JP4909067B2 - インスリン／ＩＧＦ−１受容体のようなＡＫＴを調節する化合物または上流調節因子を同定するための、ＲＨＥｓｏｄ−３プロモーターに基づくスクリーニング分析 - Google Patents
インスリン／ＩＧＦ−１受容体のようなＡＫＴを調節する化合物または上流調節因子を同定するための、ＲＨＥｓｏｄ−３プロモーターに基づくスクリーニング分析 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4909067B2 JP4909067B2 JP2006501551A JP2006501551A JP4909067B2 JP 4909067 B2 JP4909067 B2 JP 4909067B2 JP 2006501551 A JP2006501551 A JP 2006501551A JP 2006501551 A JP2006501551 A JP 2006501551A JP 4909067 B2 JP4909067 B2 JP 4909067B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- daf
- nucleic acid
- promoter
- pathway
- sod
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims description 25
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 10
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 title description 5
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 title description 5
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 title description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 title description 4
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 title description 3
- 102000038455 IGF Type 1 Receptor Human genes 0.000 title description 2
- 108010031794 IGF Type 1 Receptor Proteins 0.000 title description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 37
- LTYUPYUWXRTNFQ-UHFFFAOYSA-N 5,6-diamino-3',6'-dihydroxyspiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=C1C=C(N)C(N)=C2 LTYUPYUWXRTNFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 101100203566 Caenorhabditis elegans sod-3 gene Proteins 0.000 claims description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 34
- 101100533820 Rattus norvegicus Sod3 gene Proteins 0.000 claims description 31
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 31
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 15
- 101001059929 Caenorhabditis elegans Forkhead box protein O Proteins 0.000 claims description 14
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 13
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 12
- 108091008611 Protein Kinase B Proteins 0.000 claims description 9
- 102100033810 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 claims description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 108090000852 Forkhead Transcription Factors Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004315 Forkhead Transcription Factors Human genes 0.000 claims description 7
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 7
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 claims description 6
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 6
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 5
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 5
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 claims description 2
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 claims description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 101100447050 Caenorhabditis elegans daf-16 gene Proteins 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 7
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 5
- 101150082727 sod-3 gene Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 4
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 101100322915 Caenorhabditis elegans akt-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- SIOXPEMLGUPBBT-UHFFFAOYSA-N picolinic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=N1 SIOXPEMLGUPBBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 2
- 101150014742 AGE1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000244202 Caenorhabditis Species 0.000 description 1
