JP4783882B2 - Novel α-amylase inhibitory active substance, production method thereof and use thereof - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はコレウスフォルスコリから得られうる新規α−アミラーゼ阻害活性物質、新規α−アミラーゼ阻害剤及びそれ等の製造方法に関し、この新規物質又は新規αーアミラーゼ阻害剤が血糖の上昇を抑制する効果を有し、好ましくはα−グルコシダーゼ阻害活性作用やリパーゼ阻害活性作用も有しており、高血糖或いは肥満の予防、治療、改善等に有効であることから、健康食品や、各種医薬品等への使用が期待され、本発明はこれ等の用途にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
肥満は、虚血性心疾患、高血圧、糖尿病等多くの疾患のリスクファクターであり、高血圧症３３００万人、高脂血症２０００万人、糖尿病６９０万人の患者のうち３〜６割については、肥満が原因と日本肥満学会は推定した。更に、日本における肥満は、この３０年で２〜４倍に増えており、国民の健康を脅かす大きな要因となっている。今後、高齢化が進むにつれ、生活習慣病は益々増加するものと考えられ、肥満防止は健康面ばかりでなく社会的及び経済的側面からも克服すべき重要な課題となりつつある。
【０００３】
肥満の９割以上が単純性肥満と称する消費エネルギーに対する摂取エネルギーの過多に起因するものである。これを防止するには、１）摂取エネルギーの抑制及び２）エネルギー消費の促進がある。
【０００４】
１）については食事制限、食欲抑制剤の投与、消化管内での脂質等の吸着による吸収の抑制、難消化性食物繊維による満腹感の形成、消化酵素阻害剤の投与等の方法がある。
【０００５】
２）については、運動療法、エネルギー代謝促進剤の投与等がある。
【０００６】
コレウスフォルスコリは、その根の部分が従来インドにおいては強心剤、強精剤的効果を期待した保健食品としてピクルス等の形態で食されてきた。また、近年の医薬品開発の分野においては、1977年、Bahtにより発見された、細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させるジテルペン化合物、フォルスコリン（Forskolin）に関して、血圧降下薬（特開昭63-10783号公報参照。）や、白髪防止薬（特開平4-124122号公報及び特開平4-360836号公報参照。）としての検討がなされている。更に、この物質に関してｃＡＭＰの上昇に伴い細胞内の脂質代謝が亢進することから、肥満防止作用（脂質代謝改善）（Biochemical and Biophysical Research Comm.,vol.107(1982), p157-164参照。）についても研究が進められている。
【０００７】
現在、コレウスフォルスコリ根部よりフォルスコリンを抽出精製して、肥満防止用健康食品、育毛促進用医薬部外品の製造が行われ製品が上市されている。フォルスコリンは、水に不溶性でアセトン、クロロホルム、ベンゼン等に可溶性の化合物で、通常は、根の粉末よりアセトンにて抽出し、上記疎水性溶媒を用いて、精製される。
【０００８】
このような情況下に、高血糖を改善し、或いは肥満を防止できる更に優れた薬剤、特に経口可能な薬剤、飲食品の開発が求められている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、高血糖或いは肥満を予防、治療及び／又は改善できる優れた飲食品特に健康食品、薬剤或いはそれらに使用可能な成分の開発にある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は上記課題の解決に向けて鋭意検討した結果、コレウスフォルスコリから、従来コレウスフォルスコリの主たる生理活性物質とされていたフォルスコリンとは、全く異なる成分であり、フォルスコリンには認められないα−アミラーゼ阻害活性作用を示す化合物を含む新規物質（以下、「本発明の物質」或いは「α−アミラーゼ阻害活性物質」とも称する。）を見出した。更に、このα−アミラーゼ阻害活性物質には血糖の上昇を抑制する作用が有り、糖尿病や肥満の予防、治療、改善等に有効であることも見出され、これらの知見に基づいて本発明が完成されるに到った。
【００１１】
この物質は、前記α−アミラーゼ阻害活性作用を示す化合物を純品で又は高純度に含むこともできるし、高度に濃縮された形態で含むこともできる。好ましくは、α−グルコシダーゼ阻害活性作用や、リパーゼ阻害活性作用を有することも見出されている。
【００１２】
即ち、本発明は、その各種の形態として下記の内容を含む。
（１）フォルスコリンを抽出した残渣のコレウスフォルスコリから、水、アルコール又はこれらの混合物を用いて分離することを特徴とする、α−アミラーゼ阻害活性作用を有する抽出物の製造方法。
（２）前記α−アミラーゼ阻害活性作用を有する抽出物がα−グルコシダーゼ阻害活性作用及び／又はリパーゼ阻害活性作用を有する（１）記載の方法。
（３）コレウスフォルスコリがコレウスフォルスコリ根部である（１）又は（２）記載の方法。
（４）アルコールが、メタノール及びエタノールの少なくとも１種である（１）〜（３）何れか記載の方法。
（５）前記α−アミラーゼ阻害活性作用を有する抽出物がアセトンに不溶である（１）〜（４）何れか記載の方法。
（６）フォルスコリンを抽出した残渣のコレウスフォルスコリから分離され、α−アミラーゼ阻害活性作用を有することを特徴とする水、アルコール又はこれらの混合物による抽出物。
（７）α−グルコシダーゼ阻害活性作用及び／又はリパーゼ阻害活性作用を有する（６）記載の抽出物。
（８）アセトンに不溶で、水又はアルコールに可溶である（６）又は（７）記載の抽出物。
（９）（６）〜（８）何れか記載の抽出物を含有することを特徴とする飲食品。
（１０）健康食品である（９）記載の飲食品。
また、本発明は、以下の形態をも含む。尚、コレウスフォルスコリとしては、フォルスコリンを抽出した残渣のコレウスフォルスコリが選択される。
１． コレウスフォルスコリから、水又はアルコールに可溶で、α−アミラーゼ阻害活性作用を示す（有する）化合物を含む物質を分離することに特徴を有するα−アミラーゼ阻害活性物質又はα−アミラーゼ阻害剤の製造方法。
【００１３】
２． α−アミラーゼ阻害活性作用を示す化合物を含む物質がα−グルコシダーゼ阻害活性作用及び／又はリパーゼ阻害活性作用を有する上記製造方法。
特に好ましくは、α−アミラーゼ阻害活性作用を示す化合物がα−グルコシダーゼ阻害活性作用及び／又はリパーゼ阻害活性作用を有する上記製造方法。
【００１４】
３． コレウスフォルスコリとしてコレウスフォルスコリ根部、好ましくはその粉末を使用する上記製造方法。
【００１５】
４． アルコールが、メタノール及びエタノールの少なくとも１種である上記製造方法。
【００１６】
５． α−アミラーゼ阻害活性作用を示す化合物を含む物質がアセトンに不溶である上記製造方法。
本発明、特に本発明の物質（或いは本発明において製造される物質又はα−アミラーゼ阻害剤）には、その一形態としてコレウスフォルスコリからこのようにして製造されたアセトンに不溶でアルコールに可溶な物質が含まれる。従って、高純度α−アミラーゼ阻害活性物質のみならず、それを含有する未精製のアルコール抽出物（コレウスフォルスコリから）が本発明で製造される物質或いはα−アミラーゼ阻害剤に含まれ、即ち当該活性成分の化合物自体及び当該化合物を含む物質が本発明の物質或いは本発明のα−アミラーゼ阻害剤に該当する。当然、この化合物或いはこの物質は、特に好ましくは、更にα−グルコシダーゼ阻害活性作用及び／又はリパーゼ阻害活性作用を有している。
【００１７】
６． コレウスフォルスコリから分離することができ、α−アミラーゼ阻害活性作用を示すことに特徴を有する新規物質、又はα−アミラーゼ阻害剤。
このような阻害活性作用を有する化合物の形態でも、当該化合物を高純度又は濃縮された状態で含む形態でもよい。
【００１８】
７． 更に、α−グルコシダーゼ阻害活性作用及び／又はリパーゼ阻害活性作用を有する前記物質、又はα−アミラーゼ阻害剤。
この場合、α−アミラーゼ阻害活性作用を示す化合物を含み、この化合物がα−グルコシダーゼ阻害活性作用及び／又はリパーゼ阻害活性作用を有することがより好ましい。
