JP4830106B2 - Trichinella species-specific antigen and method for testing Trichinella infection using the antigen - Google Patents

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Description

本発明は旋毛虫の種特異的抗原及びそれをコードする核酸に関する。本発明はまた、該種特異的抗原を利用した旋毛虫感染の検査法、旋毛虫感染検査用試薬、及び旋毛虫感染検査用キットに関する。   The present invention relates to Trichinella species-specific antigens and nucleic acids encoding the same. The present invention also relates to a method for testing Trichinella infection using the species-specific antigen, a reagent for examining Trichinella infection, and a kit for examining Trichinella infection.

旋毛虫は線虫の一種であり、様々な脊椎動物に感染する。旋毛虫は筋肉組織に寄生し、炎症を引き起こす。ヒトへの感染は、旋毛虫に感染した動物（ブタ等）の肉を十分な加熱処理を経ることなく摂取した場合に生じる。シストの状態で体内に取り込まれた旋毛虫は、成長、増殖し、リンパ管や血管を介して全身に運ばれ、様々な部位の筋肉組織に寄生することになる。
旋毛虫症の主な症状は、筋肉痛、脱力感、発熱、炎症（上瞼の腫れなど）である。これらの症状は、ほとんどの場合、感染後１〜２週程度経過したときに現れる。
尚、これまでに、本発明者らの研究グループは旋毛虫Trichinella pseudospiralis(T. pseudospiralis)の53kDa分泌抗原の同定に成功している（非特許文献１）。また、他の種であるTrichinella spiralis(T. spiralis)及びTrichinella britovi(T. britovi)についての53kDa分泌抗原の塩基配列が報告されている（非特許文献２、非特許文献３）。 Trichinella is a nematode that infects various vertebrates. Trichinella parasites muscle tissue and causes inflammation. Infection to humans occurs when meat from animals (such as pigs) infected with Trichinella is ingested without sufficient heat treatment. Trichinella taken into the body in a cyst state grows and proliferates, is transported throughout the body via lymphatic vessels and blood vessels, and infests muscle tissue at various sites.
The main symptoms of trichinosis are myalgia, weakness, fever and inflammation (such as swelling of the upper arm). In most cases, these symptoms appear when about 1 to 2 weeks have passed since infection.
To date, our research group has succeeded in identifying a 53 kDa secreted antigen of Trichinella pseudospiralis (T. pseudospiralis) (Non-patent Document 1). In addition, the base sequences of 53 kDa secreted antigens for other species, Trichinella spiralis (T. spiralis) and Trichinella britovi (T. britovi), have been reported (Non-patent Documents 2 and 3).

Int. J. Parasitol., 34, 491-500. 2004Int. J. Parasitol., 34, 491-500. 2004 Mol. Biochem Parasitol. 42, 165-74. 1990Mol. Biochem Parasitol. 42, 165-74. 1990 Mol. Immunol. 41, 421-433 (2004)Mol. Immunol. 41, 421-433 (2004)

他の寄生虫感染症の場合と異なり、旋毛虫感染症（旋毛虫症）については便の顕微鏡検査では診断ができない。また、症状と好酸球の増加に基づいて初期診断も行われるが、上記の通り筋肉痛などの症状が現れるまでには一定の期間を要すること、及び筋肉痛などの症状及び好酸球の増加は旋毛虫症に限ったものではないことから、このような診断のみでは旋毛虫症の感染の有無を判定できない。
一方、旋毛虫症の診断として、旋毛虫に対する抗体の存在を調べる血清検査法が実施されている。血清検査法は信頼性が高いものの、従来の血清検査法では感染から３週間程度経過した後でなければ抗体の検出ができず、早期診断には適さないものであった。また、従来の血清検査法では、感染した旋毛虫を種のレベルまで決定することはできない。
筋肉の組織の一部を切り取って病理学的に調べる方法もあるが、この検査法は人体への侵襲性が高いという問題点があり、また切り取った組織片に旋毛虫がいるとは限らず、検出率が低いという問題点もある。
そこで本発明は、旋毛虫症の早期診断に有用である、旋毛虫の種特異的抗原を提供することを第一の目的とする。また、旋毛虫の種特異的抗原を利用することによって、早期診断を可能とし且つ感染した旋毛虫を種のレベルまで決定することも可能とする旋毛虫感染の検査法、並びに該検査法に利用される検査用試薬及び検査用キットを提供することを第二の目的とする。尚、感染した旋毛虫を種のレベルまで決定することができれば、種の相違に起因する症状の違いが明確となり、より適切な治療が可能となる。また、疫学的研究に有益な情報も得られる。 Unlike other parasitic infections, Trichinella infections (Trichinosis) cannot be diagnosed by stool microscopy. In addition, an initial diagnosis is also made based on symptoms and increase in eosinophils. As mentioned above, it takes a certain period of time for symptoms such as myalgia to appear, and symptoms such as myalgia and eosinophils Since the increase is not limited to trichinosis, the presence or absence of trichinosis cannot be determined by such a diagnosis alone.
On the other hand, as a diagnosis of trichinosis, a serum test method for examining the presence of antibodies against Trichinella has been carried out. Although the serum test method is highly reliable, the conventional serum test method cannot detect the antibody until about 3 weeks after infection, and is not suitable for early diagnosis. In addition, conventional serum testing methods cannot determine infected Trichinella to the species level.
There is also a method of cutting a part of muscle tissue and examining it pathologically, but this test method has a problem that it is highly invasive to the human body, and there is no guarantee that Trichinella is present in the cut tissue piece. There is also a problem that the detection rate is low.
Therefore, a first object of the present invention is to provide a Trichinella species-specific antigen that is useful for early diagnosis of Trichinellosis. In addition, by using a Trichinella species-specific antigen, it is possible to make an early diagnosis and to determine the infected Trichinella to the species level, and to use the method for the examination. A second object is to provide a test reagent and a test kit to be used. In addition, if the infected Trichinella can be determined to the level of the species, the difference in symptoms due to the difference in species becomes clear, and more appropriate treatment is possible. It also provides useful information for epidemiological studies.

上記課題を解決するため本発明者らは旋毛虫の種特異的抗原を検索した。まず、53kDa分泌糖タンパク質に注目し、Trichinella nativa(T. nativa)及びTrichinella papua(T. papua)について当該タンパク質のアミノ酸配列（及びそれをコードする塩基配列）を決定した。続いて、配列決定に成功したこれらのタンパク質と、T. spiralis、T. britovi、及びT. pseudospiralisの53kDa分泌糖タンパク質について組換えタンパク質を合成し、各組換えタンパク質と旋毛虫感染マウスの血清との反応性を調べた。その結果から、旋毛虫の53kDa分泌糖タンパク質が種特異的抗原であることが証明された。また、感染時期の異なるマウスの血清を用いた実験によって、感染後の極めて早い段階で53kDa分泌糖タンパク質と、対応する抗体との反応が認められること（即ち53kDa分泌糖タンパク質に対する抗体の検出が可能であること）が明らかとなった。このように本発明者らは、旋毛虫（T. spiralis、T. pseudospiralis、T. britovi、T. nativaおよびT. papua）から分泌される53kDa分泌糖タンパク質が種特異的抗原であることを見出すとともに、旋毛虫症の検査における当該種特異的抗原の有用性を確認した。本発明者らは更に研究を進め、Trichinella T8、Trichinella T9、Trichinella nelsoni(T. nelsoni)、Trichinella murrelli(T. murrelli)、Trichinella T6についても、上記の通り他の種で見出された種特異的抗原（53kDa分泌糖タンパク質）に対応するタンパク質のアミノ酸配列（及びそれをコードする塩基配列）の決定に成功した。
本発明は主として以上の成果に基づくものであって、以下の旋毛虫の種特異的抗原などを提供する。
[１] (a)配列番号１のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(b)配列番号３のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(c)配列番号５のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(d)配列番号７のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(e)配列番号９のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(f)配列番号１１のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び(g)配列番号１３のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、からなる群より選択されるポリペプチドからなる、旋毛虫の種特異的抗原。
[２] 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４の塩基配列を有する、旋毛虫の種特異的抗原をコードする核酸。
[３] [２]に記載の核酸を保持するベクター。
[４] [２]に記載の核酸を保有する形質転換体。
[５] 以下のステップ(1)及び(2)を含む、旋毛虫感染の検査法：
(1)(a)配列番号１のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(b)配列番号３のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(c)配列番号５のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(d)配列番号７のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(e)配列番号９のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(f)配列番号１１のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(g)配列番号１３のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(h)配列番号１５のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(i)配列番号１７のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び(j)配列番号１９のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、からなる群より選択される一又は二以上のポリペプチドと、検体とを接触させるステップ；及び
(2)ステップ(1)の後、前記ポリペプチドに対して特異的に結合した抗体を検出するステップ。
[６] ステップ(1)において(a)及び(d)のポリペプチドと検体とを接触させることを特徴とする、[５]に記載の旋毛虫感染の検査法。
[７] ステップ(1)において(a)、(h)、(i)及び(j)のポリペプチドと検体とを接触させることを特徴とする、[５]に記載の旋毛虫感染の検査法。
[８] (a)配列番号１のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(b)配列番号３のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(c)配列番号５のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(d)配列番号７のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(e)配列番号９のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(f)配列番号１１のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(g)配列番号１３のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(h)配列番号１５のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(i)配列番号１７のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び(j)配列番号１９のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、からなる群より選択されるポリペプチドから本質的に構成される、旋毛虫感染検査用試薬。
[９] (a)配列番号１のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(b)配列番号３のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(c)配列番号５のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(d)配列番号７のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(e)配列番号９のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(f)配列番号１１のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(g)配列番号１３のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(h)配列番号１５のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(i)配列番号１７のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び(j)配列番号１９のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、からなる群より選択される一又は二以上のポリペプチドを含む、旋毛虫感染検査用キット。
[１０] (a)及び(d)のポリペプチドを含むことを特徴とする、[９]に記載の旋毛虫感染検査用キット。
[１１] (a)、(h)、(i)及び(j)のポリペプチドを含むことを特徴とする、[９]に記載の旋毛虫感染検査用キット。 In order to solve the above problems, the present inventors searched for a Trichinella species-specific antigen. First, focusing on the 53 kDa secreted glycoprotein, the amino acid sequence (and the base sequence encoding it) of Trichinella nativa (T. nativa) and Trichinella papua (T. papua) were determined. Subsequently, recombinant proteins were synthesized for the 53 kDa secreted glycoproteins of T. spiralis, T. britovi, and T. pseudospiralis, which were successfully sequenced. The reactivity of was investigated. The results proved that Trichinella 53 kDa secreted glycoprotein is a species-specific antigen. In addition, experiments using sera from mice with different infection times showed a reaction between the 53 kDa secreted glycoprotein and the corresponding antibody at an extremely early stage after infection (ie, detection of an antibody against the 53 kDa secreted glycoprotein is possible). It became clear. Thus, the inventors find that the 53 kDa secreted glycoprotein secreted from Trichinella (T. spiralis, T. pseudospiralis, T. britovi, T. nativa and T. papua) is a species-specific antigen. In addition, the usefulness of the species-specific antigen in the examination for trichinosis was confirmed. The present inventors have further researched, and Trichinella T8, Trichinella T9, Trichinella nelsoni (T. nelsoni), Trichinella murrelli (T. murrelli), and Trichinella T6 were also found to be species-specific as described above. The amino acid sequence (and the base sequence encoding it) of the protein corresponding to the target antigen (53kDa secreted glycoprotein) was successfully determined.
The present invention is mainly based on the above results, and provides the following trichinella species-specific antigens and the like.
[1] (a) A polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a polypeptide having substantially the same amino acid sequence as the sequence, (b) A polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence substantially identical to the sequence A polypeptide, (c) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the sequence, (d) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence A polypeptide, (e) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the sequence, (f) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence Trichinella, comprising a polypeptide and a polypeptide selected from the group consisting of (g) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or a polypeptide having substantially the same amino acid sequence as the sequence Species-specific antigen.
[2] A nucleic acid encoding a Trichinella species-specific antigen having the base sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, or SEQ ID NO: 14.
[3] A vector carrying the nucleic acid according to [2].
[4] A transformant having the nucleic acid according to [2].
[5] Test method for Trichinella infection, including the following steps (1) and (2):
(1) (a) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a polypeptide having substantially the same amino acid sequence as the sequence, (b) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or having the amino acid sequence substantially identical to the sequence A polypeptide, (c) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the sequence, (d) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence A polypeptide, (e) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the sequence, (f) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence A polypeptide, (g) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the sequence, (h) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or an amino acid substantially identical to the sequence A polypeptide having an acid sequence, (i) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the sequence, and (j) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or substantially identical to the sequence Contacting the specimen with one or more polypeptides selected from the group consisting of: a polypeptide having the amino acid sequence of:
(2) A step of detecting an antibody specifically bound to the polypeptide after step (1).
[6] The method for testing Trichinella infection according to [5], wherein the polypeptide of (a) and (d) is contacted with the specimen in step (1).
[7] The method for detecting Trichinella infection according to [5], wherein in step (1), the polypeptide of (a), (h), (i) and (j) is brought into contact with the specimen. .
[8] (a) A polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence, (b) An amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence A polypeptide, (c) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the sequence, (d) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence A polypeptide, (e) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the sequence, (f) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence A polypeptide, (g) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the sequence, (h) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence A polypeptide having a nonacid sequence, (i) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the sequence, and (j) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or substantially the same A reagent for testing Trichinella infection, which is essentially composed of a polypeptide selected from the group consisting of polypeptides having the same amino acid sequence.
[9] (a) A polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a polypeptide having substantially the same amino acid sequence as the sequence, (b) A polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence substantially identical to the sequence A polypeptide, (c) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the sequence, (d) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence A polypeptide, (e) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the sequence, (f) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence A polypeptide, (g) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the sequence, (h) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence A polypeptide having a nonacid sequence, (i) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the sequence, and (j) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or substantially the same A kit for testing Trichinella infection, comprising one or more polypeptides selected from the group consisting of polypeptides having the same amino acid sequence.
[10] The kit for testing Trichinella infection according to [9], comprising the polypeptides of (a) and (d).
[11] The kit for testing Trichinella infection according to [9], comprising the polypeptides (a), (h), (i) and (j).