- 101100162366 Caenorhabditis elegans akt-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100351314 Caenorhabditis elegans pdk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100483112 Caenorhabditis elegans ttx-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010007572 Cardiac hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000006029 Cardiomegaly Diseases 0.000 description 1
- 235000014653 Carica parviflora Nutrition 0.000 description 1
- 241000243321 Cnidaria Species 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102100035416 Forkhead box protein O4 Human genes 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101000877683 Homo sapiens Forkhead box protein O4 Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 230000010632 Transcription Factor Activity Effects 0.000 description 1
- 102000004599 Winged-Helix Transcription Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010017793 Winged-Helix Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000030261 adult behavior Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 101150091060 daf-16 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150042374 daf-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000010437 gem Substances 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000007653 larval development Effects 0.000 description 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 1
- 229940081066 picolinic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 235000018770 reduced food intake Nutrition 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012106 screening analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 1
- -1 sodium orthovanadate Chemical class 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N trisodium vanadate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-][V]([O-])([O-])=O IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LSGOVYNHVSXFFJ-UHFFFAOYSA-N vanadate(3-) Chemical class [O-][V]([O-])([O-])=O LSGOVYNHVSXFFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003905 vulva Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Endocrinology (AREA)
Description
インスリン／ＩＧＦ−１受容体のようなＡＫＴを調節する化合物または上流調節因子を同定するための、フォークヘッド型転写因子依存性ｓｏｄ−３プロモーターに基づくスクリーニング分析である。
本発明は、ＦＯＸＯフォークヘッド型転写因子活性（「ＦＯＸＯ活性」）を直接的または間接的に調節する化合物のスクリーニングおよび同定プロセス、前記プロセスに適したトランスジェニックＣ．エレガンス、前記プロセスによって同定されたＦＯＸＯ活性を調節する化合物、このような化合物の、疾患の治療および医薬品の製造のための使用に関する。
Ｃ．エレガンスは、えさが豊富だと、成虫になるまでの４つの別個の幼虫段階（L１〜L４）を経て発達する。しかしながら、条件が不都合になると、発達は止まり、その代わりに分散や長期間の生存に特殊化した第三段階の幼虫が形成され、これは、耐性幼虫と呼ばれる。耐性幼虫はえさを必要とせず、長命であり、ストレス耐性である。耐性幼虫は、薄く、より暗い色であり、収縮した咽頭を有する点で、成虫と形態学的に区別することができる。形態学的な変化は、耐性幼虫と成虫における遺伝子発現パターンにおける劇的な変更に関連する。（Ｒｉｄｄｌｅ，１９８８年；ＲｉｄｄｌｅおよびＡｌｂｅｒｔ，１９９７年）。
これまでに、耐性幼虫において構成的な温度感受性を有する系統が同定されており、例えば、２５℃の制限的な温度で、これらの系統は、えさの存在下でも耐性幼虫を形成する（Ｇｅｍｓ，１９９８年）。これらの系統（ｄａｆ系という）の多くのが、線虫のインスリン／ＩＧＦ−１シグナル伝達経路に関与する後天的な遺伝子の突然変異を有することがわかった。表現型の研究により、特定のｄａｆ遺伝子を、ＤＡＦ−２／ＩＲ、ａｇｅ−１／ＰＩ−３キナーゼ、ｐｄｋ−１、ａｋｔ−１、ａｋｔ−２、および、ＦＯＸＯ転写因子ＤＡＦ−１６からなる遺伝経路と関連付けることができた（ＧｏｔｔｌｉｅｂおよびＲｕｖｋｕｎ，１９９４年；Ｒｉｄｄｌｅ，１９７７年；Ｒｉｄｄｌｅ等，１９８１年，Ｋａｅｓｔｎｅｒ等，２０００年）。
ノーザンブロッティングとＲＴ−ＰＣＲによって、ｓｏｄ−３遺伝子の発現は、ＤＡＦ−２／インスリン受容体経路における突然変異によって調節されることが示された（ＨｏｎｄａおよびＨｏｎｄａ，１９９９年）。特定の突然変異体系統におけるＤＡＦ−２機能の不活性化により、ｓｏｄ−３発現の強いアップレギュレーションが起こる。ＨｏｎｄａおよびＨｏｎｄａは、ＤＡＦ−１６は、ｓｏｄ−３遺伝子を活性化する転写因子であること、および、ＤＡＦ−１６は、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路によって阻害されることを示唆している。
その上、転写因子ＤＡＦ−１６に結合するコンセンサス配列が同定されており、この配列は、ｓｏｄ−３上流の調節領域に存在することが示された（Ｆｕｒｕｙａｍａ等，２０００年）。このような最小限のプロモーターに融合した結合モチーフは、哺乳動物組織培養系においてインスリンで調節される発現を起こすには十分である。
