JP4893194B2 - 解析装置、および補正方法 - Google Patents

解析装置、および補正方法 Download PDF

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Description

本発明は、解析装置、および補正方法に関し、特に、マイクロアレイ実験等において二蛍光標識法等から得られるデータを解析する解析装置、および、そのデータの補正方法に関する。
近年、マイクロアレイ実験やマクロアレイ実験等の技術発展により、膨大な量の遺伝子を網羅的に解析することが可能となった。マイクロアレイ実験等においては、検査対象として膨大な量の遺伝子を扱うため、演算処理装置をベースとした解析装置が用いられる。
解析装置は、マイクロアレイ実験においては複雑な工程等の高度な実験技術に基づく種々の理由に起因する測定誤差や偏り誤差が発生するため、データを補正して解析する手段を備えることが必須となる（例えば、特許文献１）。たとえば、マイクロアレイ実験の代表的な実験解析手法として二蛍光標識法が挙げられるが、二蛍光標識法における測定には、蛍光の平均検出強度に依存した偏り誤差が発生する。そのため、偏り誤差を適切に除去する補正手段を備えているか否かが、解析装置の解析精度を左右する。
従来、解析装置による偏り誤差等の補正手段としては、特許文献１、２または３に記載の補正手段のように、平均検出強度をその値により複数の区画に分け、それぞれの区画で平均値や中央値を算出し差分して補正する手段が存在する。また、特許文献４に記載の補正手段として、平均曲線を用いて補正する手段が公開されている。
しかしながら、従来の解析装置または補正方法では、偏り誤差に起因する差異を十分に除去することができず補正の精度が低いという問題があった。すなわち、特許文献１、２または３に記載の補正方法では、複数の区画に分画し補正を行うため、区画と区画の境界付近で補正の誤差が大きくなってしまうという問題があった。また、特許文献４に記載の補正方法では、平均曲線のデータに対する当てはまり具合が悪いという問題があった。
データに関数を当てはめる方法として回帰分析が考えられるが、請求項５に記載の発明は、遺伝子の機能的関連性を検出しようとするものであり、補正の手段として応用することができないという問題がある。
ここで、回帰分析を用いた従来法における補正処理の例について図１および図２を参照しながら説明する。図１は、従来技術における解析装置の補正処理の一例を示すフローチャートである。
まず、図１に示すように、従来の解析装置において、制御装置は、記憶装置に記憶された検出強度値を読み込む（ステップＳＡ−１）。
つぎに、従来の解析装置において、制御装置は、検出強度値からバックグラウンド値を減算する（ステップＳＡ−２）。例えば、全く結合対象となる被検査物質がないプローブ等を選択結合性物質として用いて担体に接触させ、制御装置は、プローブを配置した部分の検出強度値をバックグラウンド値として減ずるよう構成する等である。
つづいて、従来の解析装置において、制御装置は、記憶装置に記憶された検出強度値に基づいて、下記の数式１および数式２を用いて、２群間における対数比Ｍ（ｋ）と対数幾何平均Ａ（ｋ）とに変換する（ステップＳＡ−３）。
Ｍ（ｋ）＝ｌｏｇ2（Ｃ1k／Ｃ2k） ・・・（数式１）
Ａ（ｋ）＝ｌｏｇ2（Ｃ1k・Ｃ2k）0.5 ・・・（数式２）
ここで、ｋは任意の選択結合性物質を表し、Ｃ1kおよびＣ2kは、それぞれ異なる２種類の標識の検出強度値である。
そして、従来の解析装置においては、制御装置は、全選択結合性物質についての対数比または対数幾何平均について、重み付き局所回帰法（Ｌｏｗｅｓｓ法：LOcally WEighted Scatter plot Smooth）を用いて、誤差推定のためのＬｏｗｅｓｓ曲線を求める（ステップＳＡ−４）。
つづいて、従来の解析装置において、制御装置は、得られたＬｏｗｅｓｓ曲線に基づいて、対数幾何平均に依存した対数比の偏り誤差を推定する（ステップＳＡ−５）。
最後に、従来の解析装置において、制御装置は、得られた偏り誤差を、各選択結合性物質についての対数比から減算する（ステップＳＡ−６）。
ここで、補正前の選択的結合量に係る２群間の差異は以下のように表すことができる。すなわち、「差異＝生物学的要因に基づく差異（生物学的差異）＋非生物学的要因に基づく差異（非生物学的差異）」である。そして、補正処理において目的とするのは、非生物学的差異の推定と除去である。
特開２００３−２５６４０７号公報 特開２００５−１０６７５５号公報 特開２００３−０２８８６２号公報 特開２００３−１８５６５９号公報 国際公開第０２／０４８９１５号パンフレット
しかしながら、従来法における補正処理を実行した場合、局所回帰の際のウィンドウサイズ（データポイント数）が小さい場合には、生物学的差異を非生物学的差異とみなしてしまうという問題がある。ここで、図２は、上記従来法における補正処理を実行して、補正のためのＬｏｗｅｓｓ曲線を求めた場合のＭＡ（横軸：Ａ値、縦軸：Ｍ値）プロット図である。
すなわち、図２に示すように、ウィンドウサイズが小さい範囲（８≧Ａ≧９付近、および、Ａ≧１２付近）においては、従来法においては、比較的Ｍ値の大きいプロットに引っ張られて、Ｌｏｗｅｓｓ曲線が歪に変形してしまう。すなわち、従来法における補正処理によっては、生物学的差異を非生物学的差異とみなしてしまうという問題がある。
通常の網羅型のマイクロアレイ（搭載遺伝子数：数千〜数万遺伝子）であれば、ウィンドウサイズを小さくしても、生物学的変動（生物学的変動）がない遺伝子が大半であるので、このような問題は発生しない（または無視できるほど小さい）。しかしながら、本出願人が開発したマイクロアレイ（搭載遺伝子数：数百〜１０００遺伝子程度）の場合には、網羅型マイクロアレイに比べて全体に占める生物学的差異が期待される遺伝子の割合が高くなるため、従来の補正処理方法では、生物学的差異と偏り誤差等により生ずる非生物学的差異を十分に分離することができず、解析精度が悪いという問題がある。
要約すれば、従来、膨大な数の遺伝子を対象とするマイクロアレイ実験等においては、二色蛍光法等による検出結果を解析しようとする際に、全体のうち２種類の組織または細胞の間で発現量に差がある遺伝子は僅かであるとの考えから、発現変化がデータに含まれることを無視して全遺伝子を対象とする補正用の関数やパラメータを求めてきた。しかしながら、例えば特定疾患専用のマイクロアレイを設計する場合等においては、検査対象となる遺伝子数はコントロールを含めても数百程度に限られるので、全体のうち発現量に差がある目的遺伝子の割合が大きくなり、補正用の関数やパラメータを求める上で標本誤差が大きくなるという問題があった。
本発明は、上記に鑑みてなされたもので、マイクロアレイ実験等から得られるデータから、生物学的差異と偏り誤差により生ずる非生物学的差異を分離することができる補正方法、およびその補正方法を用いて解析精度を高めた解析装置を提供することを目的とする。
このような目的を達成するため、請求項１または請求項５にそれぞれ記載の解析装置または補正方法は、異なる条件の細胞から得られた被検査物質の２群にそれぞれ異なる２種類の標識を付し、多種類の既知の選択結合性物質を整列固定化した担体に当該被検査物質を接触させ、上記選択結合性物質に対する上記被検査物質の選択的結合量を上記標識の検出強度値として測定することにより得られる、上記選択的結合量の上記２群間における差異を検査する、少なくとも記憶装置と制御装置とを備えた解析装置、または当該解析装置において実行される方法であって、上記記憶装置は、上記選択結合性物質毎に上記検出強度値を記憶する検出強度記憶手段を備え、上記制御装置は、上記検出強度記憶手段に記憶された上記検出強度値に基づいて、下記の数式１および数式２を用いて、上記２群間における対数比Ｍ（ｋ）と対数幾何平均Ａ（ｋ）とに変換する対数変換手段（ステップ）と、上記対数幾何平均に依存した上記対数比の偏り誤差を、上記２群間において存在比が同一である上記被検査物質に係る上記対数比および上記対数幾何平均の集合について下記の数式３に基づく多項式回帰分析を行うことにより、推定する誤差推定手段（ステップ）と、上記誤差推定手段（ステップ）によって推定された上記偏り誤差を、上記選択結合性物質毎の上記対数比から減ずることにより補正対数比を導出する対数比補正手段（ステップ）と、を備えた（含む）ことを特徴とする。
