JP4780365B2 - MCH receptor antagonist / agonist screening method - Google Patents

Description

（２）［¹²⁵I］-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Phe²]-MCH(2-19)
【化２】

（３）［¹²⁵I］-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Asp³]-MCH(3-19)
【化３】

（４）［¹²⁵I］-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Met⁴]-MCH(4-19)
【化４】

（５）［¹²⁵I］-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Leu⁵]-MCH(5-19)
【化５】

（６）［¹²⁵I］-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Arg⁶]-MCH(6-19)
【化６】

（７）［¹²⁵I］-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Cys⁷]-MCH(7-19)
【化７】

などがあげられる。
なかでも、特に［¹²⁵I］-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Met⁴]-MCH(4-19)が好ましく用いられる。
ＭＣＨもしくはその誘導体の塩としては、上記のＳＬＴ、ＳＬＣ−１およびＭＣＨの塩と同様のものなどがあげられる。
本発明で用いられるＳＬＴおよび／またはＳＬＣ−１の部分ペプチド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある）としては、前記したＳＬＴおよび／またはＳＬＣ−１を構成する部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、ＳＬＴおよび／またはＳＬＣ−１の蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、レセプター結合活性を有するものなどが用いられる。
具体的には、 ＳＬＴおよび／またはＳＬＣ−１の疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Hydrophilic）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Hydrophobic）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
ＳＬＴおよび／またはＳＬＣ−１の部分ペプチドのアミノ酸の数は、前記したＳＬＴおよび／またはＳＬＣ−１の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上である。
【００１３】
また、ＳＬＴおよび／またはＳＬＣ−１の部分ペプチドとしては、上記ＳＬＴおよび／またはＳＬＣ−１を表わすアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは１〜５個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたペプチドなどもあげられる。
以下、ＳＬＴおよびＳＬＴの部分ペプチドを単にＳＬＴと、ＳＬＣ−１およびＳＬＣ−１の部分ペプチドを単にＳＬＣ−１と略称する場合がある。
本発明で用いられるＳＬＴをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、本発明で用いられるＳＬＣ−１をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１６または配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、本発明で用いられるＭＣＨをコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した組織・細胞由来のｃＤＮＡ、前記した組織・細胞由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターはバクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した組織・細胞よりＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する)によって増幅することもできる。
より具体的には、 (1)ストリンジェントな条件下で、配列番号：３、配列番号：１６、配列番号：１７または配列番号：６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡの有する配列とハイブリダイズするＤＮＡ、(2)遺伝コードの縮重のため、配列番号：３、配列番号：１６、配列番号：１７または配列番号：６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡの有する配列および(1)に定められている配列とハイブリッド形成しないが、同一アミノ酸配列をもつタンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡなどが用いられる。ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じた方法に従って行うことができる。上記ストリンジェントな条件としては、例えば４２℃、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＰＥ(１×ＳＳＰＥ＝150mM NaCl, 10mM NaH₂PO₄・H₂O, 1mM EDTA pH7.4)、５×デンハート溶液、０．１％ＳＤＳである。
本発明で用いられるＳＬＴをコードするＤＮＡ、即ち、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡとしてより具体的には、配列番号：９で表わされる塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡなどがあげられる。
本発明で用いられるＳＬＣ−１をコードするＤＮＡ、即ち、配列番号：１６または配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡとしてより具体的には、配列番号：１８または配列番号：１９で表される塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡなどがあげられる。
本発明で用いられるＭＣＨをコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡなどがあげられる。
本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１およびＭＣＨをコードするＤＮＡは以下の遺伝子工学的手法によっても製造することができる。
本発明のＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨを完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて自体公知のＰＣＲ法によって前記ＤＮＡライブラリー等から目的とするＤＮＡを増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを例えばＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨをコードする塩基配列の一部あるいは全領域を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば Molecular Cloning（２nd ed.；J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行われる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行う。
クローン化された本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００１４】
本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが利用できる。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Tｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ^rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞を用いてＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、ポリペプチドまたはその部分ペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、phoA・シグナル配列、ＯmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、メイテイングファクターα(ＭＦα)・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築されたＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、たとえばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫または昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology），１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、たとえばサッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae)ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２などが用いられる。
昆虫としては、例えばカイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh Five^TM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞〔以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィトロ（in Vitro），１３巻，２１３−２１７頁（１９７７年）〕などが用いられる。
動物細胞としては、たとえばサルＣＯＳ−７細胞，Ｖero細胞，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-ＣＨＯ細胞），マウスＬ細胞，マウス３Ｔ３細胞、マウスミエローマ細胞，ヒトＨＥＫ２９３細胞、ヒトＦＬ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、Ｓｐ−２／Ｏ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なわれる。
バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行われる。
酵母を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８)に記載の方法に従って行なわれる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、たとえばバイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,６巻, ４７−５５頁（１９８８年）などに記載の方法に従って行なわれる。
動物細胞を形質転換するには、たとえばヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なわれる。
発現ベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リポフェクション法〔Felgner, P.L. et al. プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America），８４巻，７４１３頁（１９８７年）〕、リン酸カルシウム法〔Graham, F. L. and van der Eb, A. J.ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６−４６７頁（１９７３年）〕、電気穿孔法〔Nuemann, E. et al. エンボ・ジャーナル（EMBO J.），１巻，８４１−８４５頁（１９８２年）〕等があげられる。
このようにして、本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
なお、動物細胞を用いて、本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨを安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択する。さらに、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨの高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、ｄｈｆｒ遺伝子とともに、本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨをコードするＤＮＡを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。
上記の形質転換体を本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨをコードするＤＮＡが発現可能な条件下で培養し、本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨを生成、蓄積せしめることによって、本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨを製造することができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００１５】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、たとえば３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえばバークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of The American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of The Society for The Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
特にＣＨＯ（dhfr^-）細胞およびdhfr遺伝子を選択マーカーとして用いる場合には、チミジンをほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いるのが好ましい。
上記培養物から本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨを分離精製するには、例えば下記の方法により行なうことができる。
本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨの粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標。以下、ＴＭと省略することがある。）などの界面活性剤が含まれていてもよい。
【００１６】
培養液中に本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨが分泌される場合には、培養終了後、自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨの精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法やクロマトフォーカシングなどの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨが遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、タンパク質（ペプチド）を部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。またＮ末端アミノ酸を欠失させるためには、エドマン(Edman)試薬（フェニルイソチオシアネート）を用いた公知のエドマン法を用いることが可能である。
かくして生成する本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨの存在は特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩およびＳＬＴまたはその塩を用いることを特徴とするＭＣＨまたはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法またはＭＣＨもしくはその標識体またはその塩およびＳＬＴまたはその塩を含有することを特徴とするＭＣＨまたはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット（以下、本発明のスクリーニング方法、本発明のスクリーニング用キットと略記する）について以下に詳述する。
【００１７】
ＳＬＴまたはその塩を用いるか、または組換え型ＳＬＴの発現系を構築し、該発現系を用いたＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩との結合アッセイ系（リガンド・レセプターアッセイ系）を用いることによって、 ＭＣＨまたはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩をスクリーニングすることができる。
このような化合物には、ＳＬＴを介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を有する化合物（即ちＳＬＴ（ＭＣＨ受容体）アゴニスト）と該細胞刺激活性を有しない化合物（即ちＳＬＴ（ＭＣＨ受容体）アンタゴニスト）などが含まれる。「ＭＣＨまたはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合性を変化させる」とは、 ＭＣＨまたはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合を阻害する場合とリガンドとの結合を促進する場合の両方を包含するものである。
すなわち、本発明は、（ｉ）ＳＬＴまたはその塩に、ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩を接触させた場合と（ii）上記したＳＬＴまたはその塩に、ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩および試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするＭＣＨまたはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）上記したＳＬＴまたはその塩に、ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩を接触させた場合と（ii）上記したＳＬＴまたはその塩に、ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩および試験化合物を接触させた場合における、例えば該ＳＬＴまたはその塩に対するリガンドの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較する。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法は具体的には、
▲１▼標識したＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩（「ＭＣＨの誘導体またはその塩」として、上記の「ＭＣＨ等が標識化されたものまたはその塩」を用いる場合には、更に標識する必要はない。以下同じ。）を、上記したＳＬＴまたはその塩に接触させた場合と、標識したＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩および試験化合物をＳＬＴまたはその塩に接触させた場合における、標識したＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩の該ＳＬＴまたはその塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするＭＣＨまたはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
▲２▼標識したＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩を、 ＳＬＴを含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識したＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩および試験化合物をＳＬＴを含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識したＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩の該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするＭＣＨまたはその塩とＳＬＴとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
▲３▼標識したＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩を、ＳＬＴをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＳＬＴに接触させた場合と、標識したＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩および試験化合物をＳＬＴをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＳＬＴに接触させた場合における、標識したＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩のＳＬＴに対する結合量を測定し、比較することを特徴とするＭＣＨまたはその塩とＳＬＴとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
▲４▼ＳＬＴを活性化する化合物（例えば、ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩）をＳＬＴを含有する細胞に接触させた場合と、ＳＬＴを活性化する化合物および試験化合物をＳＬＴを含有する細胞に接触させた場合における、ＳＬＴを介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とするＭＣＨまたはその塩とＳＬＴとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
▲５▼ＳＬＴを活性化する化合物（例えば、 ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩など）をＳＬＴをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＳＬＴに接触させた場合と、 ＳＬＴを活性化する化合物および試験化合物を、 ＳＬＴをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＳＬＴに接触させた場合における、 ＳＬＴを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とするＭＣＨまたはその塩とＳＬＴとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法などである。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いるＳＬＴとしては、上記のＳＬＴを含有するものであれば何れのものであってもよい。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたＳＬＴなどが適している。
ＳＬＴを製造するには、前述の方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、ＳＬＴを含有する細胞あるいは該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。
ＳＬＴを含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行うことができる。
ＳＬＴを含有する細胞としては、ＳＬＴを発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などがあげられる。
膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＳＬＴと細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該ＳＬＴを含有する細胞や膜画分中のＳＬＴの量は、１細胞当たり１０³〜１０⁸分子であるのが好ましく、１０⁵〜１０⁷分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
ＭＣＨまたはその塩とＳＬＴとの結合性を変化させる化合物をスクリーニングする前記の▲１▼〜▲３▼を実施するためには、適当なＳＬＴ画分と、標識したリガンドまたはリガンド活性を有する化合物（ＭＣＨもしくはその誘導体）が用いられる。ＳＬＴ画分としては、天然型のＳＬＴ画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型ＳＬＴ画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識したリガンドまたはリガンド活性を有する化合物としては、標識したリガンドまたはリガンド活性を有する化合物（ＭＣＨまたはその誘導体）などが用いられる。例えば〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識されたリガンド（ＭＣＨまたはその誘導体）などを利用することができる。特に、ボルトン−ハンター試薬を用いて公知の方法で調製したＭＣＨの誘導体の標識体を利用することもできる。
ＭＣＨ誘導体の標識体の具体例としては、例えば、上記の（１）〜（７）で表される化合物などがあげられる。
具体的には、ＭＣＨまたはその塩とＳＬＴとの結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行うには、まずＳＬＴを含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッファーは、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレセプターとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０^TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるＳＬＴやＭＣＨもしくはその誘導体の分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識したＭＣＨもしくはその誘導体を添加し、同時に１０^-4〜１０^-1μＭの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のＭＣＨもしくはその誘導体を加えた反応チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望ましくは４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましくは３０分から３時間行う。反応後、反応液をガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ₀）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ₀−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
また、ＳＬＴとＭＣＨもしくはその誘導体との結合を測定する方法として、ＢＩＡｃｏｒｅ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いることもできる。この方法では、ＭＣＨもしくはその誘導体を装置に添付のプロトコルに従ったアミノカップリング法によってセンサーチップに固定し、ＳＬＴを含有する細胞またはＳＬＴをコードするＤＮＡを含有する形質変換体から精製したＳＬＴまたはＳＬＴを含む膜画分、あるいは精製したＳＬＴまたはＳＬＴを含む膜画分および試験化合物を含むリン酸バッファーまたはトリスバッファーなどの緩衝液をセンサーチップ上を毎分２−２０μｌの流量で通過させる。 センサーチップ上のＭＣＨもしくはその誘導体とＳＬＴとが結合することによって生じる表面プラズモン共鳴の変化を共存する試験化合物が変化させることを観察することによってＳＬＴとＭＣＨとの結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。この方法は、ＳＬＴをセンサーチップに固定し、ＭＣＨもしくはその誘導体またはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を含むリン酸バッファーまたはトリスバッファーなどの緩衝液をセンサーチップ上を通過させる方法を用いても同様に測定することができる。試験化合物としては、上記と同様のものなどがあげられる。
ＭＣＨまたはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする前記の▲４▼〜▲５▼の方法を実施するためには、 ＳＬＴを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、ＳＬＴを含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
【００２０】
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なＳＬＴを発現した細胞が用いられる。ＳＬＴを発現した細胞としては、前述の組換え型ＳＬＴ発現細胞株などが望ましい。形質転換体であるＳＬＴ発現細胞は安定発現株でも一過性発現株でも構わない。また、動物細胞の種類は上記と同様のものが用いられる。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられる。
【００２１】
上記のリガンド・レセプターアッセイ系について、さらに具体的に記載すると以下のようなアッセイ系が用いられる。
（１）受容体発現細胞が受容体アゴニストによって刺激されると細胞内のＧタンパクが活性化されてＧＴＰが結合する。この現象は受容体発現細胞の膜画分においても観察される。通常、ＧＴＰは加水分解されてＧＤＰへと変化するが、このとき反応液中にＧＴＰγＳを添加しておくとＧＴＰγＳはＧＴＰと同様にＧタンパクに結合するが、加水分解されずにＧタンパクを含む細胞膜に結合した状態が維持される。標識したＧＴＰγＳを用いると細胞膜に残存した放射活性を測定することによって受容体アゴニストの受容体発現細胞刺激活性を測定することができる。この反応を利用してＭＣＨもしくはその誘導体のＳＬＴ発現細胞に対する刺激活性を測定することができる。この方法は、前記▲４▼〜▲５▼のようにＳＬＴを含む細胞を用いるものではなく、▲１▼〜▲３▼のようにＳＬＴを含む膜画分を用いるアッセイ法であるが、▲４▼〜▲５▼のように細胞刺激活性を測定するものであり、本測定法においてＳＬＴ膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を示す物質はアゴニストである。ここにおいて、ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を添加し、ＭＣＨもしくはその誘導体の単独投与に比べてＳＬＴ細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性に変化が生じることを観察することによってＭＣＨとＳＬＴとの結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体によるＳＬＴ細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を抑制する活性を示す化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、ＳＬＴ細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一例についてより具体的に以下に述べる。ＳＬＴを含む細胞膜画分を、膜希釈緩衝液（50 mM Tris, 5 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 1 μM GDP, 0.1% BSA pH 7.4）で希釈する。希釈率は、受容体の発現量により異なる。これをFalcon2053に0.2mlずつ分注し、ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を加え、さらに終濃度200 pMとなるように[³⁵S]GTPγSを加える。25℃で1時間保温した後、氷冷した洗浄用緩衝液（50 mM Tris, 5 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 0.1% BSA , 0.05% CHAPS pH 7.4 1.5ml）を加えて、ガラス繊維ろ紙GF/Fでろ過する。65℃、30分保温して乾燥後、液体シンチレーションカウンターでろ紙上に残った膜画分に結合した[³⁵S]GTPγSの放射活性を測定する。ＭＣＨもしくはその誘導体のみを加えた実験区の放射活性を100％、ＭＣＨもしくはその誘導体を加えなかった実験区の放射活性を0％とし、ＭＣＨもしくはその誘導体によるＧＴＰγＳ結合促進活性に対する試験化合物の影響を算出する。ＧＴＰγＳ結合促進活性が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００２２】
（２）ＳＬＴ発現細胞はＭＣＨ刺激によって細胞内cAMP量が減少する。この反応を利用してＭＣＨのＳＬＴ発現細胞に対する刺激活性を測定することができる。
ＳＬＴを発現させた種々の動物細胞のcAMP産生量はマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシなどを免疫して得られた抗cAMP抗体と¹²⁵I標識cAMP（ともに市販品）を使用することによってRIAあるいは抗cAMP抗体と標識cAMPとを組み合わせた他のEIA系でも測定することができる。また抗cAMP抗体をprotein Aあるいは抗cAMP抗体産生に用いた動物のIgGなどに対する抗体などを使用して固定したシンチラントを含むビーズと¹²⁵I標識cAMPとを使用するSPA法による定量も可能である（アマシャムファルマシアバイオテク製のキットを使用する）。
cAMP産生抑制のアッセイは、具体的には後述の実施例５またはそれに準じた方法により行われる。この系において、フォルスコリンまたはcalcitoninなど細胞内cAMP量を増加させるようなリガンドなどによって細胞内cAMP量を上昇させ、ＭＣＨもしくはその誘導体またはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を添加することによってＭＣＨもしくはその誘導体の単独投与による細胞内cAMP量の抑制が変化することを観察し、ＭＣＨとＳＬＴの結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体によるＳＬＴ発現細胞のcAMP産生抑制活性を阻害する活性を示す化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを添加してcAMP産生抑制活性を調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうことができる。
スクリーニング法をより具体的に以下に記載する。CHO/SLT細胞を24穴プレートに5 x 10⁴ cell/wellで播種し、48時間培養する。細胞を0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄する（以下、0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後0.5mlの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、2μMフォルスコリンを含む0.25mlの反応用バッファーに1 nMのＭＣＨもしくはその誘導体あるいは1 nMのＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を添加したものを細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。100μlの20%過塩素酸を加えて反応を停止させ、次に氷上で１時間置くことにより細胞内cAMPを抽出する。抽出液中のcAMP量は、cAMP EIAキット（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて測定する。フォルスコリン刺激によって産生されたcAMP量を100%とし、1 nMのＭＣＨもしくはその誘導体の添加によって抑制されたcAMP量を0%として、ＭＣＨもしくはその誘導体によるcAMP産生抑制活性に対する試験化合物の影響を算出する。ＭＣＨもしくはその誘導体の活性を阻害してcAMP産生活性が例えば５０％以上になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
cAMP産生促進活性を測定するには、フォルスコリンを添加せずにCHO/SLT細胞に試験化合物を添加して産生されたcAMPを上記の方法で定量する。
【００２３】
（３）CRE（cAMP response element）を含むＤＮＡを、ピッカジーン ベイシックベクターまたはピッカジーン エンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））のルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、これをCRE−レポーター遺伝子ベクターとする。 CRE−レポーター遺伝子ベクターをトランスフェクションした細胞において、 cAMP上昇を伴う刺激は、 CREを介したルシフェラーゼ遺伝子発現とそれに引き続くルシフェラーゼタンパク質の産生を誘導する。つまり、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、 CRE−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のcAMP量の変動を検出することができる。CRE−レポーター遺伝子ベクターをＳＬＴ発現細胞にトランスフェクションした細胞を利用してＭＣＨとＳＬＴの結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。具体的なスクリーニング法を以下に記す。
CRE−レポーター遺伝子導入ＳＬＴ発現細胞を24穴プレートに5 x 10³ cell/wellで播種し、48時間培養する。細胞を0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄する（以下、0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後0.5mlの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、1 nMのＭＣＨもしくはその誘導体あるいは1 nMのＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物と2μMフォルスコリンを含む0.25mlの反応用バッファーを細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定する。 ＭＣＨとＳＬＴの結合を変化させる化合物の影響はルシフェラーゼによる発光量をＭＣＨもしくはその誘導体を単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体の投与によりフォルスコリン刺激による発光量の増加が抑制されるが、この抑制を回復させる化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、フォルスコリン刺激によって上昇した発光量のＭＣＨもしくはその誘導体と同様な抑制を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ以外に例えばアルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼあるいはβ−ガラクトシダーゼを用いることもできる。これらのレポーター遺伝子の遺伝子産物の酵素活性は以下のように市販の測定キットを用いて容易に測定することができる。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Lumi-Phos 530によって、クロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（chloramphenicol acetyltransferase）活性は、例えば和光純薬製FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Assay KiTによって、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Aurora Gal-XEによって測定することができる。
【００２４】
（４）ＳＬＴ発現細胞はＭＣＨ刺激の結果アラキドン酸代謝物を細胞外に放出する。あらかじめ、放射活性を有するアラキドン酸を細胞に取り込ませておくことによって、この活性を細胞外に放出された放射活性を測定することによって測定することができる。測定は、後述の実施例９またはそれに準じた方法により行われる。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を添加して、ＭＣＨもしくはその誘導体のアラキドン酸代謝物放出活性に対する影響を調べることにより、ＭＣＨとＳＬＴの結合に影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体によるアラキドン酸代謝物放出活性を阻害する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。また、試験化合物のみを添加し、ＳＬＴ発現細胞のアラキドン酸代謝物放出活性を後述の実施例９に準じた方法で調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうこともできる。ＭＣＨとＳＬＴの結合に影響を与える化合物のスクリーニング法より具体的に以下に述べる。
CHO/SLT細胞を24穴プレートに5 x 10⁴ cell/wellで播種し、24時間培養後、[³H]アラキドン酸を0.25 μCi/wellとなるよう添加する。[³H]アラキドン酸添加16時間後、細胞を0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄し、各wellに0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)に溶解した終濃度10 nMのＭＣＨもしくはその誘導体あるいは10 nMのＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を含むバッファー500 μlを添加する。以降、0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)を反応用バッファーと呼ぶ。37℃で60分間インキュベートした後に、反応液400 μlをシンチレーターに加え、反応液中に遊離した[³H]アラキドン酸代謝物の量をシンチレーションカウンターにより測定する。ＭＣＨもしくはその誘導体の非添加反応バッファーによる培地中の[³H]アラキドン酸代謝物の量を0%とし、10 nMのＭＣＨもしくはその誘導体を添加したときの培地中の[³H]アラキドン酸代謝物の量を100%として試験化合物のＭＣＨもしくはその誘導体とＳＬＴの結合に対する影響を算出する。アラキドン酸代謝物産生活性が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００２５】
（５）ＳＬＴ発現細胞をＭＣＨによって刺激することによって細胞内のCaイオン濃度が上昇する。これを利用することによってＭＣＨとＳＬＴの結合に対する試験化合物の影響を調べることができる。具体的には、後述の実施例８またはそれに準じた方法で調べることができる。
ＳＬＴ発現細胞を、滅菌した顕微鏡用カバーグラス上に播き、２日後、培養液を4 mM Fura-2 AM（同仁化学研究所）を縣濁したHBSSに置換し、室温で2時間30分おく。HBSSで洗浄した後、キュベットにカバーグラスをセットし、蛍光測定器で、ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を加えたときの励起波長340nm及び380nmでの505nmの蛍光強度の比の上昇を測定する。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体を単独で投与したときに比べて試験化合物の添加によって生じる蛍光強度の変化を測定することによりＭＣＨとＳＬＴの結合に対して影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。また、以下のようにFLIPR（モレキュラーデバイス社製）を使うこともできる。すなわち、細胞縣濁液にFluo-3 AM（同仁化学研究所製）を添加し、細胞に取り込ませた後、上清を遠心により数度洗浄後、９６穴プレートに細胞を播く。FLIPR装置にセットし、Fura-2の場合と同様にＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を加え、ＭＣＨもしくはその誘導体を単独で投与したときに比べて試験化合物の添加によって観測される蛍光強度が変化することを測定することにより、ＭＣＨもしくはその誘導体とＳＬＴの結合に対して影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。これらにおいて、ＭＣＨもしくはその誘導体による蛍光強度の上昇を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみの添加による蛍光強度の上昇を観察することによってアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
ＳＬＴ発現細胞にaequorinなどのように細胞内Caイオンの上昇によって発光するようなタンパク質の遺伝子を共発現させておき、細胞内Caイオン濃度の上昇によってaequorinがCa結合型となり発光することを利用して、ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を加え、ＭＣＨもしくはその誘導体を単独で投与したときに比べて試験化合物の添加によって観測される発光強度が変化することを測定することにより、ＭＣＨとＳＬＴの結合に対して影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。方法は、蛍光物質を取り込ませないこと以外は上記と同様である。
【００２６】
（６）受容体を発現する細胞に受容体アゴニストを添加すると、細胞内イノシトール三リン酸濃度が上昇することが知られている。ＭＣＨによって生じるＳＬＴ細胞におけるこの反応を観察することによりＭＣＨとＳＬＴの結合に影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。２４穴プレートに播いて１日目の細胞にmyo-[2-³H]inositol (2.5マイクロCi/well)を添加した培地中で１日培養した細胞を、よく洗浄後、ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を添加した後、10%過塩素酸を加え反応を止める。1.5 M KOH, 60mM HEPES溶液で中和し、0.5ml のAG1x8樹脂 (Bio-Rad)を詰めたカラムに通し、5mM Na₂BO₃ 60mM HCOONH₄で洗浄した後、１M HCOONH₄ 0.1M HCOOHで溶出した放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定する。ＭＣＨもしくはその誘導体の非添加反応バッファーによる培地中の放射活性を0%とし、ＭＣＨもしくはその誘導体を添加したときの培地中の放射活性を100%として試験化合物のＭＣＨもしくはその誘導体とＳＬＴの結合に対する影響を算出する。イノシトール三リン酸産生活性が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみの添加によるイノシトール三リン酸産生上昇を観察することによってアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００２７】
