JP4877781B2

JP4877781B2 - Crystal production tool

Info

Publication number: JP4877781B2
Application number: JP2006313458A
Authority: JP
Inventors: 智一長谷川; 賢作濱田; 勝佐藤; 守利本原
Original assignee: Japan Aerospace Exploration Agency JAXA
Current assignee: Japan Aerospace Exploration Agency JAXA
Priority date: 2006-11-20
Filing date: 2006-11-20
Publication date: 2012-02-15
Anticipated expiration: 2026-11-20
Also published as: JP2008126135A

Description

本発明は、液−液拡散法の一種であるゲル・カウンタ・ディフュージョン法を用いて結晶を作製するときに使う結晶作製器具に関する。 The present invention relates to a crystal production tool used when producing a crystal using a gel counter diffusion method which is a kind of liquid-liquid diffusion method.

タンパク質を結晶化する手法のひとつとして、液−液拡散法が知られている。この液−液拡散法は、タンパク質溶液と沈殿剤とを接触させて、その自由界面で両者を拡散させて、タンパク質を部分的に過飽和状態にさせ、これによって、タンパク質を結晶化させるものである。この液−液拡散法を用いてタンパク質を結晶化させるときの条件をスクリーニングするためには、多数の条件について、同時に、微量のサンプルで結晶化の実験をできるようにすることが好ましい。そのような実験を可能にする器具として、特許文献１に開示されたような結晶化プレートが知られている。本発明はこの種の結晶化プレートに関連がある。
米国特許公開２００５／０２０１９０１ A liquid-liquid diffusion method is known as one method for crystallizing proteins. In this liquid-liquid diffusion method, a protein solution and a precipitating agent are brought into contact with each other, and both are diffused at the free interface to partially bring the protein into a supersaturated state, thereby causing the protein to crystallize. . In order to screen the conditions for protein crystallization using this liquid-liquid diffusion method, it is preferable to allow crystallization experiments with a small amount of samples at the same time for many conditions. As an instrument that enables such an experiment, a crystallization plate as disclosed in Patent Document 1 is known. The present invention relates to this type of crystallization plate.
US Patent Publication 2005/0201901

この特許文献１に開示されている結晶化プレートは、微量のサンプルで多数の結晶化条件についてスクリーニングが可能であり、プレート中に多数の細長い溝を形成して、その溝の内部でタンパク質溶液と沈殿剤を接触させるようにしている。この結晶化プレートは、タンパク質溶液の通路と沈殿剤の通路との間を開閉する開閉弁と、タンパク質溶液の供給口付近に配置したタンパク質溶液供給弁と、沈殿剤の供給口付近に配置した沈殿剤供給弁とを備えていて、これらの弁の開閉を制御することで、タンパク質溶液及び沈殿剤の供給作業を実施するとともに、タンパク質溶液と沈殿剤両者の間の相互拡散の開始を制御している。弁の開閉は、気体の圧力を利用しているため、加圧するための専用装置が必要である。拡散を開始した後は、一定期間後に開閉弁を閉じて、溶液からの水分の蒸発による濃度変化を利用して、結晶を析出させている。 The crystallization plate disclosed in Patent Document 1 can be screened for a large number of crystallization conditions with a small amount of sample. A large number of elongated grooves are formed in the plate, and the protein solution is formed inside the grooves. The precipitating agent is brought into contact. This crystallization plate has an on-off valve that opens and closes between a protein solution passage and a precipitation agent passage, a protein solution supply valve arranged near the protein solution supply port, and a precipitation arranged near the precipitation agent supply port. It is equipped with a reagent supply valve, and by controlling the opening and closing of these valves, the supply operation of the protein solution and the precipitant is performed, and the start of mutual diffusion between the protein solution and the precipitant is controlled. Yes. Since opening and closing of the valve utilizes gas pressure, a dedicated device for pressurization is required. After starting the diffusion, the on-off valve is closed after a certain period of time, and crystals are precipitated using the concentration change caused by the evaporation of moisture from the solution.

また、液−液拡散法の一種として、ゲル・カウンタ・ディフュージョン法が知られている（非特許文献１及び特許文献２）。このゲル・カウンタ・ディフュージョン法は、ゲルを挟んでタンパク質溶液と沈殿剤を配置するもので、これによって、タンパク質溶液と沈殿剤がゲルを通して混じり合って、タンパク質が結晶化するものである。本発明は、このゲル・カウンタ・ディフュージョン法に関連している。
J. Synchrotron Rad. (2004) 11, 45-48 "A simplified counter diffusion method combined with a 1-D simulation program for optimizing crystallization conditions" 特開平６−３２１７００号公報 Further, a gel counter diffusion method is known as a kind of liquid-liquid diffusion method (Non-patent Document 1 and Patent Document 2). In this gel counter diffusion method, a protein solution and a precipitating agent are arranged with a gel sandwiched therebetween, whereby the protein solution and the precipitating agent are mixed through the gel and the protein is crystallized. The present invention relates to this gel counter diffusion method.
J. Synchrotron Rad. (2004) 11, 45-48 "A simplified counter diffusion method combined with a 1-D simulation program for optimizing crystallization conditions" Japanese Patent Laid-Open No. 6-321700

さらに、本発明は、結晶作製器具に結晶を収容したままの状態で、結晶のＸ線回折測定ができることに関係しているが、この点に関連の深い公知技術として、次の特許文献３が知られている。
特開２００４−２０３９７号公報 Furthermore, the present invention relates to the fact that X-ray diffraction measurement of a crystal can be performed in a state in which the crystal is accommodated in a crystal production tool. Are known.
Japanese Patent Laid-Open No. 2004-20397

この特許文献３は、蒸気拡散法でタンパク質の結晶を作製するための結晶化プレートを開示しており、この結晶化プレートで作製した結晶をＸ線回折測定をする際に、結晶化プレートをそのままＸ線回折装置の試料ホルダーに取り付けている。この結晶化プレートは、蒸気拡散法を用いているので、結晶化プレートを水平にした状態でＸ線を照射する必要があり、試料の取り付け方法に制約がある。また、蒸気拡散法は、ゲル・カウンタ・ディフュージョン法のような細長い通路を必要としないので、比較的小さな結晶化プレートとすることができるが、ゲル・カウンタ・ディフュージョン法は、充分な長さの細長い通路を必要とする。したがって、ゲル・カウンタ・ディフュージョン法のための結晶化プレートは、蒸気拡散法の結晶化プレートのようには小さくならず、Ｘ線回折装置の試料ホルダーにそのまま取り付けることはできない。 This Patent Document 3 discloses a crystallization plate for producing a protein crystal by a vapor diffusion method. When the crystal produced by this crystallization plate is subjected to X-ray diffraction measurement, the crystallization plate is used as it is. It is attached to the sample holder of the X-ray diffractometer. Since this crystallization plate uses a vapor diffusion method, it is necessary to irradiate X-rays in a state where the crystallization plate is horizontal, and there are restrictions on the method of attaching the sample. In addition, the vapor diffusion method does not require an elongated passage like the gel counter diffusion method, so that it can be a relatively small crystallization plate. However, the gel counter diffusion method has a sufficiently long length. Requires an elongated passage. Therefore, the crystallization plate for the gel counter diffusion method is not as small as the vapor diffusion method crystallization plate, and cannot be directly attached to the sample holder of the X-ray diffractometer.

