JP4900943B2 - Modified double-stranded RNA with excellent nuclease resistance and RNA interference effect - Google Patents
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本発明は、標的遺伝子の発現を効果的に抑制できる修飾型RNAに関する。より具体的には、本発明は、23塩基からなるセンス鎖RNA(標的遺伝子中の標的配列に相補的な配列)及び該センス鎖RNAに相補的な21又は23塩基からなるアンチセンス鎖RNAを有する二本鎖RNAであって、ヌクレアーゼ耐性が高く、優れたRNA干渉効果を奏することができる修飾型RNAに関する。 The present invention relates to a modified RNA that can effectively suppress the expression of a target gene. More specifically, the present invention relates to a sense strand RNA consisting of 23 bases (a sequence complementary to the target sequence in the target gene) and an antisense strand RNA consisting of 21 or 23 bases complementary to the sense strand RNA. The present invention relates to a modified RNA which has a high nuclease resistance and can exhibit an excellent RNA interference effect.
ガンやエイズなどの難病を効率的に治療する医薬の開発は、ライフサイエンス分野における大きな一つの課題である。この課題を克服できる可能性がある有力な方法の一つとして、特定の遺伝子にのみ作用する遺伝子医薬がある。この遺伝子医薬の中でも特に最近21塩基の短い2本鎖RNA (small interfering RNA:siRNA )を利用するRNA干渉(RNA interference:RNAi)法 が注目されている。このRNAi法は、1998年にFireらにより初めて報告された(非特許文献1参照)。Fireらの報告によると、機能阻害したい遺伝子の特定領域と相同な100塩基対程度の2本鎖RNAを細胞内へ導入させることにより、細胞質内でDicerの働きにより20〜25塩基対程度の2本鎖RNAへと分解され、その後複数のタンパク質とRNA/タンパク質複合体を形成し(この複合体をRICS:RNA-induced silencing complexと呼ぶ)、標的遺伝子から産出されたmRNAの相同部位と結合し強力に遺伝子発現を抑制するというものである。しかしながら哺乳細胞では、約30塩基対以上の長い2本鎖RNAを導入させると、ウィルス応答反応であるインターフェロン反応が誘導され結果的に細胞が死んでしまうという現象が報告され、哺乳動物細胞系ではRNAi法は適用し難いと考えられた。そこでTuschlらは、3’末端にダングリングエンドをもつ21塩基長の2本鎖RNAを化学的に合成し、哺乳動物細胞へ直接導入させることにより、インターフェロン応答を回避し配列特異的に高い遺伝子発現抑制能を示すことを報告した(非特許文献2参照)。また彼らは、2本鎖領域が19塩基対で、3’末端又は5’末端に様々な長さのダングリングエンド鎖をもつ短い2本鎖RNAを合成しRNA干渉効果を検討した。その結果、3’末端に2塩基のダングリングエンドをもつ21塩基長のsiRNAは非常に高いRNA干渉効果が観測されたが、それ以外のあらゆるタイプの短い2 本鎖RNAにおいては顕著なRNA干渉効果が観測されなかった。この報告により、今日では21塩基長であり、3’末端に2塩基のダングリングエンドをもつ2本鎖RNAを用いたRNA干渉法が一般的となっている。ここでは21塩基長の短い2本鎖RNAを用いて標的遺伝子発現を阻害する方法を、RNAi法と区別してsiRNA法を呼ぶ。 The development of a medicine that efficiently treats intractable diseases such as cancer and AIDS is a major issue in the life science field. One of the promising methods that can overcome this problem is a gene drug that acts only on a specific gene. Among these gene medicines, the RNA interference (RNAi) method using a short double-stranded RNA (siRNA) of 21 bases has recently attracted attention. This RNAi method was first reported by Fire et al. In 1998 (see Non-Patent Document 1). According to the report of Fire et al., By introducing a double-stranded RNA of about 100 base pairs homologous to a specific region of the gene whose function is to be inhibited into the cell, 2 to about 20-25 base pairs by the action of Dicer in the cytoplasm. It is decomposed into single-stranded RNA, and then forms multiple RNA / protein complexes with this protein (this complex is called RICS: RNA-induced silencing complex) and binds to the homologous site of mRNA produced from the target gene. It strongly suppresses gene expression. However, in mammalian cells, when a long double-stranded RNA of about 30 base pairs or more is introduced, an interferon reaction, which is a viral response reaction, is induced, resulting in cell death. In mammalian cell systems, The RNAi method was considered difficult to apply. Therefore, Tuschl et al. Chemically synthesized a 21-base long double-stranded RNA with a dangling end at the 3 ′ end, and introduced it directly into mammalian cells, thereby avoiding the interferon response and having a high sequence-specific high gene. It was reported to show expression suppression ability (see Non-Patent Document 2). They also synthesize short double-stranded RNAs with double-stranded regions of 19 base pairs and various dangling end strands at the 3 'end or 5' end to examine the RNA interference effect. As a result, 21-base siRNA with 2 base dangling ends at the 3 'end showed a very high RNA interference effect, but with all other types of short double-stranded RNA, significant RNA interference was observed. No effect was observed. According to this report, an RNA interference method using a double-stranded RNA that is 21 bases long and has a dangling end of 2 bases at the 3 'end is now common. Here, the method of inhibiting target gene expression using a short double-stranded RNA having a length of 21 bases is referred to as the siRNA method in distinction from the RNAi method.
このsiRNA法は合成RNAを用いるのでサンプル調整も比較的容易であり、取り扱い操作も簡便で、かつ、非常に強力な効果を示す為、ライフサイエンス分野のみならずバイオビジネス分野においても大きな注目を浴びている。 Since this siRNA method uses synthetic RNA, sample preparation is relatively easy, the handling operation is simple, and it has a very powerful effect, so it attracts great attention not only in the life science field but also in the biobusiness field. ing.
しかしながら、この優れたsiRNA法にも解決しなければならない問題点がある。上記したようにsiRNAはRNA分子から構成されており、細胞内および倍地中に含まれるヌクレアーゼの働きにより速やかに分解される。また2本鎖RNA領域は1本鎖RNAに比べ比較的高いヌクレアーゼ耐性を示すが、19塩基対からなる2本鎖RNAは殆ど従来のRNA干渉効果を示さない。そのため合成siRNAは、標的遺伝子配列をもつ細胞への導入後、2日〜4日間程度までは高い遺伝子発現抑制効果を示すが、その後はRNA干渉効果が急激に弱まり、7日程度でRNA干渉効果が殆ど無くなると報告されている。 However, this excellent siRNA method also has a problem that must be solved. As described above, siRNA is composed of RNA molecules, and is rapidly degraded by the action of nucleases contained in cells and media. The double-stranded RNA region shows relatively high nuclease resistance compared to single-stranded RNA, but double-stranded RNA consisting of 19 base pairs hardly shows the conventional RNA interference effect. Therefore, synthetic siRNA shows a high gene expression suppression effect for about 2 days to 4 days after introduction into cells with the target gene sequence, but after that, the RNA interference effect declines sharply, and after about 7 days the RNA interference effect Has been reported to almost disappear.
最近、合成siRNAにおいて細胞導入性に優れ長時間高活性なRNA干渉効果を獲得するために、様々な化学修飾型siRNAが報告されている。例えば、エキソヌクレアーゼからの分解耐性を獲得する為に、siRNAの末端をアミノ基やチオール基、アベーシックなどに修飾したsiRNAが合成されている。しかしながら、末端を修飾した21塩基長のsiRNAのほとんどの場合で、RNA干渉効果が著しく減少すると既に報告されている。 Recently, various chemically modified siRNAs have been reported in order to obtain a long-term and highly active RNA interference effect in synthetic siRNAs with excellent cell transduction properties. For example, in order to acquire degradation resistance from exonuclease, siRNA in which the end of siRNA is modified with an amino group, a thiol group, or basic is synthesized. However, it has already been reported that the RNA interference effect is significantly reduced in most cases of 21-base siRNA modified at the ends.
また、細胞導入性や組織選択性を持たせる為にコレステロールや長鎖アルキル、糖鎖、ペプチドなどをsiRNAの末端に修飾したものが報告されている。コレステロールや長鎖アルキルを修飾したsiRNAは、細胞導入性が向上するだけではなく、in vivoにおいて肝臓への蓄積が観測されている。また、糖鎖やペプチドを修飾したsiRNAにおいても細胞導入性の向上が観測されている。しかしながら、いずれの場合においても修飾されていないsiRNAに比べ、同程度又は低いRNA干渉効果を観測しており、また、ヌクレアーゼ耐性も獲得していない。 Moreover, in order to give cell introduction property and tissue selectivity, cholesterol, long-chain alkyl, sugar chain, peptide and the like modified at the end of siRNA have been reported. SiRNA modified with cholesterol and long alkyl chain has not only improved cell transferability but also has been observed to accumulate in the liver in vivo. In addition, an improvement in cell introduction property has been observed in siRNA modified with sugar chains and peptides. However, in any case, compared with siRNA not modified, the same or lower RNA interference effect was observed, and nuclease resistance was not acquired.
