンド（ｏ）を、全ての抽出物中で検出した。このバンドは、６４ｔｒｐ３抗血清を用いる全てのサンプル中で検出されたバンドｃと類似のサイズ（６２ｋＤ）であるが、バンドｃは明確ではなかった。バンドｃ／ｏを、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色ゲル（図１７Ｃ）中で僅かに検出可能であった。このことは、６４ｔｒｐ２抗血清または６４ｔｒｐ３抗血清との交差反応性が特異的である可能性があり、そして非特異的結合に起因しないことを示す。また、この解釈と一貫性があるのは、６４ｔｒｐ２タンパク質および６４ｔｒｐ３タンパク質が、重複したＮ末端配列を伴う関連した構築物であるという事実である（図２を参照のこと）。
【０１３６】
６４ｔｒｐ２抗血清を用いて、淡いバンド（ｑ）を全てのサンプルで検出した。セメントコーン（レーン５）および若虫抽出物（レーン２）は、共通の明確なバンド（ｎおよびｐ）を有し、一方でバンドｒを、全ての成虫抽出物中で検出した。
【０１３７】
ｅとして記されるイムノポジティブバンドは、マダニ組織抽出物中に存在する、宿主タンパク質（ヘモグロビン／ＩｇＧ）との、抗ＧＳＴ抗血清の非特異的結合に最も起因しやすい。イムノポジティブバンドｆは、中腸、唾液腺、およびマダニの組織抽出物の全体の中にあるタンパク質バンド（これは、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ 幼虫２６ｋＤ ＧＳＴタンパク質を表す）との、抗ＧＳＴ抗血清の特異的結合（図１８Ｃを参照のこと）におそらく起因する（Ｈｅら、（１９９９）、Ｉｎｓｃｅｃｔ−Ｂｉｏｃｈｅｍ−Ｍｏｌ−Ｂｉｏｌ．２９（８０）：７３７〜４３を参照のこと）。
【０１３８】
（７．２．２ ６４ｔｒｐ５抗血清および６４ｔｒｐ６抗血清との交差反応性）
６４ｔｒｐ５抗血清および６４ｔｒｐ６抗血清の両方を、若虫抽出物中でいくつかのバンドで検出したが、成虫マダニ抽出物との明確な交差反応性は無かった（図１８Ａおよび１８Ｂ）。６４ｔｒｐ５抗血清は、セメントコーンとの優勢なバンド（ｂ）を生成するが、交差反応性は、６４ｔｒｐ６とセメントコーン抽出物との間に検出されなかった。
【０１３９】
ａおよびｅとして記されるイムノポジティブバンドは、セメントコーン抽出物および飼育したマダニの若虫抽出物全体の中にそれぞれ存在する、宿主タンパク質（ヘモグロビン／ＩｇＧ）との、抗ＧＳＴ抗血清の非特異的結合に、おそらく起因する（図１８Ｃ）。イムノポジティブバンドｆは、中腸、唾液腺、およびマダニの組織抽出物の全体の中にあるタンパク質バンド（おそらく、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ 幼虫の２６ｋＤであるＧＳＴタンパク質）との、抗ＧＳＴ抗血清の特異的結合に、おそらく起因する。
【０１４０】
（７．３ 結論）
結果を、表５に要約した。
【０１４１】
Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓおよびＩｘｏｄｅｓ ｒｉｃｉｎｕｓを用いた本発明者らのワクチン試験は、免疫ブロッティングのデータが、効果的なワクチン免疫原の良い指標を提供することを示した。このことに基づいて、この実施例に表されるこの結果は、以下を示唆する：
（ｉ） ６４ｔｒｐ２および６４ｔｒｐ３は、Ｂ．ｍｉｃｏｒｐｌｕｓ成体およびＢ．ｍｉｃｏｒｐｌｕｓ若虫を制御するための候補ワクチン免疫原である；
（ｉｉ） ６４ｔｒｐ５構築物は、Ｂ．ｍｉｃｏｒｐｌｕｓ若虫に対して効果的であり得、そして成体に対して少なくとも部分的に効果的であり得る；
（ｉｉｉ） ６４ｔｒｐ６は、Ｂ．ｍｉｃｏｒｐｌｕｓ若虫に対して効果的であり得るが、成体に対して効果的であり得ない；
（ｉｖ） 免疫原のカクテル（６４ｔｒｐ２＋６４ｔｒｐ５または６４ｔｒｐ３＋６４ｔｒｐ５のいずれか）は、Ｂ．ｍｉｃｏｒｐｌｕｓを制御するための最も効果的な戦略であり得る。
【０１４２】
（表５：６４ｔｒｐ組換え抗原で免疫したモルモット由来の血清を使用したＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマイクロカプセルマダニ抗原とＢｏｏｐｈｉｌｕｓマイクロカプセルマダニ抗原との間の交差反応性）
【０１４３】
【表５】

ＣＣ＝マダニセメントコーン抽出物（ｔｉｃｋ ｃｅｍｅｎｔ ｃｏｎｅ）、ＳＧ＝唾液腺抽出物、ｇｕｔ＝中腸抽出物、Ｈ＝血液リンパ、Ｎ＝若虫マダニ抽出物、Ｌ＝幼生マダニ抽出物
それぞれ、免疫ブロットにおいて使用した抗血清に対する、＋＝陽性反応および−＝陰性反応。ａｂ’＝抗血清；ｎｄ＝測定せず
＋^＊および＋^δ＝ＳＤＳサンプル緩衝液に１００℃で可溶化したマダニ組織抽出物の不溶性画分由来の抗ＧＳＴ抗血清に対する陽性反応。
【０１４４】
＋^＊（部分的に肥育されたマダニ由来のＣＣ）免疫陽性バンドは、おそらくセメントコーンに結合する宿主ＩｇＧ／ヘモグロビン画分および肥育されたマダニの全若虫由来の宿主ＩｇＧ／ヘモグロビン画分との抗ＧＳＴ ａｂ’の非特異的結合が原因である
＋^δ（肥育されていないマダニ由来のＳＧ）免疫陽性バンドは、おそらく等価のＧＳＴタンパク質^１との抗ＧＳＴ ａｂ’の特異的な結合が原因である。
【０１４５】
（実施例８：交差反応性ワクチン試験：Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓセメントタンパク質６４ｔｒｐ構築物で免疫され、そしてＩ．ｒｉｃｉｎｕｓ若虫でチャレンジされたモルモット）
（８．１ 免疫原の選択）
Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ６４ｔｒｐのセメント構築の要約を、図２に示す。候補の免疫原を、構築物に対する抗血清が、Ｉ．ｒｉｃｉｎｕｓサンプルの抽出物における特異的な交差反応抗原を検出したかどうかの根拠において同定した。
【０１４６】
６４ｔｒｐ抗血清を用いた免疫ブロッティングを使用した交差反応研究は、幾つかのＩ．ｒｉｃｉｕｓ全若虫抽出タンパク質および幼虫抽出タンパク質（図１９）ならびにセメントコーンの成体調製物および中腸抽出物（示さず）の検出を示した。
【０１４７】
６４ｔｒｐ２抗血清（図１９Ａ（ｉｉｉ））を使用して、２つの主要なバンド（ａおよびｂ）を、若虫抽出物において検出し、そしてまた、成体セメントコーンおよび中腸抽出物と交差反応を示した（表３を参照のこと）。
【０１４８】
６４ｔｒｐ５および６４ｔｒｐ６に対する抗血清（それぞれ、図１９Ａ（ｉｖ）および（ｖ））は、Ｉ．ｒｉｃｉｎｕｓ全若虫抽出物において幾つかのバンドを検出した。６４ｔｒｐ６に対する抗血清はまた、全幼虫抽出物において５つの優性なバンドを検出した（図１９Ｂ（ｉｉ））。
【０１４９】
ＧＳＴに対して惹起されたコントロール抗血清は、おそらく宿主タンパク質ヘモグロビン／ＩｇＧを使用する非特異的反応の原因である、全若虫抽出物、セメントコーン抽出物および中腸抽出物において非常に弱いバンドを検出した。
【０１５０】
観察した交差反応に基づいて、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓの６４ｔｒｐ２、６４ｔｒｐ５および６４ｔｒｐ６を、ワクチン試験のための免疫原とし選択した。これらを、単独でまたはカクテルとして使用した。
【０１５１】
（８．２ ワクチン試験のための処置）
・群１：組換え体６４ｔｒｐ６＋６４ｔｒｐ２＋Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ（１匹のハムスター）
・群２：組換え体６４ｔｒｐ６＋６４ｔｒｐ５＋Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ（１匹のハムスター）
・群３：ＧＳＴ（コントロール）（１ハムスター）
・群４：組換え体６４ｔｒｐ２＋Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ（１匹のハムスター）
・群５：組換え体６４ｔｒｐ５＋Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ（１匹のハムスター）
・群６：組換え体６４ｔｒｐ６＋Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ（１匹のハムスター）
総動物数＝６匹。
【０１５２】
（８．３ 経路および用量）
肩甲骨前（ｐｒｅｓｃａｐｕｌａｒ）領域における、単一の部位への単一の抗原または組み合わせとしての抗原のいずれかの皮下接種。
１匹の動物当たり、用量２５μｇ抗原。
【０１５３】
（８．４ ワクチン接種スキーム）
１．プライマー接種
２．最初のブースト
３．接種後１０〜１２日目での試験採血
４．第二のブースト（抗体力価＜１／５０００の場合）
５．接種後１０〜１２日目での試験採血
６．抗体力価＞１／５０００：５０〜１００のＩ．ｒｉｃｉｎｕｓ若虫でのチャレンジ
７．ダニの食餌成績、ダニの食餌に対する局所的な炎症性免疫応答、生存および成虫への成功した脱皮の評価。
【０１５４】
（８．５ 結果）
結果を表６に要約する。全体的に、これらは、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓのセメント質に対して誘導された推定ワクチンが、Ｉ．ｒｉｃｉｎｕｓ若虫に対して交差反応することを示す。
【０１５５】
（（ｉ）付着に対する効果）
Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓのように、Ｉ．ｒｉｃｉｎｕｓ若虫の試験動物に対する付着の割合は、影響されなかった。
【０１５６】
（（ｉｉ）炎症性応答）
４匹のハムスターは、ダニの食餌の部位での炎症性応答を示し、３匹のハムスターは、重篤な反応を有した（図２０）。この結果は、インビトロのアッセイ（すなわち、ウェスタンブロット）と相関する。炎症は、外寄生後３〜５日目に観察され、そしてダニの離脱の時点にまだ存在した（食餌の５日目）。コントロールの動物では、炎症は観察されなかった。
【０１５７】
（（ｉｉｉ）食餌後の死亡率）
インビトロアッセイとの関係における交差防御を、食餌した若虫が脱皮して成虫になったときに評価する。
【０１５８】
（８．６ 結論）
１．６４ｔｒｐタンパク質に対して惹起された抗体は、イムノブロットにおいて、Ｉ．ｒｉｃｉｎｕｓマダニの若虫、幼虫および成虫のセメントコーンならびに中腸における抗原性エピトープと交差反応する。
２．宿主応答は、６４ｔｒｐ免疫原で免疫したハムスターにおいて観察された（以前はモルモットにおいてのみ観察された）。
３．種々の程度の炎症性応答が、６４ｔｒｐ構築物で免疫された動物上のＩ．ｒｉｃｉｎｕｓ若虫マダニ食餌部位で観察され、最も重篤な応答は、６４ｔｒｐ６／５のカクテルで免疫されたハムスターにおいて観察された。
４．免疫原は、免疫応答をブーストする局所的炎症性免疫応答を刺激する。
【０１５９】
（表６．６４ＴＲＰタンパク質およびＧＳＴタンパク質で免疫したハムスター上のＩｘｏｄｅｓ ｒｉｃｉｎｕｓマダニ食餌についての、食餌パラメーターの比較）
【０１６０】
【表６】

ｉ＝炎症：−および＋は、それぞれ、食餌の間のマダニ付着部位での炎症の非存在または存在を意味する；炎症の程度は、以下によって示される：＋＝軽度、＋＋＝中程度、および＋＋＋＝重篤。^＊は、若虫Ｉ．ｒｉｃｉｎｕｓマダニのコントロールハムスター上のダニ食餌をいい、６４ｔｒｐ免疫ハムスター上で食餌したマダニ食餌と比較して、６時間延長された。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、推定セメントタンパク質の７種のクローンのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列である。
クローン２１：クローン２１の部分ｃＤＮＡ配列および転写産物。ｃＤＮＡ推定タンパク質は、セメントタンパク質であると予測される：可能であれば、シグナル配列、代表的に、分泌産物を構築する疎水性Ｎ末端領域を含み、そして構造タンパク質、特に、ケラチンと非常に類似している。グリコサミノグリカン基の翻訳後結合のための認識配列に、下線を付す。
クローン３３：融合タンパク質発現ベクター（ｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））へのＰＣＲ−クローン化産物（ｃＤＮＡライブラリ由来）の推定タンパク質配列。推定シグナル配列を、太字で示す。多くの構造タンパク質と同様に、このタンパク質は、グリシンリッチおよびプロリンリッチである。このタンパク質は、ケラチンといくらか類似性を有する。^＊は、停止コドンを示す。
クローンｃｅｍＡ：ｃｅｍＡ ｃＤＮＡおよびタンパク質（推定リーディングフレーム）の部分的な配列。このタンパク質は、非常に反復性であり、配列ＫＧＡＬＬＱＱＱＱＡＳＱＶＫＧＡＬＫＡＩまたはそのわずかな改変体を有し、数回繰り返される。
クローン２４：クローン２４の不完全なｃＤＮＡおよびｃＤＮＡ推定配列。このタンパク質は、構造タンパク質（特に、コラーゲン）に対して類似性を有し、そして繰り返し配列を含む。多くの関連のクローンは、このライブラリー中に見出される。このｃＤＮＡはまた、グルテニン（自己アセンブリタンパク質）との共通の領域を含む。
クローン６８：クローン６８の部分的なｃＤＮＡおよびｃＤＮＡ推定配列。このライブラリーは、類似のクローンのファミリーを含む。このコードされたタンパク質は、構造タンパク質（例えば、ケラチン）と類似している。一連の可能なグリコサミノグリカン結合部位に、下線を付す。
クローン６４：クローン６４の不完全ｃＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ推定タンパク質配列。この推定シグナル配列を、太字で示す。可能なグリコサミノグリカン結合部位に下線を付す。成熟タンパク質の最初の４０個のアミノ酸断片は、コラーゲン様であり、この配列の残りは、ケラチンに類似している。このタンパク質は、グリシンリッチであり、そしてモチーフ（Ｃ／Ｓ）１−４（Ｙ／Ｆ）の数回繰り返しを含み、これはまた、昆虫の卵の殻由来の構造タンパク質において見出される。このチロシンは、フェノロキシダーゼによるジチロシン−架橋の形成による架橋に関与し得る。類似のタンパク質は、クローンＩ（以下を参照のこと）によりコードされる。^＊は、停止コドンを示す。
クローンＩ：クローンＩの不完全なｃＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ推定タンパク質配列。この推定タンパク質は、グリシンリッチおよびチロシンリッチであり、そしてリーフ構築物（ｒｅｅｆ−ｂｕｉｄｉｎｇ）の多毛類Ｐｒａｇｍａｔｏｐｏｍａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａのセメントタンパク質（これらの海洋寄生虫によって構築された管中のキノン黄渇色セメントの成分）に類似している。
【図２】 図２は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて発現される６４Ｐタンパク質フラグメント（６４ＴＲＰ）のアミノ酸配列。Ｐ１／Ｐ２、Ｐ１／Ｐ３、Ｐ４／Ｐ５、Ｐ６／Ｐ５、Ｐ１／Ｐ５およびＰ７／Ｐ５は、６４Ｐタンパク質の短縮型バージョン（すなわち、それぞれ、６４ｔｒｐ２（５１アミノ酸）、６４ｔｒｐ３（７０アミノ酸）、６４ｔｒｐ１（２９アミノ酸）、６４ｔｒｐ４（６３アミノ酸）、６４ｔｒｐ５（１３３アミノ酸（ＨＩＳタグを含まない））、および６４ｔｒｐ６（１３３アミノ酸（ＨＩＳタグを含む）））としてのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞における発現について、６４Ｐアミノ酸配列からプラスミドｐＧＥＸ−２ＴへＰＣＲ産物をサブクローニングするために使用されるプライマーを表す。予測される可能な切断シグナルペプチド（アミノ酸１〜１８）は、緑色の下線が付されている。
【図３】 図３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥである：（Ａ）Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅで染色した、４〜１２％の勾配のＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルであり、（Ｂ）および（Ｃ）は、それぞれ、マダニ構造タンパク質ならびにベクター−ＧＳＴタンパク質、６４Ｐの組換え短縮型バージョン（ｔｒｐ）（すなわち、ｔｒｐ１、ｔｒｐ２、ｔｒｐ３およびｔｒｐ４）を発現するＩＰＴＧ誘導性Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の、ＧＳＴモノクローナル抗体（１：５００希釈）およびＨＩＳ−タグモノクローナル抗体アルカリホスファターゼ結合体（１：２０００希釈）を使用する、ウエスタンブロットである。レーン：１＝分子量マーカー、２＝２６ｋＤベクター−ＧＳＴタンパク質、３＝３０ｋＤのｔｒｐ１タンパク質、４＝３３ｋＤのｔｒｐ２タンパク質、および５＝３６ｋＤのｔｒｐ３タンパク質、６＝３５ｋＤのｔｒｐ４タンパク質、７＝４１ｋＤのｔｒｐ５タンパク質（ＨＩＳタグなし）、および８＝４２ｋＤのｔｒｐ６タンパク質（ＨＩＳタグ化）。サンプルは、ゲルを充填する前に、ＳＤＳ中１００℃で可溶化した。矢印：ａ＝４２ｋＤのｔｒｐ６タンパク質、ｂ＝３５ｋＤのｔｒｐ４タンパク質、ｃ＝３３ｋＤのｔｒｐ２タンパク質、ｄ＝３０ｋＤのｔｒｐ１タンパク質、およびｅ＝２６ｋＤのベクターＧＳＴ−タンパク質。
【図４】 図４は、ハムスターの薄い皮膚部分についての抗６４ｔｒｐ抗血清を使用する免疫ペルオキシダーゼの研究である。ＡおよびＣ＝一次抗体として、それぞれ抗６４ｔｒｐ抗血清：６４ｔｒｐ３および６４ｔｒｐ２と共にインキュベートしたハムスターの薄い皮膚部分；Ｂ＝一次抗体として、すなわちコントロールサンプルとしてＰＢＳ（生理食塩溶液）と共にインキュベートしたハムスターの薄い皮膚部分。１＝表皮の角質化層（角質層）、２＝表皮および３＝真皮；Ｋ＝ケラチノサイトおよびＣＦ＝コラーゲン繊維は、抗６４ｔｒｐ３抗血清とのポジティブな反応（黄色／褐色）を与えた。倍率＝２０×。
【図５】 図５は、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓを供給した後のハムスターの薄い皮膚部分についての、抗６４ｔｒｐ抗血清を使用する免疫ペルオキシダーゼ研究である。ＡおよびＣ＝一次抗体として、それぞれ、抗６４ｔｒｐ抗血清：６４ｔｒｐ３および６４ｔｒｐ２と共にインキュベートしたハムスターの薄い皮膚部分；およびＢ＝一次抗体の代わりに、すなわちコントロールサンプルとしてＰＢＳ（生理食塩溶液）と共にインキュベートしたハムスターの皮膚部分。矢印：１＝表皮；２＝真皮；３＝浅在筋膜；４＝マダニセメント錐体；および＊＝抗６４ｔｒｐ３抗血清と共にインキュベートした場合、ポジティブな反応を与えるセメント錐体およびハムスター皮膚の部分。倍率＝１０×。