【００１９】
８． アセトンに不溶で、水又はアルコール（メタノール、エタノール、イソプロパノール等）に可溶である上記新規物質、又はα−アミラーゼ阻害剤。
前記アルコール抽出物の形態であっても、この新規物質を含む限り、またα−アミラーゼ阻害活性作用を示す限りこの発明の中に含まれる。
【００２０】
９． 上記新規物質、又はα−アミラーゼ阻害剤を有効成分として含有することに特徴を有する糖尿病或いは肥満の予防、治療及び／又は改善薬。
【００２１】
10． 上記新規物質、又はα−アミラーゼ阻害剤を含有することに特徴を有する飲食品（健康食品等）。
【００２２】
11．コレウスフォルスコリから、水又はアルコールに可溶で、α−アミラーゼ阻害活性、α−グルコシダーゼ阻害活性及びリパーゼ阻害活性の少なくとも一の阻害活性作用を示す化合物を含む物質を分離することに特徴を有するα−アミラーゼ阻害活性、α−グルコシダーゼ阻害活性及び／又はリパーゼ阻害活性物質、又はα−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ及び／又はリパーゼ阻害剤の製造方法。
この場合、複数の阻害活性を含む物質、特に好ましくは複数の阻害活性を有する化合物を含む物質を、高純度に分離することができる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明の新規物質は、従来コレウスフォルスコリの主たる生理活性物質とされていたフォルスコリン（Forskolin）とは、全く異なる成分であり、フォルスコリンには認められないα−アミラーゼ阻害活性作用を有する。即ち、フォルスコリンを抽出した残渣のコレウスフォルスコリから本発明の物質を抽出することができるので、インドや日本で利用されているフォルスコリンの製造に際し、新たなる高付加価値物質が創成されることとなり、産業上の利点は大きい。
【００２４】
この新規物質は水、メタノール、エタノールで、植物コレウスフォルスコリから抽出され、更に疎水性吸着剤、例えば三菱化学（株）製ダイヤイオン「Ｈｐ−２０」等で精製し、高速液体クロマトグラフィーにて処理すると、α−アミラーゼ阻害活性が強く認められる分画を確認することができる。
【００２５】
この物質は、前述の如く前記α−アミラーゼ阻害活性作用を示す化合物を純品で又は高純度に含むこともできるし、高度に濃縮された形態で含むこともできる。好ましくは、このような物質においてα−グルコシダーゼ阻害活性作用や、リパーゼ阻害活性作用をも有する物質であり、最も好ましくは、純品又は高純度のα−アミラーゼ阻害活性作用を示す化合物の形態で、かつα−グルコシダーゼ阻害活性作用及び／又はリパーゼ阻害活性作用をも有する化合物の形態で存在する物質である。
【００２６】
本発明には、その一つ形態或いは他の別の形態として、このような物質を含有することに特徴を有するα−アミラーゼ阻害剤、或いは当該物質を前記の如く製造する方法に特徴を有するα−アミラーゼ阻害剤の製造方法が含まれる。
【００２７】
本発明の新規物質或いはα−アミラーゼ阻害剤を製造するための原料としてコレウスフォルスコリを使用することができるが、これはネパール、インド地方に自生するシソ科の植物 Coleus forskohlii であり、この植物から抽出するのが簡便である。同じ物質を含む別の植物から製造することもできるし、また別途合成する方法も考えられる。
【００２８】
本発明の新規物質或いはα−アミラーゼ阻害剤は、下記の性状を有している：
ニンヒドリン反応陽性（アミノ基及びカルボキシル基を末端に有する）；
紫外部吸収は２５０ｎｍを極大とする、
フェーリング反応陽性かつアンモニア性硝酸銀を還元して銀を析出する（還元糖分子を有する）；
６０℃で２０分の加熱処理でα−アミラーゼ阻害活性は消失しない；
蛋白分解酵素であるトリプシンによるカゼインの加水分解を阻害しない；及び
分子量は１０，０００以下である。
【００２９】
本発明の、α−アミラーゼ阻害活性物質は、糖尿病或いは肥満の予防、治療、改善効果等好ましい作用を有し、かつ後述の試験から明らかな如く、安全性に優れているので、医薬品或いは飲食品として利用することができる。
【００３０】
ラットを用いたデンプン負荷試験の結果（図５及び６参照。）では、本発明のα−アミラーゼ阻害活性物質或いはα−アミラーゼ阻害剤により血糖の上昇が抑制される傾向が明らかとなった。この結果、抗肥満、抗糖尿病を目的とする医薬品又は健康食品への使用が期待できる。
【００３１】
本発明のα−アミラーゼ阻害活性物質或いはα−アミラーゼ阻害剤を投与することにより、体重の減少、体脂肪率の減少が明確に認められ、肥満の予防、治療若しくは改善に対する有効性が確認された。
【００３２】
本発明のα−アミラーゼ阻害活性物質或いはα−アミラーゼ阻害剤は、植物コレウスフォルスコリから容易に分離することができ、α−アミラーゼ阻害活性作用を有する物質であり、その製造は特に困難は無く例えば、従来フォルスコリンを抽出した残渣（アセトンに不溶）から、水或いはアルコールで容易に抽出、分離することができる。コレウスフォルスコリ根部粉末から本発明の目的物質を抽出するのが簡便である。
【００３３】
また、アセトン抽出残渣からではなく、コレウスフォルスコリから直接アルコール抽出物をそのまま本発明品（本発明の物質若しくはα−アミラーゼ阻害活性物質、又はα−アミラーゼ阻害剤）として使用することもできる。
【００３４】
このようにして得られるアルコール抽出物（本発明の新規物質を含有する）を、更に精製することなくそのまま、α−アミラーゼ阻害剤として、またそれを含み、又は使用して健康食品等の飲食品に使用することもできるし、他の飲食品に配合して使用することもできる。
【００３５】
本発明のα−アミラーゼ阻害活性作用を示す化合物を含む物質は、好ましくはα−グルコシダーゼ阻害活性作用及び／又はリパーゼ阻害活性作用を有しており、前記各種の用途としてより好ましく利用される。
【００３６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。
【００３７】
（実施例１）フォルスコリンとα−アミラーゼ阻害活性物質の分別採取
コレウスフォルスコリ根部（粉末）からアセトン抽出を行った。コレウスフォルスコリ根部（粉末）３００ｇにアセトン９００ｍｌを加えて、室温で７時間攪拌を行った。得られたアセトン溶液を濾過後、濾液を減圧濃縮後乾燥してアセトン抽出乾燥末６．５ｇ（アセトン抽出物）を得た。一方、濾過残渣を減圧乾燥し、乾燥粉末２５５ｇ（アセトン抽出残渣）を得た。
【００３８】
上記に得られたアセトン抽出残渣２５５ｇにエタノール６００ｍｌを加えて、室温で７時間攪拌を行った。濾過後、濾液について減圧濃縮後、減圧乾燥を行い、エタノール抽出末２０ｇ（エタノール抽出物）を得た。
【００３９】
前記エタノール抽出物５ｇを１０ｍｌの水に溶解し、（三菱化学（株）製、疎水性吸着樹脂、ダイヤイオン「Ｈｐ−２０」により５０ｍｌのカラムに通液し７５ｍｌの水で水洗した後、８０％メタノール１００ｍｌを用いてカラムより溶出せしめた。溶出液を濃縮後、減圧乾固したところ、３００ｍｇの褐色粉末（「コレウスＡＩ分画物」と称する。）を得た。この粉末は、α−アミラーゼ活性を阻害した。
【００４０】
尚、α−アミラーゼ阻害活性の有無はアミラーゼのデンプン分解反応の阻害による検出法により確認された。
【００４１】
アセトン抽出物とエタノール抽出物をシリカゲル薄層クロマトグラフィーにて展開し比較したところ、アセトン抽出物には、フォルスコリンが存在するのに対してエタノール抽出物には、フォルスコリンは存在しなかった。更に、α−アミラーゼ阻害活性を調べたところ、アセトン抽出物にはα−アミラーゼ阻害活性作用が認められなかったが、エタノール抽出物には強いα−アミラーゼ阻害活性作用が認められた。
【００４２】
前記コレウスＡＩ分画物について高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製し、下記のように成分の分画と活性部分の同定を行った。
【００４３】
展開条件；０．１％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液の１００／０，９５／５，９０／１０，８０／２０，６０／４０，２０／８０，０／１００の混合比におけるステップワイズ溶出を行った。その結果を図１に示す。
【００４５】
図１に得られたピークのうち分画Ｅのみα−アミラーゼ阻害活性作用を示した。
