JP4836783B2 - Antitumor agent, method for producing antitumor agent, pharmaceutical composition containing antitumor agent, and antitumor agent-producing bacterium - Google Patents

Antitumor agent, method for producing antitumor agent, pharmaceutical composition containing antitumor agent, and antitumor agent-producing bacterium Download PDF

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Description

本発明は、ヒト小細胞肺癌Ｍｓ−１細胞等の腫瘍細胞に細胞死を誘導する活性を有する抗腫瘍剤、該抗腫瘍剤の効率的な製造方法、該抗腫瘍剤を含む医薬組成物、及び前記抗腫瘍剤を産生する新規な抗腫瘍剤産生菌に関する。   The present invention relates to an antitumor agent having an activity of inducing cell death in tumor cells such as human small cell lung cancer Ms-1 cells, an efficient method for producing the antitumor agent, a pharmaceutical composition containing the antitumor agent, And a novel antitumor agent-producing bacterium that produces the antitumor agent.

ガン等の腫瘍の化学療法においては、従来より各種の抗腫瘍剤がスクリーニングされ（例えば、特許文献１〜４参照）、その中でも、ガン細胞にのみ作用する選択的作用性があり、副作用の少ないものが使用されてきている。ところで、前記化学療法においては、ガン等の腫瘍細胞が薬剤耐性を獲得し、今まで使用していた抗腫瘍剤が効かなくなるという薬剤耐性の発現が大きな問題となっている。このため、前記薬剤耐性が発現する度に、新規な抗腫瘍剤を更に探索し、スクリーニングすることが必要となる。
しかし、新規な抗腫瘍剤を探索し、スクリーニングすることは容易ではない一方、該新規な抗腫瘍剤の開発が遅れれば、ガン等の腫瘍の化学療法に重大な支障をきたすという問題がある。
そこで、前記ガン細胞にのみ作用する選択作用性の強化、前記副作用の軽減、前記薬剤耐性の克服などを達成した新規な抗腫瘍剤、その効率的な製造方法、その産生菌、それを含む医薬組成物の開発が求められているのが現状である。In the chemotherapy of tumors such as cancer, various antitumor agents have been conventionally screened (for example, see Patent Documents 1 to 4). Among them, there is a selective action that acts only on cancer cells, and there are few side effects. Things have been used. By the way, in the said chemotherapy, tumor cells, such as cancer, acquire drug resistance, and the expression of the drug resistance that the antitumor agent currently used becomes ineffective becomes a big problem. For this reason, every time the drug resistance develops, it is necessary to further search and screen for new antitumor agents.
However, it is not easy to search for and screen for a novel antitumor agent, but if the development of the novel antitumor agent is delayed, there is a problem that it causes a serious hindrance to chemotherapy of tumors such as cancer.
Therefore, a novel antitumor agent that achieves enhancement of selective action acting only on the cancer cells, reduction of the side effects, overcoming of the drug resistance, etc., its efficient production method, its producing bacterium, and a medicine containing the same There is a current demand for the development of compositions.

特開平８−１４３５６９号公報Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-14369 特開平８−２３９３７９号公報JP-A-8-239379 特開平９−２４９６４７号公報JP-A-9-249647 特開平１１−２１２６３号公報JP-A-11-212263

本発明は、前記要望に応え、従来における問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ガン細胞にのみ作用する選択作用性の強化、副作用の軽減、薬剤耐性の克服などを達成し、ヒト小細胞肺癌Ｍｓ−１細胞や、アポトーシス抑制タンパク質Ｂｃｌ−２又はＢｃｌ−ＸＬを過剰に発現するヒト小細胞肺癌Ｍｓ−１／Ｂｃｌ−２細胞、Ｍｓ−１／Ｂｃｌ−ＸＬ細胞に細胞死を誘導する活性を有する抗腫瘍剤、その効率的な製造方法、その産生菌、及びそれを含む医薬組成物を提供することを目的とする。   An object of the present invention is to solve the conventional problems in response to the above-mentioned demands and achieve the following object. That is, the present invention achieves enhancement of selective action acting only on cancer cells, reduction of side effects, overcoming drug resistance, etc., and human small cell lung cancer Ms-1 cells, apoptosis inhibitory protein Bcl-2 or Bcl- Human small cell lung cancer Ms-1 / Bcl-2 cells overexpressing XL, antitumor agent having activity of inducing cell death in Ms-1 / Bcl-XL cells, efficient production method thereof, and producing bacteria thereof And a pharmaceutical composition containing the same.

前記課題を解決するために本発明者らが鋭意検討した結果、以下の知見を得た。即ち、前記ガン細胞が薬剤耐性を獲得する過程では、Ｂｃｌ−２やＢｃｌ−ＸＬ等のアポトーシス抑制タンパク質が作用しており、これらのアポトーシス抑制タンパク質を標的とし、これらのアポトーシス抑制タンパク質に対し活性を有する化合物が新規な抗腫瘍剤として有効である。そして、本発明者らが分離したストレプトミセス・エスピーＭＬ６９４−９０Ｆ３株を培養し、その培養物から分離した特定化合物（「ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質」と命名した）が、ヒト小細胞肺癌Ｍｓ−１細胞や、アポトーシス抑制タンパク質Ｂｃｌ−２又はＢｃｌ−ＸＬを過剰に発現するヒト小細胞肺癌Ｍｓ−１／Ｂｃｌ−２細胞、Ｍｓ−１／Ｂｃｌ−ＸＬ細胞に細胞死を誘導する活性を有し、抗腫瘍剤として有効であるという知見である。   As a result of intensive studies by the present inventors in order to solve the above problems, the following knowledge has been obtained. That is, in the process in which the cancer cells acquire drug resistance, apoptosis-inhibiting proteins such as Bcl-2 and Bcl-XL act, and these apoptosis-inhibiting proteins are targeted and active against these apoptosis-inhibiting proteins. It is effective as a novel antitumor agent. Then, the Streptomyces sp. ML694-90F3 strain isolated by the present inventors was cultured, and a specific compound isolated from the culture (named “ML694-90F3 substance”) was human small cell lung cancer Ms-1 cells. And has an activity to induce cell death in human small cell lung cancer Ms-1 / Bcl-2 cells and Ms-1 / Bcl-XL cells that overexpress the apoptosis inhibitory protein Bcl-2 or Bcl-XL, This is a finding that it is effective as a tumor agent.