【図６】 図６は、６４Ｐタンパク質の短縮型バージョン（６４ＴＲＰ）で免疫したモルモットを摂食するＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ若虫の影響を示す。Ａ＝ＧＳＴで免役したコントロールモルモットを摂食するＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ若虫を含む細胞；Ｂ、ＣおよびＤ＝６４ｔｒｐタンパク質で免役したモルモットを摂食するＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ若虫を含む細胞。＊＝Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ若虫が摂食した免役したモルモットＢ、ＣおよびＤの皮膚上の炎症（すなわち、紅斑、浮腫、リンパ節腫脹、および接触すると熱い）の部位を示す矢印。
【図７】 図７は、６４ｔｒｐタンパク質で免疫したモルモットを摂食した後の、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ雌性成体マダニに対する効果を示す。ＡおよびＢ＝それぞれ、６４ｔｒｐタンパク質および６４ｔｒｐ３タンパク質で免役したモルモットを摂食した後の、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ雌性マダニ；およびＣ＝ＧＳＴで免役したコントロールモルモットを摂食した後の、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ雌性マダニ。１＝生きた雌性マダニ、２＝卵、および３＝死亡した雌性マダニ。
【図８】 図８は、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニを供給した後の、６４ｔｒｐタンパク質で免役したモルモットの皮膚生検の剖検研究を示す。Ａ、ＢおよびＣ＝それぞれ、６４ｔｒｐ１タンパク質、６４ｔｒｐ６タンパク質および６４ｔｒｐ２タンパク質で免役したモルモットの皮膚生検、ならびにＤおよびＥ＝Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニを供給した後の、ＧＳＴで免役したコントロールモルモットの皮膚生検；１＝表皮、２＝真皮／浅在筋膜、３＝以前のマダニ付着部位、４＝壊死外傷。
【図９】 図９は、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニを供給した後の、６４ｔｒｐタンパク質で免役したモルモットの皮膚部分（ヘマトキシリンおよびエオシン、ならびにライト染料で染色）の組織学的研究を示す。１＝ＧＳＴで免役したコントロールモルモットの皮膚の組織学的部分、ならびに２、３、４、５、６、７および８＝Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ成体マダニを供給した後の、６４ｔｒｐタンパク質で免役したモルモットの皮膚の組織学的部分、染色：ヘマトキシリンおよびエオシン染色＝部分１、２、３、７および８、ならびにライト染色＝部分４、５および６；部分１、２および３の倍率＝１０×；部分７および８の倍率＝２０×；部分４、５および６の倍率＝１００×。矢印：Ａ＝表皮、Ｂ＝真皮、ｃｃ＝Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニセメント錐体が以前に付着した領域、ＣＦ＝コラーゲン繊維、Ｄ＝デンドロサイト（ｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）、Ｆ＝線維芽細胞、ＥＰ＝好酸球多型、ＢＰ＝好塩基球多型。
【図１０】 図１０は、６４ｔｒｐ組換えタンパク質で免役したモルモット由来の血清を使用する、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ抗原の可溶性画分間の交差反応性を示す。
図１０Ａ：抗６４ｔｒｐ２血清でプローブしたＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＡ／１およびＡ／２ セメント錐体；レーンＡ／３およびＡ／４ 唾液腺；レーンＡ／５およびＡ／６ 血リンパ；レーンＡ／７ 若虫；レーンＡ／８ 幼生；レーンＡ／９ 分子量マーカー^＊。
図１０Ｂ：抗６４ｔｒｐ６血清でプローブしたＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＢ／１およびＢ／２ セメント錐体；レーンＢ／３およびＢ／４ 唾液腺；レーンＢ／５およびＢ／６ 血リンパ；レーンＢ／７ 若虫；レーンＢ／８ 幼生；レーンＢ／９ 分子量マーカー^＊。
図１０Ｃ：Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ抗原（雌性および雄性）のクマシーブルーで染色した４〜１２％勾配のゲル。レーンＣ／１ 分子量マーカー^＊＊；レーンＣ／２およびＣ／３ セメント錐体；レーンＣ／４およびＣ／５ 唾液腺抽出物；レーンＣ／６およびＣ／７ 血リンパ；レーンＣ／８およびＣ／９ 中腸；レーンＣ／１０ 若虫；レーンＣ／１１ 幼生。
図１０Ｄ：抗６４ｔｒｐ６抗血清でプローブしたＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＡ／１ 分子量マーカー^＊；レーンＡ／２およびＡ／３ 給餌されていないマダニの唾液腺；レーンＡ／４、Ａ／５ 中腸。
図１０Ｅ：抗６４ｔｒｐ２抗血清でプローブしたＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＢ／１およびＢ／２ 給餌されていないマダニの唾液腺；レーンＢ／３およびＢ／４ 中腸；レーン５ 分子量マーカー^＊。
図１０Ｆ：抗６４ｔｒｐ５を使用するＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＣ／１ 分子量マーカー^＊；レーンＣ／２およびＣ／３ 給餌されていないマダニの唾液腺；レーンＣ／４およびＣ／５ 中腸。
図１０Ｇ：抗６４ｔｒｐ５抗血清を使用するＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＤ／１およびＣ／２ セメント錐体；レーンＤ／３およびＤ／４ 部分的に給餌された（２日目）マダニの唾液腺；レーンＤ／５およびＤ／６ 血リンパ；レーンＤ／７ 若虫；レーンＤ／８ 幼生；レーンＤ／９ 分子量マーカー^＊。
【図１１】 図１１は、６４ｔｒｐ組換えタンパク質で免役したモルモット由来の血清を使用するＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ抗原の不溶性画分間の交差反応性を示す。
図１１Ａ：抗６４ｔｒｐ３血清でプローブした成体雌性組織抽出物由来のＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＡ／１ マーカー^＊＊＊；レーンＡ／２ セメント錐体（モルモットを部分的に摂食した雌性由来）；レーンＡ／３ 給餌していないマダニ唾液腺；レーンＡ／４ 給餌していないマダニ血リンパ；レーンＡ／５ 給餌していないマダニ中腸。
図１１Ｂ：抗６４ｔｒｐ２血清でプローブした成体雌性組織抽出物由来のＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＢ／１、Ｂ／２、Ｂ／３およびＢ／４は、レーンＡ／２〜５の通り。
図１１Ｃ：抗６４ｔｒｐ６血清でプローブしたＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＣ／１ 全若虫；レーンＣ／２ 全幼生。
図１１Ｄ：抗６４ｔｒｐ２血清でプローブしたＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＤ／１ 全若虫；レーンＤ／２ 全幼生；レーンＤ／３ マーカー^＊＊＊。
図１１Ｅ：コントロール抗ＧＳＴ血清でプローブしたＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＥ／１ マーカー^＊＊＊；レーンＥ／２ セメント錐体（レーンＡ／２と同様）；レーンＥ／３ 唾液腺（レーンＡ／３と同様）；レーンＥ／４ 血リンパ（レーンＡ／４と同様）、レーンＥ／５ 中腸（レーンＡ／５と同様）；レーンＥ／６ 若虫（レーンＣ／２およびＤ／２と同様）；レーンＥ／７ 幼生（レーンＣ／１、Ｃ／２と同様）。
図１１Ａ〜Ｅのマーカー^＊＊＊ ＳｅｅＢｌｕｅ^ＴＭ Ｐｌｕｓ２タンパク質分子量マーカー：１８８ｋＤ＝ミオシン、９８ｋＤ＝ホスホリラーゼＢ、６２ｋＤ＝ウシ血清アルブミン、４９ｋＤ＝グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、３８ｋＤ＝アルコールデヒドロゲナーゼ、２８ｋＤ＝カルボニックアンヒドラーゼ、１７ｋＤ＝ミオグロビンレッドおよび１４ｋＤ＝リゾチーム。
図１１Ｆ Ｒ． ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ抗原のＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色４〜１２％勾配ゲル。
レーンＦ／１マーカー^＊＊、レーンＦ／２ 部分的に飼育された雄性のセメントコーン、レーンＦ／３ 部分的に飼育された雌性のセメントコーン、レーンＦ／４ 飼育されていない雄性の唾液腺、レーンＦ／５ 飼育されていない雌性の唾液腺、レーンＦ／６ 雄性血リンパ、レーンＦ／７雌性血リンパ、レーンＦ／８雄性中腸、レーンＦ／９ 雌性中腸、レーンＦ／１０ 全若虫、レーンＦ／１１ 全幼虫。２６ｋＤのバンドｆ（これは、唾液線における交差反応）は、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ について報告されたものに等しいＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ ＧＳＴを表し得る（Ｈｅら，（１９９９）．Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：７３７−７４３）。
図１１Ａ〜Ｆ。標識されたバンドの分子量：ａ＝２００ｋＤ、ｂ＝１２０〜１８８ｋＤ、ｃ＝８０〜９８ｋＤ、ｄ＝５５〜６２ｋＤ、ｅ＝４９〜５５ｋＤ、ｆ＝２６ｋＤ、ｇ＝１７ｋＤ、ｈ＝１５Ｋｄ、ｉ＝１２０ｋＤ、ｊ＝６０〜６２ｋＤ、ｋ＝３６ｋＤ、１＝１４ｋＤ、ｍ＝１８８ｋＤ、ｎ＝９８〜１２０ｋＤ、ｏ＝５５〜６２ｋＤ、ｐ＝２００ｋＤ、ｑ＝１８８ｋＤ、ｒ＝１５０ｋＤおよびｓ＝５０〜６２ｋＤ。
【図１２】 図１２は、組換えＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ ６４ｔｒｐタンパク質で免疫されたモルモット由来の抗血清と、Ａｍｂｌｙｏｍｍａ ｖａｒｉｅｇａｔｕｍおよびＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓマダニ抗原との交差反応性を示す。
Ａ 抗６４ｔｒｐ５血清を用いてプローブされたＡ．ｖａｒｉｅｇａｔｕｍマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＡ／１ 血リンパ；レーンＡ／２ 中腸；レーンＡ／３ 唾液腺；レーンＡ／４ 分子量マーカー^＊。
Ｂ 抗６４ｔｒｐ６血清でプローブされたＡ．ｖａｒｉｅｇａｔｕｍマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＡ／１ 分子量マーカー^＊；レーンＡ／２ 唾液腺；レーンＡ／３ 中腸；レーンＡ／４ 血リンパ。
Ｃ 抗６４ｔｒｐ６血清でプローブされたＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＡ／１ 分子量マーカー^＊；レーンＡ／２ 唾液腺；レーンＡ／３ 中腸；レーンＡ／４ 血リンパ。
図１０〜１２について、^＊は、ＭｕｌｔｉＭａｒｋＴＭタンパク質分子量マーカー（ＮＯＶＥＸ）を表す：９８ｋＤａ＝ホスホリラーゼＢ、５２ｋＤａ＝グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、３１ｋＤａ＝カルボニックアンヒドラーゼ、１９／１７ｋＤａ＝ミオグロビンＲｅｄ／Ｂｌｕｅ、１１ｋＤａ＝リゾチーム、６ｋＤａ＝アプロチニン、３ｋＤａ＝インスリン。
^＊＊は、Ｍａｒｋ １２ＴＭタンパク質分子量マーカー（ＮＯＶＥＸ）を表す：２００ｋＤａ＝ミオシン、１１６．３ｋＤａ＝βカラクトシダーゼ、９７．４ｋＤａ＝ホスホリラーゼ ｂ、６６．３ｋＤａ＝ウシ血清アルブミン、５５．４ｋＤａ＝グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、３６．５ｋＤａ＝乳酸デヒドロゲナーゼ、３１ｋＤａ＝カルボニックアンヒドラーゼ、２１．５ｋＤａ＝トリプシンインヒビター、１４．４ｋＤａ＝リゾチーム、６ｋＤａ＝アプロチニン、３．５ｋＤａ＝インスリンＢ鎖および２．５ｋＤａ＝インスリンＡ鎖。
【図１３】 図１３は、組換えＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ ６４ｔｒｐタンパク質で免疫されたモルモット由来の抗血清を使用するＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓマダニ抗原間の交差反応性を示す。
ＡおよびＢ 各々、抗６４ｔｒｐ３抗血清および抗６４ｔｒｐ２抗血清を使用するＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓマダニ抗原の免疫ブロット。Ｃ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色された４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ勾配ゲル（ＮｕＰＡＧＥ−ＮＯＶＥＸ）。
レーンＡ／１およびＢ／１：ＳｅｅＢｌｕｅ^ＴＭ Ｐｌｕｓ２タンパク質分子量マーカー（ＮＯＶＥＸ） １８８ｋＤ＝ミオシン；９８ｋＤａ＝ホスホリラーゼＢ；６２ｋＤ＝ＢＳＡ；４９ｋＤ＝グルタミン酸デヒドロゲナーゼ；３８ｋＤ＝アルコールデヒドロゲナーゼ；２８ｋＤ＝カルボニックアンヒドラーゼ；１７ｋＤ＝ミオグロビンレッド；１４ｋＤ＝リゾチーム；６ｋＤ＝アプロチニン。
レーンＣ／１：Ｍａｒｋ１２^ＴＭタンパク質分子量マーカー（ＮＯＶＥＸ） ２００ｋＤ＝ミオシン； １１６．３ｋＤ＝β−ガラクトシダーゼ；９７．４ｋＤ＝ホスホリラーゼｂ；６６．３ｋＤ＝ウシ血清アルブミン；５５．４ｋＤ＝グルタミン酸デヒドロゲナーゼ；３６．５ｋＤ＝乳酸デヒドロゲナーゼ；３１ｋＤ＝カルボニックアンヒドラーゼ；２１．５ｋＤ＝トリプシンインヒビター；１４．４ｋＤ＝リゾチーム；６ｋＤ＝アプロチニン。
レーン：Ａ／２、Ａ／３、Ａ／４、Ａ／５、Ａ／６、Ａ／７およびＡ／８：各々、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ全若虫抽出物、血リンパ、雄性中腸抽出物、雌性中腸抽出物、雄性唾液腺抽出物、雌性唾液腺抽出物、ならびに組み合わせた雄性および雌性セメントコーン抽出物（モルモットの部分的に存在するマダニ由来）であり、これらの免疫陽性バンドは、抗６４ｔｒｐ３抗血清を使用して、ａ＝６ｋＤ、ｂ＝１７ｋＤ、ｃ＝１８８ｋＤ、ｄ＝２６ｋＤ、ｅ＝２８ｋＤ、ｆ＝６０ｋＤおよびｇ＝８０ｋＤとして観察された。
レーン：Ｂ／２、Ｂ／３、Ｂ／４、Ｂ／５、Ｂ／６、Ｂ／７およびＢ／８：Ａと同様に、これらの免疫陽性バンドを、抗６４ｔｒｐ２抗血清を使用して、ｈ＝１２０ｋＤ、ｉ＝６２ｋＤおよびｊ＝６０ｋＤとして観察した。
レーン：Ｃ／２、Ｃ／３、Ｃ／４、Ｃ／５、Ｃ／６、Ｃ／７およびＣ／８：Ａにおけるように、タンパク質バンドａ〜ｊは、免疫ブロットＡおよびＢからの免疫陽性バンドに対応する。矢印^＊＝抗ＧＳＴ血清と結合するバックグラウンドに起因する免疫陽性バンド−図１４を参照のこと。
【図１４】 図１４は、抗ＧＳＴ抗血清を使用するＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓマダニ抗原の免疫ブロットを示す。
レーン８：Ｍａｒｋ２^ＴＭ タンパク質分子量マーカー（ＮＯＶＥＸ） ２００ｋＤ＝ミオシン；１１６．３ｋＤ＝β−ガラクトシダーゼ；９７．４ｋＤ＝ホスホリラーゼｂ；６６．３ｋＤ＝ウシ血清アルブミン；５５．４ｋＤ＝グルタミン酸デヒドロゲナーゼ；３６．５ｋＤ＝乳酸デヒドロゲナーゼ；３１ｋＤ＝カルボニックアンヒドラーゼ；２１．５ｋＤ＝トリプシンインヒビター；１４．４ｋＤ＝リゾチーム；６ｋＤ＝アプロチニン。レーン７、６、５、４、３、２および１：各々、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ全若虫抽出物、血リンパ、雄性中腸抽出物、雌性中腸抽出物、雄性唾液腺抽出物、雌性唾液腺抽出物、および組み合わせた雄性および雌性セメントコーン抽出物（モルモットの部分的に存在するマダニ由来）である。免疫陽性バンドＩ^＊およびＫ１およびＫ２^＊は、各々、雄性唾液線抽出物、雌性唾液腺抽出物およびセメントコーン抽出物に存在するタンパク質バンド（２５ｋＤ、４８ｋＤおよび２６ｋＤ）を有する抗ＧＳＴ抗血清との非特異的結合をいう。
【図１５】 図１５は、６４ｔｒｐタンパク質の異なるカクテルで免疫されたモルモットでの初期飼育の間の、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓの雄性および雌性の成虫マダニに対する効果を示す。
（Ａ）６４ｔｒｐ６／３免疫モルモット（異なる部位に注射された）からのの死亡した雌性マダニ；
（Ｂ）６４ｔｒｐ６／３免疫モルモット（１つの部位に組み合わせて注射した）からの死亡した雌性マダニ；
（Ｃ）６４ｔｒｐ６／２免疫モルモット（異なる部位に注射した）からの死亡した雌性（ｎ＝３）および雄性（ｎ＝２）マダニ；
（Ｄ）６４ｔｒｐ６／２免疫モルモット（１つの部位に組み合わせて注射した）からの死亡した雌性マダニ
【図１６】 図１６は、６４ｔｒｐ免疫モルモットで後飼育されたＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ成虫マダニに対する６４ｔｒｐタンパク質のワクチン効果を示す。
（Ａ）：生存する成虫雌性Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓマダニ（免疫原としての６４ｔｒｐ２／６タンパク質カクテルで免疫されたモルモット上で後飼育された）。２／１０マダニのみが生存した；マダニは、卵を産まず、そして完全には充血しなかった
（Ｂ）：死亡した成虫雌性Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓマダニ（免疫原としての６４ｔｒｐ２／６および６４ｔｒｐ３／６カクテルで免疫されたモルモットで後飼育された）。このマダニは、茶色／黒に変わり、そして脱離後２〜５日間乾燥一貫性を発展させた。
（Ｃ）：正常な成虫Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ雌性マダニ（このマダニは、産卵し、そしてＧＳＴ調節タンパク質で免疫されたモルモット上で、その後飼育された（ｐｏｓｔ−ｆｅｅｄｉｎｇ））。
