JP4848512B2

JP4848512B2 - Ｄ４０或いはｃａｓｃ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質をコードする遺伝子、及び、該遺伝子産物をターゲットとした癌細胞の増殖・分裂阻止及び細胞死の誘導方法、及び、該増殖・分裂阻止及び細胞死を誘導する物質のスクリーニング方法

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Publication number: JP4848512B2
Application number: JP2005303676A
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Inventors: 将人瀧本; ウラタユリ; 暹葛巻
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Priority date: 2005-10-18
Filing date: 2005-10-18
Publication date: 2011-12-28
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Description

本発明は、癌細胞中における癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制することにより、癌細胞の増殖・分裂を阻止及び／又は細胞死を誘導する方法、該方法に用いられる癌細胞の選択的増殖・分裂の阻止及び／又は細胞死の誘導剤、及び、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質をターゲットとした癌細胞の増殖・分裂の阻止及び／又は細胞死の誘導物質、或いは癌の治療及び／又は予防剤のスクリーニング方法に関する。

精巣は数多くの精巣特異的遺伝子を発現するが（Reprod. Fertility & Develop. 7, 695-704, 1995；Int. J. Develop. Biol. 40, 379-83, 1996）、それらの殆どは全くあるいは極く稀にしか一般の腫瘍では活性化しないと報告されている（Biochem. Biophys. Res. Comm. 241, 653-657, 1997）。しかし最近の研究により、癌と正常精巣両者に発現する遺伝子群が同定され、それらの中には、宿主に免疫応答を引き起こすものがあり、癌・精巣抗原（cancer-testis antigen：ＣＴ抗原）と呼ばれている。また、癌・精巣抗原遺伝子に対して相同的な塩基配列をもつが、精巣のみならず両性の生殖器官において表現されている遺伝子も知られている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 10757-62, 1998；Cancer Res. 59, 1445-8, 1999；J. Biol. Chem. 273, 17618-25, 1998）。

癌・精巣抗原をコードする遺伝子を含めた上記の遺伝子は癌・精巣関連遺伝子と称される。癌患者に免疫反応を惹起する抗原をコ−ドする癌・精巣関連遺伝子としては、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＳＳＸ等の遺伝子が知られている（Science 254, 1643-7, 1991；Immunity 2, 167-75, 1995；J. Exp. Med. 182, 689-98, 1995；Int. J. Cancer 76, 903-8, 1998；Int. J. Cancer 72, 965-71, 1997；Cancer Res. 56, 4766-72, 1996）。

これまで知られている殆どの癌・精巣関連遺伝子は、ヒトＸ染色体に存在する。例えば、ＭＡＧＥサブファミリーはＸ染色体の4つの領域、Ｘｑ２８、Ｘｑ２１．３、Ｘｑ２６及びＸｑ１１．２３（Immunogenet. 40, 360-9, 1994；Cancer Res. 58, 743-52, 1998；Genomics 59, 161-7, 1999）に存在する。また、ＳＳＸ遺伝子はＸｑ１１．２（Nature Genet. 7, 502-8, 1994）に、ＬＡＧＥ１とＮＹ−ＥＳＯ−１はＸｑ２８（Cancer J From Scientific American 5: 16-17, 1999；Intl J Cancer 76, 903-908, 1998）に、またＧＡＧＥ遺伝子はＸｐ１１．２−Ｘｐ１１．４（Cancer Res. 59, 3157-3165, 1999）の間に存在する。しかし、最近、第１染色体に存在することが知られるシナプトネマル複合タンパク質（ＳＣＰ１）は癌・精巣関連遺伝子群の一員であることが示され（EMBO J. 11, 5091-5100, 1992）、また同時にこれはＨＯＭ−ＴＥＳ−１４遺伝子（Cytogen Cell Genet 78, 103-104, 1997；Proc Natl Acad Sci USA 95, 5211-5216, 1998）と同一であることも明らかにされている。

