JP2012018122A - Observation device - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、観察装置に関するものである。 The present invention relates to an observation apparatus.
従来、多数種の分子を含む生体試料の化学的状態の分類や、生体試料に含まれる成分の濃度推定を行うために、生体試料の振動スペクトルを取得し、取得された振動スペクトルにおける全周波数領域の強度情報を変量として取り扱う多変量解析の手法が知られている(例えば、特許文献1参照。)。
また。生体試料の振動スペクトルを生体内で測定するCARS(コヒーレントアンチストークスラマン散乱)内視鏡装置が知られている(例えば、特許文献2参照。)。このCARS内視鏡装置では、CARS過程を誘起する2波長のパルスレーザ光が、単一の光ファイバによって同軸に導光されるようになっている。
Conventionally, in order to classify the chemical state of a biological sample containing many types of molecules and estimate the concentration of components contained in the biological sample, the vibration spectrum of the biological sample is acquired, and the entire frequency range in the acquired vibration spectrum is obtained. A method of multivariate analysis that handles intensity information as variables is known (see, for example, Patent Document 1).
Also. A CARS (coherent anti-Stokes Raman scattering) endoscope device that measures a vibration spectrum of a biological sample in vivo is known (for example, see Patent Document 2). In this CARS endoscope apparatus, two-wavelength pulsed laser light that induces the CARS process is guided coaxially by a single optical fiber.
ここで、CARS過程は、一般にはポンプ、ストークスおよびプローブの3本のレーザ光を試料に入射した際に誘起されるコヒーレントラマン散乱過程である。ポンプおよびストークス光のエネルギ差が試料中の分子の振動エネルギに共鳴した際に特に強度の強い散乱光(CARS信号光)が発生する。このCARS信号光を検出することで試料の分子振動の情報を取得することができる。なお、CARS過程ではポンプレーザ光自体を同時にプローブレーザ光として用いることができるため、上記CARS内視鏡装置では2波長のパルスレーザ光(ポンプおよびストークスパルスレーザ光)を用いている。 Here, the CARS process is generally a coherent Raman scattering process induced when three laser beams of a pump, Stokes, and a probe are incident on a sample. When the energy difference between the pump and Stokes light resonates with the vibration energy of the molecules in the sample, particularly intense scattered light (CARS signal light) is generated. By detecting this CARS signal light, it is possible to obtain information on the molecular vibration of the sample. In the CARS process, the pump laser light itself can be simultaneously used as the probe laser light. Therefore, the CARS endoscope apparatus uses two-wavelength pulsed laser light (pump and Stokes pulsed laser light).
しかしながら、CARS過程を誘起する2波長のパルスレーザ光の両方を単一の光ファイバによって導光する場合には、光ファイバ内におけるエネルギ密度が増大するため、不要の非線形相互作用が光ファイバ内において誘起されて波長変換が起こるため、不要な波長成分が生じてしまうという不都合がある。その結果、本来、生体試料によるCARS過程を誘起することを目的としているパルスレーザ光に対して、光学フィルタ等を用いて前記不要な波長成分を除去する必要が生じ、CARS過程に寄与するパルスレーザ光の強度が損なわれてしまうという不都合がある。さらに、強いCARS信号を得るためにレーザパワーを増大させようとしても、光ファイバの非線形性によって不要な波長変換が起こるため十分な強度のパルスレーザ光を導光することができないという不都合がある。ここで、ファイバ内で誘起される非線形相互作用は非共鳴四光波混合過程(例えば、自己位相変調)SRS(誘導ラマン散乱)等のパルスレーザ光の波長が変換されてしまう過程を意味している。 However, when both of the two-wavelength pulsed laser light that induces the CARS process are guided by a single optical fiber, the energy density in the optical fiber increases, so that unnecessary nonlinear interaction occurs in the optical fiber. Since wavelength conversion occurs when induced, there is a disadvantage that unnecessary wavelength components are generated. As a result, it is necessary to remove the unnecessary wavelength component by using an optical filter or the like with respect to the pulse laser beam originally intended to induce the CARS process by the biological sample, and the pulse laser that contributes to the CARS process. There is a disadvantage that the intensity of light is impaired. Furthermore, even if it is attempted to increase the laser power in order to obtain a strong CARS signal, there is an inconvenience that a pulse laser beam having a sufficient intensity cannot be guided because unnecessary wavelength conversion occurs due to nonlinearity of the optical fiber. Here, the nonlinear interaction induced in the fiber means a process in which the wavelength of pulsed laser light is converted, such as a non-resonant four-wave mixing process (for example, self-phase modulation) SRS (stimulated Raman scattering). .