（７）TRE（TPA response element）を含むＤＮＡを、ピッカジーン ベイシックベクターまたはピッカジーン エンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））のルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、これをTRE−レポーター遺伝子ベクターとする。 TRE−レポーター遺伝子ベクターをトランスフェクションした細胞において、 細胞内Caイオン上昇を伴う刺激は、 TREを介したルシフェラーゼ遺伝子発現とそれに引き続くルシフェラーゼタンパク質の産生を誘導する。つまり、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、 TRE−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のカルシウム量の変動を検出することができる。 TRE−レポーター遺伝子ベクターをＳＬＴ発現細胞にトランスフェクションした細胞を利用したＭＣＨとＳＬＴの結合を変化させる化合物の具体的なスクリーニング法を以下に記す。
TRE−レポーター遺伝子導入ＳＬＴ発現細胞を24穴プレートに5 x 10³ cell/wellで播種し、48時間培養する。細胞を0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄した後、10 nMのＭＣＨもしくはその誘導体あるいは10 nMのＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を添加し、３７℃で６０分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定する。 ＭＣＨもしくはその誘導体とＳＬＴの結合を変化させる化合物の影響は、ルシフェラーゼによる発光量をＭＣＨもしくはその誘導体を単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体の投与により細胞内Caイオンの上昇によって発光量が増加するが、この増加を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、ＭＣＨもしくはその誘導体と同様な発光量の増加を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ以外に例えばアルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼあるいはβ−ガラクトシダーゼを用いることもできる。これらのレポーター遺伝子の遺伝子産物の酵素活性は以下のように市販の測定キットを用いて容易に測定することができる。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Lumi-Phos 530によって、クロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（chloramphenicol acetyltransferase）活性は、例えば和光純薬製FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Assay Kitによって、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Aurora Gal-XEによって測定することができる。
【００２８】
（８）ＭＣＨに応答したＳＬＴ発現細胞はMAP kinase活性化によって増殖が観察される。この増殖をMAP kinase活性、チミジン取り込み、細胞数測定（MTTなど）によって測定することができる。これを利用してＭＣＨもしくはその誘導体とＳＬＴの結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。
MAP kinase活性は、ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を細胞に添加した後、細胞溶解液から抗MAP kinase抗体を用いた免疫沈降によってMAP kinase分画を得た後、例えば和光純薬製MAP Kinase Assay Kitとγ-[³²P]-ATPを使用して容易に測定できる。チミジン取り込み活性は、ＳＬＴ発現細胞を播き、ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を添加した後、[methyl-³H]-チミジンを加え、その後、細胞内に取り込まれた標識チミジンの放射活性を細胞を溶解して液体シンチレーションカウンターで計数することによって測定することができる。
ＳＬＴ発現細胞の増殖は、発現細胞を播き、ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を添加した後にMTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) を添加し、細胞内に取り込まれてMTTが変化したMTTホルマザンを塩酸酸性としたイソプロパノールで細胞を溶解した後、570 nmの吸収を測定することによっても測定できる。
ＭＣＨとＳＬＴの結合を変化させる化合物の、標識チミジン取り込み活性を利用した具体的なスクリーニング法を以下に記す。
ＳＬＴ発現細胞を２４穴プレートにウェル当たり５０００個まき一日間培養する。次に血清を含まない培地で２日間培養し、細胞を飢餓状態にする。ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を細胞に添加して２４時間培養した後、[methyl-³H]-チミジンをウェル当たり０．０１５ＭＢｑ添加し６時間培養する。細胞をＰＢＳで洗った後、メタノールを添加して１０分間放置する。次に５％トリクロロ酢酸を添加して１５分間放置後、固定された細胞を蒸留水で４回洗う。０．３Ｎ水酸化ナトリウム溶液で細胞を溶解し、溶解液中の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定する。ＭＣＨとＳＬＴの結合を変化させる化合物の影響は、チミジン取り込みによる放射活性の上昇をＭＣＨもしくはその誘導体を単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体の投与による放射活性の増加を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、ＭＣＨもしくはその誘導体と同様な放射活性の増加を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００２９】
（９）ＳＬＴ発現細胞にＭＣＨを添加すると、K channelが活性化し、細胞内にあるKイオンが、細胞外に流出する。 Kイオンと同族元素であるRbイオンは、Kイオンと区別無くK channelを通って細胞外に流出するので、細胞に標識Rb ([⁸⁶Rb])を添加して取り込ませておいた後、ＭＣＨの刺激によって流出する[⁸⁶Rb]の流れを測定することでＭＣＨの作用を測定できる。ＭＣＨとＳＬＴの結合を変化させる化合物の、[⁸⁶Rb]流出活性を利用した具体的なスクリーニング法を以下に記す。
２４穴にまいて２日後のＳＬＴ発現細胞を１mCi/ml の⁸⁶RbClを含む培地中で２時間保温する。培地をよく洗浄し、外液中の⁸⁶RbClを完全に除く。ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を細胞に添加して３０分後の外液を回収し、γカウンターで放射活性を測定する。ＭＣＨもしくはその誘導体とＳＬＴの結合を変化させる化合物の影響は、[⁸⁶Rb]流出による放射活性の上昇をＭＣＨもしくはその誘導体を単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体の投与による放射活性の上昇を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、ＭＣＨもしくはその誘導体と同様な放射活性の上昇を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００３０】
（１０）ＳＬＴ発現細胞がMCHに反応して変化する細胞外のpH（acidification rate）をＣｙtｏｓｅｎｓｏｒ装置（モレキュラーデバイス社）を使用して測定することによって、 ＭＣＨの活性を測定することができる。Ｃｙtｏｓｅｎｓｏｒ装置を利用した、細胞外ｐＨ変化の測定をすることによるＭＣＨとＳＬＴの結合を変化させる化合物の具体的なスクリーニング法を以下に記す。
ＳＬＴ発現細胞をＣｙtｏｓｅｎｓｏｒ装置用のカプセル内で終夜培養し、装置のチャンバーにセットして細胞外ｐＨが安定するまで約2時間0.1% BSAを含むRPMI1640培地（モレキュラーデバイス社製）を灌流させる。ｐＨが安定した後、ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を含む培地を細胞上に灌流させることによって生じる培地のpH変化を測定する。ＭＣＨとＳＬＴの結合を変化させる化合物の影響は、ＳＬＴ発現細胞の細胞外ｐＨ変化をＭＣＨもしくはその誘導体を単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体の投与による細胞外ｐＨ変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、ＭＣＨもしくはその誘導体と同様な細胞外ｐＨ変化を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００３１】
（１１）酵母（Saccharomyces cerevisiae）のhaploidα-mating Type (MATα) の性フェロモン受容体STe2はG蛋白Gpa1とカップルしており、性フェロモンα-mating factorに応答してMAP kinaseを活性化し、以下、Far1 (cell-cycle arrest) および転写活性化因子Ste12が活性化される。Ste12は接合に関与するFUS1を含む種々の蛋白の発現を誘導する。一方、制御因子Sst2は以上の過程に抑制的に機能する。この系において、受容体遺伝子を導入した酵母を作製し、受容体アゴニスト刺激によって酵母細胞内のシグナル伝達系を活性化し、その結果生じる増殖などの指標を用いた、受容体アゴニストと受容体との反応の測定系の試みが行なわれている（Pausch, M. H., Trends in Biotechnology, vol. 15, pp. 487-494 (1997)）。このような受容体遺伝子導入酵母の系を利用してＭＣＨおよびＳＬＴの結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。
MATα酵母のSte2およびGpa1をコードする遺伝子を除去し、代わりにＳＬＴ遺伝子およびGpa1-Gai2融合蛋白をコードする遺伝子を導入する。Farをコードする遺伝子を除去してcell-cycle arrestが生じないようにし、また、Sstをコードする遺伝子を除去することによってＭＣＨに対する応答の感度を向上させておく。さらに、FUS1にヒスチジン生合成遺伝子HIS3をつなげたFUS1-HIS3遺伝子を導入する。以上の遺伝子組換え操作は例えば、Priceら（Price, L. A. et al., Molecular and Cellular Biology, vol. 15, pp. 6188-6195 (1995)）の報告に記載の方法において、ソマトスタチン受容体タイプ２（SSTR2）遺伝子をＳＬＴに置き換えて実施することによって容易に行なうことができる。こうして構築された形質変換酵母はＳＬＴのリガンドであるＭＣＨに高感度で反応し、その結果MAPキナーゼの活性化が起きてヒスチジン生合成酵素が合成されるようになって、ヒスチジン欠乏培地で生育可能になる。これを利用して、ヒスチジン欠乏培地での酵母の生育を指標としてＭＣＨによるＳＬＴ発現酵母の応答を観察することができる。
上記のようにして作製された形質変換酵母を完全合成培地の液体培地で終夜培養し、2 x 10⁴ cell/mlの濃度でヒスチジンを除去した溶解寒天培地に加え、9 x 9 cmの角形シャーレに播く。寒天が固化した後、ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物をしみこませた滅菌濾紙を寒天表面におき、30℃で３日間培養する。ＭＣＨもしくはその誘導体とＳＬＴの結合を変化させる化合物の影響は、濾紙の周囲の酵母の生育をＭＣＨもしくはその誘導体を単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体の投与による酵母の生育を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、ＭＣＨもしくはその誘導体と同様な酵母の生育を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。また、あらかじめ、寒天培地に ＭＣＨもしくはその誘導体を添加しておいて滅菌濾紙に試験化合物のみをしみこませて培養し、シャーレ全面での酵母の生育が濾紙の周囲で影響を受けることを観察することによってもＭＣＨとＳＬＴの結合を変化させる化合物の影響を調べることができる。
【００３２】
（１２） ＳＬＴ遺伝子ＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に注入し、ＭＣＨによって刺激すると細胞内Caイオン濃度が上昇して、calcium-activated chloride currentが生じる。これを膜電位の変化としてとらえることが出来る（Kイオン濃度勾配に変化がある場合も同様）。ＭＣＨによって生じるＳＬＴ導入アフリカツメガエル卵母細胞におけるこの反応を観察することによりＭＣＨとＳＬＴの結合に影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。
氷冷して動けなくなった雌のアフリカツメガエルから取り出した、卵母細胞塊を,ＭＢＳ液（88mM NaCl, 1mM KCl, 0.41mM CaCl₂, 0.33mM Ca(NO₃)₂, 0.82mM MgSO₄, 2.4mM NaHCO₃, 10mM HEPES, pH7.4）に溶かしたコラーゲナーゼ(0.5mg/ml)で卵塊がほぐれるまで１９℃、１-６時間、 150rpmで処理する。外液をMBS液に置換することで３度洗浄し、マイクロマニピュレーターでpoly(A)⁺ SLT cRNA (50ng/50nl)をマイクロインジェクションする。ＳＬＴ mRNAは、組織や細胞から調製しても、プラスミドからin vitroで転写してもよい。これをMBS液中で２０℃で３日培養する。これをRinger液を流しているvoltage clamp装置のくぼみに置き、電位固定用ガラス微小電極、電位測定用ガラス微小電極を細胞内に刺入し、(-)極は、細胞外に置く。電位が安定したら、ＭＣＨもしくはその誘導体またはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を含むRinger液を流して電位変化を記録する。ＭＣＨとＳＬＴの結合を変化させる化合物の影響は、ＳＬＴ導入アフリカツメガエル卵母細胞の細胞膜電位変化をＭＣＨもしくはその誘導体を単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体の投与による細胞膜電位変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、ＭＣＨもしくはその誘導体と同様な細胞膜電位変化を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
この系において、反応を変化量を増大して測定しやすいように各種のＧタンパク質遺伝子のpoly(A)⁺ RNAを導入することもできる。またaequorinのようなCa存在下で発光を生じるようなタンパクの遺伝子のpoly(A)⁺ RNAを共インジェクションすることにより膜電位変化ではなく発光を観察してこの反応を測定することもできる。
ＭＣＨまたはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、ＳＬＴまたはその塩、ＳＬＴを含有する細胞、あるいはＳＬＴを含有する細胞の膜画分、およびＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩を含有するものである。
上記のとおり、本発明に用いられるＭＣＨは、ＳＬＣ−１に対してもリガンド活性を有することが知られているため、上述のＭＣＨとＳＬＴを用いるスクリーニング方法をＳＬＴの代わりにＳＬＣ−１を用いることによって実施し、ＭＣＨとＳＬＣ−１との結合性を変化させる化合物またはその塩（ＳＬＣ−１アンタゴニスト、ＳＬＣ−１アゴニスト）をスクリーニングすることが可能である。
従って、本発明のスクリーニング方法によって得られる「ＭＣＨとＳＬＴとの結合性を変化させる化合物またはその塩（ＳＬＴアンタゴニスト、ＳＬＴアゴニスト）」の活性と、ＳＬＴの代わりにＳＬＣ−１を用いることにより、本発明のスクリーニング方法またはそれに準じた方法によって得られる「ＭＣＨとＳＬＣ−１との結合性を変化させる化合物またはその塩（ＳＬＣ−１アンタゴニスト、ＳＬＣ−１アゴニスト）」の活性とを比較することによって、「ＭＣＨとＳＬＣ−１との結合性を選択的に変化させる化合物またはその塩（ＳＬＣ−１により選択的な活性を有するアンタゴニストもしくはアゴニスト）」、または「ＭＣＨとＳＬＴとの結合性を選択的に変化させる化合物またはその塩（ＳＬＴにより選択的な活性を有するアンタゴニストもしくはアゴニスト）」を得ることができる。
ここで、「結合性を選択的に変化させる化合物またはその塩」とは、
（１）ＳＬＣ−１またはＳＬＴのいずれか一方に対する活性（受容体（ＳＬＣ−１またはＳＬＴ）を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）など）が他方に対する活性に対して通常２倍以上、好ましくは１０倍以上、量的に異なる化合物またはその塩、および（または）
（２）ＳＬＣ−１またはＳＬＴのいずれか一方に対する結合力（例、ＩＣ₅₀値）が、他方に対する結合力に対して通常２倍以上、好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは１００倍以上、異なる化合物またはその塩のことをいう。
すなわち、「ＳＬＣ−１により選択的な活性を有するアンタゴニスト」とは、
（１）ＳＬＣ−１に対する活性（受容体（ＳＬＣ−１）を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）など）がＳＬＴに対する活性に対して通常２倍以上、好ましくは１０倍以上弱い化合物またはその塩、および（または）
（２）ＳＬＣ−１に対する結合力が、ＳＬＴに対する結合力に対して通常２倍以上、好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは１００倍以上強い化合物またはその塩のことをいう。
「ＳＬＣ−１により選択的な活性を有するアゴニスト」とは、
（１）ＳＬＣ−１に対する活性（受容体（ＳＬＣ−１）を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）など）がＳＬＴに対する活性に対して通常２倍以上、好ましくは１０倍以上強い化合物またはその塩、および（または）
（２）ＳＬＣ−１に対する結合力が、ＳＬＴに対する結合力に対して通常２倍以上、好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは１００倍以上強い化合物またはその塩のことをいう。
「ＳＬＴにより選択的な活性を有するアンタゴニスト」とは、
（１）ＳＬＴに対する活性（受容体（ＳＬＴ）を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）など）がＳＬＣ−１に対する活性に対して通常２倍以上、好ましくは１０倍以上弱い化合物またはその塩、および（または）
（２）ＳＬＴに対する結合力が、ＳＬＣ−１に対する結合力に対して通常２倍以上、好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは１００倍以上強い化合物またはその塩のことをいう。
「ＳＬＴにより選択的な活性を有するアゴニスト」とは、
（１）ＳＬＴに対する活性（受容体（ＳＬＴ）を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）など）がＳＬＣ−１に対する活性に対して通常２倍以上、好ましくは１０倍以上強い化合物またはその塩、および（または）
（２）ＳＬＴに対する結合力が、ＳＬＣ−１に対する結合力に対して通常２倍以上、好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは１００倍以上強い化合物またはその塩のことをいう。
【００３３】
このように、本発明は、さらに、
▲１▼ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩；▲２▼ＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；および▲３▼ＳＬＴもしくはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、
１）ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩と、
２）（ｉ）ＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；および／または
（ii）ＳＬＴもしくはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本スクリーニング方法によれば、
（ａ）ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩と、ＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を選択的に変化させる化合物またはその塩；
（ｂ）ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩と、ＳＬＴもしくはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を選択的に変化させる化合物またはその塩；および
（ｃ）（i）ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩と、ＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性；および（ii）ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩と、ＳＬＴもしくはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩をスクリーニングすることができる。
上記スクリーニング方法において、ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩と、ＳＬＴもしくはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を選択的に変化させる化合物またはその塩をスクリーニングすることが好ましい。
【００３４】
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものがあげられる。
１．スクリーニング用試薬
▲１▼測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
▲２▼ＳＬＴ標品およびＳＬＣ−１標品
ＳＬＴを発現させたＣＨＯ細胞またはＳＬＣ−１を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０⁵個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ₂、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
▲３▼標識リガンド
〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識したＭＣＨ。
適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
▲４▼リガンド標準液
ＭＣＨを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
２．測定法
▲１▼１２穴組織培養用プレートにて培養したＳＬＴまたはＳＬＣ−１を発現させた細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
▲２▼１０^-3〜１０^-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識したＭＣＨを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物のかわりに１０^-3Ｍのリガンド（ＭＣＨ）を５μｌ加えておく。
▲３▼反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識リガンド（ＭＣＨ）を０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
▲４▼液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。
〔数１〕
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ₀−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Percent Maximum Binding
Ｂ ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）
Ｂ₀ ：最大結合量
【００３５】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、ＭＣＨまたはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合を変化させる（結合を阻害あるいは促進する）化合物であり、具体的にはＳＬＴを介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（いわゆるＳＬＴアゴニスト）、あるいは該刺激活性を有しない化合物（いわゆるＳＬＴアンタゴニスト）である。該化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記ＳＬＴアゴニストであるかアンタゴニストであるかの具体的な評価方法は以下の（ｉ）または（ii）に従えばよい。
（ｉ）前記▲１▼〜▲３▼のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、ＭＣＨまたはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物を得た後、該化合物が上記したＳＬＴを介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はＳＬＴアゴニストであり、該活性を有しない化合物またはその塩はＳＬＴアンタゴニストである。
（ii）(a)試験化合物をＳＬＴを含有する細胞に接触させ、上記ＳＬＴを介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はＳＬＴアゴニストである。
(b) ＳＬＴを活性化する化合物（例えば、本発明のポリペプチドまたはＳＬＴアゴニストなど）をＳＬＴを含有する細胞に接触させた場合と、 ＳＬＴを活性化する化合物および試験化合物をＳＬＴを含有する細胞に接触させた場合における、 ＳＬＴを介した細胞刺激活性を測定し、比較する。 ＳＬＴを活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩はＳＬＴアンタゴニストである。
該ＳＬＴアゴニストは、 ＳＬＴに対するＭＣＨまたはその塩が有する生理活性と同様の作用を有しているので、 ＭＣＨまたはその塩と同様に安全で低毒性な医薬として有用である。
逆に、ＳＬＴアンタゴニストは、 ＳＬＴに対するＭＣＨまたはその塩が有する生理活性を抑制することができるので、該レセプター活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
【００３６】
また、ＳＬＣ−１を用いる本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、ＭＣＨまたはその塩とＳＬＣ−１またはその塩との結合を変化させる（結合を阻害あるいは促進する）化合物であり、具体的にはＳＬＣ−１を介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（いわゆるＳＬＣ−１アゴニスト）、あるいは該刺激活性を有しない化合物（いわゆるＳＬＣ−１アンタゴニスト）である。該化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記ＳＬＣ−１アゴニストであるかアンタゴニストであるかの具体的な評価方法は前記（ｉ）または（ii）に準じて行えばよい。
該ＳＬＣ−１アゴニストは、 ＳＬＣ−１に対するＭＣＨまたはその塩が有する生理活性と同様の作用を有しているので、 ＭＣＨまたはその塩と同様に安全で低毒性な医薬として有用である。
逆に、ＳＬＣ−１アンタゴニストは、 ＳＬＣ−１に対するＭＣＨまたはその塩が有する生理活性を抑制することができるので、該レセプター活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
【００３７】
ＭＣＨまたはその塩は食欲（摂食）増進作用およびオキシトシン分泌促進作用などに関与していることから、食欲（摂食）増進剤またはオキシトシン分泌促進剤などとして用いることができるため、上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物のうち、ＳＬＴアゴニストおよびＳＬＣ−１アゴニストは食欲（摂食）増進剤として用いることができる他、微弱陣痛、弛緩出血、胎盤娩出前後、子宮復古不全、帝王切開術、人工妊娠中絶、乳汁うっ滞、神経性食欲不振症などの食欲不振およびそれに伴う貧血、低蛋白症などの予防・治療薬などとして用いることができ、ＳＬＴアンタゴニストおよびＳＬＣ−１アンタゴニストは肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia)、情動障害、性機能障害などの予防・治療薬などとして用いることができる他、過強陣痛、強直性子宮収縮、胎児仮死、子宮破裂、頚菅裂傷、早産、Prader-Willi症候群、糖尿病およびその合併症（糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害など）、高血圧、高脂血症、冠状動脈硬化症、痛風、呼吸器疾患（Pickwick症候群、睡眠時無呼吸症候群）、脂肪肝、不妊症、変形性骨関節症など（特に抗肥満剤（薬）、食欲（摂食）調節剤など）の予防・治療薬などとして用いることができる。
上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物の塩としては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩などがあげられる。
無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルチニンなどとの塩があげられ、酸性アミノ酸との好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩があげられる。
【００３８】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の医薬として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、該医薬は、必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。本発明の医薬は、例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート８０（^TM）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
【００３９】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えばヒトや哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１から１０００ｍｇ、好ましくは約１．０から３００ｍｇ、より好ましくは約３．０から５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では成人の肥満症患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、ＳＬＣアンタゴニストを一日につき約０．０１から３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４０】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
Ｙ ：チミンまたはシトシン
Ｎ ：チミン、シトシン、アデニンまたはグアニン
Ｒ ：アデニンまたはグアニン
Ｍ ：シトシンまたはアデニン
Ｗ ：チミンまたはアデニン
Ｓ ：シトシンまたはグアニン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸
ＥＩＡ ：エンザイムイムノアッセイ
ＧｌｙまたはＧ ：グリシン
ＡｌａまたはＡ ：アラニン
ＶａｌまたはＶ ：バリン
ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン
ＩｌｅまたはＩ ：イソロイシン
ＳｅｒまたはＳ ：セリン
ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン
ＣｙｓまたはＣ ：システイン
ＭｅtまたはＭ ：メチオニン
ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸
ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸
ＬｙｓまたはＫ ：リジン
ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン
ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン
ＰｈｅまたはＦ ：フェニルアラニン
ＴｙｒまたはＹ ：チロシン
ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン
ＰｒｏまたはＰ ：プロリン
ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン
ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
Ｍｅ ：メチル基
Ｅt ：エチル基
Ｂｕ ：ブチル基
Ｐｈ ：フェニル基
ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
ＮＭＰ ：Ｎ−メチルピロリドン
ＰＡＭ ：フェニルアセトアミドメチル
【００４１】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＨＯＮＢ ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネンー２，３−ジカルボキシイミド
Ｂｚｌ ：ベンジル
Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ ：２−クロルベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ ：t−ブチルオキシカルボニル
ＨＯＢt ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＤＣＣ ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＤＮＰ ：ジニトロフェニル
Ｂｕｍ ：ターシャリーブトキシメチル
Ｔｒt ：トリチル
ＢＳＡ ：ウシ血清アルブミン
ＣＨＡＰＳ ：３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホナート
ＰＭＳＦ ：フェニルメチルスルホニルフルオリド
Ｅ６４ ：（Ｌ−３−trans−カルボキオキシラン−２−カルボニル）Ｌ−ロイシル−アグマチン
ＧＤＰ ：グアノシン−５’−二リン酸
ＭＥＭα ：ミニマムエッセンシャルメジウムアルファ
Ｆｕｒａ−２ＡＭ ：1-[6-アミノ-2-(5-カルボキシ-2-オキサゾリル)-5-ベンゾフラニロキシ]-2-(2-アミノ-5メチルフェノキシ)-エタン-N,N,N',N'-四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル
ＨＢＳＳ ：ハンクス平衡塩液
Ｆｌｕｏ−３ＡＭ ：1-[2-アミノ-5-(2,7-ジクロロ-6-ヒドロキシ-3-オキシ-9-キサンテニル)フェノキシ]-2-(2-アミノ-5-メチルフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル
ＨＥＰＥＳ ：２−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル]エタンスルホン酸
ＭｅＢｚｌ ：４−メチルベンジル
ＮＭＰ ：Ｎ−メチルピロリドン
【００４２】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒトSLTをコードするcDNAのクローニングに使用した合成DNAを示す。
〔配列番号：２〕
ヒトSLTをコードするcDNAのクローニングに使用した合成DNAを示す。
〔配列番号：３〕
ヒトSLTの全アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
5’側にSal I認識配列が付加され、また3’側にSpe I認識配列が付加されたヒトSLT cDNAの全塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
ヒトSLT発現CHO細胞の各クローンにおけるSLT mRNAの発現量を測定するために使用したリボプローブ（riboprobe）を示す。
〔配列番号：６〕
メラニン凝集ホルモン（melanin-concentrating hormone, MCH）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７〕
ヒトSLTをコードするcDNAをクローニングするために使用した合成DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
ヒトSLTをコードするcDNAをクローニングするために使用した合成DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するヒトSLTをコードするcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
Des-Asp¹-MCH (MCH(2-19))のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１〕
Des-[Asp¹, Phe²]-MCH (MCH(3-19))のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１２〕
Des-[Asp¹, Phe², Asp³]-MCH (MCH(4-19))のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１３〕
Des-[Asp¹, Phe², Asp³, Met⁴]-MCH (MCH(5-19))のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１４〕
Des-[Asp¹, Phe², Asp³, Met⁴, Leu⁵]-MCH (MCH(6-19))のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１５〕
Des-[Asp¹, Phe², Asp³, Met⁴, Leu⁵, Arg⁶]-MCH (MCH(7-19))のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１６〕
ラットSLC-1の全アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１７〕
ヒトSLC-1の全アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１８〕
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
配列番号：１７で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
【００４３】
後述の参考例１で得られたEscherichia coli ＤＨ５α／ｐＣＲ３．１−ｈＳＬＴは、平成１１年（１９９９年）４月２８日から日本国茨城県つくば市東１−１−３、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６７１０として、平成１１年（１９９９年）４月２０日から日本国大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５、財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６２８４として寄託されている。
【００４４】
【発明の実施の形態】
以下に実施例および参考例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００４５】
【実施例】
参考例１ ヒト海馬cDNAからのヒトSLT受容体タンパクをコードするcDNAのクローニング
ヒト海馬cDNA（クロンテック社）を鋳型とし、２個のプライマー、プライマー１（配列番号：７）およびプライマー２（配列番号：８）を用いてPCR反応を行った。該反応における反応液の組成は上記cDNAの10分の1量を鋳型として使用し、Advantage 2 Polymerase Mix（クロンテック社）1/50量、プライマー１（配列番号：７）およびプライマー２（配列番号：８）を 各0.2 μM、dNTPs 200 μM、および酵素に添付のバッファーを加え、25 μlの液量とした。PCR反応は、▲１▼94℃・1分の後、▲２▼94℃・20秒、72℃・2分のサイクルを3回、▲３▼94℃・20秒、65℃・20秒、68℃・2分のサイクルを3回、▲４▼94℃・20秒、58℃・20秒、68℃・2分のサイクルを36回繰り返し、▲３▼ 最後に68℃・7分の伸長反応を行った。該PCR反応後の反応産物をTAクローニングキット（インビトロジェン社）の処方に従いプラスミドベクターpCR3.1（インビトロジェン社）へ サブクローニングした。これを大腸菌DH5αに導入し、cDNAをもつクローンをアンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した後、個々のクローンの配列を解析した結果、新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするcDNA配列（配列番号：９）を得た。 このcDNAより導き出されるアミノ酸配列（配列番号：３）を含有する新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をhSLTと命名し、この形質転換体を大腸菌（Escherichia coli）DH5α/pCR3.1-hSLTと命名した。
【００４６】
参考例２ Des-[Asp¹, Phe², Asp³]-MCH (MCH(4-19), Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)の製造
市販Boc-Val-OCH₂-PAM樹脂（0.77 mmol/g resin) 0.5 mmol分をペプチド合成機ABI 430Aの反応曹に入れ、Boc-strategy (NMP-HOBt)ペプチド合成方法でBoc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys(MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Cys(MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Met, を順に導入し目的の保護ペプチド樹脂を得る。 この樹脂0.6 gをp-クレゾール2 g、1,4-ブタンジチオール1.2 mlと共に無水弗化水素10 ml中、0℃・60分撹袢した後、弗化水素を減圧留去し、残留物へジエチルエーテルを加え沈殿を濾過する。 この沈殿に50%酢酸水を加え抽出し、不溶部分を除き、抽出液を十分に濃縮後、50%酢酸水で充填したセファデックス（商品名）G-25カラム（2.0 x 80 cm）に付し、同溶媒で展開、主要画分を集めLiChroprep（商品名） RP-18を充填した逆相クロマトカラム（2.6 x 60 cm)に付け0.1% TFA水200 mlで洗浄、0.1% TFA水300 mlと0.1% TFA含有40%アセトニトリル水300 mlを用いた線型勾配溶出を行ない、主要画分を集め濃縮する。此れを約4 mlの酢酸に溶解し、蒸留水で240 mlに希釈の後、アンモニア水を用いpH 7.5に調整し、緩やかに空気を吹込み攪拌する。 反応をHPLCで追跡し、SH体ペプチドのピークがすべてSS体に変化した事を確認後、酢酸を加え溶液のpHを3に調整し、 上記LiChroprep（商品名） RP-18カラムに吸着する。 カラムを0.1% TFA水200 mlで洗浄後、0.1% TFA水300 mlと0.1% TFA含有50%アセトニトリル水300 mlを用いた線型勾配溶出を行ない、主要画分を集め、凍結乾燥し目的とするペプチドを得る。
質量分析による(M+H)⁺ 2009.9 (理論値 2010.0)
HPLC溶出時間：17.9分
カラム条件
カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 150 mm)
溶離液：A液−0.1% TFA含有10%アセトニトリル水、B液−0.1%TFA含有60%アセトニトリル水を用い、A/B : 20/80〜80/20へ直線型濃度勾配溶出（20分）
流速：1.0 ml/分
【００４７】
参考例３ ラジオアイソトープ標識MCH(4-19)の作製
参考例２で調製したMCHのN末端アミノ酸3残基欠失体であるMCH(4-19)を、ボルトン−ハンター法でラジオアイソトープ標識した。チューブの中でベンゼンに溶解している[¹²⁵I]-ボルトン−ハンター試薬（3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオン酸N-スクシンイミジル）9.25 MBq (0.11 nmol)（ＮＥＮライフサイエンスプロダクツ社、81.4 TBq/mmol）に乾燥窒素ガスを吹き付けて、ベンゼンを溜去した。このチューブに、18μlの50 mMリン酸緩衝液（pH 7.5）と1.5μlのジメチルスルフオキシドに溶解した2.3 nmolのMCH(4-19)と0.5μlのジメチルスルフオキシドを添加し、よく混合した。混合液を37℃で2時間保温した後、ボルトン−ハンター試薬によるMCH(4-19)の放射化誘導体である[¹²⁵I]-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Met⁴]-MCH(4-19)を逆相HPLCにより分取した。[¹²⁵I]-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Met⁴]-MCH(4-19)は、ODSカラム（トーソー、ODS-80TM (4.6 mm x 150 mm)）からアセトニトリル濃度43.6%付近に溶出した。
【００４８】
参考例４ 手動エドマン分解によるMCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)およびMCH(7-19)（配列番号：１０−１５）の調製
MCH 0.1 mg（シグマ社）を30μlの50％ピリジンに溶解し、1μlのフェニルイソチオシアネート（和光純薬）を加えて窒素置換した後、45℃に保温した。10分おきに攪拌して1時間を経過したところで保温を止め、窒素気流下で乾固した。20μlのエタノールに再度溶解し、窒素気流下、次いで減圧下で溶媒を溜去して乾固した。反応生成物であるフェニルチオカルバモイル誘導体を20μlのトリフルオロ酢酸（和光純薬）によって溶解し、窒素置換して45℃で20分間保温することによりペプチドのアミノ末端アミノ酸をアニリノチアゾリノン誘導体として切断した。窒素気流でトリフルオロ酢酸を除いた後、30μlの水および100μlの酢酸n-ブチルを加え、酢酸n-ブチルにより過剰な試薬およびアニリノチアゾリノン誘導体を抽出して除去した。酢酸n-ブチルによる抽出は3回繰り返した。アミノ末端が１残基短縮されたMCH(2-19)を含む水相を窒素気流下、次いで減圧下で乾固した。
この分解過程を１回のみ行なうことにより、アミノ末端の１残基のみが欠失したMCH(2-19)を得た。同様な分解過程を2回、3回、4回、5回あるいは6回繰り返すことにより、1残基ずつN末端のアミノ基が短縮されたMCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)およびMCH(7-19)を得た。
上記の分解反応によって得られたMCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)およびMCH(7-19)を次のように精製した後、質量分析およびアミノ酸分析によって構造の確認を行なった。以下にMCH(4-19)について詳細に述べるが、他の誘導体についてもほぼ同様の操作を行なった。得られたMCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)およびMCH(7-19)の分析値を表１に示す。
【００４９】
［表１］MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)およびMCH(7-19)の質量分析値およびアミノ酸分析値
【表１】

