JP4768936B2

JP4768936B2 - Oligosaccharides with sulfate groups

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Inventors: 智子羽田; 弘子羽渕; 弘治木全
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Priority date: 2000-08-07
Filing date: 2001-08-07
Publication date: 2011-09-07
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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はいわゆるヘパリン骨格を有し、硫酸基を有するオリゴ糖に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘパリンは各種成長因子への結合親和性を有し、その生理活性を制御することが知られている（Cell, vol.64 (1991), pp.841-848、Science, vol.252 (1991), pp.1705-1708、Mol. Cell. Biol., vol.12 (1992), pp.240-247等）。しかし、ヘパリンは抗血液凝固活性を有するため成長因子の生理活性を制御するための医薬として利用するには、その副作用の問題を解決する必要があった。そこで、ヘパリンの有する成長因子親和性に関する利点を生かしつつ、硫酸基の結合量を制御してその抗血液凝固活性を抑制したヘパリン誘導体の合成、探索が盛んになされている（Biochem. Biophys. Res. Commun.vol.203, no.1 (1994) pp450-458等）。
【０００３】
一方、ヘパリン骨格を有するオリゴ糖についても同様に様々な探索がなされており、成長因子への結合活性に必要な糖構成数や硫酸基の位置、数について検討されている（Glycobiology vol.4, no.4 (1994）pp.451-458、Glycobiology vol.4, no.6 (1994）pp.817-824、J. Biol. Chem., vol.268, no.32 (1993) pp.23898-23905等）。
【０００４】
しかし、ヘパリン及びそのオリゴ糖は未だ抗凝固剤としてしか医薬として使用されておらず、成長因子親和性を積極的に利用した医薬への活用が期待されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ヘパリン骨格を有するオリゴ糖を有用な医薬にしようとする試みがこれまでになされている。すなわち、ヘパリン骨格を有するオリゴ糖についての様々な成長因子との関係に関して研究がなされており、特にヘパリン骨格を構成するウロン酸の2位ヒドロキシル基にエステル結合した硫酸基及びヘパリン骨格を構成するグルコサミン残基の6位ヒドロキシル基にエステル結合した硫酸基と成長因子との関係が研究されているにもかかわらず、そのような硫酸基のいずれかを有する糖残基を1残基のみ有するオリゴ糖は従来は得られておらず、そのようなオリゴ糖が有する成長因子への親和性や生理活性は知られていなかった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を鑑みて鋭意検討した結果、2位ヒドロキシル基が硫酸エステル化されたウロン酸残基及び6位ヒドロキシル基が硫酸エステル化されたグルコサミン残基のいずれかの残基を１残基有し、ヘパリン骨格を有する8乃至14糖からなるオリゴ糖を得、このオリゴ糖が成長因子（成長因子としては繊維芽細胞増殖因子(aFGF、bFGFなど)、肝細胞増殖因子(HGF)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、上皮増殖因子(EGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、神経成長因子(NGF)等が例示される）への優れた親和性を特異的に示すことを見い出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）ウロン酸残基とグルコサミン残基からなる二糖の繰り返し構造のヘパリン骨格を有する6乃至20糖のオリゴ糖であって、2位ヒドロキシル基が硫酸エステル化されたウロン酸残基及び6位ヒドロキシル基が硫酸エステル化されたグルコサミン残基のいずれかの残基を繰り返し構造中に一残基有するオリゴ糖。
（２）グルコサミン残基のアミノ基が全てスルファミド化されていることを特徴とする（１）記載のオリゴ糖。
（３）還元末端及び非還元末端から２糖目のウロン酸残基のヒドロキシル基、並びにグルコサミン残基の6位ヒドロキシル基がいずれも硫酸エステル化されていないことを特徴とする（１）又は（２）記載のオリゴ糖。
（４） 8糖からなる（１）乃至（３）いずれか一項記載のオリゴ糖。
（５）下記一般式１又は２により表されるオリゴ糖。
【化３】

【化４】

但し、R¹及びR²はいずれか一方が硫酸エステル化されたヒドロキシル基であり、他方はヒドロキシル基を表し、R³及びR⁴はそれぞれ独立にいずれか一方がカルボキシル基であって他方がHを表し、NSはスルファミド基を表す。
（６）（１）乃至（５）記載のオリゴ糖を90%以上含むオリゴ糖画分。
（７）ウロン酸残基の2位ヒドロキシル基及び／又はグルコサミン残基の6位ヒドロキシル基が硫酸化されていない6乃至20糖からなるヘパリン骨格を有するオリゴ糖にヘパラン硫酸2-O-硫酸基転移酵素又はヘパラン硫酸6-O-硫酸基転移酵素を作用させることにより得られるオリゴ糖画分。
（８）下記の工程から得られるオリゴ糖画分。
(a)ヘパリン又はヘパラン硫酸が有する硫酸基を完全に脱硫酸化した後、グルコサミン残基の2位アミノ基を特異的にスルファミド化する；
(b)(a)で得られる多糖をヘパリン分解酵素により消化し、6乃至20糖のいずれかの画分を回収する；
(c)(b)で得られる画分に含まれるオリゴ糖にヘパラン硫酸2-O-硫酸基転移酵素又はヘパラン硫酸6-O-硫酸基転移酵素を用いてウロン酸残基の2位ヒドロキシル基或いはグルコサミン残基の6位ヒドロキシル基に硫酸基を転移する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下本発明を発明の実施の形態により詳細に説明する。
【０００９】
本発明のオリゴ糖は、ウロン酸残基とグルコサミン残基からなる二糖の繰り返し構造のヘパリン骨格を有する6乃至20糖のオリゴ糖であって、2位ヒドロキシル基が硫酸エステル化されたウロン酸残基及び6位ヒドロキシル基が硫酸エステル化されたグルコサミン残基のいずれかの残基を繰り返し構造中に１残基有するオリゴ糖である（以下本発明物質ともいう）。
【００１０】
本発明において「ヘパリン骨格」とはウロン酸とグルコサミンが1,4グリコシド結合した二糖の基本単位がα1,4グリコシド結合で結合した繰り返し構造であり、ヘパリン及びヘパラン硫酸の基本骨格である。
【００１１】
本発明物質においてウロン酸残基としてはヘキスロン酸残基が好ましく、具体的にはイズロン酸残基及びグルクロン酸残基が挙げられる。グルコサミン残基のアミノ基はアセチル化されていてもよく、また硫酸化されていても良いが、全てのアミノ基が硫酸化（スルファミド化）されてN硫酸化グルコサミン残基となっていることが好ましい。本発明物質は上記二糖からなる基本単位が3乃至10個（6乃至20糖）、より好ましくは3乃至7個（6乃至14糖）結合したヘパリン骨格を有することが好ましく、特に4個（8糖）結合したヘパリン骨格を有することが好ましい。
【００１２】
本発明物質は2位ヒドロキシル基が硫酸エステル化されたウロン酸残基及び6位ヒドロキシル基が硫酸エステル化されたグルコサミン残基のいずれかを一残基のみ有するオリゴ糖であり、特に2位ヒドロキシル基が硫酸エステル化されたウロン酸残基を一残基有していることが好ましい。
【００１３】
特に、本発明物質が2位ヒドロキシル基が硫酸エステル化されたウロン酸残基を一残基有するオリゴ糖の場合は、還元末端及び非還元末端から2番目のウロン酸以外のウロン酸の2位ヒドロキシル基が硫酸エステル化されていることが好ましく、例えば最も好ましい8糖の場合は、下記一般式（１）又は（２）で表される構造が例示される。
【００１４】
【化５】