Ｍ（ｋ）＝ｌｏｇ2（Ｃ1k／Ｃ2k） ・・・（数式１）
Ａ（ｋ）＝ｌｏｇ2（Ｃ1k・Ｃ2k）0.5 ・・・（数式２）
（ここで、ｋは任意の上記選択結合性物質を表し、Ｃ1kおよびＣ2kは、それぞれ異なる上記２種類の標識の上記検出強度値である。）
ｙ＝ａ0＋ａ1ｘ＋ａ2ｘ2＋ａ3ｘ3＋ ・・・ａnｘn＋ｅ ・・・（数式３）
（ここで、ｘは説明変数であり、ｙは目的変数であり、ａは定数であり、ｅは残差である。）
この発明によれば、記憶装置は、選択結合性物質毎に検出強度値を記憶し、制御装置は、記憶された検出強度値に基づいて、数式１および数式２を用いて、２群間における対数比Ｍ（ｋ）と対数幾何平均Ａ（ｋ）とに変換し、対数幾何平均に依存した対数比の偏り誤差を、２群間において存在比が同一である被検査物質に係る対数比および対数幾何平均の集合について数式３に基づく多項式回帰分析を行うことにより、推定し、推定された偏り誤差を、選択結合性物質毎の対数比から減ずることにより補正対数比を導出するので、生物学的差異と偏り誤差により生ずる非生物学差異を分離することができ、解析装置の解析精度を高めることができる。すなわち、本発明によれば、多項式回帰分析を用いるのでデータに対するあてはまり具合がよく、精度よい偏り誤差の推定を行うことができるという作用を奏する。また、多項式回帰は、局所回帰ではないためウィンドウサイズ（データポイント数）の影響を受け難いという作用を奏する。また、本発明によれば、２群間において存在比が同一である被検査物質のみのデータを回帰分析のために用いるので、ウィンドウサイズが小さい場合であっても、生物学的差異を偏り誤差等の非生物学的差異とみなすことがなく、偏り誤差等の非生物学的差異を補正により効率よくデータから除去することができるという作用を奏する。上記これらの作用により、本発明は、解析結果の精度を向上させることができるという効果を奏する。
また、請求項２に記載の解析装置は、請求項１に記載の解析装置において、上記誤差推定手段は、（Ａ）上記目的変数との相関係数が最も大きい上記説明変数から重回帰式に取り入れていき、予測精度の改善がみられる間、この操作を繰り返す変数増加法、（Ｂ）最初に全ての上記説明変数を含む上記重回帰式を構成した上で、予測に有効ではない上記説明変数を除去していき、上記予測精度の低下が一定限度以内である間、この操作を繰り返す変数減少法、（Ｃ）上記目的変数との上記相関係数が最も大きい上記説明変数から上記重回帰式に取り入れた後に、予測に有効ではない上記説明変数を除去する変数増減法、（Ｄ）最初に全ての上記説明変数を含む上記重回帰式を構成した上で、それまでに上記重回帰式に取り入れられている上記説明変数の中から最も予測に有効でない上記説明変数を除き、取り入れられていない上記説明変数の中で予測に有効な上記説明変数を取り入れる変数減増法、のいずれかを用いて上記重回帰式を生成する回帰式生成手段、を更に備えたこと特徴とする。
この発明によれば、上記発明において更に、（Ａ）変数増加法、（Ｂ）変数減少法、（Ｃ）変数増減法、（Ｄ）変数減増法、のいずれかを用いて重回帰式を生成するので、不必要に説明変数を増加させることなく、最適な重回帰式を生成することができる。
また、請求項３に記載の解析装置は、請求項１または２に記載の解析装置において、上記誤差推定手段は、上記１多項式回帰分析において、上記対数変換手段によって変換された上記対数比に対する回帰のあてはまり具合を、（Ｅ）下記の数式４に基づいて求める赤池情報量規準ＡＩＣによって評価する評価法、（Ｆ）下記の数式５に基づいて求める自由度調整済み決定係数Ｒ2によって評価する評価法、（Ｇ）下記の数式６に基づいて求めるマローズのＣｐによって評価する評価法、のいずれかの評価法によって評価する回帰式評価手段、を更に備えたことを特徴とする。
ＡＩＣ＝−２Ｌｎ（Ｌ）＋２ｓ ・・・（数式４）
（ここで、Ｌは最大尤度であり、ｓは自由パラメータの数である。）
Ｒ2＝１−[｛Ｓｅ／（Ｎ−ｐ−１）｝／｛Ｓｔ−（Ｎ−１）｝] ・・・（数式５）
（ここで、Ｓｅは残差平方和であり、Ｓｔは総平方和であり、Ｎはデータ数であり、ｐは自由度である。）
Ｃｐ＝Ｓｅ／σ2−２（ｐ＋１）−Ｎ ・・・（数式６）
（ここで、Ｓｅは上記残差平方和であり、Ｎは上記データ数であり、ｐは上記自由度であり、σは誤差分散の推定値である。）
この発明によれば、上記発明において更に、多項式回帰分析において、変換された対数比に対する回帰のあてはまり具合を、（Ｅ）赤池情報量規準ＡＩＣによって評価する評価法、（Ｆ）自由度調整済み決定係数Ｒ2によって評価する評価法、（Ｇ）マローズのＣｐによって評価する評価法、のいずれかの評価法によって評価するので、対数比に対する回帰のあてはまり具合を適切に評価することができる。
また、請求項４に記載の解析装置は、請求項１乃至３のいずれか一つに記載の解析装置において、上記被検査物質は、上記細胞から抽出したＲＮＡから合成したｃＤＮＡまたはａＲＮＡであり、上記標識は、蛍光物質であり、上記選択結合性物質は、ＤＮＡ断片であり、上記担体上には、疾患の罹患の有無や程度によって発現変動することが期待される目的遺伝子と、発現変動が少ない対照遺伝子と、を検出するための上記ＤＮＡ断片が配置されていること、を特徴とする。
この発明によれば、上記発明において、被検査物質は、細胞から抽出したＲＮＡから合成したｃＤＮＡまたはａＲＮＡであり、標識は、蛍光物質であり、選択結合性物質は、ＤＮＡ断片であり、担体上には、疾患の罹患の有無や程度によって発現変動することが期待される目的遺伝子と、発現変動が少ない対照遺伝子と、を検出するためのＤＮＡ断片が配置されているので、疾患の罹患の有無や程度を検出することができる。
この発明によれば、マイクロアレイ実験等から得られるデータから、回帰分析を用いた補正手段により偏り誤差を推測するので、生物学的差異と偏り誤差により生ずる非生物学的差異を分離することができ、解析精度を高めた解析装置を提供することができる。
以下に、本発明にかかる本解析装置および本補正方法の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。特に、本実施の形態として、本解析装置を疾患関連遺伝子の発現変動を検査する目的で用いた場合を例として示す場合があるが、本発明はこれに限定されるものではない。
［本発明の概要］
以下、本発明の概要について説明し、その後、本発明の構成および処理等について図３〜図５を参照しながら、詳細に説明する。図３は、ＭＡプロットの例を表す図である。図４は、本発明の基本原理である補正方法を説明する概念図である。図５は、本発明の本実施の形態により補正されたＭＡプロットの例を表す図である。
本発明は、概略的に、以下の基本的特徴を有する。すなわち、本発明は、異なる条件の細胞から得られた被検査物質の２群にそれぞれ異なる２種類の標識を付し、多種類の既知の選択結合性物質を整列固定化した担体に被検査物質を接触させ、選択結合性物質に対する被検査物質の選択的結合量を標識の検出強度値として測定することにより得られる、選択的結合量の２群間における差異を検査する解析装置であって、少なくとも記憶装置と制御装置とを備える。
