JP4714863B2 - Cell stimulator - Google Patents

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Description

本発明は、電界の作用により細胞内構成要素を刺激するための細胞刺激装置に関する。   The present invention relates to a cell stimulation apparatus for stimulating intracellular components by the action of an electric field.

従来より、矩形状のパルス電界により細胞膜に小孔を開け、その小孔から細胞内に遺伝子を導入するエレクトロポレーションが知られている。このエレクトロポレーションは、導電性の細胞質が誘電性の細胞膜で覆われた構造の細胞と、一対の平行平板電極とを導電性の懸濁液中に入れた状態で、その一対の電極から細胞および懸濁液にパルス電界を印加して細胞の細胞膜に電気的な刺激を与えるものである。細胞膜に与えられる電気的な刺激は、電界の印加によって懸濁液中を流れる電流が細胞膜の表面に電荷を帯電させ、細胞膜に電気的および機械的なストレスを生じさせることにより起こるものであり、そのストレスによって細胞膜を一時的に破壊して細胞膜に小孔を形成する。細胞膜を刺激するために印加されるパルス電界は、一般に、パルス幅が数十μｓ以上と長く、振幅が数十Ｖｒｍｓ程度と低いものである。それは、細胞膜を電気的に刺激するのに要する時間（緩和時間）が数十μｓ程度と長いからであり、このように長時間に渡って電界を印加しても細胞が死なないようにするには振幅を低く抑える必要があるからである。   Conventionally, electroporation is known in which a small hole is formed in a cell membrane by a rectangular pulse electric field, and a gene is introduced into the cell through the small hole. In this electroporation, a cell having a structure in which a conductive cytoplasm is covered with a dielectric cell membrane and a pair of parallel plate electrodes are placed in a conductive suspension, and the cell is discharged from the pair of electrodes. In addition, a pulsed electric field is applied to the suspension to electrically stimulate the cell membrane. The electrical stimulation given to the cell membrane is caused by the electric current flowing in the suspension by applying an electric field to charge the surface of the cell membrane, causing electrical and mechanical stress on the cell membrane, The stress temporarily destroys the cell membrane to form pores in the cell membrane. The pulse electric field applied to stimulate the cell membrane generally has a pulse width as long as several tens of μs or more and an amplitude as low as several tens of Vrms. This is because the time required for electrically stimulating the cell membrane (relaxation time) is as long as several tens of μs. Thus, in order to prevent cells from dying even when an electric field is applied for a long time. This is because the amplitude needs to be kept low.

このように、エレクトロポレーションでは、パルス幅が数十μｓ程度と長く、振幅が数Ｖｒｍｓ程度と低いパルス電界が長らく用いられてきた。しかし、近年、緩和時間以下のパルス幅のパルス電界を細胞に加えると、細胞膜を通して懸濁液および細胞質に電界の大きさに応じた電流が流れることがわかってきたことから、その応用研究が活発に行われている。非特許文献１では、それを利用して、細胞膜を破壊しないで細胞内の構成要素、例えば核膜に電界を作用させる技術が開示されている。   Thus, in electroporation, a pulse electric field having a long pulse width of about several tens of μs and a low amplitude of about several Vrms has been used for a long time. However, in recent years, it has been found that when a pulse electric field with a pulse width equal to or less than the relaxation time is applied to cells, a current corresponding to the magnitude of the electric field flows through the cell membrane to the suspension and cytoplasm. Has been done. Non-Patent Document 1 discloses a technique in which an electric field is applied to a component in a cell, for example, a nuclear membrane, without destroying the cell membrane.

Ｋ．Ｈ．Ｓｃｈｏｅｎｂａｃｈ，”Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｈｏｒｔ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｐｕｌｓｅｓ”，Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃｓ，ｖｏｌ．２２，ｐｐ．４４０−４４６，２００１K. H. Schoenbach, “Intracellular effect of ultrashort electrical pulses”, Bioelectromagnetics, vol. 22, pp. 440-446, 2001

ところで、核、核小体、微小管、リボソーム、小胞体、ゴルジ体、リソソーム、中心体、分泌顆粒およびミトコンドリアなどの細胞内構成要素は、構造や構成分子の互いに異なる誘電性物質からなるＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）を含んでいる。これらＤＮＡおよびＲＮＡは、その構造や構成分子に応じた固有の緩和時間を有しており、この固有の緩和時間の大きさに応じた固有の共鳴周波数を有する。一方、パルス電界はパルス幅の逆数の整数倍を節とする多峰状の周波数スペクトラムを有しており、入力電力の一部がパルス幅の逆数と等しい周波数以下の周波数領域（裾野領域）に集中しており、残りは高周波側に広範囲に分散している。   By the way, intracellular constituent elements such as nucleus, nucleolus, microtubule, ribosome, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, lysosome, centrosome, secretory granule and mitochondria are DNAs composed of dielectric substances having different structures and constituent molecules ( Deoxyribonucleic acid) and RNA (ribonucleic acid). These DNA and RNA have a specific relaxation time corresponding to the structure and constituent molecules, and have a specific resonance frequency corresponding to the size of the specific relaxation time. On the other hand, the pulse electric field has a multi-peak frequency spectrum whose node is an integer multiple of the reciprocal of the pulse width, and a part of the input power is in a frequency region (base region) below the frequency equal to the reciprocal of the pulse width. It is concentrated and the rest is widely distributed on the high frequency side.