【００４６】
（α−アミラーゼ阻害活性物質の性状）
α−アミラーゼ阻害活性物質についてその性状を調べたところ以下の結果となった。
【００４７】
1)ニンヒドリン反応：陽性（アミノ基及びカルボキシル基を末端に有する）；
紫外部吸収：２５０ｎｍに極大；
2)フェーリング反応：陽性かつアンモニア性硝酸銀を還元して銀を析出する（還元糖分子を有する）；
3)６０℃で２０分の加熱処理でα−アミラーゼ阻害活性は消失しない；及び
4)蛋白分解酵素であるトリプシンによるカゼインの加水分解を阻害しない。
【００４８】
フォルスコリン（和光純薬工業（株）製）とα−アミラーゼ阻害活性物質（前記精製品）についての高速液体クロマトグラフィーを行った。
【００４９】
サンプル調製；コレウスＡＩ分画物は３０ｍｇを、フォルスコリンは１０ｍｇを、１ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／アセトニトリル＝４０／６０に溶解し、各々３μｌをチャージした。
【００５１】
展開条件；０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／アセトニトリル＝４０／６０、流速；１ｍｌ／分、検出；紫外部吸収：２２０ｍｍ。
【００５２】
図２（α−アミラーゼ阻害活性物質）及び図３（フォルスコリン）に見られるようにフォルスコリンの液体クロマトグラフィーのピークは、本発明で見出されたα−アミラーゼ阻害活性物質のピークとリテンションタイムが全く異なり、しかもα−アミラーゼ阻害活性物質の抽出精製分画には、フォルスコリンのピークは全く存在せず、展開溶媒を替えても、同様の傾向が認められた。この結果より、α−アミラーゼ阻害活性に焦点を合わせた、コレウスフォルスコリからのエタノール抽出物中にはフォルスコリンは存在せず、前記図１において特定した分画中に存在するα−アミラーゼ阻害活性物質が主たる生理活性を発現していることが分かる。
【００５３】
目的とするピークの画分を、この分野で各種の精製手段として知られている方法（常法、慣用法等）を利用し又は組み合わせて分離することにより目的とする阻害活性作用を有する化合物、或いはこの化合物がより精製された形態で含まれる物質を得ることができる。
【００５４】
（フォルスコリンとコレウス由来α−アミラーゼ阻害活性物質[α−ＡＩ]の性状の比較）
【００５５】
＊２ 疎水性吸着樹脂、ロームアンドハース社製アンバーライト
＊３ 強酸性イオン交換樹脂、三菱化学（株）製ダイヤイオン
＊４ 強塩基性イオン交換樹脂、三菱化学（株）製ダイヤイオン
＊５ 弱酸性イオン交換樹脂、三菱化学（株）製ダイヤイオン
＊６ 弱塩基性イオン交換樹脂、三菱化学（株）製ダイヤイオン
【００５６】
検出方法：フォルスコリンは薄層クロマトクラマトグラフィー、α−ＡＩはアミラーゼのデンプン分解反応の阻害で検出した。
【００５７】
（分子量の測定）
コレウスＡＩ分画物について分子量分布を求めた。
東ソー（株）製シリカ系ゲル濾過剤 TSKgel G3000SWXLカラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により分子量分布を測定した。結果を下記の表に示す。
【００５８】
以上の結果から、本発明の新規物質の分子量は10,000以下であることが分かった。
【００６０】
（安全性試験）
本発明の新規物質を含有する、コレウスフォルスコリのコレウスＡＩ分画物を、ｄｄｙ系マウス雄（体重２２−２４ｇ）に経口投与し、７２時間飼育観察した結果、６００〜２０００ｍｇ／ｋｇの投与において全例が生存し、一般行動観察及び腹腔内の解剖所見も正常であった。従って、安全性に優れた物質でることが確かめられた。
【００６１】
（アミラーゼ阻害活性試験）
本発明の物質について試験管内のアミラーゼ活性に及ぼす作用を調べた。
基質緩衝液０．５ｍｌにアミラーゼ（和光純薬工業（株）製１ｍｇ／ｍｌ濃度；枯草菌製）０．０１ｍｌ及び試料（コレウスＡＩ分画物を２００ｍＭ燐酸緩衝液ｐＨ７．０に溶解、最終濃度０．２５、２．５、５ｍｇ／ｍｌになるように調整。）０．５ｍｌを添加して、３７℃で７．５分間反応をさせた後、発色試液（アミラーゼ測定キット（アミラーゼ−テストワコー）の発色液を使用。）０．５ｍｌと水２．０ｍｌを加え、よく混合して波長６６０ｎｍで吸光度を測定する。結果を図４に示した。
【００６２】
（デンプン負荷試験）
ラットを用いたデンプン負荷試験を実施し、デンプン負荷後の血中グルコース及びインスリンの変化を測定した。デンプン投与後のラット血液中のグルコース及びインスリン含量に及ぼす本発明の物質（コレウスＡＩ分画物）の影響を図５及び６に示した。
【００６３】
以上の結果から、本発明の物質を投与した群では、６０分及び１２０分後の血中グルコース濃度は非投与群に比べて低値を示し、本発明のα−アミラーゼ阻害活性物質によりデンプンの消化吸収を阻害することによる、炭水化物の体内取り込みが抑制され血糖の上昇が抑制される傾向が明らかとなった。この結果、抗肥満、抗糖尿病を目的とする医薬品又は健康食品への使用が期待できる。
【００６４】
（α−グルコシダーゼ阻害活性試験）
次に、α−グルコシダーゼ阻害活性試験を行った結果を示す。試料の調製及び試験法については下記の通り行った。
【００６５】
酵素にはα−グルコシダーゼ（酵母製、和光純薬工業）を使用し、その１００Ｕを０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．５）にて５０ｍｌに溶解した（酵素液）。
基質にはｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド、３８ｍｇを上記酢酸緩衝液１００ｍｌ（１．２ｍＭ）に調整した（基質溶液）。
被試験物の阻害物には、試料としてコレウスエキス末（前記コレウスＡＩ分画物使用）、桑の葉エキス末及び大麦抽出物を用い、上記酢酸緩衝液に各試料を溶解し、それぞれ１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ及び０．２５ｍｇ／ｍｌの溶液を調製した（試料溶液）。
【００６６】
酵素反応を下記の通り行い、各試料についての阻害活性度を測定した。
（第１段階）
酵素液１ｍｌに試料（阻害物）溶液１ｍｌを加えて、３５℃で１０分間反応を行う。
（第２段階）
第１段階で得られた溶液に２ｍｌの基質溶液を加え、３５℃で１５分間反応を行う。
（第３段階）
α−グルコシダーゼの作用による反応性生物であるニトロフェノールの量を、４０５ｎｍの吸光度の測定により計算した。
【００６７】
（測定結果）
以上のα−グルコシダーゼ阻害活性試験の結果、試料（阻害物）１ｍｇ／ｍｌの濃度でコレウスＡＩ分画物９３％、桑の葉エキス末９５％及び大麦抽出物１３％であった。更に、コレウスＡＩ分画物は、α−グルコシダーゼの活性を容量依存的に阻害することが確認された。即ち、１ｍｇ／ｍｌ：９３％；０．５ｍｇ／ｍｌ：２８％；及び０．２５ｍｇ／ｍｌ：７％であった。
【００６８】
この結果から、本発明の物質はα−グルコシダーゼ阻害活性作用を有していることが理解される。
桑の葉からの抽出物に関し、その有効成分（α−グルコシダーゼ阻害活性成分）は、グルコースの類似構造物質である１−デオキシノジリマイシンであり、その構造から推定してその阻害様式は拮抗阻害であると考えられる。
【００６９】
一方、コレウスからのα−グルコシダーゼ阻害活性物質は、その分子量（高速液体クロマトグラフィーのピークからの推定で、分子量：１万以下、１０００以上）から推定して、その阻害様式は非拮抗阻害であると考えられる。従って、上記桑の葉からの抽出物はショ糖、オリゴ糖等の基質が多量に存在すると十分な阻害効果を発揮しない可能性があるのに対し、コレウスからの抽出物は存在する基質の量に関係なく、一定の阻害効果を発揮するものと期待される。
【００７０】
（リパーゼ阻害活性について）
脂質の消化阻害力の測定（日本農芸化学会誌、６７巻、Ｎｏ．１１参照。）に従って、リパーゼ阻害活性試験を行った。被試験試料調製のための酵素については、ブタ膵液リパーゼＴｙｐｅ−II（シグマ社製）を、基質にはトリオレインを、阻害の程度を試験する阻害物には試料として前記コレウスＡＩ分画物を、それぞれ使用した。
【００７１】
試料溶液１）〜３）を下記の通り調製した。
