JP4845279B2 - Biological function measurement method - Google Patents
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、通常の顕微鏡による観察方法を適用できない条件下、例えば観察対象が大きな動物の場合や動物が活動しているときの脳内情報を得ようとした場合において、極微小領域からの蛍光信号を得ることができ、極短パルスレーザ光による多光子励起を応用した生体機能測定装置並びにファイバープローブ光検出装置を開発したものであり、例えば近赤外極短パルスレーザ光源とファイバープローブとを用いたファイバープローブ光検出装置と、それを用いた生体機能測定装置に関する。
【0002】
【従来の技術】
走査機能を有する顕微鏡ないしプローブにレーザ光をファイバーに通して導入して、画像を取得するスキャニング共焦点顕微鏡については特開平3−87804号公報に開示されている。
【0003】
また、極短パルスレーザと顕微鏡を組み合わせた多光子励起レーザ顕微鏡装置については特許2848952号公報に公開され、さらに極短パルスレーザとファイバーを用い、光学デバイスにレーザ光を導光して標本に照射する超短光パルスの伝達装置、発生装置および伝達方法に関しては特開平10−186424号公報に公開されている。
【0004】
図5は、特開平3−87804号公報(第1の先行例)に開示されているスキャニング共焦点顕微鏡装置を示す図である。
【0005】
レーザ光源51からのレーザ光は、レンズ52を介してファイバー53に導入される。
【0006】
レーザ光は、カプラ54、ファイバー55を介して、ハウジング56の内部に設置された圧電素子59上の保持具57で保持される。
【0007】
ファイバー55から出射されたレーザ光は、レンズ60a,60bによって標本58の焦点位置58aに集光する。
【0008】
焦点位置58aからの反射光ないし蛍光は再びレンズ60a,60b、ファイバー55を通り、カプラ54によってファイバー61に入射する。
【0009】
さらに、フィルター62で波長を選択し、光電変換素子63によって電気量に変換され、コンピュータ64に入力される。
【0010】
なお、コンピュータ64はドライバ65およびケーブル67を介して圧電素子59を制御する。
【0011】
この圧電素子59によってファイバー55の先端が傾き、レーザのレンズ60aに対する入射角度を変え、標本58内の焦点位置58aを光軸垂直方向に変えることができる。
【0012】
このようにファイバー55先端を走査して得られた蛍光量をコンピュータ64によって画像構築し、モニター66で表示することができることが記載されている。
【0013】
図6は、特開平10−186424号公報(第2の先行例)に開示されている超短光パルスの伝送装置を示す図である。
【0014】
レーザ光源1は極短パルスレーザである。
【0015】
レーザ光源1とファイバー3との間にはパルスストレッチャー光学系2が設置されている。
【0016】
ファイバー3を通過したレーザ光はパルスコンプレッサー光学系4を通り、光学デバイス5に入射される。
【0017】
この先行例の作用について説明する。
【0018】
レーザ光源1から発せられた極短パルスレーザ光はパルスストレッチャー光学系2に入射される。
【0019】
パルスストレッチャー光学系2では光源から発せられたレーザ光のパルス幅を伸ばし、1パルスあたりのピークパワーを減少させる。
【0020】
パルスレーザ光は、数ナノメートル程度の波長幅を有している。
【0021】
ファイバーなどの媒質を透過する際に長波長側の波長成分の光が先に進むため、入射されるレーザ光の波長に対してその波長の短い方を早く出力し、長い方を遅く出力するように入射するレーザ光を分光し波長に対応して光路長を調整できるよう、たとえばプリズムやグレーティングなどの分光光学素子を使用している。
【0022】
パルスストレッチャー光学系2を通ったレーザ光は、短波長側を早く、長波長側を遅くファイバー3に入射する。
【0023】
ファイバー3を透過中に長波長側が早く進むのでパルス幅は入射時よりも短くなり、ファイバー3から出射される。
【0024】
パルス長が短くなったレーザ光は、さらにパルスコンプレッサー光学系4に導入され、パルス幅が圧縮される。
【0025】
ただし、パルスコンプレッサー光学系4からは短波長側が若干早い極短パルスのレーザ光が出射される。
【0026】
そして、さらに光学デバイス5に入射されて、標本までの間にリレー光学系、対物レンズ(図示せず)などの光学系を透過する間にさらに短波長側の光が遅れるため結果的に標本面において元々のレーザ光のもつパルス幅に近いパルス幅でレーザ光を標本に照射することができる。
【0027】
ここで、光学デバイス5は走査型顕微鏡を想定しており、通常の顕微鏡にレーザ光を走査する偏向光学系が配備され、標本上にレーザ光を走査させて画像を取得するものである。
【0028】
元々のレーザ光の持つパルス幅に近いパルス幅で標本を照射すれば、標本面での多光子励起現象を効率よく起こすことができ、標本画像を効率よく取得することができる。
【0029】
【発明が解決しようとする課題】
第1の先行例においては、レーザ光源に可視波長域の連続レーザ光を用いているため、IR極短パルスレーザに比べて標本表面より深度の深い位置の励起ができず、その位置の蛍光を検出することができない。
【0030】
また、第1の先行例の場合、標本が歯であり、上下の歯で挟み込んでプローブを固定するというもので、固定方法としては非常に不安定なものであり、信号や画像を取得するには実用的ではないという問題点があった。
【0031】
また、第2の先行例では、極短パルスレーザ光をファイバーで顕微鏡に導入し、標本面で多光子励起現象の発生確率を上昇させればS/Nのよい標本画像を取得することは可能である。
【0032】
ただし、この第2の先行例においては、光学デバイスとして顕微鏡を例に挙げており、顕微鏡における標本としては通常微小な標本、例えば切片標本や培養標本或いは顕微鏡下に設置できる小動物、例えばマウスなどを観察するものである。
【0033】
しかしながら、比較的大きな動物の観察を考えたとき、通常の市販されている顕微鏡下で観察することは困難である。
【0034】
また、小動物を観察する場合でも顕微鏡下に設置できるよう麻酔等をかけて特別に誂えたステージに固定していた。
【0035】
麻酔をかけた状態での計測では、動物が本来活動しているときの、例えば脳内の情報を得ることと異なる可能性があるという問題点があった。
【0036】
さらに、レーザ光源と標本の設置場所の制限や該標本の大きさによりファイバーの長さを種々変えることもあるが、この第2の先行例ではこれらについて考慮されてなく実用上の制約があるという問題があった。
【0037】
さらに、脳の内部や種々の被検物からの蛍光等を効果的に検出することができるような光検出器と、それを用いた生体機能測定装置の出現が強く望まれていた。
【0038】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、通常の顕微鏡による観察方法を適用できない条件下、例えば動物が活動している状態で安定した観察が可能な生体機能測定装置を提供することを目的とする。
【0039】
したがって、上記目的を達成するために、第1の観点によれば、多光子励起を起こさせる極短パルスレーザ光を出射し、シングルモード光ファイバを用いて前記極短パルスレーザー光を標本に接触するように固定されたプローブアセンブリに伝送し、前記プローブアセンブリの光学系により、前記伝送された極短パルスレーザ光を前記標本に対して集光し、前記極短パルスレーザー光の照射に基づく多光子励起により生じた標本からの前記蛍光を前記プローブアセンブリと前記シングルモード光ファイバを介して光検出器に伝送し、前記光検出器により前記蛍光を測定することにより前記標本の脳内情報を取得し、前記プローブアセンブリの光学系は、前記標本の表面から1000μmまでの距離から発せられる蛍光を測定可能な焦点距離を有することを特徴とする動き回る動物(人を除く)の観察に用いる生体機能測定装置における生体機能測定方法、である。
【0040】
【発明の実施の形態】
図1は、本発明の第1の実施の形態に係る生体機能測定装置のファイバープローブ光検出器を示す図である。
【0041】
本発明は、通常の顕微鏡による観察方法を適用できない条件下、例えば観察対象が大きな動物であるために通常の顕微鏡下では観察できない場合や、動物が活動しているときの脳内情報を麻酔を使用せずに通常の顕微鏡で得ようとした場合等においても、極微小領域からの蛍光信号を得ることができる、極短パルスレーザ光による多光子励起を応用して開発した生体機能測定装置である。
【0042】
以下に、図面を用いて本発明の実施の形態を説明する。
【0043】
同図において、レーザ光源11は近赤外極短パルスで発振するレーザ光源である。
【0044】
レーザ光源11から出射したレーザ光の光路上には、ミラー10aが配置されており、また、ミラー10aにて反射したレーザ光の光路上にはミラー10bが配置されている。