ＤＡＦ−２／インスリン受容体経路およびその構成要素はヒトにおいて極めてよく保存されているため、ヒトにおけるインスリン／ＩＧＦ−１シグナル伝達のモジュレーターを同定するのに耐性幼虫の表現型を使用することが提唱されている（ＷＯ９８／５１３５１Ａ１）。しかしながら、従来技術による分析システムでは、耐性幼虫の発達プログラムが完了するまで長いインキュベート時間が必要となる（通常３〜５日間）。このような長時間により、分析成分の分解が起こる。その上、耐性幼虫の不浸透性のクチクラ構造は、食物摂取の減少と共に、幼虫への化合物吸収を阻害する可能性がある。
それゆえに、本発明の根本的な問題は、Ｃ．エレガンス耐性幼虫に依存しておらず、上述の不利益を克服した、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路を調節する化合物を同定するプロセスを提供することである。本発明のプロセス（すなわち本発明の分析システム）は、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路に直接的に関連するデータ読み出しに依存しており、さらに、調査中の生物の発達段階の進行の影響を受けないシステムであり、ここで、上記生物は、好ましくは哺乳動物および線虫細胞、特に線虫細胞、例えばＣ．エレガンスである。その上、本分析は、調査しようとする化合物の存在下での短時間のインキュベート（好ましくは約８〜１２時間以内）の後、定量的なデータ読み出しが提供されるものとする。従来技術の分析システムに比べて、本分析で用いられたレポーターに応じて、定量的なデータ読み出しを得ることができる。
本発明において、驚くべきことに、ｓｏｄ−３遺伝子のプロモーター要素の生物学的活性を有する核酸分子の使用は、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路、例えばｓｏｄ−３プロモーターの活性を調節する遺伝子または化合物の同定に関して多大な利点を有することが発見され、このようなｓｏｄ−３プロモーターとしては、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｒ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ｕｎｄ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（マシェローダーヴェーク（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ）１ｂ，Ｄ−３８１２４ブラウンシュヴァイク，ドイツ）に、ＤＳＭＺ番号１４９１２で、２００２年４月４日に寄託されたもの（ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩでエンドヌクレアーゼ消化した後の、１０９８ｂｐのフラグメント）があり、特に配列番号１に記載のｓｏｄ−３プロモーターである。この調節ＤＮＡフラグメントは、ａｋｔ−１を介してＤＡＦ−２／ＩＲ経路に機能的に連結した、ＦＯＸＯ ＤＡＦ−１６の結合部位を含む。現在のｄａｆ２／ＩＲシグナル伝達経路の情報にもかかわらず、Ｃ．エレガンスのシグナル伝達活性をモニターするのに適した敏感なプロモーター要素は当業界において既知ではない。ｓｏｄ−３プロモーターがレポーター遺伝子に融合している場合、ＤＡＦ−２／ＩＲ活性の迅速な定量が達成できる。それによって、本発明は、ＤＡＦ−２／ＩＲ活性の定量は、系統のバックグラウンド、または、Ｃ．エレガンスの発達段階（これらは従来技術では同時に起こる）に依存しないという大きな利点を提供する。
従って、本発明の一実施形態は、ｓｏｄ−３プロモーターの生物学的活性を示すプロモーターを含む単離された核酸分子である。好ましくは、本発明の核酸配列は、以下からなる群より選択される：（ａ）配列番号１の核酸配列を含む核酸配列；（ｂ）ｓｏｄ−３プロモーター活性を有する（ａ）の核酸配列に対して８０％、９０％、９５％またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列；（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸配列の、ｓｏｄ−３プロモーター活性を有するフラグメント；および、（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸配列の、ｓｏｄ−３プロモーター活性を有する誘導体であって、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり、より好ましくは配列番号１に対して８０％、９０％、９５％またはそれ以上の配列同一性を有する誘導体である。本発明に係る核酸分子のさらにより好ましい実施形態は、線虫、好ましくはＣ．エレガンスにおいて、ｓｏｄ−３プロモーターの生物学的活性を示すプロモーターを含む。
本発明によれば、ｓｏｄ−３プロモーターの生物学的活性を示すプロモーターは、フォークヘッド型転写因子、好ましくはＦＯＸＯフォークヘッド型転写因子（以下「ＦＯＸＯ」）、特にＤＡＦ−１６に反応性を有するあらゆるプロモーターを意味する。このようなプロモーターとしては、例えば、ＦＯＸＯ１ａ、ＦＯＸＯ３ａ、または、ＦＯＸＯ４反応性プロモーターが挙げられる（Ｋａｅｓｔｎｅｒ等，２０００年）。
本発明によれば、用語「フラグメント」は、ｓｏｄ−３プロモーターの生物学的活性を示すのに十分な長さを有する、本発明の核酸分子のあらゆる部分を意味する。
本発明によれば、用語「誘導体」は、その配列が、本発明の核酸分子の配列とは１またはそれ以上の位置で異なっていてもよいが、本発明の核酸分子の配列と高い相同性を示すことを意味する。従って、「相同体」は、少なくとも５０％の配列同一性を有するものを意味し、特に少なくとも６０％、好ましくは８０％超、さらにより好ましくは９０％超の配列同一性を有する。上述の核酸分子に関するかたより（ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）は、欠失、置換、挿入または組換えによってによって生じたものと考えられる。その上、相同性は、機能的および／または構造的に等価であることを意味する。
本発明の他の実施形態は、本発明に係る、ｓｏｄ−３プロモーター活性を示す前記核酸配列、および、レポーター遺伝子の活性を付与する核酸配列を含む単離された核酸分子（「融合分子」）；本発明に係る核酸分子を含むベクター（これはさらに、場合により、真核細胞においてレポーター遺伝子の翻訳可能なＲＮＡの転写および合成を確実にする調節要素（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）モジュレーターに連結していてもよい）、または、本発明の核酸分子またはベクターで形質転換されたトランスジェニック宿主細胞である。
本発明のさらなる他の実施形態は、本発明の核酸分子またはベクターでトランスフェクトされたトランスジェニック宿主または宿主細胞であり、これらは好ましくは線虫由来であり、および、それらの製造方法であり、本方法において、本発明の核酸分子またはベクターの使用よってトランスジェニック宿主細胞（好ましくは線虫由来）を生成する工程を含む。
本発明のさらなる他の実施形態は、本発明に係る、前記トランスジェニック細胞またはトランスジェニック生物、好ましくは線虫（例えばＣ．エレガンス）を含む、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路、ＡＫＴ経路のモジュレーター、および／または、１またはそれ以上のＦＯＸＯのキナーゼのリン酸化のモジュレーターを同定するプロセス（すなわち本発明に係る「スクリーニング分析」）である。
本発明の好ましい実施形態は、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路、ＡＫＴ経路のモジュレーター、キナーゼのリン酸化、ホスファターゼの脱リン酸化、および／または、分子組成、安定性（すなわち半減期）、亜細胞の配置、または１もしくはそれ以上のＦＯＸＯ活性を変更する他の活性（例えば酵素）を同定するプロセスであって、本プロセスは、以下を含む：