【化６】

但し、R¹及びR²はいずれか一方が硫酸エステル化されたヒドロキシル基であり、他方はヒドロキシル基を表し、R³及びR⁴はそれぞれ独立にいずれか一方がカルボキシル基であって他方がHを表し、NSはスルファミド基を表す。
【００１５】
通常は、糖鎖は単一鎖長の分子のみを精製単離することは事実上困難であるが、後述の本発明物質の調製法を用いると、本発明物質を高収率で得ることができる。
【００１６】
本発明物質を含む画分は例えばウロン酸残基の2位ヒドロキシル基及びグルコサミン残基の6位ヒドロキシル基が硫酸エステル化されていない6乃至14糖からなるヘパリン骨格を有するオリゴ糖に各々のヒドロキシル基に特異的な硫酸基転移酵素を作用させることにより上記ヒドロキシル基のいずれかを硫酸エステル化することで調製することができる。このようにして得られた本発明物質を含む画分はヘパリン骨格を有する本発明物質以外の糖鎖を含んでいても良いが、ヘパリン骨格を有する本発明物質以外の糖鎖はウロン酸残基の2位ヒドロキシル基及びグルコサミン残基の6位ヒドロキシル基のいずれもが硫酸エステル化されていない糖鎖である。
【００１７】
ウロン酸の2位ヒドロキシル基及びグルコサミンの6位ヒドロキシル基が硫酸エステル化されていない6乃至20糖からなるヘパリン骨格を有するオリゴ糖は、(1)市販のヘパリン又はヘパラン硫酸のウロン酸残基に結合した硫酸基及びグルコサミン残基の6位ヒドロキシル基に結合した硫酸基を既知の方法を組み合わせて脱硫酸化（Biochem. Biophys. Res. Commun.,vol.203, no.1(1994),pp.450-458）、又は、(2)-1ヘパリン又はヘパラン硫酸に結合した硫酸基を全て脱硫酸化及び常法に従ってグルコサミン残基のアミノ基を再硫酸化（例えばCarbohydrate Res.,58(1977),pp.47-55）する工程、及び(2)-2ヘパリチナーゼI、ヘパリチナーゼII、及びヘパリナーゼ等のヘパリン骨格を低分子化するヘパリン分解酵素を用いて消化し、低分子化する工程を組み合わせた方法で調製することができる。通常は、消化前の糖鎖100mgに対して0.02〜2.0Uの酵素を用いて20〜45℃で3時間以上反応させることで調製することができるが、上記条件に限定はされず条件は適宜選択することが可能である。
【００１８】
酵素などにより消化して得られる消化産物からの目的の数の糖残基を有するオリゴ糖を精製する方法は、分子量による分離方法が挙げられ、例えばゲル濾過法及び限外濾過法（分子濾過法）等が挙げられる。これらの方法を用いる場合の条件は当業者であれば適宜選択することが可能である。例えばゲル濾過にファルマシア社製のSuperdex30カラム（カラム容積120ml 流速1ml/分）を用いた場合には、14糖画分は65〜67分、12糖画分は68〜71分、10糖画分は71〜75分、8糖画分は75〜80分、6糖画分は80〜85分で溶出される。各画分は特定の糖残基数のオリゴ糖を90%以上含む。
【００１９】
上述のように得られたオリゴ糖に硫酸基を付加して本発明物質を得ることも可能であるが、同一の構造を有するオリゴ糖のみの画分を得て、硫酸基を付与する方が、得られる本発明物質が均一な構造を有することとなるため好ましい。例えば上記の分画によって得られたオリゴ糖をイオン交換クロマトグラフィー等によりさらに分離することで均一構造の物質からなる画分を得ることが可能である。イオン交換クロマトグラフィーを用いる場合は、溶液中の塩濃度が高くなることが多いため、得られた画分を常法により脱塩することが好ましい。
【００２０】
グルコサミン残基のアミノ基が全てスルファミド化された最も好ましい8糖からなる本発明物質を得るためには、上記工程で上記イオン交換クロマトグラフィーを例えばpH7.2条件下でファルマシア社製のmonoQカラムを用いる際は0.4M付近の食塩水で溶出する8糖の画分、同様に14糖からなる本発明物質を得るためには0.5〜0.6Mの食塩水で溶出する画分を回収することが好ましい。これらの画分に含まれるオリゴ糖は、そのオリゴ糖に含まれるグルコサミン残基のアミノ基が既に全てスルファミド化されている。
【００２１】
このようにして得られた画分に含まれるオリゴ糖の特定の糖残基の特定位置を硫酸化することで本発明物質を調製することが可能である。上記硫酸化は酵素的な方法の他に化学的な方法によっても行うことができ、酵素的な方法で行うことが、特定のヒドロキシル基に特異的に反応することと、操作がより簡易となるため好ましい。酵素的な方法による硫酸化は、既知の硫酸基転移酵素を用いて行うことができる。例えばウロン酸残基の2位ヒドロキシル基（但し還元末端及び非還元末端から２糖目のウロン酸残基を除く）が１つのみ硫酸化されている本発明物質を調製するためには、J. Biol. Chem., vol.271, no.13 (1996), pp.7845-7653に記載されているヘパラン硫酸2-O-硫酸基転移酵素（HS2ST）又はそれと同様の活性を有する酵素を用いることができる。また、同様にグルコサミン残基の6位ヒドロキシル基が１つのみ硫酸化されている本発明物質を調製するためにはJ. Biol. Chem., vol.270 (1995), pp.4172-4179に記載されたヘパラン硫酸6-O-硫酸基転移酵素（HS6ST-1）又はその同位酵素（HS6ST-2又はHS6ST-3：J. Biol. Chem., vol/275, no.4 (2000), pp.2859-2868）或いはそれらと同様の活性を有する酵素を使用することが可能である。上記硫酸基転移酵素による硫酸化は、転移されるオリゴ糖をウロン酸又はグルコサミン含量で換算して25nmolあたり0.1〜0.7Ｕの酵素と、硫酸基供与体となる活性硫酸（例えば3'-ホスホアデノシン5'-ホスホ硫酸(PAPS)等）を適当に添加し、10〜50℃で、好ましくは15〜20℃で10分〜5日程度、より好ましくは30分〜2時間程度反応させることで行うことができる。
【００２２】
このようにして得られた本発明物質は、上記の反応溶液からゲル濾過などの分子量による分離法、エタノール沈殿法等の方法により単離することが可能である。その際にコンドロイチン硫酸を添加することでより容易に本発明物質を沈殿として回収することが容易となる。コンドロイチン硫酸と本発明物質は分子量が著しく異なるため、例えばゲル濾過法などによって分子量の相違で分画する方法や、電気泳動法、市販のコンドロイチナーゼなどの酵素によるコンドロイチン硫酸の完全消化とゲル濾過などの方法を組み合わせて行うことでコンドロイチン硫酸と本発明物質とを容易に分離することができる。このようにして得られる本発明物質を含む画分をさらに常法に従ってイオン交換クロマトグラフィーとゲル濾過法を繰り返すことで、純度90%以上の高純度の本発明物質を得ることができる。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。
1.本発明物質の製造
100mgのCDSNSヘパリン（生化学工業株式会社製）を0.1UのヘパリチナーゼI（生化学工業株式会社製）により37℃で一晩消化した。この消化産物を5分間煮沸して酵素を失活させた後、1.6cm×60cmのSuperdex 30(カラム容積120ml 流速1ml／分：ファルマシア社製)を用いて0.2M NH₄OAcにより分画し、6乃至14糖画分を回収した。各オリゴ糖画分の溶出時間は6糖は80〜85分、8糖で75〜80分、10糖で71〜75分、14糖で65〜67分である。
【００２４】
上記8糖及び14糖を画分常法に従ってmonoQカラム（ファルマシア社製）を用いて50mM Tris-HCl緩衝液（pH7.2）とNaCl濃度勾配（0.2〜1.0M）で溶出して更に分画した。8糖画分の場合は0.41M、14糖画分の場合は0.56MのNaClで溶出するオリゴ糖画分がウロン酸残基とN硫酸化グルコサミン残基の繰り返し構造のみからなるオリゴ糖を主に含む画分であるので、これらを分画し、脱塩カラムPD-10（ファルマシア社製）を使用して脱塩した。これらの標品は後述の酵素的二糖分析法及びゲル濾過分析法により、ほぼ全ての二糖成分がウロン酸残基とN硫酸化グルコサミン残基のみからなる繰り返し構造を有する8糖（CDSNSH8）或いは14糖（CDSNSH14）であることを確認した。
【００２５】
脱塩したこれらの画分からそれぞれ25nmolのウロン酸を含むように秤量し、50pmolの放射能標識活性硫酸（[³⁵S]PAPS）とHS2ST（J. Biol. Chem., vol.271, no.13(1996) pp.7645-7653）又はHS6ST(HS6ST-1:J. biol. Chem., vol.270(1995), pp.4172-4179)を0.35U（CDSNSヘパリンを0.35pmol/minで硫酸化する量）を添加して、20℃で1時間反応を行った。煮沸して酵素を失活させた後、コンドロイチン硫酸A（CSA：生化学工業株式会社製）を添加し、未反応の[³⁵S]PAPSをエタノール沈殿法によって除いた。
【００２６】
HS2STを作用させて硫酸基を結合した8糖を本発明物質1、それを含む画分を本発明物質1画分、HS6STを作用させて硫酸基を結合した8糖を本発明物質2、それを含む画分を本発明物質2画分とした。
【００２７】
2.本発明物質の二糖分析による解析
本発明物質1画分及び本発明物質2画分をヘパリン分解酵素による消化と高速液体クロマトグラフィーを組み合わせた酵素的二糖分析法（新生化学実験講座３、糖質II 54-59頁）により解析した。すなわち、被検物質1.0μgを2mM酢酸カルシウムを含む20mM酢酸ナトリウム（pH7.0）25μlに溶解して、各1.5mUのヘパリチナーゼ、ヘパリチナーゼI及び0.15mUのヘパリチナーゼII（全て生化学工業株式会社製）を加えて、37℃で1時間反応させた。
【００２８】
この反応液を、HPLC（Waters社製）を用いて以下の条件で分析した。シリカ系アミノカラム（YMC社製、YMC-Pack Polyamine-IIカラムφ4.0×250mm）を使用し、羽渕らの方法（Habuchi,et al.(1992) Biochem. J., 285, pp.805-813）に従い、流速1.2ml／分で、リン酸二水素ナトリウムを用いた濃度勾配法（40mM→800mM）で溶出し、232nmでの吸光度を測定し、検出された不飽和二糖とそのピーク面積からの既知の不飽和二糖のピーク面積の合計に対する割合を算出した。
【００２９】
すなわち下記一般式で表される不飽和二糖のピークの総面積[2-アセトアミド-2-デオキシ-4-O-(4-デオキシ-α-L-threo-hex-エノピラノシルウロン酸)-D-グルコース（以下ΔDiHS-0Sと記載する）、2-デオキシ-2-スルファミノ4-O-(4-デオキシ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-D-グルコース（以下ΔDiHS-NSと記載する）、2-アセトアミド-2-デオキシ-4-O-(4-デオキシ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコース（以下ΔDiHS-6Sと記載する）、2-アセトアミド-2-デオキシ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-D-グルコース（以下ΔDiHS-USと記載する）、2-デオキシ-2-スルファミノ4-O-(4-デオキシ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコース（以下ΔDiHS-di(6,N)Sと記載する）、2-デオキシ-2-スルファミノ4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-D-グルコース（以下ΔDiHS-di(U,N)Sと記載する）、2-アセトアミド-2-デオキシ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコース（以下ΔDiHS-di(U,6)Sと記載する）、2-デオキシ-2-スルファミノ4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコース（以下ΔDiHS-tri(U,6,N)Sと記載する）のピーク面積の合計]を100％とし、各不飽和二糖のピーク面積が占める割合を算出した。
【００３０】
【化７】

