JP4747245B2 - Enzymatic method of construction of RNAi library - Google Patents

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Description

本発明は、DNA発現ベクターに基づいたRNAiライブラリーの構築方法に関し、特に、標的配列に対する系統的なライブラリーを酵素的に構築する方法に関する。 The present invention relates to a method for constructing a RNAi library based on a DNA expression vector, in particular, to a method of constructing a systematic libraries for target sequences enzymatically.
本発明は、上記酵素的に構築されたRNAiライブラリーを用いて、標的遺伝子等をサイレンシングし得る適切なiRNA発現構築物を選択するためのスクリーニング方法に関する。 The present invention uses the RNAi library constructed above enzymatically, a screening method for selecting an appropriate iRNA expression construct capable of silencing a target gene.

現在、利用可能な大量のゲノムデータ(非特許文献1-5)を利用して、機能欠失によってそれぞれの遺伝子の機能を決定するリバース遺伝学アプローチは、遺伝子と機能との関係を完全に解明するために重要な技術となっている。 Currently, the reverse genetics approach using a large amount of genomic data available (non-patent document 1-5), to determine the function of each gene by the functional deletion is completely elucidate the relationship between the genes and functional It has become an important technology in order to. リバース遺伝学アプローチを実施するための技術として、遺伝子ターゲッティングによるノックアウト動物の創生、あるいはアンチセンス技法とがある。 As a technique for performing reverse genetics approach, the creation of knockout animals by gene targeting, or have an antisense techniques.
相同的組換えによる遺伝子ターゲティング技術(非特許文献6)は、種々の遺伝子の機能を決定するために広く用いられている。 By homologous recombination gene targeting technology (non-patent document 6) are widely used to determine the function of various genes. しかし、そのプロセスは労力を要するために、簡便かつ広い用途に応用することができない。 However, the process for laborious, can not be applied to the simple and versatile. また、アンチセンスオリゴヌクレオチドはより簡便に用いることができるが、その導入はしばしば毒性、不安定性、および非特異的作用をもたらす(非特許文献7)。 Although antisense oligonucleotides can be used more simply, resulting in the introduction are often toxic, instability, and non-specific effects (Non-Patent Document 7).
一方、二本鎖RNAによって誘発される遺伝子抑制現象であるRNA干渉(RNAi)(非特許文献8)は、通常特異的であること、その上、広範囲の生物において前例のない迅速さで遺伝子抑制体を得ることができることから遺伝子ターゲッティング技術やアンチセンス技術に代わる魅力的な方法となっている(非特許文献7,9)。 On the other hand, RNA interference (RNAi) (Non-Patent Document 8), a gene suppression phenomenon induced by double-stranded RNA, it is usually specific, Moreover, gene silencing with unprecedented rapidity in a wide range of biological has become an attractive alternative to gene targeting technology and antisense technology since it is possible to obtain a body (non-Patent Document 7 and 9). RNAiは、線虫(C. elegans)におけるゲノムワイドなリバース遺伝学にも適用されている(非特許文献10)。 RNAi is nematodes in genome-wide reverse genetics in (C. elegans) has been applied (10). しかし、高等脊椎動物では長い(>30ヌクレオチド)二本鎖RNAsが有害なインターフェロン反応を誘発することから、当初RNAiの使用は無脊椎動物に限定されていた。 However, since the long in higher vertebrates (> 30 nucleotides) double stranded RNAs induces deleterious interferon response, using the original RNAi had been limited to invertebrates. この問題は、短鎖干渉RNA(siRNA)と呼ばれる短い(21〜23ヌクレオチド)の二本鎖RNAが、哺乳類において有害事象を引き起こすことなくRNAiを誘導するという知見によって克服された(非特許文献11)。 This problem is a double-stranded RNA of the short interfering RNA (siRNA) short called (21-23 nucleotides) is, to cause adverse events in mammals have been overcome by the finding that induces RNAi without (Non-Patent Document 11 ). オリゴsiRNA効果が一過性であるという特性は、siRNAまたはsiRNAを模倣した短いヘアピン構造の二重鎖RNA(shRNA)を細胞内で発現させるDNAベクターが開発されたことによって克服されている(非特許文献12-17)。 Property of oligo siRNA effect is transient, the short hairpin structure that mimics the siRNA or siRNA duplex RNA with (shRNA) a DNA vector to be expressed in a cell are overcome by developed (Non Patent Document 12-17).

RNAi技法の開発にもかかわらず、有効な遺伝子サイレンシング活性を有するsiRNA/shRNA発現構築物をデザインするための一般的な法則はまだなく、このため、適した構築物が同定されるまでには時間と費用を要する。 Despite the development of RNAi technology, effective general rule for designing siRNA / shRNA expression constructs with gene silencing activity is still not, Therefore, until appropriate construct is identified time and costly.
また、RNAiは特異的であると考えられたが、デザインした配列によっては「オフターゲットエフェクト」という標的以外の特定の遺伝子を抑制する現象も検出されている。 Further, RNAi has been thought to be specific, depending sequences designed are also detected phenomenon suppressing specific genes other than the target of "off-target effects". そのため、オフターゲットエフェクトを回避するためには、標的遺伝子内のいずれの配列に対するsiRNAまたはshRNAをデザインするかが重要になってきている。 Therefore, in order to avoid off-target effects, or to design siRNA or shRNA against any sequence in the target gene becomes important.

本発明は、系統的なスクリーニングを行い得るshRNA発現構築物のライブラリーの製造方法およびこのライブラリーを用いて所望のサイレンシング活性を有する発現構築物を選択し得るスクリーニング方法を提供することを目的とする。 The present invention aims to provide a screening method capable of selecting an expression construct with the desired silencing activity using the manufacturing method and the library of libraries of shRNA expression construct capable of performing systematic screening . この目的のために、本願発明者らは、EPRIL(RNAiライブラリーの酵素的作製)と呼ばれる技術を開発した。 To this end, the present inventors have developed a technique called EPRIL (enzymatic production of RNAi library). すなわち、標的とする遺伝子等をランダムに切断して、このランダム断片の両端にアダプターを接続する。 That is, genes such targeting is cut at random, to connect the adapter to the both ends of the random fragments. このうち、いずれか一方のアダプターをヘアピン構造とすることによりランダム断片を中央に備えたヘアピン型構造を有する断片となる。 Of these, either one of the adapter a fragment having a hairpin structure with a random fragment in the middle by a hairpin structure. このヘアピン型構造に変換された断片をストランドディスプレイス活性を有するポリメラーゼで伸長させることにより、主としてヘアピン型二重鎖RNAを発現し得るiRNA発現構築物が製造される。 By extending the hairpin structure on the converted fragments in a polymerase having strand displacement activity, iRNA expression construct capable of mainly express hairpin double-stranded RNA is produced.

また、本発明者らは標的遺伝子をレポーター遺伝子と融合させて、標的遺伝子のサイレンシングをレポーター遺伝子のサイレンシングを指標に選択し得るスクリーニング系、さらには、ネガティブ選択マーカーであるチミジンキナーゼ遺伝子を用いて、前記RNAiライブラリーから最も有効なサイレンシング活性を有するshRNA発現構築物を選択し得る技術を開発した。 Further, the present inventors have targeted gene is fused to a reporter gene, screening may select silencing of the target gene silencing of a reporter gene as an index system, furthermore, using the thymidine kinase gene is a negative selection marker Te, we have developed a technique that can select shRNA expression construct having the most effective silencing activity from the RNAi library. さらに本発明者らは、本発明のライブラリー作製方法がcDNAライブラリーから直接RNAiライブラリーを作製することに応用できることも示した。 The present inventors have also shown that can be applied to library construction method of the present invention is to prepare a direct RNAi library from cDNA libraries. すなわち、本発明は以下に示す通りである。 That is, the present invention is as follows.
1. 以下の(1)〜(3)の工程を含む、所望の標的DNAからRNAiライブラリーを製造する方法。 1. comprising the steps of the following (1) to (3), a method of manufacturing a RNAi library from a desired target DNA.
(1)標的DNAをランダムに切断し、DNA断片を生成する工程、 (1) The target DNA is cut at random, to produce a DNA fragment,
(2)ヘアピン型アダプターを、前記DNA断片の一端に接続して、ヘアピン型のDNA断片を生成する工程、 (2) a hairpin adapter, connected to one end of the DNA fragment, to produce a DNA fragment of hairpin,
(3)ヘアピン型のDNA断片をStrand−displacing活性を有するポリメラーゼを用いてプライマーエクステンションを実行させ、インターフェアレンスRNAをコードしたiRNA発現構築物を生成させる工程を含む、RNAiライブラリー製造方法。 (3) a DNA fragment of hairpin using polymerase having Strand-displacing activity is performed primer extension, comprising the step of generating an iRNA expression constructs encoding the interference RNA, RNAi library production method.
2. 前記(2)工程の前または後にDAN断片の他端に二重鎖断端型アダプターを接続する工程が含まれ、 2. The (2) step of connecting the double-stranded stump type adapter to the other end of the DAN fragment before or after the step is included,
前記二重鎖断端型アダプターまたは前記ヘアピン型アダプターのいずれか一方にアウトサイドカッターの制限酵素認識サイトが備えられ、 Either one provided with a restriction enzyme recognition site of the outside cutter of the duplex stump type adapter or the hairpin adapter,
前記制限酵素認識サイトを備えたアダプターが先に、前記DNA断片に接続され、前記アウトサイドカッターの制限酵素によりDNA断片の長さが整えられて形成された端にもう一方のアダプターが接続される、上記1記載の方法。 The adapter previously with the restriction enzyme recognition site, which is connected to the DNA fragment, the other adapter is connected to a length formed by trimmed end of the DNA fragment by restriction enzyme of the outside cutter the method of claim 1, wherein.
3. ヘアピン型アダプターにアウトサイドカッターの制限酵素認識サイトが備えられている、上記2記載の方法。 3. hairpin adapter restriction enzyme recognition sites of the outside cutter is provided, the method of the second aspect.
4. 二重鎖断端型アダプターにアウトサイドカッターの制限酵素認識サイトが備えられている、上記2記載の方法。 4. restriction enzyme recognition sites of the outside cutter duplex stump type adapter is provided, the method of the second aspect.
5. プライマーエクステンション後にiRNA発現構築物を発現ベクターに接続する工程をさらに含む、上記1記載のRNAiライブラリーの製造方法。 5. After primer extension further comprises a step of connecting the iRNA expression construct into an expression vector, a manufacturing method of an RNAi library of claim 1, wherein the.
6. 6. 発現ベクターが哺乳動物内で機能し得る、上記5記載のRNAiライブラリーの製造方法。 Expression vector capable of functioning in mammalian method of RNAi library of the 5 described.
7. 7. 発現ベクターが宿主染色体内への組込み活性を有する、上記5又は上記6記載のRNAiライブラリーの製造方法。 Expression vector comprising an integrated activity into the host chromosome, the production method of RNAi library of the 5 or the 6 wherein.
8. 8. 標的DNAが、特定の遺伝子のcDNA、cDNAライブラリー、またはサブトラクション後のcDNAのいずれかである、上記1〜7のいずれかに記載のRNAiライブラリーの製造方法。 Target DNA, cDNA of specific genes, cDNA library or either cDNA after subtraction method of RNAi library of any of the above 1-7.
9. 9. 前記(1)工程において、ショットガンクローニングに使用し得るDNA消化酵素を用いて標的DNAが断片化される、上記1記載のRNAiライブラリーの製造方法。 Wherein (1) in step with a DNA digesting enzyme may be used in shotgun cloning target DNA is fragmented, the manufacturing method of RNAi library of claim 1, wherein the.
10. アウトサイドカッターの制限酵素が、少なくとも第一のアダプター内の認識サイトから19bp以上はなれた位置を切断する、上記1〜9のいずれかに記載のRNAiライブラリーの製造方法。 10. Out of the side cutter restriction enzyme cuts the position accustomed the above 19bp from the recognition site of at least the first adapter manufacturing method of RNAi library of any of the above 1-9.
11. 11. Strand−displacing活性を有するポリメラーゼが耐熱性である、上記1から10のいずれかに記載のRNAiライブラリーの製造方法。 Strand-displacing polymerase having activity is thermotolerant, manufacturing method of RNAi library of any of the 10 from the 1.
12. 12. Strand−displacing活性を有するポリメラーゼがBstポリメラーゼまたはVentポリメラーゼのいずれかである、上記1から11のいずれかに記載のRNAiライブラリーの製造方法。 Polymerase with Strand-displacing activity is either Bst polymerase or Vent polymerase The method of RNAi library according to any one of the above 1 to 11.
13. 13. 上記1から12のいずれかに記載の方法により製造されたRNAiライブラリー。 RNAi library produced by the method according to any one of the above 1 to 12.
14. 上記1から12のいずれかに記載の方法により製造されたRNAiライブラリーから所望のRNAi活性を有するsiRNA発現構築物をスクリーニングする方法であって、 14. A method of screening for siRNA expression constructs with desired RNAi activity from RNAi library produced by the method according to any one of the above 1 to 12,
標的DNAが発現している細胞に前記RNAiライブラリーを導入する工程、 Introducing said RNAi library cells target DNA is expressed,
標的DNAの発現を測定する工程、を含むスクリーニング方法。 Screening method comprising steps, a measuring expression of the target DNA.
15. 15. 上記14記載のスクリーニング方法において、 In the screening method of the above-mentioned 14, wherein,
標的DNAをレポーター遺伝子と融合させた融合遺伝子として、 The target DNA as a fusion gene fused to a reporter gene,
標的DNAの発現を測定する工程では、前記レポータータンパク質の活性を指標に標的DNAの発現が測定される、スクリーニング方法。 In the step of measuring the expression of the target DNA, the expression of the target DNA is measured the activity of the reporter protein as an indicator, the screening method.
16. 16. 上記1から12のいずれかに記載の方法により製造されたRNAiライブラリーから所望のRNAi活性を有するsiRNA発現構築物をスクリーニングする方法であって、 A method of screening for siRNA expression constructs with desired RNAi activity from RNAi library produced by the method according to any one of the above 1 to 12,
標的DNAとネガティブ選択マーカー遺伝子とを融合させた融合遺伝子が発現している細胞に前記RNAiライブラリーを導入する工程、 Introducing said RNAi library cells fusion gene fused with the target DNA and the negative selection marker gene is expressed,
ネガティブ選択マーカーによる選択を実行しRNAi効果があった細胞のみを選択する工程とを、スクリーニング方法。 And selecting only the cells that had RNAi effect performs selection by negative selection marker, a screening method.
17. 17. RNAiライブラリーを製造するためのシステムであって、 A system for producing an RNAi library,
ヘアピン型アダプターと、二重鎖断端型アダプターとを含み、 Includes a hairpin adapter, and a double-stranded stump type adapter,
前記アダプターのいずれかにアウトサイドカッターの制限酵素認識サイトが備えられている、システム。 Restriction enzyme recognition sites of the outside cutter in any one of the adapter is provided, the system.
18. 18. さらに、アウトサイドカッターの制限酵素および/またはStrand−displacing性を有するポリメラーゼを備えた、上記17記載のシステム。 Furthermore, with a polymerase with restriction enzymes and / or Strand-displacing properties of the outside cutter, the system of the 17 described.