【0045】
ミラー10bにて反射したレーザ光の光路上にはパルスストレッチャー12が設けられている。
【0046】
パルスストレッチャー12は、レーザ光源11から発せられたレーザ光のパルス幅を伸ばし、1パルスあたりのピークパワーを減少させる。
【0047】
また、パルスストレッチャー12においては、入射されるレーザ光の波長に対してその波長の短い方を早く出力し、長い方を遅く出力するように、入射するレーザ光を分光し波長に対応して光路を調整できるようプリズムやグレーティングなどの分光光学素子を使用している。
【0048】
パルスストレッチャー12から出射したパルス幅が伸ばされたレーザ光の光路上には、ミラー10cの反射光路上には、光分岐部が配置されている。
【0049】
この光分岐部は、ダイクロイックフィルターを用いた光学システムやダイクロイックミラー等からなり、本実施の形態で使用しているダイクロイックミラー13は、ロングパスの特性を有し、パルスストレッチャー12からのレーザ光(励起光)を透過させるとともに、標本からの反射光・蛍光を反射するものである。
【0050】
ダイクロイックミラー13を透過したパルスストレッチャー12によってパルス幅が伸ばされたレーザ光の光路上には、当該レーザ光を光ファイバー(以下、ファイバーと称する。)15の一端面に集光するための集光レンズ14が設けられている。
【0051】
また、ファイバー15の他端は、後述するプローブアセンブリ17aのファイバー接合部に接続されており、ファイバー15の他端には、標本18内の集光位置18aにファイバー15を通過してきたレーザ光を集光すると共に、焦点位置18aから発せられた検出光である蛍光をファイバー15の他端面に集光する集光光学系16が設けられている。
【0052】
この集光光学系16は、金属製保護ハウジングとファイバー接合部とを有したプローブアセンブリ17a内において摺動可能に設けられている。
【0053】
プローブアセンブリ17aには、アタッチメントとして極小の保持部、例えば、標本である小動物の頭などに直接接触するようなネジ穴を有するフランジ部分17bが設けられており、該フランジ部分17bを標本に接触させてネジなどによって機械的に固定される。
【0054】
一方、ファイバー15から出射し、ダイクロイックミラー13によって反射される標本18からの検出光(反射光・蛍光)の光路上には、励起光をカットするためのフィルター19、及びこのフィルター19を通過した検出光を光ファイバー(以下、ファイバーと称する。)21の一端面に集光するための集光レンズ20が設けられている。
【0055】
ファイバー21の他端面には、ファイバー21を通過した検出光を平行光にするためのレンズ22が設けられており、このレンズ22によって平行光にされた検出光は、検出・測定系26に導かれる。
【0056】
検出・測定系26に導かれた検出光の光路系には、反射光等をカットして測光波長のみを選択するための測光フィルター24aが設けられている。
【0057】
測光フィルター24aを通過した検出光の光路上には検出光を測光するための光電変換素子25aが設けられている。
【0058】
なお、標本18から発せられる蛍光が、2波長同時測光でレシオを計算するものであるときには、ダイクロイックミラー23を光路中に設けて波長を分離する。
【0059】
ダイクロイックミラー23で反射された検出光は、該検出光の光路上に設けた測光フィルター24bによって波長を選択し、光電変換素子25bによって検出光を測光する。
【0060】
これらの光電変換素子25a,25bには、当該光電変換素子25a,25bからのデータを蓄積し処理するための不図示のコンピュータが接続されている。
【0061】
次に、本実施の形態に係る生体機能測定装置のファイバープローブ光検出器の動作を説明する。
【0062】
レーザ光源11から発せられたレーザ光はミラー10a,10bを介して、パルスストレッチャー12に入射される。
【0063】
パルスストレッチャー12はレーザ光源11から発せられたレーザ光のパルス幅を伸ばし、1パルスあたりのピークパワーを減少させる。
【0064】
また、パルスストレッチャー12においては、入射されるレーザ光の波長に対してその波長の短い方を早く出力し、長い方を遅く出力するように、入射するレーザ光を分光し波長に対応して光路長が調整される。
【0065】
パルスストレッチャー12を出力したレーザ光はダイクロイックミラー13を透過し、集光レンズ14によってファイバー15の端面に集光され、入射される。
【0066】
ファイバー15を通過し、集光光学系16を備えたプローブアセンブリ17aから出射したレーザ光はファイバー15を通過中に長波長側が早く進むのでパルス幅は入射時よりも短くなって出射される。
【0067】
ファイバー15から出射したレーザ光は集光光学系16を備えたプローブアセンブリ17aにより標本18内の焦点位置18aで集光し、2光子吸収現象により焦点位置18aを励起する。
【0068】
集光光学系16を備えたプローブアセンブリ17aは例えば小動物の頭部等に固定できるフランジ部分17bに対して摺動可能なように固定されている。
【0069】
本実施の形態の生体機能測定装置のファイバープローブ光検出器においては、フランジ部分17b内に集光光学系16を備えたプローブアセンブリ17aを摺動可能に設けていることから、標本18の深さ方向に焦点を変えることができるので、深度の情報を得ることができる。
【0070】
焦点位置18aから発せられた蛍光は再び集光光学系16によりファイバー15端面に集光され、ファイバー15を通過してダイクロイックミラー13まで戻り、ダイクロイックミラー13により反射され、フィルター19によってレーザ光(励起光)がカットされ、集光レンズ20によってファイバー21の端面に集光される。
【0071】
ファイバー21を通過した検出光はその端面より出射し、レンズ22によって平行光にされ、検出・測定系26に導かれる。
【0072】
検出・測定系26に導かれた平行光は、測光フィルター24aによって測光波長が選択され、光電変換素子25aによって検出光が測光される。
【0073】
なお、2波長同時測光する場合であって、ダイクロイックミラー23、測光フィルター24b及び光電変換素子25bを配置した場合には、レンズ22によって平行光とされた検出光のうち、特定の波長の検出光はダイクロイックミラー23によって反射されると共に、他の特定の波長の検出光はダイクロイックミラー23を透過する。
【0074】
そして、ダイクロイックミラー23を透過した検出光は、上述のように、測光フィルター24aによって測光波長が選択され、光電変換素子25aによって検出光が測光される。
【0075】
一方、ダイクロイックミラー23によって反射された検出光は、測光フィルター24bによって測光波長が選択され、光電変換素子25bによって検出光が測光される。
【0076】
なお、本実施の形態においては、フランジ部分17b内において集光光学系16を備えたプローブアセンブリ17aを光軸と直角方向に走査する走査装置もしくは集光光学系16から出射する光を光軸と直角方向に偏向する光学系(図示せず)を用いることによって標本の2次元画像を得るようにすることも可能である。
【0077】
したがって、本実施の形態の生体機能測定装置のファイバープローブ光検出器によれば、近赤外極短パルスを使用する生体機能測定装置のファイバープローブ光検出器において、光学系を標本に固定することができる保持部とファイバー5とを有しているので、比較的大きな動物の観察を容易にすることができる。
【0078】
また、上述した保持部にXY調整用のマイクロメーターとZ調整用のマイクロメーターを設けることにより、3次元画像を取得できる3次元方向に調整可能なシステムを構成することもできる。
【0079】
なお、3次元方向に調整可能なシステムは、XY調整用のマイクロメーターがXY平面で±100μmを調整可能であり、Z調整用のマイクロメーターがZ軸方向で2μmの分解能をもつことが好ましい。
【0080】
また、上述した保持部に設けられる調整手段は、プローブアセンブリの小さな振動やファイバーの伸展に対しても安定であることが望まれる。
【0081】
なお、調整手段自体の寸法としては、底面部で7×7mm、高さ15mm以下であることが好ましく、該底面部は標本(接触対象物)に対してネジ穴のついたフランジ部分で固定される。
【0082】
図2は、上述したファイバープローブ光検出器の集光光学系700の一例を示す図である。
【0083】
図2(a)は、上記集光光学系を通ったレーザ光の光路と集光位置について示した図であり、図2(b)は、上記集光光学系内のプリズム81について説明する図である。
【0084】
図2に示す集光光学系700は、ファイバー15の先端部15aより出射されるレーザ光を略平行光にするレンズ80と、該レンズ80からのレーザ光の光路を光軸と直交する方向(図2(a)中のXY方向)に任意に変更(偏向)することができる光路変更手段、ここではプリズム81と、該プリズム81を通過したレーザ光を標本18に集光するためのレンズ82とから構成される。