本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段は、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 下記一般式で表される化合物及びその誘導体のいずれかであることを特徴とする抗腫瘍剤である。
ただし、前記一般式中、Ｒは、水素原子又はアルキル基を表す。
＜２＞ 下記構造式（１）で表される化合物及びその誘導体のいずれかであることを特徴とする抗腫瘍剤である。
＜３＞ 誘導体が、無機酸塩及び有機酸塩のいずれかである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の抗腫瘍剤である。
＜４＞ 下記構造式（Ａ）で表される化合物及びその誘導体のいずれかであることを特徴とする抗腫瘍剤である。
＜５＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の抗腫瘍剤の産生能を有し、よく分枝した基生菌糸より、比較的長い気菌糸を伸長し、その先端は、かぎ状、ループ状又は緩く巻いたらせんを形成し、卵円形〜円筒形の胞子を連鎖し、各種培地で、薄黄〜にぶ黄の発育上に黄味白〜明るい灰の気菌糸を着生し、可溶性色素は、認められないか又は黄色味を帯び、細胞壁中の２，６−ジアミノピメリン酸がＬＬ−型であり、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列がストレプトミセス属放線菌と高い相同性を示す、という菌学的性質を有することを特徴とする抗腫瘍剤産生菌である。
＜６＞ ストレプトミセス属である前記＜５＞に記載の抗腫瘍剤産生菌である。
＜７＞ ストレプトミセス・エスピーである前記＜６＞に記載の抗腫瘍剤産生菌である。
＜８＞ 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９６３１である前記＜５＞から＜７＞のいずれかに記載の抗腫瘍剤産生菌である。
＜９＞ 前記＜５＞から＜８＞のいずれかに記載の抗腫瘍剤産生菌を培養し、その培養物から前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の抗腫瘍剤を分離することを特徴とする抗腫瘍剤の製造方法である。
＜１０＞ 培養が、液体振とう培養である前記＜９＞に記載の抗腫瘍剤の製造方法である。
＜１１＞ 液体振とう培養の培養液を遠心分離し、沈殿物を濃縮後、遠心液液分配クロマトグラフィーにて精製し、酸を用いて処理して抗腫瘍剤を培養物から分離する前記＜１０＞に記載の抗腫瘍剤の製造方法である。
＜１２＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の抗腫瘍剤を含むことを特徴とする医薬組成物である。This invention is based on the said knowledge by the present inventors, and the means for solving the said subject are as follows. That is,
<1> An antitumor agent characterized by being either a compound represented by the following general formula or a derivative thereof.
However, in said general formula, R represents a hydrogen atom or an alkyl group.
<2> An antitumor agent which is any one of a compound represented by the following structural formula (1) and a derivative thereof.
<3> The antitumor agent according to any one of <1> to <2>, wherein the derivative is any one of an inorganic acid salt and an organic acid salt.
<4> An antitumor agent characterized by being either a compound represented by the following structural formula (A) or a derivative thereof.
<5> The ability to produce the antitumor agent according to any one of <1> to <4> above, and a relatively long aerial mycelium is extended from a well-branched basic mycelium, and the tip thereof is a key. A loop, or a loosely wound spiral, chained oval-cylindrical spores, and in various media, light yellow-brown yellow on the growth of light yellow-bright ash aerial hyphae, The soluble pigment is not observed or yellowish, 2,6-diaminopimelic acid in the cell wall is LL-type, and the partial base sequence of 16S rRNA gene is highly homologous to Streptomyces actinomycetes, It is an antitumor agent-producing bacterium characterized by having the bacteriological properties.
<6> The antitumor agent-producing bacterium according to <5>, which belongs to the genus Streptomyces.
<7> The antitumor agent-producing bacterium according to <6>, which is Streptomyces sp.
<8> The antitumor agent-producing bacterium according to any one of <5> to <7>, which has a deposit number of FERM P-19631.
<9> The antitumor agent-producing bacterium according to any one of <5> to <8> is cultured, and the antitumor agent according to any one of <1> to <4> is separated from the culture. This is a method for producing an antitumor agent.
<10> The method for producing an antitumor agent according to <9>, wherein the culture is liquid shaking culture.
<11> Centrifugating the liquid culture of liquid shaking culture, concentrating the precipitate, purifying by centrifugal liquid partition chromatography, and treating with an acid to separate the antitumor agent from the culture <10>. The method for producing an antitumor agent according to 10>.
<12> A pharmaceutical composition comprising the antitumor agent according to any one of <1> to <4>.

本発明によると、従来における問題を解決することができ、ガン細胞にのみ作用する選択作用性の強化、副作用の軽減、薬剤耐性の克服などを達成し、ヒト小細胞肺癌Ｍｓ−１細胞や、アポトーシス抑制タンパク質Ｂｃｌ−２又はＢｃｌ−ＸＬを過剰に発現するヒト小細胞肺癌Ｍｓ−１／Ｂｃｌ−２細胞、Ｍｓ−１／Ｂｃｌ−ＸＬ細胞に細胞死を誘導する活性を有する抗腫瘍剤、その効率的な製造方法、その産生菌、及びそれを含む医薬組成物を提供することができる。   According to the present invention, conventional problems can be solved, and enhancement of selective action that acts only on cancer cells, reduction of side effects, overcoming drug resistance, etc. are achieved, human small cell lung cancer Ms-1 cells, Anti-tumor agent having an activity of inducing cell death in human small cell lung cancer Ms-1 / Bcl-2 cells, Ms-1 / Bcl-XL cells overexpressing apoptosis inhibitory protein Bcl-2 or Bcl-XL, and An efficient production method, its producing bacteria, and a pharmaceutical composition containing the same can be provided.

図１は、ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質のＫＢｒ錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルのチャートである。FIG. 1 is a chart of infrared absorption spectrum of ML694-90F3 substance measured by KBr tablet method. 図２は、ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質のメタノール中での紫外線吸収スペクトルのチャートである。FIG. 2 is a chart of an ultraviolet absorption spectrum of the ML694-90F3 substance in methanol. 図３は、ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質の重メタノール中で室温にて測定した５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。FIG. 3 is a chart of proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured at room temperature in deuterated methanol of ML694-90F3 substance. 図４は、ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質の重メタノール中で室温にて測定した１２５ＭＨｚにおける炭素１３ＮＭＲスペクトルのチャートである。FIG. 4 is a chart of a carbon 13 NMR spectrum at 125 MHz measured at room temperature in deuterated methanol of the ML694-90F3 material.

（抗腫瘍剤）
本発明の抗腫瘍剤は、下記一般式で表される化合物及びその誘導体のいずれかである。
(Anti-tumor agent)
The antitumor agent of the present invention is either a compound represented by the following general formula or a derivative thereof.

ただし、前記一般式中、Ｒは、水素原子又はアルキル基を表す。前記アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、などが挙げられるが、これらの中でもメチル基が特に好ましい。前記一般式における複数のＲは、互いに同一であってもよいし、異なっていてもよいが、窒素原子に結合していないＲが全てメチル基であるのが好ましい。なお、窒素原子に結合する２つのＲの内、分子末端に結合した酸素原子含有ヘテロ六員環に結合した窒素原子に結合するＲとしては、メチル基又は水素原子であるのが好ましい。   However, in said general formula, R represents a hydrogen atom or an alkyl group. Examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, and a butyl group. Among these, a methyl group is particularly preferable. A plurality of R in the general formula may be the same or different from each other, but it is preferable that all Rs not bonded to a nitrogen atom are methyl groups. Of the two Rs bonded to the nitrogen atom, R bonded to the nitrogen atom bonded to the oxygen atom-containing hetero 6-membered ring bonded to the molecular end is preferably a methyl group or a hydrogen atom.

なお、前記一般式を構成する下記構造式（Ａ）で表される化合物も抗腫瘍活性を示すため、前記抗腫瘍剤として使用することができる。
In addition, since the compound represented by the following structural formula (A) constituting the general formula also exhibits antitumor activity, it can be used as the antitumor agent.

前記一般式で表される抗腫瘍剤の中でも、下記構造式（１）〜（４）で表される化合物及びその誘導体がより好ましく、これらの中でも、下記構造式（１）で表される化合物及びその誘導体が特に好ましい。   Among the antitumor agents represented by the general formula, compounds represented by the following structural formulas (1) to (4) and derivatives thereof are more preferable, and among these, a compound represented by the following structural formula (1) And its derivatives are particularly preferred.

前記構造式（１）で表される化合物は、本発明者らが分離した新規化合物であり、以下、「ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質」と称することがある。該ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質においては、分子内にメチルアミノ基を２個有している。   The compound represented by the structural formula (1) is a novel compound separated by the present inventors, and may hereinafter be referred to as “ML694-90F3 substance”. The ML694-90F3 substance has two methylamino groups in the molecule.