EPRILの概要を示す図である。 Is a diagram showing the outline of the EPRIL. (a)shRNA発現ライブラリへのcDNAの酵素的誘導の図示プロトコール。 (A) shown protocol cDNA enzymatic induction into shRNA expression library. (b)酵素的誘導の過程におけるDNAsのPAGE。 (B) PAGE of DNAs in the course of the enzymatic induction. M、25 bpの梯子状DNAマーカー。 M, 25 bp of the ladder-like DNA marker. レーン1、2および3は、第一のアダプターのライゲーションおよびMmeI消化後の産物、アダプター2-ライゲーション断片、ならびにポリメラーゼ反応後の断片を示す。 Lanes 1, 2 and 3, ligation and MmeI product after digestion of the first adapter, the adapter 2 ligation fragments, as well as the fragments after the polymerase reaction. それぞれのレーンに関して、産物を矢印の先で示す。 For each lane, indicating the product in arrow head. GFPをコードするcDNAから調製したRNAiライブラリによるGFP発現のサイレンシングを示す図である。 Is a diagram showing the silencing of GFP expression by RNAi library prepared from cDNA encoding GFP. (a)RNAi効率の分布を示すヒストグラム。 (A) histogram showing the distribution of RNAi efficiency. バーは、shRNA発現構築物の数を表す。 Bars represent the shRNA expression constructs the number. 丸は、標準化した累積頻度を示す。 Circle indicates a normalized cumulative frequency was. (b)減少倍数の値によって示されるより大きい効率を有するshRNA発現構築物の分画毎の量を、減少倍数に対してプロットする。 (B) the amount of each fraction of the shRNA expression constructs with larger efficiency indicated by a decrease multiple of the value is plotted against the fold reduction. (c)個々のshRNA発現構築物の位置および効率。 (C) the position and efficiency of the individual shRNA expression constructs. 垂直方向の軸は、相対的な減少を表し、水平方向の軸はGFP配列の位置を表す。 The vertical axis represents a relative decrease, the horizontal axis represents the position of the GFP sequence. それぞれの短い水平方向のバーは、位置およびそのRNAi効率を表す。 Each short horizontal bars, position and representing the RNAi efficiency. shRNA発現構築物の方向も同様にバーの色で示し、灰色および黒のバーはそれぞれ、ガイド配列が逆方向反復配列の5'および3'側に存在するshRNA発現構築物を示す。 Direction of shRNA expression constructs likewise indicated in bar color, respectively gray and black bars, it indicates the shRNA expression constructs guide sequences are present at the 5 'and 3' inverted repeat sequence. (d)GFP配列のそれぞれの位置に関して相対減少の平均値をプロットする(平均値±SD)。 And (d) plots the average value of the relative decrease with respect to each position of the GFP sequence (mean ± SD). 括弧内の数は、それぞれの群に関するデータの数を示す。 The number in parentheses indicates the number of data for each group. 様々な形質導入操作によるRNAi効率プロフィールを示す図である。 Is a diagram showing an RNAi efficiency profiles according to various transduction operations. (a)プラスミド(左の垂直軸、黒丸)またはPCR増幅発現カセット(右の垂直軸、灰色の丸)のトランスフェクションによるGFPサイレンシングの効率を、レトロウイルス形質導入による効率と比較する(水平軸)。 (A) plasmid (left vertical axis, closed circles) or PCR amplification expression cassette (right vertical axis, gray circles) the efficiency of GFP silencing by transfection, compared to the efficiency by retroviral transduction (horizontal axis ). (b)ダイサー消化を行った(灰色の丸)および行わなかった(黒丸)場合のインビトロ転写shRNAのトランスフェクションによるGFPサイレンシングの効率を、プラスミドトランスフェクションによる効率に対してプロットする(水平軸)。 (B) was Dicer digestion (gray circles) and was not performed (black circles) efficiency of GFP silencing by transfection of in vitro transcribed shRNA cases, is plotted on the efficiency with plasmid transfection (horizontal axis) . IP 3 R cDNAに由来するRNAiライブラリによる1型IP 3 R発現のサイレンシングを示す図である。 IP 3 is a diagram showing the silencing of type 1 IP 3 R expression by RNAi library derived from R cDNA. (a)GFP蛍光強度に基づいて推定したRNAi効率。 (A) RNAi efficiency was estimated based on GFP fluorescence intensity. GFP蛍光強度の相対的減少値を示す。 It shows a relative decrease value of GFP fluorescence intensity. 四角の枠は、IP 3 Rコード領域を表し、点は、それぞれのshRNA発現構築物の標的の位置を示す。 Rectangular frame represents IP 3 R coding region, the point indicates the position of the target of each shRNA expression constructs. shRNA発現構築物、SI2A5およびSI3G6に関するデータを記す。 shRNA expression constructs, referred data regarding SI2A5 and SI3G6. (b)shRNA発現構築物を有しない(対照)、GFP-サイレンシングshRNA発現ベクター(shGFP)を有する、またはIP 3 Rを標的とするshRNA発現構築物(SI2A5およびSI3G6)を有する、レトロウイルスを感染させたA7r5細胞のウェスタンブロッティング。 (B) no shRNA expression construct (control), GFP-silenced with shRNA expression vector (shGFP), or a shRNA expression constructs an IP 3 R targeting (SI2A5 and SI3G6), it was infected with retrovirus A7r5 cell of Western blotting. アクチンは、ローディング対照としての役割を有する。 Actin, it has a role as a loading control. 編集した標準化IP 3 R発現レベルを下のパネルに示す(平均値±SEM、n=3)。 Indicating the normalized IP 3 R expression levels edited in the lower panel (mean ± SEM, n = 3). (c)IP 3 RターゲティングshRNA発現構築物を形質導入しない場合、およびSI2A5またはSI3G6を導入した場合の、バソプレッシンによって誘発したA7r5細胞の細胞内カルシウム反応を示す。 (C) IP 3 when R targeting shRNA expression does constructs were transduced, and in the case of introducing SI2A5 or SI3G6, shows intracellular calcium response of A7r5 cells induced by vasopressin. バーはAVPの適用を示す。 Bar shows the application of the AVP. 効率的なRNAi構築物の選択に関するチミジンキナーゼに基づく系を示す図である。 It is a diagram showing a system based on efficient thymidine kinase for the selection of the RNAi construct. (a)選択戦略のスキーム。 (A) scheme of the selected strategy. 上の図は、選択マーカー遺伝子構築物を示す。 The figure above shows a selection marker gene construct. TK-puroは、チミジンキナーゼとピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼとの融合タンパク質をコードするmRNAを示す。 TK-puro shows mRNA encoding the fusion protein of thymidine kinase and puromycin N- acetyltransferase. GCVは、GCVの毒性誘導体(GCV-ppp)に変換されて、細胞死に至る。 GCV is converted to a toxic derivative of GCV (GCV-ppp), leading to cell death. (b)GSV選択後(左のパネル)および選択を行わない場合(右のパネル)のRNAiライブラリにおける再構成されたshRNA発現構築物の混合物によるRNAi効果。 (B) GSV RNAi effect by a mixture of shRNA expression constructs reconstruction in RNAi library after selection case without (left panel) and selection (right panel). 右のパネルの連続曲線は、親shRNAライブラリのデータを表す。 Continuous curve of the right of the panel, representing the data of the parent shRNA library. 破線の曲線は、shRNA発現構築物の形質導入を行わないGFP蛍光分布を表す。 Dashed curves represent the GFP fluorescence distribution is not performed transduction of shRNA expression construct. (c)GCV選択を行ったまたは行わない個々のRNAiライブラリクローンの分析。 (C) GCV not or performed by selective analysis of individual RNAi library clones. 個々のクローンを、そのRNAi効率に従って四つに分類した;弱い(減少倍率値<1.5)、中等度(1.5〜2.5)、強い(2.5〜4.5)および非常に強い(>4.5)。 Individual clones that RNAi were classified into four according to efficiency; weak (decrease magnification value <1.5), moderate (1.5 to 2.5), strong (2.5 to 4.5) and very strong (> 4.5). 標準化した集団は、クローンの総数に対して標準化したそれぞれの分類におけるクローンの数を表す(GCV選択を行ったおよび行っていないクローンに関してそれぞれ、n=121および101)。 Standardized population, represents the number of clones in each category were normalized to the total number of clones (each with respect clones not having and subjected conducted GCV selection, n = 121 and 101).

siRNA発現構築物 siRNA expression constructs
本発明により、所望の標的DNAからRNAiライブラリーを製造する方法が提供された。 The present invention, a method of manufacturing an RNAi library from a desired target DNA is provided. 本発明で製造されるRNAiライブラリーは、哺乳動物、植物、昆虫、酵母などの遺伝学に応用し得るライブラリーである。 RNAi library produced in the present invention is a library mammalian, plant, insect, applied to genetics such as yeast. 従って、本書において「iRNA」は、哺乳動物細胞などの応用されている短い二重鎖RNA(一般に「siRNA」と呼ばれ、本書において同義でsiRNAの語を用いる)、短いヘアピン型の二重鎖RNA(これを一般に「shRNA」といい、本書においてもこの語を同義で用いる)および線虫、昆虫、植物、酵母などの遺伝子抑制に応用されているsiRNAなどと比べて長い二重鎖RNAを含む意味で用いる。 Thus, "iRNA" in this document, applications has been that short double-stranded RNA, such as mammalian cells (commonly referred to as "siRNA" used the term siRNA interchangeably in this document), short hairpin duplex RNA (which typically referred to as "shRNA", also used this term interchangeably in this document) and nematodes, insects, plants, and compared such a siRNA that has been applied to gene suppression long double-stranded RNA such as yeast used to include the meaning.
本発明のRNAiライブラリー製造方法では、第一に、標的DNAをランダムに断片に切断する工程が含まれる。 The RNAi library production method of the present invention, first, includes the step of cutting the random fragments of target DNA. ここで、標的DNAは、特定の遺伝子、複数の遺伝子、個体に含まれる遺伝子群、ゲノムあるいはcDNAライブラリーなどであってもよい。 Here, the target DNA is a particular gene, multiple genes, genes contained in an individual, may be a genomic or cDNA library. また、ここで「遺伝子」はイントロンを含むゲノム配列であってもよく、また、cDNAなどであってもよい。 Furthermore, where "gene" may be a genomic sequence containing introns, it may also be used as the cDNA. これら遺伝子、ライブラリーなどが由来する種は、上述したようにヒトなどの哺乳動物、植物、昆虫、細菌など制限はない。 Species of these genes, such as the library is derived, a mammal such as a human as discussed above, plants, insects, bacteria, etc. is no limitation.

この第一の工程では、所望の標的DNAを準備し、ランダムに断片化する。 In the first step, to prepare a desired target DNA, fragmented randomly. 断片化する長さは、少なくともRNAiを誘導し得るRNAをコードした長さ、例えば、十数bp以上であればよい。 Length that fragmentation length encoding a RNA capable of inducing at least RNAi, for example, may be at several tens of bp or more. 適切な長さはサイレンシングを誘導したい細胞種により異なる。 Suitable lengths vary by cell type you wish to induce silencing. 例えば、哺乳動物細胞では19〜400bp、好ましく19〜200bp、より好ましくは19〜50bpとすることができる。 For example, in mammalian cells 19~400Bp, preferably 19~200Bp, more preferably, to 19~50Bp. 一方、植物や真菌などでは、例えば、500bp程度の長いiRNAでも遺伝子のサイレンシングを誘導し得る。 On the other hand, such as in plants or fungi, for example, can induce gene silencing even long iRNA of about 500 bp. したがって、本工程で使用し得る酵素は、上記サイレンシングを誘導したい細胞種に応じた長さあるいはそれ以上の断片を生成し得るものであればよく、また切断に用いる酵素の種類も制限はない。 Thus, an enzyme that may be used in this step is not particularly limited as long as it can generate a length or more fragments according to the cell type you wish to induce the silencing, also the type of enzyme used in the cleavage is not limited . 使用し得る酵素の例を挙げれば、DNaseIやショットガンクローニングに使用し得る制限酵素、例えば、CvilJI、HaeIII、RsaI、AluI、HpaIなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 By way of example of an enzyme that may be used, restriction enzymes that may be used to DNaseI and shotgun cloning, e.g., CvilJI, HaeIII, RsaI, AluI, but like HpaI, but is not limited thereto.

第二の工程は、ヘアピン形状のオリゴヌクレオチドからなるアダプター(以下、「ヘアピン型アダプター」という)を用いて、上記DNA断片からヘアピン型DNAを生成する。 The second step, adapter consisting of an oligonucleotide hairpin shape (hereinafter, referred to as "hairpin adapters") is used to generate a hairpin DNA from the DNA fragment. ここで「ヘアピン型アダプター」は、上記二重鎖DNA断片の少なくとも一端をヘアピン形状につなぐリンカーとして機能するとともに、最終的に本方法で得られるiRNA発現構築物から発現されるiRNAのセンスRNA鎖とアンチセンスRNA鎖とをヘアピン形状につなぐRNAリンカーをコードする。 Here "hairpin adapter" is at least one end of the double-stranded DNA fragment functions as a linker connecting the hairpin shape, and finally the sense RNA strand of an iRNA expressed from iRNA expression construct obtainable by the process and the antisense RNA strand encodes an RNA linker that connects to the hairpin shape. ヘアピン型アダプターは、RNA干渉を誘導するための効果的な長さであればよく、例えば、5〜50base、好ましくは6〜20baseとすることができる。 Hairpin adapters may be any effective length for inducing RNA interference, e.g., 5~50Base, preferably be a 6~20Base. ただし、ここに示す長さ以上のヘアピン型アダプターを用いることもできる。 However, it is also possible to use more than the length of the hairpin adapters shown here. 後述するiRNA発現構築物を構築する過程でトリミングして長さを調整することにより、iRNA発現構築物が生成された際に上記適切な長さに調節することもできる。 By adjusting the trimming to length in the course of building the later-described iRNA expression constructs, it can also be adjusted to the appropriate length when iRNA expression construct was generated. また、ヘアピン部分にtRNAをコードさせたり、ハンマーヘッドリボザイムなどと組み合わせることにより、細胞内で長いヘアピンRNA部分がトリミングされて適切な長さのsiRNA等を生成し得るようにデザインすることもできる。 Also, or by encoding the tRNA hairpin portion, combined with a hammer head ribozyme, may be a long hairpin RNA portion in a cell designed so as to generate a siRNA of has been appropriate length trimming or the like. ヘアピン型アダプターの配列は、特に限定はなく、人工的な配列、マイクロRNA由来の配列のいずれであってもよい。 Sequence of the hairpin adapter is not particularly limited, artificial sequences, may be any sequence derived from a micro RNA. また、ヘアピン型アダプターは、DNAで構成することが好ましいが、RNAで構成してもよい。 Further, hairpin adapter, but it is preferably made of DNA, it may be constituted by RNA.