【図１７】 図１７は、組換えＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ ６４ｔｒｐ２および６４ｔｒｐ３タンパク質で免疫されたモルモット由来の抗血清を使用するＢｏｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｃｒｏｐｌｕｓマダニ抗原間の交差反応性を示す。
ＡおよびＢ 各々、６４ｔｒｐ２および６４ｔｒｐ３抗血清を使用するＢｏｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｃｒｏｐｌｕｓマダニ抗原の免疫ブロット；Ｃ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色された４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ勾配ゲル（ＮｕＰＡＧＥ−ＮＯＶＥＸ）。
レーン：Ａ／１およびＢ／１：ＳｅｅＢｌｕｅ^ＴＭ Ｐｌｕｓ ２タンパク質分子量マーカー（ＮＯＶＥＸ） １８８ｋＤ＝ミオシン、９８ｋＤ＝ホスホリラーゼＢ、６２ｋＤ＝ＢＳＡ、４９ｋＤ＝グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、３８ｋＤ＝アルコールデヒドロゲナーゼ、２８ｋＤ＝カルボニックアンヒドラーゼ、１７ｋＤ＝ミオグロビンレッド、１４ｋＤ＝リゾチーム、６ｋＤ＝アプロチニン。レーンＣ／１：Ｍａｒｋ１２^ＴＭタンパク質分子量マーカー（ＮＯＶＥＸ）：２００ｋＤ＝ミオシン、１１６．３ｋＤ＝β−ガラクトシダーゼ、９７．４ｋＤ＝ホスホリラーゼｂ、６６．３ｋＤ＝ウシ血清アルブミン、５５．４ｋＤ＝グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、３６．５ｋＤ＝乳酸デヒドロゲナーゼ、３１ｋＤ＝カルボニックアンヒドラーゼ、２１．５ｋＤ＝トリプシンインヒビター、１４．４ｋＤ＝リゾチームおよび６ｋＤ＝アプロチニン。
レーンＡ／５、Ａ／４、Ａ／３およびＡ／２：各々、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｃｒｏｐｌｕｓセメントコーン抽出物、唾液線抽出物、中腸抽出物および全若虫（飼育されたマダニ）抽出物であり、これらの免疫陽性バンドを、６４ｔｒｐ２抗血清を使用して、ａ＝１２０〜２００ｋＤ、ｂ＝８０ｋＤ、ｃ＝６２ｋＤ、ｄ＝４９ｋＤ、ｅ＝４０ｋＤ、ｆ＝１７ｋＤ、ｇ＝８ｋＤおよびｈ＝２００ｋＤ、Ｉ＝６０ｋＤ、ｊ＝５５ｋＤ、ｋ＝４９ｋＤおよび１＝１８ｋＤとして観察した。
レーンＢ／５、Ｂ／４、Ｂ／３およびＢ／２：各々、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｃｒｏｐｌｕｓセメントコーン抽出物、唾液線抽出物、中腸抽出物および全若虫（飼育されたマダニ）抽出物であり、これらの免疫陽性バンドを、６４ｔｒｐ３抗血清を使用して、ｍ＝１２０ｋＤ、ｎ＝３５ｋＤ、ｏ＝６２ｋＤ、ｐ＝５９ｋＤ、ｑ＝４９ｋＤおよびｒ＝２６ｋＤとして観察した。
レーンＣ／５、Ｃ／４、Ｃ／３およびＣ／２：それぞれ、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｃｒｏｐｌｕｓセメントコーン抽出物、唾液腺抽出物、中腸抽出物および全若虫抽出物（肥育したマダニ）であり、これらのタンパク質のバンドａ〜ｒは、免疫ブロットＡおよびＢからの免疫陽性バンドに対応する。
【図１８】 図１８は、組換えＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ ６４ｔｒｐ５および６４ｔｒｐ６タンパク質で免疫したモルモット由来の抗血清を使用する、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｃｒｏｐｌｕｓマダニ抗原間の交差反応性である。
ＡおよびＢ：それぞれ、抗６４ｔｒｐ５おおよび抗６４ｔｒｐ６抗血清を使用する、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｃｒｏｐｌｕｓマダニ抗原の免疫ブロット；Ｃ：組換えＧＳＴタンパク質で免疫したモルモット由来の抗血清を使用する、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｃｒｏｐｌｕｓマダニ抗原の免疫ブロット。
レーン：Ａ／５、Ｂ／５およびＣ／５＝ＳｅｅＢｌｕｅ^ＴＭおよび２つのタンパク質分子量マーカー（ＮＯＶＥＸ）：１８８ｋＤ＝ミオシン、９８ｋＤ＝ホスホリラーゼＢ、６２ｋＤ＝ＢＳＡ、４９ｋＤ＝グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、３８ｋＤ＝アルコールデヒドロゲナーゼ、２８ｋＤ＝炭酸脱水酵素、１７ｋＤ＝ミオグロビンレッド、１４ｋＤ＝リゾチーム、６ｋＤ＝アプロチニン。
レーン：Ａ／１、Ａ／２、Ａ／３およびＡ／４：それぞれ、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ セメントコーン抽出物、唾液腺抽出物、中腸抽出物および全若虫（肥育したマダニ）抽出物であり、これらの免疫陽性バンドは、抗６４ｔｒｐ５抗血清を使用して、ａ＝５０〜５５ｋＤ、ｂ＝３２ｋＤ、ｃ＝１７ｋＤ、ｄ＝７０ｋＤ、ｅ＝４８ｋＤ、ｆ＝２６ｋＤ、ｇ＝４０ｋＤおよびｈ＝３０ｋＤであると観察された。
レーン：Ｂ／１、Ｂ／２、Ｂ／３およびＢ／４：それぞれ、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｃｒｏｐｌｕｓセメントコーン抽出物、唾液腺抽出物、中腸抽出物および全若虫（肥育したマダニ）抽出物であり、これらの免疫陽性バンドは、抗６４ｔｒｐ６抗血清を使用して、ｅ＝４８ｋＤ、ｉ＝１８０ｋＤ、ｊ＝７５ｋＤ、ｋ＝１２ｋＤであると観察された。
レーン：Ｃ／１、Ｃ／２、Ｃ／３およびＣ／４：それぞれ、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｃｒｏｐｌｕｓセメントコーン抽出物、唾液腺抽出物、中腸抽出物および全若虫（肥育したマダニ）抽出物であり、これらの免疫陽性バンドは、ａ＝５０〜５５ｋＤ、ｅ＝４８であると観察された。
【図１９】 図１９は、組換えＲ．ａｐｐｅｎｌｄｉｃｕｌａｔｕｓ ６４ｔｒｐタンパク質で免疫したモルモット由来の抗血清を使用する、Ｉｘｏｄｅｓ ｒｉｃｉｎｕｓマダニ抗原間の交差反応性である。
Ａ（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）：それぞれＧＳＴ、６４ｔｒｐ２、６４ｔｒｐ５および６４ｔｒｐ６抗血清を使用する、Ｉｘｏｄｅｓ ｒｉｃｉｎｕｓ非肥育マダニの全若虫抽出物の免疫ブロット；Ａ（ｉ）：同じ抽出物の、クマシーブルー染色した４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ勾配ゲル（ＮｕＰＡＧＥ−Ｎｏｖｅｘ）。
Ｂ（ｉ）および（ｉｉ）：それぞれ、クマシーブルー染色した４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ勾配ゲル（ＮｕＰＡＧＥ−Ｎｏｖｅｘ）、および６４ｔｒｐ６抗血清を使用した、Ｉｘｏｄｅｓ ｒｉｃｉｎｕｓマダニの全幼虫抽出物の免疫ブロット。
レーン：Ａ／（ｉ）／１およびＢ／（ｉ）／１：Ｍａｒｋ１２^ＴＭタンパク質分子量マーカー（ＮＯＶＥＸ）：２００ｋＤ＝ミオシン、１１６．３ｋＤ＝β−ガラクトシダーゼ、９７．４ｋＤ＝ホスホリラーゼｂ、６６．３ｋＤ＝ＢＳＡ、５５．４Ｋｄ＝グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、３６．５ｋＤ＝乳酸デヒドロゲナーゼ、３１ｋＤ＝炭酸脱水酵素、２１．５ｋＤ＝トリプシンインヒビター、１４．４ｋＤ＝リゾチーム、および６ｋＤ＝アプロチニン。レーン：Ａ／（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）／３：Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ^ＴＭおよび２つのタンパク質分子量マーカー（Ｎｏｖｅｘ）：９８ｋＤ＝ホスホリラーゼＢ、６２ｋＤ＝ＢＳＡ、４９ｋＤ＝グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、３８ｋＤ＝アルコールデヒドロゲナーゼ、２８ｋＤ＝炭酸脱水酵素、１７ｋＤ＝ミオグロビンレッド、１４ｋＤ＝リゾチーム。レーン：Ｂ／（ｉｉ）／３：ＭｕｌｔｉＭａｒｋ^ＴＭタンパク質分子量マーカー（Ｎｏｖｅｘ）：９８ｋＤ＝ホスホリラーゼＢ、５２ｋＤ＝グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、３１ｋＤ＝炭酸脱水酵素、１９ｋＤ＝ミオグロビンレッド、１７ｋＤ＝ミオグロビンブルー、および１１ｋＤ＝アプロチニン。
レーン：Ａ／（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）／４＝Ｉ．ｒｉｃｉｎｕｓ全若虫抽出物であり、この免疫陽性バンドは、それぞれ、ａ＝１５０ｋＤおよびｂ＝６２ｋＤ、ｃ＝１００Ｋｄ、ｄ＝９８Ｋｄ、ｅ＝６２Ｋｄ、ｆ＝５０ｋＤおよびｇ＝４２ｋＤ、ｈ＝１９０ｋＤ、ｉ＝１５０ｋＤ、ｊ＝８０、ｋ＝６２ｋＤ、ｌ＝５５ｋＤ、ｍ＝３２ｋＤ、ｎ＝１７ｋＤならびにｏ＝１２ｋＤであると観察された。レーン：Ａ／（ｉｉ）／４＝Ｉ．ｒｉｃｉｎｕｓ全若虫抽出物であり、＊として観察されたこの非常わずかな免疫陽性バンドは、マダニ抗原とＧＳＴ抗血清との非特異的交差反応性に起因する。
レーン：Ｂ／（ｉｉ）／４＝Ｉ．ｒｉｃｉｎｕｓ全幼虫抽出物であり、この免疫陽性バンドは、ａ＝１１６ｋＤ、ｂ＝８０ｋＤ、ｃ＝６２ｋＤ、ｄ＝３４ｋＤ、およびｅ＝２８ｋＤであると観察された。
【図２０】 図２０は、６４ｔｒｐタンパク質の異なるカクテルで免疫したハムスターに対する、Ｉｘｏｄｅｓ ｒｉｃｉｎｕｓマダニの若虫への肥育の影響である。
ＧＳＴコントロールタンパク質（Ａ）、６４ｔｒｐ６タンパク質（Ｂ）、６４ｔｒｐ５タンパク質（Ｃ）、および６４ｔｒｐ６／５のカクテル（Ｄ）で免疫したハムスター上のＩ．ｒｉｃｉｎｕｓマダニの若虫の、肥育の間［（ｉ）−解剖前］および肥育後［（ｉｉ）−解剖後］のハムスターの皮膚の研究。
マダニ肥育後の発毛は、コントロールハムスターＡにおいては正常であり、そして６４ｔｒｐ免疫ハムスターにおいては非常に遅く、矢印ａによって示される脱毛領域を有する。これは、６４ｔｒｐ免疫ハムスター上のＩ．ｒｉｃｉｎｕｓマダニの肥育の間に生じる局所的な炎症性免疫応答に起因し、これは矢印ｃ、ｄおよびｅによって示される；ｃ＝解剖された皮膚の皮下組織において紅斑として見られる種々の程度の炎症を示す、放置されたマダニ肥育部位；ｄ＝拡大した前肩甲骨リンパ節；ｅ＝放置されたマダニ肥育部位での血清の浸出；ｆ＝コントロールハムスターの放置されたマダニ肥育部位であり、この皮下組織および前肩甲骨リンパ節は、正常のようである。ｂ＝肥育したＩ．ｒｉｃｉｎｕｓマダニの若虫；コントロールハムスター上でのマダニの肥育は、６４ｔｒｐ免疫ハムスターでの肥育と比較して、６時間延長した。[0001]
The present invention relates to tick cement protein (tick) in the generation of vaccines to protect animals against bites of blood-sucking ectoparasites and against the transmission of viruses, bacteria and other virulence factors by such ectoparasites. cement protein).
[0002]
Blood sucking ectoparasites (eg mosquitoes and ticks) are very effective as disease transmitters. For example, R. is a tick species. Appendicularulatus propagates the protozoan parasite that normally causes lethal East Coastal fever, Theileria parva, and presents major obstacles to livestock growth in some Saharan areas. This disease is often considered to be the most important disease in cattle (Norval et al., 1992a; Norval et al., 1992b). This tick is also the major vector of the virus that causes Nairobi disease, which neutralizes sheep and goats and is often a lethal disease (Davies, 1988). Further, R.A. appendiculatus and other tick pests also cause considerable damage to the skin of animals, thereby adversely affecting the leather industry.
[0003]
Traditionally, techniques for controlling tick populations have used treatment of animals with chemicals such as acaracides. This strategy results in the development of resistant ticks. That is, a new class of chemicals must be introduced. Furthermore, chemicals have poor residual effects, i.e. must be applied frequently. The second approach is to produce mite-resistant animals, but the degree of resistance produced is far from ideal.
[0004]
In the effort to combat parasite-transmitted diseases, numerous attempts have been made to immunize animals against mites using whole mite or mite intestinal extracts. One report used recombinant tick protein (see, eg, International Patent Application WO 88/03929). However, despite this development, the only commercially available tick vaccine is It is only active against the adult stage of microplus mites and changes in efficacy are seen depending on the geographical location of this species.
[0005]
No vaccine has yet been developed that provides resistance to parasites throughout the population of vaccinated animals or at any stage of their life cycle. Thus, there is a great need for effective vaccines to combat diseases transmitted by blood-sucking ectoparasites. Surprisingly, it has now been discovered that tick cement protein is useful as a vaccine component.
[0006]
(Summary of the Invention)
In accordance with the invention, a vaccine composition is provided comprising an immunogenic tick cement protein, a fragment thereof, or a functional equivalent thereof in combination with a pharmaceutically acceptable excipient. It has been shown herein that immunization of animals with such vaccines results in the production of antibodies that are effective against a wide variety of ectoparasite species.
[0007]
There are numerous ectoparasite species in various parts of the world, but their frequency tends to be concentrated in the tropics and subtropics. There, the ectoparasite species and the diseases carried thereby are unique. These species vary widely in type and adapt to widely differing feeding strategies, ranging from leeches and ticks to transient eaters (eg, mosquitoes, horseshoe flies, tsetse flies, fleas) Some of them eat for a long time. All of these ectoparasites are suitable targets for the vaccines of the present invention.
[0008]
The vaccine of the present invention is particularly effective against tick species. Examples of such targeted tick species are:
[0009]
[Chemical 1]

It is.