また、RNA干渉効果を奏する二本鎖RNAでは、末端にダングリングエンド(オーバーハング)を有する構造が一般的に採用されているが、末端にダングリングエンドを有していない構造(即ち、平滑末端を有する構造)についても、RNA干渉効果の検討が行われている。しかしながら、センス鎖RNAの5’末端側を平滑末端にした構造では、センス鎖RNAの5’末端側にダングリングエンドがある場合に比して、RNA干渉効果が殆ど変わらない、或いはRNA干渉効果が低減することが示唆されている(非特許文献3参照)。 In addition, double-stranded RNA that exerts an RNA interference effect generally employs a structure having a dangling end (overhang) at the end, but does not have a dangling end at the end (that is, smooth) The RNA interference effect is also being studied for the structure having a terminal. However, in the structure where the 5 ′ end of the sense strand RNA is a blunt end, the RNA interference effect is almost the same as when the dangling end is on the 5 ′ end side of the sense strand RNA, or the RNA interference effect Is suggested to be reduced (see Non-Patent Document 3).
更に、RNA干渉効果を奏する二本鎖RNAに、機能性分子(タンパク質、ペプチド、コレステロール等)を結合させておくことにより、RNA干渉効果に加えて、当該機能性分子に基づく有用効果も奏されることが期待される。しかしながら、RNA干渉効果を奏する二本鎖RNAに、単に機能性分子を結合させると、RNA干渉効果の顕著な減弱化を招くことが分かっており、従来技術では、優れたRNA干渉効果と機能性分子に基づく有用効果とを兼ね備えた機能性分子修飾型RNAを構築できていないのが現状である。 Furthermore, by combining functional molecules (protein, peptide, cholesterol, etc.) with double-stranded RNA that exhibits RNA interference effects, in addition to RNA interference effects, useful effects based on the functional molecules are also exhibited. It is expected that However, it has been found that simply binding a functional molecule to a double-stranded RNA that exerts an RNA interference effect leads to a significant attenuation of the RNA interference effect. The present situation is that functional molecule-modified RNA having useful effects based on molecules has not been constructed.
以上のように、従来技術では、RNA干渉効果を奏する二本鎖RNAに関して、優れたヌクレアーゼ耐性及びRNA干渉効果を備えさせるには、如何なる塩基長のRNA、如何なる構造のRNAを採用すればよいかについては解明されていないのが現状である。
本発明は、ヌクレアーゼ耐性が高く、優れたRNA干渉効果を奏することができる新規な二本鎖RNAを提供することを目的とする。更に、本発明は、優れたRNA干渉効果と機能性分子に基づく有用効果とを兼ね備えた機能性分子修飾型二本鎖RNAを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a novel double-stranded RNA that has high nuclease resistance and can exhibit an excellent RNA interference effect. Furthermore, an object of the present invention is to provide a functional molecule-modified double-stranded RNA having both an excellent RNA interference effect and a useful effect based on a functional molecule.
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねたところ、標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列を含むセンス鎖RNA、及び該センス鎖RNAに相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖RNAを有し、標的遺伝子の発現を抑制できる二本鎖RNAにおいて、下記(i)〜(iii)の特徴を全て具備させることによって、ヌクレアーゼ耐性が高く、一層優れたRNA干渉効果を奏するRNAを獲得できることを見出した。
(i)前記センス鎖RNAが23個のヌクレオチドからなり、前記アンチセンス鎖RNAが21又は23個のヌクレオチドからなる。
(ii)前記センス鎖RNAの5’末端側を平滑末端にする。
(iii)前記センス鎖RNAの5’末端側から1〜6番目のヌクレオチドの少なくとも1つに対してのみ置換基が結合している。
The inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above-mentioned problems. As a result, the present inventors include a sense strand RNA containing a base sequence complementary to the target sequence in the target gene, and a base sequence complementary to the sense strand RNA. In double-stranded RNA that has antisense strand RNA and can suppress the expression of the target gene, by providing all the features of (i) to (iii) below, it has high nuclease resistance and further excellent RNA interference effect It was found that the RNA to be played can be acquired.
(i) The sense strand RNA consists of 23 nucleotides, and the antisense strand RNA consists of 21 or 23 nucleotides.
(ii) The 5 ′ end of the sense strand RNA is blunt ended.
(iii) A substituent is bonded only to at least one of the first to sixth nucleotides from the 5 ′ end side of the sense strand RNA.
本発明は、かかる知見に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。即ち、本発明は、下記に掲げる修飾型RNAを提供する。
項1. 標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列からなるセンス鎖RNA、及び該センス鎖RNAに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖RNAを有し、且つ前記標的遺伝子の発現を抑制できる二本鎖RNAであって、
前記センス鎖RNAが23個のヌクレオチドからなり、前記アンチセンス鎖RNAが21又は23個のヌクレオチドからなり、
前記センス鎖RNAの5’末端側が平滑末端であり、
且つ前記センス鎖RNAの5’末端側から1〜6番目のヌクレオチドの少なくとも1つに対してのみ置換基が結合していることを特徴とする、修飾型RNA。
項2. 前記センス鎖RNAの5’末端側から1〜4番目のヌクレオチドに、少なくとも1つの置換基が結合している、項1に記載の修飾型RNA。
項3. 前記センス鎖RNAの5’末端側から1番目のヌクレオチドにのみ1つの置換基が結合している、項1に記載の修飾型RNA。
項4. 前記置換基が、アミノアルキル基である、項1乃至3のいずれかに記載の修飾型RNA。
項5. 前記置換基が、炭素数1〜40のアミノアルキル基である、項1乃至3のいずれかに記載の修飾型RNA。
The present invention has been completed by making further improvements based on such findings. That is, the present invention provides the following modified RNAs.
The sense strand RNA consists of 23 nucleotides, and the antisense strand RNA consists of 21 or 23 nucleotides;
The 5 ′ end side of the sense strand RNA is a blunt end,
The modified RNA is characterized in that a substituent is bonded only to at least one of the first to sixth nucleotides from the 5 ′ end of the sense strand RNA.
Item 4. Item 4. The modified RNA according to any one of
本発明の修飾型RNAは、(i)センス鎖RNAが23個のヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖RNAが21又は23個のヌクレオチドからなる、(ii)前記センス鎖RNAの5’末端側を平滑末端にする、及び(iii)前記センス鎖RNAの5’末端側から1〜6番目のヌクレオチドの少なくとも1つに対してのみ置換基を結合させる、という3つの特徴を全て充足することによって、飛躍的にRNA干渉効果が向上している。 The modified RNA of the present invention comprises (i) a sense strand RNA consisting of 23 nucleotides, and an antisense strand RNA consisting of 21 or 23 nucleotides. (Ii) a smooth 5 ′ end side of the sense strand RNA By satisfying all the three features of the terminator and (iii) binding a substituent only to at least one of the first to sixth nucleotides from the 5 ′ end of the sense strand RNA In particular, the RNA interference effect is improved.
本発明の修飾型RNAは、23個のヌクレオチドから構成され、標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列であるセンス鎖RNAを含む。 The modified RNA of the present invention comprises a sense strand RNA that is composed of 23 nucleotides and is a base sequence complementary to the target sequence in the target gene.
ここで、標的遺伝子とは、RNA干渉効果によって遺伝子発現の抑制対象となる遺伝子である。本発明の修飾型RNAにおいて、標的対象遺伝子については、特に制限されず、該修飾型RNAの用途に基づいて適宜選択することができる。 Here, the target gene is a gene whose gene expression is to be suppressed by the RNA interference effect. In the modified RNA of the present invention, the target gene is not particularly limited, and can be appropriately selected based on the use of the modified RNA.