本発明者は、最近、癌・精巣関連遺伝子についての研究の中から、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０を発現する遺伝子を見い出し、該遺伝子をクローニングした（特開２００２−８５０７１号公報）。該癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０を発現する遺伝子は、正常組織の中では精巣のみに高発現するが、一方で、癌においては種々の組織・細胞由来の多くの培養癌細胞や肺癌などのヒト原発癌においても高頻度に発現していることが明らかとなった。該癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０を発現する遺伝子は、非喫煙者に比べ喫煙者由来の肺癌に高頻度に発現している。また、高分化度の肺癌に比べ、低分化度の肺癌において該Ｄ４０を発現する遺伝子の発現頻度は優位に高いことが示されている。

しかし、これまで、該Ｄ４０を発現する遺伝子が、多くのヒト組織・臓器由来の癌細胞株と原発癌に高頻度に発現し、正常組織では精巣のみに高発現していることが知られているだけで、該遺伝子及び該遺伝子の発現産物である癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０の癌細胞における機能については、これまで殆んど知られていなかった。

特開２００２−８５０７１号公報。 Reprod. Fertility & Develop. 7, 695-704, 1995。 Int. J. Develop. Biol. 40, 379-83, 1996。 Biochem. Biophys. Res. Comm. 241, 653-657, 1997。 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 10757-62, 1998。 Cancer Res. 59, 1445-8, 1999。 J. Biol. Chem. 273, 17618-25, 1998。 Science 254, 1643-7, 1991。 Immunity 2, 167-75, 1995。 J. Exp. Med. 182, 689-98, 1995。 Int. J. Cancer 76, 903-8, 1998。 Int. J. Cancer 72, 965-71, 1997。 Cancer Res. 56, 4766-72, 1996。 Immunogenet. 40, 360-9, 1994 Cancer Res. 58, 743-52, 1998。 Genomics 59, 161-7, 1999。 Nature Genet. 7, 502-8, 1994。 Cancer J From Scientific American 5: 16-17, 1999。 Intl J Cancer 76, 903-908, 1998。 Cancer Res. 59, 3157-3165, 1999。 EMBO J. 11, 5091-5100, 1992。 Cytogen Cell Genet 78, 103-104, 1997。 Proc Natl Acad Sci USA 95, 5211-5216, 1998

本発明の課題は、癌細胞中における癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質をコードする遺伝子をターゲットとして、癌細胞の増殖・分裂を阻止及び／又は細胞死を誘導する方法、該方法に用いられる癌細胞の選択的増殖・分裂の阻止及び／又は細胞死の誘導剤、及び、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質をターゲットとした癌細胞の増殖・分裂の阻止及び／又は細胞死の誘導物質或いは癌の治療及び／又は予防剤のスクリーニング方法を提供することにある。

本発明者は、本発明者が先にクローニングした癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０を発現する遺伝子及び該遺伝子の発現産物である癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０（特開２００２−８５０７１号公報）の機能について、鋭意検討する中で、該遺伝子の発現が、細胞の増殖・分裂と深く係わっており、癌細胞中における該遺伝子の発現を抑えることにより、癌細胞の分裂に異常が生じ、結果として癌細胞の死と、強い増殖阻止が起こることを見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、癌細胞中における癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制することにより癌細胞の増殖・分裂を阻止及び／又は細胞死を誘導し、癌細胞の増殖・分裂の阻止及び／又は細胞死を誘導する方法からなる。本発明において、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質を発現する遺伝子は、多くのヒト原発癌に発現する一方で、精巣以外の正常組織の中では発現が認められないことから、該遺伝子の発現を抑制することにより、癌細胞に選択的に増殖・分裂を阻止することが可能となる。