そのため、細胞膜の緩和時間以下のパルス幅のパルス電界を細胞に加えると、入力電力の一部は共鳴周波数がパルス幅の逆数より小さい誘電性物質を含む細胞内構成要素を刺激し、入力電力の大半は細胞内構成要素を刺激するために使われることなく消費される。したがって、上記した非特許文献１の記載のように、パルス電界の印加時間を制御したとしても、細胞内構成要素のうち任意に選択した要素を選択的に刺激することは極めて困難である。ここでの「刺激する」とは、電界強度と印加時間との積の大きさ（刺激の大きさ）に応じて生ずる物理的および化学的な作用を指しており、例えば、細胞内構成要素に含まれる誘電性物質を物理的に断片化することを指している。   Therefore, when a pulse electric field with a pulse width equal to or less than the relaxation time of the cell membrane is applied to the cell, part of the input power stimulates intracellular components containing a dielectric substance whose resonance frequency is smaller than the reciprocal of the pulse width. Most are consumed without being used to stimulate intracellular components. Therefore, even if the application time of the pulse electric field is controlled as described in Non-Patent Document 1 described above, it is extremely difficult to selectively stimulate any element selected from among the intracellular constituent elements. The term “stimulate” as used herein refers to a physical and chemical action that occurs in accordance with the magnitude of the product of the electric field strength and the application time (the magnitude of the stimulus). It refers to physically fragmenting the contained dielectric material.

また、パルス電界では、パルス幅を狭めると、節の位置が高周波側に移動して周波数スペクトラムが変わる。そのため、印加時間と、電力の入力される周波数帯域とを独立に制御することができず、その結果、用途に応じた刺激を細胞内構成要素に与えることが極めて困難である。   In the pulse electric field, when the pulse width is narrowed, the position of the node moves to the high frequency side and the frequency spectrum changes. Therefore, the application time and the frequency band to which power is input cannot be controlled independently, and as a result, it is extremely difficult to give a stimulus according to the application to the intracellular component.

したがって、パルス電界を細胞に印加することにより、任意の細胞内構成要素を選択的に刺激すると共に、用途に応じた刺激を細胞内構成要素に与えることは事実上不可能であるという問題がある。   Therefore, there is a problem that it is practically impossible to selectively stimulate any intracellular component by applying a pulsed electric field to the cell, and to give stimulation according to the application to the intracellular component. .

本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、目的および用途に応じた刺激を任意の細胞内構成要素に選択的に印加することの可能な細胞刺激装置を提供することにある。   The present invention has been made in view of such problems, and an object thereof is to provide a cell stimulator capable of selectively applying a stimulus according to the purpose and application to any intracellular component. It is in.

本発明の細胞刺激装置は、細胞内構成要素のうち任意に選択した要素に含まれる誘電性物質の緩和時間の逆数と等しい値の周波数を基本周波数とするバースト高周波電界を発生する電界発生手段を備える。「バースト高周波電界」とは、所定の時間の間、切れ目なく周期的に発生する交流電界のことである。このバースト高周波電界は、時間軸に関して基本周波数成分以外の周波数成分のほとんどない純度の非常に高い電界であり、入力電力の多くが基本周波数帯域に集中しているという特徴を有する。「細胞内構成要素」とは、例えば、核、核小体、微小管、リボソーム、小胞体、ゴルジ体、リソソーム、中心体、分泌顆粒およびミトコンドリアであり、「細胞内構成要素に含まれる誘電性物質」とは、ＤＮＡである。
The cell stimulating device of the present invention comprises an electric field generating means for generating a burst high-frequency electric field having a frequency equal to a reciprocal of a relaxation time of a dielectric substance contained in an arbitrarily selected element among intracellular components as a fundamental frequency. Prepare. The “burst high frequency electric field” is an alternating electric field that is periodically generated without a break for a predetermined time. This burst high-frequency electric field is a very high-purity electric field having almost no frequency components other than the fundamental frequency component with respect to the time axis, and has a feature that most of the input power is concentrated in the fundamental frequency band. “Intracellular component” means, for example, the nucleus, nucleolus, microtubule, ribosome, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, lysosome, centrosome, secretory granule, and mitochondria. “Substance” is DNA .