【００３１】
【表１】
表１

【００３２】
また、上記略号の示す構造は以下の通り表記されることもある。
ΔDiHS-0S：ΔHexA1→4GlcNAc、ΔDiHS-NS：ΔHexA1→4GlcNS、ΔDiHS-6S：ΔHexA1→4GlcNAc(6S)、ΔDiHS-US：ΔHexA(2S)1→4GlcNAc、ΔDiHS-di(6,N)S：ΔHexA1→4GlcNS(6S)、ΔDiHS-di(U,N)S：ΔHexA(2S)1→4GlcNS、ΔDiHS-di(U,6)S：ΔHexA(2S)1→4GlcNAc(6S)、ΔDiHS-tri(U,6,N)S：ΔHexA(2S)1→4GlcNS(6S)。
【００３３】
上記式中、ΔHexAは不飽和ヘキスロン酸、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン、GlcNSはN-硫酸化グルコサミン、カッコ内は硫酸基の結合位置を示す。
【００３４】
二糖分析の結果、本発明物質1画分及び本発明物質2画分共にΔDiHS-NSが観察された。
【００３５】
シンチレーションカウンターにより各画分の放射能を測定した結果、本発明物質１画分はΔDiHS-di(U,N)Sのピークの存在、本発明物質２画分はΔDiHS-di(6,N)Sにピークの存在が明かとなった（本発明物質1画分：図１、本発明物質2画分：図２）。
【００３６】
以上結果から、本発明物質1はウロン酸残基の2位ヒドロキシル基に硫酸基が導入された二糖が含まれており、その他のヒドロキシル基には硫酸基が導入されていないことが明らかとなった。また本発明物質2はグルコサミン残基の6位ヒドロキシル基に硫酸基が導入された二糖が含まれており、その他のヒドロキシル基には硫酸基が導入されていないことが明らかとなった。
【００３７】
3.本発明物質の導入硫酸基数の特定
以下の▲１▼〜▲７▼の8糖を使用したmonoQカラムクロマトグラフィーの溶出時間から溶出時間と各硫酸基数の関係式を導いた。
▲１▼：前記1に記載されたCDSNSH8。
▲２▼及び▲３▼：2位脱硫酸化ヘパリン（2ODSヘパリン：Glycobiology vol.4, no.6 (1994), pp.817-824に記載された方法によりシグマ社製のヘパリンを使用して調製）を原料として使用して上記1記載のCDSNSH8の調製法に準じて酵素分解し、この消化産物を5分間煮沸して酵素を失活させた後、1.6cm×60cmのSuperdex 30(カラム容積120ml 流速1ml／分：ファルマシア社製)を用いて0.2M NH₄OAcにより分画し、69〜73分で溶出する8糖画分を回収した。この8糖画分をmonoQカラム（50mM Gly-HCl, pH7.2食塩濃度勾配(0.2-1.0M)により溶出）を用いて分離を行い0.70MのNaClで溶出した画分を▲２▼2ODSH8-1とし、0.77MのNaClで溶出した画分を▲３▼2ODSH8-2とした。
▲４▼、▲５▼及び▲６▼：６位脱硫酸化ヘパリン（6ODSヘパリン：WO00/6608に記載された方法によりSPL社製のブタ皮由来のヘパリンを使用して調製）を原料として使用して上記1記載のCDSNSH8の調製法に準じて酵素分解し、この消化産物を5分間煮沸して酵素を失活させた後、1.6cm×60cmのSuperdex 30(カラム容積120ml 流速1ml／分：ファルマシア社製)を用いて0.2M NH₄OAcにより分画し、70〜73分で溶出する8糖画分を回収した。この8糖画分をmonoQカラム（50mM Gly-HCl, pH7.2食塩濃度勾配(0.2-1.0M)により溶出）を用いて分離を行い0.49MのNaClで溶出した画分を▲４▼6ODSH8-1とし、0.57MのNaClで溶出した画分を▲５▼6ODSH8-2とし、0.63MのNaClで溶出した画分を▲６▼6ODSH8-3とした。
▲７▼：ウシのヘパラン硫酸（生化学工業株式会社製）を原料として使用して上記1記載のCDSNSH8の調製法に準じて調製した8糖画分（liver HS8）。
【００３８】
上述の▲１▼乃至▲７▼試料の酵素的二糖分析を行って、それらの試料が有する硫酸基数を見積もる（表２）と共に、monoQカラム（50mM Gly-HCl, pH3.0食塩濃度勾配(0.2-1.0M)により溶出）による分離を行って、各々の溶出してくる塩濃度を算出した（表３）。
【００３９】
【表２】
表２

