JP4631051B2 - Proteins localized to the centromere - Google Patents
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Description
本発明は、セントロメア構成タンパク質であるＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合し、染色体分配を制御する新規なタンパク質及びそれをコードする遺伝子に関する。 The present invention relates to a novel protein that binds to centromere-constituting proteins CENP-H and CENP-I and controls chromosome distribution and a gene encoding the same.
生物が生命を維持するためには、全ゲノム情報を包括する構造体である染色体は安定に保持・増殖されなければならない。正常な細胞では、ほぼ決まった時間周期で染色体の複製と分配が正確に行われる。染色体の複製・分配といった基本的な生体反応に狂いが生じると染色体の異数化、がん化など細胞に対する悪影響が生じる。したがって、染色体分配機構の解明は、がん化の制御につながると考えられる。 In order for an organism to maintain its life, a chromosome, which is a structure containing all genome information, must be stably maintained and propagated. In normal cells, chromosome replication and distribution occur accurately in almost fixed time periods. If a fundamental biological reaction such as chromosome replication / distribution is distorted, adverse effects on cells such as chromosome aneuploidy and canceration will occur. Therefore, elucidation of the chromosome distribution mechanism is thought to lead to the control of canceration.
細胞分裂時に両極から伸びた紡錘体が染色体の特殊構造を捕まえて、娘細胞へ分配することで染色体分配はおこる。その際、紡錘体が捕らえる染色体の特殊構造はセントロメア（動原体）と呼ばれている。従って、セントロメアは染色体分配に重要な働きを担っている。また、がん細胞のように過剰な分裂を行う細胞では、セントロメアを構成するあるタンパク質が過剰に発現していることが報告されている（非特許文献１）。ＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉは染色体分配に関わるセントロメア構成タンパク質であり、ＣＥＮＰ−ＨとＣＥＮＰ−Ｉが結合していることは報告されている（非特許文献２）。ただし、ＣＥＮＰ−ＨやＣＥＮＰ−Ｉは、染色体分配において未同定のタンパク質と作用して巨大複合体として機能すると予想されている（非特許文献３）。他のセントロメアタンパク質と同様に未同定のセントロメアタンパク質は、がん細胞で過剰に発現していることが予想される。したがって、未同定のセントロメアタンパク質は、制がん薬剤のターゲットになる可能性を秘めている。
本発明の目的は、セントロメアに局在し、ＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合して染色体分配を制御しており、制がん薬剤のターゲットとして有用な新規タンパク質を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a novel protein that is localized in the centromere and binds to CENP-H and CENP-I to control chromosome distribution and is useful as a target for anticancer drugs.
本発明者は、がん細胞の増殖制御を目指してセントロメアを構成するタンパク質について研究を行い、特にＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに注目し、これに結合するタンパク質を探索してきた。その結果、今般、ＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合し、セントロメアへ局在し染色体分配を制御する機能を有する５種のタンパク質を見出し、本発明を完成した。 The inventor has conducted research on proteins constituting centromeres with the aim of controlling the growth of cancer cells, and has focused on CENP-H and CENP-I, and has searched for proteins that bind to them. As a result, five types of proteins that bind to CENP-H and CENP-I, localize to the centromere, and control chromosome distribution have been found, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、配列番号１〜５から選ばれるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１〜５から選ばれるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有するタンパク質、並びにこれらのタンパク質をコードする遺伝子を提供するものである。 That is, the present invention relates to a protein comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 5. And a protein having binding ability to CENP-H and CENP-I, and genes encoding these proteins.