【0085】
さらに、レンズ80は、標本18に対してレンズ82の集光位置が光軸方向に任意に変更するように、ファイバー15からプリズム81の間で光軸方向(図2(a)中のZ方向)に移動、例えば第1のレンズ位置80aと第2のレンズ位置80bとに移動できる構成となっているものとする。
【0086】
なお、レンズ80を光軸方向に移動させるレンズ移動機構としては、例えば手動による機械的制御手段や、ステッピングモータ、圧電素子等を用いた電気的制御手段によって実現することができる。
【0087】
また、光軸方向での焦点位置の制御であれば、レンズ80の移動に限られるものではなく、例えばレンズ82を光軸方向に移動させるようにしてもよい。
【0088】
次いで、図2(a)に示すプリズム81の構成の一例について図2(b)を参照して以下に説明する。
【0089】
プリズム81は、ガラス部材のような透過性を有する二枚の平行平面板、ここでは入射面81dを有する平行平面板73と、出射面81b(81a,81c)を有する平行平面板74と、該平行平面板73,74間にそれぞれの平行平面板73,74が、例えば共に平行となるように設けられ、内部にシリコンオイルのような液体76を封入した状態で弾性変形可能なシリコンゴム75と、平行平面板73,74間に少なくとも三個所設けられ、平行平面板74を揺動させるように構成された少なくとも三つの圧電素子77とから構成される。
【0090】
なお、上記圧電素子77には、不図示の制御部が設けられており、該制御部の制御によってプリズム81を通過するレーザ光の光路を光軸方向に対して直交する方向に任意に変更(偏向)させることができるものとする。
【0091】
以下に、上述した集光光学系700のレンズ80とプリズム81の動作について説明する。
【0092】
ここでは、図2(a)に示すレンズ80のレンズ移動機構を例えばステッピングモータや圧電素子等の電気的制御手段で制御する例で説明する。
【0093】
先ず、レンズ移動機構は、レンズ80をレーザ光の光軸方向において前後に位置を移動させ、図2(a)に示す第1のレンズ位置80aにレンズ80を位置決めする。
【0094】
なお、図2(a)では、レンズ80が第1のレンズ位置80aと第2のレンズ位置80bをが重ねて図示されているものとする。
【0095】
次いで、プリズム81は、封入されたシリコンオイル76を介在した平行平面板73、74で構成されており、圧電素子77を制御することによって平行平面板73の入射面81dに対して平行平面板74の出射面を、平行平面板73に対して平行平面板74が平行となっている場合の出射面81bや、平行平面板73に対して平行平面板74が傾斜している場合の出射面81a(又は81c)とすることができ、入射面81dより入射したレーザ光の傾きを変えることができるようになっている。
【0096】
図2(b)は、上述した状態の一例を示しており、プリズム81の圧電素子77を矢印81eで示す方向へ制御し、出射面81bを出射面81cのように制御することで、入射面81dに垂直に入射したレーザ光の光軸90を出射面81cで曲げて光軸91のようなレーザ光を出射させる。
【0097】
次に、上述した構成からなる集光光学系700の具体的な動作について説明する。
【0098】
レンズ80が第1のレンズ位置80aにあるとき、レーザ光の光路70a,70bはレンズ80を通り、光路71a,71bのように進行し、出射面が符号81bで示したようになっているプリズム81を通り、点線で示す光路71c,71dのように進行し、レンズ82で集光されて点線で示す光路71e,71fから光路71g,71hのように進行して、標本18の焦点位置85に集光される。
【0099】
また、レンズ80が第2のレンズ位置80bにあるとき、レーザ光の光路70a,70bはレンズ80を通り、光路72a,72bのように進行し、出射面が符号81bで示したようになっているプリズム81を通り、光路72c,72dのように進行し、レンズ82で集光されて光路72e,72fから光路72g,72hのように進行して、標本18の焦点位置86に集光される。
【0100】
このように、図2(a)に示す集光光学系700においては、レンズ80の位置をレーザ光の進行方向(光軸方向)に移動制御することにより、標本18内における焦点位置をレーザ光の進行方向(光軸方向)に移動させることができる。
【0101】
次に、標本18内における焦点位置をレーザ光の進行方向(光軸方向)に直交する方向に移動させることについて説明する。
【0102】
図2(a)において、レンズ80が第2のレンズ位置80bにあるとき、プリズム81の出射面を符号81aで示したような傾きの面にすることにより、レンズ80を通り進行してきたレーザ光の光路72a,72bは、プリズム81を通り、光路72c’,72d’のように進行し、レンズ82で集光されて光路72e’,72f’から光路72g’,72h’のように進行して、標本18の焦点位置87に集光される。
【0103】
図2(a)において、レンズ80が第2のレンズ位置80bにあるとき、プリズム81の出射面が符号81cで示したような傾きの面にすることにより、レンズ80を通り進行してきたレーザ光の光路72a,72bは、出射面が符号81cで示したようになっているプリズム81を通り、光路72c’’,72d’’のように進行し、レンズ82で集光されて光路72e’’,72f’’から光路72g’’,72h’’のように進行して、標本18の焦点位置88に集光される。
【0104】
即ち、プリズム81の出射面の光路に対する傾きを符号81a,81b,81cで示した面のように変えることにより、標本18における焦点位置を、それぞれ、符号87,86,88で示すように、レーザ光の進行方向(光軸方向)に直交する方向に移動させることができる。
【0105】
このように、図2(a)に示す集光光学系700においては、プリズム81の出射面を変えてレーザ光の進行方向(光軸方向)を変えることにより、標本18における焦点位置をレーザ光の進行方向(光軸方向)に直交する方向に移動させることができる。
【0106】
次に、図3を用いて第1の実施の形態に係る生体機能測定装置のファイバープローブ光検出器のパルスストレッチャーについて説明する。
【0107】
同図において、入射光101はレーザ光源11から発せられた近赤外極短パルスのレーザ光である。
【0108】
パルスストレッチャー140の内部は、4つのプリズム142,144,146,148をそれぞれ所定の位置に配置して構成され、パルスストレッチャー12に入射した入射光101を、パルスストレッチャー140から逆分散光となった出射光120としてファイバー側へ入射させる。
【0109】
ここでは、第1と第2のプリズム142,144からなるプリズムペア150について説明する。
【0110】
該プリズムペア150を構成する第1と第2のプリズム142,144は、第1のプリズムの面1と第2のプリズムの面4、第1のプリズムの面2と第2のプリズムの面3が平行となるように配置しておくことで、第2のプリズムを出射するレーザ光を波長によらず入射したレーザ光と平行にすることができる。
【0111】
ここで、プリズムペア150を構成する第1のプリズム142に入射したレーザ光101は、第1と第2のプリズム142,144によって短波長成分Sほど大きく屈折させられるため第2のプリズム144中の光路長が短くなる。
【0112】
逆に、レーザ光101の長波長成分Lは、第2のプリズム144中の光路長が長くなるため、短波長成分Sの方が早く第2のプリズム144中から射出し、逆分散が与えられる。
【0113】
第2のプリズム144を出射したレーザ光は、波長によりずれている。
【0114】
長波長成分Lと短波長成分Sの光路が一致していないが、第1と第2のプリズム142,144から構成されるプリズムペア150と同様の第3と第4のプリズム146,148から構成されるプリズムペア152を左右対称に配置するように構成することで、レーザ光が合成された後、不図示のファイバーに入射するように構成される。
【0115】
ここで述べたパルスストレッチャー140は、第2のプリズム144と第3のプリズム146とが矢印方向に位置が移動できるように構成されている。
【0116】
このように第2と第3のプリズム144,146の位置を移動できるように構成することによってレーザ光の各波長成分の光路長差を変化させることができる。
【0117】
したがって、上述したパルスストレッチャー140によれば、ファイバーの長さを変えたり、レーザ光の波長を変えてもアライメント全体をやり直す必要がなく第2と第3のプリズム144,146の位置調整でそのファイバー長と波長に対応することができる。
【0118】
すなわち、図1に示すように近赤外極短パルスレーザ光を発振するレーザ光源11からのレーザ光をミラー10a,10bにて図3に示すようなパルスストレッチャー140に入射光101として入力し、上記パルスストレッチャー140の4つのプリズム142,144,146,148を通る光路に対するプリズムの位置調整を、入射光101の条件と前記シングルモードファイバー15の条件に対応して決めて標本18を観察することで元々のレーザ光の持つパルス幅に近いパルス幅で標本18を照射することができ、標本面での多光子励起現象を効率よく起こすことができ、標本画像を効率よく取得することができる。