ゲル・カウンタ・ディフュージョン法の結晶化プレートを用いて結晶を作製した場合には、その結晶をＸ線回折装置で測定するためには、結晶化プレートから結晶を取り出す必要があった。結晶化プレートの内部に存在する結晶をそのままの状態でＸ線回折装置で測定するためには、結晶を保有する結晶化プレートをＸ線回折装置の試料ホルダーに取り付ける必要がある。しかしながら、従来の結晶化プレートは、Ｘ線回折装置の試料ホルダーに取り付けるにはサイズが大きすぎる。結晶化プレートのサイズを小さくすると、今度は、結晶化のための流路の長さが不十分となる。 When a crystal was prepared using a gel counter diffusion method crystallization plate, it was necessary to take out the crystal from the crystallization plate in order to measure the crystal with an X-ray diffractometer. In order to measure the crystals existing inside the crystallization plate as they are with the X-ray diffractometer, it is necessary to attach the crystallization plate holding the crystals to the sample holder of the X-ray diffractometer. However, the conventional crystallization plate is too large to be attached to the sample holder of the X-ray diffractometer. If the size of the crystallization plate is reduced, the length of the flow path for crystallization becomes insufficient.

本発明の目的は、ゲル・カウンタ・ディフュージョン法を用いて微量のサンプルで結晶化を実施できて、かつ、結晶を取り出すことなく結晶作製器具をそのままの状態でＸ線回折装置の試料ホルダーに取り付けることができる結晶作製器具を提供することにある。 An object of the present invention is to perform crystallization with a small amount of sample using the gel counter diffusion method, and attach the crystal preparation tool to the sample holder of the X-ray diffractometer without removing the crystal. An object of the present invention is to provide a crystal production tool that can be used.

本発明の結晶作製器具は、結晶化すべき物質を含む物質溶液から前記物質の結晶を作製するための結晶作製器具において、次の（ア）乃至（ウ）を備えている。（ア）次の（ａ）乃至（ｆ）を備える流路プレート。（ａ）第１面と第２面を備える平板状の本体。（ｂ）前記本体に形成された細長い流路であって、第１端部と第２端部を備えていて、流路の長手方向に延びるひとつの面が前記第２面に露出していて、流路に沿った前記第１端部から前記第２端部までの長さが前記第１端部から前記第２端部までの直線距離の３倍以上となるように流路が曲がっていることを特徴とする流路。（ｃ）前記本体に形成された物質溶液導入口であって、一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の前記第１端部に連通している物質溶液導入口。（ｄ）前記本体に形成された結晶生成溶液導入口であって、一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の前記第２端部に連通している結晶生成溶液導入口。（ｅ）前記本体に形成されたゲル導入口であって、一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の途中において前記流路に連通しているゲル導入口。（ｆ）前記本体に形成された空気抜き穴であって、一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の前記第１端部と前記ゲル導入口の間の地点において前記流路に連通している空気抜き穴。（イ）前記第１面を覆う第１カバーシートであって、少なくとも前記物質溶液導入口の開口、前記結晶生成溶液導入口の開口、前記空気抜き穴の開口及び前記ゲル導入口の開口を気密に覆う第１カバーシート。（ウ）前記第２面を覆う第２カバーシートであって、少なくとも前記流路の長手方向に延びる開口を気密に覆う第２カバーシート。 A crystal production tool of the present invention is a crystal production tool for producing a crystal of a substance from a substance solution containing a substance to be crystallized, and includes the following (a) to (c). (A) A flow path plate including the following (a) to (f). (A) A flat plate-like main body having a first surface and a second surface. (B) A long and narrow flow channel formed in the main body, which has a first end and a second end, and one surface extending in the longitudinal direction of the flow channel is exposed on the second surface. The flow path is bent so that the length from the first end to the second end along the flow path is at least three times the linear distance from the first end to the second end. A flow path characterized by being. (C) A substance solution introduction port formed in the main body, wherein one end is open on the first surface and the other end communicates with the first end of the flow path. (D) A crystal formation solution introduction port formed in the main body, one end of which opens to the first surface and the other end communicates with the second end of the flow path. mouth. (E) A gel inlet formed in the main body, one end of which is open on the first surface and the other end is in communication with the channel in the middle of the channel. (F) An air vent hole formed in the main body, one end of which is open on the first surface and the other end is located at a point between the first end of the flow path and the gel inlet. Air vent hole communicating with the road. (A) A first cover sheet covering the first surface, wherein at least the opening of the substance solution introduction port, the opening of the crystal formation solution introduction port, the opening of the air vent hole and the opening of the gel introduction port are airtight. A first cover sheet to cover. (C) A second cover sheet that covers the second surface, and airtightly covers at least an opening extending in the longitudinal direction of the flow path.

流路が上述のように曲がっているので、流路プレートの平面サイズを小さくすることができる。流路プレートの本体の平面サイズは５０ｍｍ×５０ｍｍの範囲内であることが好ましい。このサイズであれば、結晶を保有したままの結晶作製器具をＸ線回折装置の試料ホルダーに取り付けることができる。 Since the flow path is bent as described above, the planar size of the flow path plate can be reduced. The planar size of the main body of the flow path plate is preferably within a range of 50 mm × 50 mm. With this size, it is possible to attach a crystal production tool that holds crystals to the sample holder of the X-ray diffractometer.

流路プレートの本体の厚さは０．５〜２．０ｍｍの範囲内であることが好ましい。厚さが０．５ｍｍ以下になると、流路プレートの強度が低下するとともに、結晶生成溶液導入口に充填できる結晶生成溶液の量が少なくなり過ぎる。厚さが２．０ｍｍ以上になると、結晶作製器具に収容したままの結晶をＸ線回折装置で測定する際に、流路プレートによるＸ線の吸収量が増加して好ましくない。より好ましくは、流路プレートの本体の厚さは０．８〜１．５ｍｍの範囲内とする。 The thickness of the main body of the flow path plate is preferably in the range of 0.5 to 2.0 mm. When the thickness is 0.5 mm or less, the strength of the flow path plate is lowered, and the amount of the crystal forming solution that can be filled in the crystal forming solution introduction port becomes too small. When the thickness is 2.0 mm or more, the amount of X-ray absorption by the flow path plate is increased when the crystal as it is housed in the crystal production tool is measured with an X-ray diffractometer. More preferably, the thickness of the main body of the flow path plate is in the range of 0.8 to 1.5 mm.

流路は渦巻き状にすることが好ましい。こうすることで、小さな平面サイズの範囲内で流路の長さを十分長くできる。 The flow path is preferably spiral. By doing so, the length of the flow path can be made sufficiently long within the range of a small plane size.