酵素は１６８Ｕ／ｍｌ（０．１Ｍ燐酸緩衝液、ｐＨ＝８．０）の溶液（酵素液）で、基質はエーテル：エタノール＝１：１の混合溶液中１０ｍｇ／ｍｌに調整した溶液（基質溶液）で、被試験物の阻害物には、試料の１％溶液（０．１Ｍ燐酸緩衝液、ｐＨ＝８．０）（試料溶液）で、それぞれ用いた。
【００７２】
１）前記燐酸緩衝液２ｍｌ；
２）酵素液１ｍｌ＋前記燐酸緩衝液１ｍｌ：及び
３）酵素液１ｍｌ＋試料溶液１ｍｌ。
【００７３】
（試験法）
前記１）〜３）を、それぞれ３７℃で１０分間プレインキュベイトする。その後、基質溶液５ｍｌを加えて３７℃で６０分間インキュベイトする。煮沸失活の後、１０ｍｌのエーテル：エタノール＝１：１の混合溶媒で未反応基質を抽出し、反応物を１／１００Ｎ−ＫＯＨでｐＨ＝９．０を終点として滴定する。
【００７４】
（阻害活性の測定と測定値）
使用した酵素の５０％を阻害する阻害物（試料）の重量（ｍｇ）を、阻害活性値として求めた。コレウスＡＩ分画物のリパーゼ阻害活性は、６７１Ｕ／ｍｇであった。
以上の結果から、本発明の物質が著しくリパーゼ阻害活性作用を有することが分かる。
【００７５】
（肥満予防、治療、改善効果）
健常ボランティア６名にコレウスＡＩ分画物８０ｍｇを含む２５０ｍｇ三角粒を１日六粒、１４日間にわたり投与したところ２名に体重の減少、４名に体脂肪率の減少が認められ、肥満の予防、治療若しくは改善に対する有効性が認められた。本発明のα−アミラーゼ阻害活性物質には肥満の予防、治療、改善効果が認められた。
【００７６】
（実施例２）コレウスフォルスコリα−アミラーゼ阻害活性物質の製造
コレウスフォルスコリ根部（粉末）３０ｋｇにエタノールを４５Ｌ添加して室温で６時間攪拌し抽出を行った。抽出液について吸引濾過を行い、濾液（エタノール抽出液）３４Ｌを得た。これを減圧濃縮して、減圧乾固することにより乾燥粉末（エタノール抽出物）２５８０ｇを得た。このようにして得られるエタノール抽出物を健康食品、或いは健康食品に添加して使用することができる。
【００７７】
【発明の効果】
本発明により、糖尿病或いは肥満の予防、治療及び／又は改善に有用な新規α−アミラーゼ阻害活性物質或いはαーアミラーゼ阻害剤を提供することができる。この物質（或いはα−アミラーゼ阻害剤）は、好ましくはα−グルコシダーゼ阻害活性作用及び／又はリパーゼ阻害活性作用をも有し、この物質（或いはα−アミラーゼ阻害剤）を有効成分として含有し又は使用することで、糖尿病或いは肥満の予防、治療及び／又は改善薬並びにそれ等の効果を有する飲食品（健康食品等）、又はそのための成分を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＨＰＬＣによるα−アミラーゼ阻害活性物質の精製結果を示す図である。ピークNo.、時間及び面積比率の関係は下記の通りである。
【図５】図５は、α−アミラーゼ阻害活性物質によるグルコース含量に及ぼす影響を示す図である。
【図６】図６は、α−アミラーゼ阻害活性物質によるインスリン含量に対する影響を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel α-amylase inhibitory active substance obtainable from Coleus forskori, a novel α-amylase inhibitor and a method for producing the same, and the novel substance or novel α-amylase inhibitor has an effect of suppressing an increase in blood glucose. And preferably has α-glucosidase inhibitory activity and lipase inhibitory activity, and is effective for prevention, treatment, improvement, etc. of hyperglycemia or obesity. The present invention also relates to these applications.
[0002]
[Prior art]
Obesity is a risk factor for many diseases such as ischemic heart disease, hypertension, diabetes, etc. About 30 to 60% of 33 million people with hypertension, 20 million people with hyperlipidemia, and 6.9 million people with diabetes, The Japanese Society of Obesity estimated that obesity is the cause. Furthermore, obesity in Japan has increased 2 to 4 times over the last 30 years, and is a major factor threatening the health of the people. In the future, as aging progresses, lifestyle-related diseases are considered to increase more and more, and prevention of obesity is becoming an important issue to be overcome not only from the health aspect but also from the social and economic aspects.
[0003]
Over 90% of obesity is caused by an excess of energy intake relative to energy consumed, which is called simple obesity. To prevent this, there are 1) suppression of intake energy and 2) promotion of energy consumption.
[0004]
As for 1), there are methods such as diet restriction, administration of an appetite suppressant, suppression of absorption by adsorption of lipids and the like in the digestive tract, formation of satiety due to indigestible dietary fiber, administration of digestive enzyme inhibitors and the like.
[0005]
Regarding 2), there are exercise therapy, administration of energy metabolism promoters, and the like.
[0006]
Coleus forskori has traditionally been eaten in the form of pickles as a health food that has been expected to have a cardiotonic and strong drug effect in India. Further, in the field of drug development in recent years, a blood pressure-lowering drug (refer to Japanese Patent Laid-Open No. 63-10783) regarding forskolin, a diterpene compound for increasing intracellular cAMP concentration, discovered by Baht in 1977. ), And as a gray hair preventive agent (see JP-A-4-124122 and JP-A-4-360836). Furthermore, since the intracellular lipid metabolism increases with the increase of cAMP for this substance, the obesity-preventing action (improvement of lipid metabolism) (see Biochemical and Biophysical Research Comm., Vol. 107 (1982), p157-164). Research is also underway.