前記構造式（１）で表される化合物、即ち前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質の物理化学的性状としては、次の通りである。即ち、
（１） 外観は、淡黄色パウダー状である。
（２） 融点は、１２２〜１２５℃である。
（３） 分子式は、Ｃ４２Ｈ６３Ｎ３Ｏ８で表される。
（４） 高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ ７３８．４６８０（Ｍ＋Ｈ）＋ であり、計算値は、ｍ／ｚ ７３８．４６９３（Ｃ４２Ｈ６４Ｎ３Ｏ８として） である。
（５） 比旋光度は、［α］Ｄ ２３＝−６５５°（ｃ０．２，メタノール）、である。
（６） 赤外線吸収スペクトルは、図１に示す通りである。
（７） 紫外線吸収スペクトルは、図２に示す通りである。
（８） プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、５００ＭＨｚにおいて重メタノール中で室温にて測定したプロトンＮＭＲスペクトルは、図３に示す通りである。
（９） 炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１２５ＭＨｚにおいて重メタノール中で室温にて測定した炭素１３ＮＭＲスペクトルは、図４に示す通りである。
（１０） 薄層クロマトグラフィーとして、シリカゲル６０Ｆ２５４（メルク社製）の薄層クロマトグラフィーでは、展開溶媒としてクロロホルム：メタノール：水（４：１：０．１、容量比）を用いて展開したときのＲｆ値は、０．２６である。The physicochemical properties of the compound represented by the structural formula (1), that is, the ML694-90F3 substance are as follows. That is,
(1) The appearance is a pale yellow powder.
(2) Melting point is 122-125 ° C.
(3) The molecular formula is represented by C 42 H 63 N 3 O 8 .
(4) The experimental value by high resolution mass spectrometry (HRESIMS: positive ion mode) is m / z 738.4680 (M + H) + , and the calculated value is m / z 738.4693 (C 42 H 64 N 3 is as O 8).
(5) The specific rotation is [α] D 23 = −655 ° (c0.2, methanol).
(6) The infrared absorption spectrum is as shown in FIG.
(7) The ultraviolet absorption spectrum is as shown in FIG.
(8) As a proton nuclear magnetic resonance spectrum, a proton NMR spectrum measured at room temperature in deuterated methanol at 500 MHz is as shown in FIG.
(9) As a carbon 13 nuclear magnetic resonance spectrum, a carbon 13 NMR spectrum measured at room temperature in deuterated methanol at 125 MHz is as shown in FIG.
(10) In thin layer chromatography of silica gel 60F 254 (Merck) as thin layer chromatography, when developed using chloroform: methanol: water (4: 1: 0.1, volume ratio) as a developing solvent. The Rf value of is 0.26.

化合物が、前記一般式又は前記構造式（１）で表される構造を有するか否かは、適宜選択した各種の分析方法により確認することができるが、例えば、前記プロトン核磁気共鳴スペクトル、前記炭素１３核磁気共鳴スペクトル、前記赤外部吸収スペクトル、前記マススペクトル等の分析を行うことにより、確認することができる。   Whether or not the compound has the structure represented by the general formula or the structural formula (1) can be confirmed by various analysis methods selected as appropriate. For example, the proton nuclear magnetic resonance spectrum, This can be confirmed by analyzing a carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum, the infrared absorption spectrum, the mass spectrum, and the like.

前記誘導体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、製剤学的に許容し得るものであるのが好ましく、例えば、前記一般式又は前記構造式（１）で表される化合物の塩などが好適に挙げられる。前記塩は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよく、前記塩としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、無機酸塩、有機酸塩などが挙げられる。   The derivative is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably pharmaceutically acceptable. For example, the derivative is represented by the general formula or the structural formula (1). Preferred examples include salts of the compounds obtained. The salt may be used alone or in combination of two or more. The salt is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, an inorganic acid Examples thereof include salts and organic acid salts.

前記無機塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩などが挙げられる。
前記有機酸塩としては、例えば、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、などの有機酸の酸付加塩が挙げられる。
前記無機酸塩、前記有機酸塩などの酸付加塩は、前記一般式又は前記構造式（１）で表される化合物に酸を付加することにより得られる。Examples of the inorganic salt include hydrochloride, sulfate, phosphate and the like.
Examples of the organic acid salt include acid addition salts of organic acids such as acetate and methanesulfonate.
Acid addition salts such as the inorganic acid salt and the organic acid salt can be obtained by adding an acid to the compound represented by the general formula or the structural formula (1).

本発明の抗腫瘍剤は、前記一般式で表される化合物及びその前記誘導体、その中でも好ましくは、前記構造式（１）で表される化合物、即ちＭＬ６９４−９０Ｆ３物質及びその前記誘導体であり、該抗腫瘍剤は、ヒト小細胞肺癌Ｍｓ−１細胞や、アポトーシス抑制タンパク質Ｂｃｌ−２又はＢｃｌ−ＸＬを過剰に発現するヒト小細胞肺癌Ｍｓ−１／Ｂｃｌ−２細胞、Ｍｓ−１／Ｂｃｌ−ＸＬ細胞などの腫瘍細胞に細胞死を誘導する活性を有する。このため、本発明の抗腫瘍剤は、後述する本発明の医薬組成物等に好適に使用することができる。
本発明の抗腫瘍剤は、後述する本発明の抗腫瘍剤産生菌を用いた本発明の抗腫瘍剤の製造方法により好適に製造することができる。The antitumor agent of the present invention is a compound represented by the general formula and the derivative thereof, preferably a compound represented by the structural formula (1), that is, an ML694-90F3 substance and the derivative thereof, The antitumor agent includes human small cell lung cancer Ms-1 cells, human small cell lung cancer Ms-1 / Bcl-2 cells, Ms-1 / Bcl-, which overexpress the apoptosis-inhibiting protein Bcl-2 or Bcl-XL. It has the activity of inducing cell death in tumor cells such as XL cells. For this reason, the antitumor agent of this invention can be used conveniently for the pharmaceutical composition etc. of this invention mentioned later.
The antitumor agent of the present invention can be preferably produced by the method for producing the antitumor agent of the present invention using the antitumor agent-producing bacterium of the present invention described later.

（抗腫瘍剤産生菌）
本発明の抗腫瘍剤産生菌としては、本発明の前記抗腫瘍剤の産生能を有すること以外は、特に制限はなく、適宜選択することができるが、よく分枝した基生菌糸より、比較的長い気菌糸を伸長し、その先端は、かぎ状、ループ状又は緩く巻いたらせんを形成し、卵円形〜円筒形の胞子を連鎖し、各種培地で、薄黄〜にぶ黄の発育上に黄味白〜明るい灰の気菌糸を着生し、可溶性色素は、認められないか又は黄色味を帯び、細胞壁中の２，６−ジアミノピメリン酸がＬＬ−型であり、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列がストレプトミセス属放線菌と高い相同性を示す、という菌学的性質を有するものが好ましく、ストレプトミセス属がより好ましく、該ストレプトミセス属の中でも、ストレプトミセス・エスピーがより好ましく、静岡県伊東市の土壌より、平成１３年９月に微生物化学研究所（現微生物化学研究センター）において分離された放線菌、ＭＬ６９４−９０Ｆ３株、が特に好ましい。(Antineoplastic agent-producing bacteria)
The antitumor agent-producing bacterium of the present invention is not particularly limited except that it has the ability to produce the antitumor agent of the present invention, and can be selected as appropriate. Elongate long aerial hyphae, the tip forms a hooked, looped or loosely wound helix, chained oval-cylindrical spores, and growth of light yellow to yellow-yellow in various media A yellowish white to bright gray aerial hyphae, soluble pigment is not observed or yellowish, 2,6-diaminopimelic acid in the cell wall is LL-type, and partial base sequence of 16S rRNA gene Having a high homology with Streptomyces genus actinomycetes is preferred, Streptomyces genus is more preferred, and Streptomyces sp. Is more preferred amongst the Streptomyces genus. Actinomycetes, ML694-90F3 strain, which was isolated at the Institute of Microbial Chemistry (currently Microbial Chemistry Research Center) in September 2001, from the soil of East City, are particularly preferred.