本発明において、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制するには、Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシング変異体タンパク質のｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉により行うことができる。該Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質のｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉は、二本鎖ＲＮＡ分子のような、Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質のｍＲＮＡに対する標的特異的ＲＮＡ分子を癌細胞内へ導入することにより行うことができる。該二本鎖ＲＮＡ分子としては、配列表の配列番号１及び該ＲＮＡ鎖の相補配列からなる二本鎖ＲＮＡ分子、配列表の配列番号２及び該ＲＮＡ鎖の相補配列からなる二本鎖ＲＮＡ分子、又は、配列表の配列番号３及び該ＲＮＡ鎖の相補配列からなる二本鎖ＲＮＡ分子を挙げることができる。

また、本発明は、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質を発現する細胞に、被検物質を導入して、癌細胞の増殖・分裂の阻止及び／又は細胞死の誘導について評価することにより、癌細胞の増殖・分裂の阻止及び／又は細胞死の誘導物質、或いは癌の治療及び／又は予防剤をスクリーニングする方法よりなる。該癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質を発現する細胞としては、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質を発現する癌動物細胞、或いは、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質をコードする遺伝子を導入した動物細胞を用いることができ、該動物細胞としては樹立された癌細胞株を用いることができる。

癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質をコードする遺伝子としては、遺伝子データーベースGen Bankにアクセッションナンバー、ＢＡＣ０５６９１、ＮＰ７３３４６８又はＡＡＦ９７５１３として登録されているアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、或いは、遺伝子データーベースGen Bankにアクセッションナンバー、ＡＢ０２２１９０、ＮＭ１７０５８９、又はＡＦ２４８０４１として登録されている塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。該癌細胞の増殖・分裂の阻止及び／又は細胞死の誘導物質のスクリーニングにより、癌の治療及び／又は予防剤のスクリーニングを行うことができる。

すなわち具体的には本発明は、（１）癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質のｍＲＮＡに対する標的特異的ＲＮＡ分子からなる癌細胞の選択的増殖・分裂の阻止及び／又は細胞死の誘導剤や、（２）標的特異的ＲＮＡ分子が、二本鎖ＲＮＡ分子であることを特徴とする前記（１）記載の癌細胞の選択的増殖・分裂の阻止及び／又は細胞死の誘導剤や、（３）二本鎖ＲＮＡ分子からなる、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質のｍＲＮＡに対する標的特異的ＲＮＡ分子が、配列表の配列番号１及び該ＲＮＡ鎖の相補配列からなる二本鎖ＲＮＡ分子、配列表の配列番号２及び該ＲＮＡ鎖の相補配列からなる二本鎖ＲＮＡ分子、又は、配列表の配列番号３及び該ＲＮＡ鎖の相補配列からなる二本鎖ＲＮＡ分子であることを特徴とする前記（２）記載の癌細胞の選択的増殖・分裂の阻止及び／又は細胞死の誘導剤からなる。

従来より、抗癌剤の開発において、癌細胞の増殖・分裂を抑える薬剤は種々開発されているが、多くは、癌細胞のみならず、正常細胞に対しても作用し、結果として重篤な副作用の問題が生じていた。本発明において、ターゲットとしている癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質をコードする遺伝子は、多くのヒト原発癌に発現している一方で、精巣以外の正常組織の中では発現が認められないことから、本発明の方法によって、該遺伝子の発現を特異的に抑制することにより、副作用の問題を回避して、癌細胞を選択的に、その増殖・分裂を阻止することが可能となる。

また、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質をコードする遺伝子は、多くのヒト原発癌に発現していることから、本発明の方法により、該遺伝子の発現を抑え、癌細胞の増殖・分裂を阻止することにより、多くのヒト原発癌の予防及び／又は治療を可能とする。特に、肺癌では、分化度の低い（より悪性の）癌、及び喫煙者由来の癌において癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質の発現頻度が高いことから、特にこれらの癌の予防及び／又は治療への本発明の方法の適用が期待される。

更に、本発明においては、本発明において見い出した、癌細胞の増殖・分裂の阻止に関与する癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質をターゲットとして、癌細胞の増殖・分裂の阻止及び／又は細胞死の誘導物質をスクリーニングすることにより、多種の癌に対する治療及び／又は予防剤の開発が可能となる。