【0119】
なお、パルスストレッチャー140の構成は、上述したようなプリズムの組み合わせに限定されるものではなく、例えば回折格子の組み合わせ、或いはプリズムと回折格子との組み合わせ、さらにはミラーとの組み合わせであってもよい。
【0120】
図4は、第1の実施の形態の生体機能測定装置のファイバープローブ光検出器において使用される集光光学系16を備えたプローブアセンブリ17aを示す図である。
【0121】
ファイバー15端面から出射される光は、プローブアセンブリ17a内のレンズ31aで平行光にされ、レンズ31bで標本18内の集光位置18aに集光する。
【0122】
集光位置18aからの反射光乃至蛍光は、再びレンズ31b及びレンズ31bによってファイバー15端面に入射される。
【0123】
フランジ部分17bは、調整環17cとネジ締結されており、またスプリング17dによってレンズ31a,31bと共にプローブアセンブリ17aを調整環17a側に常に付勢している。
【0124】
調整環17cを回転させることによってレンズ31a,31bと共にプローブアセンブリ17cを標本18に対して光軸方向に移動させることができる。
【0125】
すなわち標本18内の焦点位置18aを光軸方向に移動させることができる。
【0126】
また、フランジ部分17bは、頭蓋骨18bにネジで固定されているため、測定中に焦点位置18aが変わることはない。
【0127】
したがって、本実施の形態によれば、近赤外極短パルスで発振するレーザ光源と、該レーザ光源からの光束をファイバーに入射させる光学系と、該ファイバーの先端から出射するレーザ光を標本に集光し照射する光学系と、該光学系を該標本に固定する手段と、該標本から発する反射光乃至蛍光を該光学系で集光し、該反射光乃至は蛍光を検出する光検出器と、該レーザ光源と該ファイバーとの間に光路に対する角度と位置のいずれか一方又は双方を変えることができる機構を有するプリズム又はグレーティングを有するパルスストレッチャーと、を備えたことにより、元々のレーザ光の持つパルス幅に近いパルス幅で標本を照射することができ、標本面での多光子励起現象を効率よく起こすことができ、標本画像を効率よく取得することができる。
【0128】
また、動物が本来活動しているときの例えば脳内の情報を得ることができる。
【0129】
また、本発明は上述した動物の脳内の測定のみに限られるものではなく、例えば、均一な或いは不均一な懸濁液、プラーク、固体、生体組織の極微な測定にも適用することができる。
【0130】
また、上述した実施の形態で使用するシングルモードファイバーに関しては、レーザ光源側との連結端には適切な標準コネクターが設けられていると共に、使用されるファイバーは長さが5m以上であり、湾曲により瞬間的なモードシフトを生じない耐性を備えていることが望ましい。
【0131】
また、プローブアセンブリは、直径3mm、長さ10mmを超えない保護用のステンレススチールハウジングと、レーザ光源からのレーザ光をその表面から少なくとも1mmの距離に集光できるレンズと、を備えていることが望ましい。
【0132】
さらに、光ファイバーを4kgの張力に耐え得る十分な強度で固定すると共に、水、溶剤、機械的な衝撃に対する耐性を持たせ、重量は1gを超えないようにすることが望ましい。
【0133】
なお、プローブアセンブリはターミナルアセンブリであってもよい。
【0134】
また、本発明の生体機能測定装置は、標本として動物の頭蓋骨の切開した部位にネジ固定されたプローブアセンブリと、大脳皮質の異なる部分に対して斜めに探査可能な調整能力をもつ調整部と、表面から1000μmまでの距離の脳組織から発せられる蛍光の測定が可能な焦点距離の集光レンズと、動物が前記プローブアセンブリを固定した状態で半径5mまで動くことを可能にする長さの前記光ファイバーと、で構成されていることが望ましく、検出された蛍光に基づいて生体機能測定装置を生体組織として自由に動き回る動物の脳の研究に適用することで、神経組織の中での存在が知られている様々な化学物質の有無及びその濃度の分析を可能にしたり、まだ定量的に明らかにされていない化学物質を特定するのにも役立たせることもできる。
【0135】
また、本発明の生体機能測定装置は、上述した実施の形態のような測定に限られるものではなく、得られた結果は予期された応用が実現可能なものであり、例えばレーザ光源からのレーザ光の強度を細胞でもダメージを回避できるくらい小さくすることで、バクテリアのコロニーの中で検査される細胞であっても、1μm程度の部位から集められる蛍光を基に分子の存在を確認したり、脳の中やセロトニンや特定の脳細胞で緑色の蛍光を発するGFPのような分子を検出することにも適用できる。
【0136】
なお、レーザ光源からのレーザ光の強度をバクテリアのコロニーの中で検査される細胞でもダメージを回避できるくらい小さくし、1μm程度の部位から集められる蛍光を基に分子の存在を確認したり、脳の中やセロトニンや特定の脳細胞で緑色の蛍光を発するGFPのような分子を検出することが可能である。
【0137】
上述した集光光学系700は、上記例に限られるものではなく、少なくともファイバーの先端部から出射されるレーザ光の光路に集光手段と光路変更手段とが配置されており、ファイバーから出射されるレーザ光の焦点位置が調整することができるものであれば、種々変更可能である。
【0138】
図2に示した集光光学系700は、あくまでも一例に過ぎないが、少なくとも二つの集光手段としての凸レンズと、該凸レンズの間に配置され、レーザ光の光軸を曲げることができる光路変更手段とを具えていることが望まれる。
【0139】
そして、上述した動作を実現できる手段を適宜組み合わせ、レンズの位置制御と光路変更手段によるレーザ光の光軸を曲げる制御とを行うことによって、ファイバーから出射されるレーザ光の焦点位置を三次元方向に適宜調整することができる。
【0140】
また、上述のプローブアセンブリ17aは、ステンレス、金、セラミックのような機械的保護が可能で、防錆性能があるものであれば、その素材の有無は問わない。
【0141】
なお、上述した集光手段と光路変更手段は、レンズやプリズムに限定されるものではなく、種々のものを使用することができ、例えば用途によっては光路変更手段として、前記プリズムに反射板のような焦点位置の調整を直接司るもの以外の光路変更手段を付加するようにしたり、透過性を有するプリズムを用いないで反射性を有する部材で光路変更を行うようにしてもよい。
【0142】
また、上述した集光光学系は、その構成からファイバーの先端部にチップのように組み込むことができるので、特にファイバーの外径に対して非常に大きなホルダを用意する必要がなくなる。
【0143】
これは、本発明の生体機能測定装置のファイバープローブ光検出器を使用する場合に非常に有効であり、例えば生体内部に集光光学系部分を挿入するなどにより、所望の部分の生体内情報を得ることが望めるだけでなく、測定の信頼性が高く、その実用用途が広く、光検出装置並びにそれを用いた顕微鏡の分野の発展に寄与するところが極めて大きいものである。
【0144】
前記集光手段と光路変更手段の配置条件の調整は、電気的調整手段や液圧調整手段、或いは光学的調整手段等を用いることができ、前記集光手段と光路変更手段の配置条件の調整手段の少なくとも一部は、前記ファイバーの先端部、集光手段、光路変更手段の近傍に配置される。
【0145】
さらに、上述した調整手段は、前記ファイバーの先端部や集光手段、光路変更手段等と共に、同一のハウジング内に組み込まれて一体化していることが望ましく、このように前記ファイバーの先端部や集光手段、光路変更手段等と共に、同一のハウジング内に組み込んだ配置条件調整手段の少なくとも一部に調整情報を送信するための送信路を前記ファイバーと一体に組み込むようにすることによって、本発明の用途を大幅に拡大させることが期待できる。
【0146】
また、前記調整手段の調整情報には、電気的情報、液圧制御を行うための情報、光学的情報等多くの形態の情報を用いることができる。
【0147】
また、上述した集光光学系は、生体機能測定装置への適用のみに限定されるものではなく、本発明の光検出装置並びにそれを用いた生体機能測定装置に用いることにより得られる効果を大きく増大させ、生体機能測定装置の性能を大きく向上させることができるものである。
【0148】
また、上述した集光光学系を用いたファイバープローブ光検出器及びその光検出器を用いた生体機能測定装置において、レーザ光源から発振される極短パルスのレーザ光(励起光)をシングルモードファイバーを用いて標本等に導き、標本からの反射光や蛍光を励起光と同一のシングルモードファイバーを用いて光検出手段へ導く構成に、さらに、前記レーザ光源と前記シングルモードファイバーとの間で、極短パルスのレーザ光を前記シングルモードファイバーを伝送されるときに受ける群速度遅延とは逆の群速度遅延をレーザ光に生じさせるパルスストレッチャーを配置して各装置を構成することにより、二光子吸収の如き多光子吸収による蛍光の測定を効果的に行うことができる。