なお、該ＭＬ６９４−９０Ｆ３株は、日本国独立行政法人産業技術総合研究所（〒３０５-８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託申請され、平成１６年１月８日に、受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９６３１として受託されている。   The ML694-90F3 strain was filed with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1st, 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki, Japan 305-8586). On the day, it is entrusted as an accession number: FERM P-19631.

ここで、前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３株の菌学的性質を詳述すると、以下の通りである。即ち、
（１）形態： 分枝した基生菌糸より、比較的長い気菌糸を伸長し、その先端は、かぎ状、ループ状又は緩く巻いたらせんを形成する。成熟した胞子鎖は、１０〜５０個の卵円形〜円筒形の胞子を連鎖する。胞子の大きさは、約０.５〜０.６×０．８〜０．９μｍで、胞子の表面は平滑である。輪生枝、菌束糸、胞子のう及び運動性胞子は、認められない。Here, the bacteriological properties of the ML694-90F3 strain will be described in detail as follows. That is,
(1) Form: A relatively long aerial hyphae is elongated from a branched basic mycelium, and the tip thereof forms a hooked, looped or loosely wound helix. A mature spore chain links 10-50 oval-cylindrical spores. The size of the spore is about 0.5 to 0.6 × 0.8 to 0.9 μm, and the surface of the spore is smooth. No roticular branches, fungal bundles, spore capsules or motile spores are observed.

（２） 各種培地における生育状態： 以下の色の記載について、かっこ内に示す標準は、コンテイナー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモニー・マニュアルを用いた。
１）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２、２７℃培養）
にぶ黄〜明るい茶の発育上に、黄味白〜薄黄の気菌糸を着生する。可溶性色素は認められない。
２）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−培地３、２７℃培養）
うす黄〜にぶ黄の発育上に、明るい灰の気菌糸を着生し、可溶性色素はかすかに黄色味を帯びる。
３）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、２７℃培養）
うす黄の発育上に、黄味白〜明るい灰の気菌糸を着生し、可溶性色素は認められない。
４）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培地５、２７℃培養）
にぶ黄〜明るい茶の発育上に、黄味白の気菌糸をわずかに着生し、可溶性色素は黄色味を帯びる。
５）シュクロース・硝酸塩寒天培地（２７℃培養）
薄黄の発育上に、明るい灰の気菌糸をうっすらと着生し、可溶性色素は認められない。(2) Growth state in various media: For the following color descriptions, the standard shown in parenthesis was the Color Harmony Manual of Container Corporation of America.
1) Yeast / malt agar medium (ISP-medium 2, 27 ° C. culture)
On the growth of nibu-yellow to bright tea, yellow-white to light-yellow aerial hyphae are grown. No soluble pigment is observed.
2) Oatmeal agar medium (ISP-medium 3, 27 ° C. culture)
On the growth of light yellow to yellow yellow, bright ash aerial hyphae are grown, and the soluble pigments are slightly yellowish.
3) Starch / inorganic salt agar medium (ISP-medium 4, 27 ° C. culture)
On the growth of light yellow, yellowish white to bright ash aerial mycelium grows and no soluble pigment is observed.
4) Glycerin / asparagine agar medium (ISP-medium 5, 27 ° C. culture)
On the growth of nib yellow to bright tea, slightly yellowish white aerial mycelia are grown, and the soluble pigment is yellowish.
5) Sucrose / Nitrate agar medium (27 ° C culture)
On the growth of light yellow, bright aerial mycelium is slightly formed and no soluble pigment is observed.

（３）生理的性質
１)生育温度範囲
イースト・スターチ寒天培地（溶性デンプン１．０重量％、イーストエキス０．２重量％、ひも寒天２．４重量％、ｐＨ７．０）を用い、ｌ０℃、２０℃、２４℃、２７℃、３０℃、３７℃及び４５℃の各温度で試験した結果、１０℃、３７℃及び４５℃での生育は認められず、２０℃〜３０℃で生育した。生育至適温度は、２７℃付近である。
２）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地、ＩＳＰ−培地４、２７℃培養）
培養後１８日目頃より、僅かにスターチの加水分解が認められたが、その作用は弱い。(3) Physiological properties 1) Growth temperature range 10 ° C. using yeast starch agar medium (soluble starch 1.0% by weight, yeast extract 0.2% by weight, string agar 2.4% by weight, pH 7.0) As a result of testing at 20 ° C., 24 ° C., 27 ° C., 30 ° C., 37 ° C. and 45 ° C., growth at 10 ° C., 37 ° C. and 45 ° C. was not observed, and it grew at 20 ° C. to 30 ° C. . The optimal growth temperature is around 27 ° C.
2) Starch hydrolysis (starch / inorganic salt agar medium, ISP-medium 4, 27 ° C. culture)
From about the 18th day after culturing, a slight hydrolysis of starch was observed, but its action was weak.

（４） 菌体成分： 細胞壁中の２，６−ジアミノピメリン酸はＬＬ−型である。
（５） １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析： １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列（４５８ｂｐ）を決定し、ＤＮＡデータベースに登録された公知菌株のデータと比較すると、前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３株の塩基配列は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属放線菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と高い相同性を示す。(4) Cell component: 2,6-diaminopimelic acid in the cell wall is LL-type.
(5) 16S rRNA gene analysis: When the partial base sequence (458 bp) of the 16S rRNA gene was determined and compared with the data of known strains registered in the DNA database, the base sequence of the ML694-90F3 strain was determined to be Streptomyces (Streptomyces). ) High homology with 16S rRNA gene of genus Streptomyces.

以上より、前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３株は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属であり、本発明では、ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＬ６９４−９０Ｆ３と称することがある。   From the above, the ML694-90F3 strain belongs to the genus Streptomyces, and in the present invention, it may be referred to as Streptomyces sp. ML694-90F3.

なお、本発明においては、前記抗腫瘍剤産生菌は、前記ストレプトミセス・エスピーＭＬ６９４−９０Ｆ３株などの菌株そのものであってもよいし、これらに対し、放射線照射その他の変異処理、遺伝子組換処理などを行って、前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質産生能を向上させた菌株であってもよい。   In the present invention, the anti-tumor agent-producing bacterium may be a strain such as the Streptomyces sp. ML694-90F3 strain itself, and irradiation and other mutation treatments and gene recombination treatments for these strains. Thus, the strain may be improved by improving the ML694-90F3 substance production ability.

本発明の抗腫瘍剤産生菌は、本発明の前記抗腫瘍剤の製造に好適に使用することができ、後述する本発明の抗腫瘍剤の製造方法に好適に製造することができる。   The antitumor agent-producing bacterium of the present invention can be suitably used for the production of the antitumor agent of the present invention, and can be preferably produced by the method for producing the antitumor agent of the present invention described later.

（抗腫瘍剤の製造方法）
本発明の抗腫瘍剤の製造方法においては、前記抗腫瘍剤産生菌を培養し、その培養物から前記抗腫瘍剤を分離することを含み、更に必要に応じて適宜選択したその他の処理を含む。(Method for producing antitumor agent)
The method for producing an antitumor agent of the present invention includes culturing the antitumor agent-producing bacterium, separating the antitumor agent from the culture, and further including other treatments appropriately selected as necessary. .