本発明は、癌細胞中における癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制することにより癌細胞の増殖・分裂を阻止及び／又は細胞死を誘導し、癌細胞の増殖・分裂の阻止及び／又は細胞死の誘導を行う方法よりなる。本発明において、ターゲットとなる癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０をコードする遺伝子については、既に、本発明者がクローニングし、その塩基配列を明らかにしている（特開２００２−８５０７１号公報）。癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０の遺伝子は、転写後、オルタネティブスプライシング（alternative splicing）により、複数のｍＲＮＡとなり、それらは、複数のｃＤＮＡとしてクローニングされている。したがって、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０には、複数のスプライシングアイソフォームタンパク質がある。それらは、例えば、ＣＡＳＣ５／ＡＦ１５ｑ１４／ＫＩＡＡ１５７０として知られている。癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０のアミノ酸配列については、本発明者が、既に、その構造を明らかにしている（特開２００２−８５０７１号公報）。

また、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質の配列情報については、遺伝子データーベースGen Bankへ、アクセッションナンバー、ＢＡＣ０５６９１、ＮＰ７３３４６８又はＡＡＦ９７５１３としてアクセスすることにより得ることができ、該アミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子の配列情報については、遺伝子データーベースGen Bankへ、アクセッションナンバー、ＡＢ０２２１９０、ＮＭ１７０５８９、又はＡＦ２４８０４１としてアクセスすることにより得ることができる。

本発明において、該癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する方法としては、Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質のｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉により行うことができる。癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質をコードする遺伝子の発現を、Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質のｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉法により抑制するには、Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質のｍＲＮＡに対する標的特異的ＲＮＡ分子を、合成法等を用いて構築し、該標的特異的ＲＮＡ分子を癌細胞内へ導入することにより行うことができる。

該癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質のｍＲＮＡに対する標的特異的ＲＮＡ分子としては、有利には、二本鎖ＲＮＡ分子を用いることができ、本発明において特に有利に用いる二本鎖ＲＮＡ分子としては、配列表の配列番号１(SenseRNA:gguaaaaguc ccauagaaat t)及び該ＲＮＡ鎖の相補配列からなる二本鎖ＲＮＡ分子、配列表の配列番号２(SenseRNA:ggacgaaagu guacagaaat t)及び該ＲＮＡ鎖の相補配列からなる二本鎖ＲＮＡ分子、又は、配列表の配列番号３(SenseRNA:ggaaaaaacu uggguguuut t)及び該ＲＮＡ鎖の相補配列からなる二本鎖ＲＮＡ分子を用いることができる。

ＲＮＡ干渉法により遺伝子を抑制する方法自体は、公知の方法に従って、実施することができる。本発明において利用する、ＲＮＡ干渉（或いは、ＲＮＡｉ、ＲＮＡ interference）とは、アンチセンスＲＮＡや、アンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとが互いに結合して形成された二本鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ二重鎖：ｄｓＲＮＡ）を細胞内へ導入することによって、該ｄｓＲＮＡと相同な配列を持つｍＲＮＡが分解され、遺伝子の発現を抑制するという現象が引き起こされるが、このｄｓＲＮＡ等の導入によって遺伝子の発現が抑制される現象をいい、本発明においては、該ＲＮＡ干渉を利用する。すなわち、アンチセンスＲＮＡは、ＤＮＡより転写されるｍＲＮＡ（センスＲＮＡ）に対し、その遺伝情報が裏返しとなった転写物のことを意味し、このアンチセンスＲＮＡは、標的遺伝子からつくられるｍＲＮＡと構造的に相補性を有しているので、両者は互いに結合して二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成する。このように、言わば“フタ”をかぶされたｍＲＮＡは、特異的ＲＮＡ分解酵素によって分解され、タンパク質合成の場への移行ができなくなり、本来の遺伝子の機能が抑制される。本発明は、かかる遺伝子機能の抑制を利用する。