結晶生成溶液導入口の平面サイズは空気抜き穴の平面サイズよりも大きく形成されているので、ゲル導入口から見て、結晶生成溶液導入口の側の流路抵抗と空気抜き穴の側の流路抵抗がアンバランスである。そこで、結晶生成溶液導入口と流路の第２端部との連通部分には、空気抜き穴と実質的に同じ平面サイズのバランス穴を結晶生成溶液導入口と一体に形成するのが好ましい。ゲル導入口に充填されたゲルは、流路の内部を両方向に流れて、一方は空気導入口に向かい、他方は結晶生成溶液導入口に向かう。この場合、空気抜き穴とバランス穴が実質的に同じ平面サイズなので、ゲル導入口から充填されたゲルは、その両側の流路にほぼ均等に充填される。そして、ゲル導入口から空気抜き穴までの流路の長さと、ゲル導入口からバランス穴までの流路の長さを実質的に等しくすれば、より均等にゲルが充填される。 Since the plane size of the crystal formation solution inlet is formed larger than the plane size of the air vent hole, the channel resistance on the crystal formation solution inlet side and the channel resistance on the air vent hole side as viewed from the gel inlet Is unbalanced. Therefore, it is preferable that a balance hole having substantially the same plane size as the air vent hole is formed integrally with the crystal formation solution introduction port at the communication portion between the crystal formation solution introduction port and the second end of the flow path. The gel filled in the gel inlet flows in both directions in the flow path, one going to the air inlet and the other going to the crystal forming solution inlet. In this case, since the air vent hole and the balance hole have substantially the same planar size, the gel filled from the gel introduction port is almost uniformly filled into the flow paths on both sides thereof. If the length of the flow path from the gel inlet to the air vent hole is substantially equal to the length of the flow path from the gel inlet to the balance hole, the gel is more evenly filled.

流路プレートの本体の材質はポリジメチルシロキサンとすることが好ましい。また、その場合に、第１カバーシートと第２カバーシートの材質はポリエチレンテレフタレート、ポリイミドまたはポリテトラフルオロエチレンとすることが好ましい。このような材質の組み合わせによれば、第１カバーシートと第２カバーシートは、特に接着剤を要することなく、流路プレートの本体に密着して、流路を気密に保つことができる。これらのカバーシートは、流路プレートの本体から容易には剥がれることがない。また、これらの材質の組み合わせは、Ｘ線の吸収が比較的少なくて、結晶作製器具をそのままＸ線回折装置の試料ホルダーに取り付けるのに適している。 The material of the main body of the flow path plate is preferably polydimethylsiloxane. In that case, the material of the first cover sheet and the second cover sheet is preferably polyethylene terephthalate, polyimide or polytetrafluoroethylene. According to such a combination of materials, the first cover sheet and the second cover sheet can be in close contact with the main body of the flow path plate without requiring an adhesive, and the flow path can be kept airtight. These cover sheets are not easily peeled off from the main body of the flow path plate. Further, the combination of these materials has relatively little absorption of X-rays, and is suitable for attaching the crystal production tool as it is to the sample holder of the X-ray diffraction apparatus.

流路プレートの流路の幅及び深さは０．０５〜１．００ｍｍの範囲内であることが好ましい。その範囲内で、結晶生成溶液及び物質溶液の特性と、必要とする結晶の大きさとから、最適な値を設定することができる。より好ましくは、流路の幅及び深さは０．１〜０．５ｍｍの範囲内である。流路の幅と深さは、結晶生成の速度と、生成される結晶の大きさとに関連する。 The width and depth of the flow path of the flow path plate are preferably in the range of 0.05 to 1.00 mm. Within the range, an optimum value can be set from the characteristics of the crystal forming solution and the substance solution and the required crystal size. More preferably, the width and depth of the channel are in the range of 0.1 to 0.5 mm. The width and depth of the channel are related to the rate of crystal formation and the size of the crystals produced.

本発明の結晶作製器具は、ゲル・カウンタ・ディフュージョン法を用いて微量のサンプルで特にタンパク質を結晶化させるのに最適であるが、その他の物質を結晶化させるのに用いることもできる。 The crystal preparation instrument of the present invention is particularly suitable for crystallizing proteins with a very small amount of sample using the gel counter diffusion method, but can also be used for crystallizing other substances.

本発明によれば、ゲル・カウンタ・ディフュージョン法を用いて微量のサンプルで結晶化を実施できて、かつ、結晶を取り出すことなく結晶作製器具をそのままの状態でＸ線回折装置の試料ホルダーに取り付けることができる。また、空気抜き穴を設けているので、ゲルと物質溶液を導入する際に、流路内部の空気が容易に抜け、あまり圧力をかけなくてもゲルと物質溶液を充填することができる。 According to the present invention, crystallization can be performed with a small amount of sample using the gel counter diffusion method, and the crystal preparation tool is attached to the sample holder of the X-ray diffraction apparatus as it is without taking out the crystal. be able to. Further, since the air vent hole is provided, when the gel and the substance solution are introduced, the air inside the flow path is easily removed, and the gel and the substance solution can be filled without applying too much pressure.

以下、図面を参照して本発明の実施例を詳しく説明する。図１は本発明の結晶作製器具の一実施例の分解斜視図である。この結晶作製器具は、ゲル・カウンタ・ディフュージョン法を用いて物質溶液（結晶化すべき物質を含む溶液）から結晶を作製するための器具である。以下の説明では、タンパク質結晶を作製することを例にして説明する。この結晶作製器具は、流路プレート１０、第１カバーシート１２及び第２カバーシート１４からなる。この結晶作製器具の使用方法を簡単に説明すると、流路プレート１０の底面（第２面）に第２カバーシート１４を貼り付けてから、物質溶液としてのタンパク質溶液と、結晶生成溶液としての沈殿剤と、ゲルを、それぞれ、タンパク質溶液導入口１６（物質溶液導入口に相当する）と沈殿剤導入口１８ａ，１８ｂ，１８ｃ（結晶生成溶液導入口に相当する）とゲル導入口２０を介して、流路プレート１０の流路内に充填する。それから、流路プレート１０の上面に第１カバーシート１２を貼り付ける。このように二つのカバーシート１２、１４で挟まれた状態の流路プレート１０を、所定の温度で所定時間保持することで、流路プレート１０の流路内でタンパク質の結晶が成長する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. FIG. 1 is an exploded perspective view of an embodiment of the crystal production tool of the present invention. This crystal production instrument is an instrument for producing a crystal from a substance solution (a solution containing a substance to be crystallized) using a gel counter diffusion method. In the following description, the production of protein crystals will be described as an example. The crystal production tool includes a flow path plate 10, a first cover sheet 12, and a second cover sheet 14. Briefly explaining how to use the crystal production tool, after the second cover sheet 14 is attached to the bottom surface (second surface) of the flow path plate 10, the protein solution as the substance solution and the precipitation as the crystal generation solution are used. The agent and the gel are passed through the protein solution inlet 16 (corresponding to the substance solution inlet), the precipitant inlets 18a, 18b, 18c (corresponding to the crystal forming solution inlet) and the gel inlet 20, respectively. The flow path of the flow path plate 10 is filled. Then, the first cover sheet 12 is attached to the upper surface of the flow path plate 10. By holding the flow path plate 10 sandwiched between the two cover sheets 12 and 14 in this way at a predetermined temperature for a predetermined time, protein crystals grow in the flow path of the flow path plate 10.