本発明の細胞刺激装置では、細胞内構成要素のうち任意に選択した要素に含まれる誘電性物質の緩和時間の逆数と等しい値の周波数を基本周波数とするバースト高周波電界が電界発生手段から発生し、細胞内構成要素に印加される。これにより、基本周波数の逆数と等しい値の緩和時間の誘電性物質を含む細胞内構成要素がバースト高周波電界から選択的に刺激を受ける。   In the cell stimulating device of the present invention, a burst high-frequency electric field having a frequency equal to the reciprocal of the relaxation time of the dielectric substance contained in an arbitrarily selected element among the intracellular constituent elements is generated from the electric field generating means. Applied to intracellular components. As a result, intracellular components including a dielectric substance having a relaxation time equal to the reciprocal of the fundamental frequency are selectively stimulated from the burst high-frequency electric field.

また、バースト高周波電界は、サイクル数を増やすことで印加時間を増やすことが可能であることから、基本周波数と印加時間とを独立に制御することができる。これにより、細胞内構成要素の受ける刺激の大きさを任意に設定することができるので、目的および用途に応じた刺激を細胞内構成要素に与えることができる。   Moreover, since it is possible to increase the application time of the burst high frequency electric field by increasing the number of cycles, the fundamental frequency and the application time can be controlled independently. Thereby, since the magnitude | size of the stimulus which an intracellular component receives can be set arbitrarily, the stimulus according to the objective and a use can be given to an intracellular component.

本発明の細胞刺激装置によれば、細胞内構成要素のうち任意に選択した要素に含まれる誘電性物質の緩和時間の逆数と等しい値の周波数を基本周波数とするバースト高周波電界を発生するようにしたので、任意の細胞内構成要素を選択的に刺激することができる。また、目的および用途に応じた刺激を細胞内構成要素に与えることもできる。これにより、目的および用途に応じた刺激を任意の細胞内構成要素に選択的に与えることが可能になる。   According to the cell stimulating device of the present invention, a burst high-frequency electric field having a frequency equal to the reciprocal of the relaxation time of the dielectric substance contained in an arbitrarily selected element among the intracellular constituent elements as a fundamental frequency is generated. Therefore, any intracellular component can be selectively stimulated. In addition, stimulation according to the purpose and application can be given to the intracellular components. This makes it possible to selectively give a stimulus according to the purpose and application to any intracellular component.

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。   Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.

図１は、本発明の一実施の形態に係る細胞刺激装置の概略構成を表すものである。図２は、この細胞刺激装置から刺激を受けることとなる細胞の一具体例を表すものである。この細胞刺激装置は、正弦波信号発生器１０と、この正弦波信号発生器１０に接続された一対の平行平板状の電極１１，１２（電界発生手段）とを備える。これら電極１１，１２は容器１３内に格納されている。容器１３内には懸濁液１５が満たされており、その懸濁液１５には複数の細胞１４が分散されている。なお、個々の細胞１４が懸濁液１５の中で分散されていることが好ましいが、接触し合っていてもよい。   FIG. 1 shows a schematic configuration of a cell stimulation apparatus according to an embodiment of the present invention. FIG. 2 shows a specific example of a cell to be stimulated from this cell stimulating device. This cell stimulation apparatus includes a sine wave signal generator 10 and a pair of parallel plate electrodes 11 and 12 (electric field generating means) connected to the sine wave signal generator 10. These electrodes 11 and 12 are stored in a container 13. The container 13 is filled with a suspension 15, and a plurality of cells 14 are dispersed in the suspension 15. In addition, although it is preferable that the individual cells 14 are dispersed in the suspension 15, they may be in contact with each other.

個々の細胞１４は、例えば、核２０、核小体２１、微小管２２、リボソーム２３、小胞体２４、ゴルジ体２５、リソソーム２６、中心体２７、分泌顆粒２８、ミトコンドリア２９などの細胞内構成要素を含む。核小体２１は核２０の内部にあり、一方、微小管２２、リボソーム２３、小胞体２４、ゴルジ体２５、リソソーム２６、中心体２７、分泌顆粒２８およびミトコンドリア２９は細胞質内にある。なお、細胞１４は、動物細胞および植物細胞のいずれでもよく、細胞壁で覆われていても覆われていなくてもよい。また何らかの前処理がなされていても、なされていなくてもよい。   Individual cells 14 include, for example, intracellular components such as nucleus 20, nucleolus 21, microtubule 22, ribosome 23, endoplasmic reticulum 24, Golgi apparatus 25, lysosome 26, centrosome 27, secretory granule 28, and mitochondria 29. including. Nucleolus 21 is inside nucleus 20, while microtubule 22, ribosome 23, endoplasmic reticulum 24, Golgi body 25, lysosome 26, centrosome 27, secretory granule 28 and mitochondria 29 are in the cytoplasm. The cell 14 may be either an animal cell or a plant cell, and may or may not be covered with a cell wall. Further, some pre-processing may be performed or may not be performed.