（旋毛虫の種特異的抗原）
本発明の第１の局面は旋毛虫の種特異的抗原（以下、「本発明の抗原」ともいう）に関する。本発明の抗原は、それが天然に由来する場合には、対応する旋毛虫の細胞や組織、或いは体液などから標準的な手法を用いて分離・調製することができる。好ましくは、本明細書が開示する配列情報を参考にして、本発明の抗原を組換えDNA技術を用いて生産する。または、本発明の抗原を化学合成によって生産してもよい。 (Trichinella species-specific antigen)
The first aspect of the present invention relates to a Trichinella species-specific antigen (hereinafter also referred to as “antigen of the present invention”). When the antigen of the present invention is naturally derived, it can be separated and prepared from the corresponding Trichinella cells, tissues, body fluids, and the like using standard techniques. Preferably, the antigen of the present invention is produced using recombinant DNA technology with reference to the sequence information disclosed herein. Alternatively, the antigen of the present invention may be produced by chemical synthesis.

後述の実施例に示すように、本発明者らは各種旋毛虫から種特異的抗原を同定することに成功した。以上の成果に基づいて本発明は、以下の(a)〜(j)からなる群より選択されるポリペプチドからなる抗原（旋毛虫の種特異的抗原）を提供する。
(a)配列番号１のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（T. nativa特異的抗原）
(b)配列番号３のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（T. papua特異的抗原）
(c)配列番号５のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（Trichinella T8特異的抗原）
(d)配列番号７のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（Trichinella T9特異的抗原）
(e)配列番号９のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（T. nelsoni特異的抗原）
(f)配列番号１１のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（T. murrelli特異的抗原）
(g)配列番号１３のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（Trichinella T6特異的抗原）
(h)配列番号１５のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（T. spiralis特異的抗原）
(i)配列番号１７のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（T. britovi特異的抗原）
(j)配列番号１９のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（T. pseudospiralis特異的抗原）
これらのポリペプチドはいずれも、旋毛虫の特定の種に特異的な抗原である。従って、これらのポリペプチドは、旋毛虫感染の検査に利用できる（感染の有無、旋毛虫の種の決定）という共通の有用性を備える。本発明の好ましい一態様では、以上の(a)〜(g)からなる群より選択されるポリペプチドからなる抗原（旋毛虫の種特異的抗原）が提供される。
尚、説明の便宜上、以下の説明において(a)のポリペプチドを抗原a、(b)のポリペプチドを抗原b、(c)のポリペプチドを抗原c、(d)のポリペプチドを抗原d、(e)のポリペプチドを抗原e、(f)のポリペプチドを抗原f、(g)のポリペプチドを抗原g、(h)のポリペプチドを抗原h、(i)のポリペプチドを抗原i、(j)のポリペプチドを抗原jともいう。 As shown in Examples described later, the present inventors succeeded in identifying species-specific antigens from various Trichinella worms. Based on the above results, the present invention provides an antigen (Trichinella species-specific antigen) comprising a polypeptide selected from the group consisting of the following (a) to (j).
(a) A polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence (T. nativa-specific antigen)
(b) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence (T. papua-specific antigen)
(c) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence (Trichinella T8-specific antigen)
(d) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence (Trichinella T9-specific antigen)
(e) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence (T. nelsoni-specific antigen)
(f) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence (T. murrelli-specific antigen)
(g) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence (Trichinella T6-specific antigen)
(h) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence (T. spiralis-specific antigen)
(i) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence (T. britovi-specific antigen)
(j) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence (T. pseudospiralis-specific antigen)
All of these polypeptides are antigens specific for a particular species of Trichinella. Therefore, these polypeptides have the common utility that they can be used for examination of Trichinella infection (the presence or absence of infection, determination of Trichinella species). In a preferred embodiment of the present invention, an antigen (Trichinella species-specific antigen) comprising a polypeptide selected from the group consisting of the above (a) to (g) is provided.
For convenience of explanation, in the following explanation, the polypeptide (a) is the antigen a, the polypeptide (b) is the antigen b, the polypeptide (c) is the antigen c, the polypeptide (d) is the antigen d, The polypeptide of (e) is the antigen e, the polypeptide of (f) is the antigen f, the polypeptide of (g) is the antigen g, the polypeptide of (h) is the antigen h, the polypeptide of (i) is the antigen i, The polypeptide (j) is also referred to as antigen j.

ここで、アミノ酸配列に関して使用する用語「実質的に同一」とは、比較される二つのアミノ酸配列間で配列上の相違が比較的小さく、且つ配列上の相違が抗原としての作用・機能に実質的な影響を与えないことを意味する。従って、基準となるアミノ酸配列に対して、抗原としての作用・機能に実質的な影響を与えない範囲で一部の改変を含むとみることができるアミノ酸配列は、実質的に同一なアミノ酸配列である。ここでの「アミノ酸配列の一部の改変」とは、アミノ酸配列を構成する１〜数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１〜数個のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変化が生ずることをいう。アミノ酸配列の変異の位置は特に限定されず、また、複数の位置で変異を生じていてもよい。ここでの複数とは例えば全アミノ酸の約30％未満に相当する数であり、好ましくは約20％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約10％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約5％未満に相当する数であり、最も好ましくは約1％未満に相当する数である。
基準のポリペプチドのアミノ酸配列と、比較されるポリペプチドのアミノ酸配列とが実質的に同一であるか否かは、基準のポリペプチドに対して特異的結合性を有する抗体と、比較されるポリペプチドとの反応性を調べることにより判定できる。当該抗体に対する反応性が、基準のポリペプチドと、比較されるポリペプチドとの間で差がないか又は差が軽微なとき、これら二つのポリペプチド間においてアミノ酸配列の実質的同一性を認めることができる。 Here, the term “substantially identical” used for the amino acid sequence means that the difference in sequence between the two amino acid sequences to be compared is relatively small, and that the difference in sequence is substantially equivalent to the action / function as an antigen. Means no negative impact. Therefore, the amino acid sequence that can be considered to contain some modifications to the reference amino acid sequence within a range that does not substantially affect the action and function as an antigen is a substantially identical amino acid sequence. is there. As used herein, “partial modification of amino acid sequence” means deletion of one to several amino acids constituting the amino acid sequence, substitution, addition of one to several amino acids, insertion, or a combination thereof. A change occurs in the sequence. The position of the amino acid sequence mutation is not particularly limited, and the mutation may occur at a plurality of positions. The term “plurality” as used herein refers to, for example, a number corresponding to less than about 30% of all amino acids, preferably a number corresponding to less than about 20%, and more preferably a number corresponding to less than about 10%. The number is preferably less than about 5%, and most preferably less than about 1%.
Whether or not the amino acid sequence of the reference polypeptide and the amino acid sequence of the polypeptide to be compared are substantially the same is compared with the antibody to be compared with the antibody having specific binding property to the reference polypeptide. This can be determined by examining the reactivity with the peptide. Recognize substantial identity of amino acid sequences between these two polypeptides when the reactivity to the antibody is not different or slight between the reference polypeptide and the polypeptide being compared. Can do.

（旋毛虫の種特異的抗原をコードする核酸）
本発明の第２の局面は、本発明の抗原をコードする核酸に関する。本発明の核酸は、典型的には、本発明の抗原を調製するための材料として用いられる。このように本発明の核酸は、それを利用すれば旋毛虫の種特異的抗原を調製することができるという点において有用である。
本明細書における用語「核酸」は、それを含むことが意図されていないことが明らかな場合を除いて、DNA（cDNA及びゲノムDNAを含む）、RNA（mRNAを含む）、DNA類似体、及びRNA類似体を含む。本発明の核酸の形態は限定されず、即ち1本鎖及び2本鎖のいずれであってもよい。好ましくは2本鎖DNAである。またコドンの縮重も考慮される。即ちポリペプチドをコードする核酸の場合には、その発現産物として当該ポリペプチドが得られる限り任意の塩基配列を有していてよい。
本明細書において「特定の抗原をコードする核酸」とは、それを発現させた場合に当該特定の抗原が得られる核酸のことをいい、当該抗原のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有する核酸は勿論のこと、そのような核酸にアミノ酸配列をコードしない配列が付加されてなる核酸（例えば１又は複数個のイントロンを含むDNA）をも含む。 (Nucleic acid encoding Trichinella species-specific antigen)
The second aspect of the present invention relates to a nucleic acid encoding the antigen of the present invention. The nucleic acid of the present invention is typically used as a material for preparing the antigen of the present invention. Thus, the nucleic acid of the present invention is useful in that it can be used to prepare Trichinella species-specific antigens.
The term “nucleic acid” herein includes DNA (including cDNA and genomic DNA), RNA (including mRNA), DNA analogs, and, unless it is clear that it is not intended to include it. Contains RNA analogs. The form of the nucleic acid of the present invention is not limited, that is, it may be either single-stranded or double-stranded. Double-stranded DNA is preferable. Codon degeneracy is also considered. That is, in the case of a nucleic acid encoding a polypeptide, it may have an arbitrary base sequence as long as the polypeptide can be obtained as its expression product.
As used herein, the term “nucleic acid encoding a specific antigen” refers to a nucleic acid from which the specific antigen is obtained when expressed, and a nucleic acid having a base sequence corresponding to the amino acid sequence of the antigen is Of course, a nucleic acid (for example, DNA containing one or a plurality of introns) obtained by adding a sequence that does not encode an amino acid sequence to such a nucleic acid is also included.

本発明の核酸は好ましい態様として、配列番号２（T. nativa特異的抗原に対応する）、配列番号４（T. papua特異的抗原に対応する）、配列番号６（Trichinella T8特異的抗原に対応する）、配列番号８（Trichinella T9特異的抗原に対応する）、配列番号１０（T. nelsoni特異的抗原に対応する）、配列番号１２（T. murrelli特異的抗原に対応する）、又は配列番号１４（Trichinella T6特異的抗原に対応する）を有する。
本発明の核酸は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって調製することができる。
例えば、配列番号２の塩基配列を有する本発明の核酸は、当該塩基配列又はその相補配列の全体又は一部をプローブとしたハイブリダイゼーション法を利用してT. nativaのゲノムDNAライブラリー又はcDNAライブラリー、或はT. nativaの核酸抽出物より単離することができる。また、当該塩基配列の一部に特異的にハイブリダイズするようにデザインされた合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅反応（例えばPCR）を利用してT. nativaのゲノムDNAライブラリー又はcDNAライブラリー、或はT. nativaの核酸抽出物より増幅及び単離することができる。尚、オリゴヌクレオチドプライマーは一般に、市販の自動化DNA合成装置などを用いて容易に合成することができる。 In a preferred embodiment, the nucleic acid of the present invention has SEQ ID NO: 2 (corresponding to T. nativa-specific antigen), SEQ ID NO: 4 (corresponding to T. papua-specific antigen), and SEQ ID NO: 6 (corresponding to Trichinella T8-specific antigen). SEQ ID NO: 8 (corresponding to Trichinella T9-specific antigen), SEQ ID NO: 10 (corresponding to T. nelsoni-specific antigen), SEQ ID NO: 12 (corresponding to T. murrelli-specific antigen), or SEQ ID NO: 14 (corresponding to Trichinella T6-specific antigen).
The nucleic acid of the present invention can be prepared by using standard genetic engineering techniques, molecular biological techniques, biochemical techniques, etc. with reference to the sequence information disclosed in this specification or the attached sequence listing. it can.
For example, the nucleic acid of the present invention having the base sequence of SEQ ID NO: 2 can be obtained from a T. nativa genomic DNA library or cDNA live using a hybridization method using the whole base sequence or its complementary sequence as a probe. Or nucleic acid extract of T. nativa. In addition, a T. nativa genomic DNA library or cDNA library using a nucleic acid amplification reaction (for example, PCR) using a synthetic oligonucleotide primer designed to specifically hybridize to a part of the base sequence. Or can be amplified and isolated from a nucleic acid extract of T. nativa. In general, oligonucleotide primers can be easily synthesized using a commercially available automated DNA synthesizer.

本発明はさらに、本発明の核酸（本発明の抗原をコードする核酸）を含有するベクターを提供する。本明細書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいい、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）を含む。
使用目的（クローニング、ポリペプチドの発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。大腸菌を宿主とするベクターとしてはM13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体（pB325、pAT153、pUC8など）等、酵母を宿主とするベクターとしてはpYepSec1、pMFa、pYES2等、昆虫細胞を宿主とするベクターとしてはpAc、pVL等、哺乳類細胞を宿主とするベクターとしてはpCDM8、pMT2PC等を例示することができる。 The present invention further provides a vector containing the nucleic acid of the present invention (nucleic acid encoding the antigen of the present invention). As used herein, the term “vector” refers to a nucleic acid molecule capable of transporting a nucleic acid inserted therein into a target such as a cell, and is a plasmid vector, cosmid vector, phage vector, viral vector (adenovirus vector, Adeno-associated virus vectors, retrovirus vectors, herpesvirus vectors, etc.).
An appropriate vector is selected depending on the purpose of use (cloning, expression of polypeptide) and taking into account the type of host cell. M13 phage or a variant thereof, λ phage or a variant thereof, pBR322 or a variant thereof (pB325, pAT153, pUC8, etc.), etc. Examples of vectors using insect cells as hosts include pAc and pVL, and examples of vectors using mammalian cells as hosts include pCDM8 and pMT2PC.

本発明のベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や、発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には、選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。
本発明の核酸のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えDNA技術（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。 The vector of the present invention is preferably an expression vector. “Expression vector” refers to a vector capable of introducing a nucleic acid inserted therein into a target cell (host cell) and allowing expression in the cell. Expression vectors usually contain a promoter sequence necessary for the expression of the inserted nucleic acid, an enhancer sequence that promotes expression, and the like. An expression vector containing a selectable marker can also be used. When such an expression vector is used, the presence / absence (and extent) of introduction of the expression vector can be confirmed using a selection marker.
Insertion of the nucleic acid of the present invention into a vector, insertion of a selectable marker gene (if necessary), insertion of a promoter (if necessary), etc. are performed using standard recombinant DNA techniques (for example, Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold). A known method using a restriction enzyme and DNA ligase, which can be referred to Spring Harbor Laboratory Press, New York.

宿主細胞としては大腸菌などの細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、ヒト、サル、マウス、ラット等の哺乳類細胞（COS細胞、CHO細胞など）等を挙げることができる。   Examples of host cells include bacterial cells such as E. coli, yeast cells, insect cells, mammalian cells such as humans, monkeys, mice and rats (COS cells, CHO cells, etc.).