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、生体内において試料とパルスレーザ光とによって誘起されるCARS過程を含む四光波混合過程およびその他の非線形相互作用を観測するために、十分な強度のパルスレーザ光を照射することができる観察装置を提供することを目的としている。なお、試料とパルスレーザ光とによって誘起される四光波混合過程としてはCARS(コヒーレントアンチストークスラマン散乱)、CSRS(コヒーレントストークスラマン散乱)、SRS(誘導ラマン散乱)、IRS(逆ラマン散乱)ISRS(インパルシブ誘導ラマン散乱)等の過程が挙げられる。また、その他の非線形相互作用としてはSHG(第二高調波発生)、SFG(和周波発生)、DFG(差周波発生)、高次高調波発生、高次ラマン散乱等の過程が挙げられる。 The present invention has been made in view of the above-described circumstances, and is sufficient for observing a four-wave mixing process including a CARS process induced by a sample and pulsed laser light in the living body and other nonlinear interactions. An object of the present invention is to provide an observation apparatus capable of irradiating a pulse laser beam with a high intensity. The four-wave mixing process induced by the sample and the pulsed laser beam includes CARS (coherent anti-Stokes Raman scattering), CSRS (coherent Stokes Raman scattering), SRS (stimulated Raman scattering), IRS (inverse Raman scattering) ISRS ( Examples of such processes include impulsive stimulated Raman scattering. Other nonlinear interactions include processes such as SHG (second harmonic generation), SFG (sum frequency generation), DFG (difference frequency generation), higher order harmonic generation, and higher order Raman scattering.
上記目的を達成するために本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、試料において非線形相互作用を誘起する波長の異なる複数のパルスレーザ光を発生する光源部と、該光源部から発せられ複数の前記パルスレーザ光を別個に導光する複数の導光部材と、該導光部材により導光された複数の前記パルスレーザ光を試料に照射する照射光学系と、該照射光学系による前記パルスレーザ光の照射により前記試料において発生した非線形相互作用信号を検出する検出光学系とを備える観察装置を提供する。
In order to achieve the above object, the present invention provides the following means.
The present invention includes a light source unit that generates a plurality of pulsed laser beams having different wavelengths that induce nonlinear interaction in a sample, and a plurality of light guide members that separately guide the plurality of pulsed laser beams emitted from the light source unit And an irradiation optical system for irradiating the sample with the plurality of pulsed laser beams guided by the light guide member, and detecting a nonlinear interaction signal generated in the sample by the irradiation of the pulsed laser light by the irradiation optical system An observation apparatus including a detection optical system is provided.
本発明によれば、光源部において発生した波長の異なる複数のパルスレーザ光が、複数の導光部材によって別個に導光され、照射光学系によって試料に照射されることにより、試料において発生した非線形相互作用信号が検出光学系により検出される。試料に照射される前に導光部材によって導光される複数のパルスレーザ光は、同一の導光部材に入射されないので、導光部材内においてエネルギ密度が過度に増大することが防止され、不要の非線形相互作用が導光部材内において誘起される不都合の発生を未然に防止することができる。その結果、十分な強度のパルスレーザ光を用いて試料とパルスレーザ光との非線形相互作用を誘起させることができ、四光波混合過程等の非線形相互作用を容易に観察することが可能となる。 According to the present invention, the plurality of pulsed laser beams having different wavelengths generated in the light source unit are separately guided by the plurality of light guide members and irradiated to the sample by the irradiation optical system, thereby generating the nonlinearity generated in the sample. An interaction signal is detected by the detection optical system. Since the plurality of pulse laser beams guided by the light guide member before being irradiated on the sample are not incident on the same light guide member, the energy density is prevented from excessively increasing in the light guide member, which is unnecessary. It is possible to prevent the occurrence of inconvenience that the nonlinear interaction is induced in the light guide member. As a result, a nonlinear interaction between the sample and the pulsed laser beam can be induced using a pulse laser beam with sufficient intensity, and a nonlinear interaction such as a four-wave mixing process can be easily observed.
上記発明においては、前記導光部材が光ファイバであってもよい。
また、上記発明においては、前記導光部材がシングルモードファイバであってもよい。
また、上記発明においては、複数の前記パルスレーザ光の試料への到達時間を調節するタイミング調節部を備えていてもよい。
このようにすることで、タイミング調節部の作動により、波長の異なる複数のパルスレーザ光の試料に同時に到達させたり、適当な時間ずらして到達させたりすることができ、試料とパルスレーザ光との非線形相互作用をより効果的に発生させることができる。
In the above invention, the light guide member may be an optical fiber.