流路プレート１０は、平板状の本体に、タンパク質溶液と沈殿剤とゲルとが流れる細長い流路と、タンパク質溶液と沈殿剤とゲルのためのそれぞれの導入口１６，１８ａ，１８ｂ，１８ｃ，２０と、空気抜き穴２２とを形成したものである。流路プレート１０の本体の平面形状は矩形であり、その平面サイズは２６ｍｍ×１２．２ｍｍである。流路プレート１０の厚さは１ｍｍである。流路プレート１０の本体の材質はポリジメチルシロキサン（Polydimethylsiloxane、略称はＰＤＭＳ）である。このＰＤＭＳは無色透明なシリコーンゴムである。 The channel plate 10 has a flat body, an elongated channel through which the protein solution, the precipitant, and the gel flow, and respective inlets 16, 18a, 18b, 18c, 20 for the protein solution, the precipitant, and the gel. And an air vent hole 22 are formed. The planar shape of the main body of the flow path plate 10 is a rectangle, and the planar size is 26 mm × 12.2 mm. The thickness of the flow path plate 10 is 1 mm. The material of the main body of the flow path plate 10 is polydimethylsiloxane (abbreviated as PDMS). This PDMS is a colorless and transparent silicone rubber.

第１カバーシート１２と第２カバーシート１４の平面サイズは、流路プレート１０と同じ大きさか、それよりも若干大きくなっている。その材質は例えばポリエチレンテレフタレートである。これらのカバーシートは、厚さが０．０５〜０．２０ｍｍで、透明である。 The planar sizes of the first cover sheet 12 and the second cover sheet 14 are the same size as the flow path plate 10 or slightly larger than that. The material is, for example, polyethylene terephthalate. These cover sheets have a thickness of 0.05 to 0.20 mm and are transparent.

流路プレート１０と二つのカバーシート１２，１４は、すべて、可視光に対して透明であり、これにより、流路プレート１０の内部の状況を外部から観察できる。 The flow path plate 10 and the two cover sheets 12 and 14 are all transparent to visible light, so that the internal state of the flow path plate 10 can be observed from the outside.

図２は流路プレート１０の上面（第１面）を示した平面図である。破線で示したものは、流路プレート１０の底面（第２面）側に露出するように形成された流路２４である。流路２４の第１端部２６にはタンパク質溶液導入口１６が連通しており、流路２４の第２端部２８には第１の沈殿剤導入口１８ａが連通している。第１の沈殿剤導入口１８ａは連通路３０ａを介して第２の沈殿剤導入口１８ｂに連通しており、第２の沈殿剤導入口１８ｂはさらに連通路３０ｂを介して第３の沈殿剤導入口１８ｃに連通している。沈殿剤導入口を３個直列に接続している理由は、沈殿剤の充填容量を増やすためである。流路プレート１０は、厚さが１ｍｍと薄くなっているので、沈殿剤の充填容量を増やすためには、沈殿剤導入口の平面サイズを大きくする必要がある。円形の沈殿剤導入口を形成する場合に、大きな直径のひとつの沈殿剤導入口を形成するよりも、小さな直径の沈殿剤導入口を複数個形成する方が、流路プレート１０の平面サイズを小さくできる。また、大きな直径のひとつの沈殿剤導入口を形成するよりも、小さな直径の沈殿剤導入口を複数個形成する方が、流路プレートの強度を確保できる。この実施例では、３個の沈殿剤導入口に、合計で約６０マイクロリットルの沈殿剤を充填できる。 FIG. 2 is a plan view showing the upper surface (first surface) of the flow path plate 10. What is indicated by a broken line is a flow path 24 formed so as to be exposed on the bottom surface (second surface) side of the flow path plate 10. The protein solution introduction port 16 communicates with the first end portion 26 of the flow path 24, and the first precipitant introduction port 18 a communicates with the second end portion 28 of the flow path 24. The first precipitating agent introduction port 18a communicates with the second precipitating agent introduction port 18b through the communication passage 30a, and the second precipitating agent introduction port 18b further passes through the communication passage 30b. It communicates with the inlet 18c. The reason why three precipitant inlets are connected in series is to increase the filling capacity of the precipitant. Since the flow path plate 10 is as thin as 1 mm, it is necessary to increase the planar size of the precipitant inlet in order to increase the precipitant filling capacity. In the case of forming a circular precipitant introduction port, the planar size of the flow path plate 10 can be reduced by forming a plurality of precipitant introduction ports having a small diameter rather than forming a single precipitation agent introduction port having a large diameter. Can be small. Moreover, the strength of the flow path plate can be ensured by forming a plurality of precipitant inlets having a small diameter rather than forming a single precipitant inlet having a large diameter. In this embodiment, a total of about 60 microliters of precipitant can be filled into three precipitant inlets.

流路２４の途中にはゲル導入口２０が連通している。流路２４において、ゲル導入口２０とタンパク質導入口１６の間の地点には、空気抜き穴２２が連通している。タンパク質導入口１６と沈殿剤導入口１８ａ，１８ｂ，１８ｃとゲル導入口２０と空気抜き穴２２は、それぞれ、流路プレート１０の厚さ方向に貫通している。流路２４は流路プレート１０の底面（第２面）側に露出するように、所定の深さの溝として形成されている。 In the middle of the flow path 24, the gel inlet 20 communicates. In the channel 24, an air vent hole 22 communicates with a point between the gel inlet 20 and the protein inlet 16. The protein introduction port 16, the precipitant introduction ports 18 a, 18 b, 18 c, the gel introduction port 20, and the air vent hole 22 respectively penetrate through the flow path plate 10 in the thickness direction. The channel 24 is formed as a groove having a predetermined depth so as to be exposed on the bottom surface (second surface) side of the channel plate 10.

流路プレート１０に形成された流路２４と各種の導入口１６，１８ａ，１８ｂ，１８ｃ，２０と空気抜き穴２２と連通路３０ａ，３０ｂのすべてをまとめて、以下、切り取り部と呼ぶことにする。 The flow path 24 formed in the flow path plate 10, the various inlets 16, 18a, 18b, 18c, and 20, the air vent hole 22, and the communication paths 30a and 30b are collectively referred to as a cut-out portion hereinafter. .