【００５０】
MCH(4-19)を以下のようにHPLCで精製した。Spheri-5 RP-18逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム（ブラウンリー社、2.1 mm x 30 mm）にあらかじめA液（0.1%トリフルオロ酢酸）を流速300μl/minで流し、25℃にて平衡化した。反応産物は270μlの0.1%トリフルオロ酢酸に溶解し、1回50μlをカラムに打ち込んだ後、流速300μl/minを保ちながら、30分間かけてB液（0.1%トリフルオロ酢酸/70%アセトニトリル）濃度を70%まで上昇させた。溶出液を210 nmの吸光度でモニターし、ピークを手動で分取した。MCH(4-19)は17.1分に溶出した。１つの試験管に集めたMCH(4-19)を濃縮乾固し、100μlのDMSOに溶解した。
質量分析は日本電子JMS-HX110でLSIMS法にて行なった。即ち、プローブチップ上で1μlの3-ニトロベンジルアルコールとグリセロールが3:2からなるマトリクスと、1μlのサンプルとを混合し、イオン源に導入した。15 kVに加速されたセシウムイオンを照射し、生成した正二次イオンを10 kVに加速して検出器に導いた。
アミノ酸分析のための加水分解は、サンプル5μlをガラス管にとって減圧乾固し反応バイアルに入れ、その底部に6 N共沸塩酸（ピアス社、Sequenal Grade）200μlを入れ、ウォーターズ社Pico-Tagワークステーションを用いてウォーターズ社の推奨する方法に従って脱気後、110℃、24時間保温して行なった。
反応バイアル中の塩酸を真空ポンプにより減圧下除去した後、150μlの20 mM塩酸で試料を希釈し、分析バイアルに注入してアミノ酸分析装置にセットし、100μlを分析に供した。アミノ酸分析は日立L-8500高速アミノ酸分析計を用いて、オルトフタルアルデヒド試薬（和光純薬）を誘導体化反応に用いた蛍光分析法にて分析した。蛍光分析用緩衝液の調製法、反応液の調製法、分析条件は、L-8500アミノ酸分析計取り扱い説明書の記載に従った。ロイシンを基準としたときの測定値のモル比は表１に示したとおりである。
なお、MCHあるいはMCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)およびMCH(5-19)は参考例７から参考例１１に記載した固相合成法によっても調製することができる。
【００５１】
参考例５ MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)およびMCH(5-19)の非アイソトープボルトン−ハンター試薬による誘導体化
MCHおよびMCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)およびMCH(6-19)の非アイソトープボルトン−ハンター試薬による誘導体化を行なった。MCH(4-19)の誘導体化を例にして以下に述べる。
ジメチルホルムアミド50μlに溶解したMCH(4-19) 1 nmolに非アイソトープボルトン−ハンター試薬である3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオン酸N-スクシンイミジル（和光純薬）100 nmolおよびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（和光純薬）100 nmolを加えて37℃で4時間反応させた。
反応混合物に0.1%トリフルオロ酢酸を含む10%アセトニトリル450μlを加えてHPLCにより精製した。クロマトグラフィーの条件は以下のとおりである。カラムはWakosil-II 5C18HG (4.6 x 150 mm)で流速は毎分1.0 mlとした。溶出は0.1%トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル水を用い、アセトニトリル濃度を2分間10%に保持した後、5分間で20%まで上昇させ、その後20分間に50%まで上昇させて行なった。MCH(4-19)の非アイソトープボルトン−ハンター試薬による誘導体である[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Met⁴]-MCH(4-19)は22.9分に溶出され、手動によって分取した。MCHあるいはMCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(5-19)およびMCH(6-19)についてもほぼ同様の操作によってN末端アミノ酸のアミノ基に3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル基を導入して誘導体化し、HPLCによって分取した。これらの誘導体を酸加水分解した後、アミノ酸分析を行なった。結果を表２に示した。
【００５２】
［表２］誘導体化MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)およびMCH(6-19)のアミノ酸分析値
【表２】

【００５３】
参考例６ 放射ヨード標識MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)およびMCH(7-19)の作製
アイソトープ標識MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)およびMCH(7-19)は以下のようにアミノ酸配列中のTyr¹³を放射ヨード化して作製することもできる。MCH(4-19)について例示するが、同様の方法によってMCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)およびMCH(7-19)の放射ヨード化体を作製することができる。
MCH(4-19) 5μgを25μlの0.4 M酢酸ナトリウム（pH 5.6）に溶解し、これに200 ngのラクトパーオキシダーゼ（和光純薬製）を加えた後、1 mCiの[¹²⁵I]-ヨウ化ナトリウム（アマシャムファルマシアバイオテク社）および200 ngの過酸化水素（10μl）を加える。室温で10分間静置した後、さらに200 ngの過酸化水素（10μl）を加えて10分間静置する。これをTSKgel ODS-80T_Sカラム（4.6 mm x 25 cm、トーソー）を用いたHPLCによって精製し、[¹²⁵I]-標識MCH(4-19)を得る。
【００５４】
参考例７ MCH (Asp-Phe-Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)の製造
市販Boc-Val-OCH₂-PAM樹脂（0.77 mmol/g resin) 0.5 mmol分をペプチド合成機ABI 430Aの反応曹に入れ、Boc-strategy (NMP-HOBt)ペプチド合成方法でBoc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys(MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Cys(MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Asp(OcHex), Boc-Phe, Boc-Asp(OcHex)を順に導入し目的の保護ペプチド樹脂を得る。この樹脂0.6 gをp-クレゾール2 g、1,4-ブタンジチオール1.2 mlと共に無水弗化水素10 ml中、0℃・60分撹袢した後、弗化水素を減圧留去し、残留物へジエチルエーテルを加え沈殿を濾過する。 この沈殿に50%酢酸水を加え抽出し、不溶部分を除き、抽出液を十分に濃縮後、50%酢酸水で充填したセファデックス（商品名）G-25カラム（2.0 x 80 cm）に付し、同溶媒で展開、主要画分を集めLiChroprep（商品名） RP-18を充填した逆相クロマトカラム（2.6 x 60 cm)に付け0.1% TFA水200 mlで洗浄、0.1% TFA水300 mlと0.1% TFA含有40%アセトニトリル水300 mlを用いた線型勾配溶出を行ない、主要画分を集め濃縮する。此れを約4 mlの酢酸に溶解し、蒸留水で240 mlに希釈の後、アンモニア水を用いpH 7.5に調整し、緩やかに空気を吹込み攪拌する。 反応をHPLCで追跡し、SH体ペプチドのピークがすべてSS体に変化した事を確認後、酢酸を加え溶液のpHを3に調整し、 上記LiChroprep（商品名） RP-18カラムに吸着する。 カラムを0.1% TFA水200 mlで洗浄後、0.1% TFA水300 mlと0.1% TFA含有50%アセトニトリル水300 mlを用いた線型勾配溶出を行ない、主要画分を集め、凍結乾燥し目的とするペプチドを得る。
質量分析による(M+H)⁺ 2387.3 (理論値 2387.9)
HPLC溶出時間：20.9分
カラム条件
カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 150 mm)
溶離液：A液−0.1% TFA含有10%アセトニトリル水、B液−0.1%TFA含有60%アセトニトリル水を用い、A/B : 20/80〜80/20へ直線型濃度勾配溶出（20分）
流速：1.0 ml/分
【００５５】
参考例８ Des-Asp¹-MCH (MCH(2-19), Phe-Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)の製造
市販Boc-Val-OCH₂-PAM樹脂（0.77 mmol/g resin) 0.5 mmol分をペプチド合成機ABI 430Aの反応曹に入れ、Boc-strategy (NMP-HOBt)ペプチド合成方法でBoc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys(MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Cys(MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Asp(OcHex), Boc-Pheを順に導入し目的の保護ペプチド樹脂を得る。 この樹脂を参考例７と同様に脱保護、環化、精製を行い目的のペプチドを得る。
質量分析による(M+H)⁺ 2272.3 (理論値 2272.1)
HPLC溶出時間：20.6分
カラム条件
カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 150 mm)
溶離液：A液−0.1% TFA含有10%アセトニトリル水、B液−0.1%TFA含有60%アセトニトリル水を用い、A/B : 20/80〜80/20へ直線型濃度勾配溶出（20分）
流速：1.0 ml/分
【００５６】
参考例９ Des-[Asp¹, Phe²]-MCH (MCH(3-19), Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)の製造
市販Boc-Val-OCH₂-PAM樹脂（0.77 mmol/g resin) 0.5 mmol分をペプチド合成機ABI 430Aの反応曹に入れ、Boc-strategy (NMP-HOBt)ペプチド合成方法でBoc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys(MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Cys(MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Asp(OcHex)を順に導入し目的の保護ペプチド樹脂を得る。 この樹脂を参考例７と同様に脱保護、環化、精製を行い目的のペプチドを得る。
質量分析による(M+H)⁺ 2124.8 (理論値 2125.0)
HPLC溶出時間：19.2分
カラム条件
カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 150 mm)
溶離液：A液−0.1% TFA含有10%アセトニトリル水、B液−0.1%TFA含有60%アセトニトリル水を用い、A/B : 20/80〜80/20へ直線型濃度勾配溶出（20分）
流速：1.0 ml/分
【００５７】
参考例１０ Des-[Asp¹, Phe², Asp³, Met⁴]-MCH (MCH(5-19), Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val-OH)の製造
市販Boc-Val-OCH₂-PAM樹脂（0.77 mmol/g resin) 0.5 mmol分をペプチド合成機ABI 430Aの反応曹に入れ、Boc-strategy (NMP-HOBt)ペプチド合成方法でBoc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys(MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Cys(MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leuを順に導入し目的の保護ペプチド樹脂を得る。 この樹脂を参考例７と同様に脱保護、環化、精製を行い目的のペプチドを得る。
質量分析による(M+H)⁺ 1878.9 (理論値 1878.9)
HPLC溶出時間：17.4分
カラム条件
カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 150 mm)
溶離液：A液−0.1% TFA含有10%アセトニトリル水、B液−0.1%TFA含有60%アセトニトリル水を用い、A/B : 20/80〜80/20へ直線型濃度勾配溶出（20分）
流速：1.0 ml/分
【００５８】
実施例１ ヒトSLT受容体cDNAの増幅
参考例１記載のpCR3.1-hSLTを鋳型とし、配列番号：１および２の合成DNAプライマーを用いてPCR法による増幅を行なった。合成DNAプライマーは受容体蛋白に翻訳される領域の遺伝子が増幅されるように構築したが、その際に遺伝子の5’側に制限酵素Sal Iの認識する塩基配列が付加され、また3’側に制限酵素Spe Iの認識する塩基配列が付加されるように、5’側および3’側にそれぞれの制限酵素の認識配列を付加した。反応液の組成は、 pCR3.1-hSLT鋳型5 μl、合成DNAプライマー各0.4μM、0.2 mM dNTPs、pfu (ストラタジーン) DNAポリメラーゼ1μlおよび酵素に付属のバッファーで、総反応量は50 μlとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、94℃・60秒の加熱の後、94℃・60秒、57℃・60秒、72℃・150秒のサイクルを25回繰り返し、最後に72℃で10分間反応させた。増幅産物の確認は、0.8％アガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロマイド染色によって行なった。
【００５９】
実施例２ PCR産物のプラスミドベクターへのサブクローニングおよび挿入cDNA部分の塩基配列の解読による増幅cDNA配列の確認
実施例１で行なったPCRの反応産物は0.8 ％の低融点アガロースゲルを用いて分離し、バンドの部分をカミソリで切り出した後、細片化、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行なってDNAを回収した。PCR-Script^TM Amp SK(+)クローニングキット（ストラタジーン）の処方に従い、回収したDNAをプラスミドベクターpCR-Script Amp SK(+)へサブクローニングした。これをエシェリヒア コリ（Escherichia coli）DH5αcompetent cell （トーヨーボー）に導入して形質転換した後、cDNA挿入断片を持つクローンをアンピシリン、IPTGおよびX-galを含むLB寒天培地中で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体E. coli DH5α/hSLTを得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、 QIAwell 8 Plasmid KIt （キアゲン）を用いてプラスミドDNAを調製した。調製したDNAの一部を用いて制限酵素Sal IおよびSpe Iによる切断を行ない、挿入されている受容体cDNA断片の大きさを確認した。塩基配列の決定のための反応はDyeDeoxy Terminator Cycle Sequence Kit（PE Biosystems）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した。得られた2クローンの配列を解析し全ての配列が報告されているヒトSLTタンパク質（配列番号：３）をコードするcDNA配列の5’側にSal I認識配列が付加し、3’側にSpe I認識配列が付加した遺伝子配列と一致することを確認した（配列番号：４）。図１にヒトSLT受容体蛋白のアミノ酸配列およびそれをコードするDNA配列を示した。
【００６０】
実施例３ ヒトSLT発現CHO細胞の作製
実施例２で配列が確認されたヒトSLTの全長アミノ酸配列をコードし、5’側にSal I認識配列が付加し、また3’側にSpe I認識配列を付加した遺伝子が導入されたプラスミドによって形質転換されたE. coliのクローンよりPlasmid Midi Kit（キアゲン）を用いてプラスミドを調製し、制限酵素Sal IおよびSpe Iで切断してインサート部分を切り出した。インサートDNAは電気泳動後、アガロースゲルからカミソリで切り出し、次に細片化、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行なって回収した。このインサートDNAをSal IおよびSpe Iで切断した動物細胞発現用ベクタープラスミドpAKKO-111H（Hinuma, S. et al. Biochim. Biophys. Acta, Vol. 1219, pp. 251-259 (1994)記載のpAKKO1.11Hと同一のベクタープラスミド）に加え、T4ライゲース（宝酒造）を用いてライゲーションを行ない、蛋白発現用プラスミドpAKKO-hSLTを構築した。
pAKKO-hSLTで形質転換したE. coli DH5αcompetent cell（トーヨーボー）を培養後、Plasmid Midi Kit（キアゲン）を用いてpAKKO-hSLTのプラスミドDNAを調製した。これをCellPhect Transfection Kit（アマシャムファルマシアバイオテク）を用い添付のプロトコルに従ってCHO dhfr^-細胞に導入した。6 μgのDNAをリン酸カルシウムとの共沈懸濁液とし、24時間前に5 x 10⁵または1 x 10⁶個のCHO dhfr^-細胞を播種した6 cmシャーレに添加した。10％ウシ胎児血清を含むMEMα培地で1日間培養した後、継代し、選択培地である10％透析ウシ胎児血清を含む核酸不含MEMα培地で培養した。選択培地中で増殖してくるヒトSLT発現CHO細胞である形質転換細胞のコロニー46クローンを選択した。
【００６１】
実施例４ 全長ヒトSLTレセプター蛋白質mRNAの発現量の高いCHO/hSLT細胞株の選択
実施例３で樹立されたCHO/hSLT株46クローンの全長ヒトSLTレセプター蛋白質mRNAの発現量をCytostar T Plate（アマシャムファルマシアバイオテク）を用い、添付のプロトコルに従って以下のように測定した。CHO/ hSLT株の各クローンをCytostar T Plateの各wellに2.5 x 10⁴個ずつ播種して24時間培養した後、10％ホルマリンによって細胞を固定した。各wellに0.25％ Triton X-100を添加して細胞の透過性をあげた後、³⁵Sラベルした配列番号：５のriboprobeを加えてハイブリダイズさせた。20 mg/mlのRNaseAを各wellに加えて遊離のriboprobeを消化し、プレートをよく洗浄した後、ハイブリダイズしたriboprobeの放射活性をTopcounterで測定した。放射活性の高い株がmRNA発現量が高い。mRNA発現量の高い6クローン（#1,3,4,13,26および36）を以下の実験に用いたが、特にクローン番号1を主に用いた。
【００６２】
実施例５ MCHによるヒトSLT発現CHO細胞に対するcAMP合成抑制活性
市販の合成ヒトMCH（配列番号：６、バッケム社）を種々の濃度に希釈し、ヒトSLT発現CHO細胞に対するcAMP合成抑制活性を以下に示す方法で測定した。実施例４で選択したCHO/hSLT細胞を24穴プレートに5 x 10⁴ cell/wellで播種し、48時間培養した。細胞を0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄した（以下、0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後0.5mlの反応用バッファーを加えて30分間培養器で保温した。反応用バッファーを除き、新たに0.25 mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、種々の量のMCHと2μMフォルスコリンを含む0.25 mlの反応用バッファーを細胞に加え、37℃で30分間反応させた。100μlの20%過塩素酸を加えて反応を停止させ、次に氷上で１時間置くことにより細胞内cAMPを抽出した。抽出液中のcAMP量は、cAMP EIAキット（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて測定した。その結果、MCHは30 pMの濃度で明らかに細胞内cAMP量を低下させ、さらにペプチド濃度を増やすと用量依存的に細胞内cAMP量は減少した。（図２）。図中、 cAMP合成抑制活性は、フォルスコリンを含む反応用バッファーを添加したときの細胞内cAMP量から反応用バッファーを添加したときの細胞内cAMP量を減じた量を100％として、MCHを加えたときの細胞内cAMP量から反応用バッファーを添加したときの細胞内cAMP量を減じた量を％として表わした。
【００６３】
実施例６ ヒトSLT発現CHO細胞膜画分の調製
1 x 10⁸個のCHO/hSLT細胞に10mlのホモジネートバッファー（10 mM NaHCO₃, 5 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 1μg/ml pepstatin, 4μg/ml E64, 20μg/ml leupeptin)添加し、ポリトロン（12,000 rpm、1分間）を用いて破砕した。細胞破砕液を遠心（1,000 g, 15分間）して上清を得た。次にこの上清を超遠心分離（Beckman Type 30ローター、30,000 rpm, 1時間）し、得られた沈殿物をヒトSLT発現CHO細胞膜画分とした。
【００６４】
実施例７ ボルトン−ハンター試薬を用いて作製した[¹²⁵I]-標識MCH(4-19)を用いた受容体結合実験
参考例３でボルトン−ハンター試薬を用いて作製した[¹²⁵I]-標識MCH(4-19)およびヒトSLT発現CHO細胞から調製した細胞膜画分を用いて受容体結合実験を行なった。
ヒトSLT発現CHO細胞から実施例６に従って調製した細胞膜画分を、アッセイ用バッファー（50 mM Tris-HCl、5 mM EGTA（エチレングリコールビス（アミノエチルエーテル）四酢酸）、5 mM酢酸マグネシウム、0.05% CHAPS、0.1% BSA（ウシ血清アルブミン）、0.25 mM PMSF（フェニルメチルスルホニルフルオライド）、1μg/ml ペプスタチン、20μg/ml ロイペプチン、pH 7.4）で各種濃度に希釈後、ポリプロピレン製試験管（ファルコン社、2053）に200μlずつ分注した。最大結合量（TB）を測定するために、2μlのDMSOと、20 nMの[¹²⁵I]-標識MCH(4-19) 2μlを、また、非特異的結合（NSB）を測定するために、100μM MCHのDMSO溶液2μlと、20 nMの[¹²⁵I]-標識MCH(4-19) 2μlを、膜画分溶液に添加した。25 ℃で60分間反応させた後、ポリエチレンイミン処理したグラスフィルター（ワットマン社、GF-F）を用いて反応液を吸引ろ過した。ろ過後、γ-カウンターを用いてろ紙上に残った[¹²⁵I]-標識MCH(4-19)の放射活性を測定した。図３に示すように、膜画分の濃度に依存した[¹²⁵I]-標識MCH(4-19)の特異的な結合（SB）が認められた。
また、膜画分濃度を30μg/ｍｌに設定して、阻害率（％） からMCHの50％阻害濃度（IC₅₀値）を算出したところ、IC₅₀値は約20 nMであった（図４）。また、MCHのアミノ末端短縮体であるMCH(4-19)のIC₅₀値は3.3 nMであった（図４）。
【００６５】
実施例８ FLIPRを用いたMCHによるヒトSLT発現CHO細胞の細胞内Caイオン濃度上昇活性の測定
実施例４で得られたヒトSLT発現CHO細胞のMCH（配列番号：６）による細胞内Caイオン濃度上昇活性の測定をFLIPR(モレキュラーデバイス社)を用いて行った。CHO/hSLT細胞を15 x 10⁴ cells/mlとなるように10％透析ウシ胎児血清を含むDMEMに懸濁し、FLIPR用96穴プレート(Black plate clear bottom、コースター社)に分注器を用いて各ウェルに200μlずつ植え込み（3.0×10⁴ cells/200μl/ウェル）、5％ CO₂インキュベーター中にて37℃で一晩培養した後、アッセイに用いた(以後このプレートを細胞プレートと言う)。HANKS’/HBSS（ニッスイハンクス２（日水製薬株式会社） 9.8 g、炭酸水素ナトリウム 0.35 g、HEPES 4.77 g 、6 M水酸化ナトリウム溶液で pH7.4に合わせた後、フィルター滅菌処理）20 ml、250 mM Probenecid 200μl、ウシ胎児血清(FBS) 200μlを混合したものに、Fluo 3-AM（同仁化学研究所） 2バイアル(50μg)をジメチルスルフォキサイド40μlおよび20% Pluronic acid（モレキュラープローブ社）40μlに溶解して加えて混和後、8連ピペットを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ウェル 100μlずつ分注した後、5％ CO₂インキュベーター中にて37℃で1時間インキュベートし、細胞に色素を印加した。FLIPR用96穴プレート(V-Bottomプレート、コースター社)の各ウェルに2.5 mM Probenecid、0.05％ BSAを含むHANKS’/HBSS 150μlを入れ、さらに種々の濃度のMCHを添加してサンプルプレートを調製した。細胞プレートの色素ローディング終了後、HANKS’/HBSSに2.5 mM Probenecidを加えた洗浄バッファーでプレートウォッシャー(モレキュラーデバイス社)を用いて細胞プレートを４回洗浄し、洗浄後100μlの洗浄バッファーを残した。この細胞プレートとサンプルプレートをFLIPRにセットしアッセイを行なった（FLIPRにより、サンプルプレートから50μlのサンプルが細胞プレートへと移される)。その結果、MCHは濃度依存的にヒトSLT発現CHO細胞の細胞内Caイオン濃度を上昇させることが示された（図５）。
【００６６】
実施例９ MCHがヒトSLT発現CHO細胞に対して惹起するアラキドン酸代謝物放出活性
種々の濃度のMCHが示すヒトSLT発現CHO細胞に対するアラキドン酸代謝物放出活性を以下の方法により測定した。実施例４で得られたヒトSLT発現CHO細胞であるCHO/hSLT株を24穴プレートに5 x 10⁴ cell/wellで播種し、24時間培養後、[³H]アラキドン酸を0.25μCi/wellとなるよう添加した。[³H]アラキドン酸添加16時間後、細胞を0.05% BSAと20 mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄し、各wellに種々の濃度のMCHを加えた0.05% BSAと20 mM HEPESを含むハンクスバッファー（pH7.4)500μlを添加した。37℃で60分間インキュベートした後に、反応液400μlをシンチレーターに加え、反応液中に遊離した[³H]アラキドン酸代謝物の量をシンチレーションカウンターにより測定した。その結果、MCHが用量依存的にヒトSLT発現細胞に対してアラキドン酸代謝物放出活性を示すことが確認され、そのEC₅₀値は0.57nMであった。種々の濃度のMCHが示すヒトSLT発現CHO細胞に対するアラキドン酸代謝物放出活性を図６に示した。
【００６７】
(配列表フリーテキスト)
配列番号：６
配列に関する他の情報：第７番目および第１６番目の２つのCys残基は分子内ジスルフィド結合を形成している。
配列番号：１０
配列に関する他の情報：第６番目および第１５番目の２つのCys残基は分子内ジスルフィド結合を形成している。
配列番号：１１
配列に関する他の情報：第５番目および第１４番目の２つのCys残基は分子内ジスルフィド結合を形成している。
配列番号：１２
配列に関する他の情報：第４番目および第１３番目の２つのCys残基は分子内ジスルフィド結合を形成している。
配列番号：１３
配列に関する他の情報：第３番目および第１２番目の２つのCys残基は分子内ジスルフィド結合を形成している。
配列番号：１４
配列に関する他の情報：第２番目および第１１番目の２つのCys残基は分子内ジスルフィド結合を形成している。
配列番号：１５
配列に関する他の情報：第１番目および第１０番目の２つのCys残基は分子内ジスルフィド結合を形成している。
【００６８】
【発明の効果】
本発明のＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩およびＳＬＴまたはその塩を用いることを特徴とするＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法は、食欲（摂食）増進剤の他、微弱陣痛、弛緩出血、胎盤娩出前後、子宮復古不全、帝王切開術、人工妊娠中絶、乳汁うっ滞などの予防・治療薬などとして用いることができるＳＬＴアゴニスト、肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia)、情動障害、性機能障害などの予防・治療薬などの他、過強陣痛、強直性子宮収縮、胎児仮死、子宮破裂、頚菅裂傷、早産、Prader-Willi症候群などの予防・治療薬などとして用いることができるＳＬＴアンタゴニストのスクリーニング方法として有用である。
【００６９】
【配列表】