標的遺伝子中の標的配列については、RNA干渉効果によって遺伝子発現を抑制可能な配列である限り特に制限されず、公知の方法で、具体的には、NCBIのBLASTサーチ等を用いて適宜決定することができる。例えば、標的遺伝子のコード領域(ORF)の開始コドンから50〜100塩基下流のエキソン部分にある塩基"AA"に続く19〜30塩基からなる領域であって、GC含有量が50%前後の領域を標的配列とすればよい。このような標的配列に対する相補鎖を採用することで、優れたRNA干渉効果を獲得することが、当業界で経験的に明らかにされている。また、例えば、上記標的配列は、IDT社(Integrated DNA Technologies, INC)のマニュアル(Dicer Substrate RNAi Design)に従って設定することが出来る。また最近では、(i)アンチセンス鎖RNAの5’末端がA/Uペアであり、(ii)センス鎖RNAの5’末端がG/Cペアであり、(iii)アンチセンス鎖RNAの5’末端側に5つ程度のA/Uペアがあり、且つ(vi)2本鎖中に9つ以上のG/Cペアが無い2本鎖RNAを設計することで高いRNA干渉効果をもつ2本鎖RNAをデザインできると報告されている(Ui-Tei et. al, Nucleic Acids Res., 32, 936-948 (2004))。
The target sequence in the target gene is not particularly limited as long as it is a sequence capable of suppressing gene expression due to RNA interference effect, and is appropriately determined by a known method, specifically using NCBI BLAST search or the like. Can do. For example, a region consisting of 19 to 30 bases following the base “AA” in the
本発明の修飾型RNAにおけるセンス鎖RNAは、標的遺伝子中の上記標的配列に相補的な23個のヌクレオチドからなる塩基配列、即ち、上記標的配列に対する23塩基長の相補鎖である。なお、ここでいうセンス鎖RNAのヌクレオチド数は、標的遺伝子中の上記標的配列に相補的な塩基配列を構成するヌクレオチドの数を意味し、センス鎖RNAが置換基としてDNAやPNA等の核酸を有する場合には、これらの置換基を構成するヌクレオチドの数を含まない。 The sense strand RNA in the modified RNA of the present invention is a base sequence composed of 23 nucleotides complementary to the target sequence in the target gene, that is, a complementary strand having a length of 23 bases to the target sequence. Here, the number of nucleotides of the sense strand RNA means the number of nucleotides constituting a base sequence complementary to the target sequence in the target gene, and the sense strand RNA has a nucleic acid such as DNA or PNA as a substituent. In the case of having it, the number of nucleotides constituting these substituents is not included.
また、本発明の修飾型RNAの上記センス鎖RNAの5’末端側から1〜6番目の塩基の少なくとも1つに、置換基が結合している。一方、本発明の修飾型RNAにおいて、上記センス鎖RNAの5’末端側以外の部位には、置換基は結合していない。即ち、上記センス鎖RNAの5’末端側以外の部分、及び後述するアンチセンス鎖RNA部分は置換基によって置換されておらず、ヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのみから構成される。このように、上記センス鎖RNAの5’末端側にのみ置換基が結合していることによって、格段に優れたRNA干渉効果を発現させることが可能になる。 In addition, a substituent is bonded to at least one of the first to sixth bases from the 5 'end of the sense strand RNA of the modified RNA of the present invention. On the other hand, in the modified RNA of the present invention, no substituent is bonded to a site other than the 5 'end of the sense strand RNA. That is, the portion other than the 5 'end side of the sense strand RNA and the antisense strand RNA portion described later are not substituted with a substituent, and are composed only of nucleotides or deoxyribonucleotides. As described above, since the substituent is bonded only to the 5 'end side of the sense strand RNA, it is possible to express a significantly superior RNA interference effect.
ここで、置換基としては、特に制限されないが、その一例として、アミノ基;メルカプト基;ニトロ基;炭素数1〜40(好ましくは2〜20、更に好ましくは4〜12)のアルキル基;炭素数1〜40(好ましくは2〜20、更に好ましくは4〜12)のアミノアルキル基;炭素数1〜40(好ましくは2〜20、更に好ましくは4〜12)のチオアルキル基;炭素数1〜40(好ましくは2〜20、更に好ましくは4〜12)のアルコキシル基;炭素数1〜40(好ましくは2〜20、更に好ましくは4〜12)のアミノアルコキシル基;炭素数1〜40(好ましくは2〜20、更に好ましくは4〜12)のチオアルコキシル基;炭素数1〜40(好ましくは2〜20、更に好ましくは4〜12)のモノもしくはジアルキルアミノ基;炭素数1〜40(好ましくは2〜20、更に好ましくは4〜12)のアルキルチオ基;炭素数2〜40(好ましくは2〜20、更に好ましくは4〜12)のポリエチレンオキサイド基;炭素数3〜39(好ましくは3〜21、更に好ましくは3〜12)のポリプロピレンオキサイド基等を挙げることができる。これらの置換基を結合させることによって、RNA干渉効果を顕著に増強させることが可能になる。 Here, the substituent is not particularly limited, and examples thereof include an amino group; a mercapto group; a nitro group; an alkyl group having 1 to 40 carbon atoms (preferably 2 to 20, more preferably 4 to 12); carbon An aminoalkyl group having 1 to 40 (preferably 2 to 20, more preferably 4 to 12); a thioalkyl group having 1 to 40 (preferably 2 to 20, more preferably 4 to 12) carbon atoms; 40 (preferably 2-20, more preferably 4-12) alkoxyl group; 1-40 carbon atoms (preferably 2-20, more preferably 4-12) aminoalkoxyl groups; 1-40 carbon atoms (preferably Is a thioalkoxyl group having 2 to 20 and more preferably 4 to 12); a mono- or dialkylamino group having 1 to 40 carbon atoms (preferably 2 to 20, more preferably 4 to 12); An alkylthio group having 1 to 40 (preferably 2 to 20 and more preferably 4 to 12); a polyethylene oxide group having 2 to 40 (preferably 2 to 20 and more preferably 4 to 12) carbon atoms; 39 (preferably 3 to 21, more preferably 3 to 12) polypropylene oxide groups. By binding these substituents, the RNA interference effect can be remarkably enhanced.
更に、置換基は、上記のもの以外に、機能性分子を有する基であってもよい。このように、置換基が機能性分子を有する基である場合には、優れたRNA干渉効果と当該機能性分子に基づく有用効果を兼ね備えさせることができる。 Further, the substituent may be a group having a functional molecule other than those described above. Thus, when the substituent is a group having a functional molecule, it is possible to combine an excellent RNA interference effect and a useful effect based on the functional molecule.
ここで、機能性分子としては、糖、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、DNA、RNA(tRNAを含む)、アプタマー、修飾ヌクレオチド、低分子有機・無機材料、コレステロール、デンドリマー、脂質、高分子材料等が例示される。 Here, examples of functional molecules include sugars, proteins, peptides, amino acids, DNA, RNA (including tRNA), aptamers, modified nucleotides, low molecular organic / inorganic materials, cholesterol, dendrimers, lipids, polymer materials, etc. Is done.
上記糖としては、例えば、グルコース、ガラクトース、グルコサミン、ガラクトサミン等の単糖、これらを任意に組み合わせたオリゴ糖又は多糖等が挙げられる。 Examples of the sugar include monosaccharides such as glucose, galactose, glucosamine, and galactosamine, and oligosaccharides or polysaccharides in which these are arbitrarily combined.
上記タンパク質としては、生体内に存在するタンパク質、薬理作用を有するタンパク質、分子認識作用を有するタンパク質等を使用でき、該タンパク質の一例として、インポーチンbタンパク質、アビジン、抗体等を挙げることができる。 As said protein, the protein which exists in the living body, the protein which has a pharmacological action, the protein which has a molecule recognition effect etc. can be used, Importin b protein, avidin, an antibody etc. can be mentioned as an example of this protein.
上記DNAとしては、具体的には、塩基長が5〜50のDNA、好ましくは塩基長が5〜25のDNAが例示される。 Specific examples of the DNA include DNA having a base length of 5 to 50, preferably DNA having a base length of 5 to 25.
上記ペプチドとしては、例えば、R8、核局在化シグナルペプチド配列(HIV-1 TatやSV40T抗原等)、核外移行性シグナルペプチド(HIV-1 RevやMAPKK等)、細胞膜融合ペプチド等が挙げられる。 Examples of the peptide include R8, nuclear localization signal peptide sequences (such as HIV-1 Tat and SV40T antigen), nuclear export signal peptides (such as HIV-1 Rev and MAPKK), and cell membrane fusion peptides. .