この流路プレート１０の寸法を説明する。流路プレート１０の平面形状は矩形であり、横方向の長さＬ１が１２．２ｍｍで、縦方向の長さＬ２が２６ｍｍである。Ｘ線回折装置の試料ホルダーにそのまま取り付けてＸ線回折測定が支障なく行われるためには、Ｌ１とＬ２がそれぞれ５０ｍｍ以下であることが好ましい。流路２４の形成位置を説明すると、流路プレート１０の図示の左辺から距離Ｌ３＝１．７ｍｍだけ離れたところに、流路２４が通っており、同様に、右辺から距離Ｌ４＝１．７ｍｍだけ離れたところに、流路２４が通っている。また、上辺から距離Ｌ５＝２．３７ｍｍだけ離れたところに、流路２４が通っており、下辺から距離Ｌ６＝２．９ｍｍだけ離れたところに、流路２４が通っている。流路２４は全体として、概略、渦巻き状に形成されていて、このように曲がった経路にすることで、比較的小さな平面サイズの中で、十分な流路長さを確保している。流路２４の第１端部２６から第２端部２８までの直線距離Ｌ７は約１６ｍｍであるが、流路２４に沿って第１端部２６から第２端部２８までの長さ（流路の全長）を測ると、７１．５ｍｍである。したがって、流路の全長を直線距離Ｌ７で割ると約４．５倍になる。このように、流路を直線状に形成した場合と比較して、流路を曲線状に形成することで、比較的小さな平面サイズの範囲内に、十分な長さの流路を確保できる。流路の全長は、上述の直線距離の少なくとも３倍にすることが好ましい。 The dimensions of the flow path plate 10 will be described. The planar shape of the flow path plate 10 is a rectangle, the lateral length L1 is 12.2 mm, and the longitudinal length L2 is 26 mm. In order for X-ray diffraction measurement to be performed without hindrance as it is attached to the sample holder of the X-ray diffractometer, L1 and L2 are preferably 50 mm or less, respectively. The formation position of the flow path 24 will be described. The flow path 24 passes through a position away from the illustrated left side of the flow path plate 10 by a distance L3 = 1.7 mm. Similarly, the distance L4 = 1.7 mm from the right side. The flow path 24 passes through only a distance. Further, the flow path 24 passes through a position away from the upper side by a distance L5 = 2.37 mm, and the flow path 24 passes through a place away from the lower side by a distance L6 = 2.9 mm. The flow path 24 is generally formed in a spiral shape, and a sufficient flow path length is ensured in a relatively small plane size by using such a curved path. The linear distance L7 from the first end 26 to the second end 28 of the flow path 24 is about 16 mm, but the length (flow) from the first end 26 to the second end 28 along the flow path 24 is approximately 16 mm. The total length of the road is 71.5 mm. Therefore, dividing the total length of the flow path by the linear distance L7 is about 4.5 times. Thus, compared with the case where a flow path is formed linearly, by forming a flow path in a curved line, a sufficiently long flow path can be secured within a relatively small plane size range. The total length of the flow path is preferably at least three times the above-mentioned linear distance.

図３（Ａ）は、流路プレートに形成された切り取り部を直線状に展開したときの展開図であり、流路プレートの底面側から見たものである。流路２４の第１端部２６から第２端部２８までの長さＬ８（すなわち全長）は７１．５ｍｍである。第１端部２６から空気抜き穴２２までの長さＬ９は６０ｍｍである。空気抜き穴２２から第２端部２８までの長さＬ１０は１０ｍｍである。長さＬ１０の中点の位置にゲル導入口２０が連通している。第１端部２６にはタンパク質導入口１６が連通しており、第２端部２８には三つの沈殿剤導入口１８ａ，１８ｂ，１８ｃが直列に連通している。タンパク質導入口１６の平面形状は直径Ｄ１の円形であり、Ｄ１は２．５ｍｍである。 FIG. 3A is a development view when the cut-out portion formed in the flow path plate is developed in a straight line, and is viewed from the bottom surface side of the flow path plate. The length L8 (namely, full length) from the 1st end part 26 of the flow path 24 to the 2nd end part 28 is 71.5 mm. A length L9 from the first end portion 26 to the air vent hole 22 is 60 mm. The length L10 from the air vent hole 22 to the second end portion 28 is 10 mm. The gel inlet 20 communicates with the middle point of the length L10. The protein introduction port 16 communicates with the first end portion 26, and three precipitant introduction ports 18a, 18b, 18c communicate with the second end portion 28 in series. The planar shape of the protein inlet 16 is a circle having a diameter D1, and D1 is 2.5 mm.

図３（Ｂ）は、図３（Ａ）に示した展開図のうち、空気抜き穴２２から沈殿剤導入口１８ｃまでの切り取り部を拡大して示した拡大展開図である。３個の沈殿剤導入口１８ａ，１８ｂ，１８ｃの平面形状は直径Ｄ２の円形であり、Ｄ２は５ｍｍである。ゲル導入口２０と空気抜き穴２２の平面形状は直径Ｄ３の円形であり、Ｄ３は１．５ｍｍである。流路２４の第２端部２８と沈殿剤導入口１８ａとの連通部にはバランス穴３２が形成されている。このバランス穴３２の平面形状も直径Ｄ３の円形である。バランス穴３２と沈殿剤導入口１８ａは互いに一体につながっている。バランス穴３２は、ゲル導入口２０から見て、空気抜き穴２２とちょうど対称の位置に形成されていて、しかも、同じ平面サイズになっている。このバランス穴３２の存在により、ゲル導入口２０から両側の流路２４へと流れていくゲルは、空気抜き穴２２とバランス穴３２から均等にあふれ出すことになる。その結果、ゲルの充填が両側の通路へと均等になされる。空気抜き穴２２よりも沈殿剤導入口１８ａの方が平面サイズが大きいので、バランス穴３２が存在しないと仮定すると、ゲル導入口２０から導入されたゲルは沈殿剤導入口１８ａの方へより流れやすくなる。 FIG. 3B is an enlarged development view in which the cut-out portion from the air vent hole 22 to the precipitant introduction port 18c is enlarged in the development view shown in FIG. The planar shape of the three precipitant inlets 18a, 18b, 18c is a circle having a diameter D2, and D2 is 5 mm. The planar shape of the gel inlet 20 and the air vent hole 22 is a circle having a diameter D3, and D3 is 1.5 mm. A balance hole 32 is formed in the communication portion between the second end portion 28 of the flow path 24 and the precipitant inlet 18a. The planar shape of the balance hole 32 is also a circle having a diameter D3. The balance hole 32 and the precipitant introduction port 18a are integrally connected to each other. The balance hole 32 is formed at a position just symmetrical to the air vent hole 22 when viewed from the gel inlet 20, and has the same plane size. Due to the presence of the balance hole 32, the gel flowing from the gel inlet 20 to the flow paths 24 on both sides will overflow evenly from the air vent hole 22 and the balance hole 32. As a result, the gel is evenly filled into the passages on both sides. Since the plane size of the precipitating agent introduction port 18a is larger than that of the air vent hole 22, assuming that the balance hole 32 does not exist, the gel introduced from the gel introduction port 20 flows more easily toward the precipitating agent introduction port 18a. Become.

流路２４の幅Ｗ１は０．２ｍｍである。三つの沈殿剤導入口１８ａ，１８ｂ，１８ｃを互いに連通させる二つの連通路３０ａ，３０ｂの幅Ｗ２は０．４ｍｍである。連通路３０ａ，３０ｂの長さＬ１１は１ｍｍである。 The width W1 of the flow path 24 is 0.2 mm. The width W2 of the two communication passages 30a, 30b that allow the three precipitant inlets 18a, 18b, 18c to communicate with each other is 0.4 mm. The length L11 of the communication passages 30a and 30b is 1 mm.