[0007]
At present, forskolin is extracted and purified from the root of Coleus forskori to produce health foods for preventing obesity and quasi-drugs for promoting hair growth, and the products are on the market. Forskolin is a compound that is insoluble in water and soluble in acetone, chloroform, benzene, and the like, and is usually extracted from root powder with acetone and purified using the above hydrophobic solvent.
[0008]
Under such circumstances, there has been a demand for the development of more excellent drugs that can improve hyperglycemia or prevent obesity, particularly drugs that can be taken orally, and foods and drinks.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
The object of the present invention is to develop excellent foods and beverages that can prevent, treat and / or ameliorate hyperglycemia or obesity, in particular health foods, drugs, or components usable in them.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies aimed at solving the above-mentioned problems, the present inventors have completely different components from Coleus forskori to forskolin that has been conventionally regarded as the main physiologically active substance of coleus forskori. A novel substance (hereinafter also referred to as “substance of the present invention” or “α-amylase inhibitory active substance”) containing a compound that exhibits an α-amylase inhibitory activity that is not recognized was found. Furthermore, this α-amylase inhibitory active substance has an action of suppressing an increase in blood glucose, and it has been found that it is effective in the prevention, treatment, improvement and the like of diabetes and obesity, and the present invention is based on these findings. It came to be completed.
[0011]
This substance can contain the compound showing the α-amylase inhibitory activity in a pure product or in a high purity, or in a highly concentrated form. Preferably, it has also been found to have an α-glucosidase inhibitory activity and a lipase inhibitory activity.
[0012]
That is, the present invention includes the following contents as various forms thereof.
(1) A method for producing an extract having an α-amylase inhibitory activity, characterized in that it is separated from the residual Coleus forskori extracted from forskolin using water, alcohol or a mixture thereof.
(2) The method according to (1), wherein the extract having an α-amylase inhibitory activity has an α-glucosidase inhibitory activity and / or a lipase inhibitory activity.
(3) The method according to (1) or (2), wherein the Coleus forskori is a root of Coleus forskori.
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the alcohol is at least one of methanol and ethanol.
(5) The method according to any one of (1) to (4), wherein the extract having an α-amylase inhibitory activity is insoluble in acetone.
(6) An extract of water, alcohol or a mixture thereof, which is isolated from the residue of Foruscholine extracted from Coleus forskori and has an α-amylase inhibitory activity.
(7) The extract according to (6), which has an α-glucosidase inhibitory activity and / or a lipase inhibitory activity.
(8) The extract according to (6) or (7), which is insoluble in acetone and soluble in water or alcohol.
(9) A food or drink comprising the extract according to any one of (6) to (8).
(10) The food or drink according to (9), which is a health food.