前記培養は、本発明の前記抗腫瘍剤産生菌（好ましくは前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質産生菌、より好ましくはストレプトミセス・エスピーＭＬ６９４−９０Ｆ３株）を用いて行うことができ、培養の条件（例えば、栄養培地、温度、接種菌、日数等）、方式、などについては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記抗腫瘍剤産生菌は、独立行政法人産業技術総合研究所から受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９６３１の菌株の分与を受けて入手してもよいし、あるいは、自然界から常法によって分離することにより入手してもよい。The culture can be performed using the antitumor agent-producing bacterium of the present invention (preferably the ML694-90F3 substance-producing bacterium, more preferably Streptomyces sp. ML694-90F3 strain). The nutrient medium, temperature, inoculum, number of days, etc.), method, etc. are not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
The anti-tumor agent-producing bacterium may be obtained from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology after receiving the distribution of the strain No .: FERM P-19631 or isolated from the natural world by a conventional method. You may obtain it.

前記栄養培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の放線菌培養培地、細菌（バクテリア）培養培地、などが挙げられる。前記栄養培地に添加する栄養源としては、特に制限はなく、公知のものの中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、窒素原、炭素原、無機塩類、微量金属、などが挙げられる。   There is no restriction | limiting in particular as said nutrient medium, According to the objective, it can select suitably, For example, well-known actinomycete culture medium, bacteria (bacteria) culture medium, etc. are mentioned. There is no restriction | limiting in particular as a nutrient source added to the said nutrient medium, It can select suitably according to the objective from well-known things, For example, a nitrogen source, a carbon source, inorganic salts, trace metals, etc. are mentioned. .

前記窒素源としては、例えば、市販されているペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、コーン・グルテン・ミールコットン・シード・ミール、トーストソーヤ、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記炭素原としては、例えば、グリセロール、デンプン、グルコース、ガラクトース、デキストリン、コーンスターチ、マルトース等の炭水化物、脂肪、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記無機塩類としては、例えば、食塩、炭酸カルシウム、などが挙げられる。
前記微量金属としては、例えば、マンガン、などが挙げられる。Examples of the nitrogen source include commercially available peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, ammonium sulfate, ammonium chloride, corn, gluten, meal cotton, seed meal, toast soya, and the like. These may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together.
Examples of the carbon source include carbohydrates such as glycerol, starch, glucose, galactose, dextrin, corn starch, and maltose, and fat. These may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together.
Examples of the inorganic salts include sodium chloride and calcium carbonate.
Examples of the trace metal include manganese.

前記温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、通常、放線菌の至適温度程度であり、２５〜３０℃が好ましく、２７℃付近が特に好ましい。
前記接種菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３株の斜面（スラント）培養物、液体浸とう培養物、などが好適に挙げられる。なお、前記接種菌の接種量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。There is no restriction | limiting in particular as said temperature, According to the objective, it can select suitably, Usually, it is about the optimal temperature of actinomycetes, 25-30 degreeC is preferable and 27 degreeC vicinity is especially preferable.
There is no restriction | limiting in particular as said inoculum, According to the objective, it can select suitably, For example, the slope (slant) culture of said ML694-90F3 strain | stump | stock, a liquid immersion culture, etc. are mentioned suitably. . In addition, there is no restriction | limiting in particular as an inoculation amount of the said inoculum, According to the objective, it can select suitably.

前記日数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、通常、３〜４日程度で前記抗腫瘍剤産生菌が十分な量に増殖し、前記抗腫瘍剤が十分な量産生される。なお、前記抗腫瘍剤が十分な量産生されたかについては、前記抗腫瘍剤産生菌の培養液中の前記抗腫瘍剤（前記Ｌ６９４−９０Ｆ３物質）の力価の経時変化を測定することにより、判断することができる。そして、該抗腫瘍剤（ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質）の力価の経時変化は、例えば、ヒト小細胞肺癌Ｍｓ−１細胞、Ｍｓ−１／Ｂｃｌ−２細胞、Ｍｓ−１／Ｂｃｌ−ＸＬ細胞に与える細胞毒性を評価することにより測定することができる。   The number of days is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. Usually, the antitumor agent-producing bacteria grow to a sufficient amount in about 3 to 4 days, and the antitumor agent is sufficient. Mass produced. As for whether the antitumor agent was produced in a sufficient amount, by measuring the change over time of the titer of the antitumor agent (the L694-90F3 substance) in the culture solution of the antitumor agent-producing bacteria, Judgment can be made. The time course of the titer of the antitumor agent (ML694-90F3 substance) is given to, for example, human small cell lung cancer Ms-1 cells, Ms-1 / Bcl-2 cells, and Ms-1 / Bcl-XL cells. It can be measured by evaluating cytotoxicity.

前記方式としては、例えば、好気培養、嫌気培養のいずれであってもよいが、前記好気培養が好ましく、また、斜面（スラント）培養、平板（プレート）培養などの固体（寒天）培養や、液体培養のいずれであってもよいが、前記液体培養が好ましく、該液体培養としては、振とう培養、静置培養、攪拌培養のいずれであってもよいが、振とう培養が好ましく、回転振とう培養がより好ましい。なお、大量培養を行う場合には、発酵槽等を用いて培養を行ってもよい。   The method may be, for example, an aerobic culture or an anaerobic culture, but the aerobic culture is preferable, and a solid (agar) culture such as a slant culture or a plate culture. Any of liquid culture may be used, but the liquid culture is preferable, and the liquid culture may be any of shaking culture, static culture, and stirring culture, but shake culture is preferable, and rotation Shaking culture is more preferred. In addition, when performing mass culture, you may culture using a fermenter etc.

前記培養物からの前記抗腫瘍剤の分離は、微生物による代謝物産物の公知の分取法の中から適宜選択した方法により行うことができ、例えば、前記抗腫瘍剤が前記抗腫瘍剤産生菌の菌体外に放出される場合には、該抗腫瘍剤産生菌の培養液から前記抗腫瘍剤産生菌を分離・除去した後、該培養液中に存在する前記抗腫瘍剤を分取することができ、また、前記抗腫瘍剤が前記抗腫瘍剤産生菌の菌体内に蓄積される場合には、該抗腫瘍剤産生菌の培養液から前記抗腫瘍剤産生菌を分離した後、該抗腫瘍剤産生菌の菌体を破砕等してから、前記抗腫瘍剤を分取することができるが、これらの中でも、液体振とう培養の培養液を遠心分離し、沈殿物を濃縮後、遠心液液分配クロマトグラフィーにて精製し、酸を用いて処理することにより行うのが好ましい。   Separation of the antitumor agent from the culture can be performed by a method appropriately selected from known fractionation methods of metabolite products by microorganisms. For example, the antitumor agent is an antitumor agent-producing bacterium. In the case of release to the outside of the microbial cells, separating and removing the antitumor agent-producing bacteria from the culture solution of the antitumor agent-producing bacteria, and then separating the antitumor agent present in the culture solution In addition, when the antitumor agent is accumulated in the cells of the antitumor agent-producing bacterium, the antitumor agent-producing bacterium is separated from the culture solution of the antitumor agent-producing bacterium, and then the antitumor agent-producing bacterium is isolated. The antitumor agent can be separated after disrupting the cells of the tumor agent-producing bacteria, but among these, the culture solution of liquid shaking culture is centrifuged, the precipitate is concentrated, and then centrifuged. Preference is given to purification by liquid-liquid partition chromatography and treatment with acid. There.