[0010]
Common among all of the above ectoparasites is that any parasite that ingests blood, lymph, or that they ingest on the host skin product, ie any antibody present in that host Is either automatically internalized within its ectoparasites. This provides an advantageous and automatic route of antibody administration. And if the antibody is reactive against ectoparasite proteins, this means that a well-organized immune regimen can result in complete eradication of the parasite within the intended area. Ectoparasites that feed on blood are particularly preferred targets for the vaccines of the present invention.
[0011]
The present invention has discovered a number of different tick cement proteins. In many cases, the coding gene was cloned. For example, international patent application PCT / GB98 / 03397, the contents of which are incorporated herein by reference, describes the isolation of a number of tissue cement proteins and uses for skin surgery and wound healing. It discusses the use of the protein in medicine as a component of tissue cement for the purpose, as well as the transient or permanent binding of human or animal tissues to each other or to other biological materials.
[0012]
Tick (hard) ticks are blood-sucking parasites that attach themselves to vertebrate hosts by “cement cones” originating from type II and type III acini of the tick salivary gland It is an organism (Kemp et al., 1982; Walker et al., 1985).
[0013]
The cement that forms the cone is an opalescent secretion that is injected into the skin of the animals that these parasites eat. This cement contains a number of interacting protein and carbohydrate components. This cement spreads to the bite site and spans the skin, and upon curing, the mouthpiece remains firmly fixed to the host during the feeding period (which typically lasts 4-8 days) to be certain. This cement cone (cement cone) further functions as a gasket to prevent leakage of liquid from the bite site during eating.
[0014]
The tick cement cone is a layered structure consisting of two main types of cement. The first type of cement is created only minutes after the bite site is established and quickly solidifies to form a conical rigid “core”. The second type of cement is secreted later (about 24 hours after attachment) and solidifies more slowly to form a more flexible “cortex”. In adult ticks, cement formation typically continues until 3 or 4 days after attachment (Kemp et al., 1982; Sonnnesine et al., 1991).
[0015]
The composition of tick cement appears to be similar among tick species of different tick (Ixodid). For example, antisera raised against 90 kD salivary protein of brown ear tick (Rhipicephalis appendiculatus) include polypeptides derived from salivary glands, as well as American dog tick (Dermacenter variabilis, Dermacenter variabilis, It has been shown to recognize cement proteins of the lone star tick (Amblyomma americanum) and brown dog tick (R. sanguineus) (Jawski et al., 1992).
[0016]
Unpurified cement components have previously been tested as inducers of host resistance (Brown et al., 1986; Shapiro et al., 1989), but reliable vaccines based on these proteins have not been developed. In a sense, this is not surprising. Because the sequence relationship shows that the cement protein was designed similar to the host skin protein, most likely to avoid rejection of skin ticks by the host's natural immune defense mechanism Because. The compositional similarity of certain tick proteins with their surrounding tissue may also facilitate intimate bonding between the cement cone and the surrounding skin tissue.
[0017]
Suitable tick cement proteins for incorporation into the vaccines of the present invention include any suitable tick species (eg, Rhipicephalus appendiculatus, I. ricinus pulinus algebraicum, Dermaceticum variuminum, Rheumophilus alumicum, Dermaceticum ammimerica, Rheumophilus abimericis, Amblyomamerica, Amblyomamerica, Amblyomamerica, Amblyomamerica, Amblyomamerica, Amblyomamerica, Ammyanomerica, Rheumophilusa, Adriatica) Haemaphysalis leachii species). In a preferred embodiment, the tick cement protein is tick R. derived from appendiculatus.
[0018]
Examples of tick cement proteins that are particularly suitable for inclusion in the vaccines of the invention are given herein and also in patent application PCT / GB98 / 03397. These cement proteins include proteins referred to as clone 21, clone 33, CemA, clone 24, clone 68, clone 64, and clone I. The deduced amino acid sequences of these proteins are identified in FIG. 1 herein.
[0019]
Preferably, the tick cement protein, fragment or functional equivalent thereof used in the vaccine composition of the present invention is blood-sucking other than the tick species from which the immunogenic cement protein, fragment or functional equivalent is derived. -Feeding) should include immunogenic epitopes present in one or more directed evolution proteins of the ectoparasite species. This means that a single vaccine composition can be effective as a broad spectrum vaccine against all ectoparasite species that produce proteins containing a common epitope. For example, in certain areas, many different tick species are endemic and cause significant plague problems for the agricultural industry. The availability of a single vaccine that is effective against a number of different tick species reduces the cost of administering that vaccine and is therefore advantageous over currently available vaccines.
[0020]
Therefore, the vaccine of this aspect of the invention is particularly advantageous. This is because the inflammatory response is stimulated because it boosts the immune status of the vaccinated animals and further targets the hidden antigens, thereby causing damage to the ticks themselves.
[0021]
It has been discovered that certain tick cement proteins, and fragments of these proteins, according to one aspect of the present invention, contain epitopes that are also present in proteins present in the gut and hemolymph of ectoparasite species. This cross-reactivity makes the vaccine of this embodiment of the invention particularly advantageous. This is because ingestion of blood, and thus host antibodies, into the ectoparasite ensures delivery of the active agent to the parasite. In this manner, the vaccines of the present invention are as efficient as temporarily feeding species (eg, mosquitoes and fountains) with species that remain attached to their hosts for a sufficient time (eg, ticks). Target.
[0022]
Particularly suitable proteins for inclusion in the vaccine according to the invention are, for example, R.I. Clone 64 protein (hereinafter 64P herein), a fragment thereof, or a functional equivalent thereof, isolated from a species other than appendiculatus. This protein has a sequence typical of structural proteins and appears to be secreted into tick saliva. The sequence containing the first 40 amino acids of the cement protein is very collagenous, while the rest of the sequence is similar to keratin. A homology search performed on the sequence of this protein indicates that the highest level of homology for all sequences searched in the Genbank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Reveal that it was 51% of keratin subunit I.
[0023]
This protein is glycine rich and structural protein from Drosophila melanogaster (cuticle protein) and other insect eggshells, and vertebrate cytokeratin (mammalian keratin complex 2 basic protein, mouse keratin, human keratin, collagen IVα type , And IPIB2 precursor), including several repeats of a motif (C / S) 1-4 (Y / F).
[0024]
In one embodiment of the invention, a functional equivalent of a tick protein can be included in a vaccine composition. The term “functional equivalent” as used herein refers to a protein having a function similar to the cement protein referred to as clone 21, clone 33, CemA, clone 24, clone 68, clone 64, and clone I. Used to describe. Functionally equivalent proteins can belong to the same protein family as these proteins. By protein family is meant a group of polypeptides that share a common function and show common sequence homology between motifs present in the polypeptide sequence.
[0025]
“Sequence homology” means that polypeptide sequences are related by divergence from a common ancestor. In particular, the proteins and partial proteins identified herein have in common a specific sequence that is repeated several times over the sequence of this protein. Preferably, the homology between polypeptide sequences in the same protein family is at least 30% throughout the amino acid sequence of the protein. More preferably, the homology is at least 50%, at least 60%, or at least 70% throughout the amino acid sequence of the protein. Even more preferably, the homology is greater than 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% throughout the protein sequence.
[0026]
“Similar function” first means that the protein maintains its ability to form cement, at least when present with other cement proteins. Thus, when combined with other necessary cement constructions, such proteins can cure over time to form solid masses or adhesives. Secondly, the term can refer to a protein that is structurally similar to a cement protein and thus contains similar or identical epitopes.
[0027]
Functional equivalents of tissue cement proteins include mutations that include amino acid substitutions, insertions, or deletions from the wild-type sequence (but immunogenicity is maintained). Functional equivalents with improved immunogenicity from the immunogenicity of the wild-type protein sequence can also be designed through the synthesis or directed mutation of specific residues in the protein sequence.
[0028]
Functional equivalents include proteins containing conservative amino acid substitutions that do not adversely affect the function or activity of the protein. The term is also intended to include natural biological variants (eg, allelic variants or geographical variants in the species from which the tissue cement protein is derived).
[0029]
According to the present invention, a tick cement protein fragment is also contemplated as a component suitable for inclusion in a vaccine composition. For example, a short extension of a peptide derived from an immunogenic portion of a tick cement protein can be particularly useful as an immunogen. Such short extensions of polypeptide sequences are simple to produce in large quantities, either synthetically or via recombinant means. Protein fragments may be suitable for use in the vaccines of the invention in many instances. This is because these fragments appear to fold into a conformation that is not adopted by the full-length wild-type sequence. Since some cement proteins appear to have evolved to resemble host skin tissue and thus avoid inducing the host's immune response to ticks, the non-natural nature of such tick cement proteins This form appears to be particularly useful in the vaccines of the present invention.
[0030]
Examples of tick cement protein fragments useful for encapsulation in the vaccine compositions of the present invention include various fragments of the 64P protein recombinantly produced by the present inventors, and functional equivalents of these fragments ( For example, close homologues and variants of the type discussed above). As will be apparent to those skilled in the art, fragments similar to the proteins specifically disclosed herein are tick species R. cerevisiae. It can be prepared from ectoparasite species other than appendiculatus.
[0031]
R.I. described in this specification. The details of the appendiculatus fragment are as follows.
[0032]
A fragment called 64 trp1 is a glutathione- having a molecular weight of about 30 kDa S − Transferase A small C-terminal fragment of the 29 amino acid 64P protein cloned as a (GST) / histidine tag fusion protein.
[0033]
A fragment called 64 trp2 is a glutathione having a molecular weight of about 33 kDa S − Transferase It refers to a small N-terminal fragment of a 64P protein consisting of 51 amino acids cloned as a (GST) / histidine tag fusion protein.
[0034]
A fragment called 64 trp3 is a glutathione having a molecular weight of about 36 kDa S − Transferase Refers to the larger N-terminal fragment of the 70 amino acid 64P protein cloned as a (GST) / histidine tag fusion protein.
[0035]
A fragment called 64 trp6 is glutathione − S − Transferase This refers to a full-length clone of the 64P protein consisting of 133 amino acids cloned as a (GST) / histidine tag fusion protein. This fragment has a molecular weight of approximately 42 kDa.
[0036]
A fragment called 64 trp4 is a glutathione having a molecular weight of about 35 kDa S − Transferase This refers to a C-terminal fragment of 64P protein consisting of 63 amino acids cloned as a (GST) / histidine tag fusion protein.
[0037]
A fragment called 64 trp5 refers to a full-length clone of the 64P protein consisting of 133 amino acids cloned as a GST fusion protein (ie, lacking a histidine tag). This protein has a molecular weight of 41 kDa.
[0038]
These protein fragments, approximate functional equivalents, are particularly preferred components for incorporation into the vaccines of the present invention. These fragments can be expressed as soluble proteins or can be expressed in inclusion bodies and purified under denaturing conditions. For example, R.A. Construct 64 trp6 as isolated from appendiculatus has been prepared as a denatured protein expressed in inclusion bodies and has been demonstrated to be immunogenic in this form.
[0039]
Immunization with these protein fragments, followed by ectoparasite attachment, results in inflammation at the site of attachment followed by ectoparasite death. One skilled in the art understands that the presence of heterologous GST and HIS tag sequences is purely for the convenience of protein production. Stretching of these sequences is not considered essential for this aspect of the invention.
[0040]
Conveniently, the vaccine according to the invention comprises tick cement protein, a fragment thereof or a functional equivalent thereof, expressed in recombinant form. Recombinantly expressed proteins are inexpensive to produce and allow the desired protein product to be obtained by simple manipulation of gene sequences using current standard techniques of genetic engineering.
[0041]
It is preferred that the vaccines of the present invention are effective against both adult and immature forms of ectoparasites. The term “immature” is meant to include both larval and larval forms of ectoparasites. This means that the entire ectoparasite population can be targeted using a vaccine, increasing the efficiency of ectoparasite eradication.
[0042]
Vaccines can specifically target adult or immature forms of ectoparasites, but preferably target all parasitic stages of the life cycle. Thus, of the fragments specifically exemplified herein, depending on the type of ticks and these fragments, 64 trp2 − provides significant mortality in ticks or adult ticks or both nymphs and adults. 64 trp3-, 64 trp5-, and 64 trp6-immunized animals are particularly preferred. The 64 trp2 + 64 trp6 cocktail was effective against both adult and immature forms of tick ectoparasites; therefore, the specific fragments used in combination are particularly preferred for inclusion in vaccines according to the present invention.
[0043]
According to a further embodiment of the invention, a cocktail vaccine is provided comprising two or more tick cement proteins, fragments, or functional equivalents, optionally in combination with an adjuvant. Any two immunogenic tick cement proteins, protein fragments or functional equivalents can be used as components such as cocktail vaccines and can be different or derived from the tick species or from the same tick species. For example, it may be desirable to create a vaccine that specifically targets more than one ectoparasite or targets different proteins from the same ectoparasite. In this manner, it may be possible to make a more efficient vaccine with a wider species range. Particularly preferred combinations of components include a combination of 64 trp2, 64 trp3, 64 trp5, and 64 trp6, a combination of 64 trp2 and 64 trp6, and a combination of 64 trp3 and 64 trp6. These combinations are demonstrated herein to have particular efficacy in targeting both adult and immature ticks and in conferring cross-species resistance.
[0044]
Vaccine compositions according to the invention also include additional factors, such as molecules used by ectoparasites to facilitate pathogen transmission (eg, interferon modulators, complement inhibitors, chemokine modulators and immunoglobulin binding proteins). Can be included. In this way, other biologically active molecules released from the ectoparasite salivary glands can be recognized as foreign by the host immune system and an immune response can be generated.
[0045]
A further aspect of the invention includes a vaccine comprising a tick cement protein fused to another molecule (eg, a label, toxin or other bioactive molecule or immunogenic molecule). Particularly suitable candidates for fusion may be molecules such as glutathione-s-transferase or histidine tags, but luciferase, green fluorescent protein or horseradish peroxidase may also be suitable. Linker molecules such as streptavidin or biotin can also be used, for example, to facilitate the purification of cement protein.
[0046]
Fusion proteins can be made chemically using methods such as chemical cross-linking. Such methods are well known to those skilled in the art and may include, for example, cross-linking of the thiol group of a cysteine residue. Chemical cross-linking is most often used to fuse tissue cement proteins to non-protein molecules (eg, labels).
[0047]
If it is desired to fuse tissue cement protein to another protein molecule, the selection method is generally to genetically fuse the molecules. In order to produce a recombinant fusion protein, the gene or gene portion encoding the protein or protein fragment of interest forms one continuous gene arranged such that the two gene sequences are transcribed in frame. To be operated.
[0048]
Immunization with naked plasmid DNA encoding specific antigens has recently been recognized as an effective method of presenting antigens to the mammalian immune system to produce strong humoral and cellular immune responses ( Ulmer et al., Science, 1993, 259, 1745-1749). This technique (also called DNA vaccination) has been successfully applied to produce antibodies directed against several proteins from the following viruses, parasites and bacteria: Ulmer et al., Loc cit .; Cox et al., J. Virol.1993, 67, 5664-5667; Fynan et al., Proc. Natl.Acad.Sci.USA 1993, 90, 11478-11482; Robinson et al., Vaccine 1993,11. 957-960; Wang et al., 1993, DNA, Cell Biol. 1993, 12, 799-805; Davis et al., Hum. Mol. Genet. 1993, 2, 1847-1851; Xiang et al., Virology 1994, 199, 13 -140; Xiang et al., Virology 1995, 209, 569-579; and Justicez et al., J. Virol. 1995, 69, 7712-7717); parasites (Sedegah et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91. Mor et al., J. Immunol. 1995, 155, 2039-2046; and Yang et al., Biochem. Bioph. Res. Comm. 1995, 212, 1029-1039), and bacteria (Anderson et al., Infect. Immun. 1996, 64, 3168-3173). In some cases, a significant protective response is elicited by the host. These DNA vaccines continuously stimulate the immune response and amplify immunity, thereby reducing the cost of production and delivery as no booster injection is required.
[0049]
Based on available evidence, stimulation with plasmid DNA encoding viral tick cement protein appears to be a useful technique to further improve their anti-tick vaccine efficacy. This method involves direct injection of a host containing a eukaryotic expression vector, wherein one or more cement proteins are in vivo of the corresponding sequence in the vaccinated host (human, domestic animal, or other animal). Expressed by transcription followed by translation.
[0050]
The vaccine according to any one of the above aspects of the invention may further comprise an adjuvant. Suitable adjuvants for enhancing the effects of immunogenic proteins according to the present invention include, for example, (a) an oil-in-water emulsion formulation (as required), such as the formulation described in PCT Publication No. WO 90/14837. And other specific immunostimulatory factors such as, but not limited to, muramyl peptides or components of bacterial cell walls. Other suitable adjuvants are known in the art and include Saponin adjuvants (eg, Stimulon). ^TM (Cambridge Bioscience, Worcester, Mass.)), ISA Montanide 50, cytokines (eg, interleukin, interferon, macrophage colony stimulating factor (M-CSF) or tumor necrosis factor (TNF)).
[0051]
In accordance with a further embodiment of the present invention, monoclonal antibodies that are reactive with tick cement proteins are provided. “Reactive” means at least 10 ^-8 M, preferably at least 10 ^-9 M, more preferably at least 10 ^-10 M affinity means that the antibody binds to one or more tick epitopes. According to a preferred embodiment of this aspect of the invention, the antibody or antiserum is reactive against any one or more of the cement proteins, fragments, or functional equivalents specifically described above. This aspect of the invention includes a method of producing an antibody or antiserum, which method includes a tick cement protein, fragment thereof, or function thereof, as recited in any one of the above aspects of the invention. Stimulating the animal with a physical equivalent.