本発明のタンパク質は、セントロメアを構成するタンパク質であるＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合し、かつセントロメアへ局在する性質を有することから、染色体の分配に深く関与しているタンパク質である。このタンパク質の発現を制御すれば、がん細胞の増殖を制御でき、このタンパク質は制がん薬剤のターゲットとして有用である。すなわち、このタンパク質の過剰発現を抑制すれば、新たな作用機序による制がん剤が開発できる。 The protein of the present invention is a protein that is deeply involved in chromosome distribution because it binds to CENP-H and CENP-I, which are proteins constituting centromeres, and has a property of localizing to centromeres. Controlling the expression of this protein can control the growth of cancer cells, and this protein is useful as a target for anticancer drugs. That is, anti-cancer agents with a new mechanism of action can be developed by suppressing the overexpression of this protein.
本発明タンパク質は、配列番号１〜５から選ばれるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１〜５から選ばれるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有するタンパク質である。ここで、上記１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列と配列番号１〜５のアミノ酸配列との相同性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％以上である。 The protein of the present invention consists of an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 5. And a protein having binding ability to CENP-H and CENP-I. Here, the homology between the amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added and the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 5 is preferably 90% or more, more preferably 95%, still more preferably. Is 98% or more.
また、本発明の遺伝子は、前記タンパク質をコードする遺伝子である。この遺伝子としては、前記タンパク質をコードするものであれば制限されないが、例えば配列番号６〜１０から選ばれる塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号６〜１０から選ばれる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃、又は０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃の条件である。 The gene of the present invention is a gene encoding the protein. The gene is not limited as long as it encodes the protein. For example, DNA comprising a base sequence selected from SEQ ID NOs: 6 to 10, or a base sequence complementary to a base sequence selected from SEQ ID NOs: 6 to 10 And a DNA encoding a protein having a binding property to CENP-H and CENP-I. Here, the stringent conditions are, for example, conditions of 50 ° C. in 0.2 × SSC containing 0.1% SDS, or 60 ° C. in 1 × SSC containing 0.1% SDS.
配列番号１〜５から選ばれるアミノ酸配列及び配列番号６〜１０から選ばれる塩基配列は、ニワトリ由来のタンパク質及びそれをコードする遺伝子である。しかし、前記の如く１又は数個のアミノ酸配列が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有する限り、ヒトを含む哺乳類由来のタンパク質も本発明に含まれることはいうまでもない。 The amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 5 and the base sequence selected from SEQ ID NOs: 6 to 10 are a chicken-derived protein and a gene encoding it. However, as long as it consists of an amino acid sequence in which one or several amino acid sequences are deleted, substituted or added as described above and has binding properties to CENP-H and CENP-I, proteins derived from mammals including humans are also present. It goes without saying that it is included in the invention.
セントロメアに局在するタンパク質の同定は、生化学的手法や遺伝学的手法を用いることで数多く試みられている。しかしながら、存在量の少なさや抽出技術の困難さから、新しくセントロメアタンパク質を同定したという成功例は数少ない。また、既存のセントロメアタンパク質にタグをつけたタンパク質を細胞内で大量発現させて、結合タンパク質を同定する試みが最近さかんに行われている。しかしながら、大量発現することで、そのタンパク質がセントロメア以外の場所に局在し、セントロメアに局在するセントロメアタンパク質同定がうまくいかないなど技術的な問題点が数多くあった。 Many attempts have been made to identify proteins located in centromeres using biochemical and genetic techniques. However, few centromere proteins have been successfully identified due to their low abundance and difficulty in extraction techniques. Recently, many attempts have been made to identify binding proteins by expressing a large amount of proteins tagged with existing centromere proteins in cells. However, there are many technical problems such as that the protein is localized in a place other than the centromere due to mass expression, and the identification of the centromere protein localized in the centromere is not successful.
