JP4761337B2

JP4761337B2 - Method for stabilizing alkaline phosphatase

Info

Publication number: JP4761337B2
Application number: JP2001200613A
Authority: JP
Inventors: 成植田
Original assignee: Asahi Kasei Pharma Corp
Current assignee: Asahi Kasei Pharma Corp
Priority date: 2001-07-02
Filing date: 2001-07-02
Publication date: 2011-08-31
Anticipated expiration: 2021-07-02
Also published as: JP2003009857A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、精度管理用試料、酵素免疫測定法に基づく検査試薬に用いられるアルカリホスファターゼまたはその誘導体の水溶液の安定化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）は、植物、動物、および微生物などに存在することが知られている酵素である。臨床検査においては、血清中の酵素活性が測定され、種々の病態を反映することが知られている。また、動物由来、とりわけ牛小腸ＡＬＰは、その分子活性が高いことから、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）の標識酵素として汎用されている。
【０００３】
したがって、ＡＬＰ含有組成物は、検体検査時にはＡＬＰ酵素活性測定の際のコントロールまたは標準物質として、また、ＥＩＡにおいてＡＬＰを標識酵素として用いる免疫試薬としても有用である。
アルカリホスファターゼ水溶液の安定化に関して、アルカリホスファターゼに可逆的な結合活性を有するリン酸、リン酸エステルおよびこれらの塩などを添加する報告がある（特開平８−１６８３７７号）が、これらの化合物は、該酵素の基質または生成物でもあるため、保存中に添加物自体が分解されたり、酵素活性測定に及ぼす影響が懸念される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、冷蔵（２〜８度）で長期間、また、３７℃付近の温度でも最低１ヶ月は活性の変動のないアルカリホスファターゼ、またはその誘導体を含む水溶液の安定化方法を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸などの胆汁酸または抱合胆汁酸をＡＬＰまたはその誘導体の水溶液に添加することによって、劇的にその安定性が増すことを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明に関して、以下具体的に説明する。本発明において、安定化剤として用いられる胆汁酸としては、ケノデオキシコールコール酸、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、コール酸およびこれら胆汁酸塩、またはこれら胆汁酸のグリシン抱合体、タウリン抱合体および塩が挙げられる。これら胆汁酸類の好適な濃度としては０．１〜２０ｍＭ、特に好ましくは０．２〜１０ｍＭである。
【０００７】
また、本発明に用いられるアルカリホスファターゼについては、その用途が合致すれば特に限定されない。例えば、動物起源としては、牛腎臓、ブタ腎臓、ニワトリ小腸などが、微生物起源としては、大腸菌由来のものが市販されている。また、ＨｅＬａ細胞や羊膜細胞などの株化細胞の培養物から取得することもできる。さらに、近年の遺伝子工学技術の発展により、ヒト由来ＡＬＰ蛋白質をコードする遺伝子も明らかになっており、これらの遺伝子を組み込んだ形質転換体細胞からも取得できる。例えば、肝型ＡＬＰが形質転換動物細胞より取得、精製され旭化成（株）より市販されている（旭化成（株）診断用酵素カタログ）。
【０００８】
また、この際、形質転換体細胞としては、ヒト細胞のみでなく、チャイニーズハムスター由来ＣＨＯ細胞等のヒト以外の動物細胞や大腸菌、酵母、カビなどの微生物を用いることもできる。さらに、ＡＬＰのアミノ酸配列の一部が削除または置換され、他のアミノ酸残基またはアミノ酸配列が付加されているＡＬＰ誘導体をコードする遺伝子を用いた形質転換体を用いることもできる。これら生産された酵素は、市販されたもの以外は、カラムクロマトグラフィ法等の公知の精製法を組み合わせ、実用レベルまで純度を高めて本目的に使用すればよい。また、上記のＡＬＰに抗原、抗体、アビジン、ペプチドなどを結合して用いることもできる。
【０００９】
本発明におけるこれらの酵素添加量は、特に限定されないが、９〜６５００Ｕ／Ｌ、特に好ましくは４５〜１３００Ｕ／Ｌである。
これらの化合物は、例えば、トリスやＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳなどの緩衝能を有する水性媒体を用いて中性付近のｐＨ、具体的にはｐＨ５．５〜８．５の範囲になるように調整すればよい。また、雑菌による汚染を防ぐため、適宜防腐剤等を添加することもできる。防腐剤の例としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、アンピシリン等の抗生物質、ホウ酸、プロクリン(ProClin)などの静菌剤などが挙げられる。
【００１０】
以下、本発明を実施例に基づいて説明する。
【実施例１】
０．０１％ＢＳＡ、１０μＭ塩化亜鉛、０．０５％アジ化ナトリウム、５００Ｕ／Ｌのアルカリホスファターゼ（旭化成（株）、製品ナンバーＴ−７３）を含有する４０ｍＭＢＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液に各種添加剤を加えて、３７℃の活性推移を追った。表１に示したとおり、添加物無添加の２３日目の残存活性が６７．４％であるのに対し、各種胆汁酸類を２．５ないし５ｍＭ加えたものは、８６．５％以上の残存活性を示した。
【００１１】
【表１】