【００７０】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト海馬由来新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質hSLTをコードするDNAの塩基配列、およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す。
【図２】種々の濃度のMCHのヒトSLT発現CHO細胞に対するcAMP合成抑制活性を示す図を示す。
【図３】ボルトン−ハンター試薬を用いて作製した[¹²⁵I]-標識MCH(4-19)のヒトSLT発現CHO細胞から調製した細胞膜画分に対する特異的結合を示す図を示す。３種類の発現細胞のクローン（#1, 26, 36）の膜画分について測定した。
【図４】ヒトSLT発現CHO細胞から調製した細胞膜画分を用いた、ボルトン−ハンター試薬を用いて作製した[¹²⁵I]-標識MCH(4-19)に対するMCHおよびそのアミノ末端短縮体であるMCH(4-19)の結合阻害活性を示す図を示す。
【図５】FLIPRを用いて測定した種々の濃度のMCHのヒトSLT発現CHO細胞に対する細胞内Caイオン上昇活性を示す図を示す。
【図６】種々の濃度のMCHが示すヒトSLT発現CHO細胞に対するアラキドン酸代謝物放出活性を示す図を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an orphan receptor protein represented by SEQ ID NO: 3 (WO 00/49046 (PCT / JP00 / 00927)) or a salt thereof and MCH (melanin concentrating hormone; Endocrinology, vol. .125, 1660-1665 (1989)) or a derivative thereof or a salt thereof, and the like, and a screening method for an anti-obesity drug or appetite regulating drug, and the like.
[0002]
[Prior art]
Maintenance of vital homeostasis, reproduction, individual development, metabolism, growth, nervous system, circulatory system, immune system, digestive system, metabolic system regulation, sensory reception, etc. The cells receive endogenous factors such as transmitter substances or sensory stimuli such as light and smell through specific receptors present on the cell membrane of the living body, and react accordingly. Has been done by. Many receptors for hormones and neurotransmitters that regulate such functions are conjugated to guanine nucleotide-binding protein (hereinafter sometimes abbreviated as G protein). It is characterized by transmitting various signals and expressing various functions. These receptor proteins also have seven transmembrane regions in common. For these reasons, these receptors are collectively referred to as G protein-coupled receptors or 7-transmembrane receptors. Thus, it is known that various hormones and neurotransmitters and their receptor proteins exist and interact to play an important role in the regulation of biological functions. It is still unclear whether there is a neurotransmitter) and a receptor for it.
In recent years, human genes have been rapidly elucidated by the accumulation of sequence information by random sequencing of human genomic DNA or cDNA derived from various human tissues and rapid progress in gene analysis technology. Along with this, the existence of many genes that are expected to encode proteins of unknown function has been revealed. G protein-coupled receptors not only have seven transmembrane domains but also have many common sequences in their nucleic acids or amino acids, so they are clearly classified as G protein-coupled receptors from such proteins. be able to. On the other hand, such a G protein-coupled receptor gene has also been obtained by a polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as PCR) method using the similarity in structure. Of the G protein-coupled receptors obtained so far, this is a subtype that has a high structural homology with known receptors, and its ligand can be easily predicted. In most cases, the endogenous ligand is unpredictable, and no corresponding ligand has been found for these receptors. For this reason, these receptors are called orphan receptors. Such unidentified endogenous ligands for orphan receptors may be involved in biological phenomena that have not been fully analyzed because the ligands were not known. And when such a ligand is associated with an important physiological action or pathology, the development of its receptor agonist or antagonist is expected to lead to the creation of innovative drugs (Stadel, J et al., TiPS, 18, 430-437, 1997, Marchese, A. et al., TiPS, 20, 370-375, 1999, Civelli, O. et al., Brain Res. 848, 63-65, 1999). However, there have not been so many examples of actual orphan G protein-coupled receptor ligands identified so far.
Recently, several groups have attempted to search for ligands for such orphan receptors, and isolation and structure determination of ligands, which are new bioactive peptides, have been reported. Reinsheid et al. And Meunier et al. Independently named orphanin FQ or nociceptin using the orphan G protein-coupled receptor LC132 or ORL1 encoding cDNA in animal cells to express the receptor. Novel peptides were isolated from porcine or rat brain extracts and sequenced (Reinsheid, RK et al., Science, 270, 792-794, 1995, Meunier, J.-C. et al. Nature, 377, 532-535, 1995). Although this peptide was reported to be involved in pain sensation, further studies in receptor knockout mice revealed that it was involved in memory (Manabe, T. et al., Nature, 394 Volume 577-581, 1998).
Subsequently, new peptides such as PrRP (prolactin releasing peptide), orexin, apelin, ghrelin, and GALP (galanin-like peptide) were isolated as ligands for orphan G protein-coupled receptors. (Hinuma, S. et al., Nature, 393, 272-276, 1998, Sakurai, T. et al., Cell, 92, 573-585, 1998, Tatemoto, K. et al. Bichem. Biophys. Res. Commun., 251, 471-476, 1998, Kojima, M. et al., Nature, 402, 656-660, 1999, Ohtaki, T. et al., J. Biol. Chem., 274, 37041-37045, 1999).
On the other hand, a receptor for a physiologically active peptide that has not been clarified until now may be elucidated by a similar method. It was revealed that the receptor of motilin involved in intestinal contraction is GPR38 (Feighner, SD et al., Science, 284, 2184-2188, 1999), and SLC-1 is a melanin-concentrating hormone ( MCH) receptor (Chambers, J. et al., Nature, 400, 261-265, 1999, Saito, Y. et al., Nature, 400, 265-269, 1999 , Shimomura, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 261, 622-626, 1999, Lembo, PMC et al., Nature Cell Biol., 1, 267-271, 1999 Bachner, D. et al., FEBS Lett., 457, 522-524, 1999), and GPR14 (SENR) was reported to be a receptor for urotensin II (Ames, RS et al. Nature, 401, 282-286, 1999, Mori, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 265, 123-129, 1999, Nothacker, H.-P. et al., Nature Cell Biol., 1, 383-385, 1999, Liu, Q. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 266, 174-178, 1999)MCH has been shown to be involved in obesity because its knockout mice exhibit phenotype of sputum (Shimada, M. et al., Nature, 396, 670-674, 1998), but its receptor As a result, it became possible to search for receptor antagonists that have potential as anti-obesity agents. It has also been reported that urotensin II exerts a strong action on the cardiovascular system because it induces cardiac ischemia by intravenous administration to monkeys (Ames, RS et al., Nature, 401, 282-2). 286, 1999).
Thus, orphan receptors and their ligands are often involved in new physiological actions, and their elucidation is expected to lead to new drug development. However, there are many difficulties in searching for ligands for orphan receptors, and only a small number of receptors have been revealed so far, although the existence of numerous orphan receptors has been revealed. .
As an orphan G protein-coupled receptor, Watanabe et al. A novel receptor SLT (a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the present specification: hereinafter, sometimes simply referred to as SLT) (WO 00/49046 (PCT / JP / 00927)), but it has not been known what the ligand is.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
The search for a ligand for SLT, which is an orphan receptor protein, and the establishment of a screening method for compounds and the like characterized by using SLT and its ligand have been the subjects.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors prepared CHO cells that highly express the SLT receptor protein, and administered various animal tissue extracts or known peptides to examine the response of the receptor-expressing cells. As a result, the present inventors have unexpectedly found that MCH exhibits an intracellular cAMP production inhibitory activity against SLT receptor-expressing CHO cells. This indicates that MCH is an endogenous ligand for SLT.
Based on this finding, the present inventors have used a screening system using MCH and SLT, and more preferably combined with a screening system using MCH and SLC-1, to thereby detect MCH-mediated diseases. It has been found for the first time that therapeutic drugs (such as MCH antagonists or agonists, specifically anti-obesity drugs, etc.) can be screened.
[0005]
That is, the present invention
(1) MCH characterized by using melanin-concentrating hormone (MCH) or a derivative thereof or a salt thereof and a protein represented by SEQ ID NO: 3 or a salt thereof, or a partial peptide thereof or an amide or ester thereof or a salt thereof Or a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the salt thereof and the protein represented by SEQ ID NO: 3, or a salt thereof, or a partial peptide thereof or an amide or ester thereof or a salt thereof,
(2) The screening method according to the above (1), further comprising using SLC-1 or a salt thereof, or a partial peptide or amide or ester thereof or a salt thereof,
(3) MCH or a salt thereof, and a protein represented by SEQ ID NO: 3, or a salt thereof, or a partial peptide thereof, an amide or ester thereof, or a salt thereof, A kit for screening a compound represented by SEQ ID NO: 3, or a salt thereof, or a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof, or a salt thereof;
(4) The screening kit according to (3), further comprising SLC-1 or a salt thereof, or a partial peptide or amide or ester thereof or a salt thereof,
(5) MCH or a salt thereof and a protein represented by SEQ ID NO: 3, or a salt thereof, or a partial peptide thereof, which can be obtained using the screening method described in (1) above or the screening kit described in (3) above Or a compound or a salt thereof that changes the binding property with an amide or an ester thereof or a salt thereof,
(6) A medicament comprising the compound according to (5) above or a salt thereof,
(7) The medicament according to (6) above, which is an anti-obesity drug,
(8) The screening method according to (1) above, wherein MCH is a peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
(9) The screening kit according to (3), wherein MCH is a peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
(10) The screening method according to the above (1), wherein the derivative is a peptide containing the 5th to 19th sequences from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, or an amide or ester thereof,
(11) The screening kit according to the above (3), wherein the derivative is a peptide containing the 5th to 19th sequences from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, or an amide or ester thereof,
(12) MCH whose derivative is derived from a Bolton Hunter reagent or a peptide containing the 5th to 19th sequences from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 derived from a Bolton Hunter reagent or a peptide thereof The screening method according to the above (1), which is an amide or an ester thereof,
(13) MCH derived from a Bolton Hunter reagent or a peptide containing the 5th to 19th sequences from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 derived from a Bolton Hunter reagent or a derivative thereof A screening kit according to the above (3), which is an amide or an ester thereof;
(14) MCH or a derivative thereof or a salt thereof is [¹²⁵I]-[N- (3- (4-hydroxy-3-iodophenyl) propionyl) -Met^Four] -MCH (4-19) or a screening method according to (1) above, which is a salt thereof,
(15) MCH or a derivative thereof or a salt thereof is [¹²⁵I]-[N- (3- (4-hydroxy-3-iodophenyl) propionyl) -Met^Four] -MCH (4-19) or a salt thereof, the screening kit according to the above (3),
(16) (1) MCH or a derivative thereof or a salt thereof; (2) SLC-1 or a salt thereof, or a partial peptide or an amide or ester thereof or a salt thereof; and (3) SEQ ID NO: 3. Using a protein or a salt thereof, or a partial peptide thereof or an amide or ester thereof or a salt thereof,
1) MCH or a derivative thereof or a salt thereof,
2) (i) SLC-1 or a salt thereof, or a partial peptide or amide or ester thereof or a salt thereof; and / or
(Ii) a method for screening a compound represented by SEQ ID NO: 3, or a salt thereof, or a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof, or a salt thereof,
(17) A compound that selectively changes the binding property between MCH or a derivative thereof or a salt thereof and the protein represented by SEQ ID NO: 3, or a salt thereof, or a partial peptide or amide or ester thereof or a salt thereof, or Screening method according to (16) above, wherein the salt is screened,
(18) Screening a compound or salt thereof that selectively changes the binding property between MCH or a derivative thereof or a salt thereof and SLC-1 or a salt thereof, or a partial peptide or an amide or ester thereof or a salt thereof. The screening method according to (16) above, characterized by:
(19) MCH or a derivative thereof or a salt thereof; (i) a protein represented by SEQ ID NO: 3 or a salt thereof; or a partial peptide or an amide or ester thereof or a salt thereof; and (ii) SLC-1 or a salt thereof Screening a salt, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof, an ester thereof, or a compound that selectively changes the binding property thereof, or a salt thereof,
(20) (1) MCH or a derivative thereof or a salt thereof; (2) SLC-1 or a salt thereof, a partial peptide or an amide or ester thereof or a salt thereof; and (3) represented by SEQ ID NO: 3. Containing a protein or a salt thereof, or a partial peptide thereof or an amide or ester thereof or a salt thereof,
1) MCH or a derivative thereof or a salt thereof,
2) (i) SLC-1 or a salt thereof, or a partial peptide or amide or ester thereof or a salt thereof; and / or
(Ii) Providing a kit for screening a compound represented by SEQ ID NO: 3, a salt thereof, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof, a salt thereof or a salt thereof, or a salt thereof. It is.
[0006]
In the present specification, “substantially the same” means that the activity of a polypeptide or the like, for example, the binding activity of a ligand (MCH) and a receptor (SLT), physiological characteristics, etc. are substantially the same. .
A method for producing SLT or a salt thereof (hereinafter sometimes simply referred to as SLT) and MCH or a derivative thereof or a salt thereof (hereinafter sometimes simply referred to as MCH) used in the present invention will be described in more detail below. explain.
Further, the MCH receptor SLC-1 or a salt thereof (hereinafter sometimes simply referred to as SLC-1) that can be used in combination with a screening method characterized by using the SLT and MCH of the present invention is as follows. For example, Chambers, J. et al., Nature, 400, 261-265, 1999, Saito, Y. et al., Nature, 400, 265-269, 1999, Shimomura, Y. et. al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 261, 622-626, 1999, Lembo, PMC et al., Nature Cell Biol., 1, 267-271, 1999, Bachner, D. et al., FEBS Lett., 457, 522-524, 1999, and WO 00/40725 (PCT / JP99 / 07336). Are also described below.
SLT, SLC-1 and MCH used in the present invention include all tissues such as humans, warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, pigs, sheep, cows, monkeys, etc.) and fish (eg, pituitary gland, A polypeptide derived from pancreas, brain, kidney, liver, gonad, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, gastrointestinal tract, blood vessel, heart, etc.) : 3, SLC-1 is SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17, and MCH is any polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6. It may be a thing. For example, as SLT, in addition to a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, a polypeptide having substantially the same activity as the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 Etc. Examples of substantially the same activity include ligand binding activity and signal transduction activity. “Substantially the same quality” means that the ligand binding activity and the like are the same in nature. Accordingly, strength factors such as the strength of the ligand binding activity and quantitative factors such as the molecular weight of the polypeptide may be different. SLC-1 includes a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17 in addition to the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17, and the like. Examples thereof include polypeptides having substantially the same quality of activity. Examples of substantially the same activity include ligand binding activity and signal transduction activity. “Substantially the same quality” means that the ligand binding activity and the like are the same in nature. Accordingly, strength factors such as the strength of the ligand binding activity and quantitative factors such as the molecular weight of the polypeptide may be different. As MCH, in addition to the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, a polypeptide having substantially the same activity as the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is used. can give. Examples of substantially the same activity include receptor binding activity. “Substantially the same quality” means that the receptor binding activity and the like are the same in nature. Accordingly, strength factors such as the strength of receptor binding activity and quantitative factors such as the molecular weight of the polypeptide may be different.
[0007]
In the present specification, SLT, SLC-1 and MCH are the N-terminus (amino terminus) at the left end and the C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide designation. For example, in the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 6, the C-terminus is usually a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate (—COO).^-), But the C-terminus is an amide (-CONH₂) Or ester (-COOR). Examples of the R of the ester include C such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl._1-6C such as alkyl group, cyclopentyl, cyclohexyl, etc._3-8C such as cycloalkyl group, phenyl, α-naphthyl, etc._6-12Phenyl-C such as aryl group, benzyl, phenethyl, benzhydryl_1-2Alkyl or α-naphthyl-C such as α-naphthylmethyl_1-2C such as alkyl_7-14In addition to the aralkyl group, a pivaloyloxymethyl group, which is widely used as an oral ester, can be mentioned.
As salts of SLT, SLC-1 and MCH used in the present invention, salts with physiologically acceptable bases (for example, alkali metals) and acids (organic acids, inorganic acids) are used. The acid addition salts that are acceptable are preferred. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, Salts with tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
SLT, SLC-1 and MCH used in the present invention are a method according to a known method (eg, a method described in FEBS Letters 398 (1996) 253-258, WO 96/18651), that is, human or warm blood It can be produced by a method of purifying a polypeptide from animal tissues or cells, or can be produced according to the protein (peptide) synthesis method described below. It can also be produced by culturing a transformant containing DNA encoding a protein (peptide) described later.
[0008]
In the case of producing from tissues or cells of humans, warm-blooded animals, fish, etc., after homogenizing the tissues or cells of humans, warm-blooded animals, fish, etc., extraction is performed with acid, organic solvent, etc. Purification and isolation can be achieved by combining chromatography such as precipitation, dialysis, gel filtration, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like.
As described above, SLT, SLC-1 and MCH used in the present invention are appropriately synthesized according to a known method for synthesizing a protein (peptide) or a protein (peptide) containing SLT, SLC-1 and / or MCH is appropriately used. It can be produced by cleaving with peptidase. As a protein (peptide) synthesis method, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, when a partial peptide or amino acid capable of constituting SLT, SLC-1 and / or MCH is condensed with the remaining part and the product has a protecting group, the protecting protein is eliminated, thereby removing the target protein (peptide). Can be manufactured. Examples of known condensation methods and protecting group removal include the methods described in (1) to (5) below.
(1) M. Bodanszky and M.A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
(2) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
(3) Nobuo Izumiya et al., Basics and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
(4) Haruaki Yajima and Shunpei Sugawara, Biochemistry Experiment Course 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977)
▲ 5 ▼ Supervision by Yajima Haruaki, Development of follow-up medicines Volume 14 Peptide synthesis Hirokawa Shoten
Further, after the reaction, the protein (peptide) can be purified and isolated by combining ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. When the protein (peptide) obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method. Conversely, when it is obtained as a salt, it is converted into a free form by a known method. can do.
[0009]
As the amides of SLT, SLC-1 and MCH, commercially available resins for peptide synthesis suitable for amide formation can be used. Examples of such resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethylphenyl. Examples include acetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, and the like. . Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target peptide according to various condensation methods known per se. At the end of the reaction, the protein (peptide) is cut out from the resin and at the same time, various protecting groups are removed, and if necessary, intramolecular disulfide bond forming reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein (peptide).
For the above-described condensation of protected amino acids, various activating reagents that can be used for protein (peptide) synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. Examples of carbodiimides include DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and the like. For activation by these, a protected amino acid together with a racemization inhibitor (eg, HOBT, HOOBT, etc.) is added directly to the resin, or a preprotected amino acid such as a symmetric anhydride or HOBT ester or HOOBT ester is added. It can be added to the resin after activation. The solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents that are known to be usable for the protein (peptide) condensation reaction. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, and sulfoxides such as dimethyl sulfoxide. , Tertiary amines such as pyridine, ethers such as dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof. The reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for peptide bond formation reaction, and is usually appropriately selected from the range of about -20 ° C to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in an excess of 1.5 to 4 times. As a result of the test using the ninhydrin reaction, when the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation is not obtained even after repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated with acetic anhydride or acetylimidazole so as not to affect the subsequent reaction.
[0010]
Examples of the protecting group for the amino group of the raw material amino acid include Z, Boc, tertiary pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, trifluoro Acetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like. Examples of the protecting group for the carboxyl group include C described above as R._1-6Alkyl group, C_3-8A cycloalkyl group, C_7-14In addition to the aralkyl group, 2-adamantyl, 4-nitrobenzyl, 4-methoxybenzyl, 4-chlorobenzyl, phenacyl group and benzyloxycarbonyl hydrazide, tertiary butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like can be mentioned.
The hydroxyl groups of serine and threonine can be protected, for example, by esterification or etherification. Examples of groups suitable for esterification include lower alkanoyl groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, groups derived from carbon such as benzyloxycarbonyl groups and ethoxycarbonyl groups. Examples of groups suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a tertiary butyl group.
Examples of protecting groups for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl and Cl.₂-Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, tertiary butyl and the like.
Examples of the protecting group for imidazole of histidine include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like.
Examples of the activated carboxyl group of the raw material include the corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, cyano Methyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HOBT)] and the like. Examples of the activated amino group of the raw material include the corresponding phosphoric acid amide.
Examples of methods for removing (eliminating) protecting groups include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd black or Pd carbon, and anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid. And acid treatment with trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like. The elimination reaction by the acid treatment is generally performed at a temperature of −20 ° C. to 40 ° C. In the acid treatment, anisole, phenol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, 1 Therefore, the addition of a cation scavenger such as 2-ethanedithiol is effective. In addition, the 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine was removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan was the above 1,2-ethanedithiol and 1,4-butane. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it can also be removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide, dilute ammonia or the like.
The protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw material and the protective group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.
As another method for obtaining amides of SLT, SLC-1 and MCH, first, after amidating the α-carboxyl group of the carboxyl terminal amino acid, the peptide chain was extended to the desired chain length on the amino group side, A peptide in which only the protecting group of the α-amino group at the N-terminal of the peptide chain is removed and a peptide (or amino acid) in which only the protecting group of the carboxyl group at the C-terminal is removed are produced, and both peptides are as described above. Condensation in a mixed solvent. The details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected peptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-described method to obtain the desired crude protein (peptide). This crude protein (peptide) can be purified using various known purification means, and the main fraction can be freeze-dried to obtain an amide form of the desired protein (peptide).
[0011]
To obtain an ester of SLT, SLC-1, and MCH, the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid is condensed with the desired alcohol to form an amino acid ester, and then the desired protein is obtained in the same manner as the amide of the protein (peptide). An ester of (peptide) can be obtained.
The derivatives of MCH used in the present invention include (1) a partial peptide of MCH, (2) a peptide in which the constituent amino acids of MCH are deleted, a peptide in which other amino acids are added to the constituent amino acids, and constituent amino acids to other amino acids. Substituted peptide, or (3) MCH, the partial peptide described in (1) above, or the peptide labeled in (2), etc., preferably those having the ability to bind to SLT and SLC-1 Any one may be used.
Specific examples of the MCH partial peptide include a peptide containing the 5th to 19th partial sequences from the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, or an amide or ester thereof, or a salt thereof. It is done. More specifically, a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, or an amide or ester thereof, or The salt etc. are mention | raise | lifted.
Furthermore, when performing the below-described screening using SLT and / or SLC-1, a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, or an amide or ester thereof, or a salt thereof is preferably used.
In addition, as a peptide in which a constituent amino acid of MCH is deleted, a peptide in which another amino acid is added to the constituent amino acid, or a peptide in which the constituent amino acid is substituted with another amino acid, one or two or more in SEQ ID NO: 6 (preferably Is about 1 to 10, more preferably several (1 or 2) amino acids deleted, or 1 or 2 (preferably about 1 to 10 or more, more preferably) in the amino acid sequence. Is added with about 1 to 5, more preferably several (1 or 2) amino acids, or one or more (preferably about 1 to 10, more preferably) in the amino acid sequence. Examples thereof include peptides in which about 1 to 5, more preferably several (1 or 2) amino acids are substituted with other amino acids.
Substantially identical substitutions of amino acids in the amino acid sequence can be selected from other amino acids in the class to which the amino acid belongs, for example. Nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan, methionine and the like. Examples of polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine. Examples of positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine. Examples of negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
However, the position where the above-mentioned other amino acids are deleted or substituted is preferably a position other than Cys in the constituent amino acids of MCH.
MCH, the peptide described in (1) or the peptide described in (2) is labeled with an isotope-labeled or fluorescently-labeled product by a method known per se (for example, with fluorescein, etc. Fluorescent label), biotinylated, enzyme-labeled and the like.
[0012]
Specifically, for example, by a known method [^ThreeH], [¹²⁵I], [¹⁴C], [³⁵MCH labeled with S] or the like can be used. In addition, a labeled form of MCH or a derivative thereof prepared by a known method using a Bolton-Hunter reagent can also be used.
Specific examples of the labeled form of MCH or a derivative thereof include, for example,
(1) [¹²⁵I]-[N- (3- (4-hydroxy-3-iodophenyl) propionyl) -Asp¹] -MCH
[Chemical 1]

(2) [¹²⁵I]-[N- (3- (4-hydroxy-3-iodophenyl) propionyl) -Phe²] -MCH (2-19)
[Chemical 2]

(3) [¹²⁵I]-[N- (3- (4-hydroxy-3-iodophenyl) propionyl) -Asp^Three] -MCH (3-19)
[Chemical Formula 3]