ND:検出されず
【００４０】
【表３】
表３

ND:検出されず
【００４１】
これらの硫酸基数と溶出塩濃度を方程式として溶出塩濃度とグルコサミン残基のN硫酸基数、6O硫酸基数、及びウロン酸残基の2O硫酸基数との関係式を算出した（式１）。
【００４２】
【数１】
式１
溶出塩濃度（M）＝0.09×{(N-硫酸基数)+(2-O-硫酸基数)}+0.14×(6-O-硫酸基数)
【００４３】
この数式より算出した上記各物質の溶出塩濃度は表４の通りである。
【００４４】
【表４】
表４

【００４５】
本発明物質1画分及び本発明物質2画分について上述のmonoQカラムでの分画を行った結果、本発明物質１は0.45M、本発明物質２は0.49Mで溶出された（図３）。本発明物質１及び本発明物質２は、原料のCDSNSH8がグルコサミン残基の2位アミノ基に全て硫酸基を有しているため、N硫酸基数=4、本発明物質１は上記２の結果より6-O-硫酸基数=0、本発明物質２は上記２の結果より2-O-硫酸基数=0となる。従って、本発明物質１は2-O-硫酸基数=1となり、本発明物質２は6-O-硫酸基数=1となる。
【００４６】
4.本発明物質１の導入硫酸基の位置の解析
本発明物質１をヘパリチナーゼ（生化学工業株式会社製）によって特異的に分解して導入硫酸基の位置を解析した。ヘパリチナーゼ(EC4.2.2.7)は、ヘパリンの2-O-スルホ-L-ウロン酸に結合した2-N-スルホ（6-O-スルホ）グルコサミンのα-グルコサミニド結合を脱離反応的に特異的に切断して、不飽和ウロン酸を非還元末端に有するオリゴ糖を生成する。本発明物質１はHS2STによって1残基の2-O-硫酸基が導入されていることが上記3において明かとなったが、このことはヘパリチナーゼによる切断部位を本発明物質１は１ヶ所有することを示している。従って、放射能によってラベルした硫酸基（[³⁵S]PAPS）をHS6STによって導入した本発明物質１をヘパリチナーゼで消化すると、導入部位が還元末端の場合には２糖、還元末端から２番目のウロン酸の場合には４糖、還元末端から３番目のウロン酸の場合には６糖、非還元末端のウロン酸の場合は８糖に放射能が観察されることになる。
【００４７】
そこで、[³⁵S]硫酸で標識した本発明物質１の2nmolを0.5Uのヘパリチナーゼにより37℃で一晩消化した。消化産物を3分間煮沸してヘパリチナーゼを失活させた後、1.6cm×60cmのゲル濾過カラム（Superdex 30：カラム溶液120ml、流速2ml/分：アマシャムファルマシア社製）を用いて、0.2M NH₄OAcにより分画し、各画分の放射能を測定した（図４）。
【００４８】
その結果、ヘパリチナーゼにより消化しなかった対照は８糖に放射能が観察されたのに対し、ヘパリチナーゼにより消化した場合には放射能は４糖及び６糖に強く検出され、２糖及び８糖にはほとんど検出されなかった。このことは、本発明物質１は還元末端から２番目又は３番目のウロン酸の２位に硫酸基が導入されていることを示している。
【００４９】
5.本発明物質の成長因子結合活性
CNBr-活性化セファロース4B（ファルマシア製）に表５に示す各種成長因子を結合してアフィニティー担体を作成し、これに対する本発明物質１及び本発明物質２の結合活性を測定した。
【００５０】
CNBr-活性化セファロース4B（ファルマシア製）0.3mlをカップリングバッファー（0.5M NaClを含む0.1M NaHCO₃ pH8.3）に懸濁し、アセチル化したヘパリン（ヘパリン100mgに飽和炭酸水素ナトリウム10mgと5%無水酢酸を添加して室温で10分間反応し、この反応混液に2倍量のエタノールを添加して沈殿として得られたもの）と接触させた100μgのbFGF（Progen社製）、200μgのHGF（三菱化学株式会社製）、100μgのFGF-10（アムジェン社製）、又は100μgのFGF-18（アムジェン社製）を加え、4℃で一晩穏やかに振盪した。得られたアフィニティー担体をカップリングバッファーを用いて充分洗浄した後、更に後述の各成長因子に対応する結合バッファー（表４）を使用してカラムを洗浄した。
【００５１】
成長因子を結合させたアフィニティー担体カラムに、ウロン酸換算量で4nmolの本発明物質１（1.1×10⁵cpm/4nmol）又は本発明物質２（6.8×10⁴cpm/4nmol）を含む各種結合バッファー（表５）1mlを添加し、4℃で1時間反応させた。その後、結合バッファーで2回洗浄し、アフィニティー担体カラムに結合した本発明物質を溶出バッファー（表５）2mlで溶出した。この溶出された各本発明物質の放射能を測定することで、オリゴ糖と各種成長因子との結合率を算出した。100mgのヘパリン（シグマ社製）を0.1UのヘパリチナーゼI（生化学工業株式会社製）により37℃で一晩消化した。この消化産物を5分間煮沸して酵素を失活させた後、1.6cm×60cmのSuperdex 30(カラム容積120ml 流速1ml／分：ファルマシア社製)を用いて0.2M NH₄OAcにより分画して得られた8糖画分をShivelyとConradの方法（Biochem. (1976)15, 3932-3942）に従ってトリチウム標識し、陽性対照として使用して同様に放射能を測定した。アフィニティー担体カラムに重層した全放射能量を100%ととし、アフィニティー担体カラムに結合した放射能量を百分率で表した。
【００５２】
【表５】

【００５３】
その結果、本発明物質１の有するbFGFへの結合性が陽性対照と同等であることが明かとなった（表６）。
【００５４】
【表６】
表６

【００５５】
また、上記１記載の方法に準じて調製した14糖画分（HS2STにより硫酸基を転移して調製した物質を本発明物質３、HS6ST-1により硫酸基を転移して調製した物質を本発明物質４、 HS6ST-3（J. Biol. Chem.,vol.275, no.4(2000), pp.2859-2868）により硫酸基を転移して調製した物質を本発明物質５とする）について、上記同様に各種成長因子との結合活性を解析した。上記成長因子に加えて50μgのVEGF₁₆₅（Diaclone製）を使用したアフィニティー担体カラムも調製した（結合バッファー、溶出バッファーは共にbFGF-10、bFGF-18と同じ溶液を使用した）（表７）。
【００５６】
【表７】
表７