In the above invention, the light guide member may be a single mode fiber.
Moreover, in the said invention, you may provide the timing adjustment part which adjusts the arrival time to the sample of the said some pulsed laser beam.
In this way, by operating the timing adjustment unit, it is possible to simultaneously reach a sample of a plurality of pulsed laser beams having different wavelengths or to shift the sample with an appropriate time. Non-linear interaction can be generated more effectively.
また、上記発明においては、前記照射光学系に、1以上のパルスレーザ光の偏光を調整する偏光調整部を備えていてもよい。
一般に、生体試料にはタンパク質に代表されるように、化学組成が類似しかつ立体構造も極端に異ならない多種類の分子種が含まれている。この様な分子種は通常のラマン分光やCARS分光法では観測するスペクトルの強度パターン(スペクトル線形)が略同一となるためにスペクトル上で分離が困難となる。しかし、前記照射光学系に、1以上のパルスレーザ光の偏光を調整する偏光調整部を備えることにより、偏光調整部の作動により1以上のパルスレーザ光の偏光を調整してスペクトル線形を異ならせて観察を行うことができる。
また、上記発明においては、複数の前記パルスレーザ光の少なくとも1つがピコ秒以下のパルス幅を有していてもよい。
In the above invention, the irradiation optical system may include a polarization adjusting unit that adjusts the polarization of one or more pulsed laser beams.
In general, biological samples include many kinds of molecular species that have similar chemical compositions and do not have extremely different three-dimensional structures, as represented by proteins. Such molecular species are difficult to separate on the spectrum because the observed spectrum intensity pattern (spectrum linearity) is substantially the same in normal Raman spectroscopy or CARS spectroscopy. However, the irradiation optical system includes a polarization adjustment unit that adjusts the polarization of one or more pulsed laser beams, so that the polarization of the one or more pulsed laser beams is adjusted by the operation of the polarization adjustment unit to change the spectral line shape. Can be observed.
In the above invention, at least one of the plurality of pulsed laser beams may have a pulse width of picoseconds or less.
また、上記発明においては、前記検出光学系が、試料において発生した前記非線形相互作用信号を導光するマルチモードファイバと、該マルチモードファイバにより導光された非線形相互作用信号を検出する検出器とを備えていてもよい。
マルチモードファイバを使用することにより、より多くの非線形相互作用信号を導光することができ、より明確な観察を行うことができる。
In the above invention, the detection optical system includes a multimode fiber that guides the nonlinear interaction signal generated in the sample, and a detector that detects the nonlinear interaction signal guided by the multimode fiber; May be provided.
By using a multimode fiber, more nonlinear interaction signals can be guided and a clearer observation can be performed.
また、上記発明においては、前記導光部材の射出端が、周方向に間隔をあけて複数環状に配列されていてもよい。
このようにすることで、導光部材の射出端から射出されるパルスレーザ光を輪帯照明として用いることができ、NAを増大させて集光スポットを小さくし、分解能を向上することができるという利点がある。
Moreover, in the said invention, the injection | emission end of the said light guide member may be arranged in multiple rings at intervals in the circumferential direction.
By doing so, it is possible to use pulsed laser light emitted from the exit end of the light guide member as annular illumination, increase NA and reduce the focused spot, and improve resolution. There are advantages.
また、上記発明においては、前記照射光学系に、複数の前記導光部材により導光されてきた複数の前記パルスレーザ光を同軸に合波させる合波手段を備えていてもよい。
また、上記発明においては、前記導光部材の前記射出端の半径方向外方に、前記マルチモードファイバの入射端が周方向に間隔をあけて複数環状に配列されていてもよい。
このようにすることで、マルチモードファイバによる集光効率を増大させ、観察時間の短縮、精度の向上を図ることができる。
In the above invention, the irradiating optical system may be provided with multiplexing means for coaxially multiplexing the plurality of pulse laser beams guided by the plurality of light guide members.
Moreover, in the said invention, the incident end of the said multi-mode fiber may be arranged in multiple rings at intervals in the circumferential direction outward of the emission end of the light guide member in the radial direction.
By doing in this way, the condensing efficiency by a multimode fiber can be increased, and observation time can be shortened and accuracy can be improved.