(4) [¹²⁵I]-[N- (3- (4-hydroxy-3-iodophenyl) propionyl) -Met^Four] -MCH (4-19)
[Formula 4]

(5) [¹²⁵I]-[N- (3- (4-hydroxy-3-iodophenyl) propionyl) -Leu^Five] -MCH (5-19)
[Chemical formula 5]

(6) [¹²⁵I]-[N- (3- (4-hydroxy-3-iodophenyl) propionyl) -Arg⁶] -MCH (6-19)
[Chemical 6]

(7) [¹²⁵I]-[N- (3- (4-hydroxy-3-iodophenyl) propionyl) -Cys⁷] -MCH (7-19)
[Chemical 7]

Etc.
Especially, [¹²⁵I]-[N- (3- (4-hydroxy-3-iodophenyl) propionyl) -Met^Four] -MCH (4-19) is preferably used.
Examples of the salt of MCH or a derivative thereof include those similar to the above-described salts of SLT, SLC-1 and MCH.
As the partial peptide of SLT and / or SLC-1 used in the present invention (hereinafter, may be abbreviated as partial peptide), any peptide can be used as long as it is a partial peptide constituting SLT and / or SLC-1. For example, among the protein molecules of SLT and / or SLC-1, those that are exposed to the outside of the cell membrane and have receptor binding activity are used.
Specifically, it is a peptide containing a portion analyzed to be an extracellular region (hydrophilic site) in hydrophobic plot analysis of SLT and / or SLC-1. In addition, a peptide partially including a hydrophobic site can be used as well. Peptides containing individual domains can also be used, but a peptide containing a portion containing a plurality of domains may be used.
The number of amino acids of the partial peptide of SLT and / or SLC-1 is at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more, among the amino acid sequences constituting SLT and / or SLC-1. .
[0013]
Moreover, as a partial peptide of SLT and / or SLC-1, 1 or 2 or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (in the amino acid sequence representing SLT and / or SLC-1) ( 1 or 2)), or 1 or 2 (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1) Or 2)), or one or more (preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 5, more preferably several (1 or 1) in the amino acid sequence. 2)) amino acids are substituted with other amino acids.
Hereinafter, the partial peptide of SLT and SLT may be simply referred to as SLT, and the partial peptide of SLC-1 and SLC-1 may be simply referred to as SLC-1.
The DNA encoding SLT used in the present invention includes a DNA containing a DNA having a base sequence encoding a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, The DNA encoding SLC-1 used in the invention has a base sequence encoding a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17. As the DNA containing MCH and the DNA encoding MCH used in the present invention, a DNA having a base sequence encoding a peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 Any DNA may be used as long as it contains DNA. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the tissue / cell described above, cDNA library derived from the tissue / cell described above, and synthetic DNA may be used. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Moreover, it can also be amplified directly by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using an RNA fraction prepared from the tissues and cells.
More specifically, (1) an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 6 under stringent conditions (2) DNA that hybridizes with the sequence of DNA containing DNA having a base sequence encoding a protein or peptide containing N, and (2) due to the degeneracy of the genetic code, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: : A sequence having a DNA containing a DNA having a base sequence encoding a protein or peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 6, and (1) DNA that encodes a protein or peptide that does not hybridize to Is used. Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Examples of the stringent conditions include 42 ° C., 50% formamide, 4 × SSPE (1 × SSPE = 150 mM NaCl, 10 mM NaH).₂PO_Four・ H₂O, 1 mM EDTA pH 7.4), 5 × Denhardt's solution, 0.1% SDS.
As a DNA encoding SLT used in the present invention, that is, a DNA containing a DNA having a base sequence encoding a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. Specific examples include DNA containing DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 9.
DNA having SLC-1 used in the present invention, that is, having a base sequence encoding a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17 More specifically, examples of the DNA containing DNA include DNA containing DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 19.
Examples of the DNA encoding MCH used in the present invention include DNA containing a DNA having a base sequence encoding a peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6. can give.
The DNA encoding SLT, SLC-1 and MCH used in the present invention can also be produced by the following genetic engineering technique.
As a means for cloning DNA that completely encodes SLT, SLC-1 or MCH of the present invention, a PCR method known per se using a synthetic DNA primer having a partial base sequence of SLT, SLC-1 or MCH of the present invention A DNA fragment or a synthesis comprising a part or the entire region of a base sequence encoding, for example, SLT, SLC-1 or MCH, by amplifying a target DNA from the DNA library or the like by a DNA library or the like. Sorting can be performed by hybridization with the one labeled with DNA. The hybridization method is performed according to the method described in Molecular Cloning (2nd ed .; J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989), for example. When a commercially available library is used, it is carried out according to the method described in the attached instruction manual.
The cloned DNA encoding SLT, SLC-1 or MCH used in the present invention can be used as it is depending on the purpose, or digested with a restriction enzyme or added with a linker as desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 'end side, and may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon on the 3' end side. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
[0014]
The expression vector of SLT, SLC-1 or MCH used in the present invention is, for example, (a) excising a target DNA fragment from DNA encoding SLT, SLC-1 or MCH used in the present invention; The DNA fragment can be produced by ligating downstream of a promoter in an appropriate expression vector.
Examples of vectors include Escherichia coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), λ phage and the like. Animal viruses such as bacteriophage, retrovirus, vaccinia virus and baculovirus are used. The promoter used may be any promoter that is appropriate for the host used for gene expression.
When the host for transformation is an animal cell, SV40-derived promoters, retrovirus promoters, metallothionein promoters, heat shock promoters, cytomegalovirus promoters, SRα promoters and the like can be used. When the host is Escherichia, Trp promoter, T7 promoter, lac promoter, recA promoter, λPL promoter, lpp promoter, etc., when the host is Bacillus, SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, etc. When the host is yeast, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH1 promoter, GAL promoter, etc. are preferable. When the host is an insect cell, polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable.
In addition to the above, an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40ori) and the like is used as desired. it can. Examples of selection markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter Amp).^rAnd neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo, G418 resistance) and the like. In particular, CHO (dhfr^-) When using the DHFR gene as a selection marker using cells, it can also be selected by a medium not containing thymidine.
If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the polypeptide or a partial peptide thereof. When the host is Escherichia, the phoA signal sequence, OmpA, signal sequence, etc., and when the host is Bacillus, the α-amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc. In some cases, mating factor α (MFα) signal sequence, invertase signal sequence, etc. When the host is an animal cell, for example, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule / signal sequence, etc. Can be used respectively.
A transformant can be produced using a vector containing a DNA encoding SLT, SLC-1 or MCH thus constructed.
As the host, for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect or insect cells, animal cells, and the like are used.
Examples of the genus Escherichia include Escherichia coli K12 / DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA], 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology, 120 Volume 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], and the like.
Examples of the genus Bacillus include Bacillus subtilis MI114 [Gen, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984). ] Is used.
Examples of yeast include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R.^-NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, etc. are used.
Examples of insects include silkworm larvae [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
As insect cells, for example, when the virus is AcNPV, larvae-derived cell lines (Spodoptera frugiperda cells; Sf cells), MG1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, High Five derived from eggs of Trichoplusia ni^TMCells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. When the virus is BmNPV, sputum-derived cell lines (Bombyx mori N; BmN cells) and the like are used. Examples of the Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL 1711), Sf21 cells [Vaughn, J.L. et al., In Vitro, Vol. 13, pp. 213-217 (1977)].
Examples of animal cells include monkey COS-7 cells, Vero cells, Chinese hamster cells CHO, and DHFR gene-deficient Chinese hamster cells CHO (dhfr).^-CHO cells), mouse L cells, mouse 3T3 cells, mouse myeloma cells, human HEK293 cells, human FL cells, 293 cells, C127 cells, BALB3T3 cells, Sp-2 / O cells and the like.
In order to transform Escherichia, for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 69, 2110 (1972), for example, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA ) And Gene, Vol. 17, 107 (1982).
Transformation of Bacillus is carried out according to the method described in, for example, Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
To transform yeast, see, for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978). This is done according to the method described.
Insect cells or insects are transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, Vol. 6, pp. 47-55 (1988).
Animal cells are transformed according to the method described in, for example, Virology, Vol. 52, 456 (1973).
As a method for introducing an expression vector into cells, for example, the lipofection method [Felgner, PL et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the National Academy of Sciences of the United States of America), 84, 7413 (1987)], calcium phosphate method [Graham, FL and van der Eb, AJ Virology, 52, 456-467 (1973)], Electroporation (Nuemann, E. et al. Embo Journal (EMBO J.), Vol. 1, pp. 841-845 (1982)).
Thus, a transformant transformed with an expression vector containing DNA encoding SLT, SLC-1 or MCH used in the present invention is obtained.
In addition, as a method of stably expressing SLT, SLC-1 or MCH used in the present invention using animal cells, a cell in which the expression vector introduced into the above animal cells is integrated into a chromosome is selected by clone selection. There is a way to choose. Specifically, a transformant is selected using the above selection marker as an index. Furthermore, a stable animal cell line having a high expression ability of SLT, SLC-1 or MCH used in the present invention is obtained by repeatedly selecting clones for the animal cells obtained using the selection marker as described above. Obtainable. In addition, when the dhfr gene is used as a selection marker, the MTX concentration is gradually increased and cultured, and a resistant strain is selected, whereby the DNA encoding SLT, SLC-1 or MCH used in the present invention is used together with the dhfr gene. Can be amplified intracellularly to obtain animal cell lines with higher expression.
Culturing the above transformant under conditions capable of expressing DNA encoding SLT, SLC-1 or MCH used in the present invention, and generating and accumulating SLT, SLC-1 or MCH used in the present invention Can produce SLT, SLC-1 or MCH used in the present invention.
When cultivating a transformant whose host is an Escherichia bacterium or Bacillus genus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culture, including a carbon source necessary for the growth of the transformant, Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are contained. Examples of the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose. Examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract, and the like. Examples of organic substances and inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5-8.
[0015]
As a medium for culturing Escherichia, for example, M9 medium containing glucose and casamino acids [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]. Here, in order to make the promoter work efficiently if necessary, a drug such as 3β-indolylacrylic acid can be added.
When the host is Escherichia, the culture is usually performed at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
When the host is Bacillus, the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
When culturing a transformant whose host is yeast, examples of the medium include a Burkholder minimal medium [Bostian, KL et al., “Procedures of the National Academy of Sciences of Sciences. USA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] and SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., “Procedures of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 81, 5330 (1984)] The pH of the medium should be adjusted to about 5-8. The culture is usually performed at about 20 ° C. to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
When cultivating a transformant whose host is an insect cell, as a medium, an additive such as 10% bovine serum that has been immobilized to Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195,788 (1962)) Those added as appropriate are used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The culture is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
When cultivating a transformant whose host is an animal cell, examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, Vol. 122, 501 (1952)], DMEM medium [ Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of The American Medical Association 199, 519 (1967)], 199 medium [ Proceeding of the Society for The Biological Medicine, Vol. 73, 1 (1950)]. The pH is preferably about 6-8. The culture is usually performed at about 30 ° C. to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
Especially CHO (dhfr^-) When cells and dhfr genes are used as selection markers, it is preferable to use a DMEM medium containing dialyzed fetal calf serum that contains almost no thymidine.
Separation and purification of SLT, SLC-1 or MCH used in the present invention from the above culture can be performed, for example, by the following method.
When SLT, SLC-1 or MCH used in the present invention is extracted from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasonic waves. A method of obtaining a crude extract of SLT, SLC-1 or MCH used in the present invention by centrifuging or filtering after lysozyme and / or freeze-thawing, etc. can be used as appropriate. The buffer solution may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 (registered trademark, hereinafter may be abbreviated as TM).
[0016]
When SLT, SLC-1 or MCH used in the present invention is secreted into the culture solution, the cells or cells and the supernatant are separated by a method known per se after completion of the culture, and the supernatant is collected.
Purification of the SLT, SLC-1 or MCH used in the present invention contained in the culture supernatant or the extract thus obtained can be carried out by appropriately combining per se known separation and purification methods. . These known separation and purification methods include mainly molecular weights such as methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Method using difference in charge, method using difference in charge such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, and difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography A method using a difference in isoelectric point such as a method, isoelectric focusing method or chromatofocusing is used.
When SLT, SLC-1 or MCH used in the present invention thus obtained is obtained in a free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely obtained as a salt. In some cases, it can be converted into a free form or other salt by a method known per se or a method analogous thereto.
In addition, SLT, SLC-1 or MCH used in the present invention produced by a recombinant can be arbitrarily modified by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification, or a protein (peptide) can be added. It can also be partially removed. Examples of protein modifying enzymes include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase, and the like. In order to delete the N-terminal amino acid, a known Edman method using Edman reagent (phenyl isothiocyanate) can be used.
The presence of SLT, SLC-1 or MCH used in the present invention thus produced can be measured by an enzyme immunoassay using a specific antibody.
MCH or a derivative thereof or a salt thereof and SLT or a salt thereof, a method for screening a compound or a salt thereof which changes the binding property between MCH or a salt thereof and SLT or a salt thereof, or MCH or a label thereof or the A kit for screening a compound or its salt that changes the binding property between MCH or its salt and SLT or its salt, characterized by containing the salt and SLT or its salt (hereinafter referred to as the screening method of the present invention, The abbreviated screening kit) is described in detail below.
[0017]
By using an SLT or a salt thereof, or constructing an expression system of a recombinant SLT and using a binding assay system (ligand-receptor assay system) with MCH or a derivative thereof or a salt thereof using the expression system, A compound (for example, peptide, protein, non-peptidic compound, synthetic compound, fermentation product, etc.) or a salt thereof that changes the binding property between MCH or a salt thereof and SLT or a salt thereof can be screened.
Such compounds contain cell stimulating activity (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca via SLT).²⁺Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, activity to promote or inhibit pH reduction, etc.) A compound having a cell stimulating activity (ie, an SLT (MCH receptor) antagonist) and the like. “Modifying the binding between MCH or a salt thereof and SLT or a salt thereof” includes both the case of inhibiting the binding between MCH or a salt thereof and SLT or a salt thereof and the case of promoting the binding of a ligand. To do.
That is, the present invention includes (i) a case where SLT or a salt thereof is brought into contact with MCH or a derivative thereof or a salt thereof; and (ii) a MCH or a derivative thereof or a salt thereof and a test compound in the above-described SLT or a salt thereof. Provided is a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between MCH or a salt thereof and SLT or a salt thereof, which is compared with the case of contact.
In the screening method of the present invention, (i) when the above SLT or a salt thereof is contacted with MCH or a derivative thereof or a salt thereof; and (ii) the above SLT or a salt thereof is added with MCH or a derivative thereof or a salt thereof. For example, the amount of ligand binding to the SLT or a salt thereof, the cell stimulating activity, and the like when contacted with the test compound are measured and compared.
[0018]
Specifically, the screening method of the present invention includes:
(1) Labeled MCH or a derivative thereof or a salt thereof (in the case where the above-mentioned “MCH or the like labeled or a salt thereof” is used as a “MCH derivative or a salt thereof”, further labeling is not necessary. The same shall apply hereinafter) and the labeled MCH or a derivative thereof when the labeled MCH or a derivative thereof or a salt thereof and a test compound are contacted with the SLT or a salt thereof. Or a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding between MCH or a salt thereof and SLT or a salt thereof, wherein the binding amount of the salt to the SLT or the salt thereof is measured and compared.
(2) When labeled MCH or a derivative thereof or a salt thereof is brought into contact with a cell containing SLT or a membrane fraction of the cell, labeled MCH or a derivative thereof or a salt thereof and a test compound contain SLT. MCH or a salt thereof characterized by measuring and comparing the binding amount of labeled MCH or a derivative thereof or a salt thereof to the cell or the membrane fraction when contacted with a cell or a membrane fraction of the cell A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between SLT and SLT,
(3) When labeled MCH or a derivative thereof or a salt thereof is brought into contact with SLT expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding SLT, labeled MCH or a derivative thereof or When the salt and the test compound were contacted with SLT expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding SLT, the amount of labeled MCH or its derivative or its salt bound to SLT was determined. A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between MCH or a salt thereof and SLT, which is characterized by measuring and comparing;
(4) When a compound that activates SLT (for example, MCH or a derivative thereof or a salt thereof) is brought into contact with a cell containing SLT, and a compound that activates SLT or a test compound is brought into contact with a cell containing SLT. Cell stimulating activity via SLT (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca²⁺Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, activity to promote or inhibit pH reduction, etc.) A method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property of MCH or a salt thereof and SLT, characterized by measuring and comparing; and
(5) When a compound that activates SLT (for example, MCH or a derivative thereof or a salt thereof) is contacted with SLT expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding SLT; SLT-mediated cell stimulating activity when the compound that activates SLT and the test compound are contacted with SLT expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding SLT (for example, Arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca²⁺Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, activity to promote or inhibit pH reduction, etc.) And a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between MCH or a salt thereof and SLT.
[0019]
A specific description of the screening method of the present invention will be given below.
First, the SLT used in the screening method of the present invention may be any as long as it contains the above SLT. However, since human-derived organs are particularly difficult to obtain, SLTs that are expressed in large quantities using recombinants are suitable for use in screening.
In order to manufacture the SLT, the above-described method or the like is used.
In the screening method of the present invention, when cells containing SLT or the cell membrane fraction are used, the preparation method described below may be followed.
When cells containing SLT are used, the cells may be fixed with glutaraldehyde, formalin or the like. The immobilization method can be performed according to a method known per se.
The cell containing SLT refers to a host cell that expresses SLT, and examples of the host cell include the aforementioned E. coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cell, animal cell and the like.
The membrane fraction refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by a method known per se after disrupting cells. Cell disruption methods include crushing cells with a Potter-Elvehjem type homogenizer, disrupting with a Waring blender or polytron (manufactured by Kinematica), disrupting with ultrasonic waves, and pressurizing with a French press, etc. Crushing. For fractionation of the cell membrane, a fractionation method using centrifugal force such as a fractional centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (usually about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 rpm to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. The precipitate is taken as the membrane fraction. The membrane fraction is rich in expressed SLT and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
The amount of SLT in the cell or membrane fraction containing the SLT is 10 per cell.^Three-10⁸Preferably it is a molecule.^Five-10⁷It is preferably a molecule. In addition, the higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, making it possible not only to construct a highly sensitive screening system, but also to measure a large amount of samples in the same lot. .
In order to carry out the above (1) to (3) for screening for a compound that changes the binding property between MCH or a salt thereof and SLT, an appropriate SLT fraction and a labeled ligand or a compound having ligand activity ( MCH or a derivative thereof) is used. As the SLT fraction, a natural SLT fraction or a recombinant SLT fraction having an activity equivalent to that is desirable. Here, the equivalent activity indicates an equivalent ligand binding activity and the like. As the labeled ligand or the compound having ligand activity, a labeled ligand or a compound having ligand activity (MCH or a derivative thereof) is used. For example [^ThreeH], [¹²⁵I], [¹⁴C], [³⁵A ligand (MCH or a derivative thereof) labeled with S] or the like can be used. In particular, a labeled form of an MCH derivative prepared by a known method using a Bolton-Hunter reagent can also be used.
Specific examples of the label of the MCH derivative include the compounds represented by the above (1) to (7).
Specifically, to screen for a compound that changes the binding property between MCH or a salt thereof and SLT, first, the cell containing SLT or a membrane fraction of the cell is suspended in a buffer suitable for screening. Prepare the receptor preparation. The buffer may be any buffer that does not inhibit the binding between the ligand and the receptor, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a Tris-HCl buffer. In addition, for the purpose of reducing non-specific binding, CHAPS, Tween-80^TM(Kao-Atlas), surfactants such as digitonin and deoxycholate can also be added to the buffer. Furthermore, protease inhibitors such as PMSF, leupeptin, E-64 (manufactured by Peptide Institute) and pepstatin can be added for the purpose of suppressing the degradation of SLT, MCH or its derivatives by protease. A fixed amount (5000 cpm to 500000 cpm) of labeled MCH or a derivative thereof was added to 0.01 ml to 10 ml of the receptor solution,^-Four-10^-1A μM test compound is allowed to coexist. In order to know the non-specific binding amount (NSB), a reaction tube to which a large excess of unlabeled MCH or a derivative thereof is added is also prepared. The reaction is carried out at 0 ° C. to 50 ° C., preferably 4 ° C. to 37 ° C. for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours. After the reaction, the reaction solution is filtered with a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and then the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured with a liquid scintillation counter or a γ-counter. Count when there is no antagonist (B₀) Minus non-specific binding (NSB) (B₀When -NSB) is defined as 100%, a test compound with a specific binding amount (B-NSB) of, for example, 50% or less can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
BIAcore (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) can also be used as a method for measuring the binding between SLT and MCH or a derivative thereof. In this method, MCH or a derivative thereof is immobilized on a sensor chip by an amino coupling method according to a protocol attached to the apparatus, and purified from a cell containing SLT or a transformant containing DNA encoding SLT or A membrane fraction containing SLT, or a membrane fraction containing purified SLT or SLT and a buffer solution such as a phosphate buffer or Tris buffer containing a test compound are passed over the sensor chip at a flow rate of 2 to 20 μl per minute. Screening for a compound that changes the binding between SLT and MCH by observing that the test compound coexisting with the change in surface plasmon resonance caused by binding of MCH or its derivative on the sensor chip and SLT be able to. This method can also be achieved by immobilizing SLT on a sensor chip and passing a buffer solution such as phosphate buffer or Tris buffer containing MCH or its derivative or MCH or its derivative and a test compound over the sensor chip. Can be measured. Examples of the test compound include those similar to the above.
In order to carry out the above methods (4) to (5) for screening for a compound that changes the binding property between MCH or a salt thereof and SLT or a salt thereof, cell stimulating activity via SLT (for example, arachidonic acid release) , Acetylcholine release, intracellular Ca²⁺Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, activity to promote or inhibit pH reduction, etc.) It can be measured using a known method or a commercially available measurement kit. Specifically, first, cells containing SLT are cultured in a multiwell plate or the like. Before screening, replace with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compound, etc. and incubate for a certain period of time, then extract cells or collect supernatant and generate The product is quantified according to the respective method. When the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an index of cell stimulating activity is difficult to assay with a degrading enzyme contained in cells, an assay may be performed by adding an inhibitor to the degrading enzyme. Further, the activity such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on the cells whose basic production amount has been increased with forskolin or the like.
[0020]
In order to perform screening by measuring cell stimulating activity, cells expressing appropriate SLT are used. As the cells expressing SLT, the above-described recombinant SLT-expressing cell line and the like are desirable. The SLT-expressing cell as a transformant may be a stable expression strain or a transient expression strain. Moreover, the same kind of animal cell as above is used.
Examples of the test compound include peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
[0021]
The ligand / receptor assay system described above is more specifically described as follows.
(1) When a receptor-expressing cell is stimulated by a receptor agonist, the intracellular G protein is activated and GTP is bound. This phenomenon is also observed in the membrane fraction of receptor-expressing cells. Normally, GTP is hydrolyzed to change to GDP. At this time, if GTPγS is added to the reaction solution, GTPγS binds to G protein in the same manner as GTP, but it contains G protein without being hydrolyzed. The state of being bound to the cell membrane is maintained. When labeled GTPγS is used, the receptor-expressing cell stimulating activity of the receptor agonist can be measured by measuring the radioactivity remaining in the cell membrane. This reaction can be used to measure the stimulating activity of MCH or its derivatives on SLT-expressing cells. This method does not use cells containing SLT as in the above (4) to (5), but is an assay method using a membrane fraction containing SLT as in (1) to (3). The cell stimulating activity is measured as in 4) to 5), and in this measurement method, the substance showing the GTPγS binding promoting activity to the SLT membrane fraction is an agonist. Here, by adding MCH or a derivative thereof, or MCH or a derivative thereof and a test compound, by observing that a change occurs in the GTPγS binding promoting activity to the SLT cell membrane fraction compared to the single administration of MCH or a derivative thereof, MCH A compound that changes the binding property between SLT and SLT can be screened. At this time, a compound showing an activity of suppressing the activity of promoting GTPγS binding to the SLT cell membrane fraction by MCH or a derivative thereof can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition. On the other hand, an agonist can be screened by administering only the test compound and observing GTPγS binding promoting activity to the SLT cell membrane fraction.
An example of the screening method will be described more specifically below. Cell membrane fraction containing SLT is diluted with membrane dilution buffer (50 mM Tris, 5 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 1 μM GDP, 0.1% BSA pH 7.4). The dilution rate varies depending on the expression level of the receptor. Dispense 0.2 ml each into Falcon 2053, add MCH or a derivative thereof, or MCH or a derivative thereof and a test compound, and further adjust the final concentration to 200 pM [³⁵Add S] GTPγS. After incubation at 25 ° C for 1 hour, ice-cooled washing buffer (50 mM Tris, 5 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 0.1% BSA, 0.05% CHAPS pH 7.4 1.5 ml), and filter with glass fiber filter paper GF / F. After drying by incubating at 65 ° C for 30 minutes, it was bound to the membrane fraction remaining on the filter paper with a liquid scintillation counter [³⁵The radioactivity of S] GTPγS is measured. The effect of the test compound on the GTPγS binding-promoting activity of MCH or its derivative is defined as 100% for the experimental group to which only MCH or its derivative is added and 0% for the experimental group to which MCH or its derivative is not added. calculate. A test compound having a GTPγS binding promoting activity of 50% or less can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
[0022]
(2) The amount of intracellular cAMP in SLT-expressing cells is reduced by MCH stimulation. Using this reaction, the stimulating activity of MCH on SLT-expressing cells can be measured.
The amount of cAMP produced by various animal cells expressing SLT is the same as that of anti-cAMP antibodies obtained by immunizing mice, rats, rabbits, goats, cattle, etc.¹²⁵By using I-labeled cAMP (both commercially available), RIA or other EIA systems in which an anti-cAMP antibody and labeled cAMP are combined can be measured. In addition, beads containing scintillant in which anti-cAMP antibody is immobilized using an antibody against IgG or the like of animal used for protein A or anti-cAMP antibody production;¹²⁵Quantification by the SPA method using I-labeled cAMP is also possible (using a kit made by Amersham Pharmacia Biotech).
Specifically, the cAMP production inhibition assay is performed by Example 5 described later or a method analogous thereto. In this system, the amount of intracellular cAMP is increased by a ligand that increases the amount of intracellular cAMP, such as forskolin or calcitonin, and MCH or a derivative thereof, or MCH or a derivative thereof and a test compound are added to increase MCH or the derivative thereof. By observing that the suppression of intracellular cAMP amount by the single administration of is changed, a compound that changes the binding between MCH and SLT can be screened. At this time, a compound showing an activity of inhibiting the cAMP production inhibitory activity of SLT-expressing cells by MCH or a derivative thereof can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition. On the other hand, a compound showing agonist activity can be screened by adding only the test compound and examining cAMP production inhibitory activity.
The screening method is described more specifically below. 5 x 10 CHO / SLT cells in 24-well plates^Four Seed cells / well and incubate for 48 hours. The cells are washed with Hanks buffer (pH 7.4) containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter, Hanks containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES). Buffer (pH 7.4) is called reaction buffer). Thereafter, 0.5 ml of the reaction buffer is added, and the mixture is incubated for 30 minutes. After removing the reaction buffer and adding 0.25 ml of reaction buffer to the cells, add 1 nM MCH or its derivative or 1 nM MCH or its derivative and test to 0.25 ml of reaction buffer containing 2 μM forskolin. The compound added is added to the cells and allowed to react at 37 ° C. for 24 minutes. The reaction is stopped by adding 100 μl of 20% perchloric acid, and then intracellular cAMP is extracted by placing on ice for 1 hour. The amount of cAMP in the extract is measured using a cAMP EIA kit (Amersham Pharmacia Biotech). The amount of cAMP produced by forskolin stimulation is assumed to be 100%, and the amount of cAMP inhibited by the addition of 1 nM MCH or its derivative is assumed to be 0%. To do. A test compound that inhibits the activity of MCH or a derivative thereof and has a cAMP production activity of, for example, 50% or more can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
To measure cAMP production promoting activity, cAMP produced by adding a test compound to CHO / SLT cells without adding forskolin is quantified by the above method.
[0023]
(3) A DNA containing CRE (cAMP response element) is inserted into the multiple cloning site upstream of the luciferase gene of the Picker Gene Basic Vector or Picker Gene Enhancer Vector (Toyo Ink Co., Ltd.), and this is used as the CRE-reporter gene vector. . In cells transfected with a CRE-reporter gene vector, stimulation with elevated cAMP induces CRE-mediated luciferase gene expression and subsequent production of luciferase protein. That is, by measuring the luciferase activity, it is possible to detect a change in the amount of cAMP in the CRE-reporter gene vector-introduced cell. Screening for a compound that changes the binding between MCH and SLT can be performed using a cell in which an SLT-expressing cell is transfected with a CRE-reporter gene vector. Specific screening methods are described below.
CRE-reporter gene-introduced SLT-expressing cells are placed in 24-well plates at 5 x 10^Three Seed cells / well and incubate for 48 hours. The cells are washed with Hanks buffer (pH 7.4) containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter, Hanks containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES). Buffer (pH 7.4) is called reaction buffer). Thereafter, 0.5 ml of the reaction buffer is added, and the mixture is incubated for 30 minutes. After removing the reaction buffer and adding 0.25 ml of reaction buffer to the cells, add 1 nM MCH or its derivative or 1 nM MCH or its derivative and test compound and 2 μM forskolin for 0.25 ml of reaction. Buffer is added to the cells and allowed to react for 24 minutes at 37 ° C. The cells are dissolved with a cell lysing agent for Picker Gene (Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.), and a luminescent substrate (Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.) is added to the lysate. Luminescence by luciferase is measured with a luminometer, liquid scintillation counter or top counter. The effect of a compound that changes the binding between MCH and SLT can be measured by comparing the amount of luminescence by luciferase with that when MCH or its derivative is administered alone. At this time, an increase in the amount of luminescence due to forskolin stimulation is suppressed by administration of MCH or a derivative thereof. A compound that restores this suppression can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition. On the other hand, an agonist can be screened by administering only the test compound and observing the suppression of the luminescence level increased by forskolin stimulation in the same manner as MCH or its derivatives.
In addition to luciferase, for example, alkaline phosphatase, chloramphenicol acetyltransferase, or β-galactosidase can be used as the reporter gene. The enzyme activity of the gene products of these reporter genes can be easily measured using a commercially available measurement kit as follows. Alkaline phosphatase activity is, for example, by Lumi-Phos 530 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, chloramphenicol acetyltransferase activity is determined by, for example, FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Assay KiT manufactured by Wako Pure Chemical Industries, and β-galactosidase activity is, for example, It can be measured by Aurora Gal-XE manufactured by Koyo Pure Chemical.
[0024]
(4) SLT-expressing cells release arachidonic acid metabolites out of the cells as a result of MCH stimulation. By preliminarily incorporating arachidonic acid having radioactivity into the cell, this activity can be measured by measuring the radioactivity released to the outside of the cell. The measurement is performed by Example 9 described later or a method according thereto. At this time, screening for compounds that affect the binding of MCH and SLT by adding MCH or a derivative thereof or MCH or a derivative thereof and a test compound and examining the influence of MCH or a derivative thereof on the arachidonic acid metabolite release activity. Can be performed. At this time, a compound that inhibits arachidonic acid metabolite release activity by MCH or its derivative can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition. Further, by adding only the test compound and examining the arachidonic acid metabolite releasing activity of the SLT-expressing cells by a method according to Example 9 described later, it is possible to screen for a compound exhibiting agonist activity. The screening method for compounds that affect the binding between MCH and SLT will be described in detail below.
5 x 10 CHO / SLT cells in 24-well plates^Four After seeding at cell / well and culturing for 24 hours,^ThreeAdd H] arachidonic acid to 0.25 μCi / well. [^Three16 hours after addition of H] arachidonic acid, the cells were washed with Hank's buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20 mM HEPES, and dissolved in Hank's buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20 mM HEPES in each well. Add 500 μl of buffer containing the final concentration of 10 nM MCH or its derivative or 10 nM MCH or its derivative and the test compound. Hereinafter, Hanks buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20 mM HEPES is referred to as a reaction buffer. After incubation at 37 ° C for 60 minutes, 400 μl of the reaction solution was added to the scintillator and released into the reaction solution [^ThreeThe amount of H] arachidonic acid metabolites is measured with a scintillation counter. In the medium with the reaction buffer without MCH or its derivatives [^Three[H] When the amount of arachidonic acid metabolite is 0% and 10 nM MCH or a derivative thereof is added,^ThreeH] The amount of the arachidonic acid metabolite is defined as 100%, and the influence of the test compound on the binding between MCH or its derivative and SLT is calculated. A test compound having an arachidonic acid metabolite production activity of, for example, 50% or less can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
[0025]
(5) Stimulation of SLT-expressing cells with MCH increases the intracellular Ca ion concentration. By utilizing this, the influence of the test compound on the binding between MCH and SLT can be examined. Specifically, it can be examined by Example 8 described later or a method according thereto.
SLT-expressing cells are seeded on a sterilized microscope cover glass, and two days later, the culture solution is replaced with HBSS suspended in 4 mM Fura-2 AM (Dojindo Laboratories) and left at room temperature for 2 hours 30 minutes. After washing with HBSS, a cover glass is set in the cuvette, and the ratio of the fluorescence intensity at 505 nm at excitation wavelengths of 340 nm and 380 nm when MCH or its derivative or MCH or its derivative and test compound is added with a fluorometer. Measure rise. At this time, it is possible to screen for compounds that affect the binding of MCH and SLT by measuring the change in fluorescence intensity caused by the addition of the test compound compared to when MCH or its derivative is administered alone. . You can also use FLIPR (Molecular Devices) as follows. That is, Fluo-3 AM (manufactured by Dojindo Laboratories) is added to the cell suspension, and the cells are taken up by the cells. After washing the supernatant several times by centrifugation, the cells are seeded in a 96-well plate. It is observed by adding the test compound compared to when MCH or its derivative or MCH or its derivative and test compound are added and MCH or its derivative is administered alone, as in the case of Fura-2. By measuring the change in fluorescence intensity, a compound that affects the binding of MCH or its derivative to SLT can be screened. In these, the compound which suppresses the raise of the fluorescence intensity by MCH or its derivative (s) can be selected as a candidate substance with a competitive inhibition ability. On the other hand, an agonist can be screened by observing an increase in fluorescence intensity due to the addition of only the test compound.
Utilizing the fact that SLT-expressing cells, such as aequorin, co-express a protein gene that emits light when intracellular Ca ions increase, and that aequorin becomes Ca-binding and emits light when the intracellular Ca ion concentration increases. Measuring the change in luminescence intensity observed by addition of the test compound as compared to when MCH or a derivative thereof and a test compound are added and MCH or a derivative thereof is administered alone, Screening for compounds that affect the binding of MCH and SLT can be performed. The method is the same as described above except that no fluorescent substance is incorporated.
[0026]