本発明はさらに、本発明の核酸が導入された宿主細胞（即ち形質転換体）を提供する。本発明の形質転換体は、上記本発明のベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって得ることができる。トランスフェクション等はリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション(Potter,H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1984))、マイクロインジェクション(Graessmann,M. & Graessmann,A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73,366-370(1976))等によって実施することができる。   The present invention further provides host cells (ie, transformants) into which the nucleic acid of the present invention has been introduced. The transformant of the present invention can be obtained by transfection or transformation using the vector of the present invention. Transfection and the like include calcium phosphate coprecipitation, electroporation (Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7161-7165 (1984)), lipofection (Felgner, PL et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 84,7413-7417 (1984)), microinjection (Graessmann, M. & Graessmann, A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73,366-370 (1976)) etc. can do.

本発明の形質転換体は、本発明の抗原を生産することに利用することができる。即ち、本発明はさらに、上記形質転換体を用いた本発明の抗原の生産方法を提供する。本発明の生産方法は、上記形質転換体を本発明の抗原が産生される条件下で培養するステップを少なくとも含む。通常はこのステップに加えて、産生されたポリペプチドを回収（分離及び精製）するステップが実施される。   The transformant of the present invention can be used for producing the antigen of the present invention. That is, the present invention further provides a method for producing the antigen of the present invention using the transformant. The production method of the present invention includes at least a step of culturing the transformant under conditions that produce the antigen of the present invention. Usually, in addition to this step, a step of recovering (separating and purifying) the produced polypeptide is performed.

（旋毛虫感染の検査法）
前述のように本発明者らは、旋毛虫（T. spiralis、T. pseudospiralis、T. britovi、T. nativaおよびT. papua）から分泌される53kDa分泌糖タンパク質が種特異的抗原であることを見出した。また、T. spiralis、T. pseudospiralis、T. britovi、T. nativaおよびT. papuaの組換えタンパク質を用いた実験において、当該種特異的抗原が旋毛虫の検出及び種の特定において有用であることを証明した。更に、Trichinella T8、Trichinella T9、T. nelsoni、T. murrelli、Trichinella T6についても、上記の通り他の種で見出された種特異的抗原（53kDa分泌糖タンパク質）に対応するタンパク質のアミノ酸配列（及びそれをコードする塩基配列）の決定に成功した。これらの成果に基づいて本発明は第３の局面として旋毛虫感染の検査法を提供する。本発明の検査法では以下のステップ(1)及び(2)が実施される。
(1)(a)配列番号１のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（抗原a）、(b)配列番号３のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（抗原b）、(c)配列番号５のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（抗原c）、(d)配列番号７のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（抗原d）、(e)配列番号９のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（抗原e）、(f)配列番号１１のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（抗原f）、(g)配列番号１３のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（抗原g）、(h)配列番号１５のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（抗原h）、(i)配列番号１７のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（抗原i）、及び(j)配列番号１９のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（抗原j）、からなる群より選択される一又は二以上のポリペプチドと、検体とを接触させるステップ。
(2)ステップ(1)の後、前記ポリペプチドに対して特異的に結合した抗体を検出するステップ。 (Test method for Trichinella infection)
As mentioned above, the inventors have determined that the 53 kDa secreted glycoprotein secreted from Trichinella (T. spiralis, T. pseudospiralis, T. britovi, T. nativa and T. papua) is a species-specific antigen. I found it. In addition, in experiments using recombinant proteins of T. spiralis, T. pseudospiralis, T. britovi, T. nativa, and T. papua, the species-specific antigen is useful for detection of Trichinella and for species identification. Proved. Furthermore, for Trichinella T8, Trichinella T9, T. nelsoni, T. murrelli, and Trichinella T6, the amino acid sequences of the proteins corresponding to the species-specific antigen (53 kDa secreted glycoprotein) found in other species as described above ( And the base sequence encoding it). Based on these results, the present invention provides a method for testing Trichinella infection as a third aspect. In the inspection method of the present invention, the following steps (1) and (2) are performed.
(1) (a) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence (antigen a), (b) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or substantially identical to the sequence A polypeptide having an amino acid sequence (antigen b), (c) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or a polypeptide having substantially the same amino acid sequence as the sequence (antigen c), (d) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or A polypeptide having substantially the same amino acid sequence as the sequence (antigen d), (e) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or a polypeptide having substantially the same amino acid sequence as the sequence (antigen e), (f ) A polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence (antigen f), (g) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or a polymorphism having an amino acid sequence substantially identical to the sequence Peptide (antigen g) (H) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence (antigen h), (i) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence One or more selected from the group consisting of: a polypeptide having the amino acid sequence (antigen i); and (j) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or an amino acid sequence substantially identical to the sequence (antigen j). A step of bringing the polypeptide of and a specimen into contact with each other.
(2) A step of detecting an antibody specifically bound to the polypeptide after step (1).

ステップ(1)において、抗原a〜抗原jの任意の組合せの中から選択される一又は二以上のポリペプチドと検体とを接触させることにしてもよい。従って例えば、ステップ(1)において抗原a〜抗原gからなる群より選択される一又は二以上のポリペプチドと検体とを接触させる検査法は本発明の一態様である。この態様で使用される抗原はいずれも本発明者らがその同定に初めて成功したものである。
本発明の他の一態様ではステップ(1)において抗原a、抗原b、及び抗原h〜抗原jからなる群より選択される一又は二以上のポリペプチドと検体とを接触させる。この態様で使用される抗原はいずれもその組換えタンパク質を用いた実験において種特異的な反応性が認められたものである（後述の実施例を参照）。
本発明のさらに他の一態様ではステップ(1)において抗原a及び抗原bからなる群より選択される一又は二のポリペプチドと検体とを接触される。この態様で使用される抗原a及び抗原bはともに本発明者らが同定に初めて成功したものであり、且つその組換えタンパク質を用いた実験において種特異的な反応性が認められたものである（後述の実施例を参照）。 In step (1), the specimen may be brought into contact with one or more polypeptides selected from any combination of antigen a to antigen j. Therefore, for example, a test method in which one or two or more polypeptides selected from the group consisting of antigen a to antigen g in step (1) are brought into contact with a specimen is an embodiment of the present invention. All of the antigens used in this embodiment have been successfully identified by the present inventors for the first time.
In another embodiment of the present invention, in step (1), one or more polypeptides selected from the group consisting of antigen a, antigen b, and antigen h to antigen j are contacted with the specimen. All of the antigens used in this embodiment have been found to have species-specific reactivity in experiments using the recombinant protein (see Examples below).
In still another embodiment of the present invention, in step (1), one or two polypeptides selected from the group consisting of antigen a and antigen b are contacted with the specimen. Both antigen a and antigen b used in this embodiment were the first successful identification by the present inventors, and species-specific reactivity was observed in experiments using the recombinant protein. (See examples below).

ステップ(1)として例えば、支持体（プレートや膜など）に固定化した抗原に対して検体を接触させる。支持体としてはポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂、ガラス、ニトロセルロース、PVDF（ポリフッ化ビニリデン）等が用いられる。抗原としては、それをコードするcDNAを利用して調製した組換え体（組換えタンパク質）を用いることが好ましい。   As step (1), for example, the specimen is brought into contact with the antigen immobilized on a support (plate, membrane, etc.). As the support, polystyrene resin, polycarbonate resin, silicon resin, nylon resin, glass, nitrocellulose, PVDF (polyvinylidene fluoride), or the like is used. As an antigen, it is preferable to use a recombinant (recombinant protein) prepared using cDNA encoding it.

ステップ(2)では、抗原に対して特異的に結合した抗体を検出する。ステップ(1)の結果、特定の抗原に対する抗体が検体中に存在すれば、抗原と抗体との複合体（免疫複合体）が形成される。ステップ(2)ではこの免疫複合体を検出することになる。免疫複合体の検出は、免疫複合体を標識した後、標識量を測定することによって行うことができる。免疫複合体の標識は、標識物質が結合した抗体（標識抗体）を利用して行うことができる。検査に供する検体の由来に合わせて、ステップ(1)で生じた免疫複合体を認識可能な抗体を標識化したものを標識抗体として用いる。例えば、検体がヒト由来であれば、標識化抗ヒト抗体を標識抗体とする。標識物質には、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミンイソチオシアネート（RITC）、アルカリホスファターゼ、ビオチン、及び放射性物質などを用いることができる。尚、様々な生物種に対して標識化抗体が市販されており、それらの中から適当なものを選択して使用することができる。   In step (2), an antibody specifically bound to the antigen is detected. As a result of step (1), if an antibody against a specific antigen is present in the specimen, a complex (immunocomplex) of the antigen and the antibody is formed. In step (2), this immune complex is detected. The immune complex can be detected by labeling the immune complex and then measuring the amount of the label. The immune complex can be labeled using an antibody (labeled antibody) to which a labeling substance is bound. A labeled antibody that is labeled with an antibody capable of recognizing the immune complex produced in step (1) is used in accordance with the origin of the specimen to be subjected to the test. For example, if the specimen is derived from a human, a labeled anti-human antibody is used as the labeled antibody. As the labeling substance, peroxidase, β-D-galactosidase, microperoxidase, horseradish peroxidase (HRP), fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine isothiocyanate (RITC), alkaline phosphatase, biotin, radioactive substance, etc. may be used. it can. In addition, labeled antibodies are commercially available for various biological species, and an appropriate one can be selected and used.

検出結果を用いて、特定の抗原に対する抗体が検体中に存在するか否かを判定する。検出された標識量に基づいて検体中の抗体量を評価してもよい。尚、検体についての検出結果を陽性対照（ポジティブコントロール）及び／又は陰性対照（ネガティブコントロール）についての検出結果と対比した上で検体中における抗体の有無を評価することが好ましい。信頼性の高い検出結果が得られるからである。陽性対照としては、検査法に使用する抗原に対して調製したポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が使用される。他方、陰性対照としては検体の希釈に使用する緩衝液や水などが使用される。   The detection result is used to determine whether an antibody against a specific antigen is present in the sample. The amount of antibody in the sample may be evaluated based on the detected label amount. In addition, it is preferable to evaluate the presence or absence of the antibody in the sample after comparing the detection result for the sample with the detection result for the positive control (positive control) and / or the negative control (negative control). This is because a highly reliable detection result can be obtained. As a positive control, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody prepared against the antigen used in the test method is used. On the other hand, as a negative control, a buffer solution or water used for diluting the specimen is used.

以上のアッセイ法に限らず、競合アッセイ法を採用することもできる。競合アッセイ法では、抗原に対して特異的に結合し且つ標識された抗体（特異的標識抗体）を予め用意しておき、抗原と検体とを接触させる際（ステップ(1)）に当該特異的標識抗体を競合的に反応させる。抗原に対する抗体が検体中に存在する場合、抗原に結合する特異的標識抗体の量が減少することになる。従って、抗原に結合した特異的標識抗体の量を調べれば、検体中に目的の抗体が存在するか否か（及び目的の抗体の量）を評価することができる。   Not only the above assay method but also a competitive assay method can be adopted. In the competitive assay, an antibody that specifically binds to and labeled with an antigen (specifically labeled antibody) is prepared in advance, and when the antigen and specimen are brought into contact with each other (step (1)), the specific antibody is used. The labeled antibody is reacted competitively. If antibodies against the antigen are present in the sample, the amount of specifically labeled antibody that binds to the antigen will be reduced. Therefore, by examining the amount of the specific labeled antibody bound to the antigen, it is possible to evaluate whether the target antibody is present in the sample (and the amount of the target antibody).

一種類の抗原のみを使用した場合には、当該抗原に対する抗体が検体中に存在するか否かを判定することができる。一方、二種類の抗原を使用すれば、当該二種類の抗原それぞれについて、特異的な抗体が検体中に存在するか否かを調べることができる。このように、使用する抗原の数を多くすれば検出できる抗体の種類も多くなる。つまり、多種類の抗原について特異的抗体の存否を一度に把握することが可能となる。
一般に、感染した旋毛虫の種を決定するためには、使用する抗原の数を多くすることが好ましいといえる。そこで、ステップ(1)において検体との接触に供される抗原の数は好ましくは２以上（２〜１０）、より好ましくは３以上（３〜１０）、更に好ましくは４以上（４〜１０）、更に更に好ましくは５以上（５〜１０）、より一層好ましくは６以上（６〜１０）である。
ところで、旋毛虫の種の分布は地域によって異なり、日本には主としてT. nativa及びTrichinella T9が分布し、欧州には主としてT. nativa、T. spiralis、T. britovi、及びT. pseudospiralisが分布する。このような事情を考慮すれば、日本における旋毛虫の感染について本発明の検査法を適用する場合には、検体中におけるT. nativaに対する特異的抗体の存在と、Trichinella T9に対する特異的抗体の存在をみれば非常に高い確率で旋毛虫の検出及び種の決定を行える。従って、当該二つの種に対応する抗原、即ち抗原a及び抗原dをステップ１で使用する検査法は、日本における旋毛虫の感染症を検査する目的において実用的価値が高いといえる。同様の理由からT. nativa、T. spiralis、T. britovi、及びT. pseudospiralisについての種特異的抗原（抗原a、抗原h、抗原i、及び抗原j）をステップ(1)で使用する検査法は、欧州における旋毛虫の感染症を検査する目的において実用的価値が高いといえる。
このように利用目的に合わせて使用する抗原の数を厳選することによって、本発明の検査法の実施に伴う費用の低減化、操作の簡便化などが図られる。尚、通常は検出されないと予想される種についても的確に検出するためには、使用する抗原の種類は多い方が好ましい。また、汎用性を高めるためには使用する抗原の種類は可能な限り多いことが好ましい。この観点より、最も好ましい態様では上記の全ての抗原（抗原a〜抗原j、合計10種類）が使用される。 When only one type of antigen is used, it can be determined whether an antibody against the antigen is present in the sample. On the other hand, if two kinds of antigens are used, it is possible to examine whether or not a specific antibody exists in the specimen for each of the two kinds of antigens. In this way, the number of antibodies that can be detected increases as the number of antigens used increases. That is, it is possible to grasp the presence or absence of specific antibodies for many types of antigens at a time.
In general, it may be preferable to increase the number of antigens used in order to determine the species of infected Trichinella. Therefore, the number of antigens subjected to contact with the specimen in step (1) is preferably 2 or more (2 to 10), more preferably 3 or more (3 to 10), and further preferably 4 or more (4 to 10). Still more preferably, it is 5 or more (5-10), and more preferably 6 or more (6-10).
By the way, the distribution of Trichinella species varies from region to region, mainly T. nativa and Trichinella T9 in Japan, and mainly T. nativa, T. spiralis, T. britovi, and T. pseudospiralis in Europe. . In consideration of such circumstances, when applying the test method of the present invention for Trichinella infection in Japan, the presence of a specific antibody against T. nativa and a specific antibody against Trichinella T9 in the sample. The trichinella can be detected and the species determined with a very high probability. Therefore, it can be said that the test method using the antigens corresponding to the two species, that is, the antigen a and the antigen d in Step 1, has high practical value for the purpose of testing the infection of Trichinella in Japan. Tests using species-specific antigens (antigen a, antigen h, antigen i, and antigen j) for T. nativa, T. spiralis, T. britovi, and T. pseudospiralis in step (1) for similar reasons Can be said to have high practical value for the purpose of examining Trichinella infections in Europe.
Thus, by carefully selecting the number of antigens to be used in accordance with the purpose of use, costs associated with the implementation of the test method of the present invention, simplification of operations, and the like can be achieved. In order to accurately detect species that are normally expected not to be detected, it is preferable that the number of antigens used be large. In order to enhance versatility, it is preferable that the number of antigens used is as large as possible. From this viewpoint, in the most preferred embodiment, all the above-mentioned antigens (antigen a to antigen j, 10 types in total) are used.