【0149】
付記
下記は、出願当初の請求項9乃至請求項14を削除したことに伴ない、当該請求項9乃至請求項14に対応する記載を補正により追加したものである。
本実施の形態の第1の観点では、近赤外極短パルスのレーザ光を発するレーザ光源と、保護ハウジングとファイバー結合部とからなるプローブアセンブリと、前記レーザ光源と前記プローブアセンブリのファイバー結合部とを結合する光ファイバーと、前記プローブアセンブリ内の集光レンズと、前記プローブアセンブリを標本に対して機械的に保持する保持部と、前記保持部に設けられた前記プローブアセンブリ及び焦点位置の少なくとも1つを3次元方向に調整可能な調整部と、前記レーザ光源からのレーザ光と前記標本からの光を分離する光分岐部とを備えたことを特徴とする生体機能測定装置、である。
第2の観点では、第1の観点において、前記光分岐部は、ダイクロイックフィルター又はダイクロイックミラーを用いた光学システムであり、前記生体機能測定装置は、前記標本からの光を検出する光検出装置と、前記光検出装置からのデータを蓄積・処理するコンピュータと、前記光学システムで分離された前記標本からの光を前記光検出測定装置に導く第2の光ファイバーと、をさらに備えており、前記光学システムにより前記レーザ光源からのレーザ光と前記標本からの光とを分離し、分離された前記標本からの光を前記第2の光ファイバーを通して前記光検出測定装置に導く。
第3の観点では、第1又は第2の観点において、前記保持部は、XY平面で±100μm範囲内で焦点位置を調整できるXY調整用マイクロメーターと、Z軸方向の焦点位置を調整するZ軸調整用マイクロメーターとからなり、前記調整部は、その底面部に形成したネジ穴を有したフランジを標本に対して接触させてネジ固定可能に構成する。
第4の観点では、第1乃至第3の観点のいずれか1つにおいて、前記光ファイバーは、湾曲により瞬間的なモードシフトを生じない長さ5mまで対応可能なシングルモードファイバーであり、前記レーザ光源との接続は、コネクターとなっており、前記プローブアセンブリは、ステンレススチールハウジングと、前記レーザ光源からのレーザ光をその表面から少なくとも1mmの距離に集光できるレンズとを備える。
第5の観点では、第1乃至第4の観点のいずれか1つにおいて、前記プローブアセンブリは、前記標本として動物の頭蓋骨の切開した部位にネジ固定されており、前記調整部は、大脳皮質の異なる部分に対して斜めに探査可能であり、前記集光レンズは、表面から1000μmまでの距離の脳組織から発せられる蛍光の測定が可能な焦点距離を有し、前記光ファイバーは、前記動物が前記プローブアセンブリを固定した状態で半径5mまで動くことが可能である。
第6の観点では、第1乃至第5の観点のいずれか1つにおいて、前記生体機能測定装置を、懸濁液、プラーク、固体、生体組織の極微な測定に適用する。
【0150】
【発明の効果】
以上詳記したように、本発明によれば、通常の顕微鏡による観察方法を適用できない条件下、例えば動物が活動している状態で安定した観察が可能な生体機能測定装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の第1の実施の形態に係る生体機能測定装置のファイバープローブ光検出器を示す図。
【図2】本発明の第1の実施の形態に係る生体機能測定装置の集光光学系を示す図である。
【図3】本発明の第1の実施の形態のパルスストレッチャーの変形例を示す図。
【図4】第1の実施の形態の生体機能測定装置のファイバープローブ光検出器において使用される集光光学系を示す図。
【図5】第1の先行例に開示されているスキャニング共焦点顕微鏡装置を示す図。
【図6】第2の先行例に開示されている超短光パルスの伝送装置を示す図。
【符号の説明】
1…レーザ光源、
2…パルスストレッチャー、
3…ファイバー、
4…パルスコンプレッサー光学系、
5…光学デバイス、
10a,10b…ミラー、
11…レーザ光源、
12…パルスストレッチャー、
13…ダイクロイックミラー、
14…集光レンズ、
15…ファイバー、
16…集光光学系、
17a…プローブアセンブリ、
17b…フランジ部分、
17c…調整環、
17d…スプリング、
18…標本、
18a…焦点位置、
18b…頭蓋骨、
19…フィルター、
20…レンズ、
21…ファイバー、
22…レンズ、
23…ダイクロイックミラー、
24a,24b…測光フィルター、
25a,25b…光電変換素子、
26…検出系、
31a,31b…レンズ、
51…レーザ光、
52…レンズ、
53…ファイバー、
54…カプラ、
55…ファイバー、
56…ハウジング、
57…保持具、
58…標本、
58a…焦点位置、
59…圧電素子、
60a,60b…レンズ、
61…ファイバー、
62…フィルター、
63…光電変換素子、
64…コンピュータ、
65…ドライバ、
66…モニタ、
67…ケーブル、
101…入射光、
102…直角プリズム、
104…回折格子、
106…直角プリズム、
108…ミラー、
110…凸面鏡、
112…凹面鏡、
114…ミラー、
116…ミラー、
118…ミラー、
120…出射光、
130…矢印、
140…パルスストレッチャー、
142…第1のプリズム、
144…第2のプリズム、
146…第3のプリズム、
148…第4のプリズム、
150…プリズムペア、
152…プリズムペア。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention provides a fluorescence from a very small region under conditions where an observation method using a normal microscope cannot be applied, for example, when the observation target is a large animal or when it is intended to obtain information in the brain when the animal is active. We have developed biological function measurement devices and fiber probe light detection devices that can obtain signals and apply multi-photon excitation using ultrashort pulse laser light. For example, a near infrared ultrashort pulse laser light source and a fiber probe The present invention relates to a used fiber probe light detection device and a biological function measurement device using the same.
[0002]
[Prior art]
A scanning confocal microscope for acquiring an image by introducing laser light through a fiber into a microscope or probe having a scanning function is disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 3-87804.
[0003]
A multiphoton excitation laser microscope apparatus combining an ultrashort pulse laser and a microscope is disclosed in Japanese Patent No. 2848952, and further, an ultrashort pulse laser and a fiber are used to guide laser light to an optical device and irradiate a specimen. Japanese Patent Laid-Open No. 10-186424 discloses an ultrashort light pulse transmission device, a generation device, and a transmission method.
[0004]
FIG. 5 is a diagram showing a scanning confocal microscope apparatus disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 3-87804 (first prior example).