ここで、「被検査物質」とは、細胞から直接・間接的に得られる試料のことであり、例えば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ａＲＮＡ（ｃＤＮＡまたはその相補配列を鋳型として増幅されたＲＮＡ）、タンパク質、糖鎖、脂質などである。また、「標識」とは、検出手段によって検出することができる物質のことであり、「異なる２種類の標識」とは、例えば、蛍光物質であるＣｙ３とＣｙ５の組み合わせ等である。また、「選択結合性物質」とは、ある物質と選択的に結合する物質のことであり、例えば、ＤＮＡに対するＤＮＡ、ＤＮＡに対するＲＮＡ、抗原に対する抗体、化学物質に対する酵素などである。
また、異なる２種類の標識を付して２群間における差異を検査する手法とは、例えば、具体的には、二蛍光標識法等が挙げられる。すなわち、二蛍光標識法は、「異なる条件の細胞から得られた被検査物質」として２種類の細胞（例えば、正常細胞とガン細胞）から抽出されたＲＮＡより合成されたｃＤＮＡまたはａＲＮＡを用い、「異なる２種類の標識」として例えばＣｙ３とＣｙ５の蛍光物質を用いる。そして、ＤＮＡマイクロアレイ担体上で蛍光標識したｃＤＮＡまたはａＲＮＡを競合的にハイブリダイゼーションさせ、それぞれの蛍光の励起波長に応じて各々蛍光強度値を測定し、蛍光強度値を定量・比較することによって、異なる条件の細胞における各遺伝子発現量の差異に関する情報を得る手法である。
つぎに、本発明は、選択結合性物質毎に検出強度値を記憶する。
つづいて、本発明は、記憶された検出強度値に基づいて、下記の数式１および数式２を用いて、２群間における対数比Ｍ（ｋ）と対数幾何平均Ａ（ｋ）とに変換する。
Ｍ（ｋ）＝ｌｏｇ2（Ｃ1k／Ｃ2k） ・・・（数式１）
Ａ（ｋ）＝ｌｏｇ2（Ｃ1k・Ｃ2k）0.5 ・・・（数式２）
ここで、ｋは任意の選択結合性物質を表し、Ｃ1kおよびＣ2kは、それぞれ異なる２種類の標識の検出強度値である。
ここで、横軸に対数比Ａ、縦軸に対数幾何平均Ｍのプロットを作成した場合、図３に示すように、対数幾何平均Ａに依存して対数比Ｍの偏り誤差が発生していることがわかる。そこで、つぎに本発明は、偏り誤差を予測し補正する。
すなわち、本発明は、対数幾何平均に依存した対数比の偏り誤差を、２群間において存在比が同一である被検査物質に係る対数比および対数幾何平均の集合について下記の数式３に基づく多項式回帰分析を行うことにより、推定する。
ｙ＝ａ0＋ａ1ｘ＋ａ2ｘ2＋ａ3ｘ3＋ ・・・ａnｘn＋ｅ ・・・（数式３）
ここで、ｘは説明変数であり、ｙは目的変数であり、ａは定数であり、ｅは残差である。
ここで、図４で示すように、２群間で存在比が同一である対照となる選択結合性物質（（具体的には、対照遺伝子等）図中で三角で表す）に係る対数比と対数幾何平均の集合から、図４に概念的に示すように（矢印の先の点線枠内）、多項式回帰分析を行い、多項式回帰式(図４プロット内に点線の曲線で表す）を作成する。
最後に、本発明は、推定された偏り誤差を、選択結合性物質毎の対数比から減ずることにより補正対数比を導出する。図５で示すように、多項式回帰方程式により推定された偏り誤差をＭ（対数比）から減ずるので、図５において多項式回帰曲線はｘ軸に並行（ｙ＝a（定数））となる。
以上が本発明の概要である。これにより、マイクロアレイ実験等から得られるデータから、回帰分析を用いて補正するので、生物学的差異と偏り誤差により生ずる非生物学的差異を分離することができ、解析精度を高めることができる。
ここで、多項式回帰分析においては、（Ａ）変数増加法、（Ｂ）変数減少法、（Ｃ）変数増減法、（Ｄ）変数減増法、のいずれかを用いて重回帰式を生成してもよい。さらに、多項式回帰分析において、対数比に対する回帰のあてはまり具合を、（Ｅ）赤池情報量規準によって評価する評価法、（Ｆ）自由度調整済み決定係数によって評価する評価法、（Ｇ）マローズのＣｐによって評価する評価法、のいずれかの評価法によって評価してもよい。
また、ここで、被検査物質は、細胞から抽出したＲＮＡから合成したｃＤＮＡまたはａＲＮＡであり、標識は、蛍光物質であり、選択結合性物質は、ＤＮＡ断片であり、担体上には、疾患の罹患の有無や程度によって発現変動することが期待される目的遺伝子と、発現変動が少ない対照遺伝子と、を検出するためのＤＮＡ断片を配置してもよい。すなわち、本解析装置は、対照遺伝子の対数比と対数幾何平均に基づいて偏り誤差を推定し、目的遺伝子の補正対数比に基づいて、疾患の罹患の有無や程度を検出するよう構成してもよい。以上で本発明の概要の説明を終える。
［本解析装置の構成］
まず、本解析装置の構成について説明する。図６は、本発明の本実施の形態が適用される本解析装置の構成の一例を示すブロック図であり、該構成のうち本発明に関係する部分のみを概念的に示している。
図６において解析装置１００は、概略的に、解析装置１００の全体を統括的に制御するＣＰＵ等の制御装置１０２、通信回線等に接続されるルータ等の通信装置（図示せず）に接続される通信制御インターフェース部１０４、入力装置１１２や出力装置１１４に接続される入出力制御インターフェース部１０８、および、各種のデータベースやテーブルなどを格納する記憶装置１０６を備えて構成されており、これら各部は任意の通信路を介して通信可能に接続されている。ここで解析装置１００は、図６に示すように、ルータ等の通信装置および専用線等の有線または無線の通信回線を介して、ネットワーク３００に接続されていてもよい。
記憶装置１０６に格納される各種のデータベースやテーブル（検出強度ファイル１０６ａ〜配置ファイル１０６ｃ）は、固定ディスク装置等のストレージ手段であり、各種処理に用いる各種のプログラムやテーブルやファイルやデータベースやウェブページ等を格納する。
これら記憶装置１０６の各構成要素のうち、検出強度ファイル１０６ａは、選択結合性物質毎に検出強度値を記憶する検出強度記憶手段である。すなわち、検出強度ファイル１０６ａは、異なる条件の細胞から得られた被検査物質の２群にそれぞれ異なる２種類の標識を付し、多種類の既知の選択結合性物質を整列固定化した担体に標識を付した被検査物質を接触させ、選択結合性物質に対する被検査物質の選択的結合量として測定された標識の検出強度値を記憶する。例えば、二蛍光標識法において、蛍光色素としてＣｙ３（緑）とＣｙ５（赤）を用いた場合、検出強度ファイル１０６ａは、選択結合性物質毎に蛍光強度測定器等によって測定された各励起波長（緑・赤）の蛍光強度値を記憶する。
また、補正対数比ファイル１０６ｂは、誤差推定部１０２ｂによって推定された偏り誤差を、選択結合性物質毎の対数比から減ずることにより導出された補正対数比を記憶する補正対数比記憶手段である。
また、配置ファイル１０６ｃは、担体上の選択結合性物質の配置を記憶する配置記憶手段である。例えば、特定疾患専用のマイクロアレイを担体として用いた場合、配置ファイル１０６ｃは、担体上の特定疾患に関連する目的遺伝子や、特定疾患の有無・程度にかかわらず発現変動がない対照遺伝子を検出する選択結合性物質の配置を記憶する。すなわち、具体的には、一枚のバイオチップには、４ブロックあり、１ブロックあたり６４（８ｘ８）スポット、合計２５６遺伝子の発現パターンを検出することができる担体（バイオチップ）を用いたとすると、配置ファイル１０６ｃは、個々の遺伝子に対応する選択結合性物質（ＤＮＡ断片等）が配置された位置（ブロック番号とスポット座標（ｘ−ｙ））をその遺伝子名と対応付けて記憶する。
また、図６において、入出力制御インターフェース部１０８は、入力装置１１２や出力装置１１４の制御を行う。ここで、出力装置１１４としては、モニタ（家庭用テレビを含む）の他、プリンタ、記録媒体出力装置等を用いることができる。また、入力装置１１２としては、キーボード、マウス等の他、バーコードリーダーや蛍光検出装置等を用いることができる。