本発明では、旋毛虫に感染したか否か（及び感染した旋毛虫の種類）の判定を必要とする対象（検査対象）に由来する検体が使用される。ここでの「対象（検査対象）」はヒト、ブタ、ウマ、およびクマなどの野生動物である。ヒト又は治療対象となり得る非ヒト動物（例えばペット動物）を対象とする場合には、本発明の方法によって得られた情報（旋毛虫の感染の有無及び感染した旋毛虫の種類に関する情報）情報を利用することによって、より適切な治療が可能となる。このように、適切な治療方針の決定を可能とする点において本発明の方法は利用価値が非常に高い。一方、野生動物等に対して本発明の方法を適用して得られた情報は旋毛虫の種の分布を調べることに有用である。このように旋毛虫を対象とした疫学的研究においても本発明の方法は高い利用価値を有する。   In the present invention, a specimen derived from a subject (examination subject) that needs to be determined whether or not it is infected with Trichinella (and the type of infected Trichinella) is used. The “subject (test subject)” here is a wild animal such as a human, a pig, a horse, or a bear. When targeting humans or non-human animals that can be treated (for example, pet animals), information obtained by the method of the present invention (information on the presence or absence of Trichinella infection and the type of Trichinella infected) is obtained. By using it, more appropriate treatment becomes possible. Thus, the method of the present invention has a very high utility value in that an appropriate treatment policy can be determined. On the other hand, information obtained by applying the method of the present invention to wild animals and the like is useful for examining the distribution of Trichinella species. Thus, the method of the present invention has high utility value even in epidemiological studies targeting Trichinella.

検体としては、検査対象より採取された体液（血液、リンパ液、髄液等）が用いられる。好ましくは検査対象より採取された血液を分離して得られる血清を検体とする。即ち本発明の好ましい一形態では、特定の抗原に対する抗体が検査対象の血清中に存在するか否かが調べられることになる。血清は調製が容易であるという利点を有する。ところで、他の多くの検査の検体として血清が利用されており、このような検査と同時に本発明の検査法が実施されることも想定される。このような場合、本発明の検査法の検体として血清を採用すれば、本発明の実施のために改めて検体を調製する必要がなくなり、検査対象及び検査する者の負担が軽減し、検査時間の短縮化も図られる。   As the specimen, body fluid (blood, lymph fluid, spinal fluid, etc.) collected from the test object is used. Preferably, serum obtained by separating blood collected from the test subject is used as a specimen. That is, in a preferred embodiment of the present invention, it is examined whether an antibody against a specific antigen is present in the serum to be examined. Serum has the advantage of being easy to prepare. By the way, serum is used as a sample for many other tests, and it is also assumed that the test method of the present invention is performed simultaneously with such tests. In such a case, if serum is used as the sample of the test method of the present invention, it is not necessary to prepare a sample again for the implementation of the present invention, the burden on the test subject and the person to be tested is reduced, and the test time is reduced. Shortening is also achieved.

沈降反応や凝集反応を利用することも可能であるが、ウエスタンブロット法やELISA（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assey）法などを利用して本発明の検査法を実施することが好ましい。ウエスタンブロット法は、検出感度が高いこと、特異性が高いこと、及び高度に精製された抗原を必要としないことなどの利点を有する。ウエスタンブロット法を利用する場合の具体的な操作法の一例を以下に示す。まず、大腸菌などを宿主として用い、本発明の抗原を組換えタンパク質として生産する。得られた組換えタンパク質を電気泳動した後、適当な膜（例えばニトロセルロース膜やPVDF膜）への転写操作を行う。このようにして、本発明の抗原（組換えタンパク質）が付着した膜が得られる。複数の抗原が付着した膜を得るためには、各抗原について組換えタンパク質を調製した後、それぞれを異なるレーンで電気泳動し、そして同様の転写操作を行えばよい。このようにして得られた膜では、種類毎に区画された状態で複数の抗原が膜に付着していることになる。
次に、以上のようにして用意した膜に検体を接触させる。この操作の結果、膜に付着した抗原に対する抗体が検体中に存在していれば免疫複合体が形成される。次に、標識化抗体を反応させることで免疫複合体を標識し、標識を指標にして免疫複合体を検出する。標識化抗体としては、検体としてヒト血清が用いられるのであれば、標識物質を結合させた抗ヒト抗体が用いられる。 Although a precipitation reaction or an agglutination reaction can be used, it is preferable to carry out the test method of the present invention using a Western blot method, an ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assey) method, or the like. Western blotting has advantages such as high detection sensitivity, high specificity, and no need for highly purified antigens. An example of a specific operation method when the Western blot method is used is shown below. First, Escherichia coli or the like is used as a host, and the antigen of the present invention is produced as a recombinant protein. After the obtained recombinant protein is electrophoresed, a transfer operation to an appropriate membrane (for example, a nitrocellulose membrane or a PVDF membrane) is performed. In this way, a membrane to which the antigen (recombinant protein) of the present invention is attached is obtained. In order to obtain a membrane to which a plurality of antigens are attached, after preparing a recombinant protein for each antigen, each is electrophoresed in different lanes and the same transcription operation is performed. In the membrane thus obtained, a plurality of antigens are attached to the membrane in a state of being divided for each type.
Next, the specimen is brought into contact with the film prepared as described above. As a result of this operation, if an antibody against the antigen attached to the membrane is present in the specimen, an immune complex is formed. Next, the immune complex is labeled by reacting the labeled antibody, and the immune complex is detected using the label as an index. As the labeled antibody, if human serum is used as a specimen, an anti-human antibody to which a labeling substance is bound is used.

ELISA法は、検出感度が高いこと、特異性が高いこと、定量性に優れること、操作が簡便であること、多検体の同時処理に適することなど、多くの利点を有する。ELISA法を利用する場合の具体的な操作法の一例を以下に示す。まず、ウエスタンブロット法の場合と同様に組換えタンパク質を得る。精製後の組換えタンパク質を不溶性支持体に固定化する。具体的には例えばマイクロプレートの表面を抗原で感作する（コートする）。このように固相化した抗原に対して検体を接触させる。この操作の結果、固相化した抗原に対する抗体が検体中に存在していれば免疫複合体が形成される。次に、酵素を結合させた抗体を添加することで免疫複合体を標識した後、酵素の基質を反応させて発色させる。そして、発色量を指標として免疫複合体を検出する。
尚、ウエスタンブロット法及びELISA法の詳細については数多くの成書や論文に記載されており、各方法の実験手順や実験条件を設定する際にはそれらを参考にできる。 The ELISA method has many advantages such as high detection sensitivity, high specificity, excellent quantitativeness, simple operation, and suitability for simultaneous processing of multiple samples. An example of a specific operation method when using the ELISA method is shown below. First, a recombinant protein is obtained in the same manner as in Western blotting. The purified recombinant protein is immobilized on an insoluble support. Specifically, for example, the surface of a microplate is sensitized (coated) with an antigen. The specimen is brought into contact with the antigen thus immobilized. As a result of this operation, if an antibody against the immobilized antigen is present in the sample, an immune complex is formed. Next, an immune complex is labeled by adding an antibody conjugated with an enzyme, and then a color is developed by reacting the enzyme substrate. Then, immune complexes are detected using the color development amount as an index.
The details of Western blotting and ELISA are described in many books and papers, and can be referred to when setting the experimental procedure and experimental conditions for each method.

（旋毛虫感染検査用試薬）
本発明の更なる局面は旋毛虫感染検査用試薬に関する。本発明の検査用試薬は、本質的には、本発明の抗原a〜抗原jのいずれかよりなる。抗原a〜抗原jの任意の組合せの中から選択される抗原で本発明の旋毛虫感染検査用試薬を構成してもよい。従って例えば、抗原a〜抗原gからなる群より選択される抗原から本質的に構成される旋毛虫感染検査用試薬は本発明の一態様である。
本発明の検査用試薬を用いれば、検体中に存在する対応抗体（即ち、検査用試薬に対して特異的に結合する抗体）を特異的に捕捉することができる。従って、本発明の検査用試薬を予め標識化しておけば、標識量を指標として検体中の対応抗体を検出することができ、そして検出結果を利用して旋毛虫の特定の種についての感染の有無を判定できる。一方、無標識の検査用試薬を使用することにし、併せて、検査用試薬に対して特異的結合性を有する標識体（例えば標識化抗体）を使用することにすれば、検体中に存在する対応抗体に対して間接的に結合した標識の量を指標として、検体中に存在する対応抗体を検出することができる。 (Trichinella infection test reagent)
A further aspect of the present invention relates to a reagent for testing Trichinella infection. The test reagent of the present invention consists essentially of any one of the antigens a to j of the present invention. The reagent for examining Trichinella infection of the present invention may be composed of an antigen selected from any combination of antigens a to j. Therefore, for example, a reagent for testing Trichinella infection that is essentially composed of an antigen selected from the group consisting of antigen a to antigen g is an embodiment of the present invention.
When the test reagent of the present invention is used, a corresponding antibody (that is, an antibody that specifically binds to the test reagent) present in the specimen can be specifically captured. Therefore, if the test reagent of the present invention is labeled in advance, the corresponding antibody in the sample can be detected using the labeling amount as an index, and the detection result is used to detect the infection of a specific species of Trichinella. Presence / absence can be determined. On the other hand, if an unlabeled test reagent is used, and a labeled body (for example, a labeled antibody) having specific binding property to the test reagent is used, it is present in the sample. The corresponding antibody present in the specimen can be detected using the amount of label indirectly bound to the corresponding antibody as an index.

（旋毛虫感染検査用キット）
本発明の検査法をキット化した試薬等を用いて実施してもよい。本発明の更なる局面はこのような目的に使用される旋毛虫感性検査用キットを提供する。当該キットを用いることによって、本発明の検査法をより簡便に且つより短時間で実施することが可能となる。
本発明のキットには本発明の抗原a〜抗原jの中の１種類以上が含まれる。抗原a〜抗原jの任意の組合せの中から選択される抗原を使用して本発明の旋毛虫感染検査用キットを構築してもよい。従って例えば、抗原a〜抗原gからなる群より選択される一又は二以上の抗原を含む旋毛虫感染検査用キットは本発明の一態様である。この態様で使用される抗原はいずれも本発明者らがその同定に初めて成功したものである。本発明の他の一態様では抗原a、抗原b、及び抗原h〜抗原jからなる群より選択される一又は二以上の抗原を含む旋毛虫感染検査用キットが提供される。この態様で使用される抗原はいずれもその組換えタンパク質を用いた実験において種特異的な反応性が認められたものである（後述の実施例を参照）。本発明のさらに他の一態様では抗原a及び抗原bからなる群より選択される一又は二の抗原を含む旋毛虫感染検査用キットが提供される。この態様で使用される抗原a及び抗原bはともに本発明者らが同定に初めて成功したものであり、且つその組換えタンパク質を用いた実験において種特異的な反応性が認められたものである（後述の実施例を参照）。 (Trichinella infection test kit)
You may implement using the reagent etc. which made the test | inspection method of this invention into the kit. A further aspect of the present invention provides a Trichinella susceptibility testing kit used for such a purpose. By using the kit, the test method of the present invention can be carried out more easily and in a shorter time.
The kit of the present invention contains one or more of the antigens a to j of the present invention. The kit for testing Trichinella infection of the present invention may be constructed using an antigen selected from any combination of antigens a to j. Therefore, for example, a kit for testing Trichinella infection comprising one or more antigens selected from the group consisting of antigen a to antigen g is an embodiment of the present invention. All of the antigens used in this embodiment have been successfully identified by the present inventors for the first time. In another aspect of the present invention, there is provided a Trichinella infection test kit comprising one or more antigens selected from the group consisting of antigen a, antigen b, and antigen h to antigen j. All of the antigens used in this embodiment have been found to have species-specific reactivity in experiments using the recombinant protein (see Examples below). In still another embodiment of the present invention, a kit for testing Trichinella infection comprising one or two antigens selected from the group consisting of antigen a and antigen b is provided. Both antigen a and antigen b used in this embodiment were the first successful identification by the present inventors, and species-specific reactivity was observed in experiments using the recombinant protein. (See examples below).