[0052]
In accordance with yet a further aspect of the present invention, a process for the formulation of a vaccine composition is provided, which process comprises tick protein, a fragment thereof, or a functional equivalent thereof, optionally together with an adjuvant with a pharmaceutical carrier. Including the step of associating.
[0053]
According to a still further aspect of the present invention, there is provided a method of immunizing a mammal against an ectoparasite-transmitting disease or a blood supply ectoparasite, which method is in accordance with any one of the above aspects of the invention. Administering a vaccine to the animal.
[0054]
The invention also provides tick cement protein, fragments thereof, or functional equivalents thereof for use in vaccines. The present invention further provides the use of tick cement protein as a vaccine component.
[0055]
Various aspects and embodiments of the present invention will now be described in more detail by way of example, in particular with respect to ticks cement protein isolated from ticks, and in particular ticks cement protein isolated from Rhipicephalus appendiculatus. . It will be understood that modification of detail may be achieved without departing from the scope of the invention.
[0056]
(Example)
(Example 1: Expression of shortened cement protein (64TRP) in bacteria)
Several attempts were made to express a shortened version of 64P in Escherichia coli bacterial cells, as attempts to express a full-length clone of 64P in the baculovirus system failed.
[0057]
E. Due to the expression of this protein in E. coli AD494 cells (Novagen), a cement protein (contains no signal sequence, ie 144 amino acids long) in pET23a (+) (Novagen) and pGEX-2T (Pharmacia) prokaryotic expression vectors. ) Several unsuccessful attempts were made to insert the entire code region (named 64P). It was concluded that the structure of this construct could be toxic to bacterial cells.
[0058]
Therefore, a cloning strategy was adopted that included sequential cloning of the shortened region of the 64P clone starting at the N-terminal region (FIG. 2). Oligonucleotides were designed with appropriate restriction enzyme sites to allow PCR cloning of 64P different fragments from this cDNA. These constructs are as follows:
64 trp1 = 29 amino acid C-terminal fragment
64 trp2 = 51 amino acid N-terminal fragment
64 trp3 = 70 amino acid N-terminal fragment
64 trp4 = 63 amino acid C-terminal fragment
64 trp5 = 9XHIS. 133 amino acid fragment without TAG
Full length 64P clone which does not contain 3 amino acids at the end of this sequence
64 trp6 = 9XHIS. 133 amino acids with TAG.
[0059]
According to the manufacturer's instructions This plasmid was transformed into E. coli XL1-BLUE cells (Stratagene). GST-fusion / histidine-tagged expressed 64TRP protein was purified by GST purification method (Pharmacia) according to manufacturer's instructions. Because of the ease of purification of the 64TRP protein that can be expressed as inclusion bodies, this 9XHIS. TAG was included (because this GST purification method is applicable only to soluble proteins).
[0060]
Other GST / 9XHIS. Unlike the TAGated truncated 64P protein (ie, 64 trp1, 64 trp2, 64 trp3 and 64 trp4), the 64 trp6 protein (133 amino acids with 9XHIS.TAG) resulted in inclusion body formation instead of soluble protein. Therefore, 64 trp6 protein was purified under denaturing conditions using TALON metal affinity beads (Clontech) according to manufacturer's recommendations.
[0061]
64TRP protein was obtained from NuPAGE Tris. Analyzed by Bis 4-12% gradient Coomassie blue stained gel (Novex) according to manufacturer's recommendations (FIG. 3A). Figures 3B and 3C show the GST monoclonal antibody (GST mAb-Pharmacia) diluted 1: 500 and 6XHIS. 3B is a Western blot of a similar gel from FIG. 3A using a TAG monoclonal antibody (6XHIS.TAG mAb / APC-Clontech).
[0062]
A putative 64TRP protein band was observed in the Coomassie blue stained gel (FIG. 3A) with the following molecular weights: 64 trp1 = 30 kDa; 64 trp2 = 33 kDa; 64 trp3 = 36 kDa; 64 trp4 = 35 kDa; 64 trp5 = 41 kDa;
[0063]
Expression was confirmed by Western blot (FIGS. 3B and 3C). A 26 kDa GST protein band was used as a control marker.
[0064]
As expected, each 9XHIS. The 64 trp5 and GST protein bands lacking TAG are 6XHIS. No reaction with TAG mAb was given (Figure 3C, lanes 7 and 2, respectively).
[0065]
64TRP constructs containing either a fragment of the 64P clone or the complete N-terminal sequence (ie, 64 trp2, 64 trp3 and 64 trp5) When expressed in E. coli XL1-BLUE cells, a degradation product is produced (Figure 3A, lanes 4, 5 and 7). This was confirmed by amino-terminal sequence analysis of the degraded protein band (Matsudaira, (1987) Journal of Biological Chemistry 262: 10035-10038). To try and solve the degradation problem of the product, this construct was transformed into an E. coli strain lacking the ompT gene encoding the protease. E. coli BL21 strain was transformed.
[0066]
As expected, degradation of the 64 trp6 protein was less compared to the 64 trp5 protein. This is because the 64 trp6 protein is expressed as inclusion bodies and thereby protected from degradation by cellular proteases.
[0067]
(Example 2: Immunohistochemical study using antiserum against 64TRP)
Individual purified recombinant 64 trp proteins were used to elicit polyclonal antisera by subcutaneous injection of an equal volume of each protein and Montanide ISA 50 into Dunkin Hartley guinea pigs.
[0068]
Immunohistochemical studies were performed using 6 different anti-64 trp antisera. This antiserum was obtained from normal hamster skin sections (from animals not exposed to ticks) and R. cerevisiae. It was reacted with both hamster cement cones infected with appendiculatus ticks and sections through the surrounding skin. Immunohistochemical methods were as previously described (Coligan et al., 1991).
[0069]
The results of two of these studies (when using anti-64 trp2 and anti-64 trp3 sera) indicate the following:
[0070]
(2.1 Normal skin)
Comparison of normal skin sections treated with either anti-64 trp2 serum or anti-64 trp3 serum shows that anti-64 trp3 serum reacts strongly with epidermal and dermal tissues, particularly keratinocytes and stratum corneum of the epidermis and collagen fibers of the dermis This was clarified (FIG. 4A). By comparison, sections treated with anti-64 trp2 serum were indistinguishable from control sections treated with phosphate buffered saline (PBS) (FIGS. 4B and 4C, respectively).
[0071]
Both the 64trp2 protein sequence and the 64trp3 protein sequence contain the collagen-like region of the 64P protein. However, the 64 trp3 protein also contains some of the keratin-like sequences of the 64P protein. Thus, the difference in immunoreactivity between hamster skin sections between anti-64 trp3 and anti-64 trp2 antisera is probably related to the availability of reactive epitopes within each protein sequence fragment. This further confirms the hypothesis that 64P cement protein mimics the structure of certain its host tissues (eg, epidermal and dermal collagen, especially keratin-like proteins).
[0072]
(2.2 Tick-infected skin)
R. In the skin of hamsters reared with appliciculatus ticks, individual cement corn sections reacted with anti-64 trp3 serum. This reaction was mainly a reaction with the outermost layer and the inner layer of the cement cone attached to the epidermis (FIG. 5A). No reaction was observed in sections treated with anti-64 trp2 serum (FIG. 5C) nor in sections using PBS as a control instead of the primary antibody (FIG. 5B).
[0073]
The reaction pattern of anti-64 trp3 serum with cement corn may indicate that 64P is a cement protein that lines cement corn, possibly acting as an adhesive that attaches cement corn to the surrounding epidermal and dermal tissues. The absence of staining in the cement corn may indicate that the epitope recognized by the anti-64 trp3 serum (and possibly the anti-64 trp2 antiserum) is not exposed in the cement cone. This can occur when the 64P protein polymerizes to form a cement cone.
[0074]
Similar to being embedded in the host's skin, the outermost layer of cement corn also tapers and fuses to the host skin's epidermis (data not shown), so that where the tick cement corn ends And where the host tissue begins is difficult to identify. This observation is further designed so that the cement protein resembles the host dermis and epidermis skin proteins (ie, collagen and keratin) to avoid tick rejection through adherent cement cones on the host skin. I support the hypothesis that
[0075]
(Example 3: Vaccination trial)
Dunkin-Hartley guinea pigs were used for immunization and challenge trials. Of the 10 guinea pigs used, 2 each were immunized with 64 trp1, 64 trp2, 64 trp3 and 64 trp6, and 2 were immunized with the control protein GST. Each group of immunized guinea pigs was further analyzed by Appliciculatus ticks were divided into one guinea pig for each adult and nymph rearing stage. Approximately 50 milligrams of each 64 TRP protein (still attached to the GST beads, ie not eluting) or control GST protein was mixed with ISA Montanide adjuvant and injected subcutaneously; first and second additions Each immunization injection was given at 2-week intervals.
[0076]
The host immune response to immunization was determined by the reactivity of 64TRP and GST immune guinea pig antisera to immunoblots of GST protein and individual 64TRP proteins.
[0077]
When the antiserum titer reaches 1: 5,000, guinea pigs have R.D. Applicicularus tick was challenged. For challenge infection, a predetermined number of ticks (50-200 nymph ticks or 20 adult ticks per guinea pig) are placed in a holding chamber on the back of each guinea pig (Figure 7), One week later, a second booster injection was given.
[0078]
To analyze the effect of 64TRP-induced immunity, a daily visual test was performed starting 24 hours after guinea pig tick infection. Adhesion rate, breeding duration, inflammatory response at the site of attachment, and hatchability of detached satiety female tick eggs were recorded. The full weight of adult female ticks and the mortality of both adult and nymph ticks were determined after the end of the experiment.
[0079]
Table 1 summarizes the results of the vaccine effect of 64TRP protein on tick breeding in guinea pigs. There was no difference in the adherence rate between the control GST immunity group and the 64TRP immunity group; similarly, the rearing duration was similar for both adult and nymph stage ticks.
[0080]
Inflammatory responses that persisted for 24 to 48 hours prior to calming were observed at the site of larvae attachment on the skin of 64 TRP immunized guinea pigs during the late stages of breeding (Days 6-7). This response included erythema, edema, lymphadenopathy and lethargy (Figure 6).
[0081]
[Table 1]

(Note to Table 1)
i = Inflammation- and + indicate that inflammation is absent or present at the tick attachment site, respectively; the degree of inflammation is indicated by: + = mild, ++ = moderate and +++ = severe; ¹ and ² = Antibody titer before and after infestation; nd = not done; n / a = not applicable; h = hatched; ^* Are bred in guinea pigs immunized with 64 trp2 protein. refers to 2/9 batches of eggs that were not hatched and spawned by two adult female ticks from the Appendiculatus tick group; ^δ Are determined by a chi-square test using a one-way contingency table and are raised in 64 trp6 immunized guinea pigs. higher mortality from the group of Appendiculatus nymph ticks (χ ² , ₆ = 96.5, p <0.001); ^§ Is determined by a G-test and is bred in guinea pigs immunized with 64 trp2 protein, 64 trp3 protein and 64 trp5 protein. The mortality observed in adult female ticks from the group of appendiculatus ticks was significantly higher than for ticks from other groups (G, ₆ , = 33, p <0.001); ^ε Is determined by the F ratio and is bred in guinea pigs immunized with 64 trp2, 64 trp4 and 64 trp5. The mean satiety weight for adult female ticks from the appliciculatus tick group was also significantly less than the satiety weight for ticks from other groups (F, _{l, 62} = 15.88, p <0.001); ^‡ Is determined by the F ratio and compared to female ticks from other groups, female R. pneumoniae bred in 64 trp5 immunized guinea pigs. shows significantly lower mean egg mass weights for the appliculatus tick (F, _{l, 44} = 5.646, p <0.022).
[0082]
(3.1 Larval tick)
The isolated nymphs were normal in appearance. Inflammation was not evident at the nymph adhesion site on the skin of GST immune guinea pigs.
[0083]
The isolated nymphs were cultured according to Jones et al. (1988) Animal Technology 39, 99-106. A relatively high mortality rate of 18% and 48% was observed for isolated nymphs fed guinea pigs immunized with 64 trp2 and 64 trp6 when compared to control protein immunized guinea pigs (6.7%). These results were statistically significant p <0.01 and p <0.001, respectively, as determined by the chi-square test using a 2 × 2 contingency table.
[0084]
The death of nymphs fed on 64 trp2 and 64 trp6 immunized guinea pigs was caused by R. It suggests that the immune response was stimulated when the appliculatus tick fed the 64 TRP immune guinea pig. This response does not directly affect feeding but affects survival of nymphs. Immunoprotective epitopes include 64 trp2 protein (small N-terminal fragment of 64P protein) as well as 64 trp6 protein (such as 133 amino acid fragment of 64P protein, denatured antigen) (these can be conserved in nymph related cement proteins) It is possible to exist inside. This is further investigated by immunoblotting using anti-64 trp antiserum against nymph tissue extracts.
[0085]
(3.2 Adult ticks)
Mortality was also significant among adult female ticks fed guinea pigs immunized with 64 trp2 (mortality 55.5%) protein and 64 trp3 (70% mortality) protein. FIG. 7A (1) shows some of the adult ticks fed the 64 trp2 immune guinea pig. They had lower pile weights compared to the other 64 trp and GST immune guinea pigs (Table 2; average weight = 336 mg). In addition, two ticks from this group lay a small amount of eggs that do not hatch; and during the late stages of feeding, some of the isolated adult ticks that were well fed died two days after separation. .
[0086]
Similarly, well-stacked adult fed ticks from 64 trp3 immunized guinea pigs died within the first week after isolation (FIG. 7B). These ticks are swollen with blood meal, dark in color, and develop strong consistency in death compared to control ticks. This vaccine effect on ticks shows damage to the intestines of ticks as well as interference with osmotic regulation, a function of tick salivary glands.
[0087]
All normal adult ticks from the control protein immune guinea pigs appeared normal and survived to lay eggs (FIG. 7C).
[0088]
An autopsy study was performed by R.C. After feeding with adults of appendiculatus, it was performed from a skin biopsy from a guinea pig immunized with 64TRP protein. Erythematous papule trauma was observed at the tick attachment site (FIGS. 8A, B and C, number 3) compared to skin biopsies from control protein immune guinea pigs (FIGS. 8D and E).
[0089]
Trauma was labeled during a biopsy from a 64 trp2 immune guinea pig as shown by thickening of the skin and necrotic trauma (FIG. 8C).
[0090]
These results correlate with the high mortality observed in adult mites after feeding against 64 TRP immunized guinea pigs. Thus, tick feeding seemed to stimulate the immune response by 64 TRP vaccinated guinea pigs against the late stages of adult tick feeding.
[0091]
To confirm these findings, histological studies were performed on sections from skin biopsies using hematoxylin and eosin staining (Bancroft JD and Stevens, A. Ed. (1990). Theory and Practice of. Histologic Technologies, 3rd edition). The results show the normal histological profile expected in skin biopsy sections from post-feeding adult ticks of control protein immune guinea pigs (Figure 9.1).
[0092]
In contrast, histological studies of skin biopsy sections derived from 64TRP guinea pigs showed that, in particular, the presence of leukocyte infiltration in the dermis close to the previous tick attachment site of the epidermis (this is a low magnification (Figure 9.2 Confirm the immunological response to feeding of adult ticks, as seen by 9.3) and high magnification (observed in both FIGS. 9.7 and 9.8). There is also epidermal thickening that is evidence of a chronic inflammatory response.
[0093]
Further histological studies were performed on these same sections as well as control samples using Hema “Gurr” Rapid Blood Smear dye (BDH) (ie, light dye) according to the manufacturer's instructions. Results show leukocyte infiltration (Figure 9.5 and 9.6), which is an eosinophil and basophil polymorphism in skin biopsy sections from 64 trp guinea pigs (this is not present in the control sample (Figure 9.4). ))It was confirmed.
[0094]
(3.3 Egg production and viability)
Statistical analysis of egg production as determined by F-ratio has shown that female R. pneumoniae phagocytosed 64 trp5 immunized guinea pigs compared to female tick from other groups. significantly lower mean egg weights (F, _1,44 = 5.646, p <0.022). In addition, 2/9 eggs did not hatch. These are R. pneumoniae phagocytosed guinea pigs immunized with 64 trp2 protein. born by two female adult ticks from a group of appendiculatus ticks. This result indicates that certain constructs significantly affected the reproductive production of female adult ticks that prey on immunized animals. This is the desired vaccine effect.
[0095]
Depending on the results of the vaccine test, R. The use of 64 trp2, 64 trp3, 64 trp5 and 64 trp6 proteins as vaccines against appendiculatus mites is supported.
[0096]
The observed immune inflammatory response was observed in secondary mite infestations (Brown and Askenase, 1981 J. Immunol. 127: including severe erythema, edema, necrosis, thickening and erythematous papules at the abandoned tick feeding site. 2163-2167; Brown and Askenase, 1983 Federal Processings 42, 1744-1749). Localized cellular responses (basophil and eosinophil polymorphisms) and tissue responses in secondary invasion are known as cell-mediated immunity and are widely regarded as a major mechanism of rejection in tick-immunized animals It is considered. Thus, there are complex immune mechanisms, including localized cell-mediated responses at the site of adhesion and humoral and complement-dependent effector mechanisms.
[0097]
Antibody titers were determined by ELISA using anti-64 trp serum or anti-GST serum from guinea pigs immunized with 64 trp or GST antigen, respectively (Desai et al., (1994) J. Neurol. Sci. 122, 109. -116). Comparison of titers before and after tick infestation showed a consistent increase in antibody titers of guinea pigs immunized with 64 trp1, 64 trp2, 64 trp3, 64 trp5, or 64 trp6. The observed increase indicates that tick infestation in immunized animals has a booster effect and induces a past response. This response indicates that natural tick invasion removes the need for further immunity. This is because tick feeding provides the immune stimulation necessary to maintain vaccine protection. Thus, a single-shot vaccine requiring only one immunization can be prepared using a suitable adjuvant and a single 64 trp construct or cocktail thereof.