（ａ）トランスジェニックＣ．エレガンス（好ましくはＬ１幼虫）と、適切な条件下で、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路、ＡＫＴ経路、キナーゼのリン酸化、ホスファターゼの脱リン酸化、および／または、分子組成、安定性（すなわち半減期）、亜細胞の配置、または１もしくはそれ以上のＦＯＸＯ活性を変更する他の活性（例えば酵素）を調節する能力に関して試験しようとする１またはそれ以上の化合物（例えば酵素）とを接触させること（前記トランスジェニックＣ．エレガンス、好ましくはＬ１幼虫は、レポーター遺伝子に融合した本発明の核酸分子、または、前記融合分子を含む本発明のベクターを含む）；
（ｂ）試験しようとする１またはそれ以上の化合物の存在下で、前記レポーター遺伝子
活性を測定すること；
（ｃ）試験しようとする１またはそれ以上の化合物の非存在下で、場合により、１またはそれ以上の適切な参照化合物の存在下で、前記レポーター遺伝子活性を測定すること；
（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）のレポーター遺伝子活性を比較すること；および、
（ｄ）ＤＡＦ−２／ＩＲ経路、ＡＫＴ経路の調節化合物、キナーゼのリン酸化、ホスファターゼの脱リン酸化、および／または、分子組成、安定性（すなわち半減期）、亜細胞の配置、または１もしくはそれ以上のＦＯＸＯ活性を変更する他の活性（例えば酵素）を選択すること。
（ａ）トランスジェニックＣ．エレガンス（好ましくはＬ１幼虫）と、適切な条件下で、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路、ＡＫＴ経路、キナーゼのリン酸化、ホスファターゼの脱リン酸化、および／または、分子組成、安定性（すなわち半減期）、亜細胞の配置、または１もしくはそれ以上のＦＯＸＯ活性を変更する他の活性（例えば酵素）を調節する能力に関して試験しようとする１またはそれ以上の化合物（例えば酵素）とを接触させること（前記トランスジェニックＣ．エレガンス、好ましくはＬ１幼虫は、レポーター遺伝子に融合した本発明の核酸分子、または、前記融合分子を含む本発明のベクターを含む）；
（ｂ）試験しようとする１またはそれ以上の化合物の存在下で、前記レポーター遺伝子
活性を測定すること；
（ｃ）試験しようとする１またはそれ以上の化合物の非存在下で、場合により、１またはそれ以上の適切な参照化合物の存在下で、前記レポーター遺伝子活性を測定すること；
（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）のレポーター遺伝子活性を比較すること；および、
（ｄ）ＤＡＦ−２／ＩＲ経路、ＡＫＴ経路の調節化合物、キナーゼのリン酸化、ホスファターゼの脱リン酸化、および／または、分子組成、安定性（すなわち半減期）、亜細胞の配置、または１もしくはそれ以上のＦＯＸＯ活性を変更する他の活性（例えば酵素）を選択すること。
本発明の他の実施形態は、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路のモジュレーターを同定するプロセスであり、本プロセスは、以下を含む：
（ａ）トランスジェニックＣ．エレガンスのＬ１幼虫と、ストレス条件下でＤＡＦ−２／ＩＲ経路を調節する能力に関して試験しようとする１またはそれ以上の化合物とを接触させること（前記Ｌ１幼虫は、レポーター遺伝子に融合した本発明の核酸分子、または、前記融合分子を含む本発明のベクターを含む）；
（ｂ）試験しようとする１またはそれ以上の化合物の非存在下および存在下で、場合により１またはそれ以上の適切な参照化合物の存在下で、工程（ａ）の条件下で耐性幼虫状態になるＬ１幼虫の量を測定すること；
（ｃ）工程（ｂ）に従って耐性幼虫状態になったＬ１幼虫の量を比較すること；および、
（ｄ）ＤＡＦ−２／ＩＲ経路の調節化合物を選択すること。
（ａ）トランスジェニックＣ．エレガンスのＬ１幼虫と、ストレス条件下でＤＡＦ−２／ＩＲ経路を調節する能力に関して試験しようとする１またはそれ以上の化合物とを接触させること（前記Ｌ１幼虫は、レポーター遺伝子に融合した本発明の核酸分子、または、前記融合分子を含む本発明のベクターを含む）；
（ｂ）試験しようとする１またはそれ以上の化合物の非存在下および存在下で、場合により１またはそれ以上の適切な参照化合物の存在下で、工程（ａ）の条件下で耐性幼虫状態になるＬ１幼虫の量を測定すること；
（ｃ）工程（ｂ）に従って耐性幼虫状態になったＬ１幼虫の量を比較すること；および、
（ｄ）ＤＡＦ−２／ＩＲ経路の調節化合物を選択すること。
本発明によれば、用語「モジュレーター」は、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路、ＡＫＴ経路、キナーゼのリン酸化、ホスファターゼの脱リン酸化、および／または、分子組成、安定性（すなわち半減期）、亜細胞の配置、または１もしくはそれ以上のＦＯＸＯ活性を変更する他の活性（例えば酵素）に対して阻害、活性化または調節作用を有するあらゆる化学分子または遺伝学的要素（例えは酵素）を意味する。
本発明によれば、用語「適切な参照化合物」は、バナジン酸塩、例えば、オルトバナジン酸ナトリウム、モノペルオキソ（ピコリン酸）オキソバナジン酸塩（Ｖ）、または、ビスペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）オキソバナジン酸カリウム（Ｖ）を意味する。
本発明によれば、用語「適切な条件」は、当業者既知のＣ．エレガンスに適したあらゆる培養条件を意味する（例えば、Ｓ．ｕｌｓｔｏｎおよびＨｏｄｇｋｉｎ，１９８０年を参照）。
本発明によれば、用語「ストレス条件」は、Ｃ．エレガンスに適しているが、適切な条件と異なっており、実質的に幼虫を殺さないような部分的に適切な、当業者既知のあらゆる培養条件を意味し、好ましくは、耐性幼虫形成を誘導することがわかっている条件である（例えば、ＳｕｌｓｔｏｎおよびＨｏｄｇｋｉｎ，１９８０年を参照）。
従来の分析（例えば、耐性幼虫状態からの脱出を利用した分析）と比較すると、本発明のスクリーニング分析は、本分析のパフォーマンス速度、定量の実行可能性、および、副作用（例えば発達上の副作用）の回避に関して多大な利点を示す。
本発明に係る分析システムを実施するのに適した定量可能なレポーター遺伝子は、酵素または蛍光特性によって検出することができるタンパク質をコードしていてもよく、このようなタンパク質としては、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、分泌されたアルカリホスファターゼ、緑色蛍光タンパク質、サンゴ礁蛍光タンパク質、または、当業者既知のその他のレポーターが挙げられる（例えば、Ｈｉｌｌ等，２００１年）。レポーター活性は、生物の溶解産物で測定してもよいし、または、インサイチュで生きている細胞または動物で測定してもよい。
ＤＡＦ−２／ＩＲまたはＡＫＴ経路の阻害剤の同定においてレポーターの活性化が確認されれば、レポーター活性のダウンレギュレーションは、前記経路のアクチベーターを示す。このようなレポーターは、野生型Ｃ．エレガンスにおいて用いてもよいし、または、例えば耐性幼虫経路に関する遺伝子に突然変異を含む可能性のある特定の系統（好ましくはｄａｆ−２突然変異体系統）と組合わせて用いてもよい。
ＤＡＦ−２／ＩＲ経路の要素のシグナル伝達を阻害する同定された化合物は、腫瘍学と心臓肥大症の分野における治療剤として有望な候補であり、一方で、前記経路のアクチベーターは、糖尿病、脳／心臓の虚血、または、神経変性病の治療における治療剤として有望な候補である。
以下の実施例は本発明を限定するのではなく、単に本発明の概念を説明するものとする。
材料および方法
以前に説明された通りに、プロテイナーゼＫとフェノール抽出を用いて野生型Ｃ．エレガンス（Ｎ２）からゲノムＤＮＡを調製した（ＳｕｌｓｔｏｎおよびＨｏｄｇｋｉｎ，１９８０年）。
以前に説明された通りに、プロテイナーゼＫとフェノール抽出を用いて野生型Ｃ．エレガンス（Ｎ２）からゲノムＤＮＡを調製した（ＳｕｌｓｔｏｎおよびＨｏｄｇｋｉｎ，１９８０年）。