(6) It is known that when a receptor agonist is added to a cell expressing a receptor, the intracellular inositol triphosphate concentration increases. By observing this reaction in SLT cells caused by MCH, it is possible to screen for compounds that affect the binding of MCH and SLT. Seed in a 24-well plate and apply myo- [2-^ThreeH] inositol (2.5 microCi / well) in a medium cultured for 1 day, after washing well, MCH or its derivative or MCH or its derivative and test compound were added, and then 10% perchloric acid was added. Add to stop the reaction. Neutralize with 1.5 M KOH, 60 mM HEPES solution, pass through a column packed with 0.5 ml AG1x8 resin (Bio-Rad), and add 5 mM Na₂BO_Three 60mM HCOONH_FourAfter washing with 1M HCOONH_Four Radioactivity eluted with 0.1M HCOOH is measured with a liquid scintillation counter. With respect to the binding of the test compound MCH or its derivative to SLT, assuming that the radioactivity in the medium by the reaction buffer without MCH or its derivative was 0% and the radioactivity in the medium when MCH or its derivative was added was 100% Calculate the impact. A test compound having an inositol triphosphate production activity of, for example, 50% or less can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition. On the other hand, an agonist can be screened by observing an increase in inositol triphosphate production by adding only the test compound.
[0027]
(7) DNA containing TRE (TPA response element) is inserted into the multicloning site upstream of the Luciferase gene of Pickergene Basic Vector or Pickergene Enhancer Vector (Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.), and this is used as the TRE-reporter gene vector . In cells transfected with a TRE-reporter gene vector, stimulation accompanied by an increase in intracellular Ca ion induces TRE-mediated luciferase gene expression and subsequent production of luciferase protein. That is, by measuring the luciferase activity, it is possible to detect a change in the amount of calcium in the TRE-reporter gene vector-introduced cell. A specific screening method for a compound that changes the binding between MCH and SLT using a cell in which an SLT-expressing cell is transfected with a TRE-reporter gene vector is described below.
5 × 10 5 TRE-reporter gene-introduced SLT-expressing cells in a 24-well plate^Three Seed cells / well and incubate for 48 hours. After washing the cells with Hank's buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20 mM HEPES, 10 nM MCH or a derivative thereof or 10 nM MCH or a derivative thereof and a test compound were added and reacted at 37 ° C. for 60 minutes. Let The cells are dissolved with a cell lysing agent for Picker Gene (Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.), and a luminescent substrate (Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.) is added to the lysate. Luminescence by luciferase is measured with a luminometer, liquid scintillation counter or top counter. The effect of a compound that changes the binding of MCH or its derivative and SLT can be measured by comparing the amount of luminescence by luciferase with that when MCH or its derivative is administered alone. At this time, the amount of luminescence increases due to the increase of intracellular Ca ions by administration of MCH or a derivative thereof. A compound that suppresses this increase can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition. On the other hand, it is also possible to screen for agonists by administering only the test compound and observing an increase in the amount of luminescence similar to that of MCH or its derivatives.
In addition to luciferase, for example, alkaline phosphatase, chloramphenicol acetyltransferase, or β-galactosidase can be used as the reporter gene. The enzyme activity of the gene products of these reporter genes can be easily measured using a commercially available measurement kit as follows. Alkaline phosphatase activity is, for example, Lumi-Phos 530 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, chloramphenicol acetyltransferase activity is, for example, FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Assay Kit manufactured by Wako Pure Chemical Industries, and β-galactosidase activity is, for example, It can be measured by Aurora Gal-XE manufactured by Koyo Pure Chemical.
[0028]
(8) Proliferation of SLT-expressing cells in response to MCH is observed by MAP kinase activation. This proliferation can be measured by MAP kinase activity, thymidine incorporation, cell number measurement (MTT, etc.). This can be used to screen for compounds that alter the binding of MCH or its derivatives to SLT.
MAP kinase activity can be determined by adding MCH or a derivative thereof or MCH or a derivative thereof and a test compound to cells and then obtaining a MAP kinase fraction from the cell lysate by immunoprecipitation using an anti-MAP kinase antibody. Pharmaceutical MAP Kinase Assay Kit and γ- [³²Can be easily measured using P] -ATP. Thymidine uptake activity was determined by seeding SLT-expressing cells and adding MCH or a derivative thereof, or MCH or a derivative thereof and a test compound.^ThreeAfter adding H] -thymidine, the radioactivity of labeled thymidine incorporated into the cells can be measured by lysing the cells and counting with a liquid scintillation counter.
Proliferation of SLT-expressing cells is carried out by seeding the expressing cells and adding MCH or a derivative thereof or MCH or a derivative thereof and a test compound, followed by MTT (3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl- 2H-tetrazolium bromide) is added, and the cells are lysed with isopropanol in which MTT formazan, which has been incorporated into the cells and MTT has changed, is acidified with hydrochloric acid, and then the absorption at 570 nm is measured.
A specific screening method using a labeled thymidine incorporation activity of a compound that changes the binding between MCH and SLT is described below.
SLT-expressing cells are cultured in a 24-well plate at 5000 per well for 1 day. The cells are then cultured for 2 days in medium without serum to bring the cells to starvation. After adding MCH or a derivative thereof or MCH or a derivative thereof and a test compound to the cells and culturing for 24 hours, [methyl-^ThreeH] -thymidine is added at 0.015 MBq per well and incubated for 6 hours. After washing the cells with PBS, methanol is added and left for 10 minutes. Next, 5% trichloroacetic acid is added and allowed to stand for 15 minutes, and then the fixed cells are washed 4 times with distilled water. Cells are lysed with 0.3N sodium hydroxide solution, and the radioactivity in the lysate is measured with a liquid scintillation counter. The effect of a compound that alters the binding of MCH and SLT can be measured by comparing the increase in radioactivity due to thymidine incorporation with MCH or its derivatives administered alone. At this time, a compound that suppresses an increase in radioactivity due to administration of MCH or a derivative thereof can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition. On the other hand, it is also possible to screen for agonists by administering only the test compound and observing the increase in radioactivity similar to MCH or its derivatives.
[0029]
(9) When MCH is added to an SLT-expressing cell, K channel is activated, and K ions in the cell flow out of the cell. Rb ions, which are homologous to K ions, flow out of the cell through the K channel without distinction from K ions, so the cells are labeled with Rb ([⁸⁶Rb]) is added and incorporated, and then flows out by stimulation with MCH [⁸⁶The action of MCH can be measured by measuring the flow of Rb]. For compounds that change the binding of MCH and SLT, [⁸⁶A specific screening method using Rb] efflux activity is described below.
After 2 days in the 24 wells, SLT-expressing cells were 1mCi / ml⁸⁶Incubate in medium containing RbCl for 2 hours. Wash the medium thoroughly,⁸⁶RbCl is completely removed. MCH or a derivative thereof, or MCH or a derivative thereof and a test compound are added to the cells, and the external solution 30 minutes after is collected, and the radioactivity is measured with a γ counter. The influence of a compound that changes the binding of MCH or its derivative to SLT is [⁸⁶Rb] The increase in radioactivity due to efflux can be measured by comparing with the case where MCH or its derivative is administered alone. At this time, a compound that suppresses an increase in radioactivity due to administration of MCH or a derivative thereof can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition. On the other hand, it is also possible to screen for agonists by administering only the test compound and observing the increase in radioactivity similar to that of MCH or its derivatives.
[0030]
(10) The activity of MCH can be measured by measuring the extracellular pH (acidification rate) at which SLT-expressing cells change in response to MCH using a Cytosensor device (Molecular Device). A specific screening method for a compound that changes the binding between MCH and SLT by measuring extracellular pH change using a Cytosensor device is described below.
SLT-expressing cells are cultured overnight in a capsule for the Cytosensor device, set in the chamber of the device, and perfused with RPMI1640 medium (Molecular Device) containing 0.1% BSA for about 2 hours until the extracellular pH is stabilized. After the pH is stabilized, the change in pH of the medium caused by perfusing the medium containing MCH or a derivative thereof, or MCH or a derivative thereof and a test compound onto the cells is measured. The effect of a compound that changes the binding between MCH and SLT can be measured by comparing the extracellular pH change of SLT-expressing cells with that when MCH or its derivative is administered alone. At this time, a compound that suppresses extracellular pH change due to administration of MCH or a derivative thereof can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition. On the other hand, an agonist can be screened by administering only a test compound and observing an extracellular pH change similar to that of MCH or a derivative thereof.
[0031]
(11) The sex pheromone receptor STe2 of the haploid α-mating type (MATα) of yeast (Saccharomyces cerevisiae) is coupled to the G protein Gpa1 and activates MAP kinase in response to the sex pheromone α-mating factor. Far1 (cell-cycle arrest) and the transcriptional activator Ste12 are activated. Ste12 induces the expression of various proteins including FUS1 involved in conjugation. On the other hand, the control factor Sst2 functions in a suppressive manner in the above process. In this system, a yeast into which a receptor gene has been introduced is prepared, a signal transduction system in the yeast cell is activated by stimulation with a receptor agonist, and a receptor agonist and a receptor are used using an indicator such as proliferation resulting therefrom. Attempts have been made to measure the reaction (Pausch, MH, Trends in Biotechnology, vol. 15, pp. 487-494 (1997)). Using such a receptor gene-introduced yeast system, a compound that changes the binding of MCH and SLT can be screened.
The gene encoding Ste2 and Gpa1 of MATα yeast is removed, and a gene encoding SLT gene and Gpa1-Gai2 fusion protein is introduced instead. The gene encoding Far is removed so that cell-cycle arrest does not occur, and the sensitivity of the response to MCH is improved by removing the gene encoding Sst. Furthermore, the FUS1-HIS3 gene, in which the histidine biosynthesis gene HIS3 is connected to FUS1, is introduced. The above gene recombination operation is performed, for example, in the method described in Price et al. (Price, LA et al., Molecular and Cellular Biology, vol. 15, pp. 6188-6195 (1995)), somatostatin receptor type 2 This can be done easily by replacing the (SSTR2) gene with SLT. The transformed yeast thus constructed reacts with high sensitivity to SLT ligand MCH, and as a result, activation of MAP kinase occurs and histidine biosynthetic enzyme is synthesized, and can grow on histidine-deficient medium. become. By utilizing this, the response of SLT-expressing yeast by MCH can be observed using the growth of yeast in a histidine-deficient medium as an index.
The transformed yeast prepared as described above is cultured overnight in a liquid medium of a completely synthetic medium, and 2 x 10^Four Add to lysis agar medium with histidine removed at a cell / ml concentration and seed in a 9 x 9 cm square petri dish. After the agar has solidified, sterilized filter paper soaked with MCH or a derivative thereof or MCH or a derivative thereof and a test compound is placed on the agar surface and cultured at 30 ° C. for 3 days. The effect of a compound that alters the binding of MCH or its derivative to SLT can be measured by comparing the growth of the yeast around the filter paper with MCH or its derivative alone. At this time, a compound that suppresses yeast growth by administration of MCH or a derivative thereof can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition. On the other hand, an agonist can be screened by administering only a test compound and observing the growth of yeast similar to MCH or its derivatives. In addition, in advance, add MCH or its derivative to the agar medium, soak only the test compound in the sterilized filter paper and culture, and observe that the growth of yeast on the entire surface of the petri dish is affected around the filter paper. The effect of a compound that changes the binding between MCH and SLT can also be examined.
[0032]
(12) When SLT gene RNA is injected into Xenopus oocytes and stimulated with MCH, intracellular Ca ion concentration increases and calcium-activated chloride current is generated. This can be regarded as a change in membrane potential (the same applies when there is a change in the K ion concentration gradient). By observing this reaction in SLT-introduced Xenopus oocytes generated by MCH, compounds that affect the binding of MCH and SLT can be screened.
The oocyte mass removed from the female Xenopus laevis that was unable to move due to ice cooling was transformed into MBS solution (88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.41 mM CaCl).₂, 0.33mM Ca (NO_Three)₂, 0.82mM MgSO_Four, 2.4 mM NaHCO_Three, 10 mM HEPES, pH 7.4) with collagenase (0.5 mg / ml) at 19 ° C. for 1-6 hours at 150 rpm until the egg mass is loosened. Washing 3 times by replacing the external solution with MBS solution, poly (A) with a micromanipulator⁺  Microinject SLT cRNA (50ng / 50nl). SLT mRNA may be prepared from tissue or cells or transcribed in vitro from a plasmid. This is cultured in MBS solution at 20 ° C. for 3 days. This is placed in a dent of a voltage clamp device in which Ringer solution is flowing, and a glass microelectrode for potential fixation and a glass microelectrode for potential measurement are inserted into the cell, and the (−) electrode is placed outside the cell. When the potential is stable, a change in potential is recorded by flowing a Ring solution containing MCH or a derivative thereof or MCH or a derivative thereof and a test compound. The effect of a compound that changes the binding between MCH and SLT can be measured by comparing the change in cell membrane potential of SLT-introduced Xenopus oocytes with that when MCH or its derivative is administered alone. At this time, a compound that suppresses changes in cell membrane potential due to administration of MCH or a derivative thereof can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition. On the other hand, an agonist can be screened by administering only a test compound and observing changes in cell membrane potential similar to MCH or its derivatives.
In this system, poly (A) of various G protein genes to make it easy to measure the reaction by increasing the amount of change.⁺ RNA can also be introduced. Poly (A), a protein gene that produces luminescence in the presence of Ca, such as aequorin⁺ By co-injecting RNA, this reaction can be measured by observing luminescence rather than a change in membrane potential.
A screening kit for a compound that changes the binding property between MCH or a salt thereof and SLT or a salt thereof, or a salt thereof includes SLT or a salt thereof, a cell containing SLT, or a membrane fraction of a cell containing SLT, and MCH Or its derivative or its salt is contained.
As described above, since MCH used in the present invention is known to have ligand activity also to SLC-1, the above-described screening method using MCH and SLT uses SLC-1 instead of SLT. It is possible to screen a compound or a salt thereof (SLC-1 antagonist, SLC-1 agonist) that changes the binding between MCH and SLC-1.
Therefore, the activity of the “compound that changes the binding property between MCH and SLT or a salt thereof (SLT antagonist, SLT agonist)” obtained by the screening method of the present invention and the use of SLC-1 instead of SLT By comparing the activity of the “compound that changes the binding between MCH and SLC-1 or a salt thereof (SLC-1 antagonist, SLC-1 agonist)” obtained by the screening method of the invention or a method analogous thereto, “Compound which selectively changes the binding property between MCH and SLC-1 or a salt thereof (antagonist or agonist having selective activity by SLC-1)”, or “the binding property between MCH and SLT selectively A compound to be changed or a salt thereof (an amine having selective activity by SLT) Agonist or agonist) "can be obtained.
Here, “the compound or its salt that selectively changes the binding properties”
(1) Activity against either SLC-1 or SLT (cell stimulating activity via receptor (SLC-1 or SLT) (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca²⁺Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, activity to promote pH change, etc.) A compound or salt thereof that is usually more than twice, preferably more than 10 times, quantitatively different from the activity, and / or
(2) Binding force to either SLC-1 or SLT (eg, IC₅₀(Value) is usually 2 times or more, preferably 10 times or more, and more preferably 100 times or more of the binding force to the other, or different compounds or salts thereof.
That is, “an antagonist having selective activity by SLC-1” means
(1) Activity against SLC-1 (cell stimulating activity via receptor (SLC-1) (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca²⁺Release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, activity to promote pH change, etc.) A compound or salt thereof, which is usually 2 times or more, preferably 10 times or more weaker than the activity, and / or
(2) It refers to a compound or a salt thereof that has a strength of binding to SLC-1 that is usually 2 times or more, preferably 10 times or more, more preferably 100 times or more that of SLT-1.
“Agonist having selective activity by SLC-1” means
(1) Activity against SLC-1 (cell stimulating activity via receptor (SLC-1) (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca²⁺Release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, activity to promote pH change, etc.) A compound or a salt thereof, which is usually 2 times or more, preferably 10 times or more stronger than the activity, and / or
(2) It refers to a compound or a salt thereof that has a strength of binding to SLC-1 that is usually 2 times or more, preferably 10 times or more, more preferably 100 times or more that of SLT-1.
“Antagonist having selective activity by SLT” means
(1) Activity against SLT (cell stimulating activity via receptor (SLT) (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca²⁺Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, activity to promote pH change, etc.) etc.) A compound or a salt thereof, which is usually 2 times or more, preferably 10 times or more weaker than the activity against 1, and / or
(2) A compound or a salt thereof, which has a strength of binding to SLT that is usually 2 times or more, preferably 10 times or more, more preferably 100 times or more that of SLC-1.
“Agonist having selective activity by SLT” means
(1) Activity against SLT (cell stimulating activity via receptor (SLT) (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca²⁺Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, activity to promote pH change, etc.) etc.) A compound or salt thereof, which is usually more than 2 times, preferably more than 10 times stronger than the activity against 1, and / or
(2) A compound or a salt thereof, which has a strength of binding to SLT that is usually 2 times or more, preferably 10 times or more, more preferably 100 times or more that of SLC-1.
[0033]
Thus, the present invention further provides
(1) MCH or a derivative thereof or a salt thereof; (2) SLC-1 or a salt thereof, or a partial peptide or amide or ester thereof or a salt thereof; and (3) SLT or a salt thereof, or a partial peptide or a salt thereof. An amide or an ester thereof or a salt thereof is used,
1) MCH or a derivative thereof or a salt thereof,
2) (i) SLC-1 or a salt thereof, or a partial peptide or amide or ester thereof or a salt thereof; and / or
(Ii) Provided is a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property to SLT or a salt thereof, or a partial peptide or amide or ester or salt thereof.
According to this screening method,
(A) a compound or salt thereof that selectively changes the binding property between MCH or a derivative thereof or a salt thereof and SLC-1 or a salt thereof, or a partial peptide or amide or ester thereof or a salt thereof;
(B) a compound or salt thereof that selectively alters the binding between MCH or a derivative thereof or a salt thereof and SLT or a salt thereof, or a partial peptide or amide or ester thereof or a salt thereof; and
(C) (i) the binding of MCH or a derivative thereof or a salt thereof to SLC-1 or a salt thereof, or a partial peptide or amide or ester thereof or a salt thereof; and (ii) MCH or a derivative thereof or a salt thereof A compound that changes the binding property between a salt and SLT or a salt thereof, or a partial peptide or amide or ester or salt thereof, or a salt thereof can be screened.
Screening the compound or salt thereof that selectively alters the binding properties of MCH or a derivative thereof or a salt thereof to SLT or a salt thereof, a partial peptide thereof or an amide or ester thereof or a salt thereof in the screening method. Is preferred.
[0034]
Examples of the screening kit of the present invention include the following.
1. Screening reagents
(1) Measurement buffer and washing buffer
Hanks' Balanced Salt Solution (Gibco) plus 0.05% bovine serum albumin (Sigma).
The solution may be sterilized by filtration through a 0.45 μm filter and stored at 4 ° C. or may be prepared at the time of use.
(2) SLT standard and SLC-1 standard
CHO cells expressing SLT or CHO cells expressing SLC-1 were placed in a 12-well plate at 5 × 10 5.^FivePassed by piece / hole, 37 ° C, 5% CO₂Cultivated at 95% air for 2 days.
(3) Labeled ligand
[^ThreeH], [¹²⁵I], [¹⁴C], [³⁵M] labeled with S] or the like.
A solution dissolved in an appropriate solvent or buffer is stored at 4 ° C. or −20 ° C., and diluted to 1 μM with a measuring buffer at the time of use.
(4) Ligand standard solution
MCH is dissolved to 1 mM in PBS containing 0.1% bovine serum albumin (manufactured by Sigma) and stored at -20 ° C.
2. Measuring method
(1) Cells expressing SLT or SLC-1 cultured in a 12-well tissue culture plate are washed twice with 1 ml of measurement buffer, and then 490 μl of measurement buffer is added to each well.
▲ 2 ▼ 10^-3-10^-TenAfter 5 μl of M test compound solution is added, 5 μl of labeled MCH is added and allowed to react at room temperature for 1 hour. To know the amount of non-specific binding, instead of the test compound, 10^-3Add 5 μl of M ligand (MCH).
(3) Remove the reaction solution and wash 3 times with 1 ml of washing buffer. The labeled ligand (MCH) bound to the cells is dissolved in 0.2N NaOH-1% SDS and mixed with 4 ml of liquid scintillator A (manufactured by Wako Pure Chemical Industries).
{Circle around (4)} Radioactivity is measured using a liquid scintillation counter (manufactured by Beckman), and Percent Maximum Binding (PMB) is determined by the following equation [Formula 1].
[Equation 1]
PMB = [(B-NSB) / (B₀-NSB)] × 100
PMB: Percent Maximum Binding
B: Value when the sample is added
NSB: Non-specific binding
B₀   : Maximum binding amount
[0035]
The compound or salt thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention is a compound that changes (inhibits or promotes binding) the binding between MCH or a salt thereof and SLT or a salt thereof. Is a compound having a cell stimulating activity via SLT or a salt thereof (so-called SLT agonist), or a compound not having the stimulating activity (so-called SLT antagonist). Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products and the like, and these compounds may be novel compounds or known compounds.
The specific evaluation method of whether it is the said SLT agonist or an antagonist should just follow the following (i) or (ii).
(I) A binding assay shown by the screening methods of (1) to (3) above is performed to obtain a compound that changes the binding property (especially, inhibits binding) between MCH or a salt thereof and SLT or a salt thereof. Thereafter, it is determined whether or not the compound has a cell stimulating activity via SLT as described above. A compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is an SLT agonist, and a compound having no such activity or a salt thereof is an SLT antagonist.
(Ii) (a) A test compound is contacted with a cell containing SLT, and the cell stimulating activity via the SLT is measured. A compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is an SLT agonist.
(b) When a compound that activates SLT (eg, a polypeptide of the present invention or an SLT agonist) is contacted with a cell containing SLT, and a compound that activates SLT and a test compound that contains SLT The cell stimulation activity via SLT when it is contacted is measured and compared. A compound or salt thereof that can reduce cell stimulating activity by a compound that activates SLT is an SLT antagonist.
Since the SLT agonist has the same action as the physiological activity of MCH or a salt thereof on SLT, it is useful as a safe and low toxic pharmaceutical like MCH or a salt thereof.
On the contrary, the SLT antagonist can suppress the physiological activity of MCH or a salt thereof against SLT, and thus is useful as a safe and low-toxic pharmaceutical that suppresses the receptor activity.
[0036]
In addition, a compound or a salt thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention using SLC-1 changes the binding between MCH or a salt thereof and SLC-1 or a salt thereof (inhibiting or promoting the binding). A compound having a cell stimulating activity via SLC-1 or a salt thereof (so-called SLC-1 agonist), or a compound not having the stimulating activity (so-called SLC-1 antagonist). . Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products and the like, and these compounds may be novel compounds or known compounds.
The specific evaluation method of whether it is the above-mentioned SLC-1 agonist or antagonist may be performed according to the above (i) or (ii).
Since the SLC-1 agonist has the same action as the physiological activity of MCH or a salt thereof for SLC-1, it is useful as a safe and low-toxic drug like MCH or a salt thereof.
On the contrary, since the SLC-1 antagonist can suppress the physiological activity of MCH for SLC-1 or a salt thereof, it is useful as a safe and low-toxic pharmaceutical that suppresses the receptor activity.
[0037]
Since MCH or a salt thereof is involved in an appetite (feeding) enhancing action and an oxytocin secretion promoting action, etc., it can be used as an appetite (feeding) promoting agent or an oxytocin secretion promoting agent. Of the compounds obtained using the screening kit, the SLT agonist and SLC-1 agonist can be used as an appetite (feeding) enhancer, as well as weak labor, laxity bleeding, before and after placental delivery, uterine recurrent failure, emperor It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for anorexia such as incision, artificial abortion, milk stasis, anorexia nervosa and accompanying anemia, hypoproteinosis, etc. SLT antagonist and SLC-1 antagonist are obese [Eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperplasia Hyperinsulinar obesity, hyperplasmic obesity, hypophyseal adiposity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity Obesity (hypothalamic obesity), symptomatic obesity, childhood obesity, upper body obesity, dietary obesity, hypogonadal obesity, systemic obesity Systemic mastocytosis, simple obesity, central obesity, etc.], hyperphagia, affective disorder, sexual dysfunction, etc. Others can include excessive labor pain, ankylosing uterine contraction, fetal distress, uterine rupture, cervical laceration, premature birth, Prader-Willi syndrome, diabetes and its complications (diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, diabetic nerves) Disability), high blood pressure Hyperlipidemia, coronary atherosclerosis, gout, respiratory disease (Pickwick syndrome, sleep apnea syndrome), fatty liver, infertility, osteoarthritis, etc. (especially anti-obesity agents (drugs), appetite It can be used as a preventive / therapeutic agent for food) regulators, etc.).
Examples of the salt of the compound obtained using the screening method or screening kit described above include pharmaceutically acceptable salts. Examples include salts with inorganic bases, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, salts with basic or acidic amino acids, and the like.
Preferable examples of the salt with an inorganic base include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, aluminum salt and ammonium salt.
Preferable examples of the salt with an organic base include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine, N, N′-dibenzylethylenediamine. And salt.
Preferable examples of the salt with inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
Preferable examples of the salt with organic acid include formic acid, acetic acid, propionic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, benzoic acid. And salt.
Preferable examples of the salt with basic amino acid include salts with arginine, lysine, ortinine and the like, and preferable examples with acidic amino acid include salts with aspartic acid, glutamic acid and the like.
[0038]
When the compound or salt thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention is used as the above-mentioned pharmaceutical, it can be carried out according to conventional means. For example, the medicament is administered orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules or the like with sugar coating or enteric coating as necessary, or with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of sterile solutions or injections such as suspensions. The medicament of the present invention, for example, mixes the compound or a salt thereof in a generally accepted unit dosage form with a physiologically recognized carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder, and the like. Can be manufactured. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose within the indicated range can be obtained.
Additives that can be mixed into tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, gum tragacanth and gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like A swelling agent, a lubricant such as magnesium stearate, a sweetening agent such as sucrose, lactose or saccharin, a flavoring agent such as peppermint, red oil, or cherry are used. When the dispensing unit form is a capsule, a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. .
Examples of aqueous solutions for injection include isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose and other adjuvants, and appropriate solubilizing agents. For example, alcohol (for example, ethanol), polyalcohol (for example, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (for example, polysorbate 80 (^TM), HCO-50) or the like. Examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like as a solubilizing agent.
Buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), storage You may mix | blend with an agent (for example, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidant, etc. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
[0039]
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, for humans and mammals (for example, mice, rats, guinea pigs, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.) Can be administered.
The dose of the compound or salt thereof obtained by using the screening method or screening kit of the present invention varies depending on symptoms, but in the case of oral administration, generally for adults (with a body weight of 60 kg), Per 0.1 to 1000 mg, preferably about 1.0 to 300 mg, more preferably about 3.0 to 50 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc. For example, in the form of injection, administration to an adult obese patient (with a body weight of 60 kg) In this case, the SLC antagonist is conveniently administered by intravenous injection at about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0040]
In the present specification and drawings, bases, amino acids, and the like are represented by abbreviations based on abbreviations by IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or conventional abbreviations in the field, examples of which are described below. In addition, when there is an optical isomer with respect to an amino acid, the L form is shown unless otherwise specified.
DNA: Deoxyribonucleic acid
cDNA: complementary deoxyribonucleic acid
A: Adenine
T: Thymine
G: Guanine
C: cytosine
Y: thymine or cytosine
N: thymine, cytosine, adenine or guanine
R: adenine or guanine
M: cytosine or adenine
W: thymine or adenine
S: cytosine or guanine
RNA: Ribonucleic acid
mRNA: Messenger ribonucleic acid
dATP: Deoxyadenosine triphosphate
dTTP: Deoxythymidine triphosphate
dGTP: Deoxyguanosine triphosphate
dCTP: Deoxycytidine triphosphate
ATP: Adenosine triphosphate
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid
SDS: sodium dodecyl sulfate
TFA: trifluoroacetic acid
EIA: Enzyme immunoassay
Gly or G: Glycine
Ala or A: Alanine
Val or V: Valine
Leu or L: Leucine
Ile or I: isoleucine
Ser or S: Serine
Thr or T: Threonine
Cys or C: cysteine
Met or M: methionine
Glu or E: Glutamic acid
Asp or D: Aspartic acid
Lys or K: lysine
Arg or R: Arginine
His or H: histidine
Phe or F: phenylalanine
Tyr or Y: tyrosine
Trp or W: Tryptophan
Pro or P: proline
Asn or N: Asparagine
Gln or Q: glutamine
pGlu: pyroglutamic acid
Me: methyl group
Et: ethyl group
Bu: butyl group
Ph: phenyl group
TC: thiazolidine-4 (R) -carboxamide group
Bom: benzyloxymethyl
NMP: N-methylpyrrolidone
PAM: Phenylacetamidomethyl
[0041]
In addition, substituents, protecting groups and reagents frequently used in the present specification are represented by the following symbols.
Tos: p-toluenesulfonyl
HONB: N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide
Bzl: benzyl
Z: benzyloxycarbonyl
Br-Z: 2-bromobenzyloxycarbonyl
Cl-Z: 2-chlorobenzyloxycarbonyl
Boc: t-butyloxycarbonyl
HOBt: 1-hydroxybenztriazole
DCC: N, N'-dicyclohexylcarbodiimide
TFA: trifluoroacetic acid
Fmoc: N-9-fluorenylmethoxycarbonyl
DNP: Dinitrophenyl
Bum: Tertiary butoxymethyl
Trt: Trityl
BSA: Bovine serum albumin
CHAPS: 3-[(3-Colamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate
PMSF: Phenylmethylsulfonyl fluoride
E64: (L-3-trans-carboxyoxirane-2-carbonyl) L-leucyl-agmatine
GDP: Guanosine-5'-diphosphate
MEMα: Minimum Essential Medium Alpha
Fura-2AM: 1- [6-Amino-2- (5-carboxy-2-oxazolyl) -5-benzofuranyloxy] -2- (2-amino-5methylphenoxy) -ethane-N, N, N ′ , N'-Tetraacetic acid pentaacetoxymethyl ester
HBSS: Hanks balanced salt solution
Fluo-3AM: 1- [2-amino-5- (2,7-dichloro-6-hydroxy-3-oxy-9-xanthenyl) phenoxy] -2- (2-amino-5-methylphenoxy) ethane-N , N, N ', N'-Tetraacetic acid pentaacetoxymethyl ester
HEPES: 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid
MeBzl: 4-methylbenzyl
NMP: N-methylpyrrolidone
[0042]
The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
[SEQ ID NO: 1]
The synthetic DNA used for cloning of cDNA encoding human SLT is shown.
[SEQ ID NO: 2]
The synthetic DNA used for cloning of cDNA encoding human SLT is shown.
[SEQ ID NO: 3]
The entire amino acid sequence of human SLT is shown.
[SEQ ID NO: 4]
The entire base sequence of human SLT cDNA with Sal I recognition sequence added to the 5 'side and Spe I recognition sequence added to the 3' side is shown.
[SEQ ID NO: 5]
The riboprobe used for measuring the expression level of SLT mRNA in each clone of human SLT-expressing CHO cells is shown.
[SEQ ID NO: 6]
The amino acid sequence of melanin-concentrating hormone (MCH) is shown.
[SEQ ID NO: 7]
The base sequence of synthetic DNA used for cloning cDNA encoding human SLT is shown.
[SEQ ID NO: 8]
The base sequence of synthetic DNA used for cloning cDNA encoding human SLT is shown.
[SEQ ID NO: 9]
This shows the base sequence of cDNA encoding human SLT having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
[SEQ ID NO: 10]
Des-Asp¹This shows the amino acid sequence of -MCH (MCH (2-19)).
[SEQ ID NO: 11]
Des- [Asp¹, Phe²This shows the amino acid sequence of] -MCH (MCH (3-19)).
[SEQ ID NO: 12]
Des- [Asp¹, Phe², Asp^ThreeThis shows the amino acid sequence of] -MCH (MCH (4-19)).
[SEQ ID NO: 13]
Des- [Asp¹, Phe², Asp^Three, Met^FourThis shows the amino acid sequence of] -MCH (MCH (5-19)).
[SEQ ID NO: 14]
Des- [Asp¹, Phe², Asp^Three, Met^Four, Leu^FiveThis shows the amino acid sequence of] -MCH (MCH (6-19)).
[SEQ ID NO: 15]
Des- [Asp¹, Phe², Asp^Three, Met^Four, Leu^Five, Arg⁶This shows the amino acid sequence of] -MCH (MCH (7-19)).
[SEQ ID NO: 16]
The entire amino acid sequence of rat SLC-1 is shown.
[SEQ ID NO: 17]
The entire amino acid sequence of human SLC-1 is shown.
[SEQ ID NO: 18]
This shows the base sequence of DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16.
[SEQ ID NO: 19]
This shows the base sequence of DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17.
[0043]
Escherichia coli DH5α / pCR3.1-hSLT obtained in Reference Example 1 described later is 1-1-3 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan from April 28, 1999, Ministry of International Trade and Industry. As deposit number FERM BP-6710 at National Institute of Biotechnology (NIBH), from April 20, 1999, 2-17-85 Juzahoncho, Yodogawa-ku, Osaka, Osaka, Japan, Deposited with the Fermentation Institute (IFO) as deposit number IFO 16284.
[0044]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to examples and reference examples below, but these do not limit the scope of the present invention.
[0045]
【Example】
Reference Example 1 Cloning of cDNA encoding human SLT receptor protein from human hippocampal cDNA
Using human hippocampal cDNA (Clontech) as a template, PCR reaction was performed using two primers, primer 1 (SEQ ID NO: 7) and primer 2 (SEQ ID NO: 8). The composition of the reaction solution in the reaction was 1/10 of the above cDNA as a template, 1/50 of Advantage 2 Polymerase Mix (Clontech), Primer 1 (SEQ ID NO: 7) and Primer 2 (SEQ ID NO: 8) each 0.2 μM, dNTPs 200 μM, and the buffer attached to the enzyme were added to make a volume of 25 μl. The PCR reaction is as follows: (1) 94 ° C for 1 minute, (2) 94 ° C for 20 seconds, 72 ° C for 2 minutes 3 times, (3) 94 ° C for 20 seconds, 65 ° C for 20 seconds, 3 cycles of 68 ℃, 2 minutes, (4) 94 ℃, 20 seconds, 58 ℃, 20 seconds, 68 ℃, 2 minutes, cycle 36 times, (3) Finally, elongation at 68 ℃, 7 minutes Reaction was performed. The reaction product after the PCR reaction was subcloned into plasmid vector pCR3.1 (Invitrogen) according to the prescription of TA cloning kit (Invitrogen). This was introduced into Escherichia coli DH5α, and clones having cDNA were selected in an LB agar medium containing ampicillin, and then the sequence of each clone was analyzed. As a result, a cDNA sequence encoding a novel G protein-coupled receptor protein (SEQ ID NO: : 9) was obtained. A novel G protein-coupled receptor protein containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) derived from this cDNA was named hSLT, and this transformant was named Escherichia coli DH5α / pCR3.1-hSLT.
[0046]
Example 2 Des- [Asp¹, Phe², Asp^Three] -MCH (MCH (4-19), Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)
Commercial Boc-Val-OCH₂-PAM resin (0.77 mmol / g resin) 0.5 mmol is put into the reaction soda of the peptide synthesizer ABI 430A, and Boc-strategy (NMP-HOBt) peptide synthesis method is used for Boc-Gln, Boc-Trp (CHO), Boc- Cys (MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg (Tos), Boc-Tyr (Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg (Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc- Cys (MeBzl), Boc-Arg (Tos), Boc-Leu, and Boc-Met are introduced in this order to obtain the desired protected peptide resin. After 0.6 g of this resin was stirred together with 2 g of p-cresol and 1.2 ml of 1,4-butanedithiol in 10 ml of anhydrous hydrogen fluoride at 0 ° C. for 60 minutes, the hydrogen fluoride was distilled off under reduced pressure to give a residue. Diethyl ether is added and the precipitate is filtered. The precipitate is extracted by adding 50% aqueous acetic acid to remove insoluble parts. The extract is fully concentrated and then applied to a Sephadex (trade name) G-25 column (2.0 x 80 cm) packed with 50% aqueous acetic acid. Developed with the same solvent, collected the main fractions, attached to a reverse phase chromatography column (2.6 x 60 cm) packed with LiChroprep (trade name) RP-18, washed with 200 ml of 0.1% TFA water, and 300 ml of 0.1% TFA water. And linear gradient elution using 300 ml of 40% acetonitrile in water containing 0.1% TFA, collecting and concentrating the main fractions. This is dissolved in about 4 ml of acetic acid, diluted to 240 ml with distilled water, adjusted to pH 7.5 using aqueous ammonia, and gently blown with air and stirred. The reaction is monitored by HPLC, and after confirming that all of the SH peptide peaks have changed to SS, acetic acid is added to adjust the pH of the solution to 3, which is adsorbed on the above LiChroprep (trade name) RP-18 column. After washing the column with 200 ml of 0.1% TFA water, linear gradient elution was performed using 300 ml of 0.1% TFA water and 300 ml of 50% acetonitrile water containing 0.1% TFA, and the main fractions were collected and lyophilized for the purpose. Obtain the peptide.
By mass spectrometry (M + H)⁺ 2009.9 (theoretical 2010.0)
HPLC elution time: 17.9 minutes
Column conditions
Column: Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 150 mm)
Eluent: Liquid A-0.1% TFA-containing 10% acetonitrile water, Liquid B-0.1% TFA-containing 60% acetonitrile water, A / B: Linear gradient elution from 20/80 to 80/20 (20 minutes)
Flow rate: 1.0 ml / min
[0047]
Reference Example 3 Preparation of radioisotope labeled MCH (4-19)
MCH (4-19), which is an N-terminal amino acid 3-residue deletion form of MCH prepared in Reference Example 2, was radioisotopically labeled by the Bolton-Hunter method. Dissolved in benzene in the tube [¹²⁵I] -Bolton-Hunter reagent (3- (4-hydroxy-3-iodophenyl) propionate N-succinimidyl) 9.25 MBq (0.11 nmol) (NEN Life Science Products, 81.4 TBq / mmol) was sprayed with dry nitrogen gas The benzene was distilled off. To this tube, add 18 μl of 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), 2.3 nmol of MCH (4-19) dissolved in 1.5 μl of dimethylsulfoxide, and 0.5 μl of dimethylsulfoxide, and mix well. did. After the mixture was incubated at 37 ° C. for 2 hours, it was an activated derivative of MCH (4-19) with Bolton-Hunter reagent [¹²⁵I]-[N- (3- (4-hydroxy-3-iodophenyl) propionyl) -Met^Four] -MCH (4-19) was separated by reverse phase HPLC. [¹²⁵I]-[N- (3- (4-hydroxy-3-iodophenyl) propionyl) -Met^Four] -MCH (4-19) was eluted from the ODS column (Tosoh, ODS-80TM (4.6 mm x 150 mm)) at an acetonitrile concentration of around 43.6%.
[0048]
Reference Example 4 MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4-19), MCH (5-19), MCH (6-19) and MCH (7-19) by manual Edman degradation (sequence) No .: 10-15)
MCH 0.1 mg (Sigma) was dissolved in 30 μl of 50% pyridine, 1 μl of phenyl isothiocyanate (Wako Pure Chemical Industries) was added and the atmosphere was purged with nitrogen, and then kept at 45 ° C. Stirring was carried out every 10 minutes, and after 1 hour, the temperature was stopped and the mixture was dried under a nitrogen stream. It was dissolved again in 20 μl of ethanol, and the solvent was distilled off under a nitrogen stream and then under reduced pressure to dryness. The reaction product, phenylthiocarbamoyl derivative, is dissolved in 20 μl of trifluoroacetic acid (Wako Pure Chemical Industries), purged with nitrogen and incubated at 45 ° C for 20 minutes to cleave the amino terminal amino acid of the peptide as an anilinothiazolinone derivative did. After removing trifluoroacetic acid with a nitrogen stream, 30 μl of water and 100 μl of n-butyl acetate were added, and excess reagent and anilinothiazolinone derivative were extracted and removed with n-butyl acetate. Extraction with n-butyl acetate was repeated three times. The aqueous phase containing MCH (2-19) truncated at the amino terminus by 1 residue was dried under a nitrogen stream and then under reduced pressure.
By performing this degradation process only once, MCH (2-19) in which only one amino terminal residue was deleted was obtained. By repeating the same decomposition process twice, three times, four times, five times or six times, MCH (3-19), MCH (4-19) MCH (5-19), MCH (6-19) and MCH (7-19) were obtained.
MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4-19), MCH (5-19), MCH (6-19) and MCH (7-19) obtained by the above decomposition reaction After purification as follows, the structure was confirmed by mass spectrometry and amino acid analysis. MCH (4-19) is described in detail below, but the same procedure was performed for other derivatives. The analytical values of the obtained MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4-19), MCH (5-19), MCH (6-19) and MCH (7-19) are shown in Table 1. Shown in
[0049]
[Table 1] Mass spectrometry values of MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4-19), MCH (5-19), MCH (6-19) and MCH (7-19) Amino acid analysis value
[Table 1]