[0005]
Laser light from the
[0006]
The laser beam is held by a
[0007]
The laser beam emitted from the
[0008]
Reflected light or fluorescence from the
[0009]
Further, the wavelength is selected by the
[0010]
The
[0011]
The tip of the
[0012]
It is described that the fluorescence amount obtained by scanning the tip of the
[0013]
FIG. 6 is a diagram showing an ultrashort optical pulse transmission device disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 10-186424 (second prior example).
[0014]
The laser light source 1 is an ultrashort pulse laser.
[0015]
A pulse stretcher
[0016]
The laser light that has passed through the fiber 3 passes through the pulse compressor
[0017]
The operation of this preceding example will be described.
[0018]
The ultrashort pulse laser beam emitted from the laser light source 1 is incident on the pulse stretcher
[0019]
In the pulse stretcher
[0020]
The pulsed laser light has a wavelength width of about several nanometers.
[0021]
When transmitting through a medium such as a fiber, light of the wavelength component on the long wavelength side advances first, so the shorter one of the wavelengths of the incident laser light is output earlier and the longer one is output later. For example, a spectroscopic optical element such as a prism or a grating is used so that the laser beam incident on the light can be dispersed and the optical path length can be adjusted in accordance with the wavelength.
[0022]
The laser light that has passed through the pulse stretcher
[0023]
Since the long wavelength side advances faster during transmission through the fiber 3, the pulse width becomes shorter than that at the time of incidence and is emitted from the fiber 3.
[0024]
The laser beam whose pulse length is shortened is further introduced into the pulse compressor
[0025]
However, the pulse compressor
[0026]
Further, since the light on the short wavelength side is further delayed while being incident on the
[0027]
Here, the
[0028]
If the sample is irradiated with a pulse width close to the pulse width of the original laser light, the multiphoton excitation phenomenon on the sample surface can be efficiently caused, and the sample image can be acquired efficiently.
[0029]
[Problems to be solved by the invention]
In the first preceding example, since continuous laser light in the visible wavelength range is used as the laser light source, excitation at a position deeper than the specimen surface cannot be performed as compared with the IR ultrashort pulse laser, and fluorescence at that position is not generated. It cannot be detected.
[0030]
In the case of the first prior example, the specimen is a tooth and the probe is fixed by being sandwiched between the upper and lower teeth. The fixing method is very unstable, and a signal or an image is acquired. There was a problem that was not practical.
[0031]
In the second prior example, it is possible to obtain a sample image with a good S / N by introducing ultrashort pulse laser light into a microscope with a fiber and increasing the probability of occurrence of multiphoton excitation phenomenon on the sample surface. It is.
[0032]
However, in the second preceding example, a microscope is used as an example of the optical device. As a sample in the microscope, a micro sample, for example, a section sample, a cultured sample, or a small animal that can be placed under the microscope, such as a mouse, is used. To observe.
[0033]
However, when considering observation of relatively large animals, it is difficult to observe under an ordinary commercially available microscope.
[0034]
Moreover, even when observing small animals, they were fixed on a specially prepared stage under anesthesia so that they could be placed under a microscope.
[0035]
The measurement in the state of anesthesia has a problem that it may be different from obtaining information in the brain, for example, when the animal is originally active.
[0036]
Furthermore, the length of the fiber may be variously changed depending on the limitation of the laser light source and the specimen installation location and the size of the specimen, but in the second prior example, these are not considered and there are practical restrictions. There was a problem.
[0037]
Furthermore, the advent of a photodetector capable of effectively detecting fluorescence and the like from the inside of the brain and various specimens, and a biological function measuring device using the same has been strongly desired.
[0038]
The present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a biological function measuring apparatus capable of stable observation under conditions where an observation method using a normal microscope cannot be applied, for example, in a state where an animal is active. With the goal.
[0039]
Therefore, in order to achieve the above object, according to the first aspect,An optical system of the probe assembly that emits an ultrashort pulse laser beam causing multi-photon excitation and transmits the ultrashort pulse laser beam to a probe assembly fixed so as to come into contact with a specimen using a single mode optical fiber. The transmitted ultrashort pulse laser beam is focused on the specimen, and the fluorescence from the specimen generated by multiphoton excitation based on the irradiation of the ultrashort pulse laser light is converted into the probe assembly and the single mode. The information in the brain of the specimen is obtained by transmitting to an optical detector through an optical fiber and measuring the fluorescence by the optical detector, and the optical system of the probe assembly is 1000 μm from the surface of the specimen. Used to observe moving animals (except humans), characterized by having a focal length that can measure fluorescence emitted from a distance Biological function measuring method for body function measuring apparatus.
[0040]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
FIG. 1 is a diagram showing a fiber probe photodetector of the biological function measuring device according to the first embodiment of the present invention.
[0041]
The present invention provides anesthesia of information in the brain under conditions where a normal microscope observation method cannot be applied, for example, when an observation target is a large animal and cannot be observed under a normal microscope, or when an animal is active. A biological function measuring device developed by applying multi-photon excitation using ultrashort pulse laser light that can obtain fluorescence signals from a very small area even when trying to obtain with a normal microscope without using it. is there.
[0042]
Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings.
[0043]
In the figure, a
[0044]
A
[0045]
A
[0046]
The
[0047]
Further, in the
[0048]
On the optical path of the laser beam emitted from the
[0049]
This optical branching unit includes an optical system using a dichroic filter, a dichroic mirror, and the like. The
[0050]
On the optical path of the laser beam whose pulse width has been extended by the
[0051]
The other end of the
[0052]
The condensing
[0053]
The
[0054]
On the other hand, on the optical path of the detection light (reflected light / fluorescence) from the
[0055]
The other end surface of the
[0056]
The optical path system of the detection light guided to the detection /
[0057]
A
[0058]
When the fluorescence emitted from the
[0059]
The detection light reflected by the
[0060]
These
[0061]
Next, the operation of the fiber probe photodetector of the biological function measuring device according to the present embodiment will be described.
[0062]
Laser light emitted from the
[0063]
The
[0064]
Further, in the
[0065]
The laser beam output from the
[0066]
Laser light that has passed through the
[0067]
Laser light emitted from the
[0068]
The
[0069]
In the fiber probe photodetector of the biological function measuring device of the present embodiment, the
[0070]
Fluorescence emitted from the
[0071]
The detection light that has passed through the
[0072]
The collimated light guided to the detection /
[0073]
In the case where two wavelengths are measured simultaneously, and when the
[0074]
Then, as described above, the photometric wavelength of the detection light transmitted through the
[0075]
On the other hand, the detection light reflected by the
[0076]
In the present embodiment, the light emitted from the scanning device or the condensing
[0077]
Therefore, according to the fiber probe photodetector of the biological function measurement device of the present embodiment, the optical system is fixed to the specimen in the fiber probe photodetector of the biological function measurement device that uses near-infrared ultrashort pulses. Since it has the holding | maintenance part and
[0078]
In addition, by providing the above-described holding unit with an XY adjustment micrometer and a Z adjustment micrometer, it is possible to configure a system that can adjust a three-dimensional direction so that a three-dimensional image can be acquired.
[0079]
In the system that can be adjusted in the three-dimensional direction, the micrometer for XY adjustment can adjust ± 100 μm on the XY plane, and the micrometer for Z adjustment preferably has a resolution of 2 μm in the Z-axis direction.
[0080]
In addition, it is desirable that the adjusting means provided in the holding portion described above is stable against small vibrations of the probe assembly and fiber extension.
[0081]
The dimensions of the adjusting means itself are preferably 7 × 7 mm at the bottom surface and 15 mm or less in height, and the bottom surface is fixed to the specimen (contact object) by a flange portion with a screw hole. The
[0082]
FIG. 2 is a diagram illustrating an example of the condensing optical system 700 of the above-described fiber probe photodetector.
[0083]
FIG. 2A is a diagram showing the optical path of the laser light passing through the condensing optical system and the condensing position, and FIG. 2B is a diagram for explaining the prism 81 in the condensing optical system. It is.