Ｆｉｒｅ等（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４８巻，１９章（Ｃ．ＭｅｌｌｏおよびＡ．Ｆｉｒｅ），アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ））に従って、Ｃ．エレガンスベクターｐＰＤ４９．２６、および、ｐＰＤ９５．７５を用いた。
実施例１：ｓｏｄ−３プロモーターの単離
ｓｏｄ−３遺伝子の調節配列を単離するために、開始コドンの１２６６ｂｐ上流を、野生型Ｃ．エレガンス（Ｎ２，Ｂｒｉｓｔｏｌ，Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ，２５０ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ，ミネソタ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ），１４４５ゴートナーアベニュー，セントポール，ミネソタ州５５１０８−１０９５，米国）のゲノムＤＮＡから、上流プライマーｓｏｄ−５Ｕ（配列番号２）と、下流プライマーｓｏｄ−３Ｕ（配列番号３）とを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し、３’ＢａｍＨＩ制限部位をＰＣＲ産物に付加した。用いられたオリゴヌクレオチドプライマーは以下の通りである：
フォワードｓｏｄ−５Ｕ：５’−ａｇｔｔｔｔａａａｇａｔｔｔｔａｔｔｃａｔａｇｔｃｃ−３’（配列番号２）；
リバースｓｏｄ−３Ｄ：５’−ｇｇａｔｃｃｔｔｔａｔｔｃａｃｔｇａａａａｔｔａｇａａｇａｔｔ−３’（配列番号３）。
それに続いて、得られた１２６６ｂｐのＰＣＲ産物の同定を配列解析によって確認した。ｐＰＤ４９．２６主鎖に、ａ）ｓｏｄ−３プロモーターの１０９８ｂｐのＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとのフラグメント、および、ｂ）ｐＰＤ９５．７５（ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩのフランキング制限部位を含む）から増幅した、ＧＦＰのＰＣＲフラグメントをクローニングすることによって、ＧＦＰ発現ベクターをアセンブルした。
得られたｓｏｄ−３：：ＧＦＰ融合体を含むＣ．エレガンス発現ベクターを、ｐＭＧＣ２−２４と命名した。
ｓｏｄ−３遺伝子の調節配列を単離するために、開始コドンの１２６６ｂｐ上流を、野生型Ｃ．エレガンス（Ｎ２，Ｂｒｉｓｔｏｌ，Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ，２５０ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ，ミネソタ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ），１４４５ゴートナーアベニュー，セントポール，ミネソタ州５５１０８−１０９５，米国）のゲノムＤＮＡから、上流プライマーｓｏｄ−５Ｕ（配列番号２）と、下流プライマーｓｏｄ−３Ｕ（配列番号３）とを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し、３’ＢａｍＨＩ制限部位をＰＣＲ産物に付加した。用いられたオリゴヌクレオチドプライマーは以下の通りである：
フォワードｓｏｄ−５Ｕ：５’−ａｇｔｔｔｔａａａｇａｔｔｔｔａｔｔｃａｔａｇｔｃｃ−３’（配列番号２）；
リバースｓｏｄ−３Ｄ：５’−ｇｇａｔｃｃｔｔｔａｔｔｃａｃｔｇａａａａｔｔａｇａａｇａｔｔ−３’（配列番号３）。
それに続いて、得られた１２６６ｂｐのＰＣＲ産物の同定を配列解析によって確認した。ｐＰＤ４９．２６主鎖に、ａ）ｓｏｄ−３プロモーターの１０９８ｂｐのＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとのフラグメント、および、ｂ）ｐＰＤ９５．７５（ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩのフランキング制限部位を含む）から増幅した、ＧＦＰのＰＣＲフラグメントをクローニングすることによって、ＧＦＰ発現ベクターをアセンブルした。
得られたｓｏｄ−３：：ＧＦＰ融合体を含むＣ．エレガンス発現ベクターを、ｐＭＧＣ２−２４と命名した。
実施例２：トランスジェニックＣ．エレガンス
ｄａｆ−２（ｅ１３６８）動物およびトランスジェニック動物を標準的な手順に従って得た（ＭｅｌｌｏおよびＦｉｒｅ，１９９５年）。ＭｅｌｌｏおよびＦｉｒｅの方法とは異なり、プラスミドｐＭＧＣ２−２４を、インジェクションマーカーｔｔｘ−３：：ＧＦＰと共に、前記動物の性腺に注入した。３種の独立した系がＧＦＰ陽性動物の単離によって単離された。
ｄａｆ−２（ｅ１３６８）動物およびトランスジェニック動物を標準的な手順に従って得た（ＭｅｌｌｏおよびＦｉｒｅ，１９９５年）。ＭｅｌｌｏおよびＦｉｒｅの方法とは異なり、プラスミドｐＭＧＣ２−２４を、インジェクションマーカーｔｔｘ−３：：ＧＦＰと共に、前記動物の性腺に注入した。３種の独立した系がＧＦＰ陽性動物の単離によって単離された。
実施例３：ＤＡＦ−２／インスリン受容体経路に特異的な読み出し
様々な温度でｄａｆ−２（ｅ１３６８）動物におけるｓｏｄ−３：：ＧＦＰの発現を比較することによって、ｓｏｄ−３プロモーターの調節が実証された。ｄａｆ−２（ｅ１３６８）系統は、ＤＡＦ−２／ＩＲのリガンド結合ドメインにおける温度感受性の突然変異を含み、２５℃でＤＡＦ−２の不活性化を起こす。許容できる温度（１５℃）で４日間Ｌ１幼虫を成長させた際、成虫動物の尾、頭部および陰門においてＧＦＰの弱い発現を検出することができた。ＧＦＰの全体的な発現は極めて低かった。これは、２５℃の制限的な温度でＬ１幼虫を成長させると、ＤＡＦ−２の不活性化を伴って劇的に変化した。これらの条件下で、Ｃ．エレガンスは、耐性幼虫で停止し、ＧＦＰ蛍光は、全動物で強くアップレギュレートされた。ｄａｆ−１６遺伝子にさらなる欠失を有するｄａｆ−２（ｅ１３６８）系では、ｓｏｄ−３：：ＧＦＰのアップレギュレーションはなくなった。同様に、これらの実験条件下で、正常なＤＡＦ−２／ＩＲ機能を有する野生型Ｎ２の幼虫を２５℃で維持すると、耐性幼虫を形成しなかっただけでなく、ｓｏｄ−３発現の増加に応答もしなかった。
それゆえに、ｓｏｄ−３：：ＧＦＰ発現の調節は、２５℃でのｄａｆ−２（ｅ１３６８）系におけるＤＡＦ−２／ＩＲ経路の不活性化と関連していた。このデータは、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路が、転写因子ＤＡＦ−１６を阻害するように作用し、別な方法でｓｏｄ−３遺伝子の転写を活性化するモデルと一致している。それゆえに、上記レポーターは、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路がスイッチオフされると活性化され、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路がスイッチオンされると不活性化される。
様々な温度でｄａｆ−２（ｅ１３６８）動物におけるｓｏｄ−３：：ＧＦＰの発現を比較することによって、ｓｏｄ−３プロモーターの調節が実証された。ｄａｆ−２（ｅ１３６８）系統は、ＤＡＦ−２／ＩＲのリガンド結合ドメインにおける温度感受性の突然変異を含み、２５℃でＤＡＦ−２の不活性化を起こす。許容できる温度（１５℃）で４日間Ｌ１幼虫を成長させた際、成虫動物の尾、頭部および陰門においてＧＦＰの弱い発現を検出することができた。ＧＦＰの全体的な発現は極めて低かった。これは、２５℃の制限的な温度でＬ１幼虫を成長させると、ＤＡＦ−２の不活性化を伴って劇的に変化した。これらの条件下で、Ｃ．エレガンスは、耐性幼虫で停止し、ＧＦＰ蛍光は、全動物で強くアップレギュレートされた。ｄａｆ−１６遺伝子にさらなる欠失を有するｄａｆ−２（ｅ１３６８）系では、ｓｏｄ−３：：ＧＦＰのアップレギュレーションはなくなった。同様に、これらの実験条件下で、正常なＤＡＦ−２／ＩＲ機能を有する野生型Ｎ２の幼虫を２５℃で維持すると、耐性幼虫を形成しなかっただけでなく、ｓｏｄ−３発現の増加に応答もしなかった。