上記ランダムDNA断片にヘアピン型アダプターを付加する場合、DNA断片の末端構造を制御しなければ、一般に、DNA断片の両端にヘアピン型アダプターが結合することになる。 When adding a hairpin adapter to the random DNA fragment, to be controlled a terminal structure of the DNA fragments, generally hairpin adapter will bind to both ends of the DNA fragments. DNA断片の両端にアダプターが結合すると後述するプライマーエクステンションの操作に支障が生じる。 Trouble occurs in the operation of the primer extension to be described later adapter coupled across the DNA fragment. そのため、二重鎖DNAの一端のみにヘアピン型アダプターが結合したヘアピン型DNAを形成させるためには、DNA断片の両端にヘアピン型アダプターが結合し環状化したDNA断片の二重鎖部分を切断して、二つのヘアピン型DNAを生成することが考えられる。 Therefore, in order to form a double-stranded DNA only hairpin hairpin adapter was attached to the DNA one end of the cut the hairpin adapter is coupled across the duplex portion of the circularized DNA fragment of DNA fragments Te, it is conceivable to generate two hairpin DNA. こうした環状化したDNA断片からへアピン型DNAを生成するためには、DNA断片に由来する二重鎖領域をランダムに切断する制限酵素を用いて切断することが一例として挙げられる。 To generate a hairpin-type DNA to from such circularized DNA fragments to be cleaved with restriction enzymes that cut randomly duplex region derived from the DNA fragment is listed as one example. しかしヘアピン型DNAの生成効率およびヘアピン型DNAの長さの制御を行うためには、ヘアピン型アダプターの内部にアウトサイドカッターの制限酵素認識サイトを備え、二重鎖DNA領域をこの制限酵素により切断する手法を用いることが好ましい。 But in order to control the generation efficiency and the length of the hairpin DNA hairpin DNA has a restriction enzyme recognition site of the outside cutter inside the hairpin adapters, cleaved with the restriction enzyme double stranded DNA region it is preferable to use a method of. ヘアピン型DNAの二重鎖DNA領域の長さの制御に関して、哺乳動物では19〜21bp程度の二重鎖RNAが効果的なRNA干渉を誘導し得るとされていることから、哺乳動物に適用するRNAiライブラリーの調製を行う場合にはアウトサイドカッターの制限酵素は、認識サイトから少なくとも19bp以上離れた部位を切断する酵素であることが好ましい。 With respect to the length control of the double-stranded DNA regions of the hairpin DNA, since the double-stranded RNA of about 19~21bp in mammals are to be capable of inducing an effective RNA interference, it is applied to a mammal restriction enzymes of the outside cutter when performing a preparation of RNAi library, it is preferable from the recognition site is an enzyme that cleaves a site distant least 19bp above. このような酵素としては、一例を示せば、MmeIが挙げられる。 Such enzymes, One example include Mmel. 例えば、MmeIは認識サイトから20または21塩基離れた部位の二本鎖を切断する。 For example, Mmel cuts duplexes sites distant 20 or 21 bases from the recognition site. したがって、ヘアピン型アダプターの端部にMmeIの認識サイトを備えることにより、このヘアピン型アダプターが接続しているDNA断片は、MmeI消化により、20〜21塩基のDNA断片の一端にヘアピン型アダプターが接続されたヘアピン型DNAが生成される。 Therefore, by the end of the hairpin adapter comprises a recognition site for MmeI, DNA fragments The hairpin adapter is connected, the MmeI digestion, hairpin adapter connected to one end of a DNA fragment of 20 to 21 bases hairpin type DNA is generated. したがって、MmeIは、哺乳動物細胞内で標的遺伝子をサイレンシングさせる効果的な長さのiRNAをコードしたヘアピン型DNAを生成する好ましい制限酵素といえる。 Therefore, Mmel is be preferred restriction enzyme that produces and encodes an iRNA effective length to silence a target gene in mammalian cells hairpin DNA. MmeI以外にもMmeIと同様に認識サイトから20〜21塩基離れた位置を切断する酵素は本工程において有効である。 Enzyme that cleaves 20-21 bases away from the same recognizable sites and MmeI besides MmeI is effective in this process. また、20〜21塩基以上はなれた部位を切断する制限酵素の場合には、アダプターの長さやアダプター内の制限酵素認識サイトの配置を調整することにより、iRNAをコードしたDNA断片の長さを所望に調整し得る。 In the case of restriction enzymes that cleave sites accustomed 20-21 bases or more, by adjusting the placement of the restriction enzyme recognition site in the adapter length and adapter, the desired length of the cord DNA fragment iRNA It can be adjusted to.

上記において長いへアピン型アダプターを用いた場合にはiRNA発現構築物生成過程のいずれかの過程でトリミングすることを説明したが、このトリミングの手法は、アダプターがDNAベースであるか、RNAベースであるかにより異なる。 When using a hairpin-type adapter to long in the above has been described to be trimmed in any of the processes of the iRNA expression construct generation process, the method of this trimming, or the adapter is DNA-based, is RNA-based or by different. アダプターがDNAベースの場合には、アダプター内に任意のトリミング用の制限酵素認識サイトや切断サイトを設け、この制限酵素で消化、その後、ライゲーションにより再接続することにより、アダプターの長さを調整することができる。 If the adapter is DNA-based, providing a restriction enzyme recognition sites and cleavage sites for any trimming in the adapter, digested with the restriction enzyme, followed by re-connected by ligation, to adjust the length of the adapter be able to. このトリミング用の制限酵素は特に限定はなく、アダプターの長さを短くし得る制限酵素であればよい。 The restriction enzyme for trimming is not particularly restricted as long as it is a restriction enzyme capable of shortening the length of the adapter. 後述する実施例に示すように、認識サイトから双方向に切断を行うBcgIを制限酵素の一例としてあげることができる。 As shown in the examples below, the BcgI performing cutting from the recognition site in both directions can be mentioned as an example of a restriction enzyme. アダプター内にBcgIの認識サイトを備えることにより、一つの制限酵素BcgIでアダプター内を二箇所切断することができるため、簡便にトリミングを行うことができる。 By providing a recognition site for BcgI in adapter, since the inside of the adapter in one restriction enzyme BcgI can cut two points, it is possible to easily trimming. また二つの制限酵素を組合わせて、アダプターの長さを調節することももちろん可能である。 Also by combining two restriction enzymes, it is of course possible to adjust the length of the adapter. RNAベースのアダプターを用いた場合には、後述するプライマーエクステンションによりアダプターの領域はRNA/DNAハイブリッド二重鎖が形成される。 When using RNA-based adapter region of the adapter by primer extension to be described later RNA / DNA hybrid duplex is formed. こうしたRNA/DNAハイブリッド領域のトリミングは、先ず、RNaseHでRNA鎖を消化し、その後一本鎖DNAを消化する酵素(ssDNA酵素)によりssDNAを消化することにより、トリミングを行うことができる。 Trimming of such RNA / DNA hybrid region, first, to digest the RNA strand with RNase H, followed by digesting ssDNA by enzyme that digests single-stranded DNA (ssDNA enzymes), it is possible to perform trimming.

第三の工程は、上記DNA断片にヘアピン型アダプターが付加されて形成されたヘアピン型DNAを用いてiRNA発現構築物を生成する。 The third step generates a iRNA expression construct using hairpin DNA that hairpin adapter was formed is added to the DNA fragment. 上記ヘアピン型DNAの二重鎖をStrand−displacing活性を有するポリメラーゼを用いてプライマーエクステンションさせることにより、相補的な配列がアダプターを挟んでヘッド−テイル結合したiRNA発現構築物が生成される。 By primer extension using a polymerase having duplexes Strand-displacing activity of the hairpin DNA, head across the complementary sequence adapter - iRNA expression constructs tail bonds are produced. ここで、上記工程で生成されたヘアピン型DNAをそのままで、上記プライマーエクステンションによりiRNA発現構築物を生成してもよいが、好ましくはプライマーエクステンションを実行する前に、ヘアピン型DNAのアダプターが接続されていない他端を別のアダプターで保護することが好ましい。 Here, as it is a hairpin DNA produced in the above step, it may generate an iRNA expression construct by the primer extension but, preferably before performing the primer extension adapter hairpin DNA is not connected it is preferable to protect the not the other end in a different adapter. ここで末端保護用に接続するアダプターとしては、後にプライマーエクステンション操作に支障を与えない両末端が断端構造を備えたDNAアダプター(以下、便宜的に「二重鎖断端型アダプター」または「断端型アダプター」という)を用いる。 Wherein the terminal as the protective adapter to be connected to a primer extension operation DNA adapters at both ends not give trouble is equipped with a stump structure (hereinafter later convenience "duplex stump type adapter" or "cross end type adapter "that) is used. このアダプターの配列は特に限定はない。 The sequence of this adapter is not particularly limited. また長さは、アダプターを合成するコスト等を考慮すれば、例えば5〜100base、好ましくは20〜40baseである。 The length, considering the cost or the like to synthesize an adapter, for example 5~100Base, preferably 20~40Base. しかしこれ以上の長さであっても当然にDNA末端の保護が図れることから、実験操作に支障がない範囲であれば基本的に長さの上限に制限はない。 However since the more the protection of course DNA ends even length can be achieved, is not limited to the upper limit of essentially length so long as there is no hindrance to experimental manipulation.

また、断端型アダプターはDNA断片の保護目的で付加されていることから、プライマーエクステンションが完了した後に除去されることが好ましい。 Further, stump type adapter because it is added with a protective purpose of DNA fragments, preferably removed after the primer extension is complete. 後に詳述するプライマーエクステンション後の断端型アダプターの除去を容易にするためには、断端型アダプターに切り出しのための制限酵素サイトあるいは切断サイトが備えられていることが好ましい。 After To facilitate removal of the stump type adapter after primer extension to be described in detail, it is preferable that is provided restriction enzyme sites or cleavage site for cutting out the stump type adapter. この断端型アダプターの切り出しを行い得る制限酵素は特に制限はないが、断端型アダプター配列をプライマーエクステンションにより得られるiRNA発現構築物上に残存させないためには、アウトサイトカッターの制限酵素を用いることが好ましい。 This stump type restriction enzyme capable of performing extraction of the adapter is not particularly limited, in order not to leave the stump type adapter sequence onto iRNA expression construct obtained by primer extension, using the restriction enzyme-out site cutter It is preferred. 例えば、後述する実施例に示すようにBpmIは認識サイトから一定距離の位置を切断する。 For example, BpmI as shown in Examples described later cuts the position of certain distance from the recognition site. したがって、この切断部位をDNA断片と断端型アダプターとの境界となるようにBpmI認識サイトを断端型アダプター内に設計することにより、iRNA発現構築物上から断端型アダプターをほぼ取り除き、残された粘着末端をさらにssDNA消化活性を有する酵素で消化することにより完全にアダプター配列が除去される。 Therefore, by designing the cleavage site BpmI recognition site such that the boundary between the DNA fragment and the stump type adapter stump type in the adapter, substantially removing the stump type adapter from iRNA expression construct on, left complete adapter sequence is removed by digestion with enzymes, further comprising a ssDNA digestion activity sticky ends were. また、この断端型アダプター配列はiRNA発現構築物の両端に付加されているが、この両端を異なる制限酵素で切断することにより、後述するベクターへの接続方向を制御することも可能となる。 Further, the stump type adapter sequence has been added to both ends of the iRNA expression construct, by cutting the ends with different restriction enzymes, it is also possible to control the direction of connection to the vector which will be described later. 後述する実施例で一例を示すように、一方の断端型アダプターをBpmIにより、他方をBbsIにより切除して両端の断端型アダプターを除去するとともにiRNA発現構築物の両末端の構造を制御し得るように断端型アダプターを設計することができる。 As an example in the examples described below, by BpmI one stump type adapter can control the structure of both ends of the iRNA expression construct to remove the stump type adapters at both ends by cutting the other by BbsI it is possible to design a stump type adapter as.

上記断端型アダプターが接続されたヘアピン型DNAは、アダプターの末端にアニーリングし得るプライマーおよびStrand−displacing活性を有するポリメラーゼを用いてプライマーエクステンションが実施される。 The stump type adapter connected hairpin DNA is a primer extension is performed using polymerase with primers and Strand-displacing activity capable of annealing to the end of the adapter. ここで用いるポリメラーゼは、最低限Strand−displacing活性を備えていればよいが、PCR装置を利用してこの操作を実行するためには耐熱性であることが好ましい。 Polymerase used here, it is enough with the minimum Strand-displacing activity, it is preferable to utilize a PCR apparatus for performing this operation is thermostable. Strand−displacing活性を有するポリメラーゼとしては、Klenow Fragment、phi29など、さらに耐熱性を備えたものとしては、Bstポリメラーゼ、Ventポリメラーゼなどが挙げられる。 The polymerase having Strand-displacing activity, such as Klenow Fragment, phi29, as further provided with heat resistance, Bst polymerase, and Vent polymerase and the like. また、エクステンションの条件は、使用するポリメラーゼにより適宜決定できる。 The condition of the extension, can be appropriately determined by polymerase used. 例えば、Bstポリメラーゼを用いた場合の条件については、後述する実施例に一例を示す。 For example, for the conditions in a Bst polymerase, an example in the examples below. また、ヘアピン型アダプターがRNAベースである場合には、上記Strand−displacing活性の他にも、逆転写活性を有する酵素を用いる必要がある。 Further, when the hairpin adapters are RNA based, in addition to the Strand-displacing activity, it is necessary to use an enzyme having a reverse transcription activity.

上記プライマーエクステンションを実施することにより、両末端に断端型アダプター配列を備え、その間に、ヘアピン型アダプターを挟んで標的DNAに由来するDNA断片がヘッド−テイル結合した構造を有する二重鎖DNAが形成される。 By carrying out the above primer extension, provided with a stump type adapter sequence at both ends, in the meantime, DNA fragments derived from the target DNA across the hairpin adapter head - double stranded DNA having a structure tail bound It is formed. この構造から末端の不要な断端型アダプター配列を除去して、iRNA発現構築物を生成する。 Unwanted stump type adapter sequence at the end of the structure is removed to generate an iRNA expression construct. 不要な末端の断端型アダプター配列の除去は、断端型アダプター上に設けられたサイトを認識する制限酵素で切断する。 Removal of the stump type adapter sequence unwanted termini cleaved with the restriction enzyme that recognizes the sites provided on the stump type adapter. 制限酵素により断端型アダプターがトリミングされると、膨大なiRNA発現構築物が生成される。 When stump type adapter is trimmed, vast iRNA expression construct is generated by restriction enzyme.

なお、iRNA発現構築物が生成されるまでの過程、アダプターの付加や制限酵素で消化した毎に、またはiRNA発現構築物が精製された最終の段階で目的とするフラグメントの精製を行って過剰なアダプターや、制限酵素で除去したいフラグメントを反応系から取り除くことが好ましい。 Incidentally, the process until iRNA expression construct is produced, each digested with addition and restriction enzymes the adapter, or iRNA expression construct excess adapters Ya subjected to purification fragment of interest in purified final stage it is preferable to remove the fragments to be removed with a restriction enzyme from the reaction system. 精製の一例としては、電気泳動後のゲルから目的とする長さあるいは予想される長さの断片を抽出する方法あるいはタグなどを利用して目的のフラグメントを精製する方法が挙げられる。 An example of purification include a method of purifying the fragment of interest by using a method or tag to extract the length or expected long fragment that is of interest from the electrophoresis gel after.
上記実施形態では、標的DNAの断片化後、先に、ヘアピン型アダプターを付加し、その後に断端型アダプターを付加する例を示したが、逆の操作も可能である。 In the above embodiment, after fragmentation of the target DNA, previously added to hairpin adapter, but thereafter shows an example of adding stump type adapter, reverse operation is also possible.

上記において生成されたiRNA発現構築物はベクターに接続してRNAiライブラリーが構築される。 iRNA expression construct generated in the above RNAi library ligated to a vector is constructed. ベクターとしては、本ライブラリーを適用したい細胞種によりにより選択し得るが、好ましくは大腸菌等のバクテリアで増幅が可能なプラスミド骨格を備えた発現ベクターを好適に利用し得る。 Vectors, but may be selected by the cell type you want to apply the present library, preferably be suitably used an expression vector having a bacterial in possible amplification plasmid backbone such as E. coli. こうした大腸菌等で増幅が可能なプラスミド骨格としては、例えば、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。 The plasmid backbone capable amplification in these Escherichia coli or the like, for example, M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, and pCR-Script. こうしたバクテリア由来のプラスミドは大量に増幅を行うことができるため、ライブラリーの大量調製が容易であり、また、ヘアピン型アダプター配列のトリミングなどの処理を行う場合には便利である。 Since these bacteria-derived plasmids capable of performing large quantities amplification, it is easy to mass production of the library, also it is useful in the case of performing processing such as trimming hairpin adapter sequences. 上記バクテリア系のプラスミドには必要に応じてAmpなどの薬剤選択マーカー、栄養要求性遺伝子などを担持させることが好ましい。 Drug selection markers such as Amp If necessary, the plasmid of the bacterial system, it is preferable to carry and auxotrophic gene.