使用する抗原の種類を増やせば検出可能な種の数が増える。従って一般的には、キットに含まれる抗原の種類は多いほどよい。一方、抗原a及び抗原dを含むキットにすれば、日本における旋毛虫の感染を検査するのに適したものとなる。また、抗原a、抗原h、抗原i、及び抗原jを含むキットにすれば、欧州における旋毛虫の感染を検査するのに適したものとなる。
抗原の他、反応用試薬、希釈液、反応容器、標準抗体、標識試薬（例えば標識抗体）、発色試薬などをキットに含めることができる。
本発明のキットは例えばウエスタンブロット法を利用するキット、又はELISA法を利用するキットとして提供される。ELISA法を利用するキットの場合、典型的には、プレート又は膜などの支持体に固定化された状態の抗原（固相化抗原）を含む。複数種類の抗原を使用する場合には、種類毎に区画化された状態で抗原が支持体に固定化されている。例えば、ウェル毎に異なる抗原が固相化されたマイクロプレートが用いられる。 Increasing the type of antigen used increases the number of detectable species. Therefore, in general, the more types of antigens included in a kit, the better. On the other hand, a kit containing the antigen a and the antigen d is suitable for examining Trichinella infection in Japan. A kit containing antigen a, antigen h, antigen i, and antigen j is suitable for examining Trichinella infections in Europe.
In addition to the antigen, a reagent for reaction, a diluent, a reaction vessel, a standard antibody, a labeling reagent (for example, a labeled antibody), a coloring reagent, and the like can be included in the kit.
The kit of the present invention is provided as, for example, a kit using the Western blot method or a kit using the ELISA method. In the case of a kit using an ELISA method, typically, an antigen (solid-phase antigen) in a state of being immobilized on a support such as a plate or a membrane is included. When a plurality of types of antigens are used, the antigens are immobilized on the support in a state where each type is partitioned. For example, a microplate in which different antigens are immobilized on each well is used.

１．旋毛虫の排出・分泌産物中のタンパク質の同定
(1)T. nativeの排出・分泌産物中からの種特異的抗原候補の同定
T. nativaの排出・分泌産物の中から、種特異的抗原となり得るタンパク質を同定することを以下の手順で試みた。
(1-1)材料
感染１５及び３０日後のマウス（中部科学資材）より、ペプシン−HCl消化によってT. nativaの筋肉幼虫を単離した。一方、感染６日後のマウス小腸よりT. nativaの成虫を単離した。また。成虫を培養液（イーグル・MEM）中で３日間培養することにより産出される新生幼虫を単離した。筋肉幼虫、新生幼虫及び成虫の排泄・分泌産物の粗抽出物をそれぞれ常法（Wakelin et al., Immunology 81, 475-479, 1994、Wu et al., Parasitology 116, 61-66, 1998）により調製した。 1. Identification of proteins in Trichinella excretion and secretion products
(1) Identification of species-specific antigen candidates from T. native excretion and secretion products
From the excretion / secretion products of T. nativa, an attempt was made to identify a protein that could be a species-specific antigen by the following procedure.
(1-1) Material T. nativa muscle larvae were isolated from mice (Chubu Science Materials) 15 and 30 days after infection by digestion with pepsin-HCl. On the other hand, adult T. nativa was isolated from the mouse small intestine 6 days after infection. Also. A newborn larvae produced by culturing adults in a culture solution (Eagle MEM) for 3 days was isolated. Crude extracts of excretion / secretion products of muscle larvae, newborn larvae and adult larvae were obtained by conventional methods (Wakelin et al., Immunology 81, 475-479, 1994, Wu et al., Parasitology 116, 61-66, 1998), respectively. Prepared.

(1-2)T. nativa由来cDNAの調製
筋肉幼虫（感染30日後）より、TRIZOL（インビトロゲン）を用いて全RNAを単離した。操作は取扱説明書に従った。単離した全RNAをDNase（プロメガ）で処理した。続いて、取扱説明書に従い、Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）を用いて、逆転写反応を行った。簡潔に言えば、全RNA 3μgと0.5μg/μlのオリゴ(dT)12-18（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）1μgとをReady-To-Goチューブに入れた後、RNaseフリー水を加えて33μlとした。チューブを37℃で60分間インキュベートした後、90℃で5分間インキュベートした。 (1-2) Preparation of cDNA derived from T. nativa Total RNA was isolated from muscle larvae (30 days after infection) using TRIZOL (Invitrogen). The operation followed the instruction manual. The isolated total RNA was treated with DNase (Promega). Subsequently, a reverse transcription reaction was performed using Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads (Amersham Pharmacia Biotech) according to the instruction manual. Briefly, 3 μg of total RNA and 1 μg of 0.5 μg / μl oligo (dT) 12-18 (Amersham Pharmacia Biotech) were placed in a Ready-To-Go tube, followed by the addition of RNase-free water to 33 μl. It was. The tube was incubated at 37 ° C. for 60 minutes and then incubated at 90 ° C. for 5 minutes.

(1-3)T. nativaの排泄・分泌産物をコードする遺伝子の増幅、及びDNA配列決定
T. spiralisの53kDa糖タンパク質に対応する、T. nativaのタンパク質全長をコードする遺伝子を、BamHI及びEcoRI制限酵素認識部位を付加するプライマーを用いて筋肉幼虫（感染30日後）のcDNAを鋳型としたPCRで増幅した。プライマーの配列を以下に示す。
5'-CGG GAT CCC GAT GTT CAG CAT CAC ATT AAA-3'（配列番号２１）
5'-CGG AAT TCC Gga cag att gct taa tga agc-3'（配列番号２２）
T. nativaのcDNA 100ng、10×PCRバッファー 10μl、各2.5mMのデオキシヌクレオチド三リン酸4μl、Taqポリメラーゼ（タカラバイオ） 1.5Uを混合してPCR反応液（100μl）とした。増幅反応は35サイクル（各サイクルは、94℃で30秒間の変性、52℃で30秒間のアニーリング、72℃で60秒間の伸長からなる）行った。精製したPCR増幅産物をBamHI及びEcoRI（いずれもニューイングランド・バイオラブズ）で消化し、生じた断片をpGEM-3Zf(+)ベクター（プロメガ）にクローニングした。配列の決定にはDye Primer Cycle Sequencing Kit（アプライド・バイオシステムズ）及びABI DNA自動シーケンサー373Sを使用した。得られたDNA配列のアッセンブリ及び解析にはDNASISソフトウエア（日立ソフトウエアエンジニアリング）を使用した。その結果、同定したT. nativaのタンパク質とT. spiralisの53kDa糖タンパク質のアミノ酸配列のホモロジーは約90％であり、同定したT. nativaのタンパク質が53kDa糖タンパク質であることが証明された。同定されたタンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号１）、及びそれをコードするcDNAの塩基配列（配列番号２）を図１に示す。尚、T. nativaの筋肉幼虫（感染30日後）より調製したゲノムDNAを用いたサザンブロット分析の結果、同定されたタンパク質に対応するほぼ単一のバンドを認めた。 (1-3) Amplification of gene encoding excretion / secretion product of T. nativa and DNA sequencing
A gene encoding the full-length T. nativa protein corresponding to the 53 kDa glycoprotein of T. spiralis was used as a template with muscle larvae (30 days after infection) using primers that add BamHI and EcoRI restriction enzyme recognition sites. Amplified by PCR. The primer sequences are shown below.
5'-CGG GAT CCC GAT GTT CAG CAT CAC ATT AAA-3 '(SEQ ID NO: 21)
5′-CGG AAT TCC Gga cag att gct taa tga agc-3 ′ (SEQ ID NO: 22)
A PCR reaction solution (100 μl) was prepared by mixing 100 ng of T. nativa cDNA, 10 μl of 10 × PCR buffer, 4 μl of 2.5 mM deoxynucleotide triphosphate, and 1.5 U of Taq polymerase (Takara Bio). The amplification reaction was performed for 35 cycles (each cycle consisted of denaturation at 94 ° C. for 30 seconds, annealing at 52 ° C. for 30 seconds, and extension at 72 ° C. for 60 seconds). The purified PCR amplification product was digested with BamHI and EcoRI (both New England Biolabs), and the resulting fragment was cloned into the pGEM-3Zf (+) vector (Promega). For the sequence determination, Dye Primer Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) and ABI DNA automatic sequencer 373S were used. DNASIS software (Hitachi Software Engineering) was used for assembly and analysis of the obtained DNA sequence. As a result, the homology between the identified T. nativa protein and the 53 kDa glycoprotein of T. spiralis was about 90%, demonstrating that the identified T. nativa protein was a 53 kDa glycoprotein. The deduced amino acid sequence of the identified protein (SEQ ID NO: 1) and the base sequence of the cDNA encoding it (SEQ ID NO: 2) are shown in FIG. As a result of Southern blot analysis using genomic DNA prepared from muscle larvae of T. nativa (30 days after infection), a nearly single band corresponding to the identified protein was observed.

(1-4)組換えタンパク質の合成
同定に成功した上記タンパク質について、それをコードするcDNAを以下のプライマーを用いたPCRで発現ベクターpTrcHis（インビトロゲン、米国）に組み込んだ。
5'-CGCGGATCCGCGGTCTACAGACAATGAGAATGCTG-3'（配列番号２３）
5'-CGGAATTCCGTTAGAACAACAACTGTAGTTCTG-3'（配列番号２４）
次に、発現ベクターを大腸菌DH5α（東洋紡、日本）に導入した。発現ベクターが導入された大腸菌を液体培地で増殖させた後、培地中にIPTG（終濃度1mM）を添加して組換えタンパク質の合成を誘導した（37℃、3時間）。合成された組換えタンパク質（抗原タンパク質）を高純度で回収するために、遠心処理で集菌した後、超音波処理（20mM Tris-HCLバッファー（pH8.0））で菌体を破砕し、そして再び遠心処理して菌体内封入体を回収した。得られた菌体内封入体を尿素処理（20mM Tris-HClバッファー(pH8.0)中6M尿素）により可溶化した後、アフィニティークロマトグラフィーに供し、タンパク質を精製した。アフィニティークロマトグラフィーはHis Trapキット（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）を利用して行い、その操作は取扱説明書に従った。既報の方法に従い段階的希釈法で尿素を除去した後、500mMのイミダゾールで組換えタンパク質を溶出した。続いてイミダゾールをPD-10カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）で除去した。純度の確認のために、最終的に得られたサンプルをSDS-PAGEで分析した。 (1-4) Synthesis of Recombinant Protein The above-mentioned protein that was successfully identified was inserted into the expression vector pTrcHis (Invitrogen, USA) by PCR using the following primers.
5'-CGCGGATCCGCGGTCTACAGACAATGAGAATGCTG-3 '(SEQ ID NO: 23)
5'-CGGAATTCCGTTAGAACAACAACTGTAGTTCTG-3 '(SEQ ID NO: 24)
Next, the expression vector was introduced into E. coli DH5α (Toyobo, Japan). Escherichia coli introduced with the expression vector was grown in a liquid medium, and then IPTG (final concentration 1 mM) was added to the medium to induce synthesis of the recombinant protein (37 ° C., 3 hours). In order to recover the synthesized recombinant protein (antigen protein) with high purity, the cells are collected by centrifugation, then disrupted by sonication (20 mM Tris-HCL buffer (pH 8.0)), and Centrifugal treatment was performed again, and the inclusion bodies were collected. The obtained inclusion bodies were solubilized by urea treatment (6M urea in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0)), and then subjected to affinity chromatography to purify the protein. Affinity chromatography was performed using a His Trap kit (Amersham Pharmacia Biotech), and the operation was performed according to the instruction manual. Following removal of urea by a serial dilution method according to a previously reported method, the recombinant protein was eluted with 500 mM imidazole. Subsequently, imidazole was removed with a PD-10 column (Amersham Pharmacia Biotech). In order to confirm the purity, the finally obtained sample was analyzed by SDS-PAGE.

(1-5)ウエスタンブロット分析
まず、上記の方法で得た組換えタンパク質に対するポリクローナル抗体を常法で調製した。具体的には、100μgの組換えタンパク質を完全アジュバント（complete Fruends’ adjuvant）と混合した後、BALB/cマウスに腹腔内注射した。２週間後、不完全アジュバントと混合した組換えタンパク質（100μg）を同様に腹腔内注射し、同様の操作を繰り返した（合計４回）。免疫終了後、尾より採血した。常法で血清を分離し、抗血清（ポリクローナル抗体）を得た。
T. nativaの成虫の粗抽出物（20μg）、T. nativaの新生幼虫の粗抽出物（20μg）、T. nativaの筋肉幼虫（感染15日後および感染30日後）の粗抽出物（20μg）をSDS-PAGEに供した後、ニトロセルロース膜への転写を行った。次に、転写後のニトロセルロース膜に対して、組換えタンパク質に対するポリクローナル抗体（100倍希釈）を反応させた。続いて、二次抗体としてアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG抗体を反応させた後、BCIP及びNBTを用いて発色させた。ウエスタンブロット分析の結果を図２に示す。図２においてレーンＭは分子量マーカー、レーン１は成虫からの粗抽出物、レーン２は新生幼虫からの粗抽出物、レーン３は筋肉幼虫（感染15日後）からの粗抽出物、レーン４は筋肉幼虫（感染30日後）からの粗抽出物である。
図２から明らかなように、T. nativaの成虫の粗抽出物内の約53kDaタンパク質、T. nativaの筋肉幼虫の粗抽出物内の約53kDaタンパク質を、当該ポリクローナル抗体が特異的に認識した。これによって、同定に成功したT. nativaのタンパク質がT. nativaの成虫の粗抽出物中にも存在することが確認された。即ち、同定に成功したタンパク質はT. nativaの成虫及び筋肉幼虫の両者によって排出・分泌されることが判明した。 (1-5) Western blot analysis First, a polyclonal antibody against the recombinant protein obtained by the above method was prepared by a conventional method. Specifically, 100 μg of recombinant protein was mixed with complete adjuvant (complete Fruends' adjuvant) and then injected intraperitoneally into BALB / c mice. Two weeks later, the recombinant protein (100 μg) mixed with incomplete adjuvant was similarly injected intraperitoneally, and the same operation was repeated (total 4 times). After immunization, blood was collected from the tail. Serum was separated by a conventional method to obtain antiserum (polyclonal antibody).
Crude extract of adult T. nativa (20 μg), crude extract of new larvae of T. nativa (20 μg), crude extract of muscle larvae of T. nativa (15 days after infection and 30 days after infection) (20 μg) After being subjected to SDS-PAGE, transfer to a nitrocellulose membrane was performed. Next, a polyclonal antibody against the recombinant protein (100-fold dilution) was reacted with the nitrocellulose membrane after transfer. Subsequently, an alkaline phosphatase-conjugated goat anti-mouse IgG antibody was reacted as a secondary antibody, and color was developed using BCIP and NBT. The results of Western blot analysis are shown in FIG. In FIG. 2, Lane M is a molecular weight marker, Lane 1 is a crude extract from an adult, Lane 2 is a crude extract from a newborn larva, Lane 3 is a crude extract from a muscle larva (15 days after infection), and Lane 4 is a muscle. A crude extract from larvae (30 days after infection).
As is apparent from FIG. 2, the polyclonal antibody specifically recognized about 53 kDa protein in the crude extract of adult T. nativa and about 53 kDa protein in the crude extract of muscle larvae of T. nativa. This confirmed that the T. nativa protein that was successfully identified was also present in the crude extract of adult T. nativa. In other words, it was found that the proteins that were successfully identified were excreted and secreted by both T. nativa adults and muscle larvae.