[0098]
(Summary of research on 64P cement protein)
The cement corn produced by Rhipicephalus appendiculatus acts as an anchor, fixing the tick's mouthpart to the epidermis and dermis of its host skin. The connection between the cement cone and the surrounding host tissue forms a leak-proof seal. To avoid causing a host rejection response to ticks, cement proteins incorporate structures similar to those of collagen and keratin. The shortened form of cement protein (64P) is E. coli. expressed in E. coli and antisera raised against this protein. A summary of the results is shown in Table 2 below.
[0099]
(Table 2: Summary of properties of 64TRP protein)
[0100]
[Table 2]

Vaccine effect: + = Effect of mild intensity on Rhipipephalus appendiculatus nymph ticks after feeding with 64 trp1 immunized guinea pigs; ^a = Very potent effect on Rhipipephalus appendiculatus adult ticks after feeding with 64 trp3 immunized guinea pigs; ⁿ = Very strong effect on Rhipicephalus appendiculatus nymph ticks after feeding with 64 trp6 immunized guinea pigs; no effect on Rhipicephalus appendiculatus ticks after feeding with 64 trp4 immunized guinea pigs
^* Molecular weight of the fusion protein (ie including 26 kD GST protein + 1 kD 9XHIS.TAG)
φFusion protein molecular weight (ie including 26 kD GST protein)
Example 4: Cross-reactivity of antisera elicited against Rhipicephalus appendiculatus cement protein 64 trp
(4.1 Mechanism of action of tick cement vaccine)
As attempted in Example 3, R.I. Immunization of guinea pigs with a specific fragment of appendiculatus 64 trp resulted in high mortality in adult female ticks and young ticks after the ticks have finished feeding. Tick turns black and stiff, indicating damage to the tick's internal organs and leakage of blood from the internal organs into the body cavity.
[0101]
To test this hypothesis, an immunoblot was performed to determine whether antibodies to tick cement fragments cross-react with antigens in the viscera and hemolymph of adult ticks, and in larval and larval whole extracts. It was determined whether or not to cross-react with antigen.
[0102]
(4.2 Results)
Anti-64 trp2 serum reacted with 22 kD and 25 kD protein bands in cement corn extract (FIG. 10A). This antiserum consists of salivary glands (22, 25 kD), hemolymph (22, 52 kD), nymph extract (52, 98 kD) and larva extract (52 kD) (FIG. 10A), and midgut extract (52 kD) (FIG. 11B) showed cross-reactivity with the protein band.
[0103]
Anti-64 trp5 serum reacted with 31 kD and 48-70 kD protein bands in cement corn extract (FIG. 11D). This antiserum is found in ticks salivary gland extract (15, 22, and 31; FIG. 11C) and ticks saliva gland extract (25, 31 kD; FIG. 11D) fed for 2 days. Cross-reacted with protein band. Cross-reactivity was also detected using the protein bands of the midgut (52-70 kD; FIG. 11C) and hemolymph (31, 48 kD; FIG. 11D), but not using the nymph and larval extracts (FIG. 11D). Similar cross-reactivity was observed with anti-64 trp3 serum (not shown).
[0104]
Anti-64 trp6 serum reacted with protein bands of 22, 25 kD and 48-70 kD in cement corn extract (FIG. 10B). This antiserum is associated with protein bands (FIG. 10B) in salivary glands (22, 25 kD), hemolymph (22, 48 kD), and larval extracts (120 kD), and midgut extracts (65-70 kD; FIG. 10A). Cross-reacted but did not show a clear cross-reactivity with the nymph extract (FIG. 10B).
[0105]
(4.3 Conclusion)
Keratin-like protein, 64 trp, R.I. The antibodies raised against the appendiculatus tick cement fragment have been described in adult female R. pneumoniae. It apparently cross-reacts with antigenic epitopes in the salivary gland, midgut and hemolymph of appendiculatus. Reaction with these epitopes by antibodies in tick dry blood taken against immunized animals probably causes damage to the midgut and causes tick death. Dissection of one of the affected female ticks revealed clots dispersed within the body cavity (this is consistent with rupture of the midgut). Thus, this vaccine targets tick secreted proteins (ie, “exposed” antigens) but targets “hidden” antigens in the midgut (and possibly hemolymph and salivary glands) (ie, Affects normal physiological function), causing high mortality. So this cement fragment:
(I) stimulate an inflammatory response that boosts the immune status of the vaccinated animal; and
(Ii) targeting latent antigens and causing damage to ticks
A dual action vaccine is provided.
[0106]
(Example 5: Cross-reactivity with other tick species using immunoblots)
R. To determine whether antibodies raised against an appendiculatus cement protein react with antigenic epitopes of other tick species, Rhipicephalus sanguineus, Amblyomamma variegatum (Africa, South America, and the Caribbean) Immunoblots were performed using tissue extracts of Bovine's economically important plague) and Ixodes ricinus (sheep or tick ticks that transmit Lyme disease and tick encephalitis to humans in Europe).
[0107]
(5.1 Results)
Anti-4 trp5 serum is Varyegatum salivary gland (180 kD) and midgut (25, 52 kD) extracts and hemolymph (85 kD) protein bands cross-reacted (FIG. 12A). R. There was no cross-reactivity detected using sanguineus salivary gland, hemolymph or midgut (not shown).
[0108]
Anti-65 trp6 serum is A.I. It cross-reacted with the 50 kD band of variegatum hemolymph but did not show activity with salivary glands and midgut preparations (FIG. 12B). R. sanguineus cross-reacted with several salivary gland protein bands (51, 53-55, 65, 120 kD) and midgut (25, 52, and 55 kD), but not with hemolymph (FIG. 12C). The cross-reacting bands that appear blurred are probably glycosylated proteins.
[0109]
Using 64 trp3 antiserum (FIG. 13A), two distinct bands (a and b) and one faint band (c) were detected in the nymphal extract and mature hemolymph, medium There was also cross-reactivity with the gut and salivary glands.
[0110]
Antiserum against 64 trp2 (FIG. 13B) Some bands were detected in the sanguineus extract, including one strong band (j) present in the total extract.
[0111]
Control antiserum raised against GST detected cross-reactive bands in cement corn and salivary glands (FIG. 14). Cross-reactivity in the salivary glands is reported in R. cerevisiae as reported for Boophilus microplus. sanguineus GST can be shown and the cross-reaction in cement corn is probably due to non-specific reaction with host protein hemoglobin / IgG contaminated cement corn extract obtained from partially fed ticks.
[0112]
Antisera against each of 64 trp2 and 64 trp5 include cement corn, intestine and I.I. Cross-reacted with ricinus whole nymph extract. In contrast, non-cross reaction was detected with anti-64 trp3. This observation is consistent with R.A. sanguineus and A.M. It was different from the cross-reactivity observed with variegatum tissue extracts. Anti-64 trp6 serum I.V. There was also cross-reactivity with ricinus intestines and nymphs.
[0113]
These results are summarized in Table 3.
[0114]
(5.2 Conclusion)
R. Antibodies raised against the appendiculatus cement protein 64 trp construct cross-reacted with antigenic epitopes in the salivary gland, midgut and hemolymph of three other tick species. These results are shown in R.C. It suggests that candidate vaccines from the appendiculatus cement provide a broad spectrum vaccine that is effective against a number of different tick species.
[0115]
Based on the observed height response, R.I. appendiculatus 64 trp6 was selected as the immunogen for the vaccine trial. As described above, R.I. In a vaccine trial with appendiculatus (see Table 2), 64 trp6 is It was effective against appendiculatus nymphs but not against maturation. Accordingly, R.I. in a vaccine trial with Sanguinus, One of the two constructs effective against appendiculatus (either 64 trp3 or 64 trp2) was included with 64 trp6 as described in the following section.
Table 3: R. cerevisiae using serum from guinea pigs immunized with 64 trp recombinant antigen. appendiculatus and R.A. Summary of results for cross-reactions between Sanguineus, Amblyomma variegatum and Ixodes ricinus tick antigen.
[0116]
[Table 3]

(Code used for Table 3)
CC = tick cement corn extract, SG = salivary gland extract (from non-food tick), gut = middle intestine extract, H = hemolymph, N = nymph tick extract, L = larval tick extract .
[0117]
For the antisera used in the immunoblots, + = positive reaction and − = negative reaction, ab ′ = antiserum respectively; nd = not done.
[0118]
+ ^* And + ^δ = Positive response to anti-GST antiserum from the insoluble fraction of CC and SG extracts dissolved in SDS sample buffer at 100 ° C.
[0119]
+ ^* (CC from partially fed ticks) = immunopositive band is probably due to non-specific binding with host IgG / haemoglobin fraction bound to anti-GSTab 'cement corn. + ^δ = (SG from unfed ticks) = Immunopositive bands are probably due to specific binding of anti-GSTab 'to equivalent GST protein (Ref. Boophilus microplus GST protein).
[0120]
+ ^∞ A. solubilized in SDS / 2 mercaptoethanol sample buffer. variegatum insoluble intestinal extract, − ^* Very faint immunopositive band due to non-specific binding of nymph ticks extract antigen with GST antiserum.
[0121]
Example 6: Cross-protective vaccine trial: Guinea pig immunized with Rhipicephus appendiculatus cement protein 64 trp construct and challenged with R. sanguineus maturation
(6.1 Treatment for vaccine trial)
Group 1: recombinant 64 trp6 + 64 trp2 + Montanide ISA (4 guinea pigs)
Group 2: Recombinant 64 trp6 + 64 trp3 + Montanide ISA (4 guinea pigs)
Group 3: GST (control) (2 guinea pigs)
Total number of animals = 10
Route and dose:
Subcutaneous inoculation in the anterior scapula region such that the antigen is bound either within a single site or each antigen into a different site.
[0122]
Dose: 50 μg antigen / animal
Vaccination scheme:
1. Primer inoculation
2. First boost
3. Test bleeding 10-12 days after inoculation
4. Second boost (when antibody titer is less than 1/5000)
5. Test bleeding 10-12 days after inoculation
6). Antibody titer greater than 1/5000: 10 pairs of R.P. Challenge with adult sanguineus
7). Evaluate tick feeding efficiency, survival and reproductive outcome.
[0123]
(6.2 results)
The results are summarized in Table 4. Overall, this result is consistent with R.I. A putative vaccine induced against the cementic protein of appendiculatus 64 trp It shows that it was cross-protective with adults and nymphs of Sanguineus. Previous R.D. There was a significant difference from the observation of appendiculatus.
[0124]
[Table 4]

Table 4 Note
* Indicates that either 64 trp protein cocktail (ie, 64 trp 2/6 or 64 trp 3/6 combination) as a combined antigen to a single subcutaneous site (C) or a separate subcutaneous site (S) Individually immunized guinea pigs are shown. I refers to a local inflammatory skin reaction (transient, 2-3 days) event observed as erythema, edema, scratching, and lymphadenopathy at the site of tick feeding. nd means not going. M and F refer to male and female adult ticks, respectively. E indicates a hatched egg. † indicates two females that were alive in this group and did not lay eggs.
[0125]
((I) Effect on adhesion)
R. Unlike appendiculatus, test (but not control) R.P. The rate of attachment of adult sanguineus was affected. Twenty-four hours after infestation, we observed that most of the ticks on the four test animals were not attached and crawled away from the host on the retained gauze. Subsequently, during the initial breeding period (Day 1 to Day 5), all 16 dead adults (12 females and 4 males) out of 81 were removed from the test animals. All but one of these ticks seemed unfed (Figure 15). All 18 ticks on control animals adhered within 24 hours of infestation.
[0126]
((Ii) Effects on males)
Again, R.M. Unlike appendiculatus, effects on male survival were observed. As described above, four dead males were removed at the beginning of the breeding.
[0127]
((Iii) Inflammatory response)
All eight test guinea pigs showed an inflammatory response at the site of antigen seeding and also showed an inflammatory response in the tick habitat. Inflammation was first observed 6-7 days after infestation, and was in a lull state by day 9-10 of breeding. In control animals, no inflammation was observed.
[0128]
((Iv) lethality after breeding)
R. As observed with appendiculatus, most females (29/41) completed hyperemia. However, of these, seven died within two days of leaving. They do not conflict with damage and rupture to the intestine, R.I. A similar effect (excessive swelling and blackening) on appendiculatus was shown (FIG. 16). The moderate mortality observed in nymphs from test animals was comparable to the control case.
[0129]
((V) Reproducible output)
Of the 22 surviving congested females from the test animals, 19 spawned. These statistical analyzes are currently determined.
[0130]
(6.3 Conclusion)
Antibodies raised against the 1.64 trp protein are described in R.A. cross-reacts with immunogenic epitopes and immunoblots in the salivary gland and midgut of Sanguinus ticks.
[0131]
2. Tick R. A cocktail of vaccines containing different 64 trp proteins constructed from a secreted cement protein (ie, an “exposed” antigen) from appendiculatus is another tick species Cross-protection against Sanguineus was provided by targeting “concealed” antigens to the midgut and salivary glands of adult ticks, resulting in high mortality.
[0132]
3. Cocktail vaccines stimulate local inflammatory immune responses that boost the immune status of vaccinated animals.
[0133]
Example 7: Antigenic cross-reactivity between Rhipipephalus appendiculatus and Boophilus mirroplus detected by immunoblot using antiserum to R. appendiculatus cement protein 64 trp construct
(7.1 Preparation of B. microplus tick extract)
Boophilus microplus adults and nymphs were collected from cattle. Larvae are bred and can therefore show an increased level of non-specific cross-reactivity due to host proteins.
[0134]
(7.2 Results)
(7.2.1 Cross-reactivity with 64 trp2 and 64 trp3 antisera)
A cross-reactivity study with 64 trp3 antiserum using immunoblotting (FIG. 17A) has been performed on several B.P. microplus cement corn protein ( c , i , j , k and l ) Detected; two bands of similar size ( c and h ) Were detected in the midgut and salivary glands. Many bands were detected in the reared nymph extracts, some of which were probably non-specific (see below).
[0135]
Using 64 trp2 antiserum (Figure 17B), one distinct band ( o ) Was detected in all extracts. This band is detected in all samples using 64 trp3 antiserum c Similar size (62kD) but with band c Was not clear. band c / o Was slightly detectable in Coomassie Blue stained gel (FIG. 17C). This indicates that the cross-reactivity with 64 trp2 or 64 trp3 antisera may be specific and not due to non-specific binding. Also consistent with this interpretation is the fact that the 64trp2 and 64trp3 proteins are related constructs with overlapping N-terminal sequences (see FIG. 2).
[0136]
With 64 trp2 antiserum, a light band ( q ) Was detected in all samples. Cement corn (lane 5) and nymph extract (lane 2) have a common distinct band ( n and p ) And band on the other hand r Was detected in all adult extracts.
[0137]
e The immunopositive band marked as is most likely due to non-specific binding of the anti-GST antiserum to the host protein (hemoglobin / IgG) present in the tick tissue extract. Immunopositive band f Specific binding of anti-GST antiserum to a protein band (which represents the Boophilus microplus larvae 26 kD GST protein) within the entire midgut, salivary gland and tick tissue extracts (see FIG. 18C) (See He et al., (1999), Insect-Biochem-Mol-Biol. 29 (80): 737-43).
[0138]
(7.2.2 Cross-reactivity with 64 trp5 and 64 trp6 antisera)
Both 64 trp5 and 64 trp6 antisera were detected in several bands in the nymph extract, but there was no clear cross-reactivity with the adult tick extract (FIGS. 18A and 18B). The 64 trp5 antiserum has a dominant band with cement corn ( b ), But no cross-reactivity was detected between 64 trp6 and cement corn extract.
[0139]
a and e The immunopositive band, denoted as, is due to the non-specific binding of anti-GST antiserum to host protein (hemoglobin / IgG), respectively present in the whole cement corn extract and the larvae of reared ticks. Probably due (Figure 18C). Immunopositive band f Is probably due to the specific binding of the anti-GST antiserum to a protein band (probably the 26 kD of Boophilus microplus larvae) within the whole tissue extract of the midgut, salivary glands, and ticks .
[0140]
(7.3 Conclusion)
The results are summarized in Table 5.
[0141]
R. appendiculatus, R .; Our vaccine trial with sanguineus and Ixodes ricinus showed that immunoblotting data provided a good indicator of an effective vaccine immunogen. Based on this, the results presented in this example suggest the following:
(I) 64 trp2 and 64 trp3 are Micorplus adult and B. is a candidate vaccine immunogen for controlling micorplus nymphs;
(Ii) The 64 trp5 construct is may be effective against micorplus nymphs and may be at least partially effective against adults;
(Iii) 64 trp6 is may be effective against micorplus nymphs, but not effective against adults;
(Iv) A cocktail of immunogens (either 64 trp2 + 64 trp5 or 64 trp3 + 64 trp5) It may be the most effective strategy for controlling micorplus.
[0142]
Table 5: Cross-reactivity between R. appendiculatus microcapsule tick antigen and Boophilus microcapsule tick antigen using guinea pig sera immunized with 64 trp recombinant antigen
[0143]
[Table 5]

CC = tick cement cone extract, SG = salivary gland extract, gut = midgut extract, H = blood lymph, N = nymph tick extract, L = larval tick extract
+ = Positive response and − = negative response to antisera used in immunoblots, respectively. ab ′ = antiserum; nd = not measured
+ ^* And + ^δ = Positive response to anti-GST antiserum from the insoluble fraction of tick tissue extract solubilized in SDS sample buffer at 100 ° C.