本発明のタンパク質は、例えばニワトリＤＴ４０細胞を用いて、以下の如くして分離できる。すなわち、ニワトリＤＴ４０細胞内では、相同組み換えが高頻度でおこるために遺伝子改変を効率的に行うことができる。セントロメアタンパク質ＣＥＮＰ−Ｈ又はＣＥＮＰ−Ｉの発現を１００％タグ付きの融合タンパク質に置き換えた細胞株を樹立した。この細胞株では、タグ付きのＣＥＮＰ−ＨやＣＥＮＰ−Ｉがセントロメア以外に局在してしまうという前記問題点が克服できていた。そこでこれらの細胞株を用いてクロマチン画分を調製し、抗タグ抗体を用いた免疫沈降法によりＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉと結合するタンパク質を同定した。得られたペプチド配列をもとにｃＤＮＡクローニングすることにより、本発明の配列番号１〜５から選ばれるアミノ酸配列からなる５種類のタンパク質が得られる。 The protein of the present invention can be separated as follows using, for example, chicken DT40 cells. That is, in chicken DT40 cells, homologous recombination occurs at a high frequency, so that genetic modification can be performed efficiently. Cell lines were established in which the expression of the centromere protein CENP-H or CENP-I was replaced with a fusion protein with a 100% tag. In this cell line, the above-mentioned problem that CENP-H and CENP-I with a tag are localized other than the centromere could be overcome. Thus, chromatin fractions were prepared using these cell lines, and proteins that bind to CENP-H and CENP-I were identified by immunoprecipitation using an anti-tag antibody. Five types of proteins consisting of amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 1 to 5 of the present invention are obtained by cDNA cloning based on the obtained peptide sequences.
得られた本発明タンパク質は、これをＧＦＰ融合タンパク質等の標識タンパク質として細胞内で発現させれば、細胞周期を通じてセントロメアへ局在することが確認できる。 If the obtained protein of the present invention is expressed in a cell as a labeled protein such as a GFP fusion protein, it can be confirmed that it is localized to the centromere throughout the cell cycle.
かくして得られた本発明のタンパク質及び遺伝子は、アミノ酸配列又は塩基配列が判明したので、前記手段に限定されず、ペプチド合成等により製造することもでき、通常の遺伝子組み換え手段により製造できることは言うまでもない。 Since the protein and gene of the present invention thus obtained have been found to have an amino acid sequence or a base sequence, it is not limited to the above means, and can be produced by peptide synthesis or the like, and can be produced by ordinary genetic recombination means. .
本発明タンパク質は、ＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合し、かつセントロメアへ局在する。従って、染色体の分配に必須のタンパク質である。本発明タンパク質が過剰に発現する細胞は、がん化している可能性が高く、本発明タンパク質又はこの遺伝子を検出すればがんの診断が可能である。また、本発明タンパク質又はその遺伝子の過剰発現を指標にして、制がん剤の開発が可能である。すなわち、本発明タンパク質又はその遺伝子の過剰発現を抑制する薬剤を探索すれば制がん剤がスクリーニングできる。 The protein of the present invention binds to CENP-H and CENP-I and localizes to the centromere. Therefore, it is an essential protein for chromosome distribution. A cell in which the protein of the present invention is excessively expressed is highly likely to be cancerous, and cancer can be diagnosed by detecting the protein of the present invention or this gene. In addition, it is possible to develop an anticancer drug using the overexpression of the protein of the present invention or a gene thereof as an index. That is, anticancer drugs can be screened by searching for drugs that suppress the overexpression of the protein of the present invention or its gene.
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is given and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these Examples at all.