それゆえに、ｓｏｄ−３：：ＧＦＰ発現の調節は、２５℃でのｄａｆ−２（ｅ１３６８）系におけるＤＡＦ−２／ＩＲ経路の不活性化と関連していた。このデータは、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路が、転写因子ＤＡＦ−１６を阻害するように作用し、別な方法でｓｏｄ−３遺伝子の転写を活性化するモデルと一致している。それゆえに、上記レポーターは、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路がスイッチオフされると活性化され、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路がスイッチオンされると不活性化される。
実施例４：ｓｏｄ−３：：ＧＦＰレポーターは、発達段階とは無関係に調節される
ｓｏｄ−３：：ＧＦＰレポーターを含むｄａｆ−２（ｅ１３６８）動物を、成虫への発達を終えるまで１５℃に維持し、続いて、２５℃（制限的な温度）で成虫に変化させ、ＤＡＦ−２／ＩＲを不活性化した。耐性幼虫で観察されるように、制限的な温度に晒された成虫もまた、許容できる温度（１５℃）で維持された動物に比べてさらに多くのＧＦＰを示した。比重走査により、ＧＦＰの平均が、２．６±１．７（許容できる温度）から、５３．５±１４．６（制限的な温度）へ増加したことが明らかになった。成虫におけるＧＦＰ発現の増加の規模は、２５℃で即座に変化して耐性幼虫になるＬ１で観察される増加の規模と同じオーダーである（平均ＧＦＰ：８７．８±３５．３）。この結果により、ｓｏｄ−３プロモーターの調節は、Ｃ．エレガンスの発達段階とは無関係であること、および、ｄａｆ−２／ＩＲ遺伝子の不活性化の結果としてｓｏｄ−３プロモーターのアップレギュレーションがあらゆる時点で誘導され得ることがが示される。その結果として、成虫Ｃ．エレガンスを用いたスクリーニングにｓｏｄ−３Ｃ．エレガンス系を用いることができ、従って、化合物が線虫の発達を妨害することを防ぐことができる。加えて、本分析は発達プログラムの完了に無関係であるため、インキュベート時間を短くすることができる。
ｓｏｄ−３：：ＧＦＰレポーターを含むｄａｆ−２（ｅ１３６８）動物を、成虫への発達を終えるまで１５℃に維持し、続いて、２５℃（制限的な温度）で成虫に変化させ、ＤＡＦ−２／ＩＲを不活性化した。耐性幼虫で観察されるように、制限的な温度に晒された成虫もまた、許容できる温度（１５℃）で維持された動物に比べてさらに多くのＧＦＰを示した。比重走査により、ＧＦＰの平均が、２．６±１．７（許容できる温度）から、５３．５±１４．６（制限的な温度）へ増加したことが明らかになった。成虫におけるＧＦＰ発現の増加の規模は、２５℃で即座に変化して耐性幼虫になるＬ１で観察される増加の規模と同じオーダーである（平均ＧＦＰ：８７．８±３５．３）。この結果により、ｓｏｄ−３プロモーターの調節は、Ｃ．エレガンスの発達段階とは無関係であること、および、ｄａｆ−２／ＩＲ遺伝子の不活性化の結果としてｓｏｄ−３プロモーターのアップレギュレーションがあらゆる時点で誘導され得ることがが示される。その結果として、成虫Ｃ．エレガンスを用いたスクリーニングにｓｏｄ−３Ｃ．エレガンス系を用いることができ、従って、化合物が線虫の発達を妨害することを防ぐことができる。加えて、本分析は発達プログラムの完了に無関係であるため、インキュベート時間を短くすることができる。
配列番号１（ｓｏｄ−３プロモーター（ＤＳＭＺプラスミドｐＭＧＣ２−２４のＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩとのフラグメント））。配列は、制限部位ＨｉｎｄＩＩＩで始まり、制限部位ＢａｍＨＩで終わっている：
文献：
T. Furuyama, T.Nakazawa, I. Nakano, and N. Mori. Identification of the differential distribution patterns of mRNAs and consensus binding sequences for mouse DAF-16 homologues. Biochem. J. 349 (Pt 2): 629-634,2000.
D. Gems, A. J. Sutton, M. L. Sundermeyer, P. S. Albert, K. V. King, M. L.Edgley, P. L. Larsen, and D. L. Riddle. Two pleiotropic classes of DAF-2 mutation affect larval arrest, adult behavior, reproduction and longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics 150 (1): 129-155,1998.
S. Gottlieb and G. Ruvkun. DAF-2,DAF-16 and DAF-23: genetically interacting genes controlling Dauer formation in Caenorhabditis elegans. Genetics 137 (1): 107-120, 1994.
S. J. Hill, J. G. Baker, and S. Rees. Reporter-gene systems for the study of G-protein- coupled receptors. Curr. Opin. Pharmacol. 1 (5): 526-532,2001.
Y. Honda and S. Honda. The DAF-2 gene network for longevity regulates oxidative stress resistance and Mn-superoxide dismutase gene expression in Caenorhabditis elegans. FASEB J. 13 (11): 1385-1393,1999.
K. H. Kaestner, W.Knochel, and D. E. Martinez. Unified nomenclature for the winged helix/forkhead transcription factors. Genes Dev. 14 (2): 142-146,2000.
C. Mello and A. Fire in“Caenorhabditis elegans, Modern Biological Analysis of
an Organism”(ed. H. F. Epstein and D. C. Shakes), pp 451-482, Methods in Cell Biology, Vol. 48,1995 Academic Press.
D. L. Riddle. A genetic pathway for dauer larva formation in Caenorhabditis elegans.
Stadler Genetics Symposium 9: 101-120, 1977.
D. L. Riddle, M. M. Swanson, and P. S. Albert. Interacting genes in nematode dauer larva formation. Nature 290 (5808): 668-671,1981.
D. L. Riddle, in“The Nematode Caenorhabditis elegans”. (ed. W. B. Wood), pp 393- 412,1988 Cold Spring Harbor Laboratory.
D. L. Riddle and Albert, in“C.elegans 11”(ed. D. L. Riddle, T. Blumenthal, B. J. Meyer, J. R. Priess), pp. 739-768,1997 Cold Spring Harbor Laboratory.