前記抗腫瘍剤の分取の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、溶媒を用いた溶剤抽出法、各種吸着剤に対する吸着親和性の差を利用した吸着分離法、ゲル濾過、向流分配を利用したクロマトグラフィー法、などが挙げられる。これらは、単独で利用してもよいし、２以上を併用してもよい。
なお、前記遠心分離は、公知の遠心分離機を用いて適宜選択した遠心条件にて行うことができる。前記酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸、酢酸等の有機酸、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。該酸を用いて処理を行う場合、前記酸の添加を止める目安としては、添加した液のｐＨが３程度であるのが好ましい。The method for separating the antitumor agent is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. For example, a solvent extraction method using a solvent, a difference in adsorption affinity for various adsorbents was used. Examples include adsorption separation, gel filtration, and chromatography using countercurrent distribution. These may be used alone or in combination of two or more.
In addition, the said centrifugation can be performed on the centrifugation conditions suitably selected using the well-known centrifuge. The acid is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid and phosphoric acid, and organic acids such as acetic acid. These may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together. When the treatment is performed using the acid, the pH of the added solution is preferably about 3 as a guide for stopping the addition of the acid.

以上により分取した前記抗腫瘍剤は、通常、前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質や、これに極めて構造の類似した数種の化合物群を含む混合物であることが多い。本発明においては、前記抗腫瘍剤を混合物のまま使用してもよいし、該混合物から前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質を更に分離して使用してもよい。
なお、以上により分取したものが、前記抗腫瘍剤であることの同定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ＮＭＲ、質量分析（ＭＳ）、などの分析方法により行うことができる。The antitumor agent sorted as described above is usually a mixture containing the ML694-90F3 substance and several kinds of compound groups having very similar structures. In the present invention, the antitumor agent may be used as a mixture, or the ML694-90F3 substance may be further separated from the mixture.
In addition, there is no restriction | limiting in particular as an identification method that what was fractionated by the above is the said antitumor agent, According to the objective, it can select suitably, For example, a high performance liquid chromatography (HPLC), NMR , Mass spectrometry (MS), and other analytical methods.

前記培養物からの前記抗腫瘍剤の分離の一具体例としては、前記抗腫瘍剤産生菌（前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質産生菌）の培養物（液）を塩基性条件下で一晩氷室に保存した後、遠心分離によって上清と沈殿物とに分離させる。そして、該沈殿物をメタノールで抽出した後、濃縮乾固し、得られた油状の残渣を遠心液液分配クロマトグラフィー（溶媒系：クロロホルム：メタノール：水＝５：６：４（容量比））にかけ、前記抗腫瘍剤（前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質）を含む１次精製オイルを得る。次に、当該１次精製オイル中の前記抗腫瘍剤（前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質）に塩酸を添加し、中和反応させることにより、前記抗腫瘍剤（前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質）の塩酸塩を生成させ、これを含む反応液をそのまま遠心液液分配クロマトグラフィー（溶媒系：クロロホルム：メタノール：水＝５：６：４（容量比））にかけ、目的の前記抗腫瘍剤（前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質）の塩酸塩を純品として得ることができる。   As a specific example of the separation of the antitumor agent from the culture, the culture (liquid) of the antitumor agent-producing bacterium (ML694-90F3 substance-producing bacterium) is stored overnight in an ice chamber under basic conditions. After that, it is separated into a supernatant and a precipitate by centrifugation. The precipitate was extracted with methanol and then concentrated to dryness. The resulting oily residue was subjected to centrifugal liquid-liquid partition chromatography (solvent system: chloroform: methanol: water = 5: 6: 4 (volume ratio)). To obtain a primary purified oil containing the antitumor agent (ML694-90F3 substance). Next, hydrochloric acid is added to the antitumor agent (the ML694-90F3 substance) in the primary refined oil and neutralized to produce the hydrochloride of the antitumor agent (the ML694-90F3 substance). The reaction solution containing this was directly subjected to centrifugal liquid-liquid partition chromatography (solvent system: chloroform: methanol: water = 5: 6: 4 (volume ratio)), and the desired antitumor agent (ML694-90F3 substance) Can be obtained as a pure product.

本発明の前記抗腫瘍剤産生菌を用いた本発明の前記抗腫瘍剤の製造方法により製造した本発明の前記抗腫瘍剤は、そのまま使用してもよいし、これを含む本発明の医薬組成物とて使用してもよい。   The antitumor agent of the present invention produced by the method for producing the antitumor agent of the present invention using the antitumor agent-producing bacterium of the present invention may be used as it is, or the pharmaceutical composition of the present invention comprising this You may use it as a thing.

（医薬組成物）
本発明の医薬組成物は、前記抗腫瘍剤を含むこと以外には、特に制限はなく、公知のものの中から適宜選択したその他の成分を含有してなる。
前記医薬組成物の薬型としては、特に制限はなく、粉末薬、カプセル薬、錠剤薬、座薬、液状薬、などが挙げられる。
前記その他の成分としては、製薬学的に許容できる常用の固体又は液状担体、例えば、エタノール、水、デンプン、などが好適に挙げられる。
前記医薬組成物は、抗腫瘍剤として好適に使用することができ、ヒト小細胞肺癌Ｍｓ−１細胞や、アポトーシス抑制タンパク質Ｂｃｌ−２又はＢｃｌ−ＸＬを過剰に発現するヒト小細胞肺癌Ｍｓ−１／Ｂｃｌ−２細胞、Ｍｓ−１／Ｂｃｌ−ＸＬ細胞に細胞死を誘導する活性を有する抗腫瘍剤として特に好適に使用することができる。(Pharmaceutical composition)
The pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited except that it contains the antitumor agent, and contains other components appropriately selected from known ones.
There is no restriction | limiting in particular as a dosage form of the said pharmaceutical composition, A powder medicine, a capsule medicine, a tablet medicine, a suppository, a liquid medicine, etc. are mentioned.
Suitable examples of the other components include pharmaceutically acceptable conventional solid or liquid carriers such as ethanol, water, and starch.
The pharmaceutical composition can be suitably used as an antitumor agent, and human small cell lung cancer Ms-1 cells overexpressing human small cell lung cancer Ms-1 cells or apoptosis inhibitory protein Bcl-2 or Bcl-XL. / Bcl-2 cells and Ms-1 / Bcl-XL cells can be particularly preferably used as an antitumor agent having an activity of inducing cell death.

以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。   Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these examples.

（実施例１）
−抗腫瘍剤（ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質）の製造−
ストレプトミセス・エスピーＭＬ６９４−９０Ｆ３株（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９６３１）を前記抗腫瘍剤産生菌として用い、これを寒天斜面（スラント）培地で培養し、接種菌とした。
コットン・シード・ミール１．０重量％、グルコース２．０重量％、グリセロール２．０重量％、塩化ナトリウム０．５重量％、塩化マンガン０．０００５重量％、炭酸カルシウム０．３２重量％、及びトーストソーヤ１．２重量％を含む液体培養培地（ｐＨ７．４）を三角フラスコ（５００ｍＬ容）に１１０ｍＬずつ分注し、常法により１２０℃、２０分間滅菌処理したものに、前記接種菌を接種し、２７℃で５日間回転振とう培養を行った。Example 1
-Production of antitumor agent (ML694-90F3 substance)-
Streptomyces sp. ML694-90F3 strain (Accession number: FERM P-19631) was used as the antitumor agent-producing bacterium, and this was cultured on an agar slant medium to obtain an inoculum.
Cotton seed meal 1.0 wt%, glucose 2.0 wt%, glycerol 2.0 wt%, sodium chloride 0.5 wt%, manganese chloride 0.0005 wt%, calcium carbonate 0.32 wt%, and Dispense 110 mL of liquid culture medium (pH 7.4) containing 1.2% by weight of toast soya into an Erlenmeyer flask (500 mL volume) and sterilize it at 120 ° C. for 20 minutes by a conventional method. The mixture was then subjected to rotary shaking culture at 27 ° C. for 5 days.