本発明によれば、生体内において試料とパルスレーザ光との非線形相互作用を誘起するCARS過程を含む四光波混合過程、その他の非線形相互作用を観測するために、十分な強度のパルスレーザ光を照射することができるという効果を奏する。 According to the present invention, in order to observe a four-wave mixing process including a CARS process that induces a nonlinear interaction between a sample and a pulsed laser beam in a living body and other nonlinear interactions, a pulsed laser beam having sufficient intensity is used. There is an effect that it can be irradiated.
本発明の一実施形態に係る観察装置について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置1は、図1に示されるように、波長の異なる複数のパルスレーザ光を発生する光源部2と、該光源部2から発せられたパルスレーザ光を導光する細長い導光部3と、該導光部3により導光されたパルスレーザ光を集光して試料Aに照射する照射光学系4と、該照射光学系4によるパルスレーザ光の照射により試料において発生した非線形相互作用信号を検出する検出光学系5とを備えている。
An observation apparatus according to an embodiment of the present invention will be described below with reference to the drawings.
As shown in FIG. 1, the
光源部2は、2つの光源6,7を備えている。各光源6,7は、試料A内の所望の分子振動に由来する非線形相互作用を誘起するように設定された異なる波長のパルスレーザ光をそれぞれ発生するようになっている。また、光源部2には、2つの光源6,7から発せられたパルスレーザ光が同時に試料Aに到達するように到達時間を調節するタイミング調節部8が設けられている。
The
タイミング調節部8は、2つの光源6,7を電気的に同期させてもよいし、2つの光源6,7から発せられるパルスレーザ光の伝播光路長を操作することにより、到達時間を調節することにしてもよい。
The
導光部3は、例えば、内視鏡の鉗子チャネルに沿って内視鏡の挿入部の基端側から先端側まで挿入することができる細長い形状を有し、並列に配置された2本のシングルモードファイバ(導光部材)9,10と1本のマルチモードファイバ11とを備えている。
導光部3の先端側において、シングルモードファイバ9,10の射出端9a,10aとマルチモードファイバ11の入射端11aとは、例えば、図2に示されるように配置されている。
The
On the distal end side of the
各シングルモードファイバ9,10の基端側には、カップリングレンズのような結合器12,13を介して光源部2の別個の光源6,7が接続されている。また、マルチモードファイバ11の基端側にも、カップリングレンズのような結合器14を介して波長分解器15と光検出器16とが接続されている。
Separate
照射光学系4は、導光部3の先端側に配置され、導光部3の各シングルモードファイバ9,10を介して導光されてきたパルスレーザ光をそれぞれ略平行光に集光するコリメート光学系と、不要光を除去するフィルタ19,20と、パルスレーザ光を集光する集光光学系21とを備えている。
The irradiation
検出光学系5は、試料Aに複数の波長のパルスレーザ光が照射されることにより、試料Aにおいて発生した非線形相互作用信号を集光する上述した集光光学系21と、試料Aにおいて散乱または反射して戻るパルス光を除去するパルス光カットフィルタ22と、上記マルチモードファイバ11と、上記波長分解器15と、上記光検出器16とを備えている。マルチモードファイバ11により導光されてきた非線形相互作用信号を波長分解器15により波長分解して光検出器16により検出することで、試料A内において発生した非線形相互作用をスペクトル観察することが可能となる。
The detection
このように構成された本実施形態に係る観察装置1の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置1を用いて試料Aの非線形相互作用を観察するには、光源部2の2つの光源6,7から発生させた異なる波長のパルスレーザ光を結合器12,13によって2つのシングルモードファイバ9,10の基端側にそれぞれ入射させる。シングルモードファイバ9,10によって先端側まで導光されたパルスレーザ光は、コリメート光学系17,18によって略平行光とされた後に集光光学系21によってその焦点位置に集光される。
The operation of the
In order to observe the nonlinear interaction of the sample A using the
2つのパルスレーザ光は、試料Aに集光されることにより、試料Aにおいて非線形相互作用を発生させるように設定されているので、試料A内の焦点位置P近傍において非線形相互作用信号が発生する。発生した非線形相互作用信号は、前方方向へ伝播するが、生体試料においては散乱・反射が起こるため、焦点Pを含む領域Rにおいて前記非線形相互作用信号光が後ろ側方向へ散乱される。この非線形相互作用信号光は集光光学系21により集光され、導光部3のマルチモードファイバ11の入射端に入射される。
Since the two pulse laser beams are focused on the sample A and set to generate a nonlinear interaction in the sample A, a nonlinear interaction signal is generated near the focal position P in the sample A. . The generated nonlinear interaction signal propagates in the forward direction, but scattering and reflection occur in the biological sample, so that the nonlinear interaction signal light is scattered backward in the region R including the focal point P. The nonlinear interaction signal light is condensed by the condensing