J. Sulston and J. Hodgkin in“The Nematode Caenorhabditiselegans”. (ed. W. B. Wood), pp 604-605,1988 Cold Spring Harbor Laboratory.
T. Furuyama, T.Nakazawa, I. Nakano, and N. Mori. Identification of the differential distribution patterns of mRNAs and consensus binding sequences for mouse DAF-16 homologues. Biochem. J. 349 (Pt 2): 629-634,2000.
D. Gems, A. J. Sutton, M. L. Sundermeyer, P. S. Albert, K. V. King, M. L.Edgley, P. L. Larsen, and D. L. Riddle. Two pleiotropic classes of DAF-2 mutation affect larval arrest, adult behavior, reproduction and longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics 150 (1): 129-155,1998.
S. Gottlieb and G. Ruvkun. DAF-2,DAF-16 and DAF-23: genetically interacting genes controlling Dauer formation in Caenorhabditis elegans. Genetics 137 (1): 107-120, 1994.
S. J. Hill, J. G. Baker, and S. Rees. Reporter-gene systems for the study of G-protein- coupled receptors. Curr. Opin. Pharmacol. 1 (5): 526-532,2001.
Y. Honda and S. Honda. The DAF-2 gene network for longevity regulates oxidative stress resistance and Mn-superoxide dismutase gene expression in Caenorhabditis elegans. FASEB J. 13 (11): 1385-1393,1999.
K. H. Kaestner, W.Knochel, and D. E. Martinez. Unified nomenclature for the winged helix/forkhead transcription factors. Genes Dev. 14 (2): 142-146,2000.
C. Mello and A. Fire in“Caenorhabditis elegans, Modern Biological Analysis of
an Organism”(ed. H. F. Epstein and D. C. Shakes), pp 451-482, Methods in Cell Biology, Vol. 48,1995 Academic Press.
D. L. Riddle. A genetic pathway for dauer larva formation in Caenorhabditis elegans.
Stadler Genetics Symposium 9: 101-120, 1977.
D. L. Riddle, M. M. Swanson, and P. S. Albert. Interacting genes in nematode dauer larva formation. Nature 290 (5808): 668-671,1981.
D. L. Riddle, in“The Nematode Caenorhabditis elegans”. (ed. W. B. Wood), pp 393- 412,1988 Cold Spring Harbor Laboratory.
D. L. Riddle and Albert, in“C.elegans 11”(ed. D. L. Riddle, T. Blumenthal, B. J. Meyer, J. R. Priess), pp. 739-768,1997 Cold Spring Harbor Laboratory.
J. Sulston and J. Hodgkin in“The Nematode Caenorhabditiselegans”. (ed. W. B. Wood), pp 604-605,1988 Cold Spring Harbor Laboratory.
Claims (1)
- ＤＡＦ−２／ＩＲ経路、ＡＫＴ経路のモジュレーター、キナーゼのリン酸化、ホスファターゼの脱リン酸化、および／または、１またはそれ以上のＦＯＸＯ活性を変更するその他の酵素活性のモジュレーターを同定する方法であって：
（ａ）ＤＡＦ−２／ＩＲ経路を不活化した成虫のｄａｆ−２（ｅ１３６８）系統のトランスジェニックＣ．エレガンスと、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路、ＡＫＴ経路、キナーゼのリン酸化、ホスファターゼの脱リン酸化、および／または、１またはそれ以上のＦＯＸＯ活性を変更するその他の酵素活性を調節する能力に関して試験しようとする１またはそれ以上の化合物とを接触させること（該トランスジェニックＣ．エレガンスは、
（ｉ）プロモーターの核酸配列が、
（1）配列番号１の核酸配列を含む核酸配列；
（2）（1）に記載の核酸配列と９０％またはそれ以上の配列同一性を有する、ｓｏｄ−３プロモーター活性を有し、そして少なくとも１つのフォークヘッド型転写因子の結合部位を含む核酸配列；および、
（3）（1）または（2）に記載の核酸配列の、ｓｏｄ−３プロモーター活性を有し、そして少なくとも１つのフォークヘッド型転写因子の結合部位を含むフラグメント、
からなる群より選択される、ｓｏｄ−３プロモーターの生物学的活性を示すプロモーター、
ならびに、
（ii）レポーター遺伝子の活性を付与する核酸配列
を含む核酸分子、を含む）；
（ｂ）試験しようとする１またはそれ以上の化合物の非存在下および存在下で、場合により１またはそれ以上の適切な参照化合物の存在下で、レポーター遺伝子活性を測定すること；
（ｃ）工程（ｂ）のレポーター遺伝子活性を比較すること；および、
（ｄ）調節化合物を選択すること、
を含む、上記方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10303850A DE10303850A1 (de) | 2003-01-30 | 2003-01-30 | Screening-Assay auf Basis des Forkhead-Transkriptionsfaktor-abhängigen sod-3-Promotors zur Identifizierung von AKT modulierenden Verbindungen oder von stromaufwärts liegenden Regulatoren, wie etwa Insulin/IGF1-Rezeptoren |
| DE10303850.7 | 2003-01-30 | ||
| PCT/EP2004/000273 WO2004067773A1 (en) | 2003-01-30 | 2004-01-16 | Screening assay based on rhe sod-3 promotor for the identification of compounds modulating akt or upstream regulators such as insulin/igf-1 receptors |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011254582A Division JP5380518B2 (ja) | 2003-01-30 | 2011-11-22 | インスリン／ＩＧＦ−１受容体のようなＡＫＴを調節する化合物または上流調節因子を同定するための、ＲＨＥｓｏｄ−３プロモーターに基づくスクリーニング分析 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006516395A JP2006516395A (ja) | 2006-07-06 |
| JP4909067B2 true JP4909067B2 (ja) | 2012-04-04 |
Family
ID=32695098
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006501551A Expired - Fee Related JP4909067B2 (ja) | 2003-01-30 | 2004-01-16 | インスリン／ＩＧＦ−１受容体のようなＡＫＴを調節する化合物または上流調節因子を同定するための、ＲＨＥｓｏｄ−３プロモーターに基づくスクリーニング分析 |
| JP2011254582A Expired - Fee Related JP5380518B2 (ja) | 2003-01-30 | 2011-11-22 | インスリン／ＩＧＦ−１受容体のようなＡＫＴを調節する化合物または上流調節因子を同定するための、ＲＨＥｓｏｄ−３プロモーターに基づくスクリーニング分析 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011254582A Expired - Fee Related JP5380518B2 (ja) | 2003-01-30 | 2011-11-22 | インスリン／ＩＧＦ−１受容体のようなＡＫＴを調節する化合物または上流調節因子を同定するための、ＲＨＥｓｏｄ−３プロモーターに基づくスクリーニング分析 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20060055273A1 (ja) |
| EP (1) | EP1590481A1 (ja) |
| JP (2) | JP4909067B2 (ja) |
| DE (1) | DE10303850A1 (ja) |
| WO (1) | WO2004067773A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102004045432A1 (de) * | 2004-09-18 | 2006-04-13 | Zf Friedrichshafen Ag | Stelleinrichtung für ein Stell- oder Schaltelement |
| US8860278B2 (en) * | 2007-07-27 | 2014-10-14 | GM Global Technology Operations LLC | Stator assembly for belt alternator starter motor generator for hybrid vehicles |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5885803A (en) * | 1997-06-19 | 1999-03-23 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Disease associated protein kinases |