(2)T. papuaの排出・分泌産物中からの種特異的抗原候補の同定
（1）と同様の手順でT. papuaについて、T. spiralisの53kDa分泌糖タンパク質のホモログの同定を試みた。目的のタンパク質全長をコードする遺伝子をPCRで増幅する際に使用したプライマーの配列は以下の通りである。
5'-CGG GAT CCC GAT GTT CAG CAT CAC ATT AAA-3'（配列番号２１）
5'-CGG AAT TCC Gga cag att gct taa tga agc-3'（配列番号２２） (2) Identification of species-specific antigen candidates from T. papua excretion / secretion products In the same manner as (1), we attempted to identify a homologue of the 53 kDa secreted glycoprotein of T. spiralis for T. papua. The sequence of the primers used when a gene encoding the full length protein of interest is amplified by PCR is as follows.
5'-CGG GAT CCC GAT GTT CAG CAT CAC ATT AAA-3 '(SEQ ID NO: 21)
5′-CGG AAT TCC Gga cag att gct taa tga agc-3 ′ (SEQ ID NO: 22)

結果、T. spiralisの53kDa糖タンパク質に対応し、T. papuaの成虫及び筋肉幼虫が共通して排出・分泌するタンパク質を同定することに成功した。
同定したタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）、及びそれをコードするcDNAの塩基配列（配列番号４）を図３に示す。
以降の実験のため、同定に成功したタンパク質（53kDaタンパク質）について１.(1-4)と同様の手順で組換えタンパク質を調製した。尚、目的のタンパク質をコードする遺伝子を発現ベクターにPCRで組み込む際に使用したプライマーは次の通りである。
5'-CGCGGATCCGCGGTCTACAGACATTGAGAAGGTTG-3'（配列番号２５）
5'-CGGAATTCCGTTAGAACAACAACTGTAGTTCTG-3'（配列番号２４） As a result, we succeeded in identifying a protein excreted and secreted in common by adult T. papua and muscle larvae corresponding to the 53 kDa glycoprotein of T. spiralis.
The amino acid sequence of the identified protein (SEQ ID NO: 3) and the base sequence of the cDNA encoding it (SEQ ID NO: 4) are shown in FIG.
For subsequent experiments, a recombinant protein was prepared by the same procedure as in 1. (1-4) for a protein that was successfully identified (53 kDa protein). The primers used for incorporating the gene encoding the target protein into the expression vector by PCR are as follows.
5'-CGCGGATCCGCGGTCTACAGACATTGAGAAGGTTG-3 '(SEQ ID NO: 25)
5'-CGGAATTCCGTTAGAACAACAACTGTAGTTCTG-3 '(SEQ ID NO: 24)

２．組換えタンパク質を用いた旋毛虫の検査法（血清診断法）
同定に成功した各タンパク質が種特異的抗原であること、及び旋毛虫の検査に有用であることを検証するために、各種旋毛虫に感染したマウスの血清を用いて以下の実験を行った。また、感染時期の異なるマウスの血清に対する反応性についても調べ、早期検査が可能か否かを検討した。
（１）実験方法・材料
T. nativa 、T. papua、T. spiralis、T. pseudospiralis及びT. britoviについて組換え53kDaタンパク質を用意した。尚、T. spiralis、T. pseudospiralis及びT. britoviについては、以下に示す配列情報を基に１.(1-4)と同様の手順で目的の組換えタンパク質を調製した。
種名：アミノ酸配列：塩基配列
T. spiralis：配列番号１５：配列番号１６
T. pseudospiralis：配列番号１７：配列番号１８
T. britovi：配列番号１９：配列番号２０ 2. Method for testing Trichinella using recombinant protein (serum diagnostic method)
In order to verify that each protein successfully identified is a species-specific antigen and useful for the examination of Trichinella, the following experiment was performed using the sera of mice infected with various Trichinella. We also examined the reactivity of mice with different infection times to the serum, and examined whether early testing was possible.
(1) Experimental methods and materials
Recombinant 53 kDa proteins were prepared for T. nativa, T. papua, T. spiralis, T. pseudospiralis and T. britovi. For T. spiralis, T. pseudospiralis and T. britovi, the target recombinant protein was prepared by the same procedure as 1. (1-4) based on the sequence information shown below.
Species name: Amino acid sequence: Base sequence
T. spiralis: SEQ ID NO: 15: SEQ ID NO: 16
T. pseudospiralis: SEQ ID NO: 17: SEQ ID NO: 18
T. britovi: SEQ ID NO: 19: SEQ ID NO: 20

尚、目的のタンパク質をコードする遺伝子を発現ベクターにPCRで組み込む際に使用したプライマーは次の通りである。
T. spiralis
5'-CGCGGATCCGCGGTCTACAGACAATGAGAATGTTG-3'（配列番号２６）
5'-CGGAATTCCGTTAGAACAACAACTGTAGTTCTG-3'（配列番号２４）
T. pseudospiralis
5'-CGCGGATCCGCGGTCTTCAGACACTGATAAGGTTG-3'（配列番号２７）
5'-CGGAATTCCGTTAGAACAACAACTGTAGTTCTG-3'（配列番号２４）
T. britovi
5'-CGCGGATCCGCGGTCTACAGACAATGAGAATGCTG-3'（配列番号２３）
5'-CGGAATTCCGTTAGAACAACAACTGTAGTTCTG-3'（配列番号２４） The primers used for incorporating the gene encoding the target protein into the expression vector by PCR are as follows.
T. spiralis
5'-CGCGGATCCGCGGTCTACAGACAATGAGAATGTTG-3 '(SEQ ID NO: 26)
5'-CGGAATTCCGTTAGAACAACAACTGTAGTTCTG-3 '(SEQ ID NO: 24)
T. pseudospiralis
5'-CGCGGATCCGCGGTCTTCAGACACTGATAAGGTTG-3 '(SEQ ID NO: 27)
5'-CGGAATTCCGTTAGAACAACAACTGTAGTTCTG-3 '(SEQ ID NO: 24)
T. britovi
5'-CGCGGATCCGCGGTCTACAGACAATGAGAATGCTG-3 '(SEQ ID NO: 23)
5'-CGGAATTCCGTTAGAACAACAACTGTAGTTCTG-3 '(SEQ ID NO: 24)

一方、T.nativa、Trichinella T8、Trichinella T9、T. papua及びT. britoviについて、感染後（300larvae）30日の感染マウス血清を用意した。また、T. spiralis及びT. pseudospiralisについては感染後（300larvae）0、8、13、18、23、30、50、90、及び120日の感染マウス血清を用意した。
これらの感染マウス血清と、各旋毛虫由来の組換えタンパク質との反応性をウエスタンブロット分析で調べた。ウエスタンブロット分析は１．(1-5)と同様の手順で行った。 On the other hand, regarding T. nativa, Trichinella T8, Trichinella T9, T. papua and T. britovi, 30 days after infection (300larvae), infected mouse serum was prepared. For T. spiralis and T. pseudospiralis, infected mouse sera were prepared at 0, 8, 13, 18, 23, 30, 50, 90, and 120 days after infection (300larvae).
The reactivity of these infected mouse sera with recombinant proteins derived from each Trichinella was examined by Western blot analysis. Western blot analysis is 1. The same procedure as in (1-5) was performed.

（２）実験結果
T. spiralis及びT. pseudospiralisのウエスタンブロット分析の結果を図４に示す。図４(a)は組換えT. spiralis 53kDaタンパク質との反応結果であって、感染後0日のT. spiralis感染マウス血清との反応性（レーン１）、感染後8日のT. spiralis感染マウス血清との反応性（レーン２）、感染後13日のT. spiralis感染マウス血清との反応性（レーン３）、感染後18日のT. spiralis感染マウス血清との反応性（レーン４）、感染後23日のT. spiralis感染マウス血清との反応性（レーン５）、感染後30日のT. spiralis感染マウス血清との反応性（レーン６）、感染後50日のT. spiralis感染マウス血清との反応性（レーン７）、感染後90日のT. spiralis感染マウス血清との反応性（レーン８）、感染後120日のT. spiralis感染マウス血清との反応性（レーン９）がそれぞれ示される。
図４(b)は組換えT. pseudospiralis 53kDaタンパク質との反応結果であって、感染後0日のT. pseudospiralis感染マウス血清との反応性（レーン１０）、感染後8日のT. pseudospiralis感染マウス血清との反応性（レーン１１）、感染後13日のT. pseudospiralis感染マウス血清との反応性（レーン１２）、感染後18日のT. pseudospiralis感染マウス血清との反応性（レーン１３）、感染後23日のT. pseudospiralis感染マウス血清との反応性（レーン１４）、感染後30日のT. pseudospiralis感染マウス血清との反応性（レーン１５）、感染後50日のT. pseudospiralis感染マウス血清との反応性（レーン１６）、感染後90日のT. pseudospiralis感染マウス血清との反応性（レーン１７）、感染後120日のT. pseudospiralis感染マウス血清との反応性（レーン１８）がそれぞれ示される。
一方、図５及び図６には、ウエスタンブロット解析によるT. spiralis、T. pseudospiralis、T. nativa、T. papua及びT. britoviの各組換え53kDaタンパク質について、T. spiralis感染血清との反応性（図５(a)）、T. pseudospiralis感染血清との反応性（図５(b））、T. nativa感染血清との反応性（図５(c)）、T. papua感染血清との反応性(図５(d))、T. britovi感染血清との反応性（図６(e)）、Trichinella T8感染血清との反応性（図６(f)）及びTrichinella T9感染血清との反応性(図６(g))がそれぞれ示される。図５及び６においてＭは分子量マーカー、レーン１は組換えT. spiralis 53kDaタンパク質、レーン２は組換えT. pseudospiralis 53kDaタンパク質、レーン３は組換えT. native 53kDaタンパク質、レーン４は組換えT. papua 53kDaタンパク質、レーン５は組換えT. britovi 53kDaタンパク質である。 (2) Experimental results
The results of Western blot analysis of T. spiralis and T. pseudospiralis are shown in FIG. Fig. 4 (a) shows the results of reaction with recombinant T. spiralis 53kDa protein, reactivity with T. spiralis-infected mouse serum on day 0 after infection (lane 1), and T. spiralis infection on day 8 after infection. Reactivity with mouse serum (lane 2), reactivity with T. spiralis-infected mouse serum 13 days after infection (lane 3), reactivity with T. spiralis-infected mouse serum 18 days after infection (lane 4) Reactivity with sera of T. spiralis infected mice 23 days after infection (lane 5), Reactivity with sera of T. spiralis infected mice 30 days after infection (lane 6), T. spiralis infection 50 days after infection Reactivity with mouse serum (lane 7), reactivity with T. spiralis-infected mouse serum 90 days after infection (lane 8), reactivity with T. spiralis-infected mouse serum 120 days after infection (lane 9) Are shown respectively.
FIG. 4 (b) shows the reaction results with the recombinant T. pseudospiralis 53kDa protein, the reactivity with the sera of mice infected with T. pseudospiralis on day 0 after infection (lane 10), and the infection with T. pseudospiralis on day 8 after infection. Reactivity with mouse serum (lane 11), reactivity with T. pseudospiralis-infected mouse serum 13 days after infection (lane 12), reactivity with T. pseudospiralis-infected mouse serum 18 days after infection (lane 13) Reactivity with sera of T. pseudospiralis infected mice 23 days after infection (lane 14), Reactivity with sera of T. pseudospiralis infected mice 30 days after infection (lane 15), T. pseudospiralis infection 50 days after infection Reactivity with mouse serum (lane 16), reactivity with T. pseudospiralis-infected mouse serum 90 days after infection (lane 17), reactivity with T. pseudospiralis-infected mouse serum 120 days after infection (lane 18) Are shown respectively.
5 and 6 show the reactivity of T. spiralis, T. pseudospiralis, T. nativa, T. papua and T. britovi recombinant 53 kDa proteins with T. spiralis-infected sera by Western blot analysis. (Fig. 5 (a)), reactivity with T. pseudospiralis-infected serum (Fig. 5 (b)), reactivity with T. nativa-infected serum (Fig. 5 (c)), reaction with T. papua-infected serum (Fig. 5 (d)), reactivity with T. britovi-infected serum (Fig. 6 (e)), reactivity with Trichinella T8-infected serum (Fig. 6 (f)), and reactivity with Trichinella T9-infected serum (FIG. 6 (g)) is shown respectively. 5 and 6, M is a molecular weight marker, lane 1 is a recombinant T. spiralis 53 kDa protein, lane 2 is a recombinant T. pseudospiralis 53 kDa protein, lane 3 is a recombinant T. native 53 kDa protein, lane 4 is a recombinant T. papua 53 kDa protein, lane 5 is the recombinant T. britovi 53 kDa protein.

図４から明らかなように、T. spiralis、T. pseudospiralisともに感染後8日でも薄く反応し、感染後13日では完全に抗体は検出できた。このように感染の極めて初期からの抗体を検出することが可能であった。また、図５及び６から明らかなようにT. spiralis 、T. pseudospiralis 、T. nativa、T. papua、及びT. britoviの各組換え53kDaタンパク質はそれぞれ対応する旋毛虫の感染マウス血清にしか反応しなかった。
以上の通り、各組換えタンパク質が、対応する旋毛虫感染マウス血清に特異的に反応することが確認された。これによって、同定に成功したタンパク質（T. nativa及びT. papuaの53kDa分泌糖タンパク質）を含め、それぞれの種について53kDa糖タンパク質が種特異的抗原となることが明らかとなった。一方、極めて早期に反応性が認められたことから、これらのタンパク質（種特異的抗原）が旋毛虫感染の早期検査に有用であることが確認された。 As is clear from FIG. 4, both T. spiralis and T. pseudospiralis reacted lightly even 8 days after infection, and the antibody could be completely detected 13 days after infection. Thus, it was possible to detect antibodies from the very beginning of infection. In addition, as is apparent from FIGS. 5 and 6, the recombinant 53 kDa proteins of T. spiralis, T. pseudospiralis, T. nativa, T. papua, and T. britovi react only with the corresponding mouse sera of Trichinella. I didn't.
As described above, it was confirmed that each recombinant protein specifically reacts with the corresponding trichinella infected mouse serum. This revealed that the 53 kDa glycoprotein is a species-specific antigen for each species, including proteins that have been successfully identified (53 kDa secreted glycoproteins of T. nativa and T. papua). On the other hand, since the reactivity was recognized very early, it was confirmed that these proteins (species-specific antigens) are useful for early examination of Trichinella infection.