上記修飾ヌクレオチドとしては、例えば、ホスホロチオエート型、ボラノフォスフェート型DNA/RNA等のリン酸骨格を修飾したもの;2’−0Me修飾RNA、2’−F修飾RNA等の2’修飾ヌクレオチド;LNA(Locked Nucleic Acid)やENA(2'-O,4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids)等のヌクレオチドの糖分子を架橋した修飾ヌクレオチド;PNA(ペプチド核酸)、モリフォリノヌクレオチド等の基本骨格が異なる修飾ヌクレオチドなどが挙げられる。 Examples of the modified nucleotide include those obtained by modifying a phosphate skeleton such as phosphorothioate-type or boranophosphate-type DNA / RNA; 2′-modified nucleotides such as 2′-0Me-modified RNA and 2′-F-modified RNA; LNA (Locked Nucleic Acid) and ENA (2'-O, 4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids), etc., modified nucleotides that are cross-linked sugar molecules; PNA (peptide nucleic acid), morpholino nucleotides, etc. Modified nucleotides and the like differing
上記低分子有機・無機材料としては、例えば、Cy3、Cy5等の蛍光物質;ビオチン;量子ドット;金微粒子等が挙げられる。 Examples of the low-molecular organic / inorganic material include fluorescent substances such as Cy3 and Cy5; biotin; quantum dots; gold fine particles.
上記デンドリマーとしては、例えば、ポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。 As said dendrimer, a polyamide amine dendrimer etc. are mentioned, for example.
上記脂質としては、例えば、リノール酸、DOPE(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)等が挙げられる。 Examples of the lipid include linoleic acid and DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine).
上記高分子材料としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン等が挙げられる。 Examples of the polymer material include polyethylene glycol and polyethyleneimine.
ここで、機能性分子を有する基としては、機能性分子の残基そのものであってもよく、また、下記一般式(I)に示す基、即ち機能性分子の残基に二官能性リンカーの一方の官能基が結合した基であってもよい。つまり、前者の場合、機能性分子が、上記センス鎖RNAの所定の部位に直接結合しており、後者の場合、機能性分子が二官能性リンカーを介して上記センス鎖RNAの所定の部位に結合している。機能性分子を有する基として、好ましくは、後者の下記一般式(I)に示す基である。 Here, the group having a functional molecule may be a residue of the functional molecule itself, or a group represented by the following general formula (I), that is, a functional molecule residue of a bifunctional linker. It may be a group to which one functional group is bonded. That is, in the former case, the functional molecule is directly bonded to a predetermined site of the sense strand RNA, and in the latter case, the functional molecule is attached to a predetermined site of the sense strand RNA via a bifunctional linker. Are connected. The group having a functional molecule is preferably the latter group represented by the following general formula (I).
ここで、二官能性リンカーとしては、官能基を2つ含むリンカーであれば特に制限されないが、例えば、N-スクシニミジル=3-(2-ピリジルジチオ)プロピナート、N-4-マレイミド酪酸、S-(2-ピリジルジチオ)システアミン、ヨードアセトキシスクシンイミド、N-(4-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド、N-[5-(3’-マレイミドプロピルアミド)−1−カルボキシペンチル]イミノジアセティクアシッド、N-(5-アミノペンチル)-イミノジアセテックアシッド等を使用できる。 Here, the bifunctional linker is not particularly limited as long as it includes two functional groups. For example, N-succinimidyl = 3- (2-pyridyldithio) propinate, N-4-maleimidobutyric acid, S- (2-pyridyldithio) cysteamine, iodoacetoxysuccinimide, N- (4-maleimidobutyryloxy) succinimide, N- [5- (3′-maleimidopropylamide) -1-carboxypentyl] iminodiacetic acid, N -(5-aminopentyl) -iminodiacetic acid etc. can be used.
上記のものの他に、上記二官能性リンカーとして、下記の構造のものを使用することもできる。 In addition to the above, those having the following structure can also be used as the bifunctional linker.
ここで、上記一般式(L-4)〜(L-21)、において、n1は、1〜40の整数、好ましくは2〜20の整数、更に好ましくは2〜12の整数を示す。 Here, in the general formulas (L-4) to (L-21), n1 represents an integer of 1 to 40, preferably an integer of 2 to 20, and more preferably an integer of 2 to 12.
また、上記一般式(L-22)及び(L-23)、において、n2は、1〜20の整数、好ましくは1〜10の整数、更に好ましくは1〜6の整数を示す。 In the general formulas (L-22) and (L-23), n2 represents an integer of 1 to 20, preferably an integer of 1 to 10, and more preferably an integer of 1 to 6.
上記一般式(L-4)〜(L-23)に示すリンカーは、その右側又は左側のいずれに機能性分子が結合していてもよい。好ましくは、左側に機能性分子が結合しており、右側に上記センス鎖RNAの所定の部位が結合するように構成されているものである。 In the linkers represented by the general formulas (L-4) to (L-23), a functional molecule may be bonded to either the right side or the left side. Preferably, a functional molecule is bound on the left side, and a predetermined site of the sense strand RNA is bound on the right side.
上記二官能性リンカーは、結合させる機能性分子の種類に応じて適宜選択して使用すればよい。例えば、上記機能性分子としてコレステロールを使用する場合、一般式(L-22)又は(L-23)のリンカー、特に一般式(L-22)のリンカーが好適に使用される。 The bifunctional linker may be appropriately selected and used according to the type of functional molecule to be bound. For example, when cholesterol is used as the functional molecule, a linker of general formula (L-22) or (L-23), particularly a linker of general formula (L-22) is preferably used.
なお、機能性分子がDNAの場合には、リンカーを使用することなく、直接、上記センス鎖RNAの5'末端側にDNAを結合させることが望ましい。 When the functional molecule is DNA, it is desirable to directly bind the DNA to the 5 ′ end side of the sense strand RNA without using a linker.
上記機能性分子を含む基の中でも、好ましくはDNA又はコレステロールを含む基である。上記置換基としてDNAを採用すると、当該DNAと相補的な塩基配列を有するDNAやRNAを更にハイブリダイズさせて複合体を形成させることが可能になり、当該DNAに基づく更なる有用機能を本発明の修飾型RNAに備えさせることができる。また、上記置換基として、コレステロールを含む基を採用すると、遺伝子導入剤を使用しなくても本発明の修飾型RNAを細胞内に導入可能になるという利点を獲得できる。 Among the groups containing the functional molecule, a group containing DNA or cholesterol is preferable. When DNA is employed as the substituent, it becomes possible to form a complex by further hybridizing DNA or RNA having a base sequence complementary to the DNA, and to provide a further useful function based on the DNA of the present invention. The modified RNA can be prepared. Further, when a group containing cholesterol is employed as the substituent, it is possible to obtain the advantage that the modified RNA of the present invention can be introduced into cells without using a gene introduction agent.
上記置換基の好適なものとして、アミノアルキル基、チオアルキル基、及びコレステロールを有する基、特に好適なものとしてアミノアルキル基を例示することができる。例えば、上記置換基として、アミノアルキル基、及びチオアルキル基を採用すると、飛躍的にRNA干渉効果を向上させることができ、更にはリンカーを介して、又は介さず、膜透過性ペプチド、糖、タンパク質等の機能性分子を共有結合で結合させることができ、RNA分子に様々な機能性を付与できるという利点を獲得できる。更に、例えば、上記置換基として、コレステロールを含む基を採用すると、所望のRNA干渉効果を奏することに加え、遺伝子導入剤を使用しなくても本発明の修飾型RNAを細胞内に導入可能になるという利点を獲得できる。 Preferable examples of the substituent include aminoalkyl groups, thioalkyl groups, and groups having cholesterol, and particularly preferable examples include aminoalkyl groups. For example, when an aminoalkyl group and a thioalkyl group are employed as the substituent, the RNA interference effect can be dramatically improved, and further, a membrane-permeable peptide, sugar, protein, or not via a linker. The functional molecule such as can be covalently bound, and the advantage that various functions can be imparted to the RNA molecule can be obtained. Furthermore, for example, when a group containing cholesterol is employed as the substituent, the modified RNA of the present invention can be introduced into cells without using a gene introduction agent in addition to exhibiting a desired RNA interference effect. The advantage of becoming
上記センス鎖RNAにおいて、上記置換基の結合対象となるヌクレオチドは、上記センス鎖RNAの5’末端側から1〜6番目のヌクレオチドであれば特に制限されないが、好ましくは5’末端側から1〜4番目のヌクレオチド、更に好ましくは5’末端側から1及び/又は2番目のヌクレオチド、特に好ましくは5’末端(5’末端側から1番目)のヌクレオチドである。 In the sense strand RNA, the nucleotide to which the substituent is bound is not particularly limited as long as it is the 1st to 6th nucleotide from the 5 ′ end side of the sense strand RNA, but preferably 1 to 5 from the 5 ′ end side. The fourth nucleotide, more preferably the first and / or second nucleotide from the 5 ′ end side, particularly preferably the 5 ′ end (first from the 5 ′ end side) nucleotide.
