JP4787960B2 - Conditional knockout cell of centromere localization protein gene - Google Patents
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Description
本発明は、セントロメアに局在するタンパク質の遺伝子のコンディショナルノックアウト細胞に関する。 The present invention relates to a conditional knockout cell for a gene of a protein localized in the centromere.
生物が生命を維持するためには、全ゲノム情報を包括する構造体である染色体は安定に保持・増殖されなければならない。正常な細胞では、ほぼ決まった時間周期で染色体の複製と分配が正確に行われる。染色体の複製・分配といった基本的な生体反応に狂いが生じると染色体の異数化、がん化など細胞に対する悪影響が生じる。したがって、染色体分配機構の解明は、がん化の制御につながると考えられる。 In order for an organism to maintain its life, a chromosome, which is a structure containing all genome information, must be stably maintained and propagated. In normal cells, chromosome replication and distribution occur accurately in almost fixed time periods. If a fundamental biological reaction such as chromosome replication / distribution is distorted, adverse effects on cells such as chromosome aneuploidy and canceration will occur. Therefore, elucidation of the chromosome distribution mechanism is thought to lead to the control of canceration.
細胞分裂時に両極から伸びた紡錘体が染色体の特殊構造を捕まえて、娘細胞へ分配することで染色体分配はおこる。その際、紡錘体が捕らえる染色体の特殊構造はセントロメア（動原体）と呼ばれている。従って、セントロメアは染色体分配に重要な働きを担っている。また、がん細胞のように過剰な分裂を行う細胞では、セントロメアを構成するあるタンパク質が過剰に発現していることが報告されている（非特許文献１）。ＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉは染色体分配に関わるセントロメア構成タンパク質であり、ＣＥＮＰ−ＨとＣＥＮＰ−Ｉが結合していることは報告されている（非特許文献２）。ただし、ＣＥＮＰ−ＨやＣＥＮＰ−Ｉは、染色体分配において未同定のタンパク質と作用して巨大複合体として機能すると予想されている（非特許文献３）。他のセントロメアタンパク質と同様に未同定のセントロメアタンパク質は、がん細胞で過剰に発現していることが予想される。したがって、未同定のセントロメアタンパク質は、制がん薬剤のターゲットになる可能性を秘めている。また、当該未同定のセントロメアタンパク質の機能解明やがん研究のためには、当該タンパク質遺伝子をノックアウトした細胞が必要になる。
本発明の目的は、セントロメアに局在し、ＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合して染色体分配を制御しており、制がん薬剤のターゲットとして有用な新規タンパク質を見出し、そのタンパク質遺伝子のノックアウト細胞を提供することにある。 The object of the present invention is to find a novel protein that is localized in the centromere and binds to CENP-H and CENP-I to control chromosome partitioning and is useful as a target for anticancer drugs, and knocks out the protein gene. To provide cells.
本発明者は、がん細胞の増殖制御を目指してセントロメアを構成するタンパク質について研究を行い、特にＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに注目し、これに結合するタンパク質を探索してきた。その結果、今般、ＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合し、セントロメアへ局在し染色体分配を制御する機能を有する５種のタンパク質を見出した。そして、さらに研究してきたところ、そのうちの２種のタンパク質ＣＥＮＰ−Ｋ及びＣＥＮＰ−Ｍは細胞増殖に必須であり、遺伝子を破壊するとノックアウト細胞は樹立できないことが判明した。そこで、さらに研究を続け、テトラサイクリンに応答するプロモーターの下流にＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍ遺伝子を挿入して細胞に導入し、当該細胞の染色体上のＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍ遺伝子をノックアウトすれば、テトラサイクリン応答性のコンディショナルＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍノックアウト細胞が得られることを見出し、本発明を完成した。 The inventor has conducted research on proteins constituting centromeres with the aim of controlling the growth of cancer cells, and has focused on CENP-H and CENP-I, and has searched for proteins that bind to them. As a result, we have now found five proteins that bind to CENP-H and CENP-I, localize to the centromere and have a function of controlling chromosome distribution. As a result of further research, it was found that two of these proteins, CENP-K and CENP-M, are essential for cell growth, and knockout cells cannot be established when the gene is disrupted. Therefore, if further research is continued, a CENP-K or CENP-M gene is inserted downstream of a promoter that responds to tetracycline and introduced into a cell, and then the CENP-K or CENP-M gene on the chromosome of the cell is knocked out. The present inventors have found that tetracycline-responsive conditional CENP-K or CENP-M knockout cells can be obtained, thereby completing the present invention.
すなわち、本発明は、配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるか、又は配列番号１又は２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セントロメアに局在し、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有するタンパク質ＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍの遺伝子の染色体上における機能が欠損しており、テトラサイクリンに応答するプロモーターの下流に挿入された当該ＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍの遺伝子を有する、テトラサイクリン応答性ＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍノックアウト細胞を提供するものである。 That is, the present invention consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, The function of the gene CENP-K or CENP-M, which is localized and binds to CENP-H and CENP-I, is deficient in the function of the gene, and is inserted downstream of the promoter that responds to tetracycline. A tetracycline-responsive CENP-K or CENP-M knockout cell having a CENP-K or CENP-M gene is provided.
ＣＥＮＰ−Ｋ及びＣＥＮＰ−Ｍは、セントロメアを構成するタンパク質であるＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合し、かつセントロメアへ局在する性質を有することから、染色体の分配に深く関与しているタンパク質である。そして、本発明のコンディショナルノックアウト細胞は、細胞のがん化のメカニズム解明や染色体分配機能解明に有用なモデル細胞である。 CENP-K and CENP-M are proteins that are deeply involved in chromosome distribution because they bind to CENP-H and CENP-I, which are centromere-constituting proteins, and localize to centromeres. is there. The conditional knockout cell of the present invention is a model cell useful for elucidating the mechanism of canceration of cells and elucidating the function of chromosome distribution.
ＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍは、配列番号１又は２のアミノ酸からなるか、又は配列番号１又は２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列からなり、セントロメアに局在し、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有するタンパク質である。ここで配列番号１がＣＥＮＰ−Ｋのアミノ酸配列、配列番号２がＣＥＮＰ−Ｍのアミノ酸配列である。ここで、上記１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列と配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％以上である。 CENP-K or CENP-M comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted, or added. And has a binding property to CENP-H and CENP-I. Here, SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of CENP-K, and SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of CENP-M. Here, the homology between the amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 is preferably 90% or more, more preferably 95%, still more preferably Is 98% or more.
また、ＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍをコードする遺伝子としては、前記タンパク質をコードするものであれば制限されないが、例えば配列番号６又は７の塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号６又は７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃、又は０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃の条件である。 Further, the gene encoding CENP-K or CENP-M is not limited as long as it encodes the protein. For example, DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6 or 7, or the base of SEQ ID NO: 6 or 7 Examples thereof include DNA that hybridizes with DNA comprising a base sequence complementary to the sequence under stringent conditions and encodes a protein having binding ability to CENP-H and CENP-I. Here, the stringent conditions are, for example, conditions of 50 ° C. in 0.2 × SSC containing 0.1% SDS, or 60 ° C. in 1 × SSC containing 0.1% SDS.
配列番号１又は２のアミノ酸配列及び配列番号６又は７の塩基配列は、ニワトリ由来のタンパク質及びそれをコードする遺伝子である。しかし、前記の如く１又は数個のアミノ酸配列が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有する限り、ヒトを含む哺乳類由来のタンパク質も本発明に含まれることは言うまでもない。 The amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 and the base sequence of SEQ ID NO: 6 or 7 are a chicken-derived protein and a gene encoding it. However, as long as it consists of an amino acid sequence in which one or several amino acid sequences are deleted, substituted or added as described above and has binding properties to CENP-H and CENP-I, proteins derived from mammals including humans are also present. It goes without saying that it is included in the invention.
セントロメアに局在するタンパク質の同定は、生化学的手法や遺伝学的手法を用いることで数多く試みられている。しかしながら、存在量の少なさや抽出技術の困難さから、新しくセントロメアタンパク質を同定したという成功例は数少ない。また、既存のセントロメアタンパク質にタグをつけたタンパク質を細胞内で大量発現させて、結合タンパク質を同定する試みが最近さかんに行われている。しかしながら、大量発現することで、そのタンパク質がセントロメア以外の場所に局在し、セントロメアに局在するセントロメアタンパク質同定がうまくいかないなど技術的な問題点が数多くあった。 Many attempts have been made to identify proteins located in centromeres using biochemical and genetic techniques. However, few centromere proteins have been successfully identified due to their low abundance and difficulty in extraction techniques. Recently, many attempts have been made to identify binding proteins by expressing a large amount of proteins tagged with existing centromere proteins in cells. However, there are many technical problems such as that the protein is localized in a place other than the centromere due to mass expression, and the identification of the centromere protein localized in the centromere is not successful.
ＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍは、例えばニワトリＤＴ４０細胞を用いて、以下の如くして分離できる。すなわち、ニワトリＤＴ４０細胞内では、相同組み換えが高頻度でおこるために遺伝子改変を効率的に行うことができる。セントロメアタンパク質ＣＥＮＰ−Ｈ又はＣＥＮＰ−Ｉの発現を１００％タグ付きの融合タンパク質に置き換えた細胞株を樹立した。この細胞株では、タグ付きのＣＥＮＰ−ＨやＣＥＮＰ−Ｉがセントロメア以外に局在してしまうという前記問題点が克服できていた。そこでこれらの細胞株を用いてクロマチン画分を調製し、抗タグ抗体を用いた免疫沈降法によりＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉと結合するタンパク質を同定した。得られたペプチド配列をもとにｃＤＮＡクローニングすることにより、配列番号１又は２のアミノ酸配列からなる２種類のタンパク質ＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍ得られる。 CENP-K or CENP-M can be isolated as follows using, for example, chicken DT40 cells. That is, in chicken DT40 cells, homologous recombination occurs at a high frequency, so that genetic modification can be performed efficiently. Cell lines were established in which the expression of the centromere protein CENP-H or CENP-I was replaced with a fusion protein with a 100% tag. In this cell line, the above-mentioned problem that CENP-H and CENP-I with a tag are localized other than the centromere could be overcome. Thus, chromatin fractions were prepared using these cell lines, and proteins binding to CENP-H and CENP-I were identified by immunoprecipitation using an anti-tag antibody. Two types of proteins CENP-K or CENP-M consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 are obtained by cDNA cloning based on the obtained peptide sequence.
得られたＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍは、これをＧＦＰ融合タンパク質等の標識タンパク質として細胞内で発現させれば、細胞周期を通じてセントロメアへ局在することが確認できる。 If the obtained CENP-K or CENP-M is expressed in a cell as a labeled protein such as a GFP fusion protein, it can be confirmed that it is localized to the centromere throughout the cell cycle.
かくして得られたＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍ及びこれらの遺伝子は、アミノ酸配列又は塩基配列が判明したので、前記手段に限定されず、ペプチド合成等により製造することもでき、通常の遺伝子組み換え手段により製造できることは言うまでもない。 CENP-K or CENP-M thus obtained and these genes were found to have amino acid sequences or base sequences, and thus are not limited to the above means, and can be produced by peptide synthesis or the like, and can be produced by ordinary genetic recombination means. Needless to say, it can be manufactured.
ＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍは、ＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合し、かつセントロメアへ局在する。従って、染色体の分配に必須のタンパク質である。 CENP-K or CENP-M binds to CENP-H and CENP-I and localizes to the centromere. Therefore, it is an essential protein for chromosome distribution.
本発明において、ＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍをコードする遺伝子の機能を欠損させたとは、該遺伝子の遺伝子産物であるＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍが正常に産生されないようにしたことをいい、ＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍ自体が産生しない場合、及び一部を欠損するなどして機能を発現し得ないタンパク質を産生する場合が含まれる。 In the present invention, the loss of the function of the gene encoding CENP-K or CENP-M means that CENP-K or CENP-M, which is the gene product of the gene, is not normally produced, and CENP -The case where K or CENP-M itself does not produce, and the case where it produces a protein that cannot express a function, such as by deleting a part thereof, are included.
ＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍを直接ノックアウトさせたところ、ノックアウト細胞は樹立できなかった。これは、ＣＥＮＰ−Ｋ及びＣＥＮＰ−Ｍがいずれも、細胞増殖に必須のタンパクであることを示している。そこで、細胞に、テトラサイクリンに応答するプロモーターの下流にＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍ遺伝子を挿入したプラスミドを導入した後、染色体上のＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍをノックアウトしたところ、テトラサイクリン非存在下ではＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍが発現するため、細胞増殖し、一方、テトラサイクリン存在下ではＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍが発現しないため細胞増殖しなくなる特性を有するコンディショナルノックアウト細胞が樹立できた。 When CENP-K or CENP-M was directly knocked out, no knockout cells could be established. This indicates that CENP-K and CENP-M are both essential proteins for cell growth. Therefore, after introducing a plasmid into which CENP-K or CENP-M gene was inserted downstream of a promoter that responds to tetracycline, and then knocking out CENP-K or CENP-M on the chromosome, in the absence of tetracycline, Since CENP-K or CENP-M was expressed, the cells proliferated, while in the presence of tetracycline, conditional knockout cells having the property that cell growth did not occur because CENP-K or CENP-M was not expressed could be established.
テトラサイクリンに応答するプロモーターとしては、例えばプラスミドベクターpUHD10(Gossen and Bujard, Proc. Natl. Sci. USA, 89, 5547-5551)が用いられる。テトラサイクリンに応答するプロモーターを有するベクターとしては、プラスミドでもファージでもよいが、プラスミドが好ましい。テトラサイクリンに応答するプロモーターを有するプラスミドは、pTRE2(クローンテック社)として市販されているものを使用することができる。 As a promoter responsive to tetracycline, for example, plasmid vector pUHD10 (Gossen and Bujard, Proc. Natl. Sci. USA, 89, 5547-5551) is used. The vector having a promoter responsive to tetracycline may be a plasmid or a phage, but a plasmid is preferred. As a plasmid having a promoter that responds to tetracycline, a plasmid commercially available as pTRE2 (Clontech) can be used.
テトラサイクリンに応答するプロモーターの下流にＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍ遺伝子を挿入するには、例えばpTRE2のマルチクローニングサイトを制限酵素で切断し、ＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍの完全長cDNAとライゲートして、大腸菌に形質転換することにより行うことができる。 To insert the CENP-K or CENP-M gene downstream of a promoter that responds to tetracycline, for example, the multicloning site of pTRE2 is cleaved with a restriction enzyme and ligated with the full-length cDNA of CENP-K or CENP-M. It can be performed by transforming into E. coli.
テトラサイクリンに応答するプロモーターの下流にＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍ遺伝子を挿入されたプラスミド等を、細胞に導入するには、例えばプラスミドを制限酵素で切断して、線状化したのち、エレクトロポーレーション(550V, 25μF)法等により行われる。 In order to introduce a plasmid or the like into which CENP-K or CENP-M gene has been inserted downstream of a promoter that responds to tetracycline into cells, for example, the plasmid is cut with a restriction enzyme and linearized, and then electroporation is performed. (550V, 25μF) method or the like.
次に、染色体上のＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍ遺伝子をノックアウトする。このノックアウトは、例えばＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍの遺伝子領域の一部又は全部を相同組み換え方法によって、染色体上の当該遺伝子を破壊することにより行なわれる。相同組み換えは、他の遺伝子、例えば薬剤耐性遺伝子との間に相同組み換えを行うことにより、ＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍの遺伝子の領域を細胞から欠失させることにより行うのが好ましい。 Next, the CENP-K or CENP-M gene on the chromosome is knocked out. This knockout is performed, for example, by destroying a part of or the entire gene region of CENP-K or CENP-M by the homologous recombination method and the gene on the chromosome. The homologous recombination is preferably performed by deleting the region of the CENP-K or CENP-M gene from the cell by performing homologous recombination with another gene, for example, a drug resistance gene.
テトラサイクリンに応答するプロモーターの下流にＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍ遺伝子を導入された細胞から、本発明のコンディショナルノックアウト細胞を樹立するには、具体的には次の如くして行われる。ＣＥＮＰ−Ｍを例にして説明する。
宿主としては例えば、ニワトリのＢ細胞由来のＤＴ４０細胞を用いることができる。ＤＴ４０細胞は２倍体であるため、ＣＥＮＰ−Ｍが２ローカス存在する。そこで、２つのノックアウトコンストラクトを作成して順次遺伝子破壊を行う。はじめに、薬剤耐性遺伝子、例えばヒスティディノール耐性遺伝子（ｈｉｓＤ遺伝子）を含むノックアウトコンストラクトを導入する。このノックアウトコンストラクトがＣＥＮＰ−Ｍの遺伝子領域と相同組み換えを起こすと、ＣＥＮＰ−Ｍのエキソン３からエキソン７がｈｉｓＤ遺伝子と置き換わり、ＣＥＮＰ−Ｍの一つの遺伝子領域が破壊される。１遺伝子座が破壊された細胞へもう一つの薬剤耐性遺伝子、例えばピユーロマイシン耐性遺伝子を含む２つ目のノックアウトコンストラクトを導入して２遺伝子座も完全に破壊する。ノックアウト株の全ゲノムＤＮＡを抽出して制限酵素で消化してゲル電気泳動後、ＤＮＡをフィルターに転写する。フィルターをラベルしたのちハイブリダイズして、遺伝子置換を起こしている細胞を選択する。
To establish a conditional knockout cell of the present invention from a cell into which a CENP-K or CENP-M gene has been introduced downstream of a promoter that responds to tetracycline, the specific procedure is as follows. A description will be given by taking CENP-M as an example.
As a host, for example, DT40 cells derived from chicken B cells can be used. Since DT40 cells are diploid, there are two loci of CENP-M. Therefore, two knockout constructs are created and gene disruption is performed sequentially. First, a knockout construct containing a drug resistance gene such as a histidinol resistance gene (hisD gene) is introduced. When this knockout construct undergoes homologous recombination with the gene region of CENP-M, exon 3 to exon 7 of CENP-M are replaced with the hisD gene, and one gene region of CENP-M is destroyed. A second knockout construct containing another drug resistance gene, for example, a pieuromycin resistance gene, is introduced into the cell at which one locus has been disrupted to completely destroy the two loci. Total genomic DNA of the knockout strain is extracted, digested with restriction enzymes, gel electrophoresis, and then transferred to a filter. Cells that have undergone gene replacement are selected by hybridization after labeling the filter.
また、ＣＥＮＰ−Ｋは、性染色体にコードされているため１ローカスのみ存在している。従って、１ローカスの破壊ですべてのＣＥＮＰ−Ｋ遺伝子が破壊されるため、前記ＣＥＮＰ−Ｍ遺伝子のノックアウトの一段階だけの操作を行えばよい。 CENP-K is encoded by sex chromosomes, so only one locus exists. Accordingly, since all CENP-K genes are destroyed by destruction of one locus, only one step of knockout of the CENP-M gene may be performed.
かくして得られるコンディショナルノックアウト細胞は、テトラサイクリン非存在下ではＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍ遺伝子を発現するので細胞増殖する。一方、テトラサイクリン存在下では、ＣＥＮＰ−Ｋ又はＣＥＮＰ−Ｍ遺伝子を発現しない（ノックアウトされる）ので、増殖できない。従って、本発明のノックアウト細胞は、がん治療薬のスクリーニングモデル細胞として、また染色体分配の機構解明に有用である。 The conditional knockout cells thus obtained grow in the absence of tetracycline because they express the CENP-K or CENP-M gene. On the other hand, in the presence of tetracycline, CENP-K or CENP-M gene is not expressed (knocked out), and thus cannot grow. Therefore, the knockout cells of the present invention are useful as screening model cells for cancer therapeutic agents and for elucidating the mechanism of chromosome partitioning.
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is given and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these Examples at all.
（１）細胞内のＣＥＮＰ−Ｈ又はＣＥＮＰ−Ｉタンパク質の全てをタグ付き融合タンパク質に置換された細胞株の確立
ＣＥＮＰ−Ｈ遺伝子あるいはＣＥＮＰ−Ｉ遺伝子のゲノム領域と相同性のある約１０Kbのゲノム配列をプラスミドベクターｐＢＳへクローン化する。そのプラスミドへクローン化されたゲノム領域へ薬剤耐性遺伝子(ヒスチジノール耐性遺伝子あるいはピューロマイシン耐性遺伝子)を挿入したプラスミドを構築する (ノックアウトコンストラクト)。エレクトロポーレーション法(５５０Ｖ、２５マイクロＦ)を用いて、制限酵素ＮｏｔＩで切断されたノックアウトコンストラクトをＤＴ４０細胞へ導入して、ノックコンストラクトとゲノム領域が置換したニワトリＤＴ４０細胞株（ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉノックアウト株）を樹立する。相同組み換えの有無は、サザンハイブリダイゼーションで確認できる。平行して、ＣＭＶプローモーターの下流でＦＬＡＧタグ融合ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質が発現するプラスミドベクターを構築する(ＦＬＡＧタグ融合ベクター)。ＦＬＡＧタグ融合ベクターをエレクトロポーレーション法を用いて、ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉノックアウト株へ導入した。これらの細胞株では、野生型のＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質がノックアウトされて、ＦＬＡＧタグ融合ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質が発現しているため、細胞内の全てのＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質がＦＬＡＧタグ融合ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質に置き換わっている。
(1) Establishment of a cell line in which all intracellular CENP-H or CENP-I proteins are replaced with tagged fusion proteins Genome of about 10 Kb homologous to the genomic region of CENP-H gene or CENP-I gene The sequence is cloned into the plasmid vector pBS. A plasmid is constructed by inserting a drug resistance gene (histidinol resistance gene or puromycin resistance gene) into the genomic region cloned into the plasmid (knockout construct). Using the electroporation method (550 V, 25 micro F), the knockout construct cleaved with the restriction enzyme NotI was introduced into DT40 cells, and the chicken DT40 cell line (CENP-H or CENP) in which the knock construct and the genomic region were replaced. -I knockout strain). The presence or absence of homologous recombination can be confirmed by Southern hybridization. In parallel, a plasmid vector in which the FLAG tag fusion CENP-H or CENP-I protein is expressed downstream of the CMV promoter is constructed (FLAG tag fusion vector). The FLAG tag fusion vector was introduced into CENP-H or CENP-I knockout strain using electroporation. In these cell lines, the wild-type CENP-H or CENP-I protein is knocked out and the FLAG tag fusion CENP-H or CENP-I protein is expressed. Therefore, all CENP-H or CENP in the cell are expressed. -I protein is replaced by FLAG tag fusion CENP-H or CENP-I protein.
（２）ＣＥＮＰ−Ｋ及びＣＥＮＰ−Ｍの分離
（１）で得た細胞を大量培養して間期の細胞を集めた。Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いて細胞を破砕し、遠心分離によって核を調製する。核を緩衝液Ａ（２０mM ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ pH８．０／１５０mM ＫＣｌ／１mM ＤＴＴ）に懸濁した後、超音波破砕し、遠心分離によってＤＮＡを含む画分を調製した。ＤＮＡを含む画分に最終濃度３mMのCaCl2を添加し、さらにマイクロコッカル・ヌクレアーゼを加えて４℃１時間反応させ、ＤＮＡを切断することによって、ＤＮＡに結合しているタンパク質を可溶化した。ＫＣｌ及びＮＰ−４０をそれぞれ最終濃度３００mM及び０．１％になるよう添加し、続いて抗ＦＬＡＧ抗体を固定化したレジンを添加して４℃３時間撹拌した。抗ＦＬＡＧ抗体を固定化したレジンを遠心分離によって回収し、緩衝液Ｂ（２０mM ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ pH８．０／３００mM ＫＣｌ／１mM ＤＴＴ／０．１％ ＮＰ−４０）を用いて洗浄した。抗ＦＬＡＧ抗体を固定化したレジンに０．１Ｍ Glycine pH２．５溶液を添加して１分間静置した後、遠心分離によって溶液を回収した。溶液に等量の２０％トリクロロ酢酸及び５倍量のアセトンを添加し、−２０℃で２時間静置し、遠心分離によってタンパク質を回収した。
(2) Separation of CENP-K and CENP-M The cells obtained in (1) were cultured in large quantities to collect interphase cells. Cells are disrupted using a Dounce homogenizer and nuclei are prepared by centrifugation. Nuclei were suspended in buffer A (20 mM HEPES-KOH pH 8.0 / 150 mM KCl / 1 mM DTT), then sonicated and a fraction containing DNA was prepared by centrifugation. The final concentration of 3 mM of CaCl 2 was added to the fraction containing DNA, and then the reaction was carried out at 4 ° C. for 1 hour by adding a micrococcal nuclease to cleave the DNA, solubilizing the protein bound to the DNA. . KCl and NP-40 were added to final concentrations of 300 mM and 0.1%, respectively, followed by the addition of a resin immobilizing an anti-FLAG antibody and stirring at 4 ° C. for 3 hours. The resin on which the anti-FLAG antibody was immobilized was collected by centrifugation and washed with buffer B (20 mM HEPES-KOH pH 8.0 / 300 mM KCl / 1 mM DTT / 0.1% NP-40). A 0.1 M Glycine pH 2.5 solution was added to the resin with the anti-FLAG antibody immobilized thereon, and the mixture was allowed to stand for 1 minute, and then the solution was collected by centrifugation. An equal amount of 20% trichloroacetic acid and 5 times amount of acetone were added to the solution, and the mixture was allowed to stand at −20 ° C. for 2 hours, and the protein was recovered by centrifugation.
（３）タンパク質の同定
回収されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、銀染色で検出し、ゲルを切り出して質量分析を行うことで各タンパク質の部分アミノ酸配列を決定した。各タンパク質の部分アミノ酸配列は、以下の通りである。
(3) Identification of proteins The recovered proteins were separated by SDS-PAGE, then detected by silver staining, the gel was cut out and subjected to mass spectrometry to determine the partial amino acid sequence of each protein. The partial amino acid sequence of each protein is as follows.
（ＣＥＮＰ−４０）Asp Gly Gly Gly Arg Met Pro Ala Ala Pro Leu Ala Gln Gly Lys Val Glu Arg (CENP-40) Asp Gly Gly Gly Arg Met Pro Ala Ala Pro Leu Ala Gln Gly Lys Val Glu Arg
（ＣＥＮＰ−３５）Lys Gln Trp Thr Leu Tyr Ser Val Ser Pro Leu Tyr Lys Phe Ser Ser Ala Asp Leu Lys Asp Tyr Ala Arg Met Leu Gly Val Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg (CENP-35) Lys Gln Trp Thr Leu Tyr Ser Val Ser Pro Leu Tyr Lys Phe Ser Ser Ala Asp Leu Lys Asp Tyr Ala Arg Met Leu Gly Val Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg
（ＣＥＮＰ−３３）Lys Ala Glu Leu Glu Ser Leu Gln Arg Asp Leu Ser Phe Leu Val Lys Phe Thr Gly Ile Gln Ile Thr Ser His Ser Lys Lys Thr Leu Glu Lys Thr Gly Asn Arg (CENP-33) Lys Ala Glu Leu Glu Ser Leu Gln Arg Asp Leu Ser Phe Leu Val Lys Phe Thr Gly Ile Gln Ile Thr Ser His Ser Lys Lys Thr Leu Glu Lys Thr Gly Asn Arg
（ＣＥＮＰ−Ｋ）Arg Asn Pro Glu Leu Ile Ser Thr Asn Pro Glu Val Leu Leu Leu Leu Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys (CENP-K) Arg Asn Pro Glu Leu Ile Ser Thr Asn Pro Glu Val Leu Leu Leu Leu Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys
（ＣＥＮＰ−Ｍ）Asn Val Gln Ala Ser Leu Ala Tyr Val Asp Val Arg Phe Phe Leu Gly Lys Val Cys Phe Leu Val Thr Gly Val Gly Arg Ala Asn Asn Cys Ser Val Glu Met (CENP-M) Asn Val Gln Ala Ser Leu Ala Tyr Val Asp Val Arg Phe Phe Leu Gly Lys Val Cys Phe Leu Val Thr Gly Val Gly Arg Ala Asn Asn Cys Ser Val Glu Met
ＣＥＮＰ−Ｉ−ＧＦＰ、ＣＥＮＰ−Ｈ−ＧＦＰ、あるいはＣＥＮＰ−Ｈ−３×ＦＬＡＧ融合タンパクを発現する細胞を大量培養し、クロマチン画分を調製した。抗ＧＦＰ抗体あるいは抗ＦＬＡＧ抗体を用いてタンパク複合体を免疫沈降し、銀染色によってタンパクを検出した。得られた結果を図１に示す。コントロール実験として、野生型のＤＴ４０細胞(wt)を大量培養し、クロマチン画分を調製して抗ＧＦＰ抗体あるいは抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降実験を行った。ここで、検出されるタンパク質は、抗体の非特異的吸着により沈降されるタンパク質である。ＣＥＮＰ−Ｉ−ＧＦＰ、ＣＥＮＰ−Ｈ−ＧＦＰ、あるいはＣＥＮＰ−Ｈ−３×ＦＬＡＧ融合タンパクを発現する細胞で、特異的に沈降され、コントロール実験で沈降される5本のバンドに着目して、それらをＣＥＮＰ−Ｉ、ＣＥＮＰ−Ｈ、ＣＥＮＰ−４０、ＣＥＮＰ−３５、ＣＥＮＰ−３３、ＣＥＮＰ−Ｋ、ＣＥＮＰ−Ｍと命名した。
ＣＥＮＰ−４０、ＣＥＮＰ−３５、ＣＥＮＰ−３３、ＣＥＮＰ−Ｋ、ＣＥＮＰ−Ｍの各タンパクは、ＣＥＮＰ−ＨやＣＥＮＰ−Ｉと特異的に結合することから、これらが構成的にセントロメアに局在するタンパク複合体であると考えられた。ＣＥＮＰ−ＨをＣＥＮＰ−Ｈ−ＦＬＡＧに置き換えた細胞から調製したサンプルとＣＥＮＰ−ＩをＣＥＮＰ−Ｉ−ＦＬＡＧに置き換えた細胞から調製したサンプルで共通に見られる５本のバンドを切り出して部分的アミノ酸配列を決定した。
Cells expressing CENP-I-GFP, CENP-H-GFP, or CENP-H-3 × FLAG fusion protein were cultured in large quantities to prepare a chromatin fraction. The protein complex was immunoprecipitated using anti-GFP antibody or anti-FLAG antibody, and the protein was detected by silver staining. The obtained results are shown in FIG. As a control experiment, wild-type DT40 cells (wt) were cultured in large quantities, a chromatin fraction was prepared, and an immunoprecipitation experiment using an anti-GFP antibody or an anti-FLAG antibody was performed. Here, the protein to be detected is a protein that is precipitated by non-specific adsorption of the antibody. Cells that express CENP-I-GFP, CENP-H-GFP, or CENP-H-3xFLAG fusion protein, focusing on the five bands that are specifically precipitated and precipitated in control experiments. Were named CENP-I, CENP-H, CENP-40, CENP-35, CENP-33, CENP-K and CENP-M.
Since CENP-40, CENP-35, CENP-33, CENP-K, and CENP-M specifically bind to CENP-H and CENP-I, they are constitutively localized in the centromere. It was thought to be a protein complex. Partial amino acids cut out 5 bands commonly found in samples prepared from cells in which CENP-H was replaced with CENP-H-FLAG and samples prepared from cells in which CENP-I was replaced with CENP-I-FLAG The sequence was determined.
（４）得られた部分アミノ酸配列をもとにプローブを調製し、ニワトリ胚由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーングした。各種タンパク質に関して複数種類のｃＤＮＡクローンを得て、得られたすべてのｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定した。その結果すべての 種類のタンパク質に関して開始コドンと予想されるＡＴＧが見いだされ、完全長のｃＤＮＡの塩基配列が決定できた。（ＣＥＮＰ−Ｋが配列番号１及び６、ＣＥＮＰ−Ｍが配列番号２及び７、ＣＥＮＰ−４０が配列番号３及び８、ＣＥＮＰ−３５が配列番号４及び９、ＣＥＮＰ−３３が配列番号５及び１０にそれぞれ対応する）。それらのｃＤＮＡを参考にプライマーを設計して、ＰＣＲ反応を行いストップコドンをとり除いたｃＤＮＡを得て、その断片をｐＥＧＦＰＮ１(クローンテック社)のＢａｍＨＩサイトへクローン化した。それぞれのプラスミドは、ストップコドンが取り除かれてＧＦＰのコード領域と融合している(ＧＦＰ融合発現プラスミド)。ＧＦＰ融合発現プラスミドをＤＴ４０野生型細胞あるいはＣＥＮＰ−Ｈ−ＲＦＰ発現細胞(セントロメア領域が赤で標識されている細胞)へ導入して、ＧＦＰ融合タンパク質としてそれぞれのタンパク質を安定に発現させた。それぞれのＧＦＰ融合タンパク質の安定発現細胞を集めて、ＰＢＳで洗浄後、サイトスピン法によってスライドグラス上に貼付けた。スライドグラスを３％パラホルムアルデヒドに１５分間浸透させ、細胞を固定した。細胞をＰＢＳでリンスした後０．３マイクロg/mLのＤＡＰＩで細胞核及び染色体を染色した。作成したスライドグラスを蛍光顕微鏡へ供してＧＦＰ融合タンパク質の細胞内局在を緑チャンネルで観察した。細胞形態によって、細胞分裂期の細胞と間期の細胞の区別が可能となる。５種類すべてのタンパク質がＣＥＮＰ−ＨやＣＥＮＰ−Ｉと同様に細胞周期を通じて点状のドットとして観察された。ＣＥＮＰ−Ｈと局在をともにすることから、すべてのタンパク質が細胞周期を通じてセントロメアへ局在していることが確認できた（図２〜図６）。 (4) A probe was prepared based on the obtained partial amino acid sequence, and a cDNA library derived from a chicken embryo was screened. A plurality of types of cDNA clones were obtained for various proteins, and the base sequences of all the obtained cDNA clones were determined. As a result, ATG expected to be the start codon was found for all types of proteins, and the base sequence of full-length cDNA could be determined. (CENP-K is SEQ ID NO: 1 and 6, CENP-M is SEQ ID NO: 2 and 7, CENP-40 is SEQ ID NO: 3 and 8, CENP-35 is SEQ ID NO: 4 and 9, and CENP-33 is SEQ ID NO: 5 and 10. Corresponding to each). Primers were designed with reference to those cDNAs, and a PCR reaction was carried out to obtain cDNA from which the stop codon had been removed. The fragment was cloned into the BamHI site of pEGGFPN1 (Clontech). Each plasmid is fused to the coding region of GFP with the stop codon removed (GFP fusion expression plasmid). The GFP fusion expression plasmid was introduced into DT40 wild type cells or CENP-H-RFP expression cells (cells in which the centromere region was labeled with red), and each protein was stably expressed as a GFP fusion protein. Cells stably expressing each GFP fusion protein were collected, washed with PBS, and pasted on a slide glass by cytospin method. The slide glass was infiltrated with 3% paraformaldehyde for 15 minutes to fix the cells. Cells were rinsed with PBS, and cell nuclei and chromosomes were stained with 0.3 microg / mL DAPI. The prepared slide glass was subjected to a fluorescence microscope, and the intracellular localization of the GFP fusion protein was observed with a green channel. Depending on the cell morphology, it is possible to distinguish between cells in the cell division phase and cells in the interphase. All five proteins were observed as dotted dots throughout the cell cycle, similar to CENP-H and CENP-I. Since it was colocalized with CENP-H, it was confirmed that all proteins were localized to the centromere throughout the cell cycle (FIGS. 2 to 6).
（５）ＣＥＮＰ−Ｋノックアウト細胞
ニワトリのＢ細胞由来のＤＴ４０細胞を宿主に用いた。遺伝子破壊はＣＥＮＰ−Kの遺伝子領域の一部を欠損させたプラスミドコンストラクトと薬剤耐性遺伝子を結合させたノックアウトコンストラクトを細胞へ導入して、当該遺伝子領域と相同組み換え法によって、ノックアウトコンストラクトと遺伝子領域を置換させて遺伝子領域の一部を細胞から欠失させることで行った。
(5) CENP-K knockout cells DT40 cells derived from chicken B cells were used as hosts. In gene disruption, a plasmid construct in which a part of the gene region of CENP-K is deleted and a knockout construct in which a drug resistance gene is combined are introduced into the cell, and the knockout construct and the gene region are separated by homologous recombination with the gene region. The replacement was performed by deleting part of the gene region from the cell.
ＣＥＮＰ−Ｋは、細胞増殖に必須である遺伝子のために、この遺伝子を破壊すると細胞が死滅して、細胞を得ることができない。ＤＴ４０細胞は２倍体であるため、ＣＥＮＰ−Ｋが２ローカスあることが予想されるが、ＣＥＮＰ−Ｋは性染色体上にコードされているため、１ローカスのみ存在している。したがって、１ローカスの破壊ですべてのＣＥＮＰ−Ｋの遺伝子が破壊される。 Since CENP-K is a gene essential for cell growth, when this gene is disrupted, the cell is killed and the cell cannot be obtained. Since DT40 cells are diploid, it is expected that CENP-K has 2 loci, but since CENP-K is encoded on the sex chromosome, only 1 locus exists. Therefore, all CENP-K genes are destroyed by disruption of one locus.
そこで、遺伝子破壊に先立ち、テトラサイクリンに応答するプロモーターの下流にＣＥＮＰ−ＫのｃＤＮＡをつないだプラスミド作成した。またテトラサイクリン応答プラスミドtTA(クローンテック社)を用意した。CENP-Kプラスミドを１００μgに対してtTAを20μgの割合で混ぜ、混ぜたプラスミDNAをエレクトロポーローション法(550V 25μF)によって、細胞へ導入した。2つのプラスミドがインテグレートした細胞をサザンハイビリダイゼーションにより選別した。この細胞は、テトラサイクリン非存在下では、本プロモーターからＣＥＮＰ−Ｋが安定に発現する。すなわち、この細胞では、ＣＥＮＰ−Ｋは、本来の遺伝子領域からとテトラサイクリンに応答するプロモーターの２カ所から発現している。 Therefore, prior to gene disruption, a plasmid was prepared by connecting CENP-K cDNA downstream of a promoter responsive to tetracycline. In addition, a tetracycline responsive plasmid tTA (Clontech) was prepared. CENP-K plasmid was mixed with 100 μg of tTA at a ratio of 20 μg, and the mixed plasmid DNA was introduced into the cells by the electroporation method (550 V 25 μF). Cells in which the two plasmids were integrated were selected by Southern hybridization. In this cell, CENP-K is stably expressed from this promoter in the absence of tetracycline. That is, in this cell, CENP-K is expressed from two sites, the original gene region and the promoter that responds to tetracycline.
この細胞へ図７に示すノックアウトコンストラクトを導入した。このノックアウトコンストラクトは、ＣＥＮＰ−Kのゲノム領域をクローン化した後、エキソン４からエキソン８の部分を取り除き、ｈｉｓＤ遺伝子を挿入して構築したものである。このノックアウトコンストラクトをエレクトロポーローション法(550V 25μF)によって、細胞へ導入した。1mg/mlのヒスティディノールに耐性を示すクローンを拾った。このノックアウトコンストラクトがＣＥＮＰ−Ｋの遺伝子領域と相同組み換えを起こすと、ＣＥＮＰ−Ｋのエキソン４からエキソン８がヒスティディノール耐性遺伝子（ｈｉｓＤ遺伝子）と置き換わり、ＣＥＮＰ−Ｋの遺伝子領域が破壊される。ノックアウトコンストラクトを導入してｈｉｓＤ遺伝子を発現する細胞株を複数選択して全ゲノムＤＮＡを抽出して制限酵素ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化してゲル電気泳動後、ＤＮＡをフィルターに転写した。フィルターを図７で示すｐｒｏｂｅを放射能ラベルしたのちハイブリダイズして、遺伝子置換を起こしている細胞を選択した。ＤＮＡ置換が起きていないと約１７ｋｂにバンドがでる（図８のｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）が、ＣＥＮＰ−Ｋの遺伝子領域が破壊されている約１３ｋｂ（図８のｋｎｏｃｋｏｕｔ）のバンドをしめす。図８に示すようなバンドパターンが得られる細胞が目的のコンディショナルノックアウト細胞株である（＃１０−８９）。 The knockout construct shown in FIG. 7 was introduced into these cells. This knockout construct was constructed by cloning the genomic region of CENP-K, removing exon 8 from exon 4, and inserting the hisD gene. This knockout construct was introduced into cells by the electroporation method (550V 25 μF). A clone resistant to 1 mg / ml histidinol was picked. When this knockout construct undergoes homologous recombination with the gene region of CENP-K, exon 4 to exon 8 of CENP-K are replaced with the histidinol resistance gene (hisD gene), and the gene region of CENP-K is destroyed. A plurality of cell lines expressing the hisD gene were selected by introducing a knockout construct, whole genome DNA was extracted, digested with restriction enzymes NheI and XhoI, gel electrophoresis, and then transferred to a filter. The probe was radiolabeled with the probe shown in FIG. 7 and then hybridized to select cells that had undergone gene replacement. If DNA substitution has not occurred, a band appears at about 17 kb (wild-type in FIG. 8), but a band of about 13 kb (knockout in FIG. 8) in which the gene region of CENP-K is destroyed. The cell from which the band pattern as shown in FIG. 8 is obtained is the target conditional knockout cell line (# 10-89).
得られたＣＥＮＰ−Ｋのコンディショナルノックアウト細胞は、テトラサイクリンに応答するプロモーターからのみＣＥＮＰ−Ｋを発現している。この細胞へテトラサイクリンを終濃度で２マイクログラム／ｍｌ加えることで、このプロモーター活性が失われ、ＣＥＮＰ−Ｋの遺伝子発現が抑制されることが期待される。そこで、テトラサイクリンの添加後、時間を追って細胞内のＣＥＮＰ−Ｋの量をウエスタンブロット法にて測定した（図９）。テトラサイクリンを添加後ある時間のたった細胞を１０の５条個ずつ集めて、4%SDSに溶解して超音波破砕した。全細胞タンパク質をSDS-電気泳動に供し、泳動後ゲルをニトロセルロースフィルターへ移した。フィルターをスキムミルクでブロック後抗CENP-K抗体と1時間以上インキュベートした。HRPラベルした抗ウサギ抗体でタンパク質を検出した。その結果、テトラサイクリン添加後２４時間でほとんどＣＥＮＰ−Ｋタンパク質が検出できなかった。また、テトラサイクリン添加後４８時間で細胞増殖は止まり、その後細胞は死滅することが確認できた（図１０）。細胞増殖の測定を行うためには、適当時間の培養後細胞をトリパンブルーで染色することによって細胞数をカウントした。以上の結果より、セントロメアタンパク質ＣＥＮＰ−Ｋのコンディショナルノックアウト細胞の樹立が確認できた。 The resulting CENP-K conditional knockout cells express CENP-K only from a promoter that responds to tetracycline. By adding tetracycline to this cell at a final concentration of 2 microgram / ml, it is expected that this promoter activity is lost and the gene expression of CENP-K is suppressed. Therefore, after addition of tetracycline, the amount of intracellular CENP-K was measured by Western blotting over time (FIG. 9). Ten cells after a certain period of time after addition of tetracycline were collected in 10 5 strips, dissolved in 4% SDS and sonicated. Total cell protein was subjected to SDS-electrophoresis, and after electrophoresis the gel was transferred to a nitrocellulose filter. The filter was blocked with skim milk and incubated with anti-CENP-K antibody for 1 hour or longer. The protein was detected with an anti-rabbit antibody labeled with HRP. As a result, almost no CENP-K protein could be detected 24 hours after tetracycline addition. In addition, it was confirmed that cell growth stopped 48 hours after the addition of tetracycline, and then the cells died (FIG. 10). In order to measure cell proliferation, the cells were counted by staining the cells with trypan blue after culturing for an appropriate time. From the above results, establishment of a conditional knockout cell of the centromere protein CENP-K was confirmed.
（６）ＣＥＮＰ−Ｍノックアウト細胞
ニワトリのＢ細胞由来のＤＴ４０細胞を宿主に用いた。遺伝子破壊はＣＥＮＰ−Mの遺伝子領域の一部を欠損させたプラスミドコンストラクトと薬剤耐性遺伝子を結合させたノックアウトコンストラクトを細胞へ導入して、当該遺伝子領域と相同組み換え法によって、ノックアウトコンストラクトと遺伝子領域を置換させて遺伝子領域の一部を細胞から欠失させることで行った。
(6) CENP-M knockout cells DT40 cells derived from chicken B cells were used as hosts. In gene disruption, a plasmid construct in which part of the gene region of CENP-M is deleted and a knockout construct in which a drug resistance gene is combined are introduced into the cell, and the knockout construct and the gene region are separated by homologous recombination with the gene region. The replacement was performed by deleting part of the gene region from the cell.
ＣＥＮＰ−Ｍは、細胞増殖に必須である遺伝子のために、この遺伝子を破壊すると細胞が死滅して、細胞を得ることができない。ＤＴ４０細胞は２倍体であるため、ＣＥＮＰ−Ｍは２ローカス存在する。そこで、はじめに１ローカスのＣＥＮＰ−Ｍ遺伝子座（図１１，１ｓｔアリル）をＣＥＮＰ−Ｍエキソン２からエキソン４をヒスティディノール耐性遺伝子（ｈｉｓＤ遺伝子）と置き換えることにより破壊した。ノックアウトコンストラクトは、ＣＥＮＰ−Mのゲノム領域をクローン化した後、エキソン2からエキソン4の部分を取り除き、ｈｉｓＤ遺伝子を挿入して構築したものである。このノックアウトコンストラクトをエレクトロポーローション法(550V 25μF)によって、細胞へ導入した。1mg/mlのヒスティディノールに耐性を示すクローンを拾った。このノックアウトコンストラクトがＣＥＮＰ−Mの遺伝子領域と相同組み換えを起こすと、ＣＥＮＰ−Mのエキソン2からエキソン４がヒスティディノール耐性遺伝子（ｈｉｓＤ遺伝子）と置き換わり、ＣＥＮＰ−Mの1遺伝子領域が破壊される。ノックアウトコンストラクトを導入してｈｉｓＤ遺伝子を発現する細胞株を複数選択して,全ゲノムＤＮＡを抽出する。DNAを制限酵素ＳａｌＩで消化してゲル電気泳動後、ＤＮＡをフィルターに転写した。フィルターを図１１で示すｐｒｏｂｅＡを放射能ラベルしたのちハイブリダイズして、遺伝子置換を起こしている細胞を選択した。ＤＮＡ置換が起きていないと約１７ｋｂにバンドがでる（図１２のｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）が、１遺伝子座のＣＥＮＰ−Ｍの遺伝子領域が破壊されると、１７ｋｂに加えて１３．５ｋｂ（図１２の１ｓｔ）のバンドをしめす。 CENP-M is a gene that is essential for cell growth, and when this gene is disrupted, cells die and cells cannot be obtained. Since DT40 cells are diploid, there are two loci of CENP-M. Therefore, first, one locus CENP-M locus (FIG. 11, 1st allele) was destroyed by replacing CENP-M exon 2 to exon 4 with a histidinol resistance gene (hisD gene). The knockout construct was constructed by cloning the genomic region of CENP-M, removing exon 4 from exon 2, and inserting the hisD gene. This knockout construct was introduced into cells by the electroporation method (550V 25 μF). A clone resistant to 1 mg / ml histidinol was picked. When this knockout construct undergoes homologous recombination with the gene region of CENP-M, exon 2 to exon 4 of CENP-M are replaced with the histidinol resistance gene (hisD gene), and one gene region of CENP-M is destroyed. . A plurality of cell lines expressing the hisD gene are selected by introducing a knockout construct, and total genomic DNA is extracted. The DNA was digested with the restriction enzyme SalI and subjected to gel electrophoresis, and then transferred to a filter. The filter was labeled with probeA shown in FIG. 11 and then hybridized to select cells that had undergone gene replacement. If DNA substitution has not occurred, a band appears at about 17 kb (wild-type in FIG. 12). However, when the gene region of CENP-M at one locus is destroyed, 13.5 kb (in FIG. 12) is added. 1st) band.
２遺伝子座の遺伝子破壊に先立ち、テトラサイクリンに応答するプロモーターの下流にＣＥＮＰ−MのｃＤＮＡをつないだプラスミド作成した。またテトラサイクリン応答プラスミドtTA(クローンテック社)を用意した。CENP-Mプラスミドを１００μgに対してtTAを20μgの割合で混ぜ、混ぜたプラスミDNAをエレクトロポーローション法(550V 25μF)によって、細胞へ導入した。2つのプラスミドがインテグレートした細胞をサザンハイビリダイゼーションにより選別した。この細胞では、テトラサイクリン非存在下では、本プロモーターからＣＥＮＰ−Ｍが安定に発現する。すなわち、この細胞では、ＣＥＮＰ−Ｍは、まだ遺伝子破壊されていない１遺伝子座のＣＥＮＰ−Ｍ遺伝子領域からとテトラサイクリンに応答するプロモーターの２カ所から発現している。 Prior to gene disruption at two loci, a plasmid was prepared by connecting CENP-M cDNA downstream of a promoter that responds to tetracycline. In addition, a tetracycline responsive plasmid tTA (Clontech) was prepared. CENP-M plasmid was mixed with 100 μg of tTA at a ratio of 20 μg, and the mixed plasmid DNA was introduced into the cells by the electroporation method (550 V 25 μF). Cells in which the two plasmids were integrated were selected by Southern hybridization. In this cell, CENP-M is stably expressed from this promoter in the absence of tetracycline. That is, in this cell, CENP-M is expressed from two sites of the CENP-M gene region of one locus that has not yet been genetically disrupted and the promoter that responds to tetracycline.
この細胞へピユーロマイシン耐性遺伝子を含むノックアウトコンストラクトを導入した。このノックアウトコンストラクトがＣＥＮＰ−Ｍの２番目の遺伝子領域（図１１、２ｎｄアリル）と相同組み換えを起こすと、ＣＥＮＰ−Ｍのエキソン２からエキソン４がピユーロマイシン耐性遺伝子と置き換わり、ＣＥＮＰ−Ｍのすべての遺伝子領域が破壊される。作成したノックアウト細胞の全ゲノムＤＮＡを抽出して制限酵素ＳａｌＩで消化してゲル電気泳動後、ＤＮＡをフィルターに転写した。フィルターを図１１で示すｐｒｏｂｅＡを放射能ラベルしたのちハイブリダイズして、遺伝子置換を起こしている細胞を選択した。ＤＮＡ置換が起きていないと約１７ｋｂにバンドがでる（図１２のｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）が、１遺伝子座のＣＥＮＰ−Ｍの遺伝子領域が破壊されると、１７ｋｂに加えて１３．５ｋｂ（図１２の１ｓｔ）のバンドをしめす。また、１遺伝子座にｃＤＮＡを導入した細胞でも同様のパターンを示す（１st＋ｃＤＮＡ）。２遺伝子座とも破壊されている細胞では、１７ｋｂのバンドはでずに、１４．５ｋｂと１３．５ｋｂのバンドをしめす（２nd＋ｃＤＮＡ）。これが目的のノックアウトクローンの遺伝子座のパターンである。この細胞をＰ１−３８と呼んでいる。 A knockout construct containing a pieuromycin resistance gene was introduced into these cells. When this knockout construct undergoes homologous recombination with the second gene region of CENP-M (FIGS. 11, 2nd allele), exon 2 to exon 4 of CENP-M are replaced with the pieuromycin resistance gene, and all of CENP-M The gene region of is destroyed. Total genomic DNA of the prepared knockout cells was extracted, digested with restriction enzyme SalI, gel electrophoresis, and then transferred to a filter. The filter was labeled with probeA shown in FIG. 11 and then hybridized to select cells that had undergone gene replacement. If DNA substitution has not occurred, a band appears at about 17 kb (wild-type in FIG. 12). However, when the gene region of CENP-M at one locus is destroyed, 13.5 kb (in FIG. 12) is added. 1st) band. In addition, a similar pattern is exhibited even in cells in which cDNA is introduced into one locus (1 st + cDNA). In cells in which both loci are disrupted, the 17 kb band does not appear, but the 14.5 kb and 13.5 kb bands are shown (2 nd + cDNA). This is the locus pattern of the desired knockout clone. This cell is called P1-38.
得られたＣＥＮＰ−Ｍのコンディショナルノックアウト細胞は、テトラサイクリンに応答するプロモーターからのみＣＥＮＰ−Ｍを発現している。この細胞へテトラサイクリンを終濃度で２マイクログラム／ｍｌ加えることで、このプロモーター活性が失われ、ＣＥＮＰ−Ｍの遺伝子発現が抑制されることが期待される。そこで、テトラサイクリンの添加後、時間を追って細胞内のＣＥＮＰ−Ｍの量をウエスタンブロット法にて測定した（図１３）。テトラサイクリンを添加後ある時間のたった細胞を１０の５条個ずつ集めて、4%SDSに溶解して超音波破砕した。全細胞タンパク質をSDS-電気泳動に供し、泳動後ゲルをニトロセルロースフィルターへ移した。フィルターをスキムミルクでブロック後抗CENP-M抗体と1時間以上インキュベートした。HRPラベルした抗ウサギ抗体でタンパク質を検出した。その結果、テトラサイクリン添加後４８時間でほとんどＣＥＮＰ−Ｍタンパク質が検出できなかった。また、テトラサイクリン添加後７２時間で細胞増殖は止まり、その後細胞は死滅することが確認できた（図１４）。細胞増殖の測定を行うためには、適当時間の培養後細胞をトリパンブルーで染色することによって細胞数をカウントした。以上の結果より、セントロメアタンパク質ＣＥＮＰ−Ｍのコンディショナルノックアウト細胞の樹立が確認できた。 The obtained CENP-M conditional knockout cells express CENP-M only from a promoter that responds to tetracycline. By adding tetracycline to this cell at a final concentration of 2 microgram / ml, it is expected that this promoter activity is lost and the gene expression of CENP-M is suppressed. Therefore, after addition of tetracycline, the amount of intracellular CENP-M was measured by Western blotting over time (FIG. 13). Ten cells after a certain period of time after addition of tetracycline were collected in 10 5 strips, dissolved in 4% SDS and sonicated. Total cell protein was subjected to SDS-electrophoresis, and after electrophoresis the gel was transferred to a nitrocellulose filter. The filter was blocked with skim milk and incubated with anti-CENP-M antibody for 1 hour or longer. The protein was detected with an anti-rabbit antibody labeled with HRP. As a result, CENP-M protein was hardly detected 48 hours after the addition of tetracycline. In addition, it was confirmed that cell proliferation stopped 72 hours after the addition of tetracycline, and then the cells died (FIG. 14). In order to measure cell proliferation, the cells were counted by staining the cells with trypan blue after culturing for an appropriate time. From the above results, establishment of a conditional knockout cell of the centromere protein CENP-M was confirmed.
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