３．Trichinella T8、Trichinella T9、T. nelsoni、T. murrelli、及びTrichinella T6の種特異的抗原の同定
１．（2）と同様の手順でTrichinella T8、Trichinella T9、T. nelsoni、T. murrelli、及びTrichinella T6について、53kDa分泌糖タンパク質のホモログの同定を試みた。目的のタンパク質全長をコードする遺伝子をPCRで増幅する際に使用したプライマーの配列は以下の通りである。
5'-CGG GAT CCC GAT GTT CAG CAT CAC ATT AAA-3'（配列番号２１）
5'-CGG AAT TCC Gga cag att gct taa tga agc-3'（配列番号２２） 3. Identification of species-specific antigens of Trichinella T8, Trichinella T9, T. nelsoni, T. murrelli, and Trichinella T6 In the same procedure as in (2), identification of homologs of 53 kDa secreted glycoprotein was attempted for Trichinella T8, Trichinella T9, T. nelsoni, T. murrelli, and Trichinella T6. The sequence of the primers used when a gene encoding the full length protein of interest is amplified by PCR is as follows.
5'-CGG GAT CCC GAT GTT CAG CAT CAC ATT AAA-3 '(SEQ ID NO: 21)
5′-CGG AAT TCC Gga cag att gct taa tga agc-3 ′ (SEQ ID NO: 22)

結果、全ての種について、T. spiralisの53kDa糖タンパク質に対応し、成虫及び筋肉幼虫が共通して排出・分泌するタンパク質を同定することに成功した。
同定した各タンパク質のアミノ酸配列、及びそれをコードするcDNAの塩基配列を図７〜１１に示す。
図７：Trichinella T8由来タンパク質のアミノ酸配列（配列番号５）及びcDNA配列（配列番号６）
図８：Trichinella T9由来タンパク質のアミノ酸配列（配列番号７）及びcDNA配列（配列番号８）
図９：T. nelsoni由来タンパク質のアミノ酸配列（配列番号９）及びcDNA配列（配列番号１０）
図１０：T. murrelli由来タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１１）及びcDNA配列（配列番号１２）
図１１：Trichinella T6由来タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１３）及びcDNA配列（配列番号１４） As a result, we succeeded in identifying a protein that corresponds to the 53 kDa glycoprotein of T. spiralis and is excreted and secreted in common by adult and muscle larvae for all species.
The amino acid sequence of each identified protein and the base sequence of the cDNA encoding it are shown in FIGS.
Figure 7: Amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) and cDNA sequence (SEQ ID NO: 6) of Trichinella T8-derived protein
Figure 8: Trichinella T9 derived protein amino acid sequence (SEQ ID NO: 7) and cDNA sequence (SEQ ID NO: 8)
Fig. 9: Amino acid sequence (SEQ ID NO: 9) and cDNA sequence (SEQ ID NO: 10) of T. nelsoni-derived protein
Fig. 10: Amino acid sequence (SEQ ID NO: 11) and cDNA sequence (SEQ ID NO: 12) of T. murrelli derived protein
Figure 11: Trichinella T6 derived protein amino acid sequence (SEQ ID NO: 13) and cDNA sequence (SEQ ID NO: 14)

４．ウエスタンブロット用キットの構築
検査操作を簡便にするため、種特異的抗原（53kDa分泌糖タンパク質）の組換えタンパク質を用いてウエスタンブロット法に使用するキットを構築する。具体的には、日本国内用の検査にはT. nativaとTrichinella T9についての組換えタンパク質を転写した膜、検出用抗体、取扱説明書などを組み合わせたウエスタンブロット用キットを構築する。一方、欧州用の検査にはT. nativa、T. britovi、T. spiralis及びT. pseudospiralisについての組換えタンパクを転写した膜、検出用抗体、取扱説明書などを組み合わせたウエスタンブロット用キットを構築する。 4). Construction of a kit for Western blotting In order to simplify the test procedure, a kit for use in Western blotting is constructed using a recombinant protein of a species-specific antigen (53 kDa secreted glycoprotein). Specifically, for testing in Japan, a Western blot kit is constructed by combining a membrane transcribed with a recombinant protein for T. nativa and Trichinella T9, a detection antibody, and an instruction manual. On the other hand, for testing for Europe, a Western blot kit was constructed by combining membranes transcribed with recombinant proteins for T. nativa, T. britovi, T. spiralis and T. pseudospiralis, antibodies for detection, and instruction manuals. To do.

５．ELISA法による検出
種特異的抗原の組換えタンパク質（代表としてT. spiralis由来の種特異的抗原（53kDa分泌糖タンパク質）を用いた）、既報の方法（Matsuda et al., Jpn. J. Exp. Med. 54:131-138(1984)）に若干の修正を加えた方法でELISA用プレートを作製した。簡単にいうと、96穴マイクロタイタープレート（Maxisorp、ナルジェ・ヌンク・インターナショナル）にウェルあたり100μlの5μg/ml（0.05M重炭酸塩バッファー（pH9.6））の組換えタンパク質（種特異的抗原）を感作した（37℃で3時間インキュベートした後、4℃で一晩放置）。0.05% Tween 200を含有する0.15MのPBSで３回洗浄した後、2%のウシ血清アルブミンを含有する150μlのPBSをマイクロプレートの各ウェルに添加しブロッキングを行った（37℃で1時間）。ブロッキング液を除去した後、上記と同様の洗浄操作を行った。このようにして、T. spiralis由来の種特異的抗原が固定化されたマイクロプレート（抗原感作プレート）を得た。 5). Detection by ELISA method Recombinant protein of species-specific antigen (typically using T. spiralis-derived species-specific antigen (53 kDa secreted glycoprotein)), previously reported method (Matsuda et al., Jpn. J. Exp. Med. 54: 131-138 (1984)), an ELISA plate was prepared by a method with some modifications. Briefly, 100 μl per well of 5 μg / ml (0.05 M bicarbonate buffer (pH 9.6)) recombinant protein (species specific antigen) in a 96-well microtiter plate (Maxisorp, Nalje Nunk International) Was sensitized (incubated at 37 ° C for 3 hours and then left at 4 ° C overnight). After washing three times with 0.15M PBS containing 0.05% Tween 200, 150 μl PBS containing 2% bovine serum albumin was added to each well of the microplate for blocking (37 ° C. for 1 hour). . After removing the blocking solution, the same washing operation as described above was performed. Thus, a microplate (antigen-sensitized plate) on which a species-specific antigen derived from T. spiralis was immobilized was obtained.

抗原感作プレートを用いた旋毛虫の感染検査は次のように行うことができる。1%のウシ血清アルブミンを含有するPBSで200倍希釈したヒト血清サンプルを、ウェルあたり100μlとなるように抗原感作プレートにいれ、37℃で1時間インキュベートする。サンプルの除去及び洗浄の後、10,000倍希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgG（Fab特異的）抗体（シグマ）を各ウェルに添加し、37℃で45分間反応させる。発色のために基質2-2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)（シグマ）を各ウェルに添加し（0.3mg/ml、ウェルあたり100μl）、60分間放置する。各ウェルに1.25%のフッ化ナトリウムを50μl添加し、反応を停止させる。そして、波長414nmでの吸光度を測定し、測定結果を用いて血清サンプルの陽性（感染）又は陰性を判定する。カットオフ値は例えば、複数の健常者から得た陰性サンプルの平均値の３倍に設定する。   Trichinella infection test using an antigen-sensitized plate can be performed as follows. A human serum sample diluted 200-fold with PBS containing 1% bovine serum albumin is placed in an antigen-sensitized plate at 100 μl per well and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After sample removal and washing, a 10,000-fold diluted peroxidase-conjugated goat anti-human IgG (Fab specific) antibody (Sigma) is added to each well and allowed to react at 37 ° C. for 45 minutes. The substrate 2-2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (Sigma) is added to each well (0.3 mg / ml, 100 μl per well) for color development and left for 60 minutes. Add 50 μl of 1.25% sodium fluoride to each well to stop the reaction. Then, the absorbance at a wavelength of 414 nm is measured, and the measurement result is used to determine whether the serum sample is positive (infection) or negative. For example, the cut-off value is set to 3 times the average value of negative samples obtained from a plurality of healthy subjects.

本発明のポリペプチド（種特異的抗原）は、旋毛虫の成虫が排出・分泌するポリペプチドの一つである。従って、旋毛虫に感染した動物の体内では、感染後の早い段階で本発明のポリペプチドに対する抗体が産生されることになる。このことから、本発明のポリペプチドに対する抗体を検出対象とした検査法（即ち、本発明のポリペプチドを利用した検査法）では、感染後の早い段階で検査結果を得ることができる。
一方、本発明のポリペプチドを利用した検査法によれば、検体中に旋毛虫に由来する抗体が存在するか否か、及び抗体が存在する場合にはいずれの種に由来する抗体であるかに関する情報が得られる。従って、本発明のポリペプチドを利用した検査法を実施すれば、検体を採取した個体（被検者、被検動物）が旋毛虫に感染しているか否かの検査が行えるとともに、感染している場合にはいずれの種に感染しているかを判定することができる。感染した旋毛虫を種のレベルまで特定できれば、種の相違に起因する症状の違いを明確に把握し、感染個体に対するより適切な治療が可能となる。
以上のように、本発明のポリペプチドを利用した検査法によれば、旋毛虫感染症の治療に有用な情報を感染後早期に得ること（即ち早期診断）が可能となる。 The polypeptide (species-specific antigen) of the present invention is one of the polypeptides excreted and secreted by adults of Trichinella. Therefore, in the body of an animal infected with Trichinella, an antibody against the polypeptide of the present invention is produced at an early stage after infection. From this, in the test method using the antibody against the polypeptide of the present invention as the detection target (that is, the test method using the polypeptide of the present invention), the test result can be obtained at an early stage after infection.
On the other hand, according to the test method using the polypeptide of the present invention, whether or not an antibody derived from Trichinella is present in the sample, and if it is present, from which species is the antibody derived? Information about Therefore, if the test method using the polypeptide of the present invention is carried out, it is possible to test whether or not the individual (the subject, the test animal) from which the specimen has been collected is infected with Trichinella. If so, you can determine which species you are infected with. If the infected Trichinella can be identified to the level of the species, it will be possible to clearly grasp the difference in symptoms caused by the difference in species and to treat the infected individual more appropriately.
As described above, according to the test method using the polypeptide of the present invention, information useful for treatment of Trichinella infection can be obtained early after infection (that is, early diagnosis).

この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。 The present invention is not limited to the description of the embodiments and examples of the invention described above. Various modifications may be included in the present invention as long as those skilled in the art can easily conceive without departing from the description of the scope of claims.
The contents of papers, published patent gazettes, patent gazettes, and the like specified in this specification are incorporated by reference in their entirety.