また、上記置換基の結合部位については、特に限定されるものではないが、上記置換基が、上記センス鎖RNAの所定のヌクレオチドのリン酸部分の水酸基を構成する水素原子と置換されて結合していることが好ましい。 Further, the binding site of the substituent is not particularly limited, but the substituent is bonded to the hydrogen atom constituting the hydroxyl group of the phosphate portion of the predetermined nucleotide of the sense strand RNA. It is preferable.
本発明の修飾型RNAに結合した上記置換基の数としては、特に制限されないが、例えば1〜3個、好ましくは1又は2個、更に好ましくは1個が例示される。 The number of the substituents bound to the modified RNA of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include 1 to 3, preferably 1 or 2, and more preferably 1.
上記センス鎖RNAの5’末端側のヌクレオチドへの置換基の結合は、使用する置換基の種類等に応じて、公知の化学合成法に従って実施される。 The binding of the substituent to the nucleotide on the 5 'end side of the sense strand RNA is performed according to a known chemical synthesis method according to the type of the substituent used.
また、本発明の修飾型RNAは、上記のセンス鎖RNAに対して、センス鎖RNAの5’末端側が平滑末端(ブランドエンド)となるように、アンチセンス鎖RNAがハイブリダイズすることにより、二本鎖を形成している。ここで、センス鎖RNAの5’末端側が平滑末端となる構造とは、センス鎖RNAの5’末端のみならず、アンチセンス鎖RNAの3’末端もダングリングエンドを有していない構造を意味する。 In addition, the modified RNA of the present invention is obtained by hybridizing antisense strand RNA to the above sense strand RNA so that the 5 ′ end of the sense strand RNA is a blunt end (brand end). This chain is formed. Here, the structure in which the 5 ′ end of the sense strand RNA is a blunt end means a structure in which not only the 5 ′ end of the sense strand RNA but also the 3 ′ end of the antisense strand RNA has no dangling end. To do.
当該アンチセンス鎖RNAは、21又は23個のヌクレオチドからなり、上記センス鎖RNAの5’末端側(即ち、アンチセンス鎖RNAの3’末端側)を平滑末端にした状態で、上記センス鎖RNAとハイブリダイズして二本鎖を形成可能であるRNAである。即ち、当該アンチセンス鎖RNAが21個のヌクレオチドからなる場合、当該アンチセンス鎖RNAは、前記センス鎖の5’末端側から1〜21番目のヌクレオチドと完全相補的な21個のヌクレオチドからなる塩基配列から構成され、本発明の修飾型RNAは、センス鎖の5’末端側が平滑末端であって、センス鎖RNAの3’末端に2個のヌクレオチドからなるダングリングエンドを有する構造を有する。また、当該アンチセンス鎖RNAが23個のヌクレオチドからなる場合、当該アンチセンス鎖RNAは前記センス鎖と完全相補的な23個のヌクレオチドからなる塩基配列から構成され、本発明の修飾型RNAはセンス鎖の3’末端側及び5’末端側の双方において平滑末端の構造を有する。 The antisense strand RNA is composed of 21 or 23 nucleotides, and the sense strand RNA is in a state where the 5 ′ end side of the sense strand RNA (that is, the 3 ′ end side of the antisense strand RNA) is a blunt end. RNA that can hybridize with and form a double strand. That is, when the antisense strand RNA is composed of 21 nucleotides, the antisense strand RNA is a base composed of 21 nucleotides that are completely complementary to the 1st to 21st nucleotides from the 5 ′ end of the sense strand. The modified RNA of the present invention is composed of a sequence, and has a structure in which the 5 ′ end of the sense strand is a blunt end and a dangling end consisting of 2 nucleotides at the 3 ′ end of the sense strand RNA. When the antisense strand RNA is composed of 23 nucleotides, the antisense strand RNA is composed of a base sequence composed of 23 nucleotides that is completely complementary to the sense strand, and the modified RNA of the present invention is a sense RNA. It has a blunt end structure on both the 3 'and 5' ends of the strand.
本発明の修飾型RNAは、上記構造の置換基を有するセンス鎖RNA、及び上記構造のアンチセンス鎖RNAを合成し、これらのセンス鎖RNA及びアンチセンス鎖RNAを公知の方法に従ってハイブリダイズさせることにより、調製される。 The modified RNA of the present invention synthesizes a sense strand RNA having a substituent having the above structure and an antisense strand RNA having the above structure, and hybridizes these sense strand RNA and antisense strand RNA according to a known method. It is prepared by.
本発明の修飾型RNAは、細胞内に導入されることにより使用される。本発明の修飾型RNAについては、従来siRNAとして使用されているRNAと同様の方法で、目的の細胞内に導入され使用される。 The modified RNA of the present invention is used by being introduced into cells. The modified RNA of the present invention is introduced into a target cell and used in the same manner as RNA conventionally used as siRNA.
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。これらの実施例は、単なる例示であり、本発明を限定するものではない。 Examples are given below to illustrate the present invention in more detail. These examples are illustrative only and do not limit the invention.
実施例1 5’末端アミノ修飾2本鎖RNA
ウミシイタケルシフェラーゼと相同配列を持ち、ウミシイタケルシフェラーゼの遺伝子発現を抑制できる23〜19塩基長のセンス鎖RNAと23〜19塩基長のアンチセンス鎖RNAの2本鎖RNAをデザインし、センス鎖の5’末端にアミノ基を修飾した2本鎖RNAと修飾していない2本鎖RNAを比較した。該二本鎖RNAはアンチセンス鎖とセンス鎖の組み合わせにより様々な形態の二本鎖を形成できる。該2本鎖RNA においてダングリングエンド(一本鎖領域)を持たない完全2本鎖RNA をDS (double strand) RNA、二本鎖RNAの両末端にダングリングエンド(オーバーハング)を持つ2本鎖RNAをSi RNA、センス鎖の5’末端を左側に示したときに右側のみにダングリングエンド(オーバーハング)を持つ2本鎖RNAをRO (Right Overhang) RNA、センス鎖の5’末端を左側に示したときに左側のみにダングリングエンド(オーバーハング)を持つ2本鎖RNAをLO (Left Overhang) RNAと名付けた。また, 各種2本鎖RNAの命名はセンス鎖をA(A1又はA2)、アンチセンス鎖をBとし、センス鎖およびアンチセンス鎖となる1本鎖RNAの塩基の数を記載することにより区別している。また、センス鎖は2種類のものをデザインしたので区別のためにA1及びA2としている。また、センス鎖の5’末端をアミノ基で修飾したものをAxN(x=1, 2)と記載している。使用したRNAの配列は、以下の通りである。
<センス鎖>
23nt 23A1:5’-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGA-3’
23A2:5’-GGCCUUUCACUACUCCUACGAGC-3’
23A1N:5’NH2-(CH2)6-PO3-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGA-3’
23A2N:5’NH2-(CH2)6-PO3-GGCCUUUCACUACUCCUACGAGC-3’
21nt 21A1:5’-CUGGCCUUUCACUACUCCUAC -3’
21A2:5’-GGCCUUUCACUACUCCUACGA-3’
21A1:5’NH2-(CH2)6-PO3-CUGGCCUUUCACUACUCCUAC -3’
21A2:5’NH2-(CH2)6-PO3-GGCCUUUCACUACUCCUACGA-3’
19nt 19A1:5’ −GGCCUUUCACUACUCCUAC−3’
<アンチセンス鎖>
27nt 27B:5’-GUGCUCGUAGGAGUAGUGAAAGGCCAG-3’
25nt 25B:5’-GCUCGUAGGAGUAGUGAAAGGCCAG -3’
23nt 23B:5’-UCGUAGGAGUAGUGAAAGGCCAG-3’
21nt 21B:5’-GUAGGAGUAGUGAAAGGCCAG-3’
19nt 19B:5’-GUAGGAGUAGUGAAAGGCC-3’
Example 1 5′-terminal amino-modified double-stranded RNA
Designed a double-stranded RNA of 23-19 bases long sense strand RNA and 23-19 bases long antisense strand RNA that has a homologous sequence with Renilla luciferase and can suppress the gene expression of Renilla luciferase. A double-stranded RNA with an amino group modified at the 5 ′ end and a non-modified double-stranded RNA were compared. The double-stranded RNA can form various forms of double strands by combining the antisense strand and the sense strand. The double-stranded RNA does not have a dangling end (single-stranded region). The complete double-stranded RNA is DS (double strand) RNA, and the double-stranded RNA has two dangling ends (overhangs) at both ends. Double-stranded RNA with a dangling end (overhang) only on the right side when the 5 'end of the sense strand is shown on the left when the strand RNA is Si RNA, RO (Right Overhang) RNA, and the 5' end of the sense strand When shown on the left side, a double-stranded RNA having a dangling end (overhang) only on the left side was named LO (Left Overhang) RNA. In addition, the nomenclature of various double-stranded RNAs is distinguished by describing the number of bases of the single-stranded RNA to be the sense strand and antisense strand, with the sense strand being A (A1 or A2), the antisense strand being B, Yes. In addition, since two types of sense strands are designed, A1 and A2 are used for distinction. In addition, a modification of the 5 ′ end of the sense strand with an amino group is described as AxN (x = 1, 2). The sequence of RNA used is as follows.