【００５７】
これらの結果は、本発明物質は特定の成長因子に対して親和性を有する医薬、又はアフィニティー担体の材料などに使用できることを示唆していた。
【発明の効果】
本発明によりヘパリン骨格を有する新規なオリゴ糖が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明物質１画分を二糖分析した際に得られるチャート及び各分画の放射能の関係を示す図。
【図２】本発明物質２画分を二糖分析した際に得られるチャート及び各分画の放射能の関係を示す図。
【図３】本発明物質１及び本発明物質２のmonoQカラムによるイオン交換クロマトグラフィーのチャートを示す。●は本発明物質１を示し、■は本発明物質２を示す。
【図４】放射能ラベルした硫酸基を導入して調製した本発明物質１のヘパリチナーゼ消化産物の各画分中の放射能分布を示す図。○はヘパリチナーゼを添加しない対照の放射能分布を示し、●はヘパリチナーゼを添加した際の放射能分布を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an oligosaccharide having a so-called heparin skeleton and a sulfate group.
[0002]
[Prior art]
Heparin has a binding affinity for various growth factors and is known to regulate its physiological activity (Cell, vol.64 (1991), pp.841-848, Science, vol.252 (1991) , pp. 1705-1708, Mol. Cell. Biol., vol. 12 (1992), pp. 240-247, etc.). However, since heparin has anticoagulant activity, it has been necessary to solve the side effect problem in order to use it as a medicine for controlling the physiological activity of growth factors. Therefore, synthesis and search for heparin derivatives that suppress the anticoagulant activity by controlling the amount of sulfate group binding while taking advantage of the growth factor affinity of heparin has been actively conducted (Biochem. Biophys. Res Commun.vol.203, no.1 (1994) pp450-458 etc.).
[0003]
On the other hand, various searches for oligosaccharides having a heparin skeleton have been made in the same manner, and the number of sugar constituents and the position and number of sulfate groups necessary for binding activity to growth factors have been investigated (Glycobiology vol.4, no.4 (1994) pp.451-458, Glycobiology vol.4, no.6 (1994) pp.817-824, J. Biol. Chem., vol.268, no.32 (1993) pp.23898- 23905 etc.).
[0004]
However, heparin and its oligosaccharides are still used only as anticoagulants as drugs, and are expected to be used in drugs that actively utilize growth factor affinity.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
Attempts have been made so far to make oligosaccharides having a heparin skeleton into useful medicines. In other words, research has been conducted on the relationship between various oligosaccharides having a heparin skeleton and various growth factors. In particular, sulfate groups bonded to the 2-position hydroxyl group of uronic acid constituting the heparin skeleton and glucosamine constituting the heparin skeleton. An oligosaccharide having only one sugar residue having any of such sulfate groups, even though the relationship between the sulfate group esterified to the 6-position hydroxyl group of the residue and a growth factor has been studied. Has not been obtained in the past, and the affinity and physiological activity of such oligosaccharides for growth factors have not been known.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventors have found that any one of a uronic acid residue in which the 2-position hydroxyl group is sulfated and a glucosamine residue in which the 6-position hydroxyl group is sulfated. An oligosaccharide consisting of 8 to 14 sugars having one residue and a heparin skeleton was obtained, and this oligosaccharide was a growth factor (such as fibroblast growth factor (aFGF, bFGF, etc.), hepatocyte growth factor (HGF). ), Vascular endothelial growth factor (VEGF), epidermal growth factor (EGF), platelet-derived growth factor (PDGF), nerve growth factor (NGF), etc.) The present invention has been completed.
[0007]
That is, the gist of the present invention is as follows.
(1) A 6-20 saccharide oligosaccharide having a heparin skeleton having a disaccharide repeating structure consisting of a uronic acid residue and a glucosamine residue, wherein the 2-position hydroxyl group is sulfated and 6 An oligosaccharide having one residue in the structure of any one of the glucosamine residues in which the hydroxyl group at the position is sulfated.
(2) The oligosaccharide according to (1), wherein all amino groups of the glucosamine residue are sulfamidated.
(3) The hydroxyl group of the second uronic acid residue from the reducing end and the non-reducing end and the 6-position hydroxyl group of the glucosamine residue are not sulfated (1) or ( 2) The oligosaccharide described.
(4) The oligosaccharide according to any one of (1) to (3), comprising octasaccharide.
(5) An oligosaccharide represented by the following general formula 1 or 2.
[Chemical 3]

[Formula 4]

However, R ¹ And R ² Is one hydroxyl group sulfated, the other represents a hydroxyl group, R ^Three And R ^Four Each independently represents a carboxyl group and the other represents H, and NS represents a sulfamide group.
(6) An oligosaccharide fraction containing 90% or more of the oligosaccharides according to (1) to (5).
(7) Heparan sulfate 2-O-sulfate group on an oligosaccharide having a heparin skeleton composed of 6 to 20 sugars in which the 2-position hydroxyl group of the uronic acid residue and / or the 6-position hydroxyl group of the glucosamine residue is not sulfated An oligosaccharide fraction obtained by acting a transferase or heparan sulfate 6-O-sulfotransferase.
(8) Oligosaccharide fraction obtained from the following steps.
(a) after completely desulfating the sulfate group of heparin or heparan sulfate, the 2-position amino group of the glucosamine residue is specifically sulfamidated;
(b) digesting the polysaccharide obtained in (a) with heparin degrading enzyme and collecting any fraction of 6 to 20 sugars;
(c) 2-hydroxyl group of uronic acid residue using heparan sulfate 2-O-sulfotransferase or heparan sulfate 6-O-sulfotransferase to the oligosaccharide contained in the fraction obtained in (b) Alternatively, the sulfate group is transferred to the 6-position hydroxyl group of the glucosamine residue.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail by embodiments of the invention.
[0009]
The oligosaccharide of the present invention is a 6-20 saccharide oligosaccharide having a heparin skeleton having a disaccharide repeating structure consisting of a uronic acid residue and a glucosamine residue, wherein the 2-position hydroxyl group is sulfated. An oligosaccharide having one residue in the repeating structure of any one of a residue and a glucosamine residue in which the 6-position hydroxyl group is sulfated (hereinafter also referred to as the substance of the present invention).
[0010]
In the present invention, the “heparin skeleton” is a repeating structure in which basic units of disaccharides in which uronic acid and glucosamine are linked by 1,4 glycosidic bonds are linked by α1,4 glycosidic bonds, and are the basic skeletons of heparin and heparan sulfate.
[0011]
In the substance of the present invention, the uronic acid residue is preferably a hexuronic acid residue, and specifically includes an iduronic acid residue and a glucuronic acid residue. The amino group of the glucosamine residue may be acetylated or sulfated, but all amino groups may be sulfated (sulfamidated) to become N-sulfated glucosamine residues. preferable. The substance of the present invention preferably has a heparin skeleton in which 3 to 10 (6 to 20 sugars) basic units composed of the above disaccharides are bonded, more preferably 3 to 7 (6 to 14 sugars), particularly 4 ( It preferably has a heparin skeleton linked to an octasaccharide.
[0012]
The substance of the present invention is an oligosaccharide having only one residue, either a uronic acid residue in which the hydroxyl group at the 2-position is sulfated or a glucosamine residue in which the hydroxyl group at the 6-position is sulfated. It is preferable to have one uronic acid residue whose group is sulfated.
[0013]
In particular, when the substance of the present invention is an oligosaccharide having one uronic acid residue in which the hydroxyl group at the 2-position is sulfated, the 2-position of uronic acid other than the second uronic acid from the reducing end and the non-reducing end The hydroxyl group is preferably sulfated. For example, in the case of the most preferable octasaccharide, a structure represented by the following general formula (1) or (2) is exemplified.
[0014]
[Chemical formula 5]

[Chemical 6]