The present invention also includes the following forms.As the Coleus forskori, the residue Coleus forskori extracted from forskolin is selected.
1. Production of α-amylase inhibitory active substance or α-amylase inhibitor characterized by separating a substance containing a compound soluble in water or alcohol and having (having) α-amylase inhibitory activity from Coleus forskori Method.
[0013]
2. The said manufacturing method with which the substance containing the compound which shows an alpha-amylase inhibitory activity action has an alpha-glucosidase inhibitory activity action and / or a lipase inhibitory activity action.
Particularly preferably, the compound having an α-amylase inhibitory activity has the α-glucosidase inhibitory activity and / or the lipase inhibitory activity.
[0014]
3. The above-mentioned production method using the root of Coleus forskori, preferably its powder, as Coleus forskori.
[0015]
4). The said manufacturing method whose alcohol is at least 1 sort (s) of methanol and ethanol.
[0016]
5. The said manufacturing method whose substance containing the compound which shows alpha-amylase inhibitory activity action is insoluble in acetone.
The substance of the present invention, particularly the substance of the present invention (or the substance or α-amylase inhibitor produced in the present invention) is, as one form, insoluble in acetone and thus soluble in alcohol from Coleus forskori. Substances are included. Therefore, not only a high-purity α-amylase inhibitory active substance but also an unpurified alcohol extract (from Coleus forskori) containing it is included in the substance or α-amylase inhibitor produced in the present invention, The active ingredient compound itself and the substance containing the compound correspond to the substance of the present invention or the α-amylase inhibitor of the present invention. Of course, this compound or this substance particularly preferably further has an α-glucosidase inhibitory activity and / or a lipase inhibitory activity.
[0017]
6). A novel substance or an α-amylase inhibitor that can be separated from Coleus forskori and has an α-amylase inhibitory activity.
Even the form of the compound having such an inhibitory activity may be a form containing the compound in a highly purified or concentrated state.
[0018]
7). Furthermore, the said substance which has an alpha-glucosidase inhibitory activity action and / or a lipase inhibitory activity action, or alpha-amylase inhibitor.
In this case, it is more preferable that a compound having an α-amylase inhibitory activity action is included, and that the compound has an α-glucosidase inhibitory activity action and / or a lipase inhibitory activity action.
[0019]
8). The novel substance or α-amylase inhibitor which is insoluble in acetone and soluble in water or alcohol (methanol, ethanol, isopropanol, etc.).
Even the form of the alcohol extract is included in the present invention as long as the novel substance is contained and as long as it exhibits an α-amylase inhibitory activity.
[0020]
9. A preventive, therapeutic and / or ameliorating agent for diabetes or obesity characterized by containing the above novel substance or α-amylase inhibitor as an active ingredient.
[0021]
Ten. Food / beverage products (health food, etc.) characterized by containing the above-mentioned novel substance or α-amylase inhibitor.
[0022]
11． Α is characterized in that a substance containing a compound that is soluble in water or alcohol and exhibits at least one inhibitory activity of α-amylase inhibitory activity, α-glucosidase inhibitory activity, and lipase inhibitory activity is isolated from Coleus forskori -Method for producing amylase inhibitory activity, α-glucosidase inhibitory activity and / or lipase inhibitory active substance, or α-amylase, α-glucosidase and / or lipase inhibitor.
In this case, a substance containing a plurality of inhibitory activities, particularly preferably a substance containing a compound having a plurality of inhibitory activities, can be separated with high purity.
[0023]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Embodiments of the present invention will be described below.
The novel substance of the present invention is a completely different component from Forskolin, which has been conventionally regarded as the main physiologically active substance of Coleus forskori, and has an α-amylase inhibitory activity not found in forskolin. That is, since the substance of the present invention can be extracted from the residual Coleus forskori extracted from forskolin, a new high value-added substance will be created in the production of forskolin used in India and Japan. Thus, the industrial advantage is great.
[0024]
This new substance is extracted from plant Coleus forskori with water, methanol and ethanol, and further purified with a hydrophobic adsorbent, such as Diaion “Hp-20” manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation, and subjected to high performance liquid chromatography. When treated, a fraction in which α-amylase inhibitory activity is strongly observed can be confirmed.
[0025]
As described above, this substance can contain the compound exhibiting the α-amylase inhibitory activity as a pure product or with a high purity, or in a highly concentrated form. Preferably, it is a substance that also has an α-glucosidase inhibitory activity and a lipase inhibitory activity in such a substance, and most preferably in the form of a pure product or a compound that exhibits a high-purity α-amylase inhibitory activity, In addition, it is a substance that exists in the form of a compound having an α-glucosidase inhibitory activity and / or a lipase inhibitory activity.
[0026]
The present invention includes, as one form thereof or another form thereof, an α-amylase inhibitor characterized by containing such a substance, or a method characterized by producing the substance as described above. -Methods for producing amylase inhibitors are included.
[0027]
Coleus forskohlii can be used as a raw material for producing the novel substance or α-amylase inhibitor of the present invention, and this is a Labiatae plant Coleus forskohlii that grows naturally in Nepal and India. It is easy to extract. It can be produced from another plant containing the same substance, or a method of synthesizing it separately is conceivable.
[0028]
The novel substance or α-amylase inhibitor of the present invention has the following properties:
Ninhydrin positive (having an amino group and a carboxyl group at the end);
Ultraviolet absorption is maximized at 250 nm,
Positive Ferring reaction and reduction of ammoniacal silver nitrate to precipitate silver (having reducing sugar molecules);
Α-amylase inhibitory activity is not lost by heat treatment at 60 ° C. for 20 minutes;
Does not inhibit the hydrolysis of casein by the proteolytic enzyme trypsin; and
The molecular weight is 10,000 or less.
[0029]
The α-amylase-inhibiting active substance of the present invention has preferable actions such as prevention, treatment and improvement of diabetes or obesity, and is excellent in safety as will be apparent from the test described below. Can be used as
[0030]
From the results of the starch load test using rats (see FIGS. 5 and 6), it was revealed that the increase in blood glucose was suppressed by the α-amylase inhibitory active substance or α-amylase inhibitor of the present invention. As a result, it can be expected to be used for pharmaceuticals or health foods intended for anti-obesity and anti-diabetes.
[0031]
By administering the α-amylase inhibitory active substance or α-amylase inhibitor of the present invention, a decrease in body weight and a decrease in body fat percentage were clearly recognized, and the effectiveness for the prevention, treatment or improvement of obesity was confirmed. .
[0032]
The α-amylase inhibitory active substance or α-amylase inhibitor of the present invention is a substance that can be easily separated from plant Coleus forskori and has an α-amylase inhibitory activity, and its production is not particularly difficult. In addition, it can be easily extracted and separated with water or alcohol from a residue obtained by conventional extraction of forskolin (insoluble in acetone). It is convenient to extract the target substance of the present invention from Coleus forskori root powder.