（１）細胞内のＣＥＮＰ−Ｈ又はＣＥＮＰ−Ｉタンパク質の全てをタグ付き融合タンパク質に置換された細胞株の確立
ＣＥＮＰ−Ｈ遺伝子あるいはＣＥＮＰ−Ｉ遺伝子のゲノム領域と相同性のある約１０Kbのゲノム配列をプラスミドベクターｐＢＳへクローン化する。そのプラスミドへクローン化されたゲノム領域へ薬剤耐性遺伝子(ヒスチジノール耐性遺伝子あるいはピューロマイシン耐性遺伝子)を挿入したプラスミドを構築する (ノックアウトコンストラクト)。エレクトロポーレーション法(５５０Ｖ、２５マイクロＦ)を用いて、制限酵素ＮｏｔＩで切断されたノックアウトコンストラクトをＤＴ４０細胞へ導入して、ノックコンストラクトとゲノム領域が置換したニワトリＤＴ４０細胞株（ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉノックアウト株）を樹立する。相同組み換えの有無は、サザンハイブリダイゼーションで確認できる。平行して、ＣＭＶプローモーターの下流でＦＬＡＧタグ融合ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質が発現するプラスミドベクターを構築する(ＦＬＡＧタグ融合ベクター)。ＦＬＡＧタグ融合ベクターをエレクトロポーレーション法を用いて、ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉノックアウト株へ導入した。これらの細胞株では、野生型のＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質がノックアウトされて、ＦＬＡＧタグ融合ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質が発現しているため、細胞内の全てのＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質がＦＬＡＧタグ融合ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質に置き換わっている。
(1) Establishment of a cell line in which all intracellular CENP-H or CENP-I proteins are replaced with tagged fusion proteins Genome of about 10 Kb homologous to the genomic region of CENP-H gene or CENP-I gene The sequence is cloned into the plasmid vector pBS. A plasmid is constructed by inserting a drug resistance gene (histidinol resistance gene or puromycin resistance gene) into the genomic region cloned into the plasmid (knockout construct). Using the electroporation method (550 V, 25 micro F), the knockout construct cleaved with the restriction enzyme NotI was introduced into DT40 cells, and the chicken DT40 cell line (CENP-H or CENP) in which the knock construct and the genomic region were replaced. -I knockout strain). The presence or absence of homologous recombination can be confirmed by Southern hybridization. In parallel, a plasmid vector in which the FLAG tag fusion CENP-H or CENP-I protein is expressed downstream of the CMV promoter is constructed (FLAG tag fusion vector). The FLAG tag fusion vector was introduced into CENP-H or CENP-I knockout strain using electroporation. In these cell lines, the wild-type CENP-H or CENP-I protein is knocked out and the FLAG tag fusion CENP-H or CENP-I protein is expressed. Therefore, all CENP-H or CENP in the cell are expressed. -I protein is replaced by FLAG tag fusion CENP-H or CENP-I protein.
（２）本発明タンパク質の分離
（１）で得た細胞を大量培養して間期の細胞を集めた。Dounceホモジナイザーを用いて細胞を破砕し、遠心分離によって核を調製する。核を緩衝液Ａ（２０mM ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ pH８．０／１５０mM ＫＣｌ／１mM ＤＴＴ）に懸濁した後、超音波破砕し、遠心分離によってＤＮＡを含む画分を調製した。ＤＮＡを含む画分に最終濃度３mMのCaCl2を添加し、さらにマイクロコッカル・ヌクレアーゼを加えて４℃１時間反応させ、ＤＮＡを切断することによって、ＤＮＡに結合しているタンパク質を可溶化した。ＫＣｌ及びＮＰ−４０をそれぞれ最終濃度３００mM及び０．１％になるよう添加し、続いて抗ＦＬＡＧ抗体を固定化したレジンを添加して４℃３時間撹拌した。抗ＦＬＡＧ抗体を固定化したレジンを遠心分離によって回収し、緩衝液Ｂ（２０mM ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ pH８．０／３００mM ＫＣｌ／１mM ＤＴＴ／０．１％ ＮＰ−４０）を用いて洗浄した。抗ＦＬＡＧ抗体を固定化したレジンに０．１Ｍ Glycine pH２．５溶液を添加して１分間静置した後、遠心分離によって溶液を回収した。溶液に等量の２０％トリクロロ酢酸及び５倍量のアセトンを添加し、−２０℃で２時間静置し、遠心分離によってタンパク質を回収した。