[0144]
+ ^* Immunopotential bands (CC from partially fattened ticks) are likely anti-GST ab with host IgG / hemoglobin fraction binding to cement corn and host IgG / hemoglobin fraction from fattened tick whole nymphs Due to non-specific binding of '
+ ^δ (SG from unfattened ticks) immunopositive bands are probably equivalent GST proteins ¹ Is due to the specific binding of anti-GST ab ′ to
[0145]
Example 8: Cross-reactive vaccine test: Guinea pigs immunized with Rhipipephalus. Appendiculatus cement protein 64 trp construct and challenged with I. ricinus nymphs
(8.1 Selection of immunogen)
R. A summary of the cement construction of appendiculatus 64 trp is shown in FIG. Candidate immunogens are treated with antisera against the Identified on the basis of whether specific cross-reactive antigens were detected in extracts of ricinus samples.
[0146]
Cross-reactivity studies using immunoblotting with 64 trp antiserum have been described in several I.V. Detection of ricius whole larvae extract protein and larva extract protein (FIG. 19) and cement corn adult preparation and midgut extract (not shown) was shown.
[0147]
Using 64 trp2 antiserum (FIG. 19A (iii)), two major bands (a and b) were detected in nymph extracts and also showed cross-reactivity with adult cement corn and midgut extracts (See Table 3).
[0148]
Antisera against 64 trp5 and 64 trp6 (FIGS. 19A (iv) and (v), respectively) Several bands were detected in the ricinus whole nymph extract. Antisera against 64 trp6 also detected five dominant bands in the whole larvae extract (FIG. 19B (ii)).
[0149]
The control antiserum raised against GST has a very weak band in whole nymph extract, cement corn extract and midgut extract, which is probably responsible for the nonspecific reaction using the host protein hemoglobin / IgG. Detected.
[0150]
Based on the observed cross-reactivity, R.I. appendiculatus 64 trp2, 64 trp5 and 64 trp6 were selected as immunogens for vaccine testing. These were used alone or as a cocktail.
[0151]
(8.2 Treatment for vaccine test)
Group 1: Recombinant 64 trp6 + 64 trp2 + Montanide ISA (1 hamster)
Group 2: Recombinant 64 trp6 + 64 trp5 + Montanide ISA (1 hamster)
Group 3: GST (control) (1 hamster)
Group 4: Recombinant 64 trp2 + Montanide ISA (1 hamster)
Group 5: recombinant 64 trp5 + Montanide ISA (1 hamster)
Group 6: Recombinant 64 trp6 + Montanide ISA (1 hamster)
Total number of animals = 6.
[0152]
(8.3 Route and dose)
Subcutaneous inoculation of either a single antigen or a combination of antigens at a single site in the prescapular region.
Dose 25 μg antigen per animal.
[0153]
(8.4 Vaccination scheme)
1. Primer inoculation
2. First boost
3. Test blood sampling 10 to 12 days after inoculation
4). Second boost (if antibody titer <1/5000)
5. Test blood sampling 10 to 12 days after inoculation
6). Antibody titers> 1/5000: 50-100 I.V. Challenge with ricinus nymphs
7). Evaluation of tick diet performance, local inflammatory immune response to tick diet, survival and successful molting to adults.
[0154]
(8.5 Results)
The results are summarized in Table 6. Overall, these are R.I. A putative vaccine induced against the cementum of appendiculatus is It shows cross-reactivity against ricinus nymphs.
[0155]
((I) Effect on adhesion)
R. like appendiculatus, I.I. The rate of attachment of ricinus nymphs to test animals was not affected.
[0156]
((Ii) inflammatory response)
Four hamsters showed an inflammatory response at the site of tick diet, and three hamsters had a severe reaction (FIG. 20). This result correlates with an in vitro assay (ie Western blot). Inflammation was observed 3-5 days after infestation and was still present at the time of tick withdrawal (day 5 of diet). In control animals, no inflammation was observed.
[0157]
((Iii) Mortality after diet)
Cross protection in the context of in vitro assays is assessed when the fed nymphs have molted and become adults.
[0158]
(8.6 Conclusion)
Antibodies raised against the 1.64 trp protein were detected in the I.V. It cross-reacts with antigenic epitopes in ricinus tick nymph, larvae and adult cement corn and midgut.
2. A host response was observed in hamsters immunized with 64 trp immunogen (previously only observed in guinea pigs).
3. Various degrees of inflammatory response have been observed in I.V. on animals immunized with the 64 trp construct. The most severe response was observed in ricinus nymph tick diet sites, and was observed in hamsters immunized with a cocktail of 64 trp6 / 5.
4). The immunogen stimulates a local inflammatory immune response that boosts the immune response.
[0159]
Table 6. Comparison of diet parameters for Ixodes ricinus tick diet on hamster immunized with 64TRP protein and GST protein
[0160]
[Table 6]

i = Inflammation: − and + mean the absence or presence of inflammation at the site of tick attachment during the diet, respectively; the degree of inflammation is indicated by: + = mild, ++ = moderate, and +++ = severe. ^* Is a nymph I. Tick diet on control hamsters of Ricinus ticks, extended by 6 hours compared to ticks diets fed on 64 trp immunized hamsters.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is the nucleotide and deduced amino acid sequence of seven clones of the putative cement protein.
Clone 21: Partial cDNA sequence and transcript of clone 21. The cDNA putative protein is predicted to be a cement protein: if possible, it contains a signal sequence, typically a hydrophobic N-terminal region that builds a secreted product, and is very similar to structural proteins, especially keratin is doing. The recognition sequence for post-translational binding of the glycosaminoglycan group is underlined.
Clone 33: deduced protein sequence of PCR-cloned product (from cDNA library) into fusion protein expression vector (pGEX-2T (Pharmacia)). The predicted signal sequence is shown in bold. Like many structural proteins, this protein is glycine-rich and proline-rich. This protein has some similarity to keratin. ^* Indicates a stop codon.
Clone semA: partial sequence of semA cDNA and protein (putative reading frame). This protein is very repetitive, has the sequence KGALLQQQQQASQVKGALKAI or a slight variant thereof and is repeated several times.
Clone 24: Incomplete cDNA and cDNA deduced sequence of clone 24. This protein has similarity to structural proteins (especially collagen) and contains repetitive sequences. Many related clones are found in this library. This cDNA also contains a common region with glutenin (self assembly protein).
Clone 68: Partial cDNA and deduced sequence of clone 68. This library contains a family of similar clones. This encoded protein is similar to a structural protein (eg, keratin). A series of possible glycosaminoglycan binding sites are underlined.
Clone 64: Incomplete cDNA sequence and cDNA deduced protein sequence of clone 64. This putative signal sequence is shown in bold. Possible glycosaminoglycan binding sites are underlined. The first 40 amino acid fragments of the mature protein are collagenous and the rest of this sequence is similar to keratin. This protein is glycine rich and contains several repeats of the motif (C / S) 1-4 (Y / F), which is also found in structural proteins from insect egg shells. This tyrosine may be involved in cross-linking by the formation of dityrosine-cross-links by phenoroxidase. A similar protein is encoded by clone I (see below). ^* Indicates a stop codon.
Clone I: Incomplete cDNA sequence and cDNA deduced protein sequence of clone I. This putative protein is glycine-rich and tyrosine-rich, and the leaf-building polychaete Pragmatopoma californica cement protein, a component of the quinone-yellowing cement in the tubes constructed by these marine parasites Is similar.
FIG. 2 is an amino acid sequence of a 64P protein fragment (64TRP) expressed in Escherichia coli. P1 / P2, P1 / P3, P4 / P5, P6 / P5, P1 / P5 and P7 / P5 are truncated versions of the 64P protein (ie, 64 trp2 (51 amino acids), 64 trp3 (70 amino acids), 64 trp1 (respectively)). Plasmid from the 64P amino acid sequence for expression in Escherichia coli cells as 29 amino acids), 64 trp4 (63 amino acids), 64 trp5 (133 amino acids (without HIS tag)), and 64 trp6 (133 amino acids (including HIS tag)))) Represents the primer used to subclon the PCR product into pGEX-2T. Possible predicted cleavage signal peptides (amino acids 1-18) are underlined in green.
FIG. 3 is SDS-PAGE: (A) 4-12% gradient NuPAGE Bis-Tris gel stained with Coomassie Blue, where (B) and (C) are ticks, respectively. An IPTG-inducible E. coli expressing a structural protein and a recombinant truncated version (trp) of the vector-GST protein, 64P (ie, trp1, trp2, trp3 and trp4). E. coli Western blot using GST monoclonal antibody (1: 500 dilution) and HIS-tag monoclonal antibody alkaline phosphatase conjugate (1: 2000 dilution). Lanes: 1 = molecular weight marker, 2 = 26 kD vector-GST protein, 3 = 30 kD trp1 protein, 4 = 33 kD trp2 protein, 5 = 36 kD trp3 protein, 6 = 35 kD trp4 protein, 7 = 41 kD trp5 protein (No HIS tag), and 8 = 42 kD trp6 protein (HIS tagged). Samples were solubilized at 100 ° C. in SDS before loading the gel. Arrows: a = 42 kD trp6 protein, b = 35 kD trp4 protein, c = 33 kD trp2 protein, d = 30 kD trp1 protein, and e = 26 kD vector GST-protein.
FIG. 4 is an immunoperoxidase study using anti-64 trp antiserum on a thin skin part of a hamster. A and C = anti-64 trp antiserum as primary antibody: hamster thin skin part incubated with 64 trp3 and 64 trp2, respectively; B = hamster thin skin part incubated with primary antibody, ie PBS (saline solution) as control sample . 1 = keratinized layer of the epidermis (stratum corneum), 2 = epidermis and 3 = dermis; K = keratinocytes and CF = collagen fibers gave a positive reaction (yellow / brown) with anti-64 trp3 antiserum. Magnification = 20x.
FIG. 5 is an immunoperoxidase study using anti-64 trp antiserum on a thin skin portion of hamsters after feeding Rhipipephalus appendiculatus. A and C = anti-64 trp antiserum as primary antibody, respectively, hamster thin skin portion incubated with 64 trp3 and 64 trp2; and B = hamster incubated with PBS (saline solution) instead of primary antibody, ie as control sample Skin part. Arrows: 1 = epidermis; 2 = dermis; 3 = superficial fascia; 4 = tick cement cone; and * = portion of cement cone and hamster skin that gives a positive response when incubated with anti-64 trp3 antiserum. Magnification = 10x.
FIG. 6 shows the effect of Rhipipephalus appendiculatus nymphs feeding on guinea pigs immunized with a truncated version of the 64P protein (64TRP). A = cells containing Rhipipephalus appendiculatus nymphs feeding on control guinea pigs immunized with GST; B, C and D = cells containing Rhipicephalus appendiculatus nymphs feeding on guinea pigs immunized with 64 trp protein. * = Arrow indicating the site of inflammation (ie, erythema, edema, lymphadenopathy, and hot on contact) on the skin of immunized guinea pigs B, C and D fed by Rhipicephalus appendiculatus nymphs.
FIG. 7 shows the effect on Rhipicephalus appendiculatus female adult ticks after feeding guinea pigs immunized with 64 trp protein. A and B = Rhipipephalus appendiculatus female ticks after feeding guinea pigs immunized with 64 trp protein and 64 trp3 protein, respectively; 1 = live female ticks, 2 = eggs, and 3 = dead female ticks.
FIG. 8 shows an autopsy study of a skin biopsy of a guinea pig immunized with 64 trp protein after feeding Rhipicephalus appendiculatus ticks. A, B and C = skin biopsy of guinea pigs immunized with 64 trp1 protein, 64 trp6 protein and 64 trp2 protein, respectively, and skin biopsy of control guinea pigs immunized with GST after feeding D and E = Rhipipephalus appendiculatus ticks; 1 = epidermis, 2 = dermis / superficial fascia, 3 = previous tick attachment site, 4 = necrotic trauma.
FIG. 9 shows a histological study of guinea pig skin parts (stained with hematoxylin and eosin and light dyes) immunized with 64 trp protein after feeding Rhipicephalus appendiculatus ticks. 1 = Histological part of the skin of a control guinea pig immunized with GST, and 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 8 = of guinea pig skin immunized with 64 trp protein after feeding adult Rhipicephalus appendiculatus ticks Histological part, staining: hematoxylin and eosin staining = parts 1, 2, 3, 7 and 8 and Wright staining = parts 4, 5 and 6; parts 1, 2 and 3 magnification = 10x; parts 7 and 8 Magnification = 20x; magnification of parts 4, 5 and 6 = 100x. Arrows: A = epidermis, B = dermis, cc = Rhipicephus appendiculatus tick cement cone area, CF = collagen fiber, D = dendrocyte, F = fibroblast, EP = eosinophil Type, BP = basophil polymorphism.
FIG. 10 shows R. cerevisiae using serum from guinea pigs immunized with 64 trp recombinant protein. Figure 2 shows the cross-reactivity between soluble fractions of the appendiculatus tick antigen.
FIG. 10A: R.P. probed with anti-64 trp2 serum. Immunoblot of appendiculatus tick antigen. Lanes A / 1 and A / 2 cement cones; lanes A / 3 and A / 4 salivary glands; lanes A / 5 and A / 6 hemolymph; lanes A / 7 nymphs; lanes A / 8 larvae; lanes A / 9 molecular weight marker ^* .
FIG. 10B: R.P. probed with anti-64 trp6 serum. Immunoblot of appendiculatus tick antigen. Lanes B / 1 and B / 2 cement cones; Lanes B / 3 and B / 4 salivary glands; Lanes B / 5 and B / 6 hemolymph; Lane B / 7 nymph; Lane B / 8 larvae; Lane B / 9 Molecular weight marker ^* .
FIG. Appendiculatus tick antigen (female and male) 4-12% gradient gel stained with Coomassie blue. Lane C / 1 molecular weight marker ^** Lane C / 2 and C / 3 cement cone; lane C / 4 and C / 5 salivary gland extract; lane C / 6 and C / 7 hemolymph; lane C / 8 and C / 9 midgut; lane C / 10 Larvae; Lane C / 11 Larvae.
FIG. 10D: R.P. probed with anti-64 trp6 antiserum. Immunoblot of appendiculatus tick antigen. Lane A / 1 molecular weight marker ^* Lanes A / 2 and A / 3 Tick salivary glands of unfed ticks; Lanes A / 4, A / 5 Midgut.
FIG. 10E: R.P. probed with anti-64 trp2 antiserum. Immunoblot of appendiculatus tick antigen. Lanes B / 1 and B / 2 Tick salivary glands of unfed ticks; Lanes B / 3 and B / 4 midgut; Lane 5 molecular weight markers ^* .
FIG. 10F: R. using anti-64 trp5. Immunoblot of appendiculatus tick antigen. Lane C / 1 molecular weight marker ^* Lanes C / 2 and C / 3 Tick salivary glands of unfed ticks; Lanes C / 4 and C / 5 midgut.
FIG. 10G: R. using anti-64 trp5 antiserum. Immunoblot of appendiculatus tick antigen. Lanes D / 1 and C / 2 cement cones; lanes D / 3 and D / 4 partially fed (day 2) tick salivary glands; lanes D / 5 and D / 6 hemolymph; lane D / 7 Larvae; Lane D / 8 Larvae; Lane D / 9 Molecular weight marker ^* .
FIG. 11 shows R. cerevisiae using guinea pig serum immunized with 64 trp recombinant protein. Figure 2 shows the cross-reactivity between insoluble fractions of the appendiculatus tick antigen.
FIG. 11A: R. cerevisiae from adult female tissue extract probed with anti-64 trp3 serum. Immunoblot of appendiculatus tick antigen. Lane A / 1 marker ^*** Lane A / 2 cement cone (from female partially fed guinea pig); lane A / 3 tick salivary gland not fed; lane A / 4 tick hemolymph not fed; lane A / 5 fed Not tick midgut.
FIG. 11B: R. from adult female tissue extracts probed with anti-64 trp2 serum. Immunoblot of appendiculatus tick antigen. Lanes B / 1, B / 2, B / 3 and B / 4 are as in lanes A / 2-5.
FIG. 11C: R.P. probed with anti-64 trp6 serum. Immunoblot of appendiculatus tick antigen. Lane C / 1 all nymphs; Lane C / 2 all larvae.
FIG. 11D: R.P. probed with anti-64 trp2 serum. Immunoblot of appendiculatus tick antigen. Lane D / 1 all nymphs; lane D / 2 all larvae; lane D / 3 markers ^*** .
FIG. 11E: R.P. probed with control anti-GST serum. Immunoblot of appendiculatus tick antigen. Lane E / 1 marker ^*** Lane E / 2 cement cone (same as lane A / 2); lane E / 3 salivary gland (same as lane A / 3); lane E / 4 hemolymph (same as lane A / 4), lane E / 5 Midgut (same as lane A / 5); lane E / 6 nymph (same as lanes C / 2 and D / 2); lane E / 7 larvae (same as lanes C / 1 and C / 2).
Markers of FIGS. ^*** SeeBlue ^TM Plus2 protein molecular weight markers: 188 kD = myosin, 98 kD = phosphorylase B, 62 kD = bovine serum albumin, 49 kD = glutamate dehydrogenase, 38 kD = alcohol dehydrogenase, 28 kD = carbonic anhydrase, 17 kD = myoglobin red and 14 kD = lysozyme.
FIG. Coomassie Blue stained 4-12% gradient gel of appendiculatus tick antigen.
Lane F / 1 marker ^** Lane F / 2 partially bred male cement corn, lane F / 3 partially bred female cement corn, lane F / 4 unbred male salivary gland, lane F / 5 bred Female salivary gland, lane F / 6 male hemolymph, lane F / 7 female hemolymph, lane F / 8 male midgut, lane F / 9 female midgut, lane F / 10 all nymphs, lane F / 11 all larvae . The 26 kD band f (which is a cross-reaction in the salivary line) is equivalent to that reported for Boophilus microplus. can be represented as appendiculatus GST (He et al., (1999). Insect Biochem. Mol. Biol. 29: 737-743).