【００１２】
【実施例２】
０．０５％ＢＳＡ、１０μＭ塩化亜鉛、０．０５％アジ化ナトリウム、５００Ｕ／Ｌのアルカリホスファターゼ（旭化成（株）、製品ナンバーＴ−７３）を含有する４０ｍＭＢＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液に、グリコケノデオキシコール酸ナトリウム（Ｎａ・ＧＣＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸ナトリウム（Ｎａ・ＣＤＣＡ）の濃度をそれぞれ３水準設定して加え、２５℃、および３７℃保存における活性の推移を調べた。表２に示したとおり、２５℃では少なくとも１ヶ月間は活性の低下が全く認められず、また、３７℃においても、Ｎａ・ＧＣＤＣＡが１ｍＭ、Ｎａ・ＣＤＣＡでは２．５ｍＭ以上で、やはり１ヶ月活性の低下は認められなかった。
【００１３】
【表２】

【００１４】
【実施例３】
０．１％ＢＳＡ、１０μＭ塩化亜鉛、０．０５％アジ化ナトリウム、５００Ｕ／Ｌのアルカリホスファターゼ（旭化成（株）、製品ナンバーＴ−７３）を含有する４０ｍＭＢＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液に、グリコケノデオキシコール酸ナトリウム（Ｎａ・ＧＣＤＣＡ）を２ｍＭになるように加え、５℃、１０℃、―２０℃保存における安定性を調べた。表３に示すように、５℃、１０℃の冷蔵保存で９ヶ月まで全く活性が低下していない。また、−２０℃の凍結保存でも同様活性低下が認められなかった。
【００１５】
【表３】

【００１６】
【発明の効果】
本発明によるアルカリホスファタ−ゼ水溶液は、冷蔵で少なくとも９ヶ月、また、３７℃においては１ヶ月活性の低下が全く認められず、極めて安定性に富む組成とすることができたものである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for stabilizing an aqueous solution of alkaline phosphatase or a derivative thereof used for a quality control sample and a test reagent based on an enzyme immunoassay.
[0002]
[Prior art]
Alkaline phosphatase (ALP) is an enzyme known to exist in plants, animals, microorganisms and the like. In clinical tests, it is known that the enzyme activity in serum is measured and reflects various pathological conditions. In addition, animal-derived, especially bovine small intestine ALP, is widely used as a labeling enzyme for enzyme immunoassay (EIA) because of its high molecular activity.
[0003]
Therefore, the ALP-containing composition is useful as a control or standard substance for measuring ALP enzyme activity during specimen testing, and as an immunoreagent using ALP as a labeling enzyme in EIA.
Regarding the stabilization of alkaline phosphatase aqueous solution, there are reports of adding phosphates, phosphate esters and salts thereof having reversible binding activity to alkaline phosphatase (Japanese Patent Laid-Open No. 8-168377). Since it is also a substrate or a product of the enzyme, there is a concern that the additive itself is decomposed during storage or an influence on the enzyme activity measurement.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for stabilizing an aqueous solution containing alkaline phosphatase, or a derivative thereof, that is refrigerated (2 to 8 degrees) for a long period of time, and that does not change its activity for at least one month even at a temperature near 37 ° C. Is.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have dramatically improved the performance by adding bile acids such as cholic acid, deoxycholic acid, chenodeoxycholic acid or conjugated bile acids to an aqueous solution of ALP or a derivative thereof. It has been found that the stability is increased, and the present invention has been completed.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention will be specifically described below. In the present invention, bile acids used as stabilizers include chenodeoxycholic acid, deoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, cholic acid and their bile salts, or glycine conjugates, taurine conjugates and salts of these bile acids. Is mentioned. A suitable concentration of these bile acids is 0.1 to 20 mM, particularly preferably 0.2 to 10 mM.
[0007]
Moreover, about the alkaline phosphatase used for this invention, if the use corresponds, it will not specifically limit. For example, bovine kidney, pig kidney, chicken small intestine and the like are commercially available as animal origin, and those derived from Escherichia coli are commercially available as microbial origin. It can also be obtained from a culture of established cells such as HeLa cells and amniotic cells. Furthermore, with the recent development of genetic engineering technology, genes encoding human-derived ALP proteins have also been clarified and can be obtained from transformant cells incorporating these genes. For example, liver-type ALP is obtained and purified from transformed animal cells and is commercially available from Asahi Kasei Corporation (Asahi Kasei Corporation diagnostic enzyme catalog).
[0008]
In this case, not only human cells but also non-human animal cells such as Chinese hamster-derived CHO cells and microorganisms such as Escherichia coli, yeast, and mold can be used as transformant cells. Furthermore, a transformant using a gene encoding an ALP derivative in which a part of the amino acid sequence of ALP is deleted or substituted and another amino acid residue or amino acid sequence is added can also be used. These produced enzymes may be used for this purpose after being combined with a known purification method such as a column chromatography method to increase the purity to a practical level. In addition, antigens, antibodies, avidin, peptides and the like can be bound to the above ALP.
[0009]
Although the enzyme addition amount in this invention is not specifically limited, It is 9-6500 U / L, Most preferably, it is 45-1300 U / L.
These compounds may be adjusted to have a pH near neutral, specifically pH 5.5 to 8.5, using an aqueous medium having a buffer capacity such as Tris, PIPES, and HEPES. . Moreover, in order to prevent contamination by various bacteria, a preservative or the like can be added as appropriate. Examples of antiseptics include antibiotics such as gentamicin, kanamycin and ampicillin, and bacteriostatic agents such as boric acid and proclin.
[0010]
Hereinafter, the present invention will be described based on examples.
[Example 1]
Add various additives to 40 mM BES-NaOH buffer containing 0.01% BSA, 10 μM zinc chloride, 0.05% sodium azide, 500 U / L alkaline phosphatase (Asahi Kasei Corporation, product number T-73) The activity transition at 37 ° C. was followed. As shown in Table 1, the residual activity on the 23rd day without addition of additives was 67.4%, while the addition of 2.5 to 5 mM of various bile acids remained at 86.5% or more. Showed activity.
[0011]
[Table 1]