そして、マルチモードファイバ11によって導光された非線形相互作用信号は、結合器14によって結合されている波長分解器15によって波長分解され、光検出器16により検出されることにより、非線形相互作用のスペクトル観察を行うことができる。
Then, the nonlinear interaction signal guided by the
この場合において、本実施形態に係る観察装置1によれば、波長の異なる2つのパルスレーザ光が別個のシングルモードファイバ9,10によって導光された後に、照射光学系4によって試料A内に集光されるので、同一のシングルモードファイバ9,10内に2つのパルスレーザ光が同時に入射されずに済み、シングルモードファイバ9,10内におけるエネルギ密度を過度に増大させずに済むという利点がある。
In this case, according to the
その結果、シングルモードファイバ9,10内においては、不要な非線形相互作用が発生せず、導光したパルスレーザ光の大部分を、試料A内において非線形相互作用を発生させるために有効に利用することができ、効率的に非線形相互作用を発生させることができる。
また、シングルモードファイバ9,10内のエネルギ密度を過度に増大させないので、マルチプレックス測定のためのより高い尖頭値を有する広帯域のフェムト秒パルスレーザ光も伝送することが可能となり、内視鏡観察下でのマルチプレックスCARS光観察を行うことができる。
As a result, unnecessary nonlinear interaction does not occur in the
In addition, since the energy density in the
また、2つのパルスレーザ光を別個のシングルモードファイバ9,10によって導光することにより、各パルスレーザ光の試料Aへの入射角度を個別に設定することができる。これにより位相整合条件を満たすように最適な入射角度を選定することができ、効率的に非線形相互作用を発生させることができる。
Further, by guiding the two pulsed laser beams through the separate
さらに、本実施形態に係る観察装置1によれば、コリメート光学系17,18によって略平行光とした2つのパルスレーザ光を集光光学系21によって同一の焦点位置に集光させるので、2つのパルスレーザ光を合波させる光学系が不要であり、簡易に構成することができるという利点がある。
Furthermore, according to the
なお、本実施形態に係る観察装置1においては、図1において、コリメート光学系17,18および集光光学系21を単レンズによって表示したが、これに限定されるものではなく、複数のレンズの組み合わせにより構成してもよいし、反射光学系によって構成してもよい。また、シングルモードファイバ9,10のコア径を異ならせてもよい。また、マルチモードファイバ11に代えてシングルモードファイバを採用してもよい。
In the
また、本実施形態に係る観察装置1においては、図3に示されるように、照射光学系4のコリメート光学系17,18とフィルタ19,20との間に、偏光子あるいは波長板のような偏光調整部23,24を設け、マルチモードファイバ11の入射端11aとパルス光カットフィルタ22との間にも偏光子あるいは波長板のような偏光調整部25を設けることにしてもよい。このようにすることで、試料Aに入射させる2つのパルスレーザ光の偏光方向を調節することができ、内視鏡観察下において、偏光CARSスペクトル観察を行うことができる。また、CARS以外の非線形相互作用についても同様に偏光観察を行うことができる。
Further, in the
例えば、偏光CARSスペクトル観察の場合には、2つのパルスレーザ光の偏光方向のなす相対角度(α)が71.6°近傍であり、偏光調整部25の透過偏光方向と一方のパルスレーザ光の偏光方向とのなす相対角度(β)が63.4°近傍であることが好ましい。このようにすることで、2つのパルスレーザ光の入射により試料において非線形相互作用が発生した結果生じる非共鳴CARS成分を効率よく抑制することができ、スペクトル観察を精度よく行うことができる。
For example, in the case of polarization CARS spectrum observation, the relative angle (α) between the polarization directions of two pulsed laser beams is around 71.6 °, and the transmitted polarization direction of the
また、相対角度α,βをそれぞれ上述した角度近傍で変化させて観察してもよい。これにより、スペクトル線形を顕著に異ならせて観察を行うことができる。
他の非線形相互作用信号光を検出して行うスペクトル観察の場合にも、非共鳴成分を効率よく抑制するための偏光配置およびスペクトル線形を顕著に異ならせるための偏光配置を設定して観察することが好ましい。
Alternatively, the relative angles α and β may be observed in the vicinity of the angles described above. Thereby, it is possible to perform observation while making the spectral line shapes significantly different.
Even in the case of spectrum observation performed by detecting other nonlinear interaction signal light, set and observe a polarization arrangement for efficiently suppressing non-resonant components and a polarization arrangement for making the spectral line shape significantly different. Is preferred.