こうして得られた培養液を、水酸化ナトリウムでｐＨ９に調整し、一晩氷室で静置した後、遠心分離によって、上清と沈殿物とに分離した。そして、前記沈殿物に対し、メタノール（３００ｍＬ）を加え、攪拌し、濾過した後、濃縮し、乾固して、粗製のオイル状物質を得た（収量：３９７．３ｍｇ）。得られたオイル状物質を遠心液液分配クロマトグラフィーにより、クロロホルム：メタノール：水＝５：６：４（容量比）の混合溶媒を用いて精製し、前記抗腫瘍剤としての前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質の１次精製物を得た（収量：９６．６ｍｇ）。   The culture broth thus obtained was adjusted to pH 9 with sodium hydroxide, allowed to stand overnight in an ice chamber, and then separated into a supernatant and a precipitate by centrifugation. Then, methanol (300 mL) was added to the precipitate, stirred, filtered, concentrated and dried to obtain a crude oily substance (yield: 397.3 mg). The obtained oily substance was purified by centrifugal liquid-liquid distribution chromatography using a mixed solvent of chloroform: methanol: water = 5: 6: 4 (volume ratio), and the ML694-90F3 substance as the antitumor agent Was obtained (yield: 96.6 mg).

この１次精製物を、クロロホルム：メタノール：水＝５：６：４（容量比）の混合溶媒１ｍｌに溶解させた後、この溶液に、ｐＨが３になるまで氷零下において１ＮのＨＣｌを添加して、中和反応を行った。その結果、前記抗腫瘍剤としての前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質の塩酸塩が生成した。前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質の塩酸塩を含む反応液を、クロロホルム：メタノール：水＝５：６：４（容量比）の混合溶媒を用いて精製し、前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質の塩酸塩の純品５．７ｍｇを淡黄色パウダーとして得た。   This primary purified product is dissolved in 1 ml of a mixed solvent of chloroform: methanol: water = 5: 6: 4 (volume ratio), and then 1N HCl is added to the solution under zero ice until the pH becomes 3. Then, a neutralization reaction was performed. As a result, the hydrochloride of the ML694-90F3 substance as the antitumor agent was produced. The reaction solution containing the hydrochloride of the ML694-90F3 substance was purified using a mixed solvent of chloroform: methanol: water = 5: 6: 4 (volume ratio) to obtain a pure product 5 of the hydrochloride of the ML694-90F3 substance. .7 mg was obtained as a pale yellow powder.

（実施例２）
−抗腫瘍剤（ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質）の製造−
ストレプトミセス・エスピーＭＬ６９４−９０Ｆ３株（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９６３１）を前記抗腫瘍剤産生菌として用い、これを寒天斜面（スラント）培地で培養し、接種菌とした。
種母培養は、グルコース０．５重量％、グリセロール０．５重量％、グルタミン酸ナトリウム０．１５重量％、アジプロン０．５重量％、及び炭酸カルシウム０．１重量％を含む液体培養培地（ｐＨ７．４）を三角フラスコ（５００ｍＬ容）に１１０ｍＬずつ分注し、常法により１２０℃、２０分間滅菌処理したものに、前記接種菌を接種し、２７℃で３日間回転振とう培養することにより行った。
得られた種母培養液２．５Ｌを、同上の培地１００Ｌを含む２００Ｌ容ジャーファメンターに接種し、２７℃で３日間回転振とう培養を行った。(Example 2)
-Production of antitumor agent (ML694-90F3 substance)-
Streptomyces sp. ML694-90F3 strain (Accession number: FERM P-19631) was used as the antitumor agent-producing bacterium, and this was cultured on an agar slant medium to obtain an inoculum.
The seed culture is a liquid culture medium (pH 7.5) containing 0.5% by weight of glucose, 0.5% by weight of glycerol, 0.15% by weight of sodium glutamate, 0.5% by weight of adiprone, and 0.1% by weight of calcium carbonate. 4) was dispensed 110 mL each into an Erlenmeyer flask (500 mL volume), sterilized at 120 ° C. for 20 minutes by a conventional method, inoculated with the inoculum, and cultured by rotary shaking at 27 ° C. for 3 days. It was.
The obtained seed mother culture solution 2.5 L was inoculated into a 200 L jar fermenter containing 100 L of the same medium, and cultured with shaking at 27 ° C. for 3 days.

こうして得られた培養液を、水酸化ナトリウムでｐＨ９に調整し、一週間氷室で静置した後、吸引ろ過を行った。そして、得られた残渣に対し、クロロホルム−メタノール（１：５）混液（４０Ｌ）を加え、攪拌し、濾過した後、濃縮し、乾固して、これをクロロホルム：メタノール：水＝５：６：４（容量比）の混合溶媒２．４Ｌに溶解させて分配し、活性物質を含む有機層を８００ｍＬ得た。
得られた有機層のうち８０ｍＬを濃縮、乾固して、得られたオイル状物質を遠心液液分配クロマトグラフィーにより、クロロホルム：メタノール：水＝５：６：４（容量比）の混合溶媒を用いて精製し、前記抗腫瘍剤としての前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質の１次精製物を得た（収量：１．４７ｇ）。The culture broth thus obtained was adjusted to pH 9 with sodium hydroxide and allowed to stand in an ice chamber for one week, followed by suction filtration. Then, a chloroform-methanol (1: 5) mixed solution (40 L) was added to the obtained residue, stirred, filtered, concentrated and dried to give chloroform: methanol: water = 5: 6. Was dissolved in 2.4 L of a mixed solvent of 4 (volume ratio) and distributed to obtain 800 mL of an organic layer containing the active substance.
80 mL of the obtained organic layer was concentrated and dried, and the resulting oily substance was subjected to centrifugal liquid-liquid partition chromatography to obtain a mixed solvent of chloroform: methanol: water = 5: 6: 4 (volume ratio). To obtain a primary purified product of the ML694-90F3 substance as the antitumor agent (yield: 1.47 g).

この１次精製物を、クロロホルム：メタノール：水＝５：６：４（容量比）の混合溶媒の下層に溶解させた後、遠心液液分配クロマトグラフィーにより、クロロホルム：メタノール：５ｍＭ塩酸水＝５：６：４（容量比）の混合溶媒を用いて精製した。前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質を含む画分にクロロホルム：メタノール：水＝５：６：４（容量比）の混合溶媒の下層を加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でｐＨ８に調整して分配し、前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質を含む下層を濃縮、乾固し、前記抗腫瘍剤としての前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質のフリー体３０１ｍｇを得た。
得られた前記フリー体に１０ｍＭ塩酸を含むメタノール６０ｍＬを加えて溶解し、濃縮、乾固することにより、前記抗腫瘍剤としての前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質の塩酸塩を得た。収量は３２３ｍｇであった。This primary purified product was dissolved in the lower layer of a mixed solvent of chloroform: methanol: water = 5: 6: 4 (volume ratio), and then, chloroform: methanol: 5 mM hydrochloric acid water = 5 by centrifugal liquid-liquid partition chromatography. : 6: 4 (volume ratio) using a mixed solvent. A lower layer of a mixed solvent of chloroform: methanol: water = 5: 6: 4 (volume ratio) was added to the fraction containing the ML694-90F3 substance, adjusted to pH 8 with a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, and distributed. The lower layer containing 90F3 substance was concentrated and dried to obtain 301 mg of the free form of ML694-90F3 substance as the antitumor agent.
The obtained free body was dissolved by adding 60 mL of methanol containing 10 mM hydrochloric acid, concentrated and dried to obtain the hydrochloride of the ML694-90F3 substance as the antitumor agent. Yield was 323 mg.