また、こうしたプラスミド骨格には実験対象の宿主に応じた発現カセットを備えることが好ましい。 Further, in such the plasmid backbone preferably comprises an expression cassette according to the host of the experimental subject. 発現カセット内のプロモーターは宿主細胞に適したものであればよいが、哺乳動物細胞の場合にはsiRNA/shRNA等の短いRNAを発現させるためにRNAポリメラーゼIII駆動プロモーターを用いることが好ましい。 Promoter of the expression cassette is as long as they are suitable for host cells, in the case of mammalian cells it is preferred to use a RNA polymerase III drive promoters for expressing short RNA of such siRNA / shRNA. RNAポリメラーゼIII駆動プロモーターとしては、マウスU6遺伝子由来のプロモーター、tRNAプロモーター、アデノウイルスVAlプロモーター、5S rRNAプロモーター、7SK RNAプロモーター、7SL RNAプロモーター、H1 RNAプロモーターなどを挙げることができる。 The RNA polymerase III drive promoter include promoters derived from mouse U6 gene, tRNA promoter, adenovirus VAl promoter, 5S rRNA promoter, 7SK RNA promoter, 7SL RNA promoter, and H1 RNA promoter. また、iRNA発現構築物を染色体に組み込み安定的にiRNAを発現させるためには、レトロウイルスの発現カセットを用い、このカセット内にiRNA発現構築物を組み入れることが好ましい。 Further, in order to express a built stably iRNA the iRNA expression construct chromosome, using an expression cassette of retroviruses, it is preferred to incorporate the iRNA expression construct within the cassette. レトロウイルス発現カセットを用いた例としては、後述する実施例に示す。 Examples of using the retroviral expression cassette, shown in the examples below.

iRNAを発現させて動物細胞、植物細胞等でフォワードあるいはリバース遺伝学を実施するために、宿主細胞に応じたベクターを選択してもよい。 Animal cells to express iRNA, to implement the forward or reverse genetics in plant cells, etc., may be selected vector corresponding to the host cell. 例えば、哺乳動物由来の発現ベクター、例えば、pcDNA3 (インビトロゲン社製)や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、pCDM8など、昆虫細胞由来の発現ベクター、例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」(ギブコBRL社製)、pBacPAK8など、植物由来の発現ベクター、例えば、pMH1、pMH2など、動物ウィルス由来の発現ベクター、例えば、pHSV、pMV、pAdexLcwなど、レトロウィルス由来の発現ベクター、例えば、pZIPneoなど、酵母由来の発現ベクター、例えば、「Pichia Expression Kit」(インビトロゲン社製)、pNV11、SP-Q01など、枯草菌由来の発現ベクター、例えば、pPL608、pKTH50などが挙げられる。 For example, expression vectors derived from mammals, for example, pcDNA3 (Invitrogen) and, pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18 (17), p5322), such as pEF, pCDM8, expression vectors derived from insect cells , for example, "Bac-to-BAC baculovairus expression system" (GIBCO BRL), such as pBacPAK8, expression vectors derived from plants, for example, such as pMH1, pMH2, expression vectors derived from animal viruses, eg, pHSV, pMV, pAdexLcw etc. , expression vectors derived from retroviruses, such as, for example, pZIPneo, expression vector derived from yeast, for example, "Pichia expression Kit" (Invitrogen), pNV11, such as SP-Q01, expression vectors derived from Bacillus subtilis, for example, pPL608 , and the like pKTH50. 上記膨大なiRNA発現構築物が個別のベクターに挿入され、RNAiライブラリーが生成される。 The vast iRNA expression construct is inserted into separate vectors, RNAi library is generated.

ここで生成されたRNAiライブラリーは直接、フォワード、リバース遺伝学に利用し得る。 The generated RNAi library directly, may utilize forward, reverse genetics. その他にも、in vitroの転写系を用いて本発明のRNAiライブラリーからオリゴRNAiライブラリーを合成して、このオリゴRNAiライブラリーを生成した後にフォワード、リバース遺伝学の研究に利用してもよい。 Besides, by synthesizing oligo RNAi library from RNAi libraries of the present invention using a transfer system in vitro, forward after generating the oligo RNAi libraries, it may be utilized in the reverse genetics studies .

スクリーニング方法 The screening method
本発明は、上記RNAiライブラリーから標的遺伝子の発現を抑制し得るiRNA発現構築物を保持したクローンを選択するスクリーニング方法を提供する。 The present invention provides a screening method for selecting a clone holding an iRNA expression construct capable of suppressing the expression of a target gene from the RNAi library. 具体的には、本発明のスクリーニング方法は、標的DNAが発現している細胞に上記方法により標的DNAから調整されたRNAiライブラリーを導入する工程と、標的DNAの発現を測定する工程、が含まれる。 Specifically, the screening method of the present invention, includes the steps of introducing an RNAi library target DNA was prepared from the target DNA by the method described above into a cell expressing, measuring the expression of the target DNA, the It is.

標的DNAが発現している細胞へのRNAiライブラリーの導入方法は、RNAiライブラリーを構築した際に使用したベクターにより適宜選択し得る。 Introduction of the RNAi library to cells targeted DNA is expressed may be appropriately selected according to the vector used in building the RNAi library. 例えば、感染能力を有するウイルスベクターを用いた場合には、ウイルスの感染力によりRNAiライブラリーを細胞に導入する。 For example, when using a viral vector having the infectivity introduces an RNAi library into a cell by viral infectivity. また、プラスミドベクターの場合には、カチオニックリボソームDOTAP(ベーリンガーマンハイム社製)を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ジーンガン法、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法などから適宜選択して用いることができる。 In the case of a plasmid vector, a method using cationic liposome DOTAP (Boehringer Mannheim), electroporation method, lipofection method, a gene gun method, a calcium phosphate method, be appropriately selected from such DEAE dextran method it can.

標的DNAの発現測定は、標的DNAの抗体を用いて蛋白質の発現量に基づいて測定してもよく、また、特定の遺伝子の活性が同定されている場合には、その活性に基づいて測定してもよい。 Expression measurements of target DNA, using the antibodies of the target DNA may be measured based on the expression amount of the protein, and when the activity of specific genes have been identified, measured on the basis of its activity it may be. 例えば、当該標的DNAの活性として、下流の遺伝子がレギュレートされることがわかっている場合には、この下流の遺伝子の発現を測定することにより標的DNAの発現を間接的に測定してもよい。 For example, the activity of the target DNA, in the case where the downstream gene is known to be regulated can be measured indirectly the expression of the target DNA by measuring the expression of the downstream gene .

また、標的DNAの機能が未知であったり、活性測定が困難である場合には、標的DNAにレポーター遺伝子を接続した融合遺伝子を保持させた形質転換体を調整し、これを用いてスクリーニングを行うことが好ましい。 Also, or a unknown function of the target DNA, if the activity measurement is difficult to adjust the transformant obtained by holding the fusion gene was connected to a reporter gene into the target DNA, the screening using this it is preferable.

例えば、レポーターとしては、蛍光蛋白質(ルシフェラーゼ、GFP、CFP、YFP、RFPなど)、アミノグリコシドトランスフェラーゼ(APH)、チミジンキナーゼ(TK)、ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)などの酵素を用いることができる。 For example, a reporter, a fluorescent protein (luciferase, GFP, CFP, YFP, RFP, etc.), aminoglycoside transferase (APH), thymidine kinase (TK), can be an enzyme, such as dihydrofolate reductase (dhfr). こうしたレポータをコードした遺伝子に標的DNAを接続することにより、細胞内では融合遺伝子のmRNAが発現される。 These reporter code genes by connecting the target DNA, in cells expressed the mRNA of the fusion gene. RNAiライブラリーから発現された標的DNAに対するiRNAは、この融合遺伝子の発現を抑制し、レポーター活性が低下することになる。 iRNA to target DNA expressed from RNAi library, inhibited the expression of the fusion gene, reporter activity is lowered. したがって、このような標的DNAがレポーター遺伝子と融合された融合遺伝子を用いることにより、レポータ活性を指標にRNAiライブラリーの各クローンの標的DNAに対するサイレンシング活性を簡便に測定することが可能となる。 Therefore, by such a target DNA using a fusion gene fused to a reporter gene, it is possible to easily measure the silencing activity reporter activity as an index to the target DNA of each clone of RNAi library. 例えば、上記蛍光蛋白質などのレポータ遺伝子に用いた場合には、蛍光蛋白質の発現の減少に基づいて、RNAiライブラリー中の各クローンのサイレンシング活性を測定することができる。 For example, when used in reporter gene, such as the fluorescent protein, based on reduced expression of the fluorescent protein, it can be measured silencing activity of each clone in RNAi library. 一方、TKなどのネガティブ選択マーカーを用いた場合には、RNAiライブラリー中のサイレンシング活性を有しないクローンでは、TKの活性を抑制できずにガンシクロビルの添加により細胞は死滅し、一方、サイレンシング活性を有するクローンでは、TKの活性が抑制されてガンシクロビル添加によっても細胞は生存し得ることになる。 On the other hand, when a negative selectable marker, such as TK, in no clones silencing activity in RNAi library, the cells were killed by the addition of ganciclovir can not be suppressed the activity of TK, whereas, silencing in the clones with activity, cell by activity is suppressed ganciclovir addition of TK would be viable. このようにネガティブ選択マーカーをレポーターとして用いた場合には、サイレンシング活性を有するクローンが導入された細胞のみが選択的に生き残るため、効率よくサイレンシング活性を有するiRNA発現構築物を保持したクローンが得られる。 When used in this manner the negative selection marker as a reporter, since only cells clone has been introduced having a silencing activity survive selective, clones that holds the iRNA expression construct with efficient silencing activity obtained It is. ここで選択された細胞より、iRNA発現構築物を保持したベクターを回収することにより、標的DNA中のいなかる領域をiRNAの標的とすることが好ましいか同定することが可能となる。 From a cell selected here, by recovering the vector holding the iRNA expression construct, it is possible it is preferable either to identify which targeting of iRNA the Inakaru region in the target DNA.

キット 本発明は、上記RNAiライブラリーの酵素的構築方法を実施するためのRNAiライブラリーキットを提供する。 Kits The invention provides a RNAi library kit for carrying out the enzymatic construction method of the RNAi library. キットには、上述したヘアピン型アダプター、断端型アダプター、プライマーエクステンション用のプライマーおよび酵素、必要に応じてトリミングに使用する酵素、ランダムDNA断片を精製するための酵素などを含めることができる。 The kit can include the above-mentioned hairpin adapters, stump type adapters, primers and enzymes for primer extension, the enzyme used for trimming as needed, such as enzymes for purifying random DNA fragments. また、iRNA発現構築物を挿入するためのベクターなども含めることができる。 Further, it may also be included such as a vector for inserting an iRNA expression construct. さらに上述したRNAiライブラリーの酵素的構築方法を実施するためのプロトコールを添付してもよい。 Further enzymatic construction method of the above-described RNAi library may be accompanied by protocols for carrying out the. このように本発明のライブラリー構築方法を実施するための材料をキット化することにより、より一層簡便かつ身近に本発明のRNAiライブラリー構築方法を実施することができる。 By thus kit of materials for carrying out the library construction process of the present invention, it is possible to carry out RNAi library construction method further easily and familiar present invention.

結果 result
RNAiライブラリーの作製 Production of RNAi library
EPRILは、対象となるcDNAsからshRNA発現ベクターライブラリーを作製するために数段階の酵素処理を含む(図1a)。 EPRIL comprises an enzyme treatment of several steps in order to produce shRNA expression vector library from cDNAs of interest (Fig. 1a). 第一に、二本鎖DNAsをDNaseIによってほぼ無作為に断片化する(Anderson, S. Nucleic Acids Res. 9, 3015-3027 (1981))。 First, it fragmented into almost randomly by DNaseI the double-stranded DNAs (Anderson, S. Nucleic Acids Res. 9, 3015-3027 (1981)). 次に、MmeIの認識配列を含むヘアピン形状のアダプターを断片にライゲーションする。 Next, ligated to fragment an adapter hairpin shape comprising a recognition sequence of Mmel. MmeIは、認識配列からそれぞれ、20および18塩基離れた部位で上部および下部の鎖を切断することが報告されているが(Boyd, AC et al. Nucleic Acids Res. 14, 5255-5274 (1986))、本発明者らは、MmeIが塩基21および19位でもDNAを切断することを発見した。 MmeI, respectively from the recognition sequence have been reported to cut the top and bottom strands at sites distant 20 and 18 bases (Boyd, AC et al. Nucleic Acids Res. 14, 5255-5274 (1986) ), the present inventors have discovered that cleave DNA even MmeI bases 21 and 19 positions. したがって、MmeI消化は、標的cDNAsから20または21塩基の長さの配列を有する短い3'-突出DNA断片を生じる。 Therefore, Mmel digestion results in a short 3'-protruding DNA fragment having a sequence length of 20 or 21 bases from the target cDNAs. ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)は、MmeI消化DNAを-40 bpのバンドとして示す(図1b)。 Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) shows a MmeI digestion DNA as a band of -40 bp (Figure 1b). MmeI消化後、生成された断片に第二のアダプターをライゲーションする。 After MmeI digestion, ligation of a second adapter to the generated fragment. このアダプターは、MmeI消化物の3'突出末端が塞がれるように、一方の鎖の3'末端で二つの縮重塩基を有する。 This adapter 'as protruding ends are closed, the third one strand 3' of the MmeI digest with two degenerate bases at the ends. 第二のアダプターをライゲーションした後、プライマー伸長反応を行って、一本鎖ヘアピンDNAを、ループ配列を介して結合された逆方向反復配列を備えた二本鎖DNAに変換する(図1)。 After ligating the second adapter, performing a primer extension reaction, to convert the single-stranded hairpin DNA, double stranded DNA having an inverted repeat sequence which is coupled through a loop sequence (Figure 1). プライマー伸長産物を適当な制限エンドヌクレアーゼによって消化して、逆方向反復配列の外側の余分な配列を除去して、下記のプラスミドベクターに挿入する。 The primer extension products were digested with appropriate restriction endonucleases, to remove excess sequences outside the inverted repeat sequences, inserted into a plasmid vector below. 逆方向反復配列が隣接する長いループ内の余分な配列を適当な制限エンドヌクレアーゼによって除去した後、再環状化を行う。 After inverted repeat sequences were removed by appropriate restriction endonuclease extra sequences in long loop adjacent, to re-circularization.
ライブラリー構築とshRNA発現のために、本発明者らは、マウスU6遺伝子からRNAポリメラーゼIII駆動プロモーターを含むレトロウイルスベクターを有するプラスミドを用いた。 For library construction and shRNA expression, we used a plasmid from the mouse U6 gene having a retroviral vector containing RNA polymerase III drive promoters. shRNA発現カセットを導入するためにレトロウイルスベクターを用いることによって、安定なRNAi効果が確保される(Paddison, PJ & Hannon, GJ Cancer Cell 2, 17-23 (2002))。 By using retroviral vectors to introduce shRNA expression cassettes, stable RNAi effect is ensured (Paddison, PJ & Hannon, GJ Cancer Cell 2, 17-23 (2002)).