[0033]
In addition, alcohol extract directly from Coleus forskori can be used as it is as a product of the present invention (a substance of the present invention, an α-amylase inhibitory active substance, or an α-amylase inhibitor).
[0034]
The alcohol extract thus obtained (containing the novel substance of the present invention) can be used as it is as an α-amylase inhibitor without any further purification, and it can be used as a food or drink such as health food. It can also be used for other foods and drinks.
[0035]
The substance containing a compound exhibiting an α-amylase inhibitory activity of the present invention preferably has an α-glucosidase inhibitory activity and / or a lipase inhibitory activity, and is more preferably used for the various uses described above.
[0036]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
[0037]
(Example 1) Separate collection of forskolin and α-amylase inhibitory active substance
Acetone extraction was performed from the root of Coleus forskori (powder). To 300 g of Coleus forskori root (powder), 900 ml of acetone was added and stirred at room temperature for 7 hours. The obtained acetone solution was filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure and dried to obtain 6.5 g (acetone extract) of the powder after acetone extraction. On the other hand, the filtration residue was dried under reduced pressure to obtain 255 g of dry powder (acetone extraction residue).
[0038]
600 ml of ethanol was added to 255 g of the acetone extraction residue obtained above, and the mixture was stirred at room temperature for 7 hours. After filtration, the filtrate was concentrated under reduced pressure and dried under reduced pressure to obtain 20 g (ethanol extract) of an ethanol extract powder.
[0039]
5 g of the ethanol extract was dissolved in 10 ml of water, passed through a 50 ml column (hydrophobic adsorption resin, Diaion “Hp-20”, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), washed with 75 ml of water, and then washed with 80 ml. The eluate was concentrated and then dried under reduced pressure to obtain 300 mg of a brown powder (referred to as “Coleus AI fraction”). Inhibited amylase activity.
[0040]
The presence or absence of α-amylase inhibitory activity was confirmed by a detection method based on inhibition of amylase starch degradation reaction.
[0041]
When the acetone extract and the ethanol extract were developed by silica gel thin layer chromatography and compared, forskolin was present in the acetone extract, whereas forskolin was not present in the ethanol extract. Furthermore, when the α-amylase inhibitory activity was examined, the acetone extract showed no α-amylase inhibitory activity, but the ethanol extract showed a strong α-amylase inhibitory activity.
[0042]
The Coleus AI fraction was purified using high performance liquid chromatography (HPLC), and the components were fractionated and the active portion was identified as follows.
[0043]
Development conditions: 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution and 0.1% trifluoroacetic
[0045]
Of the peaks obtained in FIG. 1, only the fraction E showed an α-amylase inhibitory activity.
[0046]
(Properties of α-amylase inhibitory active substance)
When the properties of the α-amylase inhibitory active substance were examined, the following results were obtained.
[0047]
1) Ninhydrin reaction: Positive (having an amino group and a carboxyl group at the end);
UV absorption: maximum at 250 nm;
2) Ferring reaction: positive and ammoniacal silver nitrate is reduced to precipitate silver (having reducing sugar molecules);
3) α-amylase inhibitory activity is not lost by heat treatment at 60 ° C. for 20 minutes; and
4) Does not inhibit the hydrolysis of casein by trypsin, a proteolytic enzyme.
[0048]
Forskolin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and α-amylase inhibitory active substance (the purified product) were subjected to high performance liquid chromatography.
[0049]
Sample preparation: 30 mg of Coleus AI fraction and 10 mg of forskolin were dissolved in 1 ml of 0.1% aqueous trifluoroacetic acid / acetonitrile = 40/60, and each 3 μl was charged.
[0051]
Development conditions: 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution / acetonitrile = 40/60, flow rate: 1 ml / min, detection; ultraviolet absorption: 220 mm.
[0052]
As shown in FIG. 2 (α-amylase inhibitory active substance) and FIG. 3 (forskolin), the forskolin liquid chromatography peak shows the peak of α-amylase inhibitory active substance found in the present invention and the retention time. Are completely different, and the forskolin peak does not exist at all in the extracted and purified fraction of the α-amylase inhibitory active substance, and the same tendency was observed even when the developing solvent was changed. From this result, there was no forskolin in the ethanol extract from Coleus forskori focusing on the α-amylase inhibitory activity, and the α-amylase inhibitory activity present in the fraction specified in FIG. It can be seen that the substance expresses the main physiological activity.
[0053]
A compound having a target inhibitory activity by separating a target peak fraction by utilizing or combining methods known in the art as various purification means (ordinary method, conventional method, etc.), Alternatively, a substance containing this compound in a more purified form can be obtained.
[0054]
(Comparison of properties of forskolin and coleus-derived α-amylase inhibitory active substance [α-AI])
[0055]
* 2 Hydrophobic adsorption resin, Amberlite manufactured by Rohm and Haas
* 3 Strongly acidic ion exchange resin, Diaion manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation
* 4 Strongly basic ion exchange resin, Diaion manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation
* 5 Weakly acidic ion-exchange resin, Diaion manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation
* 6 Weakly basic ion exchange resin, Diaion manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation
[0056]
Detection method: Forskolin was detected by thin-layer chromatography, and α-AI was detected by inhibiting amylase starch degradation reaction.
[0057]
(Measurement of molecular weight)
The molecular weight distribution was determined for the Coleus AI fraction.
Tosoh Corporation Silica Gel Filter TSKgel G3000SWXLThe molecular weight distribution was measured by size exclusion chromatography (SEC) using a column. The results are shown in the table below.
[0058]
From the above results, it was found that the molecular weight of the novel substance of the present invention was 10,000 or less.
[0060]
(Safety test)
A Coleus forskori coleus AI fraction containing the novel substance of the present invention was orally administered to male ddy mice (body weight 22-24 g), and was reared and observed for 72 hours. As a result, administration at 600 to 2000 mg / kg All cases survived, and general behavioral observation and anatomical findings in the abdominal cavity were normal. Therefore, it was confirmed that the substance was excellent in safety.
[0061]
(Amylase inhibitory activity test)
The effect of the substance of the present invention on amylase activity in a test tube was examined.
0.01 ml of amylase (1 mg / ml concentration manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd .; manufactured by Bacillus subtilis) and a sample (Coleus AI fraction were dissolved in 200 mM phosphate buffer pH 7.0 in a final buffer concentration of 0.5 ml of substrate buffer. 0.25, 2.5, adjusted to 5 mg / ml.) After adding 0.5 ml and reacting at 37 ° C. for 7.5 minutes, a color reagent (amylase assay kit (Amylase-Test Wako ) Using 0.5 ml and 2.0 ml of water, mix well and measure the absorbance at a wavelength of 660 nm. The results are shown in FIG.