これら細胞内構成要素は、誘電性物質、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの高分子鎖状のタンパク質を含む。ここで誘電性物質は、その構造や構成分子に応じた固有の緩和時間を有し、この固有の緩和時間の大きさに応じた固有の共鳴周波数を有する。個々の誘電性物質の共鳴周波数は、細胞１４の種類や大きさなどによっても異なるが、おおよそ１ＭＨｚ以上１ＧＨｚ以下の範囲内に点在している。   These intracellular components include dielectric substances, for example, high molecular chain proteins such as DNA and RNA. Here, the dielectric material has a specific relaxation time corresponding to its structure and constituent molecules, and has a specific resonance frequency corresponding to the size of this specific relaxation time. The resonance frequency of each dielectric substance varies depending on the type and size of the cell 14, but is scattered within a range of approximately 1 MHz to 1 GHz.

正弦波信号発生器１０は、基本周波数がおおよそ１ＭＨｚ以上１ＧＨｚ以下の範囲内にある正弦波信号を所定の時間の間、切れ目なく周期的に生成することの可能な信号源を有している。この正弦波信号には、高調波や、低調波、非高調波、残留ＦＭ、ＳＳＢ位相雑音などの不要信号が含まれていないことが好ましいが、これら不要信号が含まれている場合は、これら不要信号によって一対の電極１１，１２から生じる電界の強度が、誘電性物質を刺激することのない程度に低いことが必要である。このように、正弦波信号は、基本周波数成分以外の周波数成分のほとんどない純度の非常に高い電界であり、入力電力の多くが基本周波数に集中しているという特徴を有する。   The sine wave signal generator 10 has a signal source that can periodically generate a sine wave signal having a fundamental frequency within a range of approximately 1 MHz to 1 GHz for a predetermined time. It is preferable that this sine wave signal does not include unnecessary signals such as harmonics, subharmonics, non-harmonics, residual FM, and SSB phase noise, but if these unnecessary signals are included, It is necessary that the intensity of the electric field generated from the pair of electrodes 11 and 12 by the unnecessary signal is low enough not to stimulate the dielectric substance. Thus, the sine wave signal is a very high-purity electric field having almost no frequency components other than the fundamental frequency component, and has a feature that most of the input power is concentrated on the fundamental frequency.

ここで「刺激する」とは、電界強度と印加時間との積の大きさ（刺激の大きさ）に応じて生ずる物理的および化学的な作用を指しており、例えば、細胞内構成要素に含まれる誘電性物質を物理的に断片化することを指している。誘電性物質を刺激することのない程度の電界強度は電界の印加時間によって異なり、印加時間が短ければ電界強度がある程度大きくても誘電性物質を刺激することはなく、逆に、印加時間が長くても電界強度がある程度低ければ誘電性物質を刺激することはない。ただし、印加時間が短くても電界強度があまりにも大きいと、電界によって細胞が加熱され死んでしまう虞がある。これらのことから、刺激の大きさは、ある一定の範囲内にあることがわかる。   Here, “stimulate” refers to a physical and chemical action that occurs in accordance with the magnitude of the product of the electric field strength and the application time (stimulus magnitude), and is included in, for example, an intracellular component. This refers to physically fragmenting the dielectric material. The electric field strength that does not stimulate the dielectric material varies depending on the application time of the electric field. If the application time is short, the dielectric material is not stimulated even if the electric field strength is large to some extent, and conversely, the application time is long. However, if the electric field strength is low to some extent, the dielectric material is not stimulated. However, even if the application time is short, if the electric field strength is too large, the cells may be heated and die by the electric field. From these things, it turns out that the magnitude | size of a stimulus exists in a certain fixed range.

一対の電極１１，１２は、正弦波信号発生器１０から生成された正弦波信号をバースト高周波電界に変えて細胞１４および懸濁液１５に印加するようになっている。このバースト高周波電界は、一対の電極１１，１２において正弦波信号から生成されたものであり、上記した正弦波信号と同様の特徴を有する。   The pair of electrodes 11 and 12 is adapted to change the sine wave signal generated from the sine wave signal generator 10 into a burst high-frequency electric field and apply it to the cell 14 and the suspension 15. This burst high-frequency electric field is generated from a sine wave signal at the pair of electrodes 11 and 12, and has the same characteristics as the above-described sine wave signal.

ここで電極１１，１２に挟まれた懸濁液１５は正弦波信号発生器１０の負荷であることから、正弦波信号発生器１０の出力インピーダンスＺｏと、負荷インピーダンスＺL とをインピーダンス整合することが好ましい。具体的には、以下の式に基づいて、電極１１，１２の間隔ｄや、電極１１，１２が互いに対向し合う面の面積Ｓが設定される。
Ｚｏ＝ＺL ＝ρ（ｄ／Ｓ）…（１） Here suspension 15 sandwiched between the electrodes 11 and 12 because it is the load of the sine wave signal generator 10, the output impedance Zo of the sine wave signal generator 10, to a load impedance Z L is the impedance matching Is preferred. Specifically, based on the following formula, the distance d between the electrodes 11 and 12 and the area S of the surface where the electrodes 11 and 12 face each other are set.
Zo = Z L = ρ (d / S) (1)