２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）等の細胞内への導入によって、ｄｓＲＮＡと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑制される現象であるＲＮＡ干渉は、１９９８年に線虫（Caenorhabditis elegans）で初めて発見されて以来、多くの報告がなされており（Nature 391, 806-811,1998; Nature 411, 494-498, 2001; Science, 296,550-553, 2002; Genes Dev 16, 948-958, 2002）、種々の方法が開示されている（ＷＯ９９／３２６１９号公報；ＷＯ００／４４８９５号公報；特開２００４−１６６５７７号公報；特開２００５−３４００８号公報；特表２００４−５１９４５８号公報）。本発明において、ＲＮＡ干渉により遺伝子の発現を抑制するには、これら公知の方法を用いて、適宜、実施することができる。

また、本発明は、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質を発現する細胞に、被検物質を導入して、癌細胞の増殖・分裂の阻止及び／又は細胞死の誘導について評価することにより、癌細胞の増殖・分裂の阻止及び／又は細胞死の誘導物質をスクリーニングする方法からなる。該スクリーニング方法においては、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質を発現する細胞、或いは、該細胞を構築することにより行うことができる。癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質を発現する細胞としては、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質を発現する癌動物細胞を挙げることができる。

また、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質を発現する細胞としては、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質をコードする遺伝子を導入した動物細胞を挙げることができる。該癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質を発現する細胞を構築するに際して、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質のアミノ酸配列については、遺伝子データーベースGen Bankから、アクセッションナンバー、ＢＡＣ０５６９１、ＮＰ７３３４６８又はＡＡＦ９７５１３として、及び、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列については、遺伝子データーベースGen Bankから、アクセッションナンバー、ＡＢ０２２１９０、ＮＭ１７０５８９、又はＡＦ２４８０４１として得ることができる。

本発明において、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質を発現する細胞の構築に際して該遺伝子を宿主動物細胞に導入するには、上記遺伝子の配列情報に基づき、公知の方法を用いて行うことができる（特開２００２−８５０７１号公報）。本発明において、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質を発現する細胞の構築に用いる宿主細胞の好ましい例としては、ＨｅＬａ、２９３、ＰＣ−１０（肺癌）のような動物細胞の樹立された癌細胞核を挙げることができる。

癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞へ導入するには、適宜、公知の方法を用いることができる、例えば、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。

本発明の癌細胞の増殖・分裂の阻止及び／又は細胞死の誘導物質のスクリーニング方法は、上記のようにして構築した癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質を発現する細胞に、被検物質を導入して、癌細胞の増殖・分裂の阻止及び／又は細胞死の誘導について評価することにより行うことができる。該癌細胞の増殖・分裂の阻止及び／又は細胞死の誘導物質のスクリーニングにおける評価から、癌の治療及び／又は予防剤のスクリーニングを行うことができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

（タンパク質Ｄ４０をノックダウンすることによる細胞増殖抑制）
増殖中の細胞では、Ｄ４０ｍＲＮＡの発現量は高く、増殖を停止させると急激に低下する。タンパク質レベルにおいても、ＨｅＬａ、２９３、ＰＣ１０（肺癌）等のヒト培養株細胞で、増殖状態とタンパク質Ｄ４０の発現レベルとの相関が認められる。そこで、タンパク質Ｄ４０の発現を抑制することで、細胞の増殖・分裂に対する変化を検討した。

（合成ｄｓＲＮＡを用いた細胞増殖抑制）
化学合成した二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いて、トランジェント（transient）な系で、Ｄ４０に対するＲＮＡｉを試みた。タンパク質Ｄ４０をコードする遺伝子の塩基配列の中から、約２０baseからなる３箇所の配列を選び、ｄｓＲＮＡを合成した（配列表の配列番号１〜３及び該ＲＮＡ鎖の相補配列）。これらをOligofectamineと混合後に、ＨｅＬａ細胞に４時間接触させてトランスフェクションした（リポフェクション法）。４８時間後に、タンパク質の発現を検討したところ、コントロールのｄｓＲＮＡをトランスフェクションした場合に比べ、タンパク質Ｄ４０の発現の約８０％の低下を認め、また、細胞増殖能が低下していることが観察された。７２時間後の生細胞数と死細胞数とを棒グラフで表した結果を、図１に示す。また、４８時間後、及び、７２時間後の細胞の増殖割合、細胞死の割合を、それぞれ図２及び図３に示す。