T. nativaの種特異的抗原のアミノ酸配列（配列番号1）及びcDNA配列（配列番号２）である。Amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) and cDNA sequence (SEQ ID NO: 2) of T. nativa species-specific antigen. ウエスタンブロットによるT. nativa抗原の解析結果である。Ｍ：分子量マーカー、１：成虫からの粗抽出物、２：新生幼虫からの粗抽出物、３：筋肉幼虫（感染15日後）からの粗抽出物、４：筋肉幼虫（感染30日後）からの粗抽出物。It is an analysis result of T. nativa antigen by Western blot. M: molecular weight marker, 1: crude extract from adult, 2: crude extract from newborn larvae, 3: crude extract from muscle larvae (15 days after infection), 4: muscle larvae (30 days after infection) Crude extract. T. papuaの種特異的抗原のアミノ酸配列（配列番号３）及びcDNA配列（配列番号４）Amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) and cDNA sequence (SEQ ID NO: 4) of T. papua species-specific antigen ウエスタンブロット解析によるT. spiralisおよびT. pseudospiralis組換えタンパク質の経時的な感染血清との反応性を示す。(a)は組換えT. spiralis 53kDaタンパク質との反応結果。１：感染後0日のT. spiralis感染マウス血清との反応、２：感染後8日のT. spiralis感染マウス血清との反応、３：感染後13日のT. spiralis感染マウス血清との反応、４：感染後18日のT. spiralis感染マウス血清との反応、５：感染後23日のT. spiralis感染マウス血清との反応、６：感染後30日のT. spiralis感染マウス血清との反応、７：感染後50日のT. spiralis感染マウス血清との反応、８：感染後90日のT. spiralis感染マウス血清との反応、９：感染後120日のT. spiralis感染マウス血清との反応。(b)は組換えT. pseudospiralis 53kDaタンパク質との反応結果。１０：感染後0日のT. pseudospiralis感染マウス血清との反応、１１：感染後8日のT. pseudospiralis感染マウス血清との反応、１２：感染後13日のT. pseudospiralis感染マウス血清との反応、１３：感染後18日のT. pseudospiralis感染マウス血清との反応、１４：感染後23日のT. pseudospiralis感染マウス血清との反応、１５：感染後30日のT. pseudospiralis感染マウス血清との反応、１６：感染後50日のT. pseudospiralis感染マウス血清との反応、１７：感染後90日のT. pseudospiralis感染マウス血清との反応、１８：感染後120日のT. pseudospiralis感染マウス血清との反応。The reactivity of the T. spiralis and T. pseudospiralis recombinant proteins with the infected serum over time by Western blot analysis is shown. (a) shows the reaction results with recombinant T. spiralis 53 kDa protein. 1: Reaction with T. spiralis-infected mouse serum on day 0 after infection 2: Reaction with T. spiralis-infected mouse serum on day 8 after infection 3: Reaction with T. spiralis-infected mouse serum on day 13 after infection 4: Reaction with T. spiralis infected mouse serum 18 days after infection, 5: Reaction with T. spiralis infected mouse serum 23 days after infection, 6: T. spiralis infected mouse serum 30 days after infection Reaction: 7: Reaction with T. spiralis infected mouse serum 50 days after infection, 8: Reaction with T. spiralis infected mouse serum 90 days after infection, 9: T. spiralis infected mouse serum 120 days after infection Reaction of. (b) shows the reaction results with recombinant T. pseudospiralis 53kDa protein. 10: Reaction with T. pseudospiralis-infected mouse serum on day 0 after infection, 11: Reaction with T. pseudospiralis-infected mouse serum on day 8 after infection, 12: Reaction with T. pseudospiralis-infected mouse serum on day 13 after infection 13: Reaction with serum of T. pseudospiralis infected mouse 18 days after infection, 14: Reaction with serum of T. pseudospiralis infected mouse 23 days after infection, 15: Reaction with serum of T. pseudospiralis infected mouse serum 30 days after infection Reaction: 16: Reaction with T. pseudospiralis-infected mouse serum 50 days after infection, 17: Reaction with T. pseudospiralis-infected mouse serum 90 days after infection, 18: T. pseudospiralis-infected mouse serum 120 days after infection Reaction of. ウエスタンブロット解析によるT. spiralis、T. pseudospiralis、 T. nativa、T. papua及びT. britoviの各組換え53kDaタンパク質のT. spiralis感染血清との反応性（a）、T. pseudospiralis感染血清との反応性（b）、T. nativa感染血清との反応性（c）、及びT. papua感染血清との反応性(d)を示す。Ｍ：分子量マーカー、１：組換えT. spiralis 53kDaタンパク質、２：組換えT. pseudospiralis 53kDaタンパク質、３：組換えT. native 53kDaタンパク質、４：組換えT. papua 53kDaタンパク質、５：組換えT. britovi 53kDaタンパク質。Reactivity of each recombinant 53kDa protein of T. spiralis, T. pseudospiralis, T. nativa, T. papua and T. britovi with T. spiralis-infected serum by Western blot analysis (a), with T. pseudospiralis-infected serum Reactivity (b), reactivity with T. nativa-infected serum (c), and reactivity with T. papua-infected serum (d) are shown. M: molecular weight marker, 1: recombinant T. spiralis 53 kDa protein, 2: recombinant T. pseudospiralis 53 kDa protein, 3: recombinant T. native 53 kDa protein, 4: recombinant T. papua 53 kDa protein, 5: recombinant T. britovi 53kDa protein. ウエスタンブロット解析によるT. spiralis、T. pseudospiralis、T. nativa、T. papua及びT. britoviの各組換え53kDaタンパク質のT. britovi感染血清との反応性（e）、Trichinella T8感染血清との反応性（f）及びTrichinella T9感染血清との反応性(g)を示す。Ｍ：分子量マーカー、１：組換えT. spiralis 53kDaタンパク質、２：組換えT. pseudospiralis 53kDaタンパク質、３：組換えT. native 53kDaタンパク質、４：組換えT. papua 53kDaタンパク質、５：組換えT. britovi 53kDaタンパク質。Reactivity of each recombinant 53kDa protein of T. spiralis, T. pseudospiralis, T. nativa, T. papua and T. britovi with T. britovi-infected serum by Western blot analysis (e), reaction with Trichinella T8-infected serum Sex (f) and reactivity (g) with Trichinella T9-infected serum are shown. M: molecular weight marker, 1: recombinant T. spiralis 53 kDa protein, 2: recombinant T. pseudospiralis 53 kDa protein, 3: recombinant T. native 53 kDa protein, 4: recombinant T. papua 53 kDa protein, 5: recombinant T. britovi 53kDa protein. Trichinella T8の種特異的抗原のアミノ酸配列（配列番号５）及びcDNA配列（配列番号６）Trichinella T8 species-specific antigen amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) and cDNA sequence (SEQ ID NO: 6) Trichinella T9の種特異的抗原のアミノ酸配列（配列番号７）及びcDNA配列（配列番号８）Trichinella T9 species-specific antigen amino acid sequence (SEQ ID NO: 7) and cDNA sequence (SEQ ID NO: 8) T. nelsoniの種特異的抗原のアミノ酸配列（配列番号９）及びcDNA配列（配列番号１０）Amino acid sequence (SEQ ID NO: 9) and cDNA sequence (SEQ ID NO: 10) of T. nelsoni species-specific antigen T. murrelliの種特異的抗原のアミノ酸配列（配列番号１１）及びcDNA配列（配列番号１２）Amino acid sequence (SEQ ID NO: 11) and cDNA sequence (SEQ ID NO: 12) of T. murrelli species-specific antigen Trichinella T6の種特異的抗原のアミノ酸配列（配列番号１３）及びcDNA配列（配列番号１４）Trichinella T6 species-specific antigen amino acid sequence (SEQ ID NO: 13) and cDNA sequence (SEQ ID NO: 14)

Claims (6)

以下のステップ(1)及び(2)を含む、旋毛虫感染の検査法：
(1)(a)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記アミノ酸配列において全アミノ酸数の1%未満のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列からなり、且つ基準の前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体との反応性が、基準の前記ポリペプチドと該抗体との反応性と同じであるポリペプチド、
(b)配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記アミノ酸配列において全アミノ酸数の1%未満のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列からなり、且つ基準の前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体との反応性が、基準の前記ポリペプチドと該抗体との反応性と同じであるポリペプチド、
(c)配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記アミノ酸配列において全アミノ酸数の1%未満のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列からなり、且つ基準の前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体との反応性が、基準の前記ポリペプチドと該抗体との反応性と同じであるポリペプチド、
(d)配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記アミノ酸配列において全アミノ酸数の1%未満のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列からなり、且つ基準の前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体との反応性が、基準の前記ポリペプチドと該抗体との反応性と同じであるポリペプチド、
(e)配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記アミノ酸配列において全アミノ酸数の1%未満のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列からなり、且つ基準の前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体との反応性が、基準の前記ポリペプチドと該抗体との反応性と同じであるポリペプチド、
(g)配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記アミノ酸配列において全アミノ酸数の1%未満のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列からなり、且つ基準の前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体との反応性が、基準の前記ポリペプチドと該抗体との反応性と同じであるポリペプチド、
(h)配列番号１５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記アミノ酸配列において全アミノ酸数の1%未満のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列からなり、且つ基準の前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体との反応性が、基準の前記ポリペプチドと該抗体との反応性と同じであるポリペプチド、
(i)配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記アミノ酸配列において全アミノ酸数の1%未満のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列からなり、且つ基準の前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体との反応性が、基準の前記ポリペプチドと該抗体との反応性と同じであるポリペプチド、及び
(j)配列番号１９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記アミノ酸配列において全アミノ酸数の1%未満のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列からなり、且つ基準の前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体との反応性が、基準の前記ポリペプチドと該抗体との反応性と同じであるポリペプチド、
からなる群より選択される二以上のポリペプチドと、検体とを接触させるステップ；及び
(2)ステップ(1)の後、前記ポリペプチドに対して特異的に結合した抗体を検出するステップ。 Test method for Trichinella infection, including the following steps (1) and (2):
(1) (a) consisting of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 , or an amino acid sequence having a mutation of less than 1% of the total number of amino acids in the amino acid sequence, and specific to the reference polypeptide A polypeptide that has the same reactivity with a binding antibody as that of the reference polypeptide and the antibody,
(b) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 , or an amino acid sequence having a mutation of less than 1% of the total number of amino acids in the amino acid sequence, and specifically binding to the reference polypeptide A polypeptide having the same reactivity as an antibody to react with the reference polypeptide and the antibody,
(c) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or an amino acid sequence having a mutation of less than 1% of the total number of amino acids in the amino acid sequence and specifically binding to the reference polypeptide A polypeptide having the same reactivity as an antibody to react with the reference polypeptide and the antibody,
(d) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 , or an amino acid sequence having a mutation of less than 1% of the total number of amino acids in the amino acid sequence, and specifically binding to the reference polypeptide A polypeptide having the same reactivity as an antibody to react with the reference polypeptide and the antibody,
(e) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 , or an amino acid sequence having a mutation of less than 1% of the total number of amino acids in the amino acid sequence and specifically binding to the reference polypeptide A polypeptide having the same reactivity as an antibody to react with the reference polypeptide and the antibody,
(g) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 , or an amino acid sequence having a mutation of less than 1% of the total number of amino acids in the amino acid sequence and specifically binding to the reference polypeptide A polypeptide having the same reactivity as an antibody to react with the reference polypeptide and the antibody,
(h) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or an amino acid sequence having a mutation of less than 1% of the total number of amino acids in the amino acid sequence and specifically binding to the reference polypeptide A polypeptide having the same reactivity as an antibody to react with the reference polypeptide and the antibody,
(i) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 , or an amino acid sequence having a mutation of less than 1% of the total number of amino acids in the amino acid sequence, and specifically binding to the reference polypeptide A polypeptide that has the same reactivity as an antibody that reacts with the reference polypeptide and the antibody, and
(j) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or an amino acid sequence having a mutation of less than 1% of the total number of amino acids in the amino acid sequence and specifically binding to the reference polypeptide A polypeptide having the same reactivity as an antibody to react with the reference polypeptide and the antibody,
Contacting the specimen with two or more polypeptides selected from the group consisting of: and
(2) A step of detecting an antibody specifically bound to the polypeptide after step (1). ステップ(1)において(a)及び(d)のポリペプチドと検体とを接触させることを特徴とする、請求項１に記載の旋毛虫感染の検査法。   The method for testing Trichinella infection according to claim 1, wherein the polypeptide of (a) and (d) is contacted with the specimen in step (1). ステップ(1)において(a)、(h)、(i)及び(j)のポリペプチドと検体とを接触させることを特徴とする、請求項１に記載の旋毛虫感染の検査法。   2. The method for examining Trichinella infection according to claim 1, wherein in step (1), the polypeptide of (a), (h), (i) and (j) is brought into contact with a specimen. (a)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記アミノ酸配列において全アミノ酸数の1%未満のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列からなり、且つ基準の前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体との反応性が、基準の前記ポリペプチドと該抗体との反応性と同じであるポリペプチド、
(b)配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記アミノ酸配列において全アミノ酸数の1%未満のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列からなり、且つ基準の前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体との反応性が、基準の前記ポリペプチドと該抗体との反応性と同じであるポリペプチド、
(c)配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記アミノ酸配列において全アミノ酸数の1%未満のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列からなり、且つ基準の前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体との反応性が、基準の前記ポリペプチドと該抗体との反応性と同じであるポリペプチド、
(d)配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記アミノ酸配列において全アミノ酸数の1%未満のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列からなり、且つ基準の前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体との反応性が、基準の前記ポリペプチドと該抗体との反応性と同じであるポリペプチド、
(e)配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記アミノ酸配列において全アミノ酸数の1%未満のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列からなり、且つ基準の前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体との反応性が、基準の前記ポリペプチドと該抗体との反応性と同じであるポリペプチド、
(g)配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記アミノ酸配列において全アミノ酸数の1%未満のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列からなり、且つ基準の前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体との反応性が、基準の前記ポリペプチドと該抗体との反応性と同じであるポリペプチド、
(h)配列番号１５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記アミノ酸配列において全アミノ酸数の1%未満のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列からなり、且つ基準の前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体との反応性が、基準の前記ポリペプチドと該抗体との反応性と同じであるポリペプチド、
(i)配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記アミノ酸配列において全アミノ酸数の1%未満のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列からなり、且つ基準の前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体との反応性が、基準の前記ポリペプチドと該抗体との反応性と同じであるポリペプチド、及び
(j)配列番号１９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記アミノ酸配列において全アミノ酸数の1%未満のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列からなり、且つ基準の前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体との反応性が、基準の前記ポリペプチドと該抗体との反応性と同じであるポリペプチド、
からなる群より選択される二以上のポリペプチドを含む、旋毛虫感染検査用キット。 (a) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having a mutation of less than 1% of the total number of amino acids in the amino acid sequence and specifically binding to the reference polypeptide A polypeptide having the same reactivity as an antibody to react with the reference polypeptide and the antibody,
(b) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 , or an amino acid sequence having a mutation of less than 1% of the total number of amino acids in the amino acid sequence, and specifically binding to the reference polypeptide A polypeptide having the same reactivity as an antibody to react with the reference polypeptide and the antibody,
(c) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or an amino acid sequence having a mutation of less than 1% of the total number of amino acids in the amino acid sequence and specifically binding to the reference polypeptide A polypeptide having the same reactivity as an antibody to react with the reference polypeptide and the antibody,
(d) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 , or an amino acid sequence having a mutation of less than 1% of the total number of amino acids in the amino acid sequence, and specifically binding to the reference polypeptide A polypeptide having the same reactivity as an antibody to react with the reference polypeptide and the antibody,
(e) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 , or an amino acid sequence having a mutation of less than 1% of the total number of amino acids in the amino acid sequence and specifically binding to the reference polypeptide A polypeptide having the same reactivity as an antibody to react with the reference polypeptide and the antibody,
(g) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 , or an amino acid sequence having a mutation of less than 1% of the total number of amino acids in the amino acid sequence and specifically binding to the reference polypeptide A polypeptide having the same reactivity as an antibody to react with the reference polypeptide and the antibody,
(h) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or an amino acid sequence having a mutation of less than 1% of the total number of amino acids in the amino acid sequence and specifically binding to the reference polypeptide A polypeptide having the same reactivity as an antibody to react with the reference polypeptide and the antibody,
(i) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 , or an amino acid sequence having a mutation of less than 1% of the total number of amino acids in the amino acid sequence, and specifically binding to the reference polypeptide A polypeptide that has the same reactivity as an antibody that reacts with the reference polypeptide and the antibody, and
(j) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or an amino acid sequence having a mutation of less than 1% of the total number of amino acids in the amino acid sequence and specifically binding to the reference polypeptide A polypeptide having the same reactivity as an antibody to react with the reference polypeptide and the antibody,
A kit for testing Trichinella infection, comprising two or more polypeptides selected from the group consisting of: (a)及び(d)のポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項４に記載の旋毛虫感染検査用キット。   The kit for the examination of Trichinella infection according to claim 4, characterized in that it comprises the polypeptides (a) and (d). (a)、(h)、(i)及び(j)のポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項４に記載の旋毛虫感染検査用キット。   The kit for testing for Trichinella infection according to claim 4, comprising the polypeptides (a), (h), (i) and (j).
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