図４（Ａ）は流路２４を直角に横切る切断面で切断したときの流路プレートの部分断面図である。流路プレート１０の厚さｔ１は１ｍｍであり、流路２４の深さｔ２は０．２ｍｍである。流路２４の幅Ｗ１は０．２ｍｍである。流路プレート１０は上面（第１面）３４と底面（第２面）３６を備えていて、通路２４のひとつの面（下側の面）が流路プレート１０の底面（第２面）３６に露出している。図４（Ｂ）は連通路３０ａを直角に横切る切断面で切断したときの流路プレートの部分断面図である。連通路３０ａの深さは流路２４の深さｔ２と同じであり、連通路３０ａの幅Ｗ２は０．４ｍｍである。連通路３０ｂの断面形状も連通路３０ａと同じである。流路プレートに細長い流路を形成するには、フォトレジストを用いたリソグラフィー技術を用いることができる。 FIG. 4A is a partial cross-sectional view of the flow path plate when the flow path 24 is cut along a cut surface that crosses at a right angle. The thickness t1 of the flow path plate 10 is 1 mm, and the depth t2 of the flow path 24 is 0.2 mm. The width W1 of the flow path 24 is 0.2 mm. The flow path plate 10 includes an upper surface (first surface) 34 and a bottom surface (second surface) 36, and one surface (lower surface) of the passage 24 is a bottom surface (second surface) 36 of the flow path plate 10. Is exposed. FIG. 4B is a partial cross-sectional view of the flow path plate when the communication path 30a is cut along a cutting plane that intersects at a right angle. The depth of the communication path 30a is the same as the depth t2 of the flow path 24, and the width W2 of the communication path 30a is 0.4 mm. The cross-sectional shape of the communication path 30b is the same as that of the communication path 30a. In order to form an elongated channel in the channel plate, a lithography technique using a photoresist can be used.

図５（Ａ）は図３（Ａ）に示した展開図の一部を拡大したものであり、図５（Ｂ）は、図５（Ａ）の展開図に対応して、流路の長手方向に沿った切断面で流路プレートを切断した断面図である。図５（Ｂ）において、流路２４の長手方向に延びるひとつの面（底面側の面）が流路プレート１０の底面（第２面）３６に露出するように形成されている。この流路２４はゲル・カウンタ・ディフュージョン法でタンパク質を結晶化するための流路である。タンパク質溶液導入口１６、沈殿剤導入口１８ａ、バランス穴３２、ゲル導入口２０及び空気抜き穴２２は、それらの一端（上端）が流路プレートの上面（第１面）３４に開口していて、それらの他端（下端）は流路プレートの底面（第２面）３６に開口するとともに、流路２４に連通している。 5A is an enlarged view of a part of the development shown in FIG. 3A, and FIG. 5B corresponds to the development of FIG. It is sectional drawing which cut | disconnected the flow-path plate with the cut surface along a direction. 5B, one surface (surface on the bottom surface side) extending in the longitudinal direction of the flow channel 24 is formed so as to be exposed on the bottom surface (second surface) 36 of the flow channel plate 10. This flow path 24 is a flow path for crystallizing proteins by the gel counter diffusion method. The protein solution inlet 16, the precipitant inlet 18 a, the balance hole 32, the gel inlet 20, and the air vent hole 22 have one end (upper end) opened to the upper surface (first surface) 34 of the flow path plate, Their other ends (lower ends) open to the bottom surface (second surface) 36 of the flow path plate and communicate with the flow path 24.

図６は、この結晶作製器具の使用方法を説明する断面図である。（Ａ）乃至（Ｃ）は、いすれも、流路の長手方向に沿って切断した断面図である。まず、図６（Ａ）に示すように、流路プレート１０の底面（第２面）３６に第２カバーシート１４を貼り付ける。流路プレート１０の本体の材質は弾力性のあるＰＤＭＳであり、第２カバーシート１４の材質はポチエチレンテレフタレートであって、両者の密着性は優れており、第２カバーシート１４を流路プレート１０の底面３６に押し付けるだけで、流路２４を気密に封止するだけの密着性がある。次に、マイクロピペット（または、比較的低圧の加圧式注入シリンジ）を用いて、ゲル導入口２０にゲル３８を導入する。ゲル３８はゲル導入口２０から通路２４の内部へと広がっていく。ゲルの導入量は、沈殿剤導入口１８ａに隣接するバランス穴３２と空気抜き穴２２のところにゲル３８が見え始めるまでとする。空気抜き穴２２とバランス穴３２は同じ平面サイズで、かつ、ゲル導入口２０から等距離の位置にあるので、ゲル３８はゲル導入口２０からその両側の流路へと均等に充填される。 FIG. 6 is a cross-sectional view for explaining how to use this crystal production tool. (A) thru | or (C) are all sectional drawings cut | disconnected along the longitudinal direction of a flow path. First, as shown in FIG. 6A, the second cover sheet 14 is attached to the bottom surface (second surface) 36 of the flow path plate 10. The material of the main body of the flow path plate 10 is elastic PDMS, the material of the second cover sheet 14 is polyethylene terephthalate, and the adhesion between them is excellent. The adhesive is sufficient to hermetically seal the flow path 24 by simply pressing the bottom face 36 against the bottom face 36. Next, the gel 38 is introduced into the gel inlet 20 using a micropipette (or a relatively low pressure pressurized injection syringe). The gel 38 spreads from the gel inlet 20 into the passage 24. The amount of gel introduced is until the gel 38 begins to appear at the balance hole 32 and the air vent hole 22 adjacent to the precipitant inlet 18a. Since the air vent hole 22 and the balance hole 32 have the same planar size and are located at an equal distance from the gel inlet 20, the gel 38 is evenly filled from the gel inlet 20 into the flow paths on both sides thereof.

次に、図６（Ｂ）に示すように、マイクロピペットを用いて、沈殿剤導入口１８ａに沈殿剤４０を導入する。このとき、３個の沈殿剤導入口１８ａ，１８ｂ，１８ｃ（図２を参照）のすべてに沈殿剤４０を導入する。沈殿剤４０の導入量は、沈殿剤導入口の開口付近まで沈殿剤４０を満たすまでとする。次に、マイクロピペット（または、比較的低圧の加圧式注入シリンジ）を用いて、タンパク質溶液導入口１６にタンパク質溶液４２を導入する。タンパク質溶液４２は流路２４の内部を進んでいくが、タンパク質溶液４２が空気抜き穴２２のところに到達すると、空気抜き穴２２の内部を上昇する。タンパク質溶液４２の導入量は、タンパク質溶液導入口１６及び空気抜き穴２２の開口付近までタンパク質溶液４２を満たすまでとする。もし、空気抜き穴２２が無いと仮定すると、充填済みのゲル３８と、導入するタンパク質溶液４２との間に、空気溜まりができてしまうおそれがある。空気抜き穴２２があるおかげで、空気溜まりができるおそれはなく、空気が容易に逃げていく。 Next, as shown in FIG. 6B, the precipitant 40 is introduced into the precipitant inlet 18a using a micropipette. At this time, the precipitant 40 is introduced into all of the three precipitant inlets 18a, 18b, and 18c (see FIG. 2). The amount of the precipitating agent 40 introduced is such that the precipitant 40 is filled up to the vicinity of the opening of the precipitant introducing port. Next, the protein solution 42 is introduced into the protein solution introduction port 16 using a micropipette (or a relatively low pressure pressurized injection syringe). The protein solution 42 proceeds inside the flow path 24, but when the protein solution 42 reaches the air vent hole 22, the protein solution 42 rises inside the air vent hole 22. The amount of the protein solution 42 introduced is such that the protein solution 42 is filled to the vicinity of the openings of the protein solution inlet 16 and the air vent hole 22. If it is assumed that there is no air vent hole 22, there is a possibility that an air pocket may be formed between the filled gel 38 and the protein solution 42 to be introduced. Thanks to the air vent hole 22, there is no risk of air accumulation and air escapes easily.