[0084]
A condensing optical system 700 shown in FIG. 2 includes a lens 80 that makes laser light emitted from the
[0085]
Further, the lens 80 is arranged between the
[0086]
The lens moving mechanism for moving the lens 80 in the optical axis direction can be realized by, for example, manual mechanical control means, or electrical control means using a stepping motor, a piezoelectric element, or the like.
[0087]
Further, the control of the focal position in the optical axis direction is not limited to the movement of the lens 80. For example, the lens 82 may be moved in the optical axis direction.
[0088]
Next, an example of the configuration of the prism 81 illustrated in FIG. 2A will be described below with reference to FIG.
[0089]
The prism 81 includes two parallel plane plates having transparency such as a glass member, here a
[0090]
The
[0091]
Hereinafter, operations of the lens 80 and the prism 81 of the above-described condensing optical system 700 will be described.
[0092]
Here, an example in which the lens moving mechanism of the lens 80 shown in FIG. 2A is controlled by an electric control means such as a stepping motor or a piezoelectric element will be described.
[0093]
First, the lens moving mechanism moves the lens 80 back and forth in the optical axis direction of the laser light, and positions the lens 80 at the
[0094]
In FIG. 2A, it is assumed that the lens 80 is illustrated with the
[0095]
Next, the prism 81 is composed of
[0096]
FIG. 2B shows an example of the above-described state. The
[0097]
Next, a specific operation of the condensing optical system 700 having the above-described configuration will be described.
[0098]
When the lens 80 is at the
[0099]
When the lens 80 is at the
[0100]
In this way, in the condensing optical system 700 shown in FIG. 2A, the focal position in the
[0101]
Next, the movement of the focal position in the
[0102]
In FIG. 2A, when the lens 80 is at the
[0103]
In FIG. 2A, when the lens 80 is at the
[0104]
That is, by changing the inclination of the exit surface of the prism 81 with respect to the optical path to the surfaces indicated by
[0105]
In this way, in the condensing optical system 700 shown in FIG. 2A, the focal position of the
[0106]
Next, the pulse stretcher of the fiber probe photodetector of the biological function measuring device according to the first embodiment will be described with reference to FIG.
[0107]
In the figure, incident light 101 is a near-infrared ultrashort pulse laser beam emitted from a
[0108]
The inside of the pulse stretcher 140 is configured by arranging four
[0109]
Here, the
[0110]
The first and
[0111]
Here, since the laser light 101 incident on the
[0112]
On the contrary, the long wavelength component L of the laser beam 101 has a longer optical path length in the
[0113]
The laser beam emitted from the
[0114]
Although the optical paths of the long wavelength component L and the short wavelength component S do not match, the third and
[0115]
The pulse stretcher 140 described here is configured such that the position of the
[0116]
In this way, by configuring so that the positions of the second and
[0117]
Therefore, according to the pulse stretcher 140 described above, it is not necessary to redo the entire alignment even if the length of the fiber is changed or the wavelength of the laser beam is changed, and the position adjustment of the second and
[0118]
That is, as shown in FIG. 1, laser light from a
[0119]
The configuration of the pulse stretcher 140 is not limited to the combination of prisms as described above. For example, the pulse stretcher 140 may be a combination of diffraction gratings, a combination of prisms and diffraction gratings, or a combination of mirrors. Good.
[0120]
FIG. 4 is a diagram showing a
[0121]
The light emitted from the end face of the
[0122]
Reflected light or fluorescence from the condensing
[0123]
The
[0124]
By rotating the adjusting ring 17c, the probe assembly 17c together with the
[0125]
That is, the
[0126]
Further, since the
[0127]
Therefore, according to the present embodiment, a laser light source that oscillates with near-infrared ultrashort pulses, an optical system that causes a light beam from the laser light source to enter the fiber, and laser light emitted from the tip of the fiber as a sample. An optical system for condensing and irradiating, means for fixing the optical system to the specimen, and a photodetector for collecting reflected light or fluorescence emitted from the specimen by the optical system and detecting the reflected light or fluorescence And a pulse stretcher having a prism or a grating having a mechanism capable of changing either or both of an angle and a position with respect to the optical path between the laser light source and the fiber. The specimen can be irradiated with a pulse width close to the pulse width of the light, the multi-photon excitation phenomenon on the specimen surface can be caused efficiently, and the specimen image can be acquired efficiently. Kill.
[0128]
In addition, for example, information in the brain when the animal is originally active can be obtained.
[0129]
Further, the present invention is not limited to the above-described measurement in the brain of an animal, and can be applied to, for example, a micro measurement of a uniform or non-uniform suspension, plaque, solid, or living tissue. .
[0130]
In addition, regarding the single mode fiber used in the above-described embodiment, an appropriate standard connector is provided at the connection end with the laser light source side, and the fiber used has a length of 5 m or more and is curved. Therefore, it is desirable to have a tolerance that does not cause an instantaneous mode shift.
[0131]
The probe assembly may include a protective stainless steel housing having a diameter not exceeding 3 mm and a length not exceeding 10 mm, and a lens capable of condensing the laser light from the laser light source at a distance of at least 1 mm from the surface thereof. desirable.
[0132]
Further, it is desirable to fix the optical fiber with sufficient strength to withstand a tension of 4 kg, to have resistance to water, solvent, and mechanical impact so that the weight does not exceed 1 g.
[0133]
The probe assembly may be a terminal assembly.
[0134]
Further, the biological function measuring device of the present invention includes a probe assembly screwed to an incised part of an animal skull as a specimen, an adjustment unit having an adjustment capability capable of being probed obliquely with respect to different parts of the cerebral cortex, A focal length condensing lens capable of measuring fluorescence emitted from brain tissue at a distance of 1000 μm from the surface, and the length of the optical fiber allowing an animal to move to a radius of 5 m with the probe assembly fixed It is desirable that the biological function measuring device is applied to the study of the brain of an animal that freely moves around as a biological tissue based on the detected fluorescence. It can also be used to analyze the presence and concentration of various chemical substances, and to identify chemical substances that have not yet been quantitatively revealed. Kill.
[0135]
Further, the biological function measuring device of the present invention is not limited to the measurement as in the above-described embodiment, and the obtained result can realize an expected application, for example, a laser from a laser light source. By reducing the light intensity so that even cells can avoid damage, even cells that are examined in bacterial colonies can confirm the presence of molecules based on the fluorescence collected from a site of about 1 μm, It can also be applied to detecting molecules such as GFP that emit green fluorescence in the brain, serotonin, or specific brain cells.
[0136]
The intensity of the laser light from the laser light source is made small enough to avoid damage even in cells examined in bacterial colonies, and the presence of molecules can be confirmed based on fluorescence collected from a site of about 1 μm, It is possible to detect molecules such as GFP which emit green fluorescence in serotonin and specific brain cells.
[0137]
The above-described condensing optical system 700 is not limited to the above example, and at least a condensing unit and an optical path changing unit are arranged in the optical path of the laser beam emitted from the tip of the fiber, and the light is emitted from the fiber. Various adjustments can be made as long as the focal position of the laser beam can be adjusted.
[0138]
The condensing optical system 700 shown in FIG. 2 is merely an example, but is arranged between at least two convex lenses as condensing means and an optical path change that can bend the optical axis of laser light. It is desirable to have a means.
[0139]
Then, the focal position of the laser light emitted from the fiber is determined in a three-dimensional direction by appropriately combining means capable of realizing the above-described operation and performing control of lens position control and bending of the optical axis of the laser light by the optical path changing means. Can be adjusted appropriately.
[0140]
The
[0141]
The condensing unit and the optical path changing unit described above are not limited to lenses and prisms, and various types can be used. For example, depending on the application, as the optical path changing unit, the prism may be a reflector. An optical path changing means other than the one that directly controls the focal position may be added, or the optical path may be changed with a reflective member without using a transmissive prism.
[0142]
Further, since the above-described condensing optical system can be incorporated like a chip at the tip of the fiber due to its configuration, it is not necessary to prepare a very large holder especially for the outer diameter of the fiber.
[0143]
This is very effective when using the fiber probe photodetector of the biological function measuring device of the present invention. For example, by inserting a condensing optical system part inside the living body, the in vivo information of the desired part can be obtained. In addition to being able to be obtained, the reliability of measurement is high, its practical application is wide, and it greatly contributes to the development of the field of light detection devices and microscopes using them.