また、図６において、制御装置１０２は、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）等の制御プログラム、各種の処理手順等を規定したプログラム、および所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラム等により、種々の処理を実行するための情報処理を行う。制御装置１０２は、機能概念的に、対数変換部１０２ａ、誤差推定部１０２ｂ、対数比補正部１０２ｅ、疾患検出部１０２ｆ、出力部１０２ｇを備えて構成されている。
このうち、対数変換部１０２ａは、検出強度ファイル１０６ａに記憶された検出強度値に基づいて、下記の数式１および数式２を用いて、２群間における対数比Ｍ（ｋ）と対数幾何平均Ａ（ｋ）とに変換する対数変換手段である。
Ｍ（ｋ）＝ｌｏｇ2（Ｃ1k／Ｃ2k） ・・・（数式１）
Ａ（ｋ）＝ｌｏｇ2（Ｃ1k・Ｃ2k）0.5 ・・・（数式２）
ここで、ｋは任意の選択結合性物質を表し、Ｃ1kおよびＣ2kは、それぞれ異なる２種類の標識の検出強度値である。
また、誤差推定部１０２ｂは、対数幾何平均に依存した対数比の偏り誤差を、２群間において存在比が同一である被検査物質に係る対数比および対数幾何平均の集合について数式３に基づく多項式回帰分析を行うことにより、推定する誤差推定手段である。
ｙ＝ａ0＋ａ1ｘ＋ａ2ｘ2＋ａ3ｘ3＋ ・・・ａnｘn＋ｅ ・・・（数式３）
ここで、ｘは説明変数であり、ｙは目的変数であり、ａは定数であり、ｅは残差である。
ここで、図６に示すように、誤差推定部１０２ｂは、回帰式生成部１０２ｃ、評価部１０２ｄを備えて構成される。このうち、回帰式生成部１０２ｃは、（Ａ）変数増加法、（Ｂ）変数減少法、（Ｃ）変数増減法、（Ｄ）変数減増法、のいずれかを用いて回帰式を生成する回帰式生成手段である。また、評価部１０２ｄは、回帰のあてはまり具合を、（Ｅ）赤池情報量規準によって評価する評価法、（Ｆ）自由度調整済み決定係数によって評価する評価法、（Ｇ）マローズのＣｐによって評価する評価法、のいずれかの評価法によって評価する回帰式評価手段である。
また、図６に示すように、対数比補正部１０２ｅは、誤差推定部１０２ｂによって推定された偏り誤差を、対数比から減ずることにより補正された補正対数比を導出する対数比補正手段である。ここで、対数比補正部１０２ｅは、導出された補正対数比を補正対数比ファイル１０６ｂに格納するよう構成してもよい。
また、図６に示すように、疾患検出部１０２ｆは、補正対数比ファイル１０６ｂに格納された、疾患に関連した目的遺伝子を検出するＤＮＡ断片についての補正対数比を、所定の指標値と対比して、疾患の罹患の有無もしくは程度を検出する疾患検出手段である。
また、出力部１０２ｇは、補正対数比ファイル１０６ｂに格納された補正対数比を出力装置１１４等に出力する出力手段である。ここで、出力部１０２ｇは、疾患検出部１０２ｆの処理により検出された疾患の罹患の有無もしくは程度を出力してもよい。また、ここで、制御装置１０２は、出力部１０２ｇの処理により、入出力制御インターフェース部１０８を制御して、補正対数比を出力装置１１４に出力してもよい。また、出力部１０２ｇは、出力装置１１４として、モニタに出力することに限られず、プリンタや、記録媒体出力装置を介して記録媒体等に出力してもよい。また、出力部１０２ｇは、通信制御インターフェース１０４を制御して、ネットワーク３００を介して、外部システム２００の外部データベース等の外部記憶装置に出力してもよい。
また、図６において、通信制御インターフェース部１０４は、解析装置１００とネットワーク３００（またはルータ等の通信装置）との間における通信制御を行う。すなわち、通信制御インターフェース部１０４は、他の端末と通信回線を介してデータを通信する機能を有する。
また、図６に示すように、本実施の形態における本解析システムは、概略的に解析装置１００と、疾患に関連する目的遺伝子を検出するマイクロアレイの配置データ等に関する外部データベースや外部プログラム等を提供する外部システム２００とを、ネットワーク３００を介して通信可能に接続して構成されてもよい。
すなわち、図６において、ネットワーク３００は、解析装置１００と外部システム２００とを相互に接続する機能を有し、例えば、インターネット等である。
また、図６において、外部システム２００は、ネットワーク３００を介して、解析装置１００と相互に接続され、利用者に対して疾患に関連する目的遺伝子を検出するマイクロアレイの配置データ等に関する外部データベースや外部プログラム等を実行するウェブサイトを提供する機能を有する。
また、ここで、外部システム２００は、ＷＥＢサーバやＡＳＰサーバ等として構成していてもよく、そのハードウェア構成は、一般に市販されるワークステーション、パーソナルコンピュータ等の情報処理装置およびその付属装置により構成していてもよい。また、外部システム２００の各機能は、外部システム２００のハードウェア構成中のＣＰＵ、ディスク装置、メモリ装置、入力装置、出力装置、通信制御装置等およびそれらを制御するプログラム等により実現される。
また、図６において、解析装置１００の利用者は、ネットワーク３００を介して、外部システム２００が提供するバイオチップに関する検出強度データベースや、遺伝子配置データベース等の外部データベース、または検査プログラム等の外部プログラムを提供するウェブサイトにアクセスすることによって検出強度値データ、配置データ、解析プログラム、補正プログラム等を入手するようにしてもよい。これにて、本解析装置の構成の説明を終える。
［本解析装置の処理］
次に、このように構成された本実施の形態における本解析装置の処理の一例について、以下に図６および図７を参照しながら詳細に説明する。図７は、本実施の形態における本解析装置１００の補正処理の一例を示すフローチャートである。
まず、図７に示すように本解析装置１００において、制御装置１０２は、検出強度ファイル１０６ａに記憶された検出強度値を読み込む（ステップＳＢ−１）。ここで、検出強度値データは、入出力制御インターフェース部１０８を介して、検出装置によって検出された検出強度値データを格納した外部記録媒体から、読み込んでもよい。また、標識の検出装置から直接入力される場合に限らず、検出強度値データは、ネットワーク３００を介して、外部システム２００の外部データベース等から取得してもよく、また、ネットワーク３００を介して検出装置を制御することにより、検出強度値データを取得してもよい。
つぎに、本解析装置１００において、制御装置１０２は、検出強度値からバックグラウンド値を減算する（ステップＳＢ−２）。例えば、全く結合対象となる被検査物質がないプローブ等を選択結合性物質として用いて担体に固着させ、当該プローブを配置した部分の検出強度値をバックグラウンド値として減ずるように構成してもよい。
つづいて、本解析装置１００において、制御装置１０２は、対数変換部１０２ａの処理により、検出強度ファイル１０６ａに記憶された（バックグラウンドを除去した）検出強度値に基づいて、下記の数式１および数式２を用いて、２群間における対数比Ｍ（ｋ）と対数幾何平均Ａ（ｋ）とに変換する（ステップＳＢ−３）。
Ｍ（ｋ）＝ｌｏｇ2（Ｃ1k／Ｃ2k） ・・・（数式１）
Ａ（ｋ）＝ｌｏｇ2（Ｃ1k・Ｃ2k）0.5 ・・・（数式２）
ここで、ｋは任意の選択結合性物質を表し、Ｃ1kおよびＣ2kは、それぞれ異なる２種類の標識の検出強度値である。
ここまでの本実施の形態に係る補正処理の流れは、「背景技術」で示した従来法における補正処理と同一である。以下の処理では、本実施の形態では、目的遺伝子などの検査対象となる２群間で存在比が同一である被検査物質において、対数幾何平均に対する対数比で表される差異を、非生物学的要因によるものと考える。また、本実施の形態にかかる補正処理方法は、局所回帰ではないためウィンドウサイズの影響を受けず、検査対象となる被検査物質における偏り誤差は、多項式曲線上で内挿もしくは補外することにより求めることができる。