GFPをコードするcDNAからのRNAiライブラリー RNAi library from the cDNA encoding GFP
EPRILを評価するために、本発明者らは、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするcDNAからshRNA発現ライブラリーを作製した。 To assess EPRIL, the present inventors have produced an shRNA expression library from cDNA encoding the green fluorescent protein (GFP). ライブラリーからの個々のクローンの配列分析により、配列データを有するクローン343個中290個が逆方向反復配列を有することが示された。 Sequence analysis of individual clones from the library, 290 pieces clone 343 or in having the sequence data has been shown to have an inverted repeat sequence. これらのクローン39個は不完全な逆方向反復を有していたが、クローン251個はGFP配列に由来する19塩基またはそれ以上の長さの塩基の逆方向反復配列を有するGFPサイレンシングのための候補shRNA発現構築物であった。 39 These clones had a imperfect inverted repeat, 251 clones for GFP silencing having an inverted repeat sequence of the bases of 19 bases or more in length derived from the GFP sequence It was a candidate shRNA expression constructs. ほとんどのクローンの逆方向反復配列の長さは20または21ヌクレオチドのいずれかであり、クローン251個中18個(7.2%)、139個(55.4%)、および94個(37.5%)はそれぞれ、19、20、および21塩基の長さであった。 And almost any reverse length of repeat sequences of 20 or 21 nucleotides in clone 251 in 18 clones (7.2%), 139 (55.4%), and 94 pieces (37.5%), respectively, 19, 20, and 21 bases were long. 第一のアダプターはDNaseI消化断片の両端に結合させることができるため、二つの異なる方向を有するshRNAを得ることができるはずである。 The first adapter because it can be attached to both ends of DNaseI digestion fragments, it should be possible to obtain a shRNA having two different directions. mRNA配列と相補的であるガイド配列は、shRNAの5'または3'側にほぼ同じ頻度で存在する(54.6%対45.4%、p>0.1)。 Guide sequence that is complementary to a mRNA sequence is present in approximately equal number of times in the 5 'or 3' side of the shRNA (54.6% vs. 45.4%, p> 0.1). 標的配列の分析から、様々なshRNA発現構築物が標的遺伝子の様々な部分から生成されたことが示された;完全な720 bpのGFPコード配列の全域に対して、独立したクローン251個から非重複shRNA発現構築物157個によって全体の96.3%がカバーされていた。 Analysis of the target sequence, a variety of shRNA expression constructs has been shown to have been generated from different parts of the target gene; against the entire region of the GFP coding sequence of the complete 720 bp, nonoverlapping from independent clones 251 96.3% of the total by shRNA expression construct 157 were covered. このように、EPRILによって、対象となるcDNAからのshRNA発現構築物の膨大なアレイのハイスループット産生が可能となる。 Thus, by EPRIL, high-throughput production of vast arrays of shRNA expression constructs from a cDNA of interest is possible.

shRNA発現構築物を有するレトロウイルスを、96ウェルプレートフォーマットで個々のプラスミドから産生し、これによって本発明者らは、独立したウイルスの膨大なアレイを同時に得ることができる。 The retrovirus has a shRNA expression construct, produced from individual plasmids in a 96-well plate format, which by the inventors can obtain a vast array of independent virus simultaneously. GFPを発現するJurkat T細胞にも同じフォーマットでウイルスを感染させた。 In Jurkat T cells expressing GFP were infected with virus in the same format. 感染細胞のGFP発現レベルは、フローサイトメトリーによって決定して、RNAi効率を定量した。 GFP expression level of infected cells were determined by flow cytometry to quantitate the RNAi efficiency. shRNA発現構築物に応じてRNAi効率にかなりの変動を認めた。 It showed a considerable variation in RNAi efficiency in accordance with the shRNA expression constructs. このように、本発明者らは、それぞれ重複していない構築物262個の測定結果からRNAi効率の分布を分析した(図2a)。 Thus, the present inventors have analyzed the distribution of RNAi efficiency from each non-overlapping construct 262 amino measurements (Figure 2a). 構築物約56%が低いRNAi活性であった(1.5倍未満の減少)。 Construction about 56% thereof were low RNAi activity (reduction of less than 1.5). 所定の減少倍数(x)より大きいRNAi効率を有するshRNA発現構築物を発見する確率を推定するために、本発明者らは、その減少倍数がxを超えるshRNA発現構築物の分画毎の量をxに対してプロットした。 To estimate the probability of finding the shRNA expression constructs with predetermined fold reduction (x) greater than RNAi efficiency, the present inventors found that the decrease multiples the amount of each fraction of the shRNA expression constructs exceeding x x It was plotted against. おおよそ、30%が2倍を超えるRNAi効率の減少を示したのに対し、8倍を超える減少を有したのはごくわずかな割合であった。 Approximately, whereas 30% showed a reduction in RNAi efficiency more than twice, for had a loss of more than 8-fold it was negligible proportions. 全体的な確率は、〜-1.7べき法則スケーリングで減少倍数と比例し、このことは5倍の減少効率を有するRNAi構築物を発見したい場合、例えば、15(5 1.7 )倍多い候補構築物をスクリーニングしなければならないことを意味する。 The overall probability is proportional to the fold reduction in ~-1.7 power law scaling, if this is to be found an RNAi construct having a 5-fold reduction efficiency, for example, to screen 15 (5 1.7) times more candidate constructs It means that there must be.

次に、本発明者らは、RNAi効率の領域依存性を分析した。 Next, we analyzed the area dependence of RNAi efficiency. 効率的および非効率的shRNA発現構築物の双方が領域全体に分布した(図2c)。 Both efficient and inefficient shRNA expression constructs were distributed throughout the region (Fig. 2c). 定量的分析の場合、本発明者らは、等しく亜分割した領域10個に従ってデータを分類して(図2d)、分散分析を行った。 For quantitative analysis, the present inventors classify data according equally nitrous divided regions 10 (FIG. 2d), was subjected to analysis of variance. 本発明者らは、有意な領域依存性を認めなかった(クラスカル・ウォリス検定;p<0.4)。 The present inventors have no significant region dependent (Kruskal-Wallis test; p <0.4). 特に結果は、その領域がRNAiにとって不良な基質であるというこれまでの推定にもかかわらず(Dykxhoorn, DM et al. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 457-467 (2003))、開始コドンから72 bp内の領域でさえも良好な標的として役立ちうることを示した。 In particular the results, the region despite the estimated far that it is poor substrate for RNAi (Dykxhoorn, DM et al. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 457-467 (2003)), starting even in a region from the codon within 72 bp showed that can serve as good targets. shRNA発現構築物の方向に関して、3'側に存在するガイド配列はより有効である、という全体的な傾向を認めた。 With respect to the direction of shRNA expression constructs guide sequences present in the 3 'side is more effective, it showed an overall tendency.

RNAi効率の変動パターンは、調べた代表的な構築物10個が、HEK293またはHeLa細胞において類似の効率プロフィールを示したことから(データは示していない)、細胞タイプ非依存的である。 Variation pattern of RNAi efficiency, representative construct 10 having examined, because it showed the efficiency profile similar in HEK293 or HeLa cells (data not shown), a cell type-independent manner. プラスミドまたはPCR増幅した最小のshRNA発現カセットの直接トランスフェクションにより、レトロウイルス形質導入と類似のプロフィールが得られ(図3a)、ウイルス力価の差の影響は除外された。 Direct transfection of minimum shRNA expression cassette plasmid or PCR amplification, retroviral transduction similar profile was obtained (Figure 3a), the influence of the difference in virus titer were excluded. さらに、インビトロで転写されたshRNAの直接トランスフェクションによるRNAiプロフィールは、DNAに基づく発現のプロフィールと十分に相関した(図3b)。 Furthermore, RNAi profile by direct transfection of the transcribed shRNA in vitro was correlated well and profile of expression based on DNA (Figure 3b). インビトロで転写したshRNAsをダイサーによって予め消化した場合でも、類似の結果を得た。 The shRNAs were transcribed in vitro even if the pre-digested by Dicer to yield similar results. これらの結果は、RNAi効率プロフィールを決定する要因が転写およびダイサー-プロセシング段階の下流に存在することを示している。 These results are factors that determine the RNAi efficiency profile transcription and dicer - indicate the presence in the downstream processing steps.

1型IP 3受容体をコードするcDNAからのRNAiライブラリー 本発明者らは、上記の戦略が内因性の遺伝子に応用可能であるか否かを調べた。 Type 1 IP 3 RNAi library present inventors from cDNA encoding the receptor was examined whether or not the strategy is applicable to the endogenous gene. 本発明者らは、標的として1型イノシトール1,4,5-三リン酸受容体(Mignery, GA et al. J. Biol. Chem. 265, 12679-12685 (1990))(IP 3 R)をコードするDNAを用いた。 The present inventors have found that type 1 inositol 1,4,5-triphosphate receptor as target (Mignery, GA et al. J. Biol. Chem. 265, 12679-12685 (1990)) (IP 3 R) using a code to DNA. GFPの場合と同様に、本発明者らはIP 3 Rに関して様々なshRNA発現構築物を得た。 As in the case of GFP, we have obtained various shRNA expression constructs regarding IP 3 R. 配列データを有するクローン256個の中で、214個はshRNA発現構築物を有することが判明し、これには異なる標的位置を有し互いに重複していない構築物199個が含まれた。 Among 256 clones with sequence data, the 214 pieces were found to have a shRNA expression constructs, which included construct 199 that do not overlap each other have different target location. 有効なshRNA発現構築物を迅速にスクリーニングするために、本発明者らは、GFPおよびIP 3 Rのヘッド−テイル結合mRNAsを発現するレポーター構築物を保持したJurkat T細胞を作製した。 To rapidly screen effective shRNA expression constructs, head GFP and IP 3 R - was produced Jurkat T cells holding the reporter constructs expressing tail bond mRNAs. shRNA発現構築物による標的mRNAの分解は、GFP蛍光の減少をモニターすることによって評価することができる(Kumar, R et al. Genome Res. 13, 2333-2340 (2003))。 Degradation of the target mRNA by shRNA expression constructs can be assessed by monitoring the decrease in GFP fluorescence (Kumar, R et al. Genome Res. 13, 2333-2340 (2003)). IP 3 Rを標的とするshRNA発現構築物も同様にRNAi効率を変化させた(図4a)。 ShRNA expression constructs an IP 3 R targeting also changing the RNAi efficiency as well (Figure 4a). 本発明者らは、最も有効な構築物の中で二つのshRNA発現構築物、SI2A5およびSI3G6を選択して、これらのクローンが血管平滑筋細胞株A7r5において内因性に発現されたIP 3 Rに関して有効なRNAiを誘導し得るか否かを調べた(De Smedt, H. et al. J. Biol. Chem. 269, 21691-21698 (1994))。 The present inventors have found that two shRNA expression constructs in the most effective construct, select SI2A5 and SI3G6, these clones are valid with respect to IP 3 R expressed endogenously in vascular smooth muscle cell line A7r5 It investigated whether can induce RNAi (De Smedt, H. et al. J. Biol. Chem. 269, 21691-21698 (1994)). ウェスタンブロット分析によって、IP 3 R発現レベルが減少したことを確認した(図4b)。 Western blot analysis confirmed that the IP 3 R expression levels were decreased (Fig. 4b). 機能喪失はまた、バソプレッシン誘発細胞内Ca 2+反応を測定することによっても確認した(図4c)。 Loss of function was also confirmed by measuring the vasopressin-induced intracellular Ca 2+ response (Fig. 4c). これらの結果は、EPRILが内因性の遺伝子を標的とする有効なshRNA発現構築物を検索するために有用であることを示している。 These results indicate that useful to find valid shRNA expression constructs EPRIL to the endogenous gene targeted.

有効なshRNA発現構築物の細胞内選択 ハイスループットスクリーニングを促進するために、本発明者らは、効率的なshRNA発現構築物の正の選択を行うために特殊な選択マーカー遺伝子に基づく新規細胞内選択スキームを開発した(図5a)。 To facilitate intracellular selected high-throughput screening of active shRNA expression constructs, the present inventors have found that efficient shRNA expression construct positive selection New intracellular selection scheme based on a special selection marker gene in order to perform the It was developed (Fig. 5a). マーカー遺伝子は、二つのヘッド−テイル結合部分からなる;第一の部分は、チミジンキナーゼとピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼからなる融合タンパク質をコードして(Chen, YT & Bradley, A. Genesis 28, 31-35 (2000))、後者は標的mRNAをコードする。 Marker gene, two heads - consisting tail coupling portion; the first portion encodes a fusion protein consisting of thymidine kinase and puromycin N- acetyltransferase (Chen, YT & Bradley, A. Genesis 28, 31 -35 (2000)), the latter encodes a target mRNA. 通常、ガンシクロビル(GCV)を適用すると、チミジンキナーゼの作用による(Chen, YT & Bradley, A. Genesis 28, 31-35 (2000))GCVの毒性誘導体の細胞内蓄積によって、このマーカー遺伝子を有する細胞が殺される。 Normally, cells having Applying ganciclovir (GCV), by the action of thymidine kinase (Chen, YT & Bradley, A. Genesis 28, 31-35 (2000)) by intracellular accumulation of toxic derivatives of GCV, the marker gene It is killed. 標的遺伝子に関して有効なRNAi活性を有するshRNAを細胞に形質導入すると、細胞は、チミジンキナーゼ発現がサイレンシングされることによって細胞死を免れることになる。 When the shRNA having effective RNAi activity with respect to the target gene transduced into cells, the cells will be spared cell death by thymidine kinase expression is silenced. 本発明者らは、標的としてGFPを用いてそのようなマーカー遺伝子を構築して、これをJurkat T細胞に導入して、ピューロマイシン選択を行った。 The present inventors, to build such a marker gene using GFP as a target, which is then introduced into the Jurkat T cells were puromycin selection. 次に、本発明者らは、GFPを標的とするshRNAiライブラリーからの混合物としてshRNA-発現レトロウイルスを作製し、マーカー遺伝子発現細胞にこれらのレトロウイルスを感染させた。 Next, the GFP to produce shRNA- expression retrovirus as a mixture from shRNAi library that targets were infected with these retroviruses in cells expressing the marker gene. 感染細胞にGCVによる48時間の処置を行い、GCV耐性細胞を培養した。 It takes action 48 hours by GCV infected cells were cultured GCV resistant cells. 本発明者らは、生存細胞からのPCR増幅によってshRNA発現構築物を回収して、それらをレトロウイルス発現ベクターに再構築して、選択されたライブラリーを得た。 The present inventors have recovered the shRNA expression construct by PCR amplification from viable cells, they rebuild the retroviral expression vector, resulting in a library that is selected. GCV選択が実際に有効なshRNA発現構築物を濃縮したか否かを調べるために、GFPを発現するJurkat T細胞に、再構築されたライブラリーから調製したウイルス混合物を感染させた。 To investigate whether GCV selection was concentrated actually effective shRNA expression construct into Jurkat T cells expressing GFP, they were infected with the virus mixture prepared from libraries reconstructed. GCV-選択ライブラリーからのレトロウイルスを形質導入した細胞におけるGFP発現は、無処置または親ライブラリーからのレトロウイルスを形質導入した細胞での発現より大きく減弱されたことがフローサイトメトリーの結果によって示された。 GFP expression GCV- in cells transduced with retrovirus from selected libraries, the results retroviruses that are larger attenuated than expression in transduced cells in flow cytometry from untreated or parent library It was shown. このことは、GCV選択によってより有効なshRNA発現構築物が濃縮されたことを示している(図5b)。 This indicates that the more effective shRNA expression constructs were concentrated by GCV selection (Figure 5b). GCV選択による有効なshRNA発現構築物の濃縮の成功はまた、個々のクローンの分析によっても確認した。 Success concentration effective shRNA expression construct according GCV selection was also confirmed by analysis of individual clones. 高い効率を有するshRNA発現構築物集団の顕著な増加をGCV選択ライブラリーにおいて認めた(図5c)。 A marked increase in shRNA expression construct populations with high efficiency observed in GCV selected library (Figure 5c). これらの結果は、ライブラリーから有効なshRNA発現構築物を得るために、新規細胞内選択スキームが有用であることを示している。 These results, in order to obtain effective shRNA expression constructs from the library, new intracellular selection scheme is shown to be useful.