[0012]
[Example 2]
Sodium glycochenodeoxycholate was added to 40 mM BES-NaOH buffer containing 0.05% BSA, 10 μM zinc chloride, 0.05% sodium azide, 500 U / L alkaline phosphatase (Asahi Kasei Corporation, product number T-73). (Na · GCDCA) and chenodeoxycholate sodium (Na · CDCA) were added at three levels, respectively, and the transition of activity during storage at 25 ° C. and 37 ° C. was examined. As shown in Table 2, no decrease in activity was observed at 25 ° C. for at least one month. Also at 37 ° C., Na · GCDCA was 1 mM and Na · CDCA was 2.5 mM or more. No decrease in activity was observed.
[0013]
[Table 2]

[0014]
[Example 3]
Sodium glycochenodeoxycholate was added to 40 mM BES-NaOH buffer containing 0.1% BSA, 10 μM zinc chloride, 0.05% sodium azide, 500 U / L alkaline phosphatase (Asahi Kasei Corporation, product number T-73). (Na · GCDCA) was added to 2 mM, and the stability at 5 ° C., 10 ° C., and −20 ° C. storage was examined. As shown in Table 3, the activity was not lowered at all by refrigerated storage at 5 ° C. and 10 ° C. until 9 months. Similarly, no decrease in activity was observed even when frozen at -20 ° C.
[0015]
[Table 3]

[0016]
【The invention's effect】
The alkaline phosphatase aqueous solution according to the present invention has a composition with extremely high stability, with no decrease in activity observed at least 9 months after refrigeration and 1 month at 37 ° C.

Claims

Cholic acid in an aqueous solution containing a human-derived alkaline phosphatase, taurocholate, deoxycholate, glycodeoxycholic acid, taurodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, glycochenodeoxycholic acid or a human-derived alkaline, characterized in that the addition of these salts Method for stabilizing phosphatase.

The stabilization method according to claim 1, wherein the human-derived alkaline phosphatase is a human-derived liver-type alkaline phosphatase obtained from a transformed animal cell .

Human-derived alkaline phosphatase is a human-derived liver alkaline phosphatase derivative comprising a conjugate of human alkaline phosphatase and an antigen, antibody, avidin, haptens, peptides, or nucleic acid, the stabilization method according to claim 1.

The concentration of cholic acid, taurocholic acid, deoxycholic acid, glycodeoxycholic acid, taurodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, or glycochenodeoxycholic acid in an aqueous solution containing human alkaline phosphatase is 0.2 mM to 10 mM, The stabilization method according to claim 1.

Aqueous solution of cholic acid containing human-derived alkaline phosphatase, taurocholate, deoxycholate, glycodeoxycholic acid, taurodeoxycholic acid, human, characterized by containing chenodeoxycholic acid, glycochenodeoxycholic acid, or salts thereof stabilized aqueous solution of alkaline phosphatase from.

A human alkaline phosphatase stabilizer comprising cholic acid, taurocholic acid, deoxycholic acid, glycodeoxycholic acid, taurodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, glycochenodeoxycholic acid, or a salt thereof .