更に、ＦＡＣＳ（Fluorescent activated cell sorter）により、Ｄ４０ｄｓＲＮＡをトランスフェクションされた細胞の細胞周期を解析したところ、トランスフェクション後、４８時間では、Ｇ１の細胞に比べ、Ｇ２／Ｍ期の細胞が相対的に増加していることが観察された。７２時間後の細胞をPropidium Iodine（ＰＩ）染色し、ＦＡＣＳで細胞周期の分布を解析した結果を、図４（Control dsRNA）及び図５（D40 dsRNA）に示す。図中、縦軸は、ＰＩの蛍光の強さを示し、横軸は細胞数を示す。図に示されるように、コントロールのｄｓＲＮＡを導入されたＨｅＬａ細胞に比べ、Ｄ４０ｄｓＲＮＡを導入された細胞では、Ｇ１期（Ｍ２）の細胞が減少し、subＧ１期（Ｍ１）の細胞数が増えている。これは、タンパク質Ｄ４０の発現低下のため、Ｇ２／Ｍ期（Ｍ４）の４倍体の細胞が分裂できず（Ｍ２の低下）に細胞死に陥った（Ｍ１の増加）ことを示している。上記、実験から、タンパク質Ｄ４０が細胞分裂において重要な役割を担っていることが示された。

本発明の合成ｄｓＲＮＡを用いた細胞増殖抑制の実施例において、７２時間後の生細胞数と死細胞数とを棒グラフで表した結果を、示す図である。本発明の合成ｄｓＲＮＡを用いた細胞増殖抑制の実施例において、４８時間後、及び、７２時間後の細胞の増殖割合について示す図である。本発明の合成ｄｓＲＮＡを用いた細胞増殖抑制の実施例において、４８時間後、及び、７２時間後の細胞の細胞死の割合について示す図である。本発明の合成ｄｓＲＮＡを用いた細胞増殖抑制の実施例において、７２時間後の細胞をPropidium Iodine（ＰＩ）染色し、ＦＡＣＳで細胞周期の分布を解析した結果を、（Control dsRNA）について示す図である。本発明の合成ｄｓＲＮＡを用いた細胞増殖抑制の実施例において、７２時間後の細胞をPropidium Iodine（ＰＩ）染色し、ＦＡＣＳで細胞周期の分布を解析した結果を、（D40 dsRNA）について示す図である。

Claims

癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質のｍＲＮＡに対する標的特異的ＲＮＡ分子からなる癌細胞の選択的増殖・分裂の阻止及び／又は細胞死の誘導剤。
標的特異的ＲＮＡ分子が、二本鎖ＲＮＡ分子であることを特徴とする請求項１記載の癌細胞の選択的増殖・分裂の阻止及び／又は細胞死の誘導剤。
二本鎖ＲＮＡ分子からなる、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０或いはＣＡＳＣ５、又は、該癌・精巣抗原タンパク質のスプライシングアイソフォームタンパク質のｍＲＮＡに対する標的特異的ＲＮＡ分子が、配列表の配列番号１及び該ＲＮＡ鎖の相補配列からなる二本鎖ＲＮＡ分子、配列表の配列番号２及び該ＲＮＡ鎖の相補配列からなる二本鎖ＲＮＡ分子、又は、配列表の配列番号３及び該ＲＮＡ鎖の相補配列からなる二本鎖ＲＮＡ分子であることを特徴とする請求項２記載の癌細胞の選択的増殖・分裂の阻止及び／又は細胞死の誘導剤。