つづいて、本解析装置１００において、制御装置１０２は、誤差推定部１０２ｂの処理により、対数幾何平均に依存した対数比の偏り誤差を推定するため、２群間において存在比が同一である被検査物質に係る対数比および対数幾何平均を抽出する（ステップＳＢ−４）。
つぎに、本解析装置１００において、制御装置１０２は、誤差推定部１０２ｂの処理により、抽出した集合について下記の数式３に基づく多項式回帰分析を行う（ステップＳＢ−５）。
ｙ＝ａ0＋ａ1ｘ＋ａ2ｘ2＋ａ3ｘ3＋ ・・・ａnｘn＋ｅ ・・・（数式３）
ここで、ｘは説明変数であり、ｙは目的変数であり、ａは定数であり、ｅは残差である。
ここで、制御装置１０２は、回帰式生成部１０２ｃの処理により、下記の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかを用いて多項式回帰式を生成する（ステップＳＢ−５）。
（Ａ）目的変数との相関係数が最も大きい説明変数から重回帰式に取り入れていき、予測精度の改善がみられる間、この操作を繰り返す変数増加法。
（Ｂ）最初に全ての説明変数を含む重回帰式を構成した上で、予測に有効ではない説明変数を除去していき、予測精度の低下が一定限度以内である間、この操作を繰り返す変数減少法。
（Ｃ）目的変数との相関係数が最も大きい説明変数から重回帰式に取り入れた後に、予測に有効ではない説明変数を除去する変数増減法。
（Ｄ）最初に全ての説明変数を含む重回帰式を構成した上で、それまでに重回帰式に取り入れられている説明変数の中から最も予測に有効でない説明変数を除き、取り入れられていない説明変数の中で予測に有効な説明変数を取り入れる変数減増法。
つづいて、本解析装置１００において、制御装置１０２は、評価部１０２ｄの処理により、多項式回帰分析において、下記の（Ｅ）〜（Ｇ）のいずれかの評価法によって評価値を算出し、算出した評価値を所定の基準値と比較して、対数比に対する回帰のあてはまり具合を評価する（ステップＳＢ−６）。
（Ｅ）下記の数式４に基づいて求める赤池情報量規準ＡＩＣによって評価する評価法。
ＡＩＣ＝−２Ｌｎ（Ｌ）＋２ｓ ・・・（数式４）
ここで、Ｌは最大尤度であり、ｓは自由パラメータの数である。
（Ｆ）下記の数式５に基づいて求める自由度調整済み決定係数Ｒ2によって評価する評価法。
Ｒ2＝１−[｛Ｓｅ／（Ｎ−ｐ−１）｝／｛Ｓｔ−（Ｎ−１）｝] ・・・（数式５）
ここで、Ｓｅは残差平方和であり、Ｓｔは総平方和であり、Ｎはデータ数であり、ｐは自由度である。
（Ｇ）下記の数式６に基づいて求めるマローズのＣｐによって評価する評価法。
Ｃｐ＝Ｓｅ／σ2−２（ｐ＋１）−Ｎ ・・・（数式６）
ここで、Ｓｅは残差平方和であり、Ｎはデータ数であり、ｐは自由度であり、σは誤差分散の推定値である。
そして、本解析装置１００において、制御装置１０２は、上記評価に基づいて、誤差推定部１０２ｂの処理により、多項式回帰式の次数を決定し、多項式回帰式を導出する（ステップＳＢ−７）。
さらに、本解析装置１００において、制御装置１０２は、誤差推定部１０２ｂの処理により、導出した多項式回帰式を用いて、各選択結合性物質について、偏り誤差を推定する（ステップＳＢ−８）。すなわち、偏り誤差は、多項式曲線上で内挿もしくは補外することにより求めることができる。
最後に、本解析装置１００において、制御装置１０２は、対数比補正部１０２ｅの処理により、各選択結合性物質の対数比から推定された偏り誤差を減算して、補正対数比を求める（ステップＳＢ−９）。ここで、制御装置１０２は、対数比補正部１０２ｅの処理により、求めた補正対数比を補正対数比ファイル１０６ｂに格納してもよい。また、ここで、制御装置１０２は、出力部１０２ｇの処理により、入出力制御インターフェース部１０８を制御して、補正対数比を出力装置１１４に出力してもよい。また、出力部１０２ｇは、出力装置１１４として、モニタに出力することに限られず、プリンタ等の印刷装置に出力してもよく、記録媒体等に出力してもよい。さらに、出力部１０２ｇは、通信制御インターフェース１０４を制御して、ネットワーク３００を介して、外部システム２００の外部データベース等の外部記憶装置に出力するよう構成してもよい。
これにて、本解析装置１００の補正処理の説明を終了する。以上の補正処理を行うことにより、従来法の補正方法と比べて、ウィンドウサイズを小さくしても、２群間で存在比が同一の対照用選択結合性物質について誤差推定のための回帰分析をするので、生物学的差異と偏り誤差により生ずる非生物学的差異を十分に分離することができ、解析精度の向上を図ることができる。
[実施例]
本解析装置を食道ガン診断用ＤＮＡチップの解析装置として用いた場合の実施例を、以下に[ＤＮＡマイクロアレイの作成]、[ターゲットｃＤＮＡの調製]、[ハイブリダイゼーション]、[遺伝子発現量の測定]、[診断用遺伝子変動の検出]の順で、図６および図８〜図１２を参照しながら説明する。
まず、本実施の形態に係る本実施例の概要を説明する。本実施例は、「異なる条件の細胞」として、正常細胞と食道ガン細胞を用い、「被検査物質」としてｃＤＮＡを用いる。そして、ｃＤＮＡ合成時において、「標識」として蛍光物質で標識する。また、「選択結合性物質」としてＤＮＡ断片を担体に整列固定化し、ＤＮＡマイクロアレイを作成する。そして、ＤＮＡマイクロアレイ上のＤＮＡ断片とｃＤＮＡをハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション量（選択的結合量）を蛍光強度値として検出する。そして、本実施の形態における本実施例の本解析装置は、２種類の蛍光物質による蛍光強度値のデータから、対数比と対数幾何平均を求め、偏り誤差を推測し補正する。最後に、補正した対数比から、食道ガンの有無や程度を検査する。
すなわち、本実施の形態に係る本実施例は、基板（担体）上に多数の既知遺伝子ＤＮＡ断片（既知の選択結合性物質）を高密度に整列固定化し、蛍光色素（標識）で各々標識した異なる２条件の研究対象細胞の遺伝子をハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション量（選択的結合量）を蛍光強度値（検出強度値）として測定することにより得られる前記既知遺伝子の前記２条件間の発現変動（差異）を検査するシステムであって、前記既知遺伝子の蛍光強度データを入力する入力装置と、以下の（１）〜（３）のステップを含む前記既知遺伝子の２条件間の発現比を導出する解析装置と、前記補正された対数比Ｍ（ｋ）を出力する出力装置と、を有することを特徴とする解析システムとして構成される。
（１）ある既知遺伝子ｋについて取得された前記２条件の蛍光強度データ（Ｃｙ５k，Ｃｙ３k）から、以下の数式１を用いて対数比Ｍ（ｋ）と対数幾何平均Ａ（ｋ）とに変換するステップ、（２）既知遺伝子全てについて２次元にプロットした（Ａ（ｋ），Ｍ（ｋ））について、Ａ（ｋ）に依存したＭ（ｋ）の偏り誤差を、既知遺伝子のうち上記２条件間で発現に差異がみられないことが知られている遺伝子群を用いて、数式３に基づく多項式回帰によって、推定するステップ、（３）全遺伝子に対して推定された偏り誤差を減ずることにより、補正された対数比Ｍ（ｋ）を導出するステップ。
Ｍ（ｋ）＝ｌｏｇ2（Ｃy3k／Ｃy5k） ・・・（数式１）
Ａ（ｋ）＝ｌｏｇ2（Ｃy5k・Ｃy3k）0.5 ・・・（数式２）
ｙ＝ａ0＋ａ1ｘ＋ａ2ｘ2＋ａ3ｘ3＋ ・・・ａnｘn＋ｅ ・・・（数式３）
（ここで、ｘは説明変数であり、ｙは目的変数であり、ａは定数であり、ｅは残差である。）
以上で、本実施例の概要の説明を終える。
［ＤＮＡマイクロアレイの作成］
食道ガンの診断用候補遺伝子１５３種および、ヒトの多くの組織で発現変動がない（定常発現）と考えられる対照遺伝子１０７種について、配列の重複をおこさないように配列特異性が高い部位のＤＮＡ配列６０〜７０残基をそれぞれ選択して合成した。これらの合成オリゴＤＮＡを、凹凸構造を持つポリメチルメタクリレート製ＤＮＡチップ基板（３Ｄ−Ｇｅｎｅ（商品名）、製造販売 東レ株式会社（会社名）、特開２００４−２６４２８９参照）の凸部にスポッターを用いてスポットした。ここで、一枚のチップ上には４ブロックあり、１ブロックあたり６４（８ｘ８）スポット、合計２５６遺伝子の発現パターンを検出することができる。