ただし、電極１１，１２に印加することの可能な電圧Ｖの範囲は正弦波信号発生器１０の仕様によって制限されている。そのため、細胞内構成要素を刺激することの可能な電界Ｅが電圧Ｖの印加により電極１１，１２の間に生じるようにすることが必要である。具体的には、以下の式に基づいて、電極１１，１２の間隔ｄが設定される。
ｄ＝Ｖ／Ｅ…（２） However, the range of the voltage V that can be applied to the electrodes 11 and 12 is limited by the specification of the sine wave signal generator 10. Therefore, it is necessary to generate an electric field E capable of stimulating intracellular components between the electrodes 11 and 12 by applying the voltage V. Specifically, the distance d between the electrodes 11 and 12 is set based on the following formula.
d = V / E (2)

次に、本実施の形態の正弦波信号の特徴について、パルス信号の特徴と対比して説明する。   Next, the characteristics of the sine wave signal of this embodiment will be described in comparison with the characteristics of the pulse signal.

図３（Ａ）は本実施の形態の正弦波信号の一具体例を時間軸領域で表すものであり、図３（Ｂ）は図３（Ａ）の波形を周波数領域で表すものである。図４（Ａ）は、比較例として、パルス信号の一具体例を時間領域で表すものであり、図４（Ｂ）は図４（Ａ）の波形を周波数領域で表すものである。なお、図３（Ａ），（Ｂ）は、基本周波数が５０ＭＨｚ、印加時間が１μｓの正弦波信号の様子を、図４（Ａ），（Ｂ）は、パルス幅が６０ｎｓ、立ち上がり時間および立ち下がり時間が共に６ｎｓのパルス信号の様子をそれぞれ表す。また、図３（Ａ），図４（Ａ）の縦軸は時間領域での振幅電圧を、図３（Ｂ），図４（Ｂ）の縦軸は各周波数成分の振幅電圧の実効値をそれぞれ表す。   FIG. 3A shows a specific example of the sine wave signal of this embodiment in the time axis region, and FIG. 3B shows the waveform of FIG. 3A in the frequency region. 4A shows a specific example of a pulse signal as a comparative example in the time domain, and FIG. 4B shows the waveform of FIG. 4A in the frequency domain. 3A and 3B show a sine wave signal having a fundamental frequency of 50 MHz and an application time of 1 μs, and FIGS. 4A and 4B show a pulse width of 60 ns, a rise time and a rise time. Each of the fall times represents a state of a pulse signal of 6 ns. 3A and 4A, the vertical axis represents the amplitude voltage in the time domain, and the vertical axis in FIGS. 3B and 4B represents the effective value of the amplitude voltage of each frequency component. Represent each.

パルス信号は、パルス幅の逆数の整数倍を節とする多峰状の周波数スペクトラムを有している。また、パルス信号の時間領域での振幅電圧をＶｆｄ１（＝１．１Ｖ）、パルス幅の逆数と等しい周波数以下の周波数領域（裾野領域）での振幅電圧の実効値をＶｔｄ１（＝０．１０５Ｖｒｍｓ）とすると、Ｖｔｄ１に２0.5 を掛けた値と、Ｖｆｄ１との比（（Ｖｔｄ１ｘ２0.5 ）／Ｖｆｄ１）がおよそ０．１３であることから、入力電力の一部が裾野領域に集中しており、残りは高周波側に広範囲に分散していることがわかる。これにより、細胞膜の緩和時間以下のパルス幅のパルス電界が細胞に加えられると、共鳴周波数がパルス幅の逆数より小さい誘電性物質を含む各種の細胞内構成要素が刺激されることとなる。したがって、パルス電界の印加時間を調整したとしても、所定の細胞内構成要素を選択的に刺激することは極めて困難である。 The pulse signal has a multimodal frequency spectrum whose node is an integer multiple of the reciprocal of the pulse width. Also, the amplitude voltage in the time domain of the pulse signal is Vfd1 (= 1.1 V), and the effective value of the amplitude voltage in the frequency domain (bottom region) equal to or lower than the reciprocal of the pulse width is Vtd1 (= 0.105 Vrms). When a value obtained by multiplying the Vtd1 2 0.5, since the ratio of Vfd1 ((Vtd1x2 0.5) / Vfd1 ) is approximately 0.13, part of the input power is concentrated in the foot region, the remaining It can be seen that is widely dispersed on the high frequency side. Thus, when a pulse electric field having a pulse width equal to or less than the relaxation time of the cell membrane is applied to the cell, various intracellular components including a dielectric substance whose resonance frequency is smaller than the reciprocal of the pulse width are stimulated. Therefore, even if the application time of the pulse electric field is adjusted, it is extremely difficult to selectively stimulate predetermined intracellular components.