[0062]
(Starch load test)
A starch tolerance test using rats was performed to measure changes in blood glucose and insulin after starch loading. The influence of the substance of the present invention (Coleus AI fraction) on the glucose and insulin contents in rat blood after starch administration is shown in FIGS.
[0063]
From the above results, in the group to which the substance of the present invention was administered, the blood glucose concentration after 60 minutes and 120 minutes was lower than that in the non-administered group. Inhibition of digestion and absorption tended to suppress the uptake of carbohydrates and suppress the increase in blood sugar. As a result, it can be expected to be used for pharmaceuticals or health foods intended for anti-obesity and anti-diabetes.
[0064]
(Α-glucosidase inhibitory activity test)
Next, the results of an α-glucosidase inhibitory activity test are shown. The sample preparation and test method were as follows.
[0065]
Α-Glucosidase (manufactured by Yeast, Wako Pure Chemical Industries) was used as the enzyme, and 100 U was dissolved in 50 ml with 0.05 M acetic acid buffer (pH = 5.5) (enzyme solution).
As a substrate, 38 mg of p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside was adjusted to 100 ml (1.2 mM) of the above acetate buffer (substrate solution).
For the inhibitor of the test substance, Coleus extract powder (using the Coleus AI fraction), mulberry leaf extract powder and barley extract were used as samples. Solutions of ml, 0.5 mg / ml and 0.25 mg / ml were prepared (sample solution).
[0066]
The enzyme reaction was performed as follows, and the inhibitory activity for each sample was measured.
(First stage)
Add 1 ml of sample (inhibitor) solution to 1 ml of enzyme solution and react at 35 ° C. for 10 minutes.
(Second stage)
2 ml of the substrate solution is added to the solution obtained in the first stage, and the reaction is carried out at 35 ° C. for 15 minutes.
(3rd stage)
The amount of nitrophenol, which is a reactive organism due to the action of α-glucosidase, was calculated by measuring the absorbance at 405 nm.
[0067]
(Measurement result)
As a result of the above α-glucosidase inhibitory activity test, the concentration of the sample (inhibitor) at 1 mg / ml was Coleus AI fraction 93%, mulberry leaf extract powder 95%, and barley extract 13%. Furthermore, it was confirmed that the Coleus AI fraction inhibits the activity of α-glucosidase in a dose-dependent manner. That is, 1 mg / ml: 93%; 0.5 mg / ml: 28%; and 0.25 mg / ml: 7%.
[0068]
From this result, it is understood that the substance of the present invention has an α-glucosidase inhibitory activity.
Regarding the extract from mulberry leaves, its active ingredient (α-glucosidase inhibitory active ingredient) is 1-deoxynojirimycin, which is a similar structural substance of glucose. It is believed that there is.
[0069]
On the other hand, the α-glucosidase inhibitory active substance from Coleus is estimated from its molecular weight (estimated from the peak of high performance liquid chromatography, molecular weight is 10,000 or less, 1000 or more), and its inhibition mode is non-competitive inhibition. it is conceivable that. Therefore, the extract from mulberry leaves may not exhibit a sufficient inhibitory effect when a large amount of a substrate such as sucrose or oligosaccharide is present, whereas the extract from Coleus has an amount of the substrate present. Regardless of, it is expected to exert a certain inhibitory effect.
[0070]
(Lipase inhibitory activity)
A lipase inhibitory activity test was performed according to the measurement of lipid digestion inhibitory activity (see Journal of Japanese Agricultural Chemistry, Vol. 67, No. 11). For the enzyme for preparing the test sample, porcine pancreatic juice lipase Type-II (manufactured by Sigma), triolein as the substrate, and the above-mentioned Coleus AI fraction as a sample for the inhibitor to be tested for the degree of inhibition are used. , Each used.
[0071]
Sample solutions 1) to 3) were prepared as follows.
The enzyme is a solution (enzyme solution) of 168 U / ml (0.1 M phosphate buffer, pH = 8.0), and the substrate is a solution (substrate solution) adjusted to 10 mg / ml in a mixed solution of ether: ethanol = 1: 1. ) And 1% solution of the sample (0.1 M phosphate buffer, pH = 8.0) (sample solution) was used as the inhibitor of the test object.
[0072]
1) 2 ml of the phosphate buffer;
2) 1 ml of enzyme solution + 1 ml of the above phosphate buffer:
3) 1 ml of enzyme solution + 1 ml of sample solution.
[0073]
(Test method)
The above 1) to 3) are each preincubated at 37 ° C. for 10 minutes. Thereafter, 5 ml of the substrate solution is added and incubated at 37 ° C. for 60 minutes. After boiling inactivation, unreacted substrate is extracted with 10 ml of a mixed solvent of ether: ethanol = 1: 1, and the reaction is titrated with 1/100 N-KOH at pH = 9.0.
[0074]
(Measurement and measurement of inhibitory activity)
The weight (mg) of the inhibitor (sample) that inhibits 50% of the enzyme used was determined as the inhibitory activity value. The lipase inhibitory activity of the Coleus AI fraction was 671 U / mg.
From the above results, it can be seen that the substance of the present invention has a lipase inhibitory activity.
[0075]
(Obesity prevention, treatment, improvement effect)
6 healthy volunteers were treated with 250 mg triangular granules containing 80 mg of Coleus AI fraction for 6 days a day, 2 patients lost weight and 4 lost body fat percentage, preventing obesity Efficacy for treatment or improvement was observed. The α-amylase inhibitory active substance of the present invention was found to have an effect of preventing, treating and improving obesity.
[0076]
(Example 2) Production of Coleus forskori α-amylase inhibitory active substance
Extraction was performed by adding 45 L of ethanol to 30 kg of Coleus forskori root (powder) and stirring at room temperature for 6 hours. The extract was subjected to suction filtration to obtain 34 L of a filtrate (ethanol extract). This was concentrated under reduced pressure and dried under reduced pressure to obtain 2580 g of a dry powder (ethanol extract). The ethanol extract thus obtained can be used by being added to health food or health food.
[0077]
【The invention's effect】
According to the present invention, a novel α-amylase inhibitory active substance or α-amylase inhibitor useful for the prevention, treatment and / or improvement of diabetes or obesity can be provided. This substance (or α-amylase inhibitor) preferably also has α-glucosidase inhibitory activity and / or lipase inhibitory activity, and contains or uses this substance (or α-amylase inhibitor) as an active ingredient. By doing so, it is possible to provide a preventive, therapeutic and / or ameliorating agent for diabetes or obesity, and a food or drink (health food, etc.) having such effects, or a component therefor.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the results of purification of an α-amylase inhibitory active substance by HPLC. The relationship between peak number, time and area ratio is as follows.
FIG. 5 is a graph showing the influence of an α-amylase inhibitory active substance on the glucose content.
FIG. 6 is a graph showing the influence of an α-amylase inhibitory active substance on insulin content.
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