［ターゲットｃＤＮＡの調製］
試料として食道ガン患者の食道組織における食道ガン病変部の組織を用いた。おのおのの組織から、Ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（会社名））を用いて、東レ社（会社名）推奨のプロトコールによりｔｏｔａｌＲＮＡを調製した。
上述の方法で得られたｔｏｔａｌＲＮＡ １μgについて、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマー及びランダムノナマーを併用し、ＣｙＳｃｒｉｂｅ Ｆｉｒｓｔ-Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（商品名）（製造販売 ＧＥヘルスケア社（会社名））を用いてメーカー推奨のプロトコールで逆転写反応を行った。食道ガン組織由来のｔｏｔａｌＲＮＡにはＣｙ３−ｄＵＴＰ（製造販売 ＧＥヘルスケア社（会社名））を、ヒトリファレンスｔｏｔａｌＲＮＡ（製造販売 Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（会社名））にはＣｙ５−ｄＵＴＰ（製造販売 ＧＥヘルスケア社（会社名））を添加して、各社推奨のプロトコールで逆転写反応時にｃＤＮＡの標識を行った。標識されたｃＤＮＡはＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名）（製造販売 ＱＩＡＧＥＮ社（会社名））で精製してからハイブリダイズに用いた。
［ハイブリダイゼーション］
標識したｃＤＮＡ０．１μgと上記のＤＮＡチップを用い、４２℃で１６時間ハイブリダイズを行った。ハイブリダイズ終了後、ＤＮＡチップを３ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、１ｘＳＳＣ、０．１ｘＳＳＣで順次洗浄した。
［遺伝子発現量の測定］
上述の方法により、ハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡチップをＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイスキャナー（商品名）（製造販売 Ａｇｉｌｅｎｔ社（会社名））を用いてスキャンした。ヒトリファレンスｔｏｔａｌＲＮＡ由来のｃＤＮＡのハイブリダイゼーション量は、ｃＤＮＡがＣｙ５で標識されているため、蛍光物質Ｃｙ５の励起波長を選択的に透過するチャンネル１で測定され、Ｃｙ５の蛍光強度値として数値化される。一方、食道ガン組織ｔｏｔａｌＲＮＡ由来のｃＤＮＡのハイブリダイゼーション量は、ｃＤＮＡがＣｙ３で標識されているため、蛍光物質Ｃｙ３の励起波長を選択的に透過するチャンネル２で測定され、Ｃｙ３の蛍光強度値として数値化される。数値化された蛍光強度値は、入力装置１１２等を介して、本実施の形態に係る本実施例の本解析装置１００の検出強度ファイル１０６ａに格納される。
つぎに、異なる２条件の組織検体（癌組織、非癌組織）における遺伝子発現比較を行うため、二色蛍光法で得られた実験結果を図８および図９に示す。ここで、図８は、食道ガン診断用ＤＮＡチップに搭載された２５６遺伝子について、チャンネル１で測定されたＣｙ５の蛍光強度値を表すプロット図である。また、図９は、食道ガン診断用ＤＮＡチップに搭載された２５６遺伝子について、チャンネル２で測定されたＣｙ３の蛍光強度値を表すプロット図を示す。すなわち、図８はチャンネル１（Ｃｙ５側）によって得られた非癌組織における遺伝子発現強度を示し、図９はチャンネル２（Ｃｙ３側）によって得られた癌組織における遺伝子発現強度を示している。
つづいて、食道ガン組織由来ｔｏｔａｌＲＮＡの遺伝子発現パターンと、ヒトリファレンスｔｏｔａｌＲＮＡにおける遺伝子発現パターンの差を考察するために、対数変換部１０２ａは、各遺伝子について、それぞれの蛍光強度値から対数幾何平均Ａおよび対数比（以下「発現強度比」という）Ｍを算出した。ある遺伝子ｇiのチャンネル１、２の蛍光強度値をそれぞれＩred,i、Ｉgreen,iとすると、ＡiおよびＭiはＡi = 0.5 x log2(Ｉgreen,i x Ｉred,i)、Ｍi = log2(Igreen,i / Ired, i)と定義される（数式１および数式２）。
ここで、図１０は、食道ガン組織ｔｏｔａｌＲＮＡとヒトリファレンスｔｏｔａｌＲＮＡを食道ガン診断用ＤＮＡチップに適用した時の補正前のＭＡプロット図である。すなわち、図１０は、Ａ値（両チャンネルの平均発現強度値）を横軸、Ｍ値（チャンネル１に対するチャンネル２の発現強度比）を縦軸にとった散布図であり、遺伝子全体の発現変動を視覚的に表現する。図中において、黒丸は対照遺伝子データを示し、白抜きの四角は食道ガン組織において発現変動が期待される目的遺伝子を示す。図１０に示すように、平均発現強度値Ａが弱いところほどチャンネル２の強度が高くなる傾向が認められる。すなわちＭＡプロットからＡ値に依存した系統的なＭ値の変動すなわち偏り誤差が認められる。この偏り誤差は、蛍光色素Ｃｙ３とＣｙ５の感度の違いにより生じたもので、本来は発現差の少ない遺伝子に発現差があるようにみえることになるため、真の発現強度比Ｍの検査を妨げるものである。したがって、補正処理を行って偏り誤差を取り除く必要がある。
［診断用遺伝子変動の検出］
まず、従来技術を用いた補正処理による遺伝子変動の検出結果について図１１を参照しながら説明し、その後、本実施の形態における本実施例の補正処理よる遺伝子変動の検出結果について図１２を参照しながら説明を行う。図１１は、従来法を用いて、対数幾何平均Ａに対する発現強度比Ｍの偏り誤差を推定し、補正を行った結果を示すＭＡプロット図である。一方、図１２は、本実施の形態にかかる本実施例による補正方法を用いて、偏り誤差を推定し、補正を行った結果を示すＭＡプロットである。なお、各ＭＡプロット図において、横軸はＡ値、縦軸はＭ値である。
従来法に則した補正方法として、偏り誤差の推定に重み付き局所回帰（ＬＯＷＥＳＳ）を用いた。すなわち、食道ガン組織ｔｏｔａｌＲＮＡとヒトリファレンスｔｏｔａｌＲＮＡを食道ガン診断用ＤＮＡチップに適用し、従来の補正方法として、重み付き局所回帰（ＬＯＷＥＳＳ法）によって補正を行った。重み関数としては、ｔｒｉｃｕｂｅ関数を用いた。また、誤差の推定をする遺伝子をｇa、領域内に含まれる他の遺伝子をｇbとし、それぞれのＡ値をＡa、Ａbとすると、散布図上の２遺伝子の距離ｄgagbは、ｄgagb=|Ａa−Ａb|となる。重み関数はこの距離に依存し、|ｄgagb|＜1のときは、Ｗ=(1-|ｄgagb|3)3とし、|ｄgagb|≧1のときはＷ=0とした。また、補正は、回帰式によって推定された各遺伝子ｇiの偏り誤差ｄｍiをＭ値から差し引くことにより行った。その結果、図１１に示すように、従来法では、全遺伝子データを用いて局所回帰を行うことによって、有意差（Ｍ≧１）がある５つの遺伝子（図中の三角）が検出された。
一方、本実施の形態にかかる本実施例では、１つの領域に含まれる遺伝子数を１０３とした。すなわち、本実施例の本解析装置１００は、誤差推定部１０２ｂの処理により、アレイに搭載されている遺伝子のうち正常組織と食道ガン組織とで遺伝子発現に変化が少ないことが分かっている対照遺伝子のみについて回帰分析を行った。なお、対照遺伝子の配置データは配置ファイル１０６ｃに記憶されており、本解析装置１００の誤差推定部１０２ｂは、配置ファイル１０６ｃを参照して１０３の対照遺伝子群のみについて回帰分析を実行する。