沈殿剤４０とタンパク質溶液４２の導入が完了したら、図６（Ｃ）に示すように、流路プレート１０の上面（第１面）３４に第１カバーシート１２を貼り付ける。第１カバーシート１２も、第２カバーシート１４と同様に、ポリエチレンテレフタレートでできているので、第１カバーシート１２を流路プレート１０の上面３４に押し付けるだけで、タンパク質溶液導入口１６の開口、沈殿剤導入口１８ａ，１８ｂ，１８ｃの開口、ゲル導入口２０の開口、及び、空気抜き穴２２の開口を、気密に封止するだけの密着性がある。カバーシート１２、１４の材質のポリエチレンテレフタレートは、水分の透過性が低いので、水分の蒸発による結晶化はほとんど起きないと考えられる。タンパク質の結晶化は、ゲル３８を通して、タンパク質溶液４２が沈殿剤４０に拡散し、あるいは、沈殿剤４０がタンパク質溶液４２に拡散していく過程で、タンパク質溶液４２中でタンパク質の濃度が過飽和になることで達成されると考えられる。図６（Ｃ）では、通路２４内に生じたタンパク質結晶４４を模式的に示している。 When the introduction of the precipitant 40 and the protein solution 42 is completed, the first cover sheet 12 is attached to the upper surface (first surface) 34 of the flow channel plate 10 as shown in FIG. Similarly to the second cover sheet 14, the first cover sheet 12 is also made of polyethylene terephthalate. Therefore, simply pressing the first cover sheet 12 against the upper surface 34 of the flow path plate 10 opens the protein solution inlet 16; Adhesiveness is sufficient to hermetically seal the openings of the precipitant inlets 18a, 18b, and 18c, the opening of the gel inlet 20, and the opening of the air vent hole 22. Polyethylene terephthalate, which is the material of the cover sheets 12 and 14, has a low moisture permeability, so that it is considered that crystallization due to evaporation of moisture hardly occurs. In the protein crystallization, the protein solution 42 diffuses into the precipitant 40 through the gel 38, or the protein concentration in the protein solution 42 becomes supersaturated in the process of the precipitant 40 diffusing into the protein solution 42. This is considered to be achieved. FIG. 6C schematically shows the protein crystal 44 generated in the passage 24.

上述のように準備された結晶作製器具は、複数個まとめて、適当な透明なケースの中に入れてから、恒温装置の中にセットして、所定時間だけ静置しておき、タンパク質が結晶化するのを待つ。ケースと流路プレート１０と二つのカバーシート１２、１４は、すべて透明なので、外部からタンパク質の結晶化の様子を確認できる。十分な大きさの結晶ができたことを確認できたら、結晶作製器具内に結晶を保持した状態で結晶作製器具をそのままＸ線回折装置の試料ホルダーに取り付けて、タンパク質結晶のＸ線回折測定を実施できる。これにより、例えば、タンパク質結晶の結晶構造解析ができる。流路プレート１０は二つのカバーシート１２，１４で挟まれているので、直立させた状態で試料ホルダーに取り付けても、結晶や溶液が流出することがない。 Prepare a plurality of crystal preparation tools prepared as described above, put them in an appropriate transparent case, set them in a thermostatic apparatus, and let them stand for a predetermined time. Wait for it to turn. Since the case, the flow path plate 10 and the two cover sheets 12 and 14 are all transparent, the state of protein crystallization can be confirmed from the outside. After confirming that a sufficiently large crystal has been formed, attach the crystal preparation tool directly to the sample holder of the X-ray diffractometer while holding the crystal in the crystal preparation tool, and perform X-ray diffraction measurement of the protein crystal. Can be implemented. Thereby, for example, a crystal structure analysis of a protein crystal can be performed. Since the flow path plate 10 is sandwiched between the two cover sheets 12 and 14, even if it is attached to the sample holder in an upright state, crystals and solutions do not flow out.

本発明の結晶作製器具は、ゲル導入口、沈殿剤導入口及びタンパク質溶液導入口に、それぞれ、ゲル、沈殿剤及びタンパク質溶液を導入するだけでセットアップが完了するので、非常に簡便であり、サンプル量が微量であっても、再現性が良好である。そして、空気抜き穴があるので、ゲルとタンパク質溶液を導入する際に、大きな加圧力を必要としない。ひとつの結晶作製器具当たり（ひとつの条件当たり）のサンプル量は非常に少なくて済み、例えば、タンパク質溶液の必要量はマイクロリットルのオーダーである。 The crystal preparation instrument of the present invention is very simple because the setup is completed simply by introducing the gel, the precipitant, and the protein solution into the gel inlet, the precipitant inlet, and the protein solution inlet, respectively. Reproducibility is good even if the amount is very small. And since there exists an air vent hole, when introducing a gel and a protein solution, a big pressurizing force is not required. The amount of sample per crystal production tool (per condition) is very small, for example, the required amount of protein solution is on the order of microliters.

図７は複数の流路プレート１０を共通のカバーシートで挟んだ状態を示す平面図である。本発明の結晶作製器具は、図１に示すように、ひとつの流路プレート１０を二つのカバーシート１２，１４で挟む構造のほかに、図７に示すように、複数の流路プレート１０を共通のカバーシートで挟んだ構造にすることもできる。このようにすると、小さいサイズの結晶作製器具を複数個まとめて取り扱うのに便利である。図７の例では、７個の流路プレート１０を隣り合うように並べてから、これらを共通の第２のカバーシート１４に貼り付けて、その状態で、ゲルと沈殿剤とタンパク質溶液の導入作業を行うことができる。その後、共通の第１のカバーシート１２を貼り付ける。二つのカバーシート１２，１４は、７個の流路プレート１０を並べた状態の寸法（８５．４ｍｍ×２６ｍｍ）に対して、その周囲に２ｍｍ程度突き出すようなサイズ（９０ｍｍ×３０ｍｍ）にしている。この状態のままで、結晶成長作業を行い、結晶をＸ線回折測定するときになって、個別の結晶作製器具に分離する。すなわち、隣り合う流路プレート１０の境界線４６のところで、上下のカバーシート１２，１４をカッターで切断することで、個別の結晶作製器具に分離できて、分離された結晶作製器具は、流路プレート１０が上下のカバーシート１２，１４で挟まれた状態のものとなる。この状態の結晶作製器具を、結晶を保持したままで、Ｘ線回折装置の試料ホルダーに取り付けることができる。 FIG. 7 is a plan view showing a state in which a plurality of flow path plates 10 are sandwiched between common cover sheets. As shown in FIG. 1, the crystal production tool of the present invention has a structure in which a single flow path plate 10 is sandwiched between two cover sheets 12 and 14, as shown in FIG. It is also possible to adopt a structure sandwiched between common cover sheets. In this way, it is convenient to handle a plurality of small-sized crystal production tools together. In the example of FIG. 7, the seven flow path plates 10 are arranged so as to be adjacent to each other, and these are attached to the common second cover sheet 14, and in this state, the gel, the precipitant, and the protein solution are introduced. It can be performed. Thereafter, the common first cover sheet 12 is attached. The two cover sheets 12 and 14 are sized (90 mm × 30 mm) so as to protrude about 2 mm around the dimensions (85.4 mm × 26 mm) in a state where the seven flow path plates 10 are arranged. . In this state, the crystal growth operation is performed, and when the crystal is measured by X-ray diffraction, it is separated into individual crystal production tools. That is, the upper and lower cover sheets 12 and 14 are cut with a cutter at the boundary line 46 between the adjacent flow path plates 10, so that they can be separated into individual crystal production tools. The plate 10 is sandwiched between the upper and lower cover sheets 12 and 14. The crystal production tool in this state can be attached to the sample holder of the X-ray diffractometer while holding the crystal.