| DE19819889A1 (de) * | 1998-05-04 | 1999-11-11 | Fraunhofer Ges Forschung | Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren |
| HUP0102123A2 (hu) * | 1998-05-04 | 2001-10-28 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Eljárás és berendezés nukleinsavak izolálására |
| AU7353700A (en) * | 1999-09-07 | 2001-04-10 | Neurogenetics, Inc. | Therapies and reagents for increasing stress resistance and life span |
| GB0014009D0 (en) * | 2000-06-08 | 2000-08-02 | Devgen Nv | Compound screens relating to insulin deficiency or insulin resistance |
| EP1406489A4 (en) * | 2001-06-22 | 2005-08-24 | Univ California | EUCARYOTIC GENES INVOLVED IN THE REGULATION OF THE ADULT LIVES OF EUKARYOTES |
-
2003
- 2003-01-30 DE DE10303850A patent/DE10303850A1/de not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-01-16 EP EP04702656A patent/EP1590481A1/en not_active Ceased
- 2004-01-16 WO PCT/EP2004/000273 patent/WO2004067773A1/en active Application Filing
- 2004-01-16 JP JP2006501551A patent/JP4909067B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-06-14 US US10/542,806 patent/US20060055273A1/en not_active Abandoned
-
2011
- 2011-11-22 JP JP2011254582A patent/JP5380518B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20060055273A1 (en) | 2006-03-16 |
| DE10303850A1 (de) | 2004-08-12 |
| WO2004067773A1 (en) | 2004-08-12 |
| EP1590481A1 (en) | 2005-11-02 |
| JP2012061003A (ja) | 2012-03-29 |
| JP2006516395A (ja) | 2006-07-06 |
| JP5380518B2 (ja) | 2014-01-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Menzel et al. | A systematic gene expression screen of Caenorhabditis elegans cytochrome P450 genes reveals CYP35 as strongly xenobiotic inducible | |
| Wittkopp et al. | Evolution of yellow gene regulation and pigmentation in Drosophila | |
| Podos et al. | The DSmurf ubiquitin-protein ligase restricts BMP signaling spatially and temporally during Drosophila embryogenesis | |
| Hombría et al. | Characterisation of Upd2, a Drosophila JAK/STAT pathway ligand | |
| Sluss et al. | A JNK signal transduction pathway that mediates morphogenesis and an immune response in Drosophila. | |
| Wang et al. | A two‐component histidine kinase gene that functions in Dictyostelium development. | |
| Kimura et al. | A CaMK cascade activates CRE-mediated transcription in neurons of Caenorhabditis elegans | |
| Roman et al. | kurtz, a novel nonvisual arrestin, is an essential neural gene in Drosophila | |
| Noh et al. | Expression of an evolutionarily distinct novel BiP gene during the unfolded protein response in Arabidopsis thaliana | |
| Ciapponi et al. | Drosophila Fos mediates ERK and JNK signals via distinct phosphorylation sites | |
| Peng et al. | A direct docking mechanism for a plant GSK3-like kinase to phosphorylate its substrates | |
| Dearolf | JAKs and STATs in invertebrate model organisms | |
| US10221422B2 (en) | Blue light-inducible system for gene expression | |
| Moghal et al. | A component of the transcriptional mediator complex inhibits RAS-dependent vulval fate specification in C. elegans | |
| Hong et al. | BLISTER-regulated vegetative growth is dependent on the protein kinase domain of ER stress modulator IRE1A in Arabidopsis thaliana | |
| Timmons et al. | Role of AWD/nucleoside diphosphate kinase in Drosophila development | |
| Therond et al. | Molecular organisation and expression pattern of the segment polarity gene fused of Drosophila melanogaster | |
| JP5380518B2 (ja) | インスリン／ＩＧＦ−１受容体のようなＡＫＴを調節する化合物または上流調節因子を同定するための、ＲＨＥｓｏｄ−３プロモーターに基づくスクリーニング分析 | |
| Kupsco et al. | Genetic and biochemical characterization of Drosophila Snipper: a promiscuous member of the metazoan 3′ hExo/ERI-1 family of 3′ to 5′ exonucleases | |
| Singh et al. | Cloning and characterization of a new theta-class glutathione-S-transferase (GST) gene, gst-3, from Drosophila melanogaster | |
| Morgan et al. | Two novel transmembrane protein tyrosine kinases expressed during Caenorhabditis elegans hypodermal development | |
| Rollmann et al. | Pinocchio, a novel protein expressed in the antenna, contributes to olfactory behavior in Drosophila melanogaster | |
| Hwa et al. | Germ-line specific variants of components of the mitochondrial outer membrane import machinery in Drosophila | |
| US7435868B2 (en) | Screening assay based on the forkhead transcription factor-dependent sod-3 promoter | |
| Lidsky et al. | Monitoring integrated stress response in live Drosophila |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070110 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091110 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100209 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110104 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110428 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20110513 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110830 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111122 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20111220 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120113 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150120 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |