JP4703922B2

JP4703922B2 - Protein purification method

Info

Publication number: JP4703922B2
Application number: JP2001296433A
Authority: JP
Inventors: 隆佐藤; 浩明藤田
Original assignee: Nihon Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Nihon Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2001-09-27
Filing date: 2001-09-27
Publication date: 2011-06-15
Anticipated expiration: 2021-09-27
Also published as: JP2003096095A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脂質を含有するヒト血漿由来の蛋白質沈殿画分、特にハプトグロ沈殿画分ビンから、迅速且つ簡便に脂質を除去する蛋白質の精製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医薬として用いられるヒト血漿由来の蛋白質には種々のものがあるが、それらは生理活性の分離、副作用の抑制などの観点からいずれもできる限り精製されたものであることが望ましい。ハプトグロビンは分子量８万５千〜４０万のヒト血漿由来の蛋白質の一種であり、遊離しているヘモグロビンと特異的に結合して複合体を形成し、代謝経路である肝臓に運ばれる。しかしハプトグロビンの量が遊離のヘモグロビン量よりも少ないと、遊離ヘモグロビンが血漿中に存在することになり、その結果としてヘモグロビン血症やヘモグロビン尿症などを引き起こす。火傷、輸血、外科手術の際には、溶血により大量の遊離ヘモグロビンが組織や血中に生成してくるので、それによって引き起こされるヘモグロビン血症やヘモグロビン尿症の予防、治療のためにハプトグロビンの投与は有効とされている。ハプトグロビンは、たとえばヒト血漿のα−およびβ−グロブリン画分より抽出精製されることが知られている（日本国特許第９５８７７４号）。ところで、当該画分には脂質等の夾雑物（例えば、リポ蛋白など）が含まれているために、当該画分の水溶液は混濁している。そこで、その水溶液を清澄化して、その後の操作を円滑に進めることが必要となる。この方法としては、ヒト血漿のα−およびβ−グロブリン画分の水溶液にアクリノールを添加して夾雑物を沈殿させ、上清を回収した後、アクリノールを除くために透析又は吸着処理を行う方法、又はコロイド珪酸と接触させる方法（特開昭６３−１７８９９）が知られている。しかしこれらの方法は、操作が複雑であり、効果も十分ではなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況のもとに、本発明は、脂質を含むヒト血漿由来の蛋白質溶液から簡便且つ迅速に脂質を分離、除去して、脂質含量が低減された蛋白質、特にハプトグロビンを迅速且つ簡便に取得することを目的としている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため種々研究を重ねた結果、原料として例えば、コーンの低温エタノール分画法による第IV、IV−１またはIV−４画分を、水溶性ポリマーを含む緩衝液と接触させると、脂質は溶解せず蛋白質は溶解してくるので、その上清から蛋白質、特にハプトグロビンを採取するという方法によって、容易且つ迅速に脂質含量の低減された蛋白質画分が得られることを知見し、その知見に基づいてさらに研究を重ねて本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）コーンの低温エタノール分画法による第IV−４沈殿画分を水溶性ポリマーを含む緩衝液と接触させ、その上清から蛋白質を採取することを特徴とする蛋白質の精製法、
（２）蛋白質がハプトグロビンである（１）記載の精製法、
（３）水溶性ポリマーが分子量４００〜１００００のポリオキシエチレングリコールである（１）又は（２）記載の精製法、
（４）緩衝液がリン酸緩衝液、酢酸緩衝液およびクエン酸緩衝液から選ばれた少なくとも１種である（１）又は（２）記載の精製法、および
（５）水溶性ポリマーを含む緩衝液が、水溶性ポリマーを０．５〜１０．０ｗ／ｖ％含む０．１〜３００ｍＭ濃度の緩衝液である（１）又は（２）記載の精製法、
である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の原料として用いられるヒト血漿由来の蛋白質画分は、α−およびβ−グロブリン画分、コーン低温エタノール分画法の第IV、IV-１、IV−４等の各沈殿画分から調製することができる。これらの蛋白質沈殿画分は、通常コレステロール、リン脂質等の脂質を比較的豊富に含んでいることが多い。
【０００７】
本発明では脂質を含む原料蛋白質を先ず水溶性ポリマーを含む緩衝液と接触させる。この操作により、蛋白質は緩衝液中に溶解し、脂質は液中に不溶物として残存してくる。水溶性ポリマーは、分子中に水酸基等の親水性基を有し、水と混じり合う性質を有するポリマーであり、ポリエチレングリコール（分子量４００〜１０，０００）、デキストラン、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどが例として挙げられるが、好ましいものは分子量１０００〜６０００のポリエチレングリコールである。緩衝液はリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液などが挙げられるが、リン酸緩衝液やリン酸−ＮａＣｌ緩衝液が好ましい。緩衝液のｐＨは、通常４．５〜７．０、好ましくは４．８〜６．０である。また混合液中の緩衝液の濃度は、０．１〜３００ｍＭ、好ましくは、１〜１００ｍＭ、さらに好ましくは５〜５０ｍＭである。
【０００８】
水溶性ポリマーを含む緩衝液中の水溶性ポリマーの濃度は、通常０．５〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは２〜６％（ｗ／ｖ）である。接触は、１分〜２時間、好ましくは１０分〜１時間行う。接触時の温度は、常温又は冷却下に行うのがよい。接触は、回分式でもよく、また連続式でもよい。このようにして得られた液から脂質を含む不溶物を除去する。不溶物の除去は、どのような方法でもよいが、通常フィルターによる濾過又は遠心分離が好ましい。
【０００９】
濾液に、例えば、硫酸アンモニウムを加え、沈殿物を採取する。沈殿物を水に溶解し、いわゆるウイルス不活化のための加熱処理（通常５０〜７０℃、１〜２４時間）を行う。
加熱処理した液を、必要により陰イオン交換クロマトグラフィーにかけて精製する。得られた蛋白質溶液、とくにハプトグロビン溶液は、さらに公知の製剤化技術を組み合わせることにより、臨床上適応できる蛋白製剤、特にハプトグロビン製剤とすることができる。例えば、安定化剤、賦形剤等の添加、小分け分注、透析、限外濾過、凍結乾燥等を施すことができる。
【００１０】
【実施例】
以下に実施例、比較例および実験例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
実施例１
ヒト血漿由来のコーン低温エタノール分画法で分画したIV−４沈殿画分各１４ｇに、ＰＥＧ４０００を０〜１０ｗ／ｖ％含む２０ｍＭリン酸−１０ｍＭＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ４．９）１５ミリリットルを加えて、室温下約１５分攪拌し、フィルターで濾過して濾液を採取した。
【００１１】
比較例１
ＰＥＧ４０００を含まない２０ｍＭリン酸−１０ｍＭＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ４．９）を用いて実施例１と同様の方法で抽出操作を行った。
試験例１
実施例１および比較例１で得られた濾液中の総リン脂質、コレステロールの量および蛋白（ハプトグロビン）量を測定し、〔表１〕に示す結果を得た。
【００１２】
【表１】

上記〔表１〕から明らかなように、リン酸−ＮａＣｌ緩衝液単独使用に比して、ＰＥＧ４０００を併用した場合は、脂質含量が大幅に低減された。
【００１３】
【発明の効果】
本発明は、ヒト血漿由来の蛋白質画分、特にコーン低温エタノール分画法による第IV−４沈殿画分等を、水溶性ポリマーを含む緩衝液で処理（抽出）するだけで、簡便且つ迅速に脂質含量の低減された蛋白質溶液を得ることができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for purifying a protein that quickly and easily removes a lipid from a human plasma-derived protein precipitate fraction containing lipid, particularly a haptoglobulin precipitate fraction bottle.
[0002]
[Prior art]
There are various proteins derived from human plasma used as pharmaceuticals, and it is desirable that they are as purified as possible from the viewpoints of separation of physiological activity and suppression of side effects. Haptoglobin is a kind of protein derived from human plasma having a molecular weight of 85,000 to 400,000, and specifically binds to free hemoglobin to form a