<Sense strand>
23nt 23A1: 5'-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGA-3 '
23A2: 5'-GGCCUUUCACUACUCCUACGAGCGC-3 '
23A1N: 5'NH 2- (CH 2 ) 6 -PO 3 -CUGGCCUUUCACUACUCCUACGA-3 '
23A2N: 5'NH 2- (CH 2 ) 6 -PO 3 -GGCCUUUCACUACUCCUACGAGC-3 '
21nt 21A1: 5'-CUGGCCUUUCACUACUCCUAC-3 '
21A2: 5'-GGCCUUUCACUACUCCUACGA-3 '
21A1: 5'NH 2- (CH 2 ) 6 -PO 3 -CUGGCCUUUCACUACUCCUAC -3 '
21A2: 5'NH 2- (CH 2 ) 6 -PO 3 -GGCCUUUCACUACUCCUACGA-3 '
19nt 19A1: 5 '-GGCCUUUCACUACUCCUAC-3'
<Antisense strand>
1.末端アミノ修飾2本鎖RNAの構造
2 本鎖RNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖の5’末端をアミノ化した末端アミノ修飾2本鎖RNAを合成した。具体的な合成方法を以下に示す。まず、末端アミノ修飾RNAは、1本鎖の状態のRNA(林化成株式会社より購入;HPLC精製、MALDI-TOF MS解析済み)を用い、5’末端アミノ化は5’-Amino-Modifier C6 (Glen Research)を用いて合成した。合成された5’末端アミノ修飾2本鎖RNAは、該末端(5’末端側から1番目のヌクレオチド)に−(CH2)6−NH2が結合されている。合成した1本鎖RNAは、UVスペクトル検出器を用い、260nmの吸光度を測定することにより濃度を算出した。また、universal buffer(林化成株式会社)中、同モルのセンス鎖およびアンチセンス鎖1本鎖RNAを混合し、92℃で2分間加熱した後、4℃まで徐々に温度を下げることで作成した。合成した各種2本鎖RNAは、20% ポリアクリルアミドゲルを用い、250Vの条件化で60分間電気泳動し、その後、銀染色キット(GEヘルスケア バイオサイエンス)で2本鎖RNAを染色することにより確認した。末端が修飾されていない未修飾2本鎖RNAおよび5’末端をアミノ基で修飾した修飾型2本鎖RNAを図1に示す。
1. Structure of terminal amino-modified double-stranded RNA
A terminal amino-modified double-stranded RNA in which the 5 ′ end of the sense strand and the antisense strand of the double-stranded RNA was aminated was synthesized. A specific synthesis method is shown below. First, the terminal amino-modified RNA is a single-stranded RNA (purchased from Hayashi Kasei Co., Ltd .; HPLC purified and MALDI-TOF MS analyzed), and 5′-terminal amination is 5′-Amino-Modifier C6 ( Glen Research). In the synthesized 5 ′ terminal amino-modified double-stranded RNA, — (CH 2 ) 6 —NH 2 is bound to the terminal (the first nucleotide from the 5 ′ terminal side). The concentration of the synthesized single-stranded RNA was calculated by measuring the absorbance at 260 nm using a UV spectrum detector. In addition, in the universal buffer (Hayashi Kasei Co., Ltd.), the same strand of sense and antisense strands were mixed, heated at 92 ° C for 2 minutes, and then gradually lowered to 4 ° C. . Each synthesized double-stranded RNA is electrophoresed for 60 minutes under a 250V condition using a 20% polyacrylamide gel, and then stained with a silver staining kit (GE Healthcare Bioscience). confirmed. FIG. 1 shows an unmodified double-stranded RNA whose end is not modified and a modified double-stranded RNA in which the 5 ′ end is modified with an amino group.
2.末端アミノ修飾2本鎖の分解酵素耐性
未修飾2本鎖RNAおよび5’末端アミノ修飾2本鎖RNAのヌクレアーゼ耐性を検討した。実験は、最終濃度が2 μMになるよう調整した5’末端アミノ修飾2本鎖RNAを10%FBS(三光純薬株式会社)を含むRPMI-1640培地(インビトロジェン)中 (最終量110μl)、37℃でインキュベートし、0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h後にそれぞれ10μl取り、2μlのローデングダイを含むサンプルチューブに添加した。分解反応を停止させる為、サンプル採取後すぐ液体窒素中にて凍結し、−20℃にて保存した。得られた産物を20% ポリアクリルアミドゲルを用い250Vで70分間サンプルを電気泳動した。その後、銀染色キット(GEヘルスケア バイオサイエンス)で産物を染色し(染色条件は製品マニュアル参照)、ChemiImager 4000(Alpha Innotech corporation)でゲル解析を行った。結果を図2に示す。この結果より、センス鎖の5’末端側及び/又は3’末端側に平滑末端を持つ2本鎖RNAであるDs 23A1/23B RNA、Ds 23A1N/23B RNA、RO 23A1/21B RNA、RO 23A1N/21B RNA、LO 21A2/23B RNA及びLO 21A2N/23B RNAは、RNA干渉反応において一般によく使用されている21塩基長で3’末端に2塩基のダングリングエンドを含む21siRNAに比べ分解耐性が高いことが明らかとなった。また、2本鎖RNAの鎖長が長い方が分解酵素耐性に優れていることが示唆され、且つ5’末端にアミノ基が結合した方が分解酵素耐性に優れていることが示唆された。更にセンス鎖の5’末端側は平滑末端であり、且つアンチセンス鎖の5’末端にダングリングエンドをもつRO RNAは、10% FBSを含む培地中において速やかに分解されていることが明らかとなった。この結果より、(a)センス鎖の鎖長が23塩基からなり、両末端が平滑末端であるDS RNA、(b)センス鎖の鎖長が23塩基からなり、センス鎖の5’末端が平滑末端で、且つセンス鎖の3’末端にダングリングエンドを持つRO RNA、或いは(c)センス鎖の鎖長が23塩基からなり、センス鎖の3’末端が平滑末端で、且つアンチセンス鎖の3’末端にダングリングエンドを持つLO RNAは、21siRNAよりも高い分解酵素耐性を保有しているという新たな知見が得られた。
2. Was studied terminal amino-modified two resistance to enzymatic degradation unmodified double-stranded RNA and the 5 'end amino-modified double-stranded RNA nuclease resistance of the chain. In the experiment, 5′-terminal amino-modified double-stranded RNA adjusted to a final concentration of 2 μM was added to RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 10% FBS (Sanko Junyaku Co., Ltd.) (final amount 110 μl), 37 After incubation at 0 ° C., 10 μl was taken after 0 h, 0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 12 h, 24 h, and 48 h, and added to a sample tube containing 2 μl of loading die. In order to stop the decomposition reaction, the sample was frozen in liquid nitrogen immediately after sampling and stored at -20 ° C. The obtained product was subjected to electrophoresis using a 20% polyacrylamide gel at 250 V for 70 minutes. Thereafter, the product was stained with a silver staining kit (GE Healthcare Bioscience) (see the product manual for staining conditions), and gel analysis was performed with ChemiImager 4000 (Alpha Innotech Corporation). The results are shown in FIG. From these results, Ds 23A1 / 23B RNA, Ds 23A1N / 23B RNA, RO 23A1 / 21B RNA, RO 23A1N /, which are double-stranded RNAs having blunt ends at the 5 ′ end and / or 3 ′ end of the
3.末端アミノ修飾2本鎖RNAのDicerによるプロセシング
次に、それぞれの5’末端アミノ修飾2本鎖RNAのDicerによるプロセシングを検討した。Dicerによる切断実験は、20mM Tris-HCl(pH 8.0), 15 mM NaCl, 2.5mM Mg2Cl溶液中、0.5 UのリコンビナントDicer(Gene Therapy Systems)と最終濃度2 μMになるよう調整した5’末端アミノ修飾2本鎖RNAをサンプルチューブに10 μl準備し、37℃に設定したインキュベーター中、12時間インキュベートした。その後、Dicerによる切断反応を停止させる為に、2μlのDicer Stop Solution (Gene Therapy Systems)を反応溶液に加え、更に2μlのローデングダイを加えた。得られた産物を20% ポリアクリルアミドゲルを用い250Vで70分間サンプルを電気泳動した。その後、銀染色キット(GEヘルスケア バイオサイエンス)で産物を染色し(染色条件は製品マニュアル参照)、ChemiImager 4000(Alpha Innotech corporation)でゲル解析を行った。また、また、コントロールとしてDicer処理していない21塩基長の2本鎖RNAからなるsiRNA (Si 21A2/21B1 RNA)も同時に測定した。
3. Processing of terminal amino-modified double-stranded RNA with Dicer Next, processing of each 5′-terminal amino-modified double-stranded RNA with Dicer was examined. Dicer cleavage experiments were performed at 5 'end adjusted to a final concentration of 2 μM with 0.5 U recombinant Dicer (Gene Therapy Systems) in 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 15 mM NaCl, 2.5 mM Mg 2 Cl solution. 10 μl of amino-modified double-stranded RNA was prepared in a sample tube and incubated for 12 hours in an incubator set at 37 ° C. Thereafter, in order to stop the cleavage reaction by Dicer, 2 μl of Dicer Stop Solution (Gene Therapy Systems) was added to the reaction solution, and further 2 μl of loading dye was added. The obtained product was subjected to electrophoresis using a 20% polyacrylamide gel at 250 V for 70 minutes. Thereafter, the product was stained with a silver staining kit (GE Healthcare Bioscience) (see the product manual for staining conditions), and gel analysis was performed with ChemiImager 4000 (Alpha Innotech Corporation). As a control, siRNA (Si 21A2 / 21B1 RNA) consisting of double-stranded RNA of 21 base length not treated with Dicer was also measured at the same time.