(2) Separation of the protein of the present invention The cells obtained in (1) were mass-cultured to collect interphase cells. Cells are disrupted using a Dounce homogenizer and nuclei are prepared by centrifugation. Nuclei were suspended in buffer A (20 mM HEPES-KOH pH 8.0 / 150 mM KCl / 1 mM DTT), then sonicated and a fraction containing DNA was prepared by centrifugation. The final concentration of 3 mM of CaCl 2 was added to the fraction containing DNA, and then the reaction was carried out at 4 ° C. for 1 hour by adding a micrococcal nuclease to cleave the DNA, solubilizing the protein bound to the DNA. . KCl and NP-40 were added to final concentrations of 300 mM and 0.1%, respectively, followed by the addition of a resin immobilizing an anti-FLAG antibody and stirring at 4 ° C. for 3 hours. The resin on which the anti-FLAG antibody was immobilized was collected by centrifugation and washed with buffer B (20 mM HEPES-KOH pH 8.0 / 300 mM KCl / 1 mM DTT / 0.1% NP-40). A 0.1 M Glycine pH 2.5 solution was added to the resin with the anti-FLAG antibody immobilized thereon, and the mixture was allowed to stand for 1 minute, and then the solution was collected by centrifugation. An equal amount of 20% trichloroacetic acid and 5 times amount of acetone were added to the solution, and the mixture was allowed to stand at −20 ° C. for 2 hours, and the protein was recovered by centrifugation.
（３）タンパク質の同定
回収されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、銀染色で検出し、ゲルを切り出して質量分析を行うことで各タンパク質の部分アミノ酸配列を決定した。各タンパク質の部分アミノ酸配列は、以下の通りである。
(3) Identification of proteins The recovered proteins were separated by SDS-PAGE, then detected by silver staining, the gel was cut out and subjected to mass spectrometry to determine the partial amino acid sequence of each protein. The partial amino acid sequence of each protein is as follows.
（ＣＥＮＰ−４０）Asp Gly Gly Gly Arg Met Pro Ala Ala Pro Leu Ala Gln Gly Lys Val Glu Arg (CENP-40) Asp Gly Gly Gly Arg Met Pro Ala Ala Pro Leu Ala Gln Gly Lys Val Glu Arg
（ＣＥＮＰ−３５）Lys Gln Trp Thr Leu Tyr Ser Val Ser Pro Leu Tyr Lys Phe Ser Ser Ala Asp Leu Lys Asp Tyr Ala Arg Met Leu Gly Val Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg (CENP-35) Lys Gln Trp Thr Leu Tyr Ser Val Ser Pro Leu Tyr Lys Phe Ser Ser Ala Asp Leu Lys Asp Tyr Ala Arg Met Leu Gly Val Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg
（ＣＥＮＰ−３３）Lys Ala Glu Leu Glu Ser Leu Gln Arg Asp Leu Ser Phe Leu Val Lys Phe Thr Gly Ile Gln Ile Thr Ser His Ser Lys Lys Thr Leu Glu Lys Thr Gly Asn Arg (CENP-33) Lys Ala Glu Leu Glu Ser Leu Gln Arg Asp Leu Ser Phe Leu Val Lys Phe Thr Gly Ile Gln Ile Thr Ser His Ser Lys Lys Thr Leu Glu Lys Thr Gly Asn Arg
（ＣＥＮＰ−３０）Arg Asn Pro Glu Leu Ile Ser Thr Asn Pro Glu Val Leu Leu Leu Leu Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys (CENP-30) Arg Asn Pro Glu Leu Ile Ser Thr Asn Pro Glu Val Leu Leu Leu Leu Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys
（ＣＥＮＰ−１７）Asn Val Gln Ala Ser Leu Ala Tyr Val Asp Val Arg Phe Phe Leu Gly Lys Val Cys Phe Leu Val Thr Gly Val Gly Arg Ala Asn Asn Cys Ser Val Glu Met (CENP-17) Asn Val Gln Ala Ser Leu Ala Tyr Val Asp Val Arg Phe Phe Leu Gly Lys Val Cys Phe Leu Val Thr Gly Val Gly Arg Ala Asn Asn Cys Ser Val Glu Met
ＣＥＮＰ−Ｉ−ＧＦＰ、ＣＥＮＰ−Ｈ−ＧＦＰ、あるいはＣＥＮＰ−Ｈ−３×ＦＬＡＧ融合タンパクを発現する細胞を大量培養し、クロマチン画分を調製した。抗ＧＦＰ抗体あるいは抗ＦＬＡＧ抗体を用いてタンパク複合体を免疫沈降し、銀染色によってタンパクを検出した。得られた結果を図１に示す。コントロール実験として、野生型のＤＴ４０細胞 (wt)を大量培養し、クロマチン画分を調製して抗ＧＦＰ抗体あるいは抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降実験を行った。ここで、検出されるタンパク質は、抗体の非特異的吸着により沈降されるタンパク質である。ＣＥＮＰ−Ｉ−ＧＦＰ、ＣＥＮＰ−Ｈ−ＧＦＰ、あるいはＣＥＮＰ−Ｈ−３×ＦＬＡＧ融合タンパクを発現する細胞で、特異的に沈降され、コントロール実験で沈降される5本のバンドに着目して、それらをＣＥＮＰ−Ｉ、ＣＥＮＰ−Ｈ、ＣＥＮＰ−４０、ＣＥＮＰ−３５、ＣＥＮＰ−３３、ＣＥＮＰ−３０、ＣＥＮＰ−１７と命名した。
ＣＥＮＰ−４０、ＣＥＮＰ−３５、ＣＥＮＰ−３３、ＣＥＮＰ−３０、ＣＥＮＰ−１７の各タンパクは、ＣＥＮＰ−ＨやＣＥＮＰ−Ｉと特異的に結合することから、これらが構成的にセントロメアに局在するタンパク複合体であると考えられた。ＣＥＮＰ−ＨをＣＥＮＰ−Ｈ−ＦＬＡＧに置き換えた細胞から調製したサンプルとＣＥＮＰ−ＩをＣＥＮＰ−Ｉ−ＦＬＡＧに置き換えた細胞から調製したサンプルで共通に見られる５本のバンドを切り出して部分的アミノ酸配列を決定した。
Cells expressing CENP-I-GFP, CENP-H-GFP, or CENP-H-3 × FLAG fusion protein were cultured in large quantities to prepare a chromatin fraction. The protein complex was immunoprecipitated using anti-GFP antibody or anti-FLAG antibody, and the protein was detected by silver staining. The obtained results are shown in FIG. As a control experiment, wild-type DT40 cells (wt) were cultured in large quantities, a chromatin fraction was prepared, and an immunoprecipitation experiment using an anti-GFP antibody or an anti-FLAG antibody was performed. Here, the protein to be detected is a protein that is precipitated by non-specific adsorption of the antibody. Cells that express CENP-I-GFP, CENP-H-GFP, or CENP-H-3xFLAG fusion protein, focusing on the five bands that are specifically precipitated and precipitated in control experiments. Were named CENP-I, CENP-H, CENP-40, CENP-35, CENP-33, CENP-30, and CENP-17.
Since CENP-40, CENP-35, CENP-33, CENP-30, and CENP-17 specifically bind to CENP-H and CENP-I, they are constitutively localized in the centromere. It was thought to be a protein complex. Partial amino acids cut out 5 bands commonly found in samples prepared from cells in which CENP-H was replaced with CENP-H-FLAG and samples prepared from cells in which CENP-I was replaced with CENP-I-FLAG The sequence was determined.