11A-F. Molecular weight of labeled bands: a = 200 kD, b = 120-188 kD, c = 80-98 kD, d = 55-62 kD, e = 49-55 kD, f = 26 kD, g = 17 kD, h = 15 Kd, i = 120 kD J = 60-62 kD, k = 36 kD, 1 = 14 kD, m = 188 kD, n = 98-120 kD, o = 55-62 kD, p = 200 kD, q = 188 kD, r = 150 kD and s = 50-62 kD.
FIG. 12 shows recombinant R.P. 2 shows cross-reactivity of antiserum from guinea pigs immunized with appendiculatus 64 trp protein with Amblyomma variegatum and Rhipicephalus sanguineus tick antigens.
A. probed with anti-64 trp5 serum Immunoblot of variegatum tick antigen. Lane A / 1 hemolymph; Lane A / 2 midgut; Lane A / 3 salivary gland; Lane A / 4 molecular weight marker ^* .
B. A. probed with anti-64 trp6 serum. Immunoblot of variegatum tick antigen. Lane A / 1 molecular weight marker ^* Lane A / 2 salivary gland; Lane A / 3 midgut; Lane A / 4 hemolymph.
C. probed with anti-64 trp6 serum. immunoblot of Sanguinus tick antigen. Lane A / 1 molecular weight marker ^* Lane A / 2 salivary gland; Lane A / 3 midgut; Lane A / 4 hemolymph.
About FIGS. ^* Represents the MultiMark ™ protein molecular weight marker (NOVEX): 98 kDa = phosphorylase B, 52 kDa = glutamate dehydrogenase, 31 kDa = carbonic anhydrase, 19/17 kDa = myoglobin Red / Blue, 11 kDa = lysozyme, 6 kDa = aprotinin, 3k.
^** Represents Mark 12TM protein molecular weight marker (NOVEX): 200 kDa = myosin, 116.3 kDa = β galactosidase, 97.4 kDa = phosphorylase b, 66.3 kDa = bovine serum albumin, 55.4 kDa = glutamate dehydrogenase, 36. 5 kDa = lactate dehydrogenase, 31 kDa = carbonic anhydrase, 21.5 kDa = trypsin inhibitor, 14.4 kDa = lysozyme, 6 kDa = aprotinin, 3.5 kDa = insulin B chain and 2.5 kDa = insulin A chain.
FIG. 13 shows recombinant R.P. Figure 3 shows cross-reactivity between Rhipicephalus sanguineus tick antigens using antiserum derived from guinea pigs immunized with an appliculatus 64 trp protein.
A and B R. using anti-64 trp3 and anti-64 trp2 antisera, respectively. immunoblot of Sanguinus tick antigen. C Coomassie Blue stained 4-12% Bis-Tris gradient gel (NuPAGE-NOVEX).
Lanes A / 1 and B / 1: SeeBlue ^TM Plus2 protein molecular weight marker (NOVEX) 188 kD = myosin; 98 kDa = phosphorylase B; 62 kD = BSA; 49 kD = glutamate dehydrogenase; 38 kD = alcohol dehydrogenase; 28 kD = carbonic anhydrase; 17 kD = myoglobin red;
Lane C / 1: Mark12 ^TM Protein molecular weight marker (NOVEX) 200 kD = myosin; 116.3 kD = β-galactosidase; 97.4 kD = phosphorylase b; 66.3 kD = bovine serum albumin; 55.4 kD = glutamate dehydrogenase; 36.5 kD = lactate dehydrogenase; 31 kD = carbonic Anhydrase; 21.5 kD = trypsin inhibitor; 14.4 kD = lysozyme; 6 kD = aprotinin.
Lanes: A / 2, A / 3, A / 4, A / 5, A / 6, A / 7 and A / 8: R.E. sanguineus whole nymph extract, hemolymph, male midgut extract, female midgut extract, male salivary gland extract, female salivary gland extract, and combined male and female cement corn extracts (partially present ticks of guinea pigs) These immunopositive bands were observed as a = 6 kD, b = 17 kD, c = 188 kD, d = 26 kD, e = 28 kD, f = 60 kD and g = 80 kD using anti-64 trp3 antiserum. It was done.
Lanes: B / 2, B / 3, B / 4, B / 5, B / 6, B / 7 and B / 8: Similar to A, these immunopositive bands were treated with anti-64 trp2 antiserum. H = 120 kD, i = 62 kD and j = 60 kD.
Lanes: C / 2, C / 3, C / 4, C / 5, C / 6, C / 7 and C / 8: As in A, protein bands aj are immunized from immunoblots A and B Corresponds to the positive band. Arrow ^* = Immunopositive band due to background binding to anti-GST serum-see FIG.
FIG. 14 shows R. cerevisiae using anti-GST antiserum. Fig. 2 shows an immunoblot of Sanguinus tick antigen.
Lane 8: Mark2 ^TM Protein molecular weight marker (NOVEX) 200 kD = myosin; 116.3 kD = β-galactosidase; 97.4 kD = phosphorylase b; 66.3 kD = bovine serum albumin; 55.4 kD = glutamate dehydrogenase; 36.5 kD = lactate dehydrogenase; 31 kD = carbonic Anhydrase; 21.5 kD = trypsin inhibitor; 14.4 kD = lysozyme; 6 kD = aprotinin. Lanes 7, 6, 5, 4, 3, 2 and 1: R.R. sanguineus whole nymph extract, hemolymph, male midgut extract, female midgut extract, male salivary gland extract, female salivary gland extract, and combined male and female cement corn extracts (partially present guinea pig ticks) Origin). Immunopositive band I ^* And K1 and K2 ^* Refers to non-specific binding to anti-GST antiserum with protein bands (25 kD, 48 kD and 26 kD) present in male salivary gland extract, female salivary gland extract and cement corn extract, respectively.
FIG. 15 shows the effect of Rhipicephalus sanguineus on male and female adult ticks during initial breeding in guinea pigs immunized with different cocktails of 64 trp protein.
(A) Dead female ticks from 64 trp6 / 3 immunized guinea pigs (injected at different sites);
(B) dead female ticks from 64 trp6 / 3 immunized guinea pigs (injected in combination at one site);
(C) dead female (n = 3) and male (n = 2) ticks from 64 trp6 / 2 immunized guinea pigs (injected at different sites);
(D) Dead female ticks from 64 trp6 / 2 immunized guinea pigs (injected in combination at one site)
FIG. 16 shows the vaccine effect of 64 trp protein against adult Rhipipephalus sanguineus ticks post-bred with 64 trp immunized guinea pigs.
(A): Surviving adult female R.P. sanguineus ticks, reared on guinea pigs immunized with a 64 trp 2/6 protein cocktail as an immunogen. Only 2/10 ticks survived; ticks did not lay eggs and were not fully hyperemic
(B): dead adult female R.P. sanguineus ticks, reared in guinea pigs immunized with 64 trp 2/6 and 64 trp 3/6 cocktails as immunogens. The ticks turned brown / black and developed dry consistency for 2-5 days after detachment.
(C): normal adult R.D. sanguineus female ticks, which were laid and then post-feeding on guinea pigs immunized with GST regulatory proteins.
FIG. 17 shows recombinant R.P. Figure 3 shows cross-reactivity between Boophilus microplus tick antigen using antiserum from guinea pigs immunized with appendiculatus 64 trp2 and 64 trp3 proteins.
A and B Immunoblots of Boophilus microplus tick antigen using 64 trp2 and 64 trp3 antisera, respectively; C Coomassie Blue stained 4-12% Bis-Tris gradient gel (NuPAGE-NOVEX).
Lanes: A / 1 and B / 1: SeeBlue ^TM Plus 2 protein molecular weight marker (NOVEX) 188 kD = myosin, 98 kD = phosphorylase B, 62 kD = BSA, 49 kD = glutamate dehydrogenase, 38 kD = alcohol dehydrogenase, 28 kD = carbonic anhydrase, 17 kD = myoglobin red, 14 kD = lysozyme, 6 kD = prosanthine . Lane C / 1: Mark12 ^TM Protein molecular weight marker (NOVEX): 200 kD = myosin, 116.3 kD = β-galactosidase, 97.4 kD = phosphorylase b, 66.3 kD = bovine serum albumin, 55.4 kD = glutamate dehydrogenase, 36.5 kD = lactate dehydrogenase, 31 kD = Carbonic anhydrase, 21.5 kD = trypsin inhibitor, 14.4 kD = lysozyme and 6 kD = aprotinin.
Lanes A / 5, A / 4, A / 3 and A / 2: Boophilus microplus cement corn extract, salivary line extract, midgut extract and whole nymph (bred tick) extract, respectively The immunopositive bands of a = 120-200 kD, b = 80 kD, c = 62 kD, d = 49 kD, e = 40 kD, f = 17 kD, g = 8 kD and h = 200 kD, I = 120 kD using 64 trp2 antiserum. Observations were made at 60 kD, j = 55 kD, k = 49 kD and 1 = 18 kD.
Lanes B / 5, B / 4, B / 3 and B / 2: Boophilus microplus cement corn extract, salivary line extract, midgut extract and whole nymph (bred tick) extract, respectively Were observed using 64 trp3 antiserum at m = 120 kD, n = 35 kD, o = 62 kD, p = 59 kD, q = 49 kD and r = 26 kD.
Lanes C / 5, C / 4, C / 3 and C / 2: Boophilus microplus cement corn extract, salivary gland extract, midgut extract and whole nymph extract (fattened ticks), these proteins Bands a to r correspond to immunopositive bands from immunoblots A and B.
FIG. 18 shows recombinant R.P. Cross-reactivity between Boophilus microplus tick antigens using antiserum from guinea pigs immunized with appendiculatus 64 trp5 and 64 trp6 proteins.
A and B: immunoblots of Boophilus microplus tick antigen using anti-64 trp5 and anti-64 trp6 antisera, respectively; C: immunization of Boophilus microplus tick antigen using antiserum from guinea pigs immunized with recombinant GST protein Blot.
Lane: A / 5, B / 5 and C / 5 = SeeBlue ^TM And two protein molecular weight markers (NOVEX): 188 kD = myosin, 98 kD = phosphorylase B, 62 kD = BSA, 49 kD = glutamate dehydrogenase, 38 kD = alcohol dehydrogenase, 28 kD = carbonic anhydrase, 17 kD = myoglobin red, 14 kD = lysozyme, 6 kD = Aprotinin.
Lanes: A / 1, A / 2, A / 3 and A / 4: Boophilus microplus cement corn extract, salivary gland extract, midgut extract and whole nymph (fattening tick) extract, respectively The immunopositive bands are a = 50-55 kD, b = 32 kD, c = 17 kD, d = 70 kD, e = 48 kD, f = 26 kD, g = 40 kD and h = 30 kD using anti-64 trp5 antiserum. Observed.
Lanes: B / 1, B / 2, B / 3 and B / 4: Boophilus microplus cement corn extract, salivary gland extract, midgut extract and whole nymph (fattening tick) extract, respectively The immunopositive bands were observed to be e = 48 kD, i = 180 kD, j = 75 kD, k = 12 kD using anti-64 trp6 antiserum.
Lanes: C / 1, C / 2, C / 3 and C / 4: Boophilus microplus cement corn extract, salivary gland extract, midgut extract and whole nymph (fattening tick) extract, respectively An immunopositive band was observed with a = 50-55 kD, e = 48.
FIG. 19 shows recombinant R.P. Cross-reactivity between Ixodes ricinus tick antigens using antiserum from guinea pigs immunized with applicdiculitus 64 trp protein.
A (ii), (iii), (iv) and (v): Immunoblots of whole nymph extracts of Ixodes ricinus non-fattening ticks using GST, 64 trp2, 64 trp5 and 64 trp6 antisera, respectively; A (i): Coomassie blue stained 4-12% Bis-Tris gradient gel (NuPAGE-Novex) of the same extract.
B (i) and (ii): immunoblots of whole larval extracts of Ixodes ricinus ticks using Coomassie blue stained 4-12% Bis-Tris gradient gel (NuPAGE-Novex) and 64 trp6 antiserum, respectively .
Lane: A / (i) / 1 and B / (i) / 1: Mark12 ^TM Protein molecular weight marker (NOVEX): 200 kD = myosin, 116.3 kD = β-galactosidase, 97.4 kD = phosphorylase b, 66.3 kD = BSA, 55.4 Kd = glutamate dehydrogenase, 36.5 kD = lactate dehydrogenase, 31 kD = carbonic acid dehydration Enzyme, 21.5 kD = trypsin inhibitor, 14.4 kD = lysozyme, and 6 kD = aprotinin. Lane: A / (ii), (iii), (iv) and (v) / 3: See Blue ^TM And two protein molecular weight markers (Novex): 98 kD = phosphorylase B, 62 kD = BSA, 49 kD = glutamate dehydrogenase, 38 kD = alcohol dehydrogenase, 28 kD = carbonic anhydrase, 17 kD = myoglobin red, 14 kD = lysozyme. Lane: B / (ii) / 3: MultiMark ^TM Protein molecular weight markers (Novex): 98 kD = phosphorylase B, 52 kD = glutamate dehydrogenase, 31 kD = carbonic anhydrase, 19 kD = myoglobin red, 17 kD = myoglobin blue, and 11 kD = aprotinin.
Lane: A / (iii), (iv) and (v) / 4 = I. ricinus whole nymph extract, this immunopositive band is a = 150 kD and b = 62 kD, c = 100 Kd, d = 98 Kd, e = 62 Kd, f = 50 kD and g = 42 kD, h = 190 kD, i = 150 kD, j = 80, k = 62 kD, l = 55 kD, m = 32 kD, n = 17 kD and o = 12 kD were observed. Lane: A / (ii) / 4 = I. This very slight immunopositive band observed as *, which is a ricinus whole nymph extract, is due to non-specific cross-reactivity of tick antigen and GST antiserum.
Lane: B / (ii) / 4 = I. Ricinus whole larvae extract and this immunopositive band was observed to be a = 116 kD, b = 80 kD, c = 62 kD, d = 34 kD, and e = 28 kD.
FIG. 20 is the effect of fattening of Ixodes ricinus ticks on hamsters immunized with different cocktails of 64 trp protein.
I. on hamsters immunized with GST control protein (A), 64 trp6 protein (B), 64 trp5 protein (C), and 64 trp6 / 5 cocktail (D). Studies of hamster skin during fattening [(i) -pre-dissection] and post fattening [(ii) -post-dissection] of ricinus tick nymphs.
Hair growth after tick fattening is normal in control hamster A and very slow in 64 trp immune hamsters and has a hair loss region indicated by arrow a. This is because I.V. on a 64 trp immune hamster. Due to the local inflammatory immune response that occurs during fattening of Ricinus ticks, this is indicated by arrows c, d and e; c = various degrees of inflammation seen as erythema in the subcutaneous tissue of dissected skin D = enlarged anterior scapular lymph node; e = leaching of serum at the left tick fattening site; f = left tick fattening site in the control hamster, this subcutaneous Tissue and anterior scapular lymph nodes appear normal. b = fattened I. Ricinus ticks larvae; Tick fattening on control hamsters was extended by 6 hours compared to fattening on 64 trp immune hamsters.

Claims (7)

A vaccine composition comprising a recombinant fragment of Rhipicephalus appendiculatus tick 64P cement protein as an active ingredient in combination with a pharmaceutically acceptable excipient, wherein said fragment is selected from one or more of the following groups A composition comprising:
64 trp2 (N-terminal fragment of a 64P tick cement protein consisting of 51 amino acids, cloned as a glutathione-S-transferase and histidine tag fusion protein and consisting of 1 to 51 amino acids of the amino acid sequence shown in FIG. 2 );
64 trp3 (N-terminal fragment of a 64P tick cement protein consisting of 70 amino acids cloned as a glutathione-S-transferase and histidine tag fusion protein and consisting of 1 to 70 amino acids of the amino acid sequence shown in FIG. 2 );
64 trp5 (a fragment of a 64P tick cement protein consisting of 133 amino acids cloned as a glutathione-S-transferase fusion protein and consisting of 1 to 133 amino acids of the amino acid sequence shown in FIG. 2 );
64 trp6 (a fragment of a 64P tick cement protein consisting of 133 amino acids, cloned as a glutathione-S-transferase and histidine tag fusion protein and having 1 to 133 amino acids of the amino acid sequence shown in FIG. 2 ); The composition of claim 1, wherein the fragments are 64 trp2 and 64 trp6. The composition of claim 1, wherein the fragments are 64 trp3 and 64 trp6.  The composition according to any one of claims 1 to 3, further comprising an adjuvant. A method for producing an antibody or antiserum that reacts with one or more fragments selected from the following groups, wherein a non-human animal is immunized with the vaccine composition recited in any one of claims 1 to 4 A method comprising the steps of:
64 trp2 (N-terminal fragment of a 64P tick cement protein consisting of 51 amino acids, cloned as a glutathione-S-transferase and histidine tag fusion protein and consisting of 1 to 51 amino acids of the amino acid sequence shown in FIG. 2);
64 trp3 (N-terminal fragment of a 64P tick cement protein consisting of 70 amino acids cloned as a glutathione-S-transferase and histidine tag fusion protein and consisting of 1 to 70 amino acids of the amino acid sequence shown in FIG. 2);
64 trp5 (a fragment of a 64P tick cement protein consisting of 133 amino acids cloned as a glutathione-S-transferase fusion protein and consisting of 1 to 133 amino acids of the amino acid sequence shown in FIG. 2);
64 trp6 (a fragment of a 64P tick cement protein consisting of 133 amino acids, cloned as a glutathione-S-transferase and histidine tag fusion protein and having 1 to 133 amino acids of the amino acid sequence shown in FIG. 2); Use of the vaccine composition according to any one of claims 1 to 4 in the preparation of a medicament for immunizing a mammal against ticks. The vaccine composition according to any one of claims 1 to 4, for use in immunizing a mammal against ticks.

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