つぎに、本実施例の本解析装置１００は、回帰式生成部１０２ｃの処理により多項式の次数を、変数減少法を用いて選択し、評価部１０２ｄの処理により、赤池情報量規準（ＡＩＣ）を用いて評価の目安とした。その結果、本実施例では「y=2.9623−0.0233x2+0.003x3−0.0001x4」という回帰式を得た。つづいて、本解析装置１００は、対数比補正部１０２ｅの処理により、診断用の目的遺伝子ｇiの偏り誤差推定値ｄｍiを、回帰式に目的遺伝子のＡi値を代入して得た後、さらにＭ値から当該推定誤差ｄｍiを減算することにより真のＭ値を導出し補正した。図１２は、本発明の本補正方法によって補正を行った食道ガン組織ｔｏｔａｌＲＮＡとヒトリファレンスｔｏｔａｌＲＮＡを食道ガン診断用ＤＮＡチップに適用した場合のＭＡプロット図（横軸：Ａ値、縦軸：Ｍ値）である。
図１２に示すように、本実施例による補正処理後に有意差（|Ｍ|≧1）のある診断用目的遺伝子数は７個となり、従来の手法による５個（図１１参照）と比較してより検出力が高く、精度の高い補正処理が行われたことが確認できた。これは、従来法の図１１では全遺伝子の発現強度差そのものが偏り誤差としてみなされ減算補正されているのに対し、本実施例の図１２では偏り誤差だけが補正されていることに起因する。ここで、つづいて、本解析装置１００は、検出強度ファイル１０６ａに記憶された補正対数比データを用いて、疾患検出部１０２ｆの処理により、診断用の目的遺伝子の変動の検出と疾患の罹患の有無、程度を検出してもよい。
以上説明のように、本発明の本実施例によれば、従来の方法では検出できなかった変動遺伝子を検出することができ、マイクロアレイ実験等から得られるデータから、解析結果の精度を高めることができる。
［他の実施の形態］
さて、これまで本発明の実施の形態について説明したが、本発明は、上述した実施の形態以外にも、上記特許請求の範囲に記載した技術的思想の範囲内において種々の異なる実施の形態にて実施されてよいものである。
特に、本発明の実施の形態については、選択結合性物質としてＤＮＡを用いて説明したが、これに限られず、選択結合性物質には、抗体などのタンパク質ライブラリや、化合物のライブラリ等を配置してもよい。
また、ここで「担体」の材料にあっては、ガラスに限られず、メンブレンやプラスチックでもよい。
また、上述の実施の形態においては、標識として蛍光化学物質（例えばＣｙ３，Ｃｙ５）を用いたが、これに限られず、標識には、蛍光特性を持たない色素や、放射性同位体、ＧＦＰ・ＧＲＰなどのタンパク質、Ｈｉｓタグ、ビオチン化などを用いることができる。
例えば、解析装置１００がスタンドアローンの形態で処理を行う場合を一例に説明したが、解析装置１００とは別筐体で構成されるクライアント端末からの要求に応じて処理を行い、その処理結果を当該クライアント端末に返却するように構成してもよい。
また、実施の形態において説明した各処理のうち、自動的に行われるものとして説明した処理の全部または一部を手動的に行うこともでき、あるいは、手動的に行われるものとして説明した処理の全部または一部を公知の方法で自動的に行うこともできる。このほか、上記文献中や図面中で示した処理手順、制御手順、具体的名称、各処理の登録データ等を含む情報、データベース構成については、特記する場合を除いて任意に変更することができる。
また、解析装置１００に関して、図示の各構成要素は機能概略的なものであり、必ずしも物理的に図示の如く構成されていることを要しない。
例えば、解析装置１００の各装置が備える処理機能、特に制御装置１０２にて行われる各処理機能については、その全部または任意の一部を、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）および当該ＣＰＵにて解釈実行されるプログラムにて実現することができ、あるいは、ワイヤードロジックによるハードウェアとして実現することも可能である。尚、プログラムは、後述する記録媒体に記録されており、必要に応じて解析装置１００に機械的に読み取られる。すなわち、ＲＯＭまたはＨＤなどの記憶装置１０６などは、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）として協働してＣＰＵに命令を与え、各種処理を行うためのコンピュータプログラムが記録されている。このコンピュータプログラムは、ＲＡＭにロードされることによって実行され、ＣＰＵと協働して制御装置を構成する。
また、このコンピュータプログラムは、解析装置１００に対して任意のネットワーク３００を介して接続されたアプリケーションプログラムサーバに記憶されていてもよく、必要に応じてその全部または一部をダウンロードすることも可能である。
また、本発明に係るプログラムを、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納することもできる。ここで、この「記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＤＶＤ等の任意の「可搬用の物理媒体」、あるいは、ＬＡＮ、ＷＡＮ、インターネットに代表されるネットワークを介してプログラムを送信する場合の通信回線や搬送波のように、短期にプログラムを保持する「通信媒体」を含むものとする。
また、「プログラム」とは、任意の言語や記述方法にて記述されたデータ処理方法であり、ソースコードやバイナリコード等の形式を問わない。なお、「プログラム」は必ずしも単一的に構成されるものに限られず、複数のモジュールやライブラリとして分散構成されるものや、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）に代表される別個のプログラムと協働してその機能を達成するものをも含む。なお、実施の形態に示した各装置において記録媒体を読み取るための具体的な構成、読み取り手順、あるいは、読み取り後のインストール手順等については、周知の構成や手順を用いることができる。
記憶装置１０６に格納される各種のデータベース等（検出強度ファイル１０６ａ〜配置ファイル１０６ｃ）は、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリ装置、ハードディスク等の固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等のストレージ手段であり、各種処理やウェブサイト提供に用いる各種のプログラムやテーブルやデータベースやウェブページ用ファイル等を格納する。
また、解析装置１００は、既知のパーソナルコンピュータ、ワークステーション等の情報処理装置を接続し、該情報処理装置に本発明の方法を実現させるソフトウェア（プログラム、データ等を含む）を実装することにより実現してもよい。
更に、装置の分散・統合の具体的形態は図示するものに限られず、その全部または一部を、各種の付加等に応じた任意の単位で、機能的または物理的に分散・統合して構成することができる。
以上詳述に説明したように、本発明によれば、マイクロアレイ実験等から得られるデータから、回帰分析を用いた補正手段により偏り誤差を推測するので、生物学的差異と偏り誤差により生ずる非生物学的差異を分離することができ、解析精度を高めた解析装置を提供することができるので、特に、医療分野、バイオ産業分野等に利用可能である。