（実施例３）
−抗腫瘍活性の評価−
実施例１で得られた前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質の塩酸塩の抗腫瘍剤としての活性を評価するために以下の実験を行った。
（１）ヒト小細胞肺癌Ｍｓ−１細胞、（２）Ｂｃｌ−２又はＢｃｌ−ＸＬを過剰に発現するように構築されたヒト小細胞肺癌Ｍｓ−１／Ｂｃｌ−２細胞、（３）Ｍｓ−１／Ｂｃｌ−ＸＬ細胞を、それぞれ９６ウエルプレートのウエル中にそれぞれ１×１０４個となるように撒き、更に各ウエル中に、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地 (日水製薬株式会社) を高圧蒸気滅菌したものに、ウシ胎児血清 （ＦＢＳ）（Ｂｉｏｓｅｒｕｍ）５重量％、濾過滅菌したＫａｎａｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ）１００ｍｇ／ｍＬ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ）１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、Ｌ（＋）−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ(関東化学株式会社)３０ｍｇ／ｍＬと、高圧蒸気滅菌したＮａＨＣＯ３ １０ｇ／Ｌを加えたものを培地とし、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で培養した。２４時間後、前記ＲＰＭＩ１６４０培地中に、種々の濃度の前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質を添加し、３７℃で４８時間培養を続けた。
前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質の細胞毒性は、トリパンブルー排出外試験法を用いた細胞の生存率により評価した。その結果、（１）ヒト小細胞肺癌Ｍｓ−１細胞、（２）Ｂｃｌ−２又はＢｃｌ−ＸＬを過剰に発現するように構築されたヒト小細胞肺癌Ｍｓ−１／Ｂｃｌ−２細胞、（３）Ｍｓ−１／Ｂｃｌ−ＸＬ細胞において、それぞれ、前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質が、１００ｎｇ／ｍＬの濃度で５０％の細胞死を起こすことが認められた。この結果より、前記ＭＬ６９４−９０Ｆ３物質の塩酸塩が、抗腫瘍剤としての活性を有することを確認した。(Example 3)
-Evaluation of antitumor activity-
In order to evaluate the activity of the hydrochloride of the ML694-90F3 substance obtained in Example 1 as an antitumor agent, the following experiment was conducted.
(1) human small cell lung cancer Ms-1 cell, (2) human small cell lung cancer Ms-1 / Bcl-2 cell constructed to overexpress Bcl-2 or Bcl-XL, (3) Ms- 1 / Bcl-XL cells were seeded at 1 × 10 4 cells in each well of a 96-well plate, and Rowell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) was added to each well. Sterilized with high-pressure steam, fetal bovine serum (FBS) (Bioserum) 5% by weight, filter-sterilized Kanamycin (Sigma) 100 mg / mL, Penicillin (Sigma) 100 units / mL, L (+)-Glutamine (Kanto Chemical Co., Ltd.) company) and 30mg / mL, NaHCO 3 10g were autoclaved And medium plus L, 37 ° C., were cultured in 5% CO 2 in an incubator. After 24 hours, various concentrations of the ML694-90F3 substance were added to the RPMI 1640 medium, and the culture was continued at 37 ° C. for 48 hours.
The cytotoxicity of the ML694-90F3 substance was evaluated by the cell viability using the trypan blue exclusion test method. As a result, (1) human small cell lung cancer Ms-1 cells, (2) human small cell lung cancer Ms-1 / Bcl-2 cells constructed to overexpress Bcl-2 or Bcl-XL, (3 ) In Ms-1 / Bcl-XL cells, each of the ML694-90F3 substances was found to cause 50% cell death at a concentration of 100 ng / mL. From this result, it was confirmed that the hydrochloride of the ML694-90F3 substance has activity as an antitumor agent.

本発明の抗腫瘍剤は、ヒト小細胞肺癌Ｍｓ−１細胞や、アポトーシス抑制タンパク質Ｂｃｌ−２又はＢｃｌ−ＸＬを過剰に発現するヒト小細胞肺癌Ｍｓ−１／Ｂｃｌ−２細胞、Ｍｓ−１／Ｂｃｌ−ＸＬ細胞に細胞死を誘導する活性を有する抗腫瘍剤として好適に使用することができ、本発明の医薬組成物に好適に使用することができる。
本発明の抗腫瘍剤産生菌は、本発明の抗腫瘍剤を産生するのに好適に使用することができる。
本発明の医薬組成物は、抗腫瘍剤として好適に使用することができる。
Antitumor agents of the present invention include human small cell lung cancer Ms-1 cells, human small cell lung cancer Ms-1 / Bcl-2 cells overexpressing apoptosis inhibitory protein Bcl-2 or Bcl-XL, Ms-1 / It can be suitably used as an antitumor agent having an activity of inducing cell death in Bcl-XL cells, and can be suitably used in the pharmaceutical composition of the present invention.
The antitumor agent-producing bacterium of the present invention can be suitably used for producing the antitumor agent of the present invention.
The pharmaceutical composition of the present invention can be suitably used as an antitumor agent.

Claims (7)

下記一般式で表される化合物、前記化合物の無機酸塩、及び前記化合物の有機酸塩のいずれかであることを特徴とする抗腫瘍剤。
ただし、前記一般式中、Ｒは、水素原子又はアルキル基を表す。An antitumor agent, which is any one of a compound represented by the following general formula, an inorganic acid salt of the compound, and an organic acid salt of the compound .
However, in said general formula, R represents a hydrogen atom or an alkyl group. 下記構造式（１）で表される化合物、前記化合物の無機酸塩、及び前記化合物の有機酸塩のいずれかであることを特徴とする抗腫瘍剤。
An antitumor agent which is any one of a compound represented by the following structural formula (1), an inorganic acid salt of the compound, and an organic acid salt of the compound .
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９６３１である請求項１から２のいずれかに記載の抗腫瘍剤の産生能を有する抗腫瘍剤産生菌。The antitumor agent-producing bacterium having the antitumor agent-producing ability according to any one of claims 1 to 2, which has a deposit number of FERM P-19631. 請求項３に記載の抗腫瘍剤産生菌を培養し、その培養物から請求項１から２のいずれかに記載の抗腫瘍剤を分離することを特徴とする抗腫瘍剤の製造方法。A method for producing an antitumor agent comprising culturing the antitumor agent-producing bacterium according to claim 3 and separating the antitumor agent according to any one of claims 1 to 2 from the culture. 培養が、液体振とう培養である請求項４に記載の抗腫瘍剤の製造方法。The method for producing an antitumor agent according to claim 4, wherein the culture is liquid shaking culture. 液体振とう培養の培養液を遠心分離し、沈殿物を濃縮後、遠心液液分配クロマトグラフィーにて精製し、酸を用いて処理して抗腫瘍剤を分離する請求項５に記載の抗腫瘍剤の製造方法。6. The antitumor agent according to claim 5, wherein the culture solution of liquid shaking culture is centrifuged, the precipitate is concentrated, purified by centrifugal liquid partition chromatography, and treated with an acid to separate the antitumor agent. Manufacturing method. 請求項１から２のいずれかに記載の抗腫瘍剤を含むことを特徴とする医薬組成物。A pharmaceutical composition comprising the antitumor agent according to claim 1.
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