However, R ¹ And R ² Is one hydroxyl group sulfated, the other represents a hydroxyl group, R ^Three And R ^Four Each independently represents a carboxyl group and the other represents H, and NS represents a sulfamide group.
[0015]
Normally, it is practically difficult to purify and isolate only a single-chain molecule of a sugar chain. However, using the method for preparing the substance of the present invention described later, the substance of the present invention can be obtained in high yield. it can.
[0016]
Fractions containing the substance of the present invention include, for example, oligosaccharides having a heparin skeleton consisting of 6 to 14 sugars in which the 2-position hydroxyl group of the uronic acid residue and the 6-position hydroxyl group of the glucosamine residue are not sulfated. It can be prepared by sulphate esterifying any of the above hydroxyl groups by acting a sulfotransferase specific to the group. The fraction containing the substance of the present invention thus obtained may contain a sugar chain other than the substance of the present invention having a heparin skeleton, but the sugar chain other than the substance of the present invention having a heparin skeleton contains uronic acid residues. Both the 2-position hydroxyl group and the 6-position hydroxyl group of the glucosamine residue are sugar chains that are not sulfated.
[0017]
Oligosaccharides having a heparin skeleton consisting of 6 to 20 sugars in which the 2-position hydroxyl group of uronic acid and the 6-position hydroxyl group of glucosamine are not sulfated are: (1) The uronic acid residue of commercially available heparin or heparan sulfate The sulfate group bonded to the 6-position hydroxyl group of the glucosamine residue is combined with known methods to desulfate (Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 203, no. 1 (1994), pp. 450-458), or (2) -1 desulfation of all sulfate groups bound to heparin or heparan sulfate, and resulfation of amino groups of glucosamine residues according to conventional methods (for example, Carbohydrate Res., 58 (1977), pp.47-55), and (2) -2 a method comprising a step of digesting with a heparin-degrading enzyme that lowers the heparin skeleton, such as heparitinase I, heparitinase II, and heparinase, to lower the molecular weight. Can be prepared with The Usually, it can be prepared by reacting at 100-mg sugar chain before digestion with 0.02-2.0 U enzyme at 20-45 ° C. for 3 hours or more, but it is not limited to the above conditions and the conditions are appropriately determined. It is possible to select.
[0018]
Examples of methods for purifying oligosaccharides having a desired number of sugar residues from digested products obtained by digestion with enzymes include separation methods based on molecular weight, such as gel filtration and ultrafiltration (molecular filtration methods). ) And the like. Those skilled in the art can appropriately select the conditions for using these methods. For example, when a Pharmacia Superdex30 column (column volume 120 ml, flow rate 1 ml / min) is used for gel filtration, the 14 sugar fraction is 65 to 67 minutes, the 12 sugar fraction is 68 to 71 minutes, and the 10 sugar fraction is Is eluted at 71-75 minutes, the 8 sugar fraction at 75-80 minutes, and the 6 sugar fraction at 80-85 minutes. Each fraction contains 90% or more oligosaccharides having a specific number of sugar residues.
[0019]
Although it is possible to obtain a substance of the present invention by adding a sulfate group to the oligosaccharide obtained as described above, it is preferable to obtain a fraction of only oligosaccharides having the same structure and add a sulfate group. The obtained substance of the present invention is preferable because it has a uniform structure. For example, it is possible to obtain a fraction composed of a substance having a uniform structure by further separating the oligosaccharide obtained by the above fractionation by ion exchange chromatography or the like. When ion exchange chromatography is used, since the salt concentration in the solution often increases, it is preferable to desalinate the obtained fraction by a conventional method.
[0020]
In order to obtain the substance of the present invention consisting of the most preferred octasaccharide in which all amino groups of the glucosamine residue are all sulfamidated, the above-mentioned ion exchange chromatography is carried out in the above step, for example, using a monoQ column manufactured by Pharmacia under pH 7.2 conditions. When used, it is preferable to collect the fraction of 8 sugars eluted with about 0.4M saline, and similarly the fraction eluted with 0.5-0.6M saline to obtain the substance of the present invention consisting of 14 sugars. . In the oligosaccharides contained in these fractions, the amino groups of the glucosamine residues contained in the oligosaccharide are all already sulfamided.
[0021]
The substance of the present invention can be prepared by sulfating a specific position of a specific sugar residue of the oligosaccharide contained in the fraction thus obtained. The sulfation can be performed by a chemical method in addition to the enzymatic method, and the enzymatic method makes it easier to react specifically with a specific hydroxyl group and to operate. Therefore, it is preferable. Sulfation by an enzymatic method can be performed using a known sulfate group transferase. For example, in order to prepare the substance of the present invention in which only one hydroxyl group at the 2-position of a uronic acid residue (excluding the second uronic acid residue from the reducing and non-reducing ends) is sulfated, J Heparan sulfate 2-O-sulfotransferase (HS2ST) described in Biol. Chem., Vol.271, no.13 (1996), pp.7845-7653 or an enzyme having the same activity is used. be able to. Similarly, in order to prepare the substance of the present invention in which only one hydroxyl group at the 6-position of the glucosamine residue is sulfated, J. Biol. Chem., Vol.270 (1995), pp.4172-4179 The described heparan sulfate 6-O-sulfotransferase (HS6ST-1) or its isoenzyme (HS6ST-2 or HS6ST-3: J. Biol. Chem., Vol / 275, no.4 (2000), pp. .2859-2868) or enzymes having similar activity can be used. Sulfation by the above-mentioned sulfate group transferase is performed by converting 0.1 to 0.7 U of enzyme per 25 nmol of the oligosaccharide to be transferred in terms of uronic acid or glucosamine content, and active sulfate (for example, 3′-phosphoadenosine) as a sulfate group donor. 5′-phosphosulfate (PAPS) etc.) is added appropriately, and the reaction is carried out at 10-50 ° C., preferably at 15-20 ° C. for about 10 minutes to 5 days, more preferably for about 30 minutes to 2 hours. be able to.
[0022]
The substance of the present invention thus obtained can be isolated from the above reaction solution by a method such as a gel filtration or other molecular weight separation method or an ethanol precipitation method. At this time, it becomes easier to collect the substance of the present invention as a precipitate by adding chondroitin sulfate. Since chondroitin sulfate and the substance of the present invention have significantly different molecular weights, for example, gel filtration method is used for fractionation by molecular weight difference, electrophoresis method, chondroitin sulfate complete digestion by enzymes such as commercially available chondroitinase and gel filtration The chondroitin sulfate and the substance of the present invention can be easily separated by performing a combination of the above methods. The fraction containing the substance of the present invention thus obtained can be further subjected to ion exchange chromatography and gel filtration in accordance with conventional methods to obtain a substance of high purity of 90% or more.
[0023]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.
1. Production of the substance of the present invention
100 mg of CDSNS heparin (manufactured by Seikagaku Corporation) was digested with 0.1 U heparitinase I (manufactured by Seikagaku Corporation) at 37 ° C. overnight. The digested product was boiled for 5 minutes to deactivate the enzyme, and then 0.2 M NH using 1.6 cm × 60 cm Superdex 30 (column volume 120 ml, flow rate 1 ml / min: manufactured by Pharmacia). _Four Fractionation was performed with OAc, and 6 to 14 sugar fractions were collected. The elution time of each oligosaccharide fraction is 80 to 85 minutes for 6 sugars, 75 to 80 minutes for 8 sugars, 71 to 75 minutes for 10 sugars, and 65 to 67 minutes for 14 sugars.
[0024]
Elution of the above 8 sugars and 14 sugars using a monoQ column (Pharmacia) with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.2) and NaCl concentration gradient (0.2-1.0 M) did. The oligosaccharide fraction eluted with 0.41M NaCl for the 8-saccharide fraction and 0.56M NaCl for the 14-sugar fraction is mainly composed of oligosaccharides consisting only of repeating structures of uronic acid residues and N-sulfated glucosamine residues. These fractions were fractionated and desalted using a desalting column PD-10 (Pharmacia). These preparations were analyzed by the enzymatic disaccharide analysis method and gel filtration analysis method described below, and almost all disaccharide components have octasaccharides consisting of only uronic acid residues and N-sulfated glucosamine residues (CDSNSH8). Or it confirmed that it was 14 sugars (CDSNSH14).
[0025]
Each of these desalted fractions was weighed to contain 25 nmol of uronic acid, and 50 pmol of radiolabeled sulfuric acid ([ ³⁵ S] PAPS) and HS2ST (J. Biol. Chem., Vol.271, no.13 (1996) pp.7645-7653) or HS6ST (HS6ST-1: J. biol. Chem., Vol.270 (1995) , pp.4172-4179) was added at 0.35 U (amount of sulfated CDSNS heparin at 0.35 pmol / min), and the reaction was carried out at 20 ° C. for 1 hour. After boiling to inactivate the enzyme, chondroitin sulfate A (CSA: manufactured by Seikagaku Corporation) is added and unreacted [ ³⁵ S] PAPS was removed by ethanol precipitation.
[0026]
The present invention substance 1 is an octasaccharide bonded with sulfate groups by the action of HS2ST, the fraction 1 of the present invention is a fraction containing it, and the present invention substance 2 is an octasaccharide bonded with sulfate groups by the action of HS6ST. The fraction containing was defined as 2 fractions of the substance of the present invention.
[0027]
2. Analysis of the substance of the present invention by disaccharide analysis
Analyzes of the present substance 1 fraction and the present substance 2 fraction by enzymatic disaccharide analysis method combining the digestion with heparin degrading enzyme and high performance liquid chromatography (Shinsei Chemistry Laboratory 3, Carbohydrate II pages 54-59) did. Specifically, 1.0 μg of the test substance was dissolved in 25 μl of 20 mM sodium acetate (pH 7.0) containing 2 mM calcium acetate, and 1.5 mU heparitinase, heparitinase I and 0.15 mU heparitinase II (all manufactured by Seikagaku Corporation) Was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
[0028]
This reaction solution was analyzed under the following conditions using HPLC (manufactured by Waters). A silica-based amino column (YMC, YMC-Pack Polyamine-II column φ4.0 × 250 mm) was used, and the method of Habuchi et al. (1992) Biochem. J., 285, pp.805- 813), elution was performed with a concentration gradient method using sodium dihydrogen phosphate (40 mM → 800 mM) at a flow rate of 1.2 ml / min, and the absorbance at 232 nm was measured. The detected unsaturated disaccharide and its peak area To the total peak area of known unsaturated disaccharides was calculated.
[0029]
That is, the total area of unsaturated disaccharide peaks represented by the following general formula [2-acetamido-2-deoxy-4-O- (4-deoxy-α-L-threo-hex-enopyranosyluronic acid) -D-glucose (hereinafter referred to as ΔDiHS-0S), 2-deoxy-2-sulfamino 4-O- (4-deoxy-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid) -D- Glucose (hereinafter referred to as ΔDiHS-NS), 2-acetamido-2-deoxy-4-O- (4-deoxy-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid) -6-O- Sulfo-D-glucose (hereinafter referred to as ΔDiHS-6S), 2-acetamido-2-deoxy-4-O- (4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyra Nosyluronic acid) -D-glucose (hereinafter referred to as ΔDiHS-US), 2-deoxy-2-sulfamino 4-O- (4-deoxy-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluron) Acid) -6-O-sulfo-D-glucose (hereinafter referred to as ΔDiHS-di (6, N) S), 2-deoxy-2-sulfamino 4-O- (4-deoxy -2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid) -D-glucose (hereinafter referred to as ΔDiHS-di (U, N) S), 2-acetamido-2- Deoxy-4-O- (4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid) -6-O-sulfo-D-glucose (hereinafter referred to as ΔDiHS-di ( U, 6) S), 2-deoxy-2-sulfamino-4-O- (4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid)- The ratio of the peak area of each unsaturated disaccharide is calculated by setting the total peak area of 6-O-sulfo-D-glucose (hereinafter referred to as ΔDiHS-tri (U, 6, N) S) to 100%. did.
[0030]
[Chemical 7]