また、本実施形態においては、照射光学系4が、2つのパルスレーザ光を試料Aに集光させ、かつ、試料Aからの非線形相互作用信号光を集光するために共通の集光光学系21を有する例を示したが、これに限定されるものではない。すなわち、図4に示されるように、コリメート光学系17,18に代えて、正のパワーを有する集光光学系26,27をその光軸が焦点位置Pを通過するように傾斜させて配置し、集光光学系26,27によって2つのパルスレーザ光を試料Aに直接集光することにしてもよい。
In the present embodiment, the irradiation
この場合に、集光光学系21は、非線形相互作用信号光を集光するためのみに使用することにしてもよい。
また、この場合に、シングルモードファイバ9,10の射出端9a,10aは、パルスレーザ光が集光光学系26,27の光軸に沿って射出されるように傾斜させることにしてもよい。
In this case, the condensing
In this case, the exit ends 9a and 10a of the
非同軸で射出されたパルスレーザ光を共通の集光光学系21によって集光する本実施形態の場合には、各パルスレーザ光に対して独立の集光光学系26,27を用いることにより、色収差を低減して、焦点位置におけるスポット径の最適化を容易に行うことができるという利点がある。
In the case of the present embodiment in which pulse laser light emitted non-coaxially is collected by a common condensing
なお、パルスレーザ光の光軸を傾斜させる手段として、シングルモードファイバ9,10の射出端9a,10aを傾斜させ、かつ、集光光学系26,27を傾斜させたが、いずれか一方によって行ってもよい。また、射出端9a,9bを傾斜させるために、シングルモードファイバ9,10自体の設置角度を傾斜させてもよい。
In addition, as means for inclining the optical axis of the pulsed laser light, the exit ends 9a and 10a of the
また、本実施形態においては、シングルモードファイバ9,10をパルスレーザ光の照射用のみに使用したが、これに代えて、図5に示されるように、試料Aにおいて発生した非線形相互作用信号光の一部をシングルモードファイバ9,10を介して導光部3の基端側まで導光し、検出することにしてもよい。この場合には、光源6,7と結合器12,13との間に、ダイクロイックミラー等の分岐部28,29を設け、シングルモードファイバ9,10を介して導光されてきた非線形相互作用信号光を分岐部28,29で分岐して、結合器14により、マルチモードファイバ11を介して導光されてきた非線形相互作用信号光と合波させればよい。
Further, in the present embodiment, the
このようにすることで、パルスレーザ光を導光するためのシングルモードファイバ9,10を利用して、より多くの非線形相互作用信号光を検出することができ、より精度の高い観察を行うことができるという利点がある。
なお、シングルモードファイバ9,10を介して導光されてきた非線形相互作用信号光を、結合器14により、マルチモードファイバ11を介して導光されてきた非線形相互作用信号光と合波することなく、別個に検出してもよい。
By doing so, it is possible to detect more nonlinear interaction signal light by using the
The nonlinear interaction signal light guided through the
また、本実施形態においては、パルスレーザ光を1カ所の固定焦点に集光させることとしたが、これに代えて、図6に示されるように、パルスレーザ光の焦点位置Pを光軸に直交する方向に移動させることにしてもよい。図6に示される例では、シングルモードファイバ9,10の射出端9a,10aおよびマルチモードファイバ11の入射端11aを同期させて傾斜させるように往復移動させている。往復移動は、例えば、図示しないピエゾ素子のようなアクチュエータによって行うことができる。
In this embodiment, the pulse laser beam is focused on one fixed focus. Instead, as shown in FIG. 6, the focus position P of the pulse laser beam is used as the optical axis. You may make it move to the orthogonal direction. In the example shown in FIG. 6, the exit ends 9 a and 10 a of the
このようにすることで、焦点位置Pを走査させることができ、焦点位置Pと非線形相互作用信号光の強度とを対応づけて記憶することにより、非線形相互作用を画像として取得することができる。
なお、シングルモードファイバ9,10の射出端9a,10aおよびマルチモードファイバ11の入射端11aを同期して走査させることに代えて、コリメート光学系17,18の位置や角度を偏向することにより、パルスレーザ光を走査させてもよい。
By doing so, the focal position P can be scanned, and the nonlinear interaction can be acquired as an image by storing the focal position P and the intensity of the nonlinear interaction signal light in association with each other.