[0050]
MCH (4-19) was purified by HPLC as follows. Spheri-5 RP-18 Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography Column (Brownley, 2.1 mm x 30 mm) is pre-flowed with Liquid A (0.1% trifluoroacetic acid) at a flow rate of 300 μl / min and equilibrated at 25 ° C. did. Dissolve the reaction product in 270 μl of 0.1% trifluoroacetic acid, apply 50 μl once to the column, and maintain the concentration of solution B (0.1% trifluoroacetic acid / 70% acetonitrile) over 30 minutes while maintaining a flow rate of 300 μl / min. Increased to 70%. The eluate was monitored by absorbance at 210 nm, and peaks were collected manually. MCH (4-19) eluted at 17.1 minutes. MCH (4-19) collected in one test tube was concentrated to dryness and dissolved in 100 μl DMSO.
Mass spectrometry was performed by LSIMS method with JEOL JMS-HX110. That is, 1 μl of a 3-nitrobenzyl alcohol and glycerol 3: 2 matrix and 1 μl of a sample were mixed on a probe chip and introduced into an ion source. Cesium ions accelerated to 15 kV were irradiated, and the generated positive secondary ions were accelerated to 10 kV and led to the detector.
For hydrolysis for amino acid analysis, 5 μl of the sample was dried under reduced pressure in a glass tube and placed in a reaction vial, 200 μl of 6 N azeotropic hydrochloric acid (Pierce, Sequenal Grade) was placed at the bottom, Waters Pico-Tag workstation After deaeration according to the method recommended by Waters, the sample was kept at 110 ° C. for 24 hours.
After removing hydrochloric acid in the reaction vial under reduced pressure with a vacuum pump, the sample was diluted with 150 μl of 20 mM hydrochloric acid, poured into an analysis vial, set in an amino acid analyzer, and 100 μl was subjected to analysis. Amino acid analysis was carried out using a Hitachi L-8500 high-speed amino acid analyzer with a fluorescence analysis method using an orthophthalaldehyde reagent (Wako Pure Chemical Industries) in the derivatization reaction. The method for preparing the buffer for fluorescence analysis, the method for preparing the reaction solution, and the analysis conditions were as described in the instruction manual for the L-8500 amino acid analyzer. The molar ratio of the measured values based on leucine is as shown in Table 1.
MCH or MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4-19) and MCH (5-19) are also prepared by the solid phase synthesis method described in Reference Examples 7 to 11. be able to.
[0051]
Reference Example 5 Derivatization of MCH, MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4-19) and MCH (5-19) with non-isotopic Bolton-Hunter reagent
MCH and MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4-19), MCH (5-19) and MCH (6-19) were derivatized with non-isotopic Bolton-Hunter reagents. An example of derivatization of MCH (4-19) is described below.
MCH (4-19) dissolved in 50 μl of dimethylformamide 1 nmol and non-isotopic Bolton-Hunter reagent 3- (4-hydroxy-3-iodophenyl) propionate N-succinimidyl (Wako Pure Chemical Industries) 100 nmol and N, N-diisopropylethylamine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 nmol was added and reacted at 37 ° C. for 4 hours.
To the reaction mixture, 450 μl of 10% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid was added and purified by HPLC. The chromatographic conditions are as follows. The column was Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 150 mm) and the flow rate was 1.0 ml per minute. Elution was performed using acetonitrile water containing 0.1% trifluoroacetic acid, holding the acetonitrile concentration at 10% for 2 minutes, then increasing to 20% in 5 minutes and then increasing to 50% in 20 minutes. [N- (3- (4-hydroxy-3-iodophenyl) propionyl) -Met is a derivative of MCH (4-19) with a non-isotopic Bolton-Hunter reagent^Four] -MCH (4-19) eluted at 22.9 minutes and was collected manually. For MCH or MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (5-19) and MCH (6-19), the amino group of the N-terminal amino acid was subjected to 3- (4-hydroxy- 3-Iodophenyl) propionyl group was introduced for derivatization and fractionated by HPLC. These derivatives were subjected to amino acid analysis after acid hydrolysis. The results are shown in Table 2.
[0052]
[Table 2] Amino acid analysis values of derivatized MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4-19), MCH (5-19) and MCH (6-19)
[Table 2]