この結晶作製器具を用いてタンパク質結晶を作製するときの導入材質については、特に制約はないが、例えば、次のようなものを使用できる。タンパク質溶液としては、例えば、リゾチーム溶液やソーマチン溶液、インスリン溶液などを使用できる。沈殿剤としては、タンパク質溶液の材質に対応した適当な沈殿剤を使用できる。ゲルとしては、例えば、アガロースゲルを使用できる。 Although there is no restriction | limiting in particular about the introductory material when producing a protein crystal using this crystal preparation instrument, For example, the following can be used. As the protein solution, for example, a lysozyme solution, a thaumatin solution, an insulin solution, or the like can be used. As the precipitant, an appropriate precipitant corresponding to the material of the protein solution can be used. For example, an agarose gel can be used as the gel.

二つのカバーシート１２、１４の材質は、ＰＤＭＳとの間で密着性の良好なものとして、上述のポリエチレンテレフタレートを使うことができ、そのほかには、ポリイミドまたはポリテトラフルオロエチレンを使うことができる。 As the material of the two cover sheets 12 and 14, the above-mentioned polyethylene terephthalate can be used as a material having good adhesion with PDMS, and polyimide or polytetrafluoroethylene can be used in addition thereto.

本発明の結晶作製器具の一実施例の分解斜視図である。It is a disassembled perspective view of one Example of the crystal production instrument of this invention. 流路プレート１０の上面（第１面）を示した平面図である。3 is a plan view showing an upper surface (first surface) of the flow path plate 10. FIG. 流路プレートに形成された切り取り部を直線状に展開したときの展開図である。It is an expanded view when the cutout part formed in the flow-path plate is expand | deployed linearly. 流路を直角に横切る切断面で切断したときの流路プレートの部分断面図である。It is a fragmentary sectional view of a flow path plate when it cut | disconnects by the cut surface which crosses a flow path at right angle. （Ａ）は図３（Ａ）に示した展開図の一部を拡大した拡大展開図であり、（Ｂ）は流路の長手方向に沿った切断面で流路プレートを切断した断面図である。(A) is an expanded development view in which a part of the development view shown in FIG. 3 (A) is enlarged, and (B) is a cross-sectional view of the flow path plate cut along a cut surface along the longitudinal direction of the flow path. is there. 結晶作製器具の使用方法を説明する断面図である。It is sectional drawing explaining the usage method of a crystal preparation instrument. 複数の流路プレートを共通のカバーシートで挟んだ状態を示す平面図である。It is a top view which shows the state which pinched | interposed the several flow-path plate with the common cover sheet.

Explanation of symbols

１０流路プレート
１２第１カバーシート
１４第２カバーシート
１６タンパク質溶液導入口
１８ａ，１８ｂ，１８ｃ沈殿剤導入口
２０ゲル導入口
２２空気抜き穴
２４流路
２６第１端部
２８第２端部
３０ａ，３０ｂ連通路
３２バランス穴
３４流路プレートの上面（第１面）
３６流路プレートの底面（第２面）
３８ゲル
４０沈殿剤
４２タンパク質溶液
４４タンパク質結晶
４６境界線 DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 Flow path plate 12 1st cover sheet 14 2nd cover sheet 16 Protein solution inlet 18a, 18b, 18c Precipitant inlet 20 Gel inlet 22 Air vent hole 24 Channel 26 1st end 28 2nd end 30a, 30b Communication path 32 Balance hole 34 Upper surface of flow path plate (first surface)
36 Bottom of flow path plate (second surface)
38 Gel 40 Precipitant 42 Protein solution 44 Protein crystal 46 Boundary line

Claims

A crystal production instrument for producing a crystal of a substance from a substance solution containing a substance to be crystallized, comprising the following (a) to (c).
(A) A flow path plate including the following (a) to (f).
(A) A flat plate-like main body having a first surface and a second surface.
(B) A long and narrow flow channel formed in the main body, which has a first end and a second end, and one surface extending in the longitudinal direction of the flow channel is exposed on the second surface. The flow path is bent so that the length from the first end to the second end along the flow path is at least three times the linear distance from the first end to the second end. A flow path characterized by being.
(C) A substance solution introduction port formed in the main body, wherein one end is open on the first surface and the other end communicates with the first end of the flow path.
(D) A crystal formation solution introduction port formed in the main body, one end of which opens to the first surface and the other end communicates with the second end of the flow path. mouth.
(E) A gel inlet formed in the main body, one end of which is open on the first surface and the other end is in communication with the channel in the middle of the channel.
(F) An air vent hole formed in the main body, one end of which is open on the first surface and the other end is located at a point between the first end of the flow path and the gel inlet. Air vent hole communicating with the road.
(A) A first cover sheet covering the first surface, wherein at least the opening of the substance solution introduction port, the opening of the crystal formation solution introduction port, the opening of the air vent hole and the opening of the gel introduction port are airtight. A first cover sheet to cover.
(C) A second cover sheet that covers the second surface, and airtightly covers at least an opening extending in the longitudinal direction of the flow path.

2. The crystal production tool according to claim 1, wherein a planar size of the main body of the flow path plate is in a range of 50 mm × 50 mm.

3. The crystal production tool according to claim 1, wherein the thickness of the main body of the flow path plate is in a range of 0.5 to 2.0 mm.

The crystal production tool according to any one of claims 1 to 3, wherein the flow path has a spiral shape.

The crystal production instrument according to any one of claims 1 to 4, wherein a plane size of the crystal formation solution introduction port is formed larger than a plane size of the air vent hole, A crystal production tool, wherein a balance hole having substantially the same plane size as the air vent hole is formed integrally with the crystal forming solution introduction port at a communication portion with the second end portion.

6. The crystal production device according to claim 5, wherein the length of the flow path from the gel inlet to the air vent hole is substantially equal to the length of the flow path from the gel inlet to the balance hole. A crystal production tool characterized by.

The crystal production tool according to any one of claims 1 to 6, wherein a material of the main body of the flow path plate is polydimethylsiloxane.

8. The crystal production tool according to claim 7, wherein a material of the first cover sheet and the second cover sheet is polyethylene terephthalate, polyimide, or polytetrafluoroethylene.

9. The crystal production tool according to claim 1, wherein the flow path has a width and a depth of 0.05 to 1.00 mm.