Instead of synchronously scanning the exit ends 9a and 10a of the
また、本実施形態においては2本のシングルモードファイバ9,10によって波長の異なる2つのパルスレーザ光を導光することとしたが、これに代えて、図7に示されるように、3本以上のシングルモードファイバ9,10を交互に周方向に並べて円環状に配列してもよい。波長の異なるパルスレーザ光を導光するシングルモードファイバ9,10をそれぞれ複数本にすることにより、1本当たりのシングルモードファイバ9,10によって伝送されるパルスレーザ光のエネルギ密度を低減することができ、シングルモードファイバ9,10内において発生する非線形相互作用信号光を低減することができる。
In the present embodiment, two pulse laser beams having different wavelengths are guided by the two
さらに、図7に示されるように、シングルモードファイバ9,10の射出端9a,10aを円環状に配列することにより、図2の場合と比較して集光光学系21の開口数を有効に使用することができ、実効開口数を増大させることができる。さらに、円環状配列を採用することによって照明が輪帯状となるため、前記実効開口数における瞳径全体を用いたときと比較して、エアリーディスク内スポット径は小さくなる。集光スポット径を小さくすることで、非線形相互作用を効率的に発生させることができるとともに空間分解能を高めることができるという利点がある。
Further, as shown in FIG. 7, by arranging the exit ends 9a and 10a of the
また、本実施形態においては、図8〜図10に示されるように、照射光学系4にミラー30およびダイクロイックミラー31を設けることにより、一方のパルスレーザ光を他方のパルスレーザ光と同軸に合波して試料Aに照射することにしてもよい。
図9は図8のB−B断面、図10は図8のC−C断面での光路を示す図である。
Further, in this embodiment, as shown in FIGS. 8 to 10, by providing the irradiation
FIG. 9 is a diagram showing an optical path in a BB section in FIG. 8, and FIG. 10 is a diagram showing an optical path in a CC section in FIG.
このようにすることで、2つのパルスレーザ光に試料Aにおける合焦調整をミラー30およびダイクロイックミラー31によって行うことができ、シングルモードファイバ9,10やコリメート光学系17,18の位置を調整する場合と比較して調整を容易にすることができるという利点がある。
In this way, the focus adjustment on the sample A can be performed on the two pulse laser beams by the
また、本実施形態においては、波長の異なる2つのパルスレーザ光を使用する例を示したが、これに代えて、波長の異なる3つのパルスレーザ光を使用してもよい。
例えば、2つのパルスレーザ光のエネルギ差が特定の振動数と一致し、3つ目のパルスレーザ光の波長を芳香族アミノ酸の吸収帯に近づけるように条件設定することにより、前記アミノ酸を含んだタンパク質を強調して観察することができる。
In the present embodiment, an example in which two pulsed laser beams having different wavelengths are used has been described. Alternatively, three pulsed laser beams having different wavelengths may be used.
For example, the amino acid was included by setting the conditions so that the energy difference between the two pulse laser beams coincided with a specific frequency and the wavelength of the third pulse laser beam was close to the absorption band of the aromatic amino acid. The protein can be highlighted and observed.
さらに例えば、400nmの領域のヘムタンパク質の強い吸収波長領域に3つ目のパルスレーザ光の波長を近づければ、ヘムに由来する振動スペクトルを測定することができる。
さらに例えば、紫外領域のペプチドカルボニル基の吸収帯に3つ目のパルスレーザ光の波長を近づければ、アミド変角モードやα炭素に結合した水素原子の面内変角振動モードによるラマンバンドが強く観測される。これらの振動モードはタンパク質の高次構造情報を含んでおり、個々のタンパク質の特徴を示す。
Further, for example, if the wavelength of the third pulse laser beam is brought close to the strong absorption wavelength region of the heme protein in the region of 400 nm, the vibration spectrum derived from heme can be measured.
Furthermore, for example, if the wavelength of the third pulse laser beam is brought close to the absorption band of the peptide carbonyl group in the ultraviolet region, the Raman band due to the amide bending mode or the in-plane bending vibration mode of hydrogen atoms bonded to α-carbon is generated. Strongly observed. These vibration modes contain protein higher-order structure information and show the characteristics of individual proteins.
すなわち、種々のタンパク質の混合物において、特定のタンパク質のもつ特徴、つまり芳香族アミノ酸の含有率・量やヘムの有無あるいは高次構造情報によって、その特定のタンパク質のスペクトルが他のタンパク質のスペクトルと区別可能となる。したがって、3つ目のパルスレーザ光の波長を適宜選択することにより、スペクトル線形を変化させることができる。 That is, in a mixture of various proteins, the spectrum of a specific protein is distinguished from the spectrum of other proteins by the characteristics of the specific protein, that is, the content and amount of aromatic amino acids, the presence or absence of heme, or higher-order structure information It becomes possible. Therefore, the spectral line shape can be changed by appropriately selecting the wavelength of the third pulse laser beam.