また、パルス電界では、パルス幅を狭めると、節の位置が高周波側に移動して周波数スペクトラムが変わる。そのため、印加時間と、電力の入力される周波数帯域とを独立に制御することができず、その結果、目的および用途に応じた刺激を細胞内構成要素に与えることが極めて困難である。   In the pulse electric field, when the pulse width is narrowed, the position of the node moves to the high frequency side and the frequency spectrum changes. For this reason, the application time and the frequency band into which power is input cannot be controlled independently, and as a result, it is extremely difficult to give stimulation according to the purpose and application to the intracellular components.

一方、本実施の形態の正弦波信号は、基本周波数（５０ＭＨｚ）成分以外の周波数成分のほとんどない純度の非常に高い信号である。また、正弦波信号の時間領域での振幅電圧をＶｆｄ２（＝１．０Ｖ）、基本周波数での振幅電圧の実効値をＶｔｄ２（＝０．４０Ｖｒｍｓ）とすると、Ｖｔｄ２に２0.5 を掛けた値と、Ｖｆｄ２との比（（Ｖｔｄ２ｘ２0.5 ）／Ｖｆｄ２）がおよそ０．５６であることから、入力電力のほとんどは基本周波数領域に集中していることがわかる。これにより、細胞内構成要素のうち任意に選択した要素に含まれる誘電性物質の緩和時間の逆数と等しい値の周波数を基本周波数とするバースト高周波電界が一対の平行平板状の電極１１，１２から発生し、細胞内構成要素に印加されと、基本周波数の逆数と等しい値の緩和時間の誘電性物質を含む細胞内構成要素が選択的に刺激を受けることとなる。したがって、任意の細胞内構成要素を選択的に刺激することができる。 On the other hand, the sine wave signal of the present embodiment is a signal having a very high purity with almost no frequency components other than the fundamental frequency (50 MHz) component. The amplitude voltage Vfd2 (= 1.0V) in the time domain of a sinusoidal signal, when the effective value of the amplitude voltage at the fundamental frequency and Vtd2 (= 0.40Vrms), a value obtained by multiplying the Vtd2 2 0.5 , Vfd2 ratio ((Vtd2 × 2 0.5 ) / Vfd2) is approximately 0.56, which indicates that most of the input power is concentrated in the fundamental frequency region. As a result, a burst high-frequency electric field having a frequency equal to the reciprocal of the relaxation time of the dielectric substance contained in an arbitrarily selected element among the intracellular constituent elements is generated from the pair of parallel plate electrodes 11 and 12. When generated and applied to an intracellular component, the intracellular component containing a dielectric material with a relaxation time equal to the inverse of the fundamental frequency is selectively stimulated. Thus, any intracellular component can be selectively stimulated.

なお、このように入力電力のほとんどが基本周波数領域に集中していることから、細胞内構成要素を刺激するために大きな電力のバースト高周波電界を入力する必要はない。   Since most of the input power is concentrated in the fundamental frequency region as described above, it is not necessary to input a burst high frequency electric field with a large power in order to stimulate the intracellular components.

また、正弦波信号は、サイクル数を増やすことで印加時間を増やすことが可能であることから、基本周波数と印加時間とを独立に制御することができる。これにより、細胞内構成要素の受ける刺激の大きさを任意に設定することができるので、目的および用途に応じた刺激を細胞内構成要素に与えることができる。   Further, since the application time of the sine wave signal can be increased by increasing the number of cycles, the fundamental frequency and the application time can be controlled independently. Thereby, since the magnitude | size of the stimulus which an intracellular component receives can be set arbitrarily, the stimulus according to the objective and a use can be given to an intracellular component.

このように、本実施の形態の細胞刺激装置によれば、細胞内構成要素のうち任意に選択した要素に含まれる誘電性物質の緩和時間の逆数と等しい値の周波数を基本周波数とする正弦波信号（バースト高周波電界）を発生するようにしたので、任意の細胞内構成要素を選択的に刺激することができる。また、目的および用途に応じた刺激を細胞内構成要素に与えることもできる。これにより、目的および用途に応じた刺激を任意の細胞内構成要素に選択的に与えることが可能になる。
［実施例］ Thus, according to the cell stimulation apparatus of the present embodiment, a sine wave having a frequency equal to the reciprocal of the relaxation time of the dielectric substance contained in an arbitrarily selected element among the intracellular components as a fundamental frequency. Since a signal (burst radio frequency electric field) is generated, any intracellular component can be selectively stimulated. In addition, stimulation according to the purpose and application can be given to the intracellular component. This makes it possible to selectively give a stimulus according to the purpose and application to any intracellular component.
[Example]

次に、上記実施の形態に係る実施例について説明する。   Next, examples according to the above embodiment will be described.

本実施例では、細胞内構成要素の経過を観察することができるように、容器１４上部に共焦点レーザ顕微鏡（図示せず）を設けると共に、ＣＨＯ（Chinese Hamster Ovary ：チャイニーズハムスターの卵巣) 細胞のうち特定の細胞内構成物質に含まれるＤＮＡと色素結合する蛍光色素としてのアクリジンオレンジ（ＡＯ：Acridine Orange ）を懸濁液１５に混入した。   In this example, a confocal laser microscope (not shown) is provided on the top of the container 14 so that the progress of intracellular components can be observed, and CHO (Chinese Hamster Ovary) cells Among them, acridine orange (AO) as a fluorescent dye that binds to DNA contained in a specific intracellular constituent substance was mixed into the suspension 15.