従来技術における解析装置の補正処理の一例を示すフローチャートである。 重み付き局所回帰法（ＬＯＷＥＳＳ法）を用いて、補正のためのＬｏｗｅｓｓ曲線を求めた場合のＭＡ（横軸：Ａ値、縦軸：Ｍ値）プロット図である。 ＭＡプロットの例を示す概念図である。 本発明の基本原理である補正方法を説明する概念図である。 本発明によって補正された場合のＭＡプロットの例を表す図 本発明の本実施の形態が適用される本解析装置の構成の一例を示すブロック図である。 本実施の形態における本解析装置１００の補正処理の一例を示すフローチャートである。 食道ガン診断用ＤＮＡチップに搭載された２５６遺伝子について、チャンネル１で測定されたＣｙ５による蛍光強度値を表すプロット図である。 食道ガン診断用ＤＮＡチップに搭載された２５６遺伝子について、チャンネル２で測定されたＣｙ３による蛍光強度値を表すプロット図である。 食道ガン組織ｔｏｔａｌＲＮＡとヒトリファレンスｔｏｔａｌＲＮＡを食道ガン診断用ＤＮＡチップに適用した時の補正前のＭＡプロット図である。 従来法を用いて、対数幾何平均Ａに対する発現強度比Ｍの偏り誤差を推定し、補正を行った結果を示すＭＡプロット図である。 本実施の形態にかかる本実施例による補正方法を用いて、偏り誤差を推定し、補正を行った結果を示すＭＡプロット図である。
符号の説明
１００ 解析装置
１０２ 制御装置
１０２ａ 対数変換部
１０２ｂ 誤差推定部
１０２ｃ 回帰式生成部
１０２ｄ 評価部
１０２ｅ 対数比補正部
１０２ｆ 疾患検出部
１０２ｇ 出力部
１０４ 通信制御インターフェース部
１０６ 記憶装置
１０６ａ 検出強度ファイル
１０６ｂ 補正対数比ファイル
１０６ｃ 配置ファイル
１０８ 入出力制御インターフェース部
１１２ 入力装置
１１４ 出力装置
２００ 外部システム
３００ ネットワーク

Claims (5)

  1. 異なる条件の細胞から得られた被検査物質の２群にそれぞれ異なる２種類の標識を付し、多種類の既知の選択結合性物質を整列固定化した担体に当該被検査物質を接触させ、上記選択結合性物質に対する上記被検査物質の選択的結合量を上記標識の検出強度値として測定することにより得られる、上記選択的結合量の上記２群間における差異を検査する、少なくとも記憶装置と制御装置とを備えた解析装置であって、
    上記記憶装置は、
    上記選択結合性物質毎に上記検出強度値を記憶する検出強度記憶手段を備え、
    上記制御装置は、
    上記検出強度記憶手段に記憶された上記検出強度値に基づいて、下記の数式１および数式２を用いて、上記２群間における対数比Ｍ（ｋ）と対数幾何平均Ａ（ｋ）とに変換する対数変換手段と、
    Ｍ（ｋ）＝ｌｏｇ2（Ｃ1k／Ｃ2k） ・・・（数式１）
    Ａ（ｋ）＝ｌｏｇ2（Ｃ1k・Ｃ2k）0.5 ・・・（数式２）
    （ここで、ｋは任意の上記選択結合性物質を表し、Ｃ1kおよびＣ2kは、それぞれ異なる上記２種類の標識の上記検出強度値である。）
    上記対数幾何平均に依存した上記対数比の偏り誤差を、上記２群間において存在比が同一である上記被検査物質に係る上記対数比および上記対数幾何平均の集合について下記の数式３に基づく多項式回帰分析を行うことにより、推定する誤差推定手段と、
    ｙ＝ａ0＋ａ1ｘ＋ａ2ｘ2＋ａ3ｘ3＋ ・・・ａnｘn＋ｅ ・・・（数式３）
    （ここで、ｘは説明変数であり、ｙは目的変数であり、ａは定数であり、ｅは残差である。）
    上記誤差推定手段によって推定された上記偏り誤差を、上記選択結合性物質毎の上記対数比から減ずることにより補正対数比を導出する対数比補正手段と、
    を備えたことを特徴とする解析装置。
  2. 請求項１に記載の解析装置において、
    上記誤差推定手段は、
    （Ａ）上記目的変数との相関係数が最も大きい上記説明変数から重回帰式に取り入れていき、予測精度の改善がみられる間、この操作を繰り返す変数増加法、
    （Ｂ）最初に全ての上記説明変数を含む上記重回帰式を構成した上で、予測に有効ではない上記説明変数を除去していき、上記予測精度の低下が一定限度以内である間、この操作を繰り返す変数減少法、
    （Ｃ）上記目的変数との上記相関係数が最も大きい上記説明変数から上記重回帰式に取り入れた後に、予測に有効ではない上記説明変数を除去する変数増減法、
    （Ｄ）最初に全ての上記説明変数を含む上記重回帰式を構成した上で、それまでに上記重回帰式に取り入れられている上記説明変数の中から最も予測に有効でない上記説明変数を除き、取り入れられていない上記説明変数の中で予測に有効な上記説明変数を取り入れる変数減増法、
    のいずれかを用いて上記重回帰式を生成する回帰式生成手段、
    を更に備えたこと特徴とする解析装置。
  3. 請求項１または２に記載の解析装置において、
    上記誤差推定手段は、
    上記多項式回帰分析において、上記対数変換手段によって変換された上記対数比に対する回帰のあてはまり具合を、
    （Ｅ）下記の数式４に基づいて求める赤池情報量規準ＡＩＣによって評価する評価法、
    ＡＩＣ＝−２Ｌｎ（Ｌ）＋２ｓ ・・・（数式４）
    （ここで、Ｌは最大尤度であり、ｓは自由パラメータの数である。）
    （Ｆ）下記の数式５に基づいて求める自由度調整済み決定係数Ｒ2によって評価する評価法、
    Ｒ2＝１−[｛Ｓｅ／（Ｎ−ｐ−１）｝／｛Ｓｔ−（Ｎ−１）｝] ・・・（数式５）
    （ここで、Ｓｅは残差平方和であり、Ｓｔは総平方和であり、Ｎはデータ数であり、ｐは自由度である。）
    （Ｇ）下記の数式６に基づいて求めるマローズのＣｐによって評価する評価法、
    Ｃｐ＝Ｓｅ／σ2−２（ｐ＋１）−Ｎ ・・・（数式６）
    （ここで、Ｓｅは上記残差平方和であり、Ｎは上記データ数であり、ｐは上記自由度であり、σは誤差分散の推定値である。）
    のいずれかの評価法によって評価する回帰式評価手段、
    を更に備えたことを特徴とする解析装置。
  4. 請求項１乃至３のいずれか一つに記載の解析装置において、
    上記被検査物質は、上記細胞から抽出したＲＮＡから合成したｃＤＮＡまたはａＲＮＡであり、
    上記標識は、蛍光物質であり、
    上記選択結合性物質は、ＤＮＡ断片であり、
    上記担体上には、疾患の罹患の有無や程度によって発現変動することが期待される目的遺伝子と、発現変動が少ない対照遺伝子と、を検出するための上記ＤＮＡ断片が配置されていること、
    を特徴とする解析装置。
  5. 異なる条件の細胞から得られた被検査物質の２群にそれぞれ異なる２種類の標識を付し、多種類の既知の選択結合性物質を整列固定化した担体に当該被検査物質を接触させ、上記選択結合性物質に対する上記被検査物質の選択的結合量を上記標識の検出強度値として測定することにより得られる、上記選択的結合量の上記２群間における差異を検査する、少なくとも記憶装置と制御装置とを備えた解析装置において実行される補正方法であって、
    上記記憶装置は、上記選択結合性物質毎に上記検出強度値を記憶する検出強度記憶手段を備えており、
    上記制御装置は、
    上記検出強度記憶手段に記憶された上記検出強度値に基づいて、下記の数式１および数式２を用いて、上記２群間における対数比Ｍ（ｋ）と対数幾何平均Ａ（ｋ）とに変換する対数変換ステップと、
    Ｍ（ｋ）＝ｌｏｇ2（Ｃ1k／Ｃ2k） ・・・（数式１）
    Ａ（ｋ）＝ｌｏｇ2（Ｃ1k・Ｃ2k）0.5 ・・・（数式２）
    （ここで、ｋは任意の上記選択結合性物質を表し、Ｃ1kおよびＣ2kは、それぞれ異なる上記２種類の標識の上記検出強度値である。）
    上記対数幾何平均に依存した上記対数比の偏り誤差を、上記２群間において存在比が同一である上記被検査物質に係る上記対数比および上記対数幾何平均の集合について下記の数式３に基づく多項式回帰分析を行うことにより、推定する誤差推定ステップと、
    ｙ＝ａ0＋ａ1ｘ＋ａ2ｘ2＋ａ3ｘ3＋ ・・・ａnｘn＋ｅ ・・・（数式３）
    （ここで、ｘは説明変数であり、ｙは目的変数であり、ａは定数であり、ｅは残差である。）
    上記誤差推定ステップにおいて推定された上記偏り誤差を、上記選択結合性物質毎の上記対数比から減ずることにより補正対数比を導出する対数比補正ステップと、
    を備えたことを特徴とする補正方法。
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