図3に結果を示す。図3において、「A」はDS RNA、「B」はSi RNA、「C」はRO RNA、「D」はLO RNAのリコンビナントDicerによるプロセシングの結果である。 The results are shown in FIG. In FIG. 3, “A” is the result of processing of DS RNA, “B” is Si RNA, “C” is RO RNA, and “D” is the result of recombinant Dicer processing.
その結果、DS 23A1/23B1 RNA及び DS 23A1N/23B1 RNAは、その1部において21塩基長の2本鎖RNAへのプロセシングが確認されたが、その殆どにおいてDicerによるプロセシングを受けていなかった。また、DS 21A1/21B1 RNA及び DS 21A1N/21B1 RNAは、Dicer存在下による変化は確認されていない。
Si RNAにおいては、Si 23A2/23B RNA及びSi 23A2N/25B RNAにおいても、1部はDicerによるプロセシングを受けなかったものの、ほとんどのRNA分子において21塩基長のSiRNAへとプロセシングを受けていた。21 SiRNAのセンス鎖の5’末端をアミノ化したSi 21A2N/21B RNAはDicer存在下においても変化は観測されなかった。
As a result, DS 23A1 / 23B1 RNA and DS 23A1N / 23B1 RNA were confirmed to be processed into double-stranded RNA of 21 base length in one part, but most of them were not processed by Dicer. In addition, DS 21A1 / 21B1 RNA and DS 21A1N / 21B1 RNA have not been confirmed to change in the presence of Dicer.
As for Si RNA, although part of Si 23A2 / 23B RNA and Si 23A2N / 25B RNA was not processed by Dicer, most RNA molecules were processed into 21-base-length SiRNA. No change was observed in Si 21A2N / 21B RNA in which the 5 ′ end of the sense strand of 21 SiRNA was aminated even in the presence of Dicer.
また、RO RNAにおいて、センス鎖に23塩基長のRNAを持つRO RNAは、その1部において21塩基長の2本鎖RNAへのプロセシングが確認されたが、その殆どにおいてDicerによるプロセシングを受けていなかった。また、センス鎖の5’末端をアミノ化したものに関してはその現象が顕著に現れた。また、センス鎖に21塩基長のRNA分子を持つRO RNAは、センス鎖の5’末端の修飾基の存在に関係なく、Dicer存在下において変化は確認されなかった。 In addition, in RO RNA, RO RNA with 23-base-long RNA in the sense strand was confirmed to be processed into double-stranded RNA of 21-base length in one part, but most of it was processed by Dicer. There wasn't. In addition, the phenomenon appeared remarkably in the case where the 5 'end of the sense strand was aminated. In addition, RO RNA having a 21-base long RNA molecule in the sense strand was not confirmed in the presence of Dicer, regardless of the presence of the modifying group at the 5 'end of the sense strand.
一方、LO RNAにおいて、センス鎖に23塩基長のRNA分子を持つLO RNAは、センス鎖の5’末端の修飾基の存在に関係なく、Dicerによるプロセシングにて21塩基長のsiRNAまたはそれに近いRNA産物がゲル電気泳動解析により確認されている。また、センス鎖の21塩基長のRNA分子を持つLO RNAも同様に、センス鎖の5’末端の修飾基の存在に関係なく、Dicerによるプロセシングにて21塩基長のsiRNAまたはそれに近いRNA産物が得られていることが示唆される結果を得た。 On the other hand, in LO RNA, LO RNA having a 23-base-long RNA molecule in the sense strand is 21-base siRNA or RNA close to it when processed by Dicer, regardless of the presence of a modifying group at the 5 'end of the sense strand. The product has been confirmed by gel electrophoresis analysis. Similarly, LO RNA having a 21-base-long RNA molecule in the sense strand can also produce a 21-base-long siRNA or a similar RNA product by processing with Dicer, regardless of the presence of a modifying group at the 5 'end of the sense strand. The result was suggested to be obtained.
4.末端アミノ修飾2本鎖RNAのRNA干渉効果
つぎにそれぞれの末端アミノ修飾2本鎖RNAのRNA干渉効果をウミシイタケルシフェラーゼをターゲットとして評価した。実験前に1x105 cell/mlに調整したHeLa細胞(ヒト子宮頸ガン細胞、東北大学加齢医学研究所)を96wellプレート上にそれぞれ100μl撒き、37℃で一晩インキュベートした。翌日、ウェル上の古い培地を取り除き、抗生物質を含ない新しい培地をウェルにそれぞれ80 μl加え、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼを発現するベクター(psiCHECKTM-2 Vector: プロメガ)とLipofectamineTM 2000 (商品名、インビトロジェン)の複合溶液を10μlづつHeLa細胞が入ったそれぞれのウェルに加えた。ここで発現ベクターは1ウェルあたり0.02μgになるように、またLipofectamineTM 2000は1ウェルあたり0.2μlになるよう設定し、OptiMem(インビトロジェン)で必要量を調整した。また、複合体を形成させる為に、発現ベクターとLipofectamineTM 2000をOptiMemを用いて混合した後、室温で30分間インキュベートした。複合溶液を加えた後、細胞を5% CO2 存在下、37℃で4時間インキュベートした。その後、ウミシイタケルシフェラーゼの遺伝配列と相同的なアンチセンス配列を含む末端アミノ修飾2本鎖RNA を最終濃度が0nM, 0.2nM, 0.5nM, 1nM, 2nM, 5nM, 10nMになるようLipofectamineTM 2000 (インビトロジェン) と複合体を形成させ、10μlの複合体溶液を発現ベクターを導入したHeLa細胞に加えた。ここで、1ウェルあたりの最終量は100 μlとなる。RNAとLipofectamineTM 2000の複合溶液は、1ウェルあたり5 μlのRNA水溶液と5 μlのLipofectamineTM 2000 (0.2μl) OptiMem溶液を混合し、30分間室温でインキュベートすることにより作成した。RNAを導入させた後、48時間インキュベートし、Dula-GloTMLuciferase Assay System(プロメガ)を用いてホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの発現量をルミノメータ(MicroLumat LB96p: BERTHOLD)で測定し、ホタルルシフェラーゼの発現量をコントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼの発現抑制効果を算出した。
4). RNA interference effect of terminal amino-modified double-stranded RNA Next , the RNA interference effect of each terminal amino-modified double-stranded RNA was evaluated using Renilla luciferase as a target. Before the experiment, HeLa cells (human cervical cancer cells, Tohoku University Institute for Aging Medicine) adjusted to 1 × 10 5 cells / ml were plated on a 96-well plate, and incubated at 37 ° C. overnight. The next day, remove the old medium in the wells, add 80 μl each of fresh medium without antibiotics to the wells, and add firefly and Renilla luciferase-expressing vectors (psiCHECK TM -2 Vector: Promega) and Lipofectamine TM 2000 (trade name) , Invitrogen) was added to each well containing 10 μl of HeLa cells. Here, the expression vector was set to 0.02 μg per well and Lipofectamine ™ 2000 was set to 0.2 μl per well, and the required amount was adjusted with OptiMem (Invitrogen). In order to form a complex, the expression vector and Lipofectamine ™ 2000 were mixed using OptiMem and then incubated at room temperature for 30 minutes. After adding the complex solution, the cells were incubated for 4 hours at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 . After that, terminal amino-modified double-stranded RNA containing an antisense sequence homologous to the genetic sequence of Renilla luciferase was added to Lipofectamine TM 2000 (final concentration to 0nM, 0.2nM, 0.5nM, 1nM, 2nM, 5nM, 10nM). Complexed with Invitrogen) and 10 μl of the complex solution was added to HeLa cells into which the expression vector had been introduced. Here, the final volume per well is 100 μl. A complex solution of RNA and Lipofectamine ™ 2000 was prepared by mixing 5 µl of RNA aqueous solution and 5 µl of Lipofectamine ™ 2000 (0.2 µl) OptiMem solution per well and incubating at room temperature for 30 minutes. After introducing the RNA, incubate for 48 hours, measure the expression level of firefly and Renilla luciferase using Dula-Glo ™ Luciferase Assay System (Promega) with a luminometer (MicroLumat LB96p: BERTHOLD), and express the level of firefly luciferase As a control, the expression suppression effect of Renilla luciferase was calculated.