また、例えば、2つのパルスレーザ光のエネルギ差が特定の振動数と共鳴する条件で、3つ目のパルスレーザ光に所望の時間遅延を与えて試料に入射させることで、時間分解観察を行うことができる。非共鳴バックグラウンドは、3つのパルスを同時に入射させるために引き起こされるため、3つ目のパルスレーザ光に所定の時間遅延を与えて照射することで、この非共鳴バックグラウンドの発生を低減できるという利点がある。 In addition, for example, time-resolved observation is performed by applying a desired time delay to the third pulse laser beam and making it incident on the sample under the condition that the energy difference between the two pulse laser beams resonates with a specific frequency. be able to. Since the non-resonant background is caused by the simultaneous incidence of three pulses, the generation of this non-resonant background can be reduced by irradiating the third pulse laser beam with a predetermined time delay. There are advantages.
また、本実施形態においては、図11に示されるように、試料における非線形相互作用信号光を導光するマルチモードファイバ11を複数本配置してもよい。これにより、非線形相互作用信号光の集光効率を増大させることができ、スペクトル取得時間を短縮することができるとともに、観察の精度を向上することができるという利点がある。
Further, in the present embodiment, as shown in FIG. 11, a plurality of
また、本実施形態においては、光源6,7とシングルモードファイバ9,10との間に、負の群速度分散を発生させる分散補償器(図示略)を配置してもよい。このようにすることで、導光部材、集光光学系の分散およびサンプル自体のもつ分散を打ち消すことが可能となり、試料内の焦点位置におけるパルスレーザ光のパルス幅を最適化することができ、非線形相互作用信号光の強度を向上させることができるという利点がある。
In the present embodiment, a dispersion compensator (not shown) that generates negative group velocity dispersion may be disposed between the
さらに、分散補償器で予め負分散を与えることにより、導光部材を伝播する単位時間あたりのレーザ強度が減少し、本発明の効果を向上することができる。また、パルス巾最適化は、例えば、試料内の焦点位置においてフーリエ変換限界パルスを生じさせることで、実現してもよい。この分散補償器には例えば負の群速度分散(GVD)効果を有するファイバを用いてもよい。これを用いることで空間光学系を排除して高効率で導光部材にカップリングして導光する光強度の低減を抑制することが可能となる。 Furthermore, by giving negative dispersion in advance by the dispersion compensator, the laser intensity per unit time propagating through the light guide member is reduced, and the effect of the present invention can be improved. Further, the pulse width optimization may be realized, for example, by generating a Fourier transform limit pulse at the focal position in the sample. For example, a fiber having a negative group velocity dispersion (GVD) effect may be used for the dispersion compensator. By using this, it is possible to eliminate the spatial optical system and to suppress a reduction in light intensity that is coupled to the light guide member with high efficiency and guided.
また、本実施形態においては、試料Aにおいて発生した非線形相互作用信号光をマルチモードファイバ11によって導光部3の基端側まで導いた後に光検出器16により検出することとしたが、これに代えて、光検出器16を導光部の先端に配置して、検出された電気信号を導光部の基端側まで導くことにしてもよい。
In the present embodiment, the nonlinear interaction signal light generated in the sample A is guided to the proximal end side of the
A 試料
1 観察装置
2 光源部
4 照射光学系
5 検出光学系
8 タイミング調節部
9,10 シングルモードファイバ(導光部材)
9a,10a 射出端
11 マルチモードファイバ
11a 入射端
16 光検出器(検出器)
23,24,25 偏光調整部
31 ダイクロイックミラー(合波手段)
A
9a,
23, 24, 25
Claims (10)
該光源部から発せられ複数の前記パルスレーザ光を別個に導光する複数の導光部材と、
該導光部材により導光された複数の前記パルスレーザ光を試料に照射する照射光学系と、
該照射光学系による前記パルスレーザ光の照射により前記試料において発生した非線形相互作用信号を検出する検出光学系とを備える観察装置。 A light source unit that generates a plurality of pulsed laser beams having different wavelengths that induce nonlinear interaction in a sample;
A plurality of light guide members separately guiding a plurality of the pulsed laser beams emitted from the light source unit;
An irradiation optical system for irradiating the sample with a plurality of the pulse laser beams guided by the light guide member;
An observation apparatus comprising: a detection optical system that detects a nonlinear interaction signal generated in the sample by irradiation of the pulsed laser light by the irradiation optical system.
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