[0031]
[Table 1]
Table 1

[0032]
The structure indicated by the abbreviation may be expressed as follows.
ΔDiHS-0S: ΔHexA1 → 4GlcNAc, ΔDiHS-NS: ΔHexA1 → 4GlcNS, ΔDiHS-6S: ΔHexA1 → 4GlcNAc (6S), ΔDiHS-US: ΔHexA (2S) 1 → 4GlcNAc, ΔDiHS-di (6, N) S: ΔHexA1 → 4GlcNS (6S), ΔDiHS-di (U, N) S: ΔHexA (2S) 1 → 4GlcNS, ΔDiHS-di (U, 6) S: ΔHexA (2S) 1 → 4GlcNAc (6S), ΔDiHS-tri (U , 6, N) S: ΔHexA (2S) 1 → 4GlcNS (6S).
[0033]
In the above formula, ΔHexA is unsaturated hexuronic acid, GlcNAc is N-acetylglucosamine, GlcNS is N-sulfated glucosamine, and the parenthesis indicates the binding position of the sulfate group.
[0034]
As a result of disaccharide analysis, ΔDiHS-NS was observed in the fraction 1 of the substance of the present invention and the fraction 2 of the substance of the present invention.
[0035]
As a result of measuring the radioactivity of each fraction with a scintillation counter, the fraction of the substance of the present invention was the presence of a peak of ΔDiHS-di (U, N) S, and the fraction of the substance of the present invention was ΔDiHS-di (6, N) The presence of a peak in S was clarified (substance 1 of the present invention: FIG. 1, fraction 2 of the present invention 2: FIG. 2).
[0036]
From the above results, it is clear that the substance 1 of the present invention contains a disaccharide in which a sulfate group is introduced into the 2-position hydroxyl group of the uronic acid residue, and no sulfate group is introduced into other hydroxyl groups. became. In addition, it was revealed that the substance 2 of the present invention contains a disaccharide having a sulfate group introduced into the 6-position hydroxyl group of the glucosamine residue, and no sulfate group was introduced into other hydroxyl groups.
[0037]
3. Identification of the number of sulfate groups introduced in the substance of the present invention
From the elution time of monoQ column chromatography using the following 8 sugars of (1) to (7), a relational expression between the elution time and the number of each sulfate group was derived.
(1): CDSNSH8 described in 1 above.
(2) and (3): 2-position desulfated heparin (2ODS heparin: prepared using Sigma heparin by the method described in Glycobiology vol.4, no.6 (1994), pp.817-824 ) As a raw material according to the method for preparing CDSNSH8 described in 1 above, the digested product is boiled for 5 minutes to deactivate the enzyme, and then 1.6 cm × 60 cm Superdex 30 (column volume 120 ml 0.2M NH using a flow rate of 1ml / min: Pharmacia) _Four Fractionation with OAc, and the 8-saccharide fraction eluting at 69-73 minutes was collected. This octasaccharide fraction was separated using a monoQ column (eluted with 50 mM Gly-HCl, pH 7.2 salt gradient (0.2-1.0 M)), and the fraction eluted with 0.70 M NaCl was added to (2) 2ODSH8- The fraction eluted with 0.77M NaCl was designated as (3) 2ODSH8-2.
(4), (5) and (6): 6-position desulfated heparin (6ODS heparin: prepared by using the method described in WO00 / 6608 using heparin derived from pig skin made by SPL) is used as a raw material. Then, after enzymatic digestion according to the method for preparing CDSNSH8 described in 1 above, this digested product was boiled for 5 minutes to deactivate the enzyme, and then 1.6 cm × 60 cm Superdex 30 (column volume 120 ml, flow rate 1 ml / min: Pharmacia) 0.2M NH using _Four Fractionation with OAc, and the 8-saccharide fraction eluting at 70-73 minutes was collected. This octasaccharide fraction was separated using a monoQ column (eluted with 50 mM Gly-HCl, pH 7.2 salt concentration gradient (0.2-1.0M)), and the fraction eluted with 0.49M NaCl was added to (4) 6ODSH8- The fraction eluted with 0.57M NaCl was designated as <5> 6ODSH8-2, and the fraction eluted with 0.63M NaCl was designated as <6> 6ODSH8-3.
(7): An 8-saccharide fraction (liver HS8) prepared according to the method for preparing CDSNSH8 described in 1 above using bovine heparan sulfate (manufactured by Seikagaku Corporation) as a raw material.
[0038]
The above samples (1) to (7) are subjected to enzymatic disaccharide analysis to estimate the number of sulfate groups contained in these samples (Table 2) and a monoQ column (50 mM Gly-HCl, pH 3.0 salt concentration gradient ( The elution salt concentration was calculated (Table 3).
[0039]
[Table 2]
Table 2

ND: not detected
[0040]
[Table 3]
Table 3

ND: not detected
[0041]
Using the sulfate group number and the eluted salt concentration as an equation, a relational expression between the eluted salt concentration and the number of N sulfate groups, 6O sulfate groups of glucosamine residues, and 2O sulfate groups of uronic acid residues was calculated (Formula 1).
[0042]
[Expression 1]
Formula 1
Elution salt concentration (M) = 0.09 x {(N-sulfate group number) + (2-O-sulfate group number)} + 0.14 x (6-O-sulfate group number)
[0043]
Table 4 shows the elution salt concentration of each substance calculated from this formula.
[0044]
[Table 4]
Table 4