[0144]
The adjustment of the arrangement conditions of the condensing means and the optical path changing means can be performed using an electric adjusting means, a hydraulic pressure adjusting means, an optical adjusting means, or the like. At least a part of the means is disposed in the vicinity of the tip of the fiber, the light collecting means, and the optical path changing means.
[0145]
Further, it is desirable that the adjusting means described above is integrated and integrated in the same housing together with the tip of the fiber, the condensing means, the optical path changing means, and the like. A transmission path for transmitting adjustment information to at least a part of the arrangement condition adjusting means incorporated in the same housing together with the optical means, the optical path changing means, etc. is integrated with the fiber. It can be expected to greatly expand the application.
[0146]
In addition, as the adjustment information of the adjusting means, many types of information such as electrical information, information for performing hydraulic pressure control, optical information, and the like can be used.
[0147]
In addition, the above-described condensing optical system is not limited to application to a biological function measurement device, and the effect obtained by using the light detection device of the present invention and the biological function measurement device using the same is greatly increased. It is possible to greatly increase the performance of the biological function measuring device.
[0148]
Further, in the above-described fiber probe photodetector using the condensing optical system and the biological function measuring apparatus using the photodetector, an ultrashort pulse laser beam (excitation light) oscillated from a laser light source is used as a single mode fiber. To the sample or the like using the same, the configuration in which the reflected light and fluorescence from the sample are guided to the light detection means using the same single mode fiber as the excitation light, and further between the laser light source and the single mode fiber, By configuring each device by arranging a pulse stretcher that causes the laser beam to generate a group velocity delay opposite to the group velocity delay that is received when the single mode fiber is transmitted with the ultrashort pulse laser beam. It is possible to effectively measure fluorescence by multiphoton absorption such as photon absorption.
[0149]
Appendix
The following is a description corresponding to claims 9 to 14 added by amendment as the claims 9 to 14 at the beginning of the application are deleted.
According to a first aspect of the present embodiment, a laser light source that emits near-infrared ultrashort pulse laser light, a probe assembly that includes a protective housing and a fiber coupling portion, and a fiber coupling portion between the laser light source and the probe assembly. An optical fiber, a condensing lens in the probe assembly, a holding unit that mechanically holds the probe assembly with respect to the specimen, and at least one of the probe assembly and the focal position provided in the holding unit A biological function measuring device comprising: an adjustment unit capable of adjusting the three in a three-dimensional direction; and a light branching unit that separates laser light from the laser light source and light from the sample.
In a second aspect, in the first aspect, the light branching unit is an optical system using a dichroic filter or a dichroic mirror, and the biological function measurement device includes a light detection device that detects light from the specimen, A computer for storing and processing data from the photodetection device; and a second optical fiber for guiding the light from the specimen separated by the optical system to the photodetection measurement device. The system separates the laser light from the laser light source and the light from the sample, and guides the separated light from the sample to the light detection and measurement device through the second optical fiber.
In a third aspect, in the first or second aspect, the holding unit adjusts the focal position in the Z-axis direction with an XY adjustment micrometer capable of adjusting a focal position within a range of ± 100 μm on the XY plane. It consists of a shaft adjusting micrometer, and the adjusting portion is configured so that a flange having a screw hole formed on the bottom surface thereof is brought into contact with the specimen and can be fixed with screws.
In a fourth aspect, in any one of the first to third aspects, the optical fiber is a single mode fiber capable of supporting a length of up to 5 m that does not cause an instantaneous mode shift due to bending, and the laser light source The probe assembly includes a stainless steel housing and a lens capable of condensing the laser light from the laser light source at a distance of at least 1 mm from the surface thereof.
In a fifth aspect, according to any one of the first to fourth aspects, the probe assembly is screwed to the incised part of the animal skull as the specimen, and the adjustment unit is a cerebral cortex. The condensing lens has a focal length capable of measuring fluorescence emitted from brain tissue at a distance of 1000 μm from the surface, and the optical fiber is connected to the animal by the animal. It is possible to move to a radius of 5 m with the probe assembly fixed.
In a sixth aspect, in any one of the first to fifth aspects, the biological function measuring device is applied to a microscopic measurement of a suspension, a plaque, a solid, or a biological tissue.
[0150]
【The invention's effect】
As described above in detail, according to the present invention, it is possible to provide a biological function measuring device capable of stable observation under conditions where an observation method using a normal microscope cannot be applied, for example, in a state where an animal is active. .
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a fiber probe photodetector of a biological function measuring device according to a first embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing a condensing optical system of the biological function measuring device according to the first embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a view showing a modification of the pulse stretcher according to the first embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a diagram showing a condensing optical system used in the fiber probe photodetector of the biological function measuring device according to the first embodiment.
FIG. 5 is a diagram showing a scanning confocal microscope apparatus disclosed in a first prior example.
FIG. 6 is a diagram showing an ultrashort optical pulse transmission device disclosed in a second prior example.
[Explanation of symbols]
1 ... Laser light source,
2 ... Pulse stretcher,
3 ... Fiber,
4 ... Pulse compressor optical system,
5 ... Optical device,
10a, 10b ... mirror,
11 ... Laser light source,
12 ... Pulse stretcher,
13 ... Dichroic mirror,
14 ... Condensing lens,
15 ... Fiber,
16 ... Condensing optical system,
17a ... probe assembly,
17b ... flange part,
17c ... adjustment ring,
17d ... Spring,
18 ... specimen,
18a ... Focus position,
18b ... skull,
19 ... filter,
20 ... Lens,
21 ... Fiber,
22 ... Lens,
23 ... Dichroic mirror,
24a, 24b ... photometric filter,
25a, 25b ... photoelectric conversion elements,
26 ... detection system,
31a, 31b ... lenses,
51 ... Laser light,
52 ... Lens,
53 ... Fiber,
54 ... coupler,
55 ... Fiber,
56 ... Housing,
57 ... retainer,
58 ... Sample,
58a: focal position,
59 ... Piezoelectric element,
60a, 60b ... lenses,
61 ... Fiber,
62 ... filter,
63 ... photoelectric conversion element,
64 ... computer,
65 ... Driver,
66 ... Monitor,
67 ... Cable,
101: Incident light,
102 ... right angle prism,
104: diffraction grating,
106 ... right angle prism,
108 ... Mirror,
110 ... convex mirror,
112 ... concave mirror,
114 ... mirror,
116 ... Mirror,
118 ... Mirror,
120 ... outgoing light,
130 ... Arrow,
140 ... pulse stretcher,
142 ... first prism,
144 ... second prism,
146 ... the third prism,
148 ... Fourth prism,
150 ... Prism pair,
152 ... Prism pair.
Claims (1)
シングルモード光ファイバを用いて前記極短パルスレーザー光を標本に接触するように固定されたプローブアセンブリに伝送し、 Transmitting the ultrashort pulse laser light to a probe assembly fixed to contact the specimen using a single mode optical fiber;
前記プローブアセンブリの光学系により、前記伝送された極短パルスレーザ光を前記標本に対して集光し、 By the optical system of the probe assembly, the transmitted ultrashort pulse laser beam is focused on the specimen,
前記極短パルスレーザー光の照射に基づく多光子励起により生じた標本からの前記蛍光を前記プローブアセンブリと前記シングルモード光ファイバを介して光検出器に伝送し、 Transmitting the fluorescence from a specimen generated by multi-photon excitation based on irradiation of the ultrashort pulse laser light to a photodetector through the probe assembly and the single mode optical fiber;
前記光検出器により前記蛍光を測定することにより前記標本の脳内情報を取得し、 By acquiring the information in the brain of the specimen by measuring the fluorescence with the photodetector,
前記プローブアセンブリの光学系は、前記標本の表面から1000μmまでの距離から発せられる蛍光を測定可能な焦点距離を有することを特徴とする動き回る動物(人を除く)の観察に用いる生体機能測定装置における生体機能測定方法。 The optical system of the probe assembly has a focal length capable of measuring fluorescence emitted from a distance of up to 1000 μm from the surface of the specimen. In the biological function measuring apparatus used for observing moving animals (excluding humans) Biological function measurement method.
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