cDNAライブラリー由来RNAiライブラリー cDNA library derived from the RNAi library
EPRILは、単一のcDNA起源よりむしろcDNAライブラリーのようなcDNAsの複雑な混合物からshRNAiライブラリーを構築する機会を提供する。 EPRIL provides an opportunity to build a shRNAi library from a complex mixture of cDNAs, such as cDNA libraries, rather than a single cDNA origin. そのようなshRNAiライブラリーは、特定の細胞機能に関与する遺伝子を包括的に検索するために極めて貴重となるはずである。 Such shRNAi libraries should be extremely valuable for a comprehensive search for genes involved in a particular cellular functions. このため、本発明者らはそのような目的のために本技術を実現可能であるか否かを調べた。 Therefore, we examined whether it can implement the present technology for such purpose. マウス骨髄前駆細胞FL5.12細胞において発現されたmRNAから調製されたcDNAライブラリーにEPRILを行って、shRNAiライブラリーを作製した。 Performing EPRIL the cDNA library prepared from mRNA expressed in mouse bone marrow progenitor cells FL5.12 cells to generate shRNAi library. 無作為に選択したクローンをシークエンシングしたところ、得られた配列240個中215個が、逆方向反復配列を含むことが判明した(表1)。 Randomly place the selected clones were sequenced, 240 in 215 amino sequence was obtained and found to contain an inverted repeat sequence (Table 1). これらの中で、クローン35個からの逆方向反復配列は、おそらくmRNAsのポリAテールに由来するポリAまたはTの10塩基を超える鎖からなる配列を含んだ。 Among these, inverted repeats of 35 amino clones contained a possibly poly A tail consisting of a chain of more than 10 base poly A or T derived from the sequence of mRNAs. したがって、残りのクローン180個にBLAST検索を行った。 Therefore, I went the BLAST search to 180 the rest of the clones. クローン165個の配列がcDNA配列および/またはESTsにマッチした(表2)。 Clone 165 sequence matches a cDNA sequence and / or ESTs (Table 2). 本発明者らは、ユニジーンクラスターに従って、遺伝子転写物に由来するこれらのクローンを分類し(Build 126)、クローン165個中146個が、ユニジーンクラスターの少なくとも一つに属することを発見した。 The present inventors have found that according to Unigene cluster, classifies these clones derived from the gene transcript (Build 126), 165 amino clones 146 amino is found to belong to at least one of Unigene cluster. これらの中で、いくつかのクローンは、同じクラスターに対応して、これらのクローンが同じ遺伝子に由来することを示唆した。 Among these, some clones correspond to the same cluster, these clones suggesting that derived from the same gene. これらには、熱ショックタンパク質8、ユビキチンBおよびリボソームタンパク質L41をコードする遺伝子が含まれ、その全てが多くの臓器において高度に発現されている。 These include heat shock proteins 8, include genes encoding ubiquitin B and ribosomal protein L41, is highly expressed in all its many organs. ユニジーンクラスターの大きさは、相対的発現レベルのほぼ推定値であることから、クラスターの大きさを同じ遺伝子の出現回数と比較した。 The size of the Unigene clusters, since it is almost estimates of relative expression levels were compared the size of the cluster and the number of occurrences of the same gene. 1個より多い反復配列を有するクラスターの大きさは、反復配列を有しないクラスターより有意に大きかった(p<0.003、マンホイトニーU-検定)。 The size of the clusters having more than one repeat was significantly greater than no clusters repetitive sequences (p <0.003, Manhoitoni U- test). これらの特徴は、RNAiライブラリーが当初の発現プロフィールを表すことを示唆している。 These features suggest that RNAi library represents the initial expression profile. 本発明者らはさらに、転写物の標的位置を分析した。 We further analyzed the target position of the transcript. 53%がコード領域に対応し、44%が3'-非翻訳領域に対応し、そして3%が5'非翻訳領域に対応した。 53% corresponds to the coding region, corresponding to 44% 3'-untranslated region, and 3% 5 'corresponding to the untranslated region. このように、転写物の様々な部分からshRNA発現構築物が得られた。 Thus, shRNA expression construct was obtained from different parts of the transcript. 結果は、様々な遺伝子の複雑な混合物からなるcDNAライブラリーであってもEPRILを適用できることを示している。 The results show that it is possible to apply the EPRIL be cDNA library consisting of complex mixtures of various genes.

方法細胞培養 Methods Cell culture
Jurkat T細胞は、10%仔ウシ胎児血清(FCS)、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地(インビトロジェン(Invitrogen))において培養した。 Jurkat T cells with 10% fetal fetal calf serum (FCS), were cultured in RPMI 1640 medium containing penicillin and streptomycin (Invitrogen (Invitrogen)). GP293、HEK293、A7r5、およびHeLa細胞は、10%FCSを含むダルベッコ改変イーグル培地(シグマ(Sigma)またはインビトロジェン)において維持した。 GP293, HEK293, A7r5 and HeLa cells, were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% FCS (Sigma (Sigma) or Invitrogen). FL5.12細胞(広島大学Inaba博士の寄贈)は、10%FCSおよび1 ng/ml IL-3(和光、日本)を含むRPMI 1640(シグマ)において維持した。 FL5.12 cells (gift of Hiroshima Inaba Dr.) is, 10% FCS and 1 ng / ml IL-3 (Wako, Japan) were maintained in RPMI 1640 (Sigma) containing.

プラスミドの構築 The construction of the plasmid
shRNA発現レトロウイルスベクターを有するプラスミドpNAMA-U6を含む全てのプラスミドは、標準的な分子生物学技術を用いて構築した。 All plasmids containing plasmid pNAMA-U6 with shRNA expression retrovirus vector was constructed using standard molecular biology techniques. 簡単に説明すると、pSilencer1.0-U6(アンビオン(Ambion))からのPCR増幅によって得られたU6プロモーターおよびターミネーションシグナルコードDNAを、pMXレトロウイルスベクター(東京大学、Kitamura博士の寄贈)からの3' LTRを有するプラスミドのNheI部位に挿入した。 Briefly, the U6 promoter and termination signal-encoding DNA obtained by PCR amplification from PSilencer1.0-U6 (Ambion (Ambion)), pMX retroviral vector 3 from (University of Tokyo, Kitamura gift of Dr.) ' It was inserted into the NheI site of the plasmid carrying the LTR. プライマー対、5'-CGCGGATCCGAATGCTTTTTTTAATTCCTGCAGCCCG-3'(配列番号:1)および5'-CGCGGATCCGAAGACCCCAAACAAGGCTTTTCTCCAAG-3'(配列番号:2)を用いてプラスミドにさらにPCR増幅を行い、shRNAコードDNA断片を挿入するためのBbsI/BsmI部位を形成して、pBsk-U63-3LTRを得た。 Primer pair, 5'-CGCGGATCCGAATGCTTTTTTTAATTCCTGCAGCCCG-3 '(SEQ ID NO: 1) and 5'-CGCGGATCCGAAGACCCCAAACAAGGCTTTTCTCCAAG-3' (SEQ ID NO: 2) performs a further PCR amplification plasmid using, for inserting shRNA-encoding DNA fragment forming a BbsI / BsmI site to obtain pBsk-U63-3LTR. pNAMA-U6を構築するために、NheI部位でU6プロモーターを含む3' LTRを有するHindIII/SalI断片を、pBsk-U63-3LTRから切除して、pDsRed2-N1に由来するDsRed2遺伝子(クロンテック(Clontech))と共に3' LTR欠損pMXベクターを有するpda5LTR-DeRed2-M4のHindIII/SalI部位に挿入した。 To construct PNAMA-U6, the HindIII / SalI fragment with a 3 'LTR containing the U6 promoter NheI site, was excised from pBsk-U63-3LTR, DsRed2 gene derived from pDsRed2-N1 (Clontech (Clontech) ) with 3 'was inserted into the HindIII / SalI sites of pda5LTR-DeRed2-M4 having the LTR-deficient pMX vector.

SV40プロモーターの制御下で、チミジンキナーゼ-ピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ融合タンパク質(Chen, YT & Bradley, A. Genesis 28, 31-35 (2000))を発現するレトロウイルスをコードするプラスミドpMS240-PNSを、チミジンキナーゼとピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼをコードするPCR増幅断片から構築した。 Under the control of the SV40 promoter, the thymidine kinase - puromycin -N- acetyltransferase fusion protein (Chen, YT & Bradley, A. Genesis 28, 31-35 (2000)) plasmids encoding retrovirus expressing pMS240-PNS It was constructed from PCR amplified fragments encoding the thymidine kinase and puromycin acetyltransferase. チミジンキナーゼとピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むDNA断片を、自己不活化レトロウイルスベクターpMS240にサブクローニングして、pMS240-PNSを産生した。 The DNA fragment containing the thymidine kinase and puromycin N- acetyltransferase gene was subcloned into a self-inactivating retroviral vectors PMS240, was produced pMS240-PNS. pMS240-PNSは、標的遺伝子をコードするDNA断片をクローニングするためのBamHI/NotI部位を有する。 pMS240-PNS has a BamHI / NotI sites for cloning a DNA fragment encoding the target gene. GFPを標的とする有効なshRNA発現構築物を選択するために、pd2EGFP-1(クロンテック)からのGFPコード断片をその部位に挿入した。 The GFP in order to select an effective shRNA expression constructs that target, was inserted GFP coding fragment from pd2EGFP-1 (Clontech) to the site.

IP 3 RサイレンシングをモニターするためのレトロウイルスベクターをコードするプラスミドであるpMX-d2EGFP-IP 3 Rを構築するために、脱安定化GFP変種をコードするDNAをpd2EGFP-1から調製して、これをpMXに挿入した。 To construct the pMX-d2EGFP-IP 3 R is a plasmid encoding the retroviral vector to monitor IP 3 R silenced, by preparing a DNA encoding a destabilizing GFP variants from pd2EGFP-1, This was inserted into the pMX. pBS-IP 3 RからのIP 3 RをコードするDNAをd3EGFPの下流の部位に挿入した。 DNA encoding IP 3 R from pBS-IP 3 R was inserted into a site downstream of D3EGFP.

EPRIL EPRIL
GFPを標的とするshRNA発現構築物を作製するために、GFPをコードするBamHI/NotI DNA断片をpEGFP-1(クロンテック)から得た。 The GFP to produce shRNA expression constructs that target, to obtain a BamHI / NotI DNA fragment encoding GFP from pEGFP-1 (Clontech). IP 3 Rの場合、ラット1型IP 3 Rの全コード領域をコードする断片をpBS-IP 3 R1のEcoRI/NotI消化によって調製した。 For IP 3 R, the fragment encoding the entire coding region of the rat type 1 IP 3 R was prepared by EcoRI / NotI digestion of pBS-IP 3 R1. cDNAライブラリーに由来するshRNA発現構築物を作製するために、Super SMART PCR cDNA合成キット(クロンテック)を用いて、FL5.12細胞から調製したmRNAから二本鎖cDNAライブラリーを作製し、これをサブクローニングせずにさらなる誘導のために直接用いた。 To generate shRNA expression constructs derived from cDNA library, using the Super SMART PCR cDNA synthesis kit (Clontech), to prepare a double-stranded cDNA library from mRNA prepared from FL5.12 cells subcloned It was used directly for further induction without. 次に、これらのDNA断片を用いて以下のような6段階プロトコールに従ってEPRILを適用した: Next, apply the EPRIL accordance 6-step protocol as follows using these DNA fragments:

段階1. Stage 1. ランダムDNA断片の調製 Preparation of random DNA fragments
DNA断片は、1 mM MgCl 2 、0.1 mg/ml BSA、および50 mMトリス-塩酸(pH 7.5)の存在下でDNaseIによって限定的に消化して、0.1 U/μl T4 DNAポリメラーゼ(タカラ(Takara)、日本)によって末端を修復した。 DNA fragments, 1 mM MgCl 2, 0.1 mg / ml BSA, and 50 mM Tris - HCl and limitedly digested with DNaseI in the presence of (pH 7.5), 0.1 U / μl T4 DNA polymerase (Takara (Takara) It was end-repaired by Japan). DNaseI(タカラ、日本)の濃度をそれぞれの調製物について経験的に決定して、PAGE上で平均の大きさ約100〜200 bpを有する消化物を得た。 DNaseI (Takara, Japan) for each preparation concentration of empirically determined, to obtain a digest with an average size of about 100 to 200 bp on PAGE.

段階2. Stage 2. 第一のアダプターのライゲーションとMmeI切断 消化物を、T4 DNAリガーゼ(DNAライゲーションキットバージョン2、タカラ、日本)によって、ヘアピン形状のオリゴヌクレオチドであるアダプター1、5'-GTCGGACAATTGCGACCCGCATGCTGCGGGTCGCAATTGTCCGAC-3'(配列番号:3)にライゲーションした。 The ligated with MmeI cleavage digest of first adapter, T4 DNA ligase (DNA ligation kit version 2, Takara, Japan) by the adapter 1,5'-GTCGGACAATTGCGACCCGCATGCTGCGGGTCGCAATTGTCCGAC-3 '(SEQ ID NO: is an oligonucleotide hairpin shape: It was ligated to the 3). ヘアピン形状のアダプター1は、使用前に化学合成したオリゴヌクレオチドから未変性PAGEによって精製した。 Adapter 1 hairpin shape, were purified by native PAGE of an oligonucleotide chemically synthesized prior to use. アダプター1の5'末端と消化したDNAの3'末端との間のニックは、1.0または1.25 U/μl T4ポリヌクレオチドキナーゼによる処理後に、0.1 mM NAD、1.2 mM EDTA、10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 、4 mM MgCl 2 、および30 mMトリス-塩酸(pH 8.0)の存在下で、0.006 U/μl大腸菌リガーゼ(タカラ、日本)によって修復した。 Nick between 5 the adapter 1 'end and 3'end of the digested DNA', after treatment with 1.0 or 1.25 U / μl T4 polynucleotide kinase, 0.1 mM NAD, 1.2 mM EDTA , 10 mM (NH 4) 2 SO 4, 4 mM MgCl 2, and 30 mM tris - in the presence of hydrochloric acid (pH 8.0), was repaired by 0.006 U / [mu] l E. coli ligase (Takara, Japan). アダプターが結合した短いDNA断片をMmeIによる切断によって生成した。 Short DNA fragments by the adapter binding was generated by cleavage with Mmel. 生成したDNA断片は、未変性のPAGE上で〜40 bpで移動する単一のバンドとして検出された。 The resulting DNA fragment was detected as a single band migrating at to 40 bp on the native PAGE. ゲルのバンドを切除して、MmeI-切断産物をフェノール-クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって得た。 And excised gel bands, the MmeI- cleavage product phenol - was obtained by chloroform extraction and ethanol precipitation.

段階3. Step 3. 第二のアダプターのライゲーション オリゴヌクレオチド対、5'-CAAAGAGTCTTCGGCCCTCCAGACCGTGAGTC-3'(配列番号:4)および5'-GCCGAAGACTCTTTGNN-3'(配列番号:5)をアニールさせることによって両端が断端形状のアダプター2を調製した後、PAGEを用いて精製した。 Ligation oligonucleotide pair of the second adapter, 5'-CAAAGAGTCTTCGGCCCTCCAGACCGTGAGTC-3 '(SEQ ID NO: 4) and 5'-GCCGAAGACTCTTTGNN-3' (SEQ ID NO: 5) at both ends by annealing the stump shape adapter 2 after preparation of was purified using PAGE. 後者のオリゴヌクレオチドは、「N」と呼ばれる3'末端で二つの縮重塩基を含み、これはA、C、G、またはTを表す。 The latter oligonucleotide comprises two degenerate bases at the 3 'end, referred to as "N", which represents the A, C, G or T,. T4 DNAリガーゼを用いて、アダプター2を段階2からのMmeI切断DNA断片にライゲーションした。 Using T4 DNA ligase to ligate the adapter 2 to the MmeI cleavage DNA fragment from step 2. PAGEによって精製した後、アダプター2-ライゲーション断片上のニックを、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(タカラ、日本)およびT4 DNAリガーゼによる処置によって修復した。 After purification by PAGE, nick on the adapter 2 ligated fragments were repaired by treatment with T4 polynucleotide kinase (Takara, Japan) and T4 DNA ligase.