[0053]
Reference Example 6 Radioactive iodine labeled MCH, MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4-19), MCH (5-19), MCH (6-19) and MCH (7-19) Production
The isotope-labeled MCH, MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4-19), MCH (5-19), MCH (6-19) and MCH (7-19) are as follows: Tyr in amino acid sequence¹³Can be produced by radiating iodine. Although illustrated for MCH (4-19), MCH, MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (5-19), MCH (6-19) and MCH (7-19) ) Can be produced.
Dissolve 5 μg of MCH (4-19) in 25 μl of 0.4 M sodium acetate (pH 5.6), add 200 ng of lactoperoxidase (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), and then add 1 mCi [¹²⁵I] -sodium iodide (Amersham Pharmacia Biotech) and 200 ng hydrogen peroxide (10 μl) are added. Allow to stand at room temperature for 10 minutes, then add another 200 ng of hydrogen peroxide (10 μl) and let stand for 10 minutes. This is TSKgel ODS-80T_SPurify by HPLC using column (4.6 mm x 25 cm, Tosoh)¹²⁵I] -labeled MCH (4-19) is obtained.
[0054]
Reference Example 7 Production of MCH (Asp-Phe-Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)
Commercial Boc-Val-OCH₂-PAM resin (0.77 mmol / g resin) 0.5 mmol is put into the reaction soda of the peptide synthesizer ABI 430A, and Boc-strategy (NMP-HOBt) peptide synthesis method is used for Boc-Gln, Boc-Trp (CHO), Boc- Cys (MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg (Tos), Boc-Tyr (Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg (Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc- Cys (MeBzl), Boc-Arg (Tos), Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Asp (OcHex), Boc-Phe, and Boc-Asp (OcHex) are introduced in this order to obtain the desired protected peptide resin. After 0.6 g of this resin was stirred together with 2 g of p-cresol and 1.2 ml of 1,4-butanedithiol in 10 ml of anhydrous hydrogen fluoride at 0 ° C. for 60 minutes, the hydrogen fluoride was distilled off under reduced pressure to give a residue. Diethyl ether is added and the precipitate is filtered. The precipitate is extracted by adding 50% aqueous acetic acid to remove insoluble parts. The extract is fully concentrated and then applied to a Sephadex (trade name) G-25 column (2.0 x 80 cm) packed with 50% aqueous acetic acid. Developed with the same solvent, collected the main fractions, attached to a reverse phase chromatography column (2.6 x 60 cm) packed with LiChroprep (trade name) RP-18, washed with 200 ml of 0.1% TFA water, and 300 ml of 0.1% TFA water. And linear gradient elution using 300 ml of 40% acetonitrile in water containing 0.1% TFA, collecting and concentrating the main fractions. This is dissolved in about 4 ml of acetic acid, diluted to 240 ml with distilled water, adjusted to pH 7.5 using aqueous ammonia, and gently blown with air and stirred. The reaction is monitored by HPLC, and after confirming that all of the SH peptide peaks have changed to SS, acetic acid is added to adjust the pH of the solution to 3, which is adsorbed on the above LiChroprep (trade name) RP-18 column. After washing the column with 200 ml of 0.1% TFA water, linear gradient elution was performed using 300 ml of 0.1% TFA water and 300 ml of 50% acetonitrile water containing 0.1% TFA, and the main fractions were collected and lyophilized for the purpose. Obtain the peptide.
By mass spectrometry (M + H)⁺ 2387.3 (Theoretical value 2387.9)
HPLC elution time: 20.9 minutes
Column conditions
Column: Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 150 mm)
Eluent: Liquid A-0.1% TFA-containing 10% acetonitrile water, Liquid B-0.1% TFA-containing 60% acetonitrile water, A / B: Linear gradient elution from 20/80 to 80/20 (20 minutes)
Flow rate: 1.0 ml / min
[0055]
Reference Example 8 Des-Asp¹-MCH (MCH (2-19), Phe-Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)
Commercial Boc-Val-OCH₂-PAM resin (0.77 mmol / g resin) 0.5 mmol is put into the reaction soda of the peptide synthesizer ABI 430A, and Boc-strategy (NMP-HOBt) peptide synthesis method is used for Boc-Gln, Boc-Trp (CHO), Boc- Cys (MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg (Tos), Boc-Tyr (Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg (Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc- Cys (MeBzl), Boc-Arg (Tos), Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Asp (OcHex), and Boc-Phe are introduced in this order to obtain the desired protected peptide resin. This resin is deprotected, cyclized and purified in the same manner as in Reference Example 7 to obtain the desired peptide.
By mass spectrometry (M + H)⁺ 2272.3 (Theoretical value 2272.1)
HPLC elution time: 20.6 minutes
Column conditions
Column: Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 150 mm)
Eluent: Liquid A-0.1% TFA-containing 10% acetonitrile water, Liquid B-0.1% TFA-containing 60% acetonitrile water, A / B: Linear gradient elution from 20/80 to 80/20 (20 minutes)
Flow rate: 1.0 ml / min
[0056]
Reference Example 9 Des- [Asp¹, Phe²] -MCH (MCH (3-19), Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)
Commercial Boc-Val-OCH₂-PAM resin (0.77 mmol / g resin) 0.5 mmol is put into the reaction soda of the peptide synthesizer ABI 430A, and Boc-strategy (NMP-HOBt) peptide synthesis method is used for Boc-Gln, Boc-Trp (CHO), Boc- Cys (MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg (Tos), Boc-Tyr (Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg (Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc- Cys (MeBzl), Boc-Arg (Tos), Boc-Leu, Boc-Met, and Boc-Asp (OcHex) are introduced in this order to obtain the desired protected peptide resin. This resin is deprotected, cyclized and purified in the same manner as in Reference Example 7 to obtain the desired peptide.
By mass spectrometry (M + H)⁺ 2124.8 (theoretical 2125.0)
HPLC elution time: 19.2 minutes
Column conditions
Column: Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 150 mm)
Eluent: Liquid A-0.1% TFA-containing 10% acetonitrile water, Liquid B-0.1% TFA-containing 60% acetonitrile water, A / B: Linear gradient elution from 20/80 to 80/20 (20 minutes)
Flow rate: 1.0 ml / min
[0057]
Reference Example 10 Des- [Asp¹, Phe², Asp^Three, Met^Four] -MCH (MCH (5-19), Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val-OH)
Commercial Boc-Val-OCH₂-PAM resin (0.77 mmol / g resin) 0.5 mmol is put into the reaction soda of the peptide synthesizer ABI 430A, and Boc-strategy (NMP-HOBt) peptide synthesis method is used for Boc-Gln, Boc-Trp (CHO), Boc- Cys (MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg (Tos), Boc-Tyr (Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg (Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc- Cys (MeBzl), Boc-Arg (Tos), and Boc-Leu are introduced in this order to obtain the desired protected peptide resin. This resin is deprotected, cyclized and purified in the same manner as in Reference Example 7 to obtain the desired peptide.
By mass spectrometry (M + H)⁺ 1878.9 (theoretical value 1878.9)
HPLC elution time: 17.4 minutes
Column conditions
Column: Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 150 mm)
Eluent: Liquid A-0.1% TFA-containing 10% acetonitrile water, Liquid B-0.1% TFA-containing 60% acetonitrile water, A / B: Linear gradient elution from 20/80 to 80/20 (20 minutes)
Flow rate: 1.0 ml / min
[0058]
Example 1 Amplification of human SLT receptor cDNA
Amplification by PCR was performed using pCR3.1-hSLT described in Reference Example 1 as a template and the synthetic DNA primers of SEQ ID NOs: 1 and 2. The synthetic DNA primer was constructed so that the gene in the region translated into the receptor protein was amplified. At this time, the base sequence recognized by the restriction enzyme Sal I was added to the 5 'side of the gene, and the 3' side The recognition sequences for the respective restriction enzymes were added to the 5 ′ side and 3 ′ side so that the base sequence recognized by the restriction enzyme Spe I was added to the 5 ′ side and 3 ′ side. The composition of the reaction solution was 5 μl of pCR3.1-hSLT template, each 0.4 μM of synthetic DNA primer, 0.2 mM dNTPs, 1 μl of pfu (Stratagene) DNA polymerase and the buffer attached to the enzyme, and the total reaction volume was 50 μl. . The cycle for amplification uses a thermal cycler (PE Biosystems). After heating at 94 ° C for 60 seconds, the cycle of 94 ° C for 60 seconds, 57 ° C for 60 seconds, 72 ° C for 150 seconds is repeated 25 times. And reacted at 72 ° C. for 10 minutes. Confirmation of the amplification product was performed by ethidium bromide staining after 0.8% agarose gel electrophoresis.
[0059]
Example 2 Confirmation of amplified cDNA sequence by subcloning PCR product into plasmid vector and decoding base sequence of inserted cDNA
The PCR reaction product performed in Example 1 was separated using a 0.8% low-melting point agarose gel, and the band portion was cut out with a razor, followed by fragmentation, phenol extraction, phenol / chloroform extraction, and ethanol precipitation. DNA was recovered. PCR-Script^TM The recovered DNA was subcloned into the plasmid vector pCR-Script Amp SK (+) in accordance with the Amp SK (+) cloning kit (Stratagene). This is Escherichia coli (Escherichia coli) After introduction into DH5αcompetent cell (Toyobo) and transformation, select clones with cDNA inserts in LB agar medium containing ampicillin, IPTG and X-gal, and sterilized toothpicks with only white clones sterilized To obtain a transformant E. coli DH5α / hSLT. Individual clones were cultured overnight in LB medium containing ampicillin, and plasmid DNA was prepared using QIAwell 8 Plasmid KIt (Qiagen). A portion of the prepared DNA was cleaved with restriction enzymes Sal I and Spe I, and the size of the inserted receptor cDNA fragment was confirmed. The reaction for determination of the base sequence was performed using DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence Kit (PE Biosystems) and decoded using a fluorescent automatic sequencer. Analyzing the sequences of the two clones obtained, a Sal I recognition sequence was added to the 5 ′ side of the cDNA sequence encoding the human SLT protein (SEQ ID NO: 3), for which all sequences have been reported, and Spe was added to the 3 ′ side. It was confirmed that the I recognition sequence matched the added gene sequence (SEQ ID NO: 4). FIG. 1 shows the amino acid sequence of the human SLT receptor protein and the DNA sequence encoding it.
[0060]
Example 3 Production of human SLT-expressing CHO cells
A plasmid encoding the full-length amino acid sequence of human SLT whose sequence was confirmed in Example 2, with a Sal I recognition sequence added on the 5 ′ side and a gene added with a Spe I recognition sequence on the 3 ′ side. TransformedE. coliPlasmids were prepared from these clones using Plasmid Midi Kit (Qiagen), and cut with restriction enzymes Sal I and Spe I to cut out the insert. After the electrophoresis, the insert DNA was excised from the agarose gel with a razor, and then recovered by fragmentation, phenol extraction, phenol / chloroform extraction, and ethanol precipitation. Animal cell expression vector plasmid pAKKO-111H obtained by digesting this insert DNA with Sal I and Spe I (pAKKO1 described in Hinuma, S. et al. Biochim. Biophys. Acta, Vol. 1219, pp. 251-259 (1994)) In addition to .11H vector plasmid), T4 ligase (Takara Shuzo) was used for ligation to construct a protein expression plasmid pAKKO-hSLT.
transformed with pAKKO-hSLTE. coli After culturing DH5α competent cells (Toyobo), plasmid DNA of pAKKO-hSLT was prepared using Plasmid Midi Kit (Qiagen). Use CellPhect Transfection Kit (Amersham Pharmacia Biotech) according to the attached protocol.^-Introduced into cells. Prepare 6 μg of DNA as a co-precipitation suspension with calcium phosphate and add 5 x 10^FiveOr 1 x 10⁶CHO dhfr^-It added to the 6 cm petri dish which seed | inoculated the cell. After culturing in a MEMα medium containing 10% fetal bovine serum for 1 day, the cells were subcultured and cultured in a nucleic acid-free MEMα medium containing 10% dialyzed fetal bovine serum as a selective medium. Forty-six colonies of transformed cells, which are human SLT-expressing CHO cells growing in the selective medium, were selected.
[0061]
Example 4 Selection of CHO / hSLT cell line with high expression level of full-length human SLT receptor protein mRNA
The expression level of full-length human SLT receptor protein mRNA of 46 clones of CHO / hSLT strain established in Example 3 was measured using Cytostar T Plate (Amersham Pharmacia Biotech) as follows according to the attached protocol. 2.5 x 10 CHO / hSLT strain clones in each well of Cytostar T Plate^FourAfter seeding one by one and culturing for 24 hours, the cells were fixed with 10% formalin. After adding 0.25% Triton X-100 to each well to increase cell permeability,³⁵S-labeled riboprobe of SEQ ID NO: 5 was added and hybridized. 20 mg / ml RNase A was added to each well to digest free riboprobe, and the plate was washed thoroughly, and then the radioactivity of the hybridized riboprobe was measured with a Topcounter. Highly radioactive strains have high mRNA expression levels. Six clones (# 1,3,4,13,26 and 36) with high mRNA expression were used in the following experiments, but clone number 1 was mainly used.
[0062]
Example 5 cAMP synthesis inhibitory activity against human SLT-expressing CHO cells by MCH
Commercially available synthetic human MCH (SEQ ID NO: 6, Bacchem) was diluted to various concentrations, and cAMP synthesis inhibitory activity against human SLT-expressing CHO cells was measured by the following method. The CHO / hSLT cells selected in Example 4 are placed in a 24-well plate at 5 x 10^Four The cells were seeded at cell / well and cultured for 48 hours. The cells were washed with Hanks buffer (pH 7.4) containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter, Hanks containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES). Buffer (pH 7.4) is called reaction buffer). Thereafter, 0.5 ml of a reaction buffer was added, and the mixture was kept warm in an incubator for 30 minutes. After removing the reaction buffer and adding 0.25 ml of reaction buffer to the cells, add 0.25 ml of reaction buffer containing various amounts of MCH and 2 μM forskolin to the cells and react at 37 ° C for 30 minutes. It was. The reaction was stopped by adding 100 μl of 20% perchloric acid, and then intracellular cAMP was extracted by placing on ice for 1 hour. The amount of cAMP in the extract was measured using a cAMP EIA kit (Amersham Pharmacia Biotech). As a result, MCH clearly decreased the intracellular cAMP level at a concentration of 30 pM, and further increased the peptide concentration, the intracellular cAMP level decreased in a dose-dependent manner. (FIG. 2). In the figure, cAMP synthesis inhibitory activity is defined as the amount obtained by subtracting the amount of intracellular cAMP when reaction buffer is added from the amount of intracellular cAMP when reaction buffer containing forskolin is added, and adding MCH. The amount obtained by subtracting the amount of intracellular cAMP when the reaction buffer was added from the amount of intracellular cAMP at this time was expressed as%.
[0063]
Example 6 Preparation of CHO cell membrane fraction expressing human SLT
1 x 10⁸Each CHO / hSLT cell with 10 ml homogenate buffer (10 mM NaHCO_Three, 5 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 1 μg / ml pepstatin, 4 μg / ml E64, 20 μg / ml leupeptin), and crushing using polytron (12,000 rpm, 1 minute). The cell lysate was centrifuged (1,000 g, 15 minutes) to obtain a supernatant. Next, this supernatant was subjected to ultracentrifugation (Beckman Type 30 rotor, 30,000 rpm, 1 hour), and the resulting precipitate was used as a human SLT-expressing CHO cell membrane fraction.
[0064]
Example 7 Prepared using Bolton-Hunter reagent [¹²⁵Receptor binding experiments using I] -labeled MCH (4-19)
Prepared using Bolton-Hunter reagent in Reference Example 3 [¹²⁵Receptor binding experiments were performed using cell membrane fractions prepared from I] -labeled MCH (4-19) and human SLT-expressing CHO cells.
A cell membrane fraction prepared from human SLT-expressing CHO cells according to Example 6 was assayed with an assay buffer (50 mM Tris-HCl, 5 mM EGTA (ethylene glycol bis (aminoethyl ether) tetraacetic acid), 5 mM magnesium acetate, 0.05%. After diluting to various concentrations with CHAPS, 0.1% BSA (bovine serum albumin), 0.25 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), 1 μg / ml pepstatin, 20 μg / ml leupeptin, pH 7.4), polypropylene test tubes (Falcon, 2053) was dispensed in 200 μl aliquots. To measure maximum binding (TB), 2 μl DMSO and 20 nM [¹²⁵I] -labeled MCH (4-19) 2 μl, and 2 μl of 100 μM MCH in DMSO to measure non-specific binding (NSB) and 20 nM [¹²⁵2 μl of I] -labeled MCH (4-19) was added to the membrane fraction solution. After reacting at 25 ° C. for 60 minutes, the reaction solution was suction filtered using a glass filter treated with polyethyleneimine (Whatman, GF-F). After filtration, it remained on the filter paper using a γ-counter [¹²⁵The radioactivity of I] -labeled MCH (4-19) was measured. As shown in FIG. 3, [¹²⁵Specific binding (SB) of I] -labeled MCH (4-19) was observed.
In addition, the membrane fraction concentration was set to 30 μg / ml, and the inhibition rate (%) to the 50% inhibition concentration of MCH (IC₅₀Value) is calculated as IC₅₀The value was about 20 nM (Figure 4). In addition, the IC of MCH (4-19), which is an amino terminal shortened form of MCH₅₀The value was 3.3 nM (FIG. 4).
[0065]
Example 8 Measurement of intracellular Ca ion concentration increasing activity of human SLT-expressing CHO cells by MCH using FLIPR
The activity of increasing intracellular Ca ion concentration by MCH (SEQ ID NO: 6) of human SLT-expressing CHO cells obtained in Example 4 was measured using FLIPR (Molecular Devices). 15 x 10 CHO / hSLT cells^Four Suspend in DMEM containing 10% dialyzed fetal calf serum to give cells / ml, and inject 200 μl of each well into a 96 well plate for FLIPR (Black plate clear bottom, Coaster) using a dispenser (3.0 × Ten^Four cells / 200μl / well), 5% CO₂After overnight culture at 37 ° C. in an incubator, it was used for the assay (hereinafter this plate is referred to as a cell plate). HANKS '/ HBSS (Nissui Hanks 2 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) 9.8 g, sodium bicarbonate 0.35 g, HEPES 4.77 g, adjusted to pH 7.4 with 6 M sodium hydroxide solution, filter sterilized) 20 ml, Fluo 3-AM (Dojindo Laboratories) 2 vials (50 μg) mixed with 250 mM Probenecid 200 μl and fetal bovine serum (FBS) 200 μl, dimethyl sulfoxide 40 μl and 20% Pluronic acid (Molecular Probes) Dissolve in 40 μl, add and mix, then dispense 100 μl of each well into a cell plate from which the culture solution has been removed using an 8 pipette, then add 5% CO₂The cells were incubated at 37 ° C. for 1 hour in an incubator, and the dye was applied to the cells. Sample plates were prepared by adding 150 μl of HANKS '/ HBSS containing 2.5 mM Probenecid and 0.05% BSA to each well of a 96-well plate for FLIPR (V-Bottom plate, Coaster), and adding various concentrations of MCH. . After completion of dye loading of the cell plate, the cell plate was washed 4 times with a washing buffer obtained by adding 2.5 mM Probenecid to HANKS '/ HBSS using a plate washer (Molecular Device), and 100 µl of washing buffer was left after washing. The cell plate and sample plate were set in FLIPR and assayed (with FLIPR, 50 μl of sample was transferred from the sample plate to the cell plate). As a result, MCH was shown to increase the intracellular Ca ion concentration of human SLT-expressing CHO cells in a concentration-dependent manner (FIG. 5).
[0066]
Example 9 Arachidonic acid metabolite release activity induced by MCH on human SLT-expressing CHO cells
Arachidonic acid metabolite-releasing activity against human SLT-expressing CHO cells exhibited by various concentrations of MCH was measured by the following method. The CHO / hSLT strain, which is a human SLT-expressing CHO cell obtained in Example 4, was placed in a 24-well plate at 5 × 10.^Four After seeding at cell / well and culturing for 24 hours,^ThreeH] arachidonic acid was added to 0.25 μCi / well. [^ThreeH] 16 hours after addition of arachidonic acid, the cells were washed with Hanks buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20 mM HEPES, and 0.05% BSA and 20 mM HEPES containing various concentrations of MCH were added to each well. 500 μl of Hanks buffer (pH 7.4) containing was added. After incubation at 37 ° C for 60 minutes, 400 µl of the reaction solution was added to the scintillator and released into the reaction solution [^ThreeThe amount of H] arachidonic acid metabolites was measured with a scintillation counter. As a result, it was confirmed that MCH exhibited arachidonic acid metabolite release activity on human SLT-expressing cells in a dose-dependent manner.₅₀The value was 0.57 nM. The arachidonic acid metabolite releasing activity against human SLT-expressing CHO cells exhibited by various concentrations of MCH is shown in FIG.
[0067]
(Sequence table free text)
SEQ ID NO: 6
Other information about the sequence: The 7th and 16th Cys residues form an intramolecular disulfide bond.
SEQ ID NO: 10
Other information about the sequence: The 6th and 15th two Cys residues form an intramolecular disulfide bond.
SEQ ID NO: 11
Other information about the sequence: The two Cys residues at the 5th and 14th form an intramolecular disulfide bond.
SEQ ID NO: 12
Other information about the sequence: The 4th and 13th two Cys residues form an intramolecular disulfide bond.
SEQ ID NO: 13
Other information about the sequence: The third and twelfth Cys residues form an intramolecular disulfide bond.
SEQ ID NO: 14
Other information about the sequence: The second and eleventh Cys residues form an intramolecular disulfide bond.
SEQ ID NO: 15
Other information about the sequence: The first and tenth Cys residues form an intramolecular disulfide bond.
[0068]
【The invention's effect】
A method for screening a compound or its salt that changes the binding property of MCH or its derivative or its salt and SLT or its salt, characterized by using MCH or its derivative or its salt and SLT or its salt of the present invention, In addition to appetite (feeding) enhancer, SLT agonist that can be used as a prophylactic / therapeutic agent for weak labor, relaxation bleeding, before and after placental delivery, uterine restoration failure, cesarean section, artificial abortion, milk retention, etc., Obesity (eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinar obesity, hyperplasmic obesity, hypophyseal adiposity, Hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity, symptomatism ic obesity), childhood obesity, upper body obesity, dietary obesity, hypogonadal obesity, systemic mastocytosis, simpleness Obesity (simple obesity, central obesity, etc.), hyperphagia, affective disorder, sexual dysfunction, and other prophylactic / therapeutic drugs, excessive labor pain, tonic uterine contraction, fetus It is useful as a screening method for SLT antagonists that can be used as preventive / therapeutic agents for asphyxia, uterine rupture, cervical laceration, premature birth, Prader-Willi syndrome, and the like.
[0069]
[Sequence Listing]

[0070]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the base sequence of DNA encoding a novel hippocampus-derived novel G protein-coupled receptor protein hSLT and the amino acid sequence deduced therefrom.
FIG. 2 is a diagram showing cAMP synthesis inhibitory activity of various concentrations of MCH on human SLT-expressing CHO cells.
[Fig. 3] Prepared using Bolton-Hunter reagent [¹²⁵FIG. 3 shows the specific binding of [I] -labeled MCH (4-19) to the cell membrane fraction prepared from human SLT-expressing CHO cells. The membrane fraction of three types of expression cell clones (# 1, 26, 36) was measured.
FIG. 4 was prepared using a Bolton-Hunter reagent using a cell membrane fraction prepared from human SLT-expressing CHO cells [¹²⁵The figure which shows the binding inhibitory activity of MCH and its amino terminal truncation MCH (4-19) with respect to [I] -labeled MCH (4-19).
FIG. 5 is a graph showing intracellular Ca ion-elevating activity of various concentrations of MCH on human SLT-expressing CHO cells measured using FLIPR.
FIG. 6 shows graphs showing arachidonic acid metabolite releasing activity against human SLT-expressing CHO cells exhibited by various concentrations of MCH.

Claims (17)

Melanin-concentrating hormone (MCH) or a derivative thereof or a salt thereof and SEQ ID NO: 3 protein expressed by or sequence MCH or a salt thereof, characterized by using a salt thereof Number: proteins or expressed Part 3 A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property with a salt.   The screening method according to claim 1, further comprising using SLC-1 or a salt thereof, or a partial peptide thereof or an amide or ester thereof or a salt thereof. MCH or its derivative or a salt thereof and SEQ ID NO: protein or expressed 3 MCH or a salt thereof and SEQ ID NO: characterized in that it contains a salt thereof: binding of the protein or a salt thereof represented by the 3 A kit for screening a compound or a salt thereof that changes sex.   The screening kit according to claim 3, further comprising SLC-1 or a salt thereof, or a partial peptide or amide or ester thereof or a salt thereof.   The screening method according to claim 1, wherein MCH is a peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.   The screening kit according to claim 3, wherein MCH is a peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.   The screening method according to claim 1, wherein the derivative is a peptide containing the 5th to 19th sequences from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, or an amide or ester thereof.   The screening kit according to claim 3, wherein the derivative is a peptide containing the 5th to 19th sequences from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, or an amide or ester thereof.   MCH derived from a Bolton Hunter reagent or a peptide containing the 5th to 19th sequences from the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 derived from a Bolton Hunter reagent or an amide thereof, or a derivative thereof The screening method according to claim 1, which is an ester.   MCH derived from a Bolton Hunter reagent or a peptide containing the 5th to 19th sequences from the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 derived from a Bolton Hunter reagent or an amide thereof, or a derivative thereof The screening kit according to claim 3, which is an ester. The MCH or a derivative thereof or a salt thereof is [ ¹²⁵ I]-[N- (3- (4-hydroxy-3-iodophenyl) propionyl) -Met ⁴ ] -MCH (4-19) or a salt thereof. The screening method described. The MCH or a derivative thereof or a salt thereof is [ ¹²⁵ I]-[N- (3- (4-hydroxy-3-iodophenyl) propionyl) -Met ⁴ ] -MCH (4-19) or a salt thereof. The screening kit as described. (1) MCH or its derivative or a salt thereof; (2) SLC-1 or its salt or the partial peptide or its amide or ester, or a salt thereof; and (3) SEQ ID NO: or a protein represented by 3 Using the salt ,
1) MCH or a derivative thereof or a salt thereof,
2) (i) SLC-1 or its salt or its partial peptide or its amide or ester, or a salt thereof; and / or (ii) SEQ ID NO: the binding property between a protein or a salt thereof 3 A screening method for a compound to be changed or a salt thereof. MCH or derivative or its salt thereof, SEQ ID NO: protein or expressed 3 Screening of claim 13, wherein the screening of compounds or salts thereof selectively alters the binding property between a salt thereof Method. Screening a compound or a salt thereof that selectively changes the binding property between MCH or a derivative thereof or a salt thereof and SLC-1 or a salt thereof, or a partial peptide or an amide or an ester thereof or a salt thereof The screening method according to claim 13 . MCH or its derivative or a salt thereof, (i) SEQ ID NO: 3 protein or expressed in and contact a salt thereof (ii) SLC-1 or its salt or the partial peptide or its amide or ester, or a salt thereof, 14. The screening method according to claim 13 , wherein a compound or a salt thereof that selectively alters the binding property with the protein is screened. (1) MCH or its derivative or a salt thereof; (2) SLC-1 or its salt or the partial peptide or its amide or ester, or a salt thereof; and (3) SEQ ID NO: or a protein represented by 3 Containing the salt ,
1) MCH or a derivative thereof or a salt thereof,
2) (i) SLC-1 or its salt or its partial peptide or its amide or ester, or a salt thereof; and / or (ii) SEQ ID NO: the binding property between a protein or a salt thereof 3 A kit for screening a compound to be changed or a salt thereof.

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