また、懸濁液１５を、抵抗率が１００Ωｃｍの培養液により構成し、平行平板状の電極１１，１２を、プラチナにより構成し、表面積が０．４ｃｍ2 の面が０．２ｍｍの間隔で対向配置した。容器１３を、アクリルにより構成した。 The suspension 15 is composed of a culture solution having a resistivity of 100 Ωcm, the parallel plate electrodes 11 and 12 are composed of platinum, and the surfaces having a surface area of 0.4 cm 2 face each other at intervals of 0.2 mm. Arranged. The container 13 was made of acrylic.

正弦波信号発生器１０を、基本周波数が５０ＭＨｚ、ゼロ・ピーク振幅電圧が２００Ｖ、印加時間が１００μｓの正弦波信号が発生するように設定した。これにより、一対の電極１１，１２から細胞１４および懸濁液１５に１ｋＶ／ｃｍのバースト高周波電界を印加することが可能となる。   The sine wave signal generator 10 was set to generate a sine wave signal having a fundamental frequency of 50 MHz, a zero peak amplitude voltage of 200 V, and an application time of 100 μs. Thereby, a burst high-frequency electric field of 1 kV / cm can be applied from the pair of electrodes 11 and 12 to the cell 14 and the suspension 15.

図５（Ａ），（Ｂ）は、上記したバースト高周波電界を細胞１４および懸濁液１５に印加したのちの細胞１４の経過を数分間隔で表すものである。図５（Ａ）は明視野での細胞１４の様子を、図５（Ｂ）はＤＮＡと色素結合したアクリジンオレンジの蛍光の様子をそれぞれ数分間隔で表すものである。図６は、細胞１４にバースト高周波電界を印加していないときと、細胞１４にバースト高周波電界を印加したときのアクリジンオレンジ発光強度の経時変化を表すものである。   5A and 5B show the progress of the cell 14 after applying the burst high-frequency electric field to the cell 14 and the suspension 15 at intervals of several minutes. FIG. 5A shows the state of the cell 14 in a bright field, and FIG. 5B shows the state of fluorescence of acridine orange bonded to DNA and dye at intervals of several minutes. FIG. 6 shows changes over time in the acridine orange emission intensity when no burst high-frequency electric field is applied to the cell 14 and when a burst high-frequency electric field is applied to the cell 14.

なお、比較例として、基本周波数が２０ｋＨｚ、ゼロ・ピーク振幅電圧が２００Ｖ、印加時間が１００μｓのバースト高周波電界を印加したときの細胞１４の経過を図７（Ａ），（Ｂ）に示す。また、細胞１４にバースト高周波電界を印加していないときと、細胞１４に比較例に係るバースト高周波電界を印加したときのアクリジンオレンジの発光強度の経時変化を図８に示す。   As a comparative example, FIGS. 7A and 7B show the course of the cell 14 when a burst high-frequency electric field having a fundamental frequency of 20 kHz, a zero peak amplitude voltage of 200 V, and an application time of 100 μs is applied. Further, FIG. 8 shows changes with time in emission intensity of acridine orange when no burst high-frequency electric field is applied to the cell 14 and when a burst high-frequency electric field according to the comparative example is applied to the cell 14.

比較例のバースト高周波電界が印加された細胞１４では、細胞外でアクリジンオレンジの蛍光が確認できる。バースト高周波電界の周波数が１ＭＨｚより小さいため、電界による機械的なストレスにより細胞膜が破れ、ＤＮＡが細胞の外へ漏出しているものと推察される。一方、本実施の形態のバースト高周波電界が印加された細胞１４では、細胞外でアクリジンオレンジの蛍光が全く確認できない。バースト高周波電界の周波数が１ＭＨｚ以上１ＧＨｚ以下であるため、細胞膜は電界から何らの影響を受けておらず、ＤＮＡが細胞の外へ漏出していないものと推察される。   In the cell 14 to which the burst high frequency electric field of the comparative example is applied, fluorescence of acridine orange can be confirmed outside the cell. Since the frequency of the burst high-frequency electric field is smaller than 1 MHz, it is assumed that the cell membrane is broken by mechanical stress due to the electric field and the DNA leaks out of the cell. On the other hand, in the cell 14 to which the burst high-frequency electric field of the present embodiment is applied, no fluorescence of acridine orange can be confirmed outside the cell. Since the frequency of the burst high-frequency electric field is 1 MHz or more and 1 GHz or less, the cell membrane is not affected at all by the electric field, and it is assumed that DNA does not leak out of the cell.