[0045]
As a result of fractionation of the present substance 1 fraction and the present substance 2 fraction using the above-mentioned monoQ column, the present substance 1 was eluted at 0.45M and the present substance 2 was eluted at 0.49M (FIG. 3). . Inventive substance 1 and invented substance 2 have a sulfate group in the 2-position amino group of the glucosamine residue of the starting material CDSNSH8. 6-O-sulfuric acid group number = 0, this invention substance 2 becomes 2-O-sulfuric acid group number = 0 from the above result 2. Therefore, the substance 1 of the present invention has a 2-O-sulfate group number = 1, and the substance 2 of the present invention has a 6-O-sulfate group number = 1.
[0046]
4. Analysis of the position of the introduced sulfate group of the substance 1 of the present invention
The substance 1 of the present invention was specifically decomposed with heparitinase (manufactured by Seikagaku Corporation) to analyze the position of the introduced sulfate group. Heparitinase (EC4.2.2.7) specifically desorbs α-glucosaminide bond of 2-N-sulfo (6-O-sulfo) glucosamine bound to 2-O-sulfo-L-uronic acid of heparin Cleavage to produce an oligosaccharide having an unsaturated uronic acid at the non-reducing end. It was clarified in the above 3 that the present substance 1 has a 2-O-sulfate group introduced by HS2ST by HS2ST. This means that the present substance 1 has one cleavage site by heparitinase. Is shown. Therefore, the sulfate group ([[ ³⁵ When the substance 1 of the present invention introduced with S] PAPS) by HS6ST is digested with heparitinase, it is disaccharide when the introduction site is the reducing end, tetrasaccharide when the introduction site is the second uronic acid from the reducing end, and 3 from the reducing end. In the case of the second uronic acid, radioactivity is observed in hexasaccharide, and in the case of non-reducing terminal uronic acid, radioactivity is observed in octasaccharide.
[0047]
Therefore,[ ³⁵ 2 nmol of the substance 1 of the present invention labeled with S] sulfuric acid was digested with 0.5 U heparitinase at 37 ° C. overnight. After digesting the digested product for 3 minutes to inactivate heparitinase, using a 1.6 cm × 60 cm gel filtration column (Superdex 30: 120 ml of column solution, flow rate of 2 ml / min: manufactured by Amersham Pharmacia), 0.2M NH _Four Fractionation was performed with OAc, and the radioactivity of each fraction was measured (FIG. 4).
[0048]
As a result, the radioactivity was observed in octasaccharide in the control that was not digested with heparitinase, whereas the radioactivity was detected strongly in tetrasaccharide and hexasaccharide when digested with heparitinase, and in disaccharide and octasaccharide. Was hardly detected. This indicates that in the substance 1 of the present invention, a sulfate group is introduced at the 2-position of the second or third uronic acid from the reducing end.
[0049]
5. Growth factor binding activity of the substance of the present invention
Various growth factors shown in Table 5 were bound to CNBr-activated Sepharose 4B (manufactured by Pharmacia) to prepare an affinity carrier, and the binding activities of the substance 1 and 2 of the present invention were measured.
[0050]
CNBr-activated Sepharose 4B (Pharmacia) 0.3ml coupling buffer (0.1M NaHCO containing 0.5M NaCl) _Three suspended in pH 8.3), acetylated heparin (100 mg of heparin, 10 mg of saturated sodium bicarbonate and 5% acetic anhydride were added and reacted at room temperature for 10 minutes, and 2 times the amount of ethanol was added to the reaction mixture. 100 μg bFGF (manufactured by Progen), 200 μg HGF (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), 100 μg FGF-10 (manufactured by Amgen), or 100 μg FGF-18 (amgen) And gently shaken overnight at 4 ° C. The obtained affinity carrier was sufficiently washed with a coupling buffer, and the column was further washed with a binding buffer (Table 4) corresponding to each growth factor described later.
[0051]
4 nmol of the substance of the present invention 1 (1.1 × 10 4 in terms of uronic acid equivalent amount) on an affinity carrier column to which a growth factor is bound ^Five cpm / 4nmol) or Substance 2 of the present invention (6.8 × 10 ^Four 1 ml of various binding buffers (Table 5) containing cpm / 4 nmol) was added and reacted at 4 ° C. for 1 hour. Thereafter, the membrane was washed twice with a binding buffer, and the substance of the present invention bound to the affinity carrier column was eluted with 2 ml of an elution buffer (Table 5). By measuring the radioactivity of each eluted substance of the present invention, the binding rate between the oligosaccharide and various growth factors was calculated. 100 mg of heparin (manufactured by Sigma) was digested overnight at 37 ° C. with 0.1 U of heparitinase I (manufactured by Seikagaku Corporation). The digested product was boiled for 5 minutes to deactivate the enzyme, and then 0.2 M NH using 1.6 cm × 60 cm Superdex 30 (column volume 120 ml, flow rate 1 ml / min: manufactured by Pharmacia). _Four The octasaccharide fraction obtained by fractionation with OAc was tritium-labeled according to the method of Shively and Conrad (Biochem. (1976) 15, 3932-3942) and used as a positive control to measure radioactivity in the same manner. The total amount of radioactivity superimposed on the affinity carrier column was defined as 100%, and the amount of radioactivity bound to the affinity carrier column was expressed as a percentage.
[0052]
[Table 5]

[0053]
As a result, it was revealed that the binding property to bFGF possessed by the substance 1 of the present invention is equivalent to that of the positive control (Table 6).
[0054]
[Table 6]
Table 6

[0055]
In addition, a 14 sugar fraction prepared according to the method described in 1 above (a substance prepared by transferring a sulfate group with HS2ST is a substance of the present invention 3, and a substance prepared by transferring a sulfate group with HS6ST-1 is a substance of the present invention. Substance 4, HS6ST-3 (the substance prepared by transferring a sulfate group according to J. Biol. Chem., Vol. 275, no. 4 (2000), pp. 2859-2868) is designated as substance 5 of the present invention) The binding activity with various growth factors was analyzed as described above. 50 μg VEGF in addition to the above growth factors ₁₆₅ An affinity carrier column using (manufactured by Diaclone) was also prepared (both binding buffer and elution buffer were the same solutions as bFGF-10 and bFGF-18) (Table 7).
[0056]
[Table 7]
Table 7

[0057]
These results suggested that the substance of the present invention can be used as a drug having affinity for a specific growth factor, or an affinity carrier material.
【The invention's effect】
The present invention provides a novel oligosaccharide having a heparin skeleton.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the relationship between the chart obtained when disaccharide analysis of a fraction of the substance of the present invention and the radioactivity of each fraction.
FIG. 2 is a diagram showing the relationship between the chart obtained when disaccharide analysis is performed on two fractions of the substance of the present invention and the radioactivity of each fraction.
FIG. 3 shows a chart of ion exchange chromatography using a monoQ column of the substance 1 of the present invention and the substance 2 of the present invention. ● represents the substance 1 of the present invention, and ■ represents the substance 2 of the present invention.
FIG. 4 is a view showing the radioactivity distribution in each fraction of the heparitinase digestion product of the substance 1 of the present invention prepared by introducing a radiolabeled sulfate group. ○ indicates the radioactivity distribution of the control without addition of heparitinase, and ● indicates the radioactivity distribution when heparitinase is added.

Claims

A oligosaccharide 8 sugar with heparin skeleton of the repeating disaccharide consisting of uronic acid residue and a glucosamine residue, the 2-position hydroxyl group is directly compared with the structure in a repeating uronic acid residues are sulfated Oligosaccharide having a group.

The oligosaccharide according to claim 1, wherein all amino groups of the glucosamine residue are sulfamidated.

Reducing end and a non-reducing end from a disaccharide first hydroxyl groups of the uronic acid residue, characterized in that the non-sulfated claim 1 or 2, wherein the oligosaccharide.

An oligosaccharide represented by the following general formula 1 or 2.

However, R ¹¹ And R ²² Is one hydroxyl group sulfated, the other represents a hydroxyl group, R ^3Three And R ^4Four Each independently represents a carboxyl group and the other represents H, and NS represents a sulfamide group.