図4に、0.5nM濃度のときの末端アミノ修飾2本鎖RNAのRNA干渉効果の結果を示す。 FIG. 4 shows the results of the RNA interference effect of the terminal amino-modified double-stranded RNA at a concentration of 0.5 nM.
その結果、DS RNAやRO RNAのようなセンス鎖の5’末端側が平滑末端のものにアミノ基を修飾することにより、同様のRNA構造の修飾されていないRNA分子に比べ飛躍的なRNA干渉効果の向上が観察された。また、その効果はRO RNAにおける平滑末端側を逆側にあるダングリングエンドの鎖長に関係なく、且つアンチセンス鎖の5’末端にダングリングエンドが存在する場合も全て同様に、センス鎖の5’末端をアミノ修飾することにより高いRNA干渉効果が得られた。一方、アンチセンス鎖の3’末端側にダングリングエンドを持つSi RNAやLO RNAにおいては、センス鎖の5’末端をアミノ基で修飾を施しても、非修飾で同様の構造を持つRNA分子と比べ、ほぼ同程度のRNA干渉効果を示した。この結果より、DS RNAやRO RNAといったセンス鎖の5’末端側が平滑末端となっているRNA干渉分子のセンス鎖の5’末端のみに修飾を施すことにより飛躍的にRNA干渉効果が向上するという新たな知見が得られた。 As a result, by modifying the amino group with a blunt end at the 5 'end of the sense strand, such as DS RNA or RO RNA, a dramatic RNA interference effect compared to RNA molecules with similar RNA structure but not modified An improvement was observed. In addition, the effect is the same regardless of the length of the dangling end on the reverse side of the blunt end side in RO RNA, and when the dangling end is present at the 5 ′ end of the antisense strand, A high RNA interference effect was obtained by amino-modifying the 5 ′ end. On the other hand, in the case of Si RNA or LO RNA that has a dangling end on the 3 'end of the antisense strand, the RNA molecule that has the same structure without modification even if the 5' end of the sense strand is modified with an amino group The RNA interference effect was almost the same as that of. From this result, it is said that the RNA interference effect is dramatically improved by modifying only the 5 ′ end of the sense strand of the RNA interference molecule in which the 5 ′ end of the sense strand such as DS RNA or RO RNA is a blunt end. New findings were obtained.
5.末端アミノ修飾2本鎖RNAのRNA干渉効果の持続性
次に、末端アミノ修飾2本鎖RNAのRNA干渉効果の持続性を検討した。RNA干渉効果の持続性を評価するために、50nMに調整した末端アミノ修飾2本鎖RNAをそれぞれ2日間、4日間、7日間、HeLa細胞(ヒト子宮頸ガン細胞、東北大学加齢医学研究所)とインキュベートし、その後のRNA干渉効果を追跡した。遺伝子発現抑制実験で用いたターゲットはウミシイタケルシフェラーゼで、測定の48時間前にホタル及びウミシイタケルシフェラーゼの遺伝子をもつベクター(psiCHECKTM-2 Vector: プロメガ)をLipofectamineTM 2000を用い細胞へ導入させた。また、末端アミノ修飾27nt dsRNAもLipofectamineTM 2000を用いて細胞内へ導入させておいて、2日おきに培地交換を行った。遺伝子発現抑制解析は、Dula-GloTMLuciferase Assay System(プロメガ)を用いてホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの発現量をルミノメータで測定し、ホタルルシフェラーゼの発現量をコントロールとしウミシイタケルシフェラーゼの発現抑制効果を算出した。ここで使用した発現ベクターやRNAの導入方法は前述と同様の方法でLipofectamineTM 2000と複合体を形成させ、それぞれ10 μlのサンプルを細胞に添加した。また、細胞溶液の最終容量は100 μlになるよう調整した。
5. Persistence of RNA interference effect of terminal amino-modified double-stranded RNA Next, the persistence of RNA interference effect of terminal amino-modified double-stranded RNA was examined. In order to evaluate the persistence of the RNA interference effect, the terminal amino-modified double-stranded RNA adjusted to 50 nM was applied to HeLa cells (human cervical cancer cells, Tohoku University Institute for Aging Medicine, respectively) for 2 days, 4 days, and 7 days. ) Followed by subsequent RNA interference effects. The target used in the gene expression suppression experiment was Renilla luciferase, and a vector (psiCHECK TM -2 Vector: Promega) containing the firefly and Renilla luciferase genes was introduced into the cells 48 hours before measurement using Lipofectamine TM 2000 . In addition, terminal amino-modified 27nt dsRNA was introduced into cells using Lipofectamine ™ 2000, and the medium was changed every two days. For gene expression suppression analysis, firefly and Renilla luciferase expression levels were measured with a luminometer using the Dula-Glo ™ Luciferase Assay System (Promega), and the Renilla luciferase expression suppression effect was calculated using the firefly luciferase expression level as a control did. The expression vector and RNA used here were complexed with Lipofectamine ™ 2000 in the same manner as described above, and 10 μl of each sample was added to the cells. The final volume of the cell solution was adjusted to 100 μl.
得られた結果を図5に示す。その結果、上記でRNA干渉効果が高かったDS RNAやRO RNAのセンス鎖の5’末端をアミノ基で修飾した末端修飾型RNA干渉分子は、高いRNA干渉効果の持続性も示し、かつ、細胞添加後7日後においてもセンス鎖の5’末端をアミノ基で修飾したのもの方が非修飾RNA に比べ高いRNA 干渉効果を示した。 The obtained results are shown in FIG. As a result, the above-mentioned end-modified RNA interference molecules in which the 5 'end of the sense strand of DS RNA or RO RNA, which had a high RNA interference effect, was modified with an amino group also showed a high persistence of the RNA interference effect, and the cell Even after 7 days from the addition, the one in which the 5 ′ end of the sense strand was modified with an amino group showed a higher RNA interference effect than the unmodified RNA.
以上の結果から、センス鎖RNAが23個のヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖RNAが21又は23個のヌクレオチドからなり、センス鎖RNAの5’末端側を平滑末端である二本鎖RNAにおいて、センス鎖RNAの5’末端側のみに修飾基を結合させることによって、ヌクレアーゼ耐性及びRNA干渉効果の双方の点で優れた特性を備えさせることが可能になることが明らかになった。 From the above results, the sense strand RNA is composed of 23 nucleotides, the antisense strand RNA is composed of 21 or 23 nucleotides, and the sense strand RNA has a blunt end on the 5 ′ end side of the sense strand RNA. It has been clarified that it is possible to provide excellent characteristics in terms of both nuclease resistance and RNA interference effect by attaching a modifying group only to the 5 ′ end side of the strand RNA.
Claims (2)
前記センス鎖RNAが23個のヌクレオチドからなり、前記アンチセンス鎖RNAが21又は23個のヌクレオチドからなり、
前記センス鎖RNAの5’末端側が平滑末端であり、
且つ前記センス鎖RNAの5’末端側から1番目のヌクレオチドにのみ1つのアミノアルキル基が結合していることを特徴とする、修飾型RNA。 Two strands having a sense strand RNA consisting of a base sequence complementary to the target sequence in the target gene, and an antisense strand RNA having a base sequence complementary to the sense strand RNA, and capable of suppressing the expression of the target gene Strand RNA,
The sense strand RNA consists of 23 nucleotides, and the antisense strand RNA consists of 21 or 23 nucleotides;
The 5 ′ end side of the sense strand RNA is a blunt end,
And wherein the sense strand one aminoalkyl group only from 5 'end to the first nucleotide of the RNA is bound, modified RNA.
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