段階4. Stage 4. プライマーの伸長 次に、段階3からの産物にプライマー伸長反応を行って、プライマーオリゴヌクレオチド、5'-GACTCACGGTCTGGAGGGCCGAA-3'(配列番号:6)と共に、0.1%トライトンX-100、0.2 mM dNTPs、10 mM KCl、10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 、2 mM MgSO 4 、および20 mMトリス-塩酸(pH 8.8)を含む反応緩衝液において94℃で135秒間インキュベートした後、62℃に冷却した。 Primer extension then performs a primer extension reaction product from step 3, the primer oligonucleotide, 5'-GACTCACGGTCTGGAGGGCCGAA-3 '(SEQ ID NO: 6) with a 0.1% Triton X-100,0.2 mM dNTPs, 10 mM KCl, 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4, 2 mM MgSO 4, and 20 mM tris - after incubation 135 seconds at 94 ° C. in a reaction buffer containing hydrochloric acid (pH 8.8), and cooled to 62 ° C.. 次に、0.02 U/μl Bst DNAポリメラーゼ大断片(NEB)を反応混合物に加えて、プライマー伸長反応を開始した。 Then, 0.02 U / μl Bst DNA polymerase large fragment (NEB) was added to the reaction mixture to initiate a primer extension reaction. 反応は65℃で300秒間行い、4℃に冷却することによって停止させた。 The reaction was carried out for 300 seconds at 65 ° C., it was stopped by cooling to 4 ° C.. 反応産物はPAGEによって精製した。 The reaction products were purified by PAGE.

段階5. Step 5. プラスミドへのサブクローニング 段階4からの産物をBpmIによって消化して、クレノウ断片(タカラ、日本)によって平滑末端にした後、BbsIによって消化した。 The product from subcloning steps 4 to plasmid was digested with BpmI, after blunt by Klenow fragment (Takara, Japan) was digested with BbsI. pNAMA-U6をBsmIによって消化して、同様に平滑末端にしてからBbsIによって消化した後、細菌アルカリホスファターゼ(タカラ、日本)による処置を行った。 The pNAMA-U6 was digested with BsmI, after digestion by BbsI from similarly blunt ends were treated by the bacterial alkaline phosphatase (Takara, Japan). 消化した断片をゲル精製して、モル比約3:1でライゲーションした。 The digested fragment was gel purified, the molar ratio of about 3: was ligated with 1. ライゲーション混合物を精製後、電気穿孔によってElectroMAX DH5a-Eコンピテント細胞(インビトロジェン)に導入した。 After purification of the ligation mixture was introduced into ElectroMAX DH5a-E competent cells (Invitrogen) by electroporation. 形質転換細胞を、100 μg/mlカルベニシリンを含む500 cm 2 LB寒天プレートに播種した。 The transformed cells were plated in 500 cm 2 LB agar plates containing 100 [mu] g / ml carbenicillin. 一晩インキュベートした後、芝状に増殖した細菌をへらで採取して、プラスミド精製キット(プラスミドMIDIキット、キアゲン(Qiagen))を用いてプラスミドDNAを調製した。 After overnight incubation, the lawn shape grown bacteria were harvested with a spatula, plasmid purification kit plasmid DNA was prepared using (Plasmid MIDI kit, Qiagen (Qiagen)).

段階6. Step 6. 過剰なリンカーの切断 段階5から精製されたプラスミドをBcgIによって消化して、T4 DNAポリメラーゼによって平滑末端にして、自己ライゲーションによって再度環状化した。 Excess linkers plasmid purified from the cutting stage 5 by digestion with BcgI, and blunt-ended by T4 DNA polymerase, and re-circularized by self-ligation. この処置によって、アダプター1からの配列のほとんどが除去されるが、短いリンカー配列、5'-TTGTCCGAC-3'(配列番号:7)は保持される。 This treatment is most sequence from the adapter 1 is removed, a short linker sequence, 5'-TTGTCCGAC-3 '(SEQ ID NO: 7) is maintained. 不完全に消化されたプラスミドの混入を可能な限り消失させるために、その認識配列がアダプター1からの配列のBcgI切除部分に存在するMfeIによってDNAを消化した。 In order to eliminate as far as possible contamination of the incompletely digested plasmid DNA was digested with MfeI whose recognition sequence is present in BcgI cutting portion of the sequence from the adapter 1. ElectroMAX DH5a-Eコンピテント細胞を、再環状化したプラスミドによって形質転換して、100 μg/mlカルベニシリンを含むLB-寒天プレート上で選択した。 The ElectroMAX DH5a-E competent cells were transformed with recircularized plasmid were selected on LB- agar plates containing 100 [mu] g / ml carbenicillin. プレート上で一晩培養した後、プラスミドライブラリーのストックを得た。 After incubation overnight on plates, to obtain a stock of plasmid library.

ゲノムからのshRNA発現構築物の回収 Collection of shRNA expression constructs from the genome
shRNA発現構築物を、形質導入したFL5.12細胞から調製したゲノムDNA 100 ngからPCR増幅によって回収した。 ShRNA expression constructs were recovered by PCR amplification from genomic DNA 100 ng prepared from FL5.12 cells transduced. PCRのために、Vent DNAポリメラーゼ(NEB)を、プライマー対、5'-GTACGAGCGCACCGAGGGCCGCCACC-3'(配列番号:8)および5'-GGCGTTACTTAAGCTAGCGATCCGACGCCGCCATC-3'(配列番号:9)と共に用いた。 For the PCR, the Vent DNA polymerase (NEB), primer pair, 5'-GTACGAGCGCACCGAGGGCCGCCACC-3 '(SEQ ID NO: 8) and 5'-GGCGTTACTTAAGCTAGCGATCCGACGCCGCCATC-3' (SEQ ID NO: 9) was used with. PCR増幅DNAをNotIおよびAflIIによって消化して、pBsk-3LTRにサブクローニングした。 The PCR amplified DNA was digested with NotI and AflII, and subcloned into pBsk-3LTR. 形質転換および精製後、回収されたshRNA発現構築物を含む3' LTRをコードするDNAをHindIIIおよびNotIによって切除して、pda5LTR-DsRed2-M4にサブクローニングした。 After transformation and purification, the DNA encoding the 3 'LTR containing the recovered shRNA expression construct was excised by HindIII and NotI, subcloned into pda5LTR-DsRed2-M4. 得られたプラスミドは、pNAMA-U6と構造的に同じであり、回収されたshRNA発現構築物を有するレトロウイルスを産生するためにパッケージングを行うことができる。 The resulting plasmids are pNAMA-U6 and structurally identical, it is possible to perform packaging in order to produce retroviruses having recovered shRNA expression constructs.

インビトロでのshRNAの調製 Preparation of shRNA in vitro
shRNAsはT7プロモーターに基づくインビトロ転写を用いることによって合成した。 shRNAs were synthesized by using the in vitro transcription based on the T7 promoter. インビトロ転写のための鋳型を調製するために、二つの化学合成オリゴヌクレオチド、T7プロモーターコードオリゴヌクレオチド、5'-taatacgactcactataG-3'(配列番号:10)およびshRNAコードオリゴヌクレオチド5'-AAAAN 20-21 GTCGGACAAN' 20-21 ctatagtgagtcgtatta-3'(配列番号:11、N 20-21およびN' 20-21は、shRNAの基本構造に対応する配列を示し、小文字は、T7-プロモーターコードオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを示す)を、94℃で135秒間インキュベートした後、45℃で30秒間アニールした。 To prepare the template for in vitro transcription, two chemically synthesized oligonucleotides, T7 promoter code oligonucleotide, 5'-taatacgactcactataG-3 '(SEQ ID NO: 10) and shRNA encoding oligonucleotide 5'-AAAAN 20-21 GTCGGACAAN '20-21 ctatagtgagtcgtatta-3' (SEQ ID NO: 11, N 20-21 and N '20-21 shows a sequence corresponding to the basic structure of the shRNA, lowercase, complementary to the T7- promoter encoding oligonucleotide the a the nucleotide) were incubated 135 seconds at 94 ° C., annealing for 30 sec at 45 ° C.. 次に、アニールしたオリゴヌクレオチドを、Bst DNAポリメラーゼ大断片(0.08 U/μl)を用いて、50℃で600秒間の伸長反応によって二本鎖DNA鋳型に変換した。 Next, the annealed oligonucleotides, using Bst DNA polymerase large fragment (0.08 U / μl), was converted to double-stranded DNA templates by extension reaction 600 seconds 50 ° C.. shRNAは、CUGA7インビトロ転写キット(ニッポンジーン、日本)を用いて、製造元のプロトコールに従って精製鋳型から作製した。 shRNA is, CUGA7 vitro transcription kit (Nippon Gene, Japan) was used to prepare the purified template according to the manufacturer's protocol. 転写されたshRNAをゲル濾過スピンカラム(マイクロスピンG-25、アマシャム・バイオサイエンシズ(Amersham Bioeciences))を用いて精製した。 The transferred shRNA gel filtration spin column and purified using (micro spin G-25, Amersham Biosciences (Amersham Bioeciences)). ダイサー消化shRNAを作製する場合、shRNAを組換え型ヒトダイサー(ジーンセラピーシステムズ(Gene Therapy Systems))によって製造元のプロトコールに従って処理した。 When fabricating the Dicer digestion shRNA, it was processed according to the manufacturer's protocol by the shRNA recombinant human dicer (Gene Therapy Systems (Gene Therapy Systems)).

異なるshRNAコードオリゴヌクレオチドのN 20-21配列は、 The N 20-21 sequence of different shRNA code oligonucleotides,
TCTCGGCATGGACGAGCTGT (shGFP1)(配列番号:12) TCTCGGCATGGACGAGCTGT (shGFP1) (SEQ ID NO: 12)
CTTCACCTCGGCGCGGGTCT (shGFP5)(配列番号:13) CTTCACCTCGGCGCGGGTCT (shGFP5) (SEQ ID NO: 13)
CTACAAGACCCGCGCCGAGG (shGFP7)(配列番号:14) CTACAAGACCCGCGCCGAGG (shGFP7) (SEQ ID NO: 14)
CCCCATCGGCGACGGCCCCGT (shGFP10)(配列番号:15) CCCCATCGGCGACGGCCCCGT (shGFP10) (SEQ ID NO: 15)
AGATCCGCCACAACATCGAGG (shGFP12)(配列番号:16) AGATCCGCCACAACATCGAGG (shGFP12) (SEQ ID NO: 16)
TCAGCTCGATGCGGTTCACC (shGFP13)(配列番号:17) TCAGCTCGATGCGGTTCACC (shGFP13) (SEQ ID NO: 17)
CCACAAGTTCAGCGTGTCCGG (shGFP14)(配列番号:18) CCACAAGTTCAGCGTGTCCGG (shGFP14) (SEQ ID NO: 18)
CTTCAAGTCCGCCATGCCCGA (shGFP17)(配列番号:19) CTTCAAGTCCGCCATGCCCGA (shGFP17) (SEQ ID NO: 19)
TGCTGGTAGTGGTCGGCGAGC (shGFP18)(配列番号:20) TGCTGGTAGTGGTCGGCGAGC (shGFP18) (SEQ ID NO: 20)
TCGGCGCGGGTCTTGTAGTTG (shGFP19)(配列番号:21)および TCGGCGCGGGTCTTGTAGTTG (shGFP19) (SEQ ID NO: 21) and
TTGTAGTTGCCGTCGTCCTT (shGFP20)(配列番号:22)であった。 TTGTAGTTGCCGTCGTCCTT (shGFP20) (SEQ ID NO: 22) was.
N' 20-21配列は、N 20-21配列と相補的であった。 N '20-21 sequence was complementary to the N 20-21 sequence.

レトロウイルス産生と形質導入 ハイスループットスクリーニングの場合、shRNA発現構築物を有するレトロウイルスの作製および形質導入は、96ウェルプレートフォーマットで行った。 For retrovirus producer and transduction high throughput screening, generation and retroviral transduction with shRNA expression constructs were performed in 96-well plate format. プラスミドは、QIAウェル96ウルトラプラスミドキット(キアゲン)を用いて、製造元のプロトコールに従って96ウェルプレートのフォーマットで調製した。 Plasmid, using the QIA well 96 Ultra Plasmid Kit (Qiagen), was prepared in the format of 96-well plates according to the manufacturer's protocol. GP293パッケージング細胞株(クロンテック)に、レトロウイルスベクタープラスミド〜200 ngおよびVSG-Gコードプラスミド17 ngを、96ウェルプレートにおいてそれぞれのウェルに関してリポフェクタミン2000(インビトロジェン)を用いてトランスフェクトした。 The GP293 packaging cell line (Clontech), the retroviral vector plasmid to 200 DEG ng and VSG-G code plasmid 17 ng, were transfected using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) for each well in 96-well plates. トランスフェクションの2日後、レトロウイルスを含む培養培地を得た。 Two days after transfection, to obtain a culture medium containing the retrovirus. レトロウイルス形質導入は、レトロウイルス粒子を含む培地50 μlをJurkat T細胞浮遊液(1.0×10 5個/ml)50 μlに加えることによって行った。 Retroviral transduction was performed by the addition of culture medium 50 [mu] l containing retroviral particles Jurkat T cell suspension (1.0 × 10 5 cells / ml) in 50 [mu] l. 中等度の規模でレトロウイルスを作製する場合、DNAをプラスミドMIDIキットによって精製して、レトロウイルスベクタープラスミド24 μgおよびVSG-Gコードプラスミド2 μgによるトランスフェクションによって、10 cm培養皿において増殖させたGP293においてレトロウイルスパッケージングを行った。 When fabricating a moderate retrovirus on a scale of, DNA was purified by plasmid MIDI kits, by transfection with a retrovirus vector plasmid 24 [mu] g and VSG-G code plasmid 2 [mu] g, it was grown in 10 cm culture dishes GP293 It was retrovirus packaging in. 必要であれば、レトロウイルス粒子を、一晩遠心することによって濃縮した後、適当な培養培地に再浮遊させた。 If necessary, the retroviral particles, after concentration by centrifugation overnight and resuspended in a suitable culture medium.

フローサイトメトリーとRNAi効率の評価 相対的GFP発現レベルは、FACスキャンフローサイトメーター(BD)を用いて分析した蛍光強度に基づいて推定した。 Flow Evaluation Relative GFP expression levels cytometry and RNAi efficiency was estimated based on the fluorescence intensity was analyzed using a FAC scan flow cytometer (BD). GFP蛍光の減少倍数(shRNA形質導入を行った細胞の蛍光強度で除した対照蛍光強度)を、RNAi効率の測定値として用いた。 Fold reduction of GFP fluorescence (control fluorescence intensity divided by the fluorescence intensity of cells was performed shRNA transduction), it was used as a measure of RNAi efficiency. レトロウイルス力価の変動によるRNAi効率のバッチ毎の差を補正するために、一連の内部対照shRNA発現構築物をそれぞれの96ウェルプレートに含めた。 In order to compensate for the difference in each batch of RNAi efficiency due to variation of the retroviral titers, including a series of internal control shRNA expression construct to each 96-well plate.

ウェスタンブロット分析 Western blot analysis
A7r5細胞にshRNA発現構築物を有するレトロウイルスを感染させた。 The A7r5 cells were infected with retrovirus having a shRNA expression construct. 4日後、細胞をトリプシン処理によって回収して、可溶化し、SDS-PAGEを行った。 After 4 days, cells were harvested by trypsinization, solubilized, subjected to SDS-PAGE. SDS-PAGE産物をPVDFメンブレンに転写した後、IP 3 Rに対応するタンパク質を、一次抗体および二次抗体としてそれぞれ、ウサギIgG抗1型IP 3 R(アロモン(Alomone))およびHRP結合抗ウサギIgG(MBL、日本)によってプロービングして、化学発光によって検出した。 After transferring the SDS-PAGE product to PVDF membranes, IP 3 a protein corresponding to R, respectively as primary and secondary antibodies, rabbit IgG anti-type 1 IP 3 R (allomone (Alomone)) and HRP conjugated anti-rabbit IgG (MBL, Japan) was probed by, were detected by chemiluminescence. イムノブロットシグナル強度の定量は、IPLabスペクトルソフトウェアを用いて行った(スキャンアナリティクスインク(Scananalytics, Inc))。 Determination of immunoblot signal intensity was performed using IPLab Spectrum software (Scan Analytics ink (Scananalytics, Inc)). IP 3 Rシグナルは、抗アクチン抗体(サンタクルズ(Santa cruz))を用いてプロービングしたアクチンのイムノブロットシグナルによって標準化した。 IP 3 R signals were normalized by immunoblot signal of actin probed with anti-actin antibody (Santa Cruz (Santa cruz)).