また、比較例および実施例ともに、細胞質および核２１内でアクリジンオレンジの発光強度が時間の経過と共に減少している。比較例では、主にＤＮＡが細胞の外へ漏出したことが原因であると考えられるが、実施例では、ＤＮＡは細胞の外へ漏出していないことから、ＤＮＡがバースト高周波電界から何らかの刺激を受け、例えば断片化されるなどして変質したことが原因であると考えられる。   In both the comparative example and the example, the emission intensity of acridine orange decreases in the cytoplasm and nucleus 21 over time. In the comparative example, it is considered that the cause is mainly that the DNA leaked out of the cell. However, in the example, since the DNA did not leak out of the cell, the DNA was subjected to some stimulation from the burst high-frequency electric field. It is thought that this is caused by, for example, fragmentation and alteration.

これより、基本周波数が５０ＭＨｚのバースト高周波電界を細胞１４に印加することにより、ＣＨＯ細胞（細胞１４）のうち特定の細胞内構成物質に含まれるＤＮＡを選択的に刺激することができることがかわる。   This indicates that by applying a burst high-frequency electric field having a fundamental frequency of 50 MHz to the cell 14, DNA contained in a specific intracellular constituent substance in the CHO cell (cell 14) can be selectively stimulated.

以上、実施の形態および実施例を挙げて本発明を説明したが、本発明は、これらに限定されるものではなく、種々の変形が可能である。   While the present invention has been described with reference to the embodiment and examples, the present invention is not limited to these, and various modifications are possible.

例えば、上記実施の形態では、生体から採取した細胞を対象としていたが、本発明はこれに限定されるものではなく、生体内の細胞を対象としてもよい。ただし、この場合には、電極構造を平行平板状からアンテナ状にして、そのアンテナ状の電極から生体内の細胞（例えば、ガン細胞）に向けてバースト高周波電界を発信することが好ましい。   For example, in the above embodiment, the cells collected from the living body are targeted. However, the present invention is not limited to this, and the cells in the living body may be targeted. However, in this case, it is preferable that the electrode structure is changed from a parallel plate shape to an antenna shape, and a burst high-frequency electric field is transmitted from the antenna-shaped electrode toward cells (for example, cancer cells) in the living body.

本発明の一実施の形態に係る細胞刺激装置の概略構成図である。It is a schematic block diagram of the cell stimulation apparatus which concerns on one embodiment of this invention. 細胞の概略構成図である。It is a schematic block diagram of a cell. 正弦波信号の特徴を説明するための波形図である。It is a wave form diagram for demonstrating the characteristic of a sine wave signal. パルス信号の特徴を説明するための波形図である。It is a wave form diagram for demonstrating the characteristic of a pulse signal. 実施例での細胞の経過を表した図である。It is a figure showing progress of a cell in an example. 実施例での細胞の経過を表した図である。It is a figure showing progress of a cell in an example. 比較例での細胞の経過を表した図である。It is a figure showing progress of a cell in a comparative example. 比較例での細胞の経過を表した図である。It is a figure showing progress of a cell in a comparative example.

符号の説明Explanation of symbols

１０…正弦波信号発生器、１１，１２…電極、１３…容器、１４…細胞、１５…懸濁液、２０…核、２１…核小体、２２…微小管、２３…リボソーム、２４…小胞体、２５…ゴルジ体、２６…リソソーム、２７…中心体、２８…分泌顆粒、２９…ミトコンドリア。
DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 ... Sinusoidal signal generator, 11, 12 ... Electrode, 13 ... Container, 14 ... Cell, 15 ... Suspension, 20 ... Nucleus, 21 ... Nucleolus, 22 ... Microtubule, 23 ... Ribosome, 24 ... Small Endoplasmic reticulum, 25 ... Golgi apparatus, 26 ... lysosome, 27 ... centrosome, 28 ... secretory granule, 29 ... mitochondria.

Claims (3)

細胞内構成要素のうち任意に選択した要素に含まれるＤＮＡの緩和時間の逆数と等しい値の周波数を基本周波数とするバースト高周波電界を発生する電界発生手段
を備えたことを特徴とする細胞刺激装置。 A cell stimulator comprising: an electric field generating means for generating a burst high-frequency electric field having a frequency equal to a reciprocal of the relaxation time of DNA contained in an element selected from among the intracellular constituent elements as a fundamental frequency . 前記基本周波数は、１ＭＨｚ以上１ＧＨｚ以下である
ことを特徴とする請求項１に記載の細胞刺激装置。 The cell stimulation apparatus according to claim 1, wherein the fundamental frequency is 1 MHz or more and 1 GHz or less. 前記バースト高周波電界の電界強度と印加時間との積が所定の範囲内となるように、前記バースト高周波電界の電界強度および印加時間がそれぞれ設定される
ことを特徴とする請求項１に記載の細胞刺激装置。 2. The cell according to claim 1, wherein the electric field intensity and the application time of the burst high-frequency electric field are set so that the product of the electric field intensity of the burst high-frequency electric field and the application time is within a predetermined range. Stimulator.
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