（４）得られた部分アミノ酸配列をもとにプローブを調製し、ニワトリ胚由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーングした。各種タンパク質に関して複数種類のｃＤＮＡクローンを得て、得られたすべてのｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定した。その結果すべての 種類のタンパク質に関して開始コドンと予想されるＡＴＧが見いだされ、完全長のｃＤＮＡの塩基配列が決定できた。（ＣＥＮＰ−４０が配列番号１及び６、ＣＥＮＰ−３５が配列番号２及び７、ＣＥＮＰ−３３が配列番号３及び８、ＣＥＮＰ−３０が配列番号４及び９、ＣＥＮＰ−１７が配列番号５及び１０にそれぞれ対応する）。それらのｃＤＮＡを参考にプライマーを設計して、ＰＣＲ反応を行いストップコドンをとり除いたｃＤＮＡを得て、その断片をｐＥＧＦＰＮ１(クローンテック社)のＢａｍＨＩサイトへクローン化した。それぞれのプラスミドは、ストップコドンが取り除かれてＧＦＰのコード領域と融合している(ＧＦＰ融合発現プラスミド)。ＧＦＰ融合発現プラスミドをＤＴ４０野生型細胞あるいはＣＥＮＰ−Ｈ−ＲＦＰ発現細胞(セントロメア領域が赤で標識されている細胞)へ導入して、ＧＦＰ融合タンパク質としてそれぞれのタンパク質を安定に発現させた。それぞれのＧＦＰ融合タンパク質の安定発現細胞を集めて、ＰＢＳで洗浄後、サイトスピン法によってスライドグラス上に貼付けた。スライドグラスを３％パラホルムアルデヒドに１５分間浸透させ、細胞を固定した。細胞をＰＢＳでリンスした後０．３マイクロg/mLのＤＡＰＩで細胞核及び染色体を染色した。作成したスライドグラスを蛍光顕微鏡へ供してＧＦＰ融合タンパク質の細胞内局在を緑チャンネルで観察した。細胞形態によって、細胞分裂期の細胞と間期の細胞の区別が可能となる。５種類すべてのタンパク質がＣＥＮＰ−ＨやＣＥＮＰ−Ｉと同様に細胞周期を通じて点状のドットとして観察された。ＣＥＮＰ−Ｈと局在をともにすることから、すべてのタンパク質が細胞周期を通じてセントロメアへ局在していることが確認できた（図２〜図６）。 (4) A probe was prepared based on the obtained partial amino acid sequence, and a cDNA library derived from a chicken embryo was screened. A plurality of types of cDNA clones were obtained for various proteins, and the base sequences of all the obtained cDNA clones were determined. As a result, ATG expected to be the start codon was found for all types of proteins, and the base sequence of full-length cDNA could be determined. (CENP-40 is SEQ ID NO: 1 and 6, CENP-35 is SEQ ID NO: 2 and 7, CENP-33 is SEQ ID NO: 3 and 8, CENP-30 is SEQ ID NO: 4 and 9, and CENP-17 is SEQ ID NO: 5 and 10. Corresponding to each). Primers were designed with reference to those cDNAs, and a PCR reaction was carried out to obtain cDNA from which the stop codon had been removed. The fragment was cloned into the BamHI site of pEGGFPN1 (Clontech). Each plasmid is fused to the coding region of GFP with the stop codon removed (GFP fusion expression plasmid). The GFP fusion expression plasmid was introduced into DT40 wild type cells or CENP-H-RFP expression cells (cells in which the centromere region was labeled with red), and each protein was stably expressed as a GFP fusion protein. Cells stably expressing each GFP fusion protein were collected, washed with PBS, and pasted on a slide glass by cytospin method. The slide glass was infiltrated with 3% paraformaldehyde for 15 minutes to fix the cells. Cells were rinsed with PBS, and cell nuclei and chromosomes were stained with 0.3 microg / mL DAPI. The prepared slide glass was subjected to a fluorescence microscope, and the intracellular localization of the GFP fusion protein was observed with a green channel. Depending on the cell morphology, it is possible to distinguish between cells in the cell division phase and cells in the interphase. All five proteins were observed as dotted dots throughout the cell cycle, similar to CENP-H and CENP-I. Since it was colocalized with CENP-H, it was confirmed that all proteins were localized to the centromere throughout the cell cycle (FIGS. 2 to 6).
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2005
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