細胞内カルシウム測定 細胞内カルシウムを測定するために、カバーグラスに播種したA7r5細胞をshRNA発現レトロウイルスに感染させて、感染4日後にCa 2+指標物質Fura-2をローディングした。 To measure intracellular calcium measurements intracellular calcium, the A7r5 cells seeded in coverslips were infected with shRNA expression retrovirus was loaded Ca 2+ indicator substance Fura-2 after infection 4 days. 細胞内Ca 2+濃度の変化は、既に記述されているように(Hirose, K. et al. Science 284, 1527-1530 (1999))、CCDカメラ(フォトメトリクス(Photometrics))を備えた倒立顕微鏡において比測定による蛍光測定によって評価した。 Changes in intracellular Ca 2+ concentrations, as described previously (Hirose, K. et al. Science 284, 1527-1530 (1999)), an inverted microscope equipped with a CCD camera (Photo metrics (Photometrics)) It was assessed by fluorescence measurement with a ratio measured in. L型Ca 2+チャンネル阻害剤であるニカルジピン(10 μM)の存在下で1 nMアルギニンバソプレッシン(AVP)を加えることによって細胞を刺激した。 The cells were stimulated by an L-type Ca 2+ channel inhibitors in the presence of nicardipine (10 [mu] M) is added 1 nM arginine vasopressin (AVP).

上記の通り、本発明者らは、shRNA発現ライブラリーをcDNA鋳型から酵素的に誘導することができる技術「EPRIL」を確立した。 As described above, the present inventors have shRNA expression library established a technology "EPRIL" that can be derived from the cDNA template enzymatically. 本発明を単一のcDNA源に適用すると、ライブラリーは、cDNA上の様々な領域に対する候補shRNA発現構築物の膨大なアレイを提供し得る。 When applying the present invention to a single cDNA source library may provide a vast array of candidate shRNA expression constructs for the various regions on the cDNA. EPRILをハイスループットスクリーニングおよび細胞内選択スキームと組み合わせると、あらゆる遺伝子に関して最善のshRNA発現構築物の大きいコレクションを作製するための一般化し得るプラットフォームを提供する。 When combined with high-throughput screening and intracellular selection scheme EPRIL, it provides a generalized may platform for making large collection of best shRNA expression constructs for any gene. そのようなコレクションは一般的に、哺乳類におけるRNAiに基づくハイスループットリバース遺伝学に大きく貢献するであろう。 Such collections will generally contribute significantly to high throughput reverse genetics-based RNAi in mammals.

本発明者らは、効率的なRNAiの配列選択性を同定しようと試みた。 The present inventors have attempted to identify the sequence selectivity of efficient RNAi. 本発明者らは、ガイド配列の5'末端から4番目のヌクレオチドでUを有するshRNA発現構築物がGFPおよびIP 3 Rにとって有効である、という弱いが一般的傾向を認めたが、他の位置に対する選択性は必ずしも一貫しなかった。 Inventors found that shRNA expression constructs with U in the fourth nucleotides from the 5 'end of the guide sequence is valid for GFP and IP 3 R, weak that it showed a general trend, for other positions It did not necessarily consistent selectivity. 例えば、第二のヌクレオチドでのGはIP 3 Rにとっては好ましい傾向が見られたが、GFPではそのような傾向は認められなかった。 For example, although the G at the second nucleotide was observed positive trends for the IP 3 R, the GFP Such tendency was not observed. 明らかに、全般的な配列選択性を決定するために様々な遺伝子からより多くのデータが必要である。 Clearly, there is a need for more data from various genes to determine the overall sequence selectivity. EPRILはそのような研究を大きく促進するであろう。 EPRIL will greatly facilitate such studies.

EPRILによって、cDNAsの複雑な混合物からなるcDNAライブラリーから大きいshRNAiライブラリーを作製することができる。 By EPRIL, it can be made large shRNAi library from a cDNA library made from a complex mixture of cDNAs. 本発明者らは、ライブラリーが、独立したcDNA由来shRNA発現構築物3×10 5 〜4×10 6個を含むと推定した。 The present inventors have found that the library is estimated to contain independent cDNA derived shRNA expression constructs 3 × 10 5 ~4 × 10 6 cells and the. したがって、本発明の方法によって、絶対的な表現型の基準、例えば、細胞形態学、接着、細胞死、重要な分子の発現レベルおよび他の機能的指標に基づく選択によって遺伝子を同定することができるRNAiに基づくフォワード遺伝学を行うことができるであろう。 Thus, the method of the present invention, absolute phenotypic criteria, for example, cell morphology, adhesion, cell death, can be used to identify genes by selection based on the expression levels and other functional indicators of important molecules It will be able to make a forward genetics based on RNAi. shRNA配列は、ランダム配列を有する20および21-塩基の長さのタグを完全にマッチさせることができる(Saha, S. et al. Nat. Biotechnol. 20, 508-512 (2002))確率9.1×10 -13および2.3×10 -13が、マウスまたはヒトゲノムのサイズ〜3×10 9 bpを考慮すると十分に小さいことから、遺伝子同定のための信頼できるタグとして役立ちうる。 shRNA sequence can be perfectly matched to 20 and 21 bases in length tag with a random sequence (Saha, S. et al. Nat. Biotechnol. 20, 508-512 (2002)) probabilities 9.1 × 10-13 and 2.3 × 10 -13 is a sufficiently small considering the size to 3 × 10 9 bp of mouse or human genome, it can serve as a reliable tags for gene identification.

本発明のRNAiライブラリーを用いたフォワード遺伝学を動物レベルに適用してもよい。 The forward genetics using RNAi libraries of the invention may be applied to the animal level. レンチウイルス媒介形質導入によって、shRNA発現構築物を有するマウスを作製できることから(Rubinson, DA et al. Nat. Genet. 33, 401-406 (2003))、本発明者らは、異なる遺伝子を標的とするshRNA発現構築物によって変異動物の膨大なアレイを効率よく作製することができる。 By lentivirus-mediated transduction, since the mice with shRNA expression constructs can be prepared (Rubinson, DA et al. Nat. Genet. 33, 401-406 (2003)), the present inventors have targeted different genes the shRNA expression constructs can be produced a vast array of mutant animals efficiently. 表現型に基づいて系統的にスクリーニングすると、特定の表現型に関与する遺伝子を容易に同定することができる。 When systematically screening based on phenotype, it is possible to readily identify genes involved in a particular phenotype. この特徴は、エチルニトロソウレア(ENU)を用いてマウスにおいて進行中の大規模な変異誘発プロジェクトの特徴とは対照的である(Kile, BT et al. Nature 425, 81-86 (2003))。 This feature is in contrast to the characteristics of the large-scale mutagenesis projects ongoing in mice using ethyl nitrosourea (ENU) (Kile, BT et al. Nature 425, 81-86 (2003)). ENU-変異誘発は変異体動物を効率よく作製するが、座を決定するまでに単調で退屈なプロセスを要する。 ENU- mutagenesis to produce good mutant animals efficiency, but requires a tedious process before determining the seat. さらに、shRNA発現構築物のRNAi効率の変動によって、遺伝子サイレンシングの程度の変動により独自の表現型が発見される可能性がある。 Furthermore, the variation in RNAi efficiency of shRNA expression constructs, there is a possibility that the own phenotype is found by variation in the degree of gene silencing. このように、EPRILは、哺乳類におけるフォワード遺伝学の新しいスタイルを提供し、RNAiに基づくリバース遺伝学におけるその役割と共に、全ゲノムレベルでの遺伝子と機能との関係の解明に大きく貢献するであろう。 In this way, EPRIL provides a new style of forward genetics in mammals, along with its role in reverse genetics based on RNAi, will contribute greatly to the understanding of the relationship between gene and function of the genome-wide level .

Claims (16)

  1. 以下の(1)〜(3)の工程を含む、所望の標的DNAからRNAiライブラリーを製造する方法であって、前記(2)工程の前または後にDNA断片の他端に二重鎖断端型アダプターを接続する工程が含まれ、前記二重鎖断端型アダプターまたは前記(2)工程に記載のヘアピン型アダプターのいずれか一方にアウトサイドカッターの制限酵素認識サイトが備えられており、前記制限酵素認識サイトを備えたアダプターが先に前記DNA断片に接続され、前記アウトサイドカッターの制限酵素によりDNA断片の長さが整えられて形成された端にもう一方のアダプターが接続される、方法。 Includes the following (1) to (3) step, a method for producing a RNAi library from a desired target DNA, the (2) to the other end before or after the DNA fragments of step duplex stump includes the step of connecting the mold adapter is provided with a restriction enzyme recognition site of the outside cutter in one of hairpin adapters according to the double-stranded stump type adapter or the (2) step, wherein restriction enzyme recognition sites adapter with being connected to the DNA fragment previously, the other adapter end has been formed by trimmed length of DNA fragments by restriction enzyme of the outside cutter is connected, the method .
    (1)標的DNAをランダムに切断し、DNA断片を生成する工程、 (1) The target DNA is cut at random, to produce a DNA fragment,
    (2)ヘアピン型アダプターを、前記DNA断片の一端に接続して、ヘアピン型のDNA断片を生成する工程、 (2) a hairpin adapter, connected to one end of the DNA fragment, to produce a DNA fragment of hairpin,
    (3)ヘアピン型のDNA断片をStrand−displacing活性を有するポリメラーゼを用いてプライマーエクステンションを実行させ、インターフェアレンスRNAをコードしたiRNA発現構築物を生成させる工程。 (3) a DNA fragment of hairpin using polymerase having Strand-displacing activity to execute the primer extension step of generating an iRNA expression constructs encoding the interference RNA.
  2. ヘアピン型アダプターにアウトサイドカッターの制限酵素認識サイトが備えられている、請求項1記載の方法。 Of the outside cutter hairpin adapter restriction enzyme recognition sites are provided, The method of claim 1, wherein.
  3. 二重鎖断端型アダプターにアウトサイドカッターの制限酵素認識サイトが備えられている、請求項1記載の方法。 Doubly stranded stump type adapter restriction enzyme recognition sites of the outside cutter is provided, the process of claim 1.
  4. プライマーエクステンション後にiRNA発現構築物を発現ベクターに接続する工程をさらに含む、請求項1記載のRNAiライブラリーの製造方法。 Primer further comprises an extension after the step of connecting the iRNA expression construct into an expression vector, a manufacturing method of an RNAi library of claim 1, wherein.
  5. 発現ベクターが哺乳動物内で機能し得る、請求項4記載のRNAiライブラリーの製造方法。 Expression vector capable of functioning in mammalian method of RNAi library of claim 4 wherein.
  6. 発現ベクターが宿主染色体内への組込み活性を有する、請求項4又は5記載のRNAiライブラリーの製造方法。 Expression vector comprising an integrated activity into the host chromosome, the production method of RNAi library of claim 4 or 5, wherein.
  7. 標的DNAが、特定の遺伝子のcDNA、cDNAライブラリー、またはサブトラクション後のcDNAのいずれかである、請求項1から6のいずれかに記載のRNAiライブラリーの製造方法。 Target DNA, cDNA of specific genes, cDNA library or either cDNA after subtraction method of RNAi library of any of claims 1 to 6,.
  8. 前記(1)工程において、ショットガンクローニングに使用し得るDNA消化酵素を用いて標的DNAが断片化される、請求項1記載のRNAiライブラリーの製造方法。 Wherein (1) in step is fragmented target DNA using a DNA digesting enzyme may be used in shotgun cloning method of RNAi library of claim 1, wherein.
  9. アウトサイドカッターの制限酵素が、少なくとも第一のアダプター内の認識サイトから19bp以上はなれた位置を切断する、請求項1から8のいずれかに記載のRNAiライブラリーの製造方法 Restriction enzymes of the outside cutter, to cut the positions become the above 19bp from the recognition site of at least the first adapter manufacturing method of RNAi library of any of claims 1 to 8
  10. Strand−displacing活性を有するポリメラーゼが耐熱性である、請求項1から9のいずれかに記載のRNAiライブラリーの製造方法。 Polymerase with Strand-displacing activity is thermotolerant, manufacturing method of RNAi library of any of claims 1 to 9.
  11. Strand−displacing活性を有するポリメラーゼがBstポリメラーゼまたはVentポリメラーゼのいずれかである、請求項1から10のいずれかに記載のRNAiライブラリーの製造方法。 Strand-displacing polymerase having activity is either Bst polymerase or Vent polymerase The method of RNAi library of any of claims 1 to 10.
  12. 請求項1から11のいずれかに記載の方法により製造されたRNAiライブラリーからインターフェアレンスRNAをコードするiRNA発現構築物をスクリーニングする方法であって、 A method of screening an iRNA expression construct encoding the interference RNA from RNAi libraries prepared as claimed in any of claims 1 to 11,
    標的DNAが発現している細胞に前記RNAiライブラリーを導入する工程、 Introducing said RNAi library cells target DNA is expressed,
    標的DNAの発現を測定する工程、を含むスクリーニング方法。 Screening method comprising steps, a measuring expression of the target DNA.
  13. 請求項12記載のスクリーニング方法において、 In the screening method of claim 12, wherein,
    標的DNAをレポーター遺伝子と融合させた融合遺伝子として、 The target DNA as a fusion gene fused to a reporter gene,
    標的DNAの発現を測定する工程では、前記レポータータンパク質の活性を指標に標的DNAの発現が測定される、スクリーニング方法。 In the step of measuring the expression of the target DNA, the expression of the target DNA is measured the activity of the reporter protein as an indicator, the screening method.
  14. 請求項1から11のいずれかに記載の方法により製造されたRNAiライブラリーからインターフェアレンスRNAをコードするiRNA発現構築物をスクリーニングする方法であって、 A method of screening an iRNA expression construct encoding the interference RNA from RNAi libraries prepared as claimed in any of claims 1 to 11,
    標的DNAとネガティブ選択マーカー遺伝子とを融合させた融合遺伝子が発現している細胞に前記RNAiライブラリーを導入する工程と、 Introducing said RNAi library cells fusion gene fused with the target DNA and the negative selection marker gene is expressed,
    ネガティブ選択マーカーによる選択を実行しRNAi効果があった細胞のみを選択する工程とを含む、スクリーニング方法。 Run the selection by negative selection marker and a step of selecting only cells that had RNAi effect, the screening method.
  15. 請求項1から11のいずれかに記載の方法によりRNAiライブラリーを製造するためのキットであって、 The method according to any one of claims 1 to 11 and a kit for the preparation of a RNAi library,
    前記ヘアピン型アダプターと、前記二重鎖断端型アダプターとを含み、 The includes a hairpin adapter, and said duplex stump type adapter,
    前記アダプターのいずれかにアウトサイドカッターの制限酵素認識サイトが備えられている、キット。 Restriction enzyme recognition sites of the outside cutter in any one of the adapter is provided, the kit.
  16. さらに、アウトサイドカッターの制限酵素および/またはStrand−displacing性を有するポリメラーゼを備えた、請求項15記載のキット。 Furthermore, with a polymerase with restriction enzymes and / or Strand-displacing properties of the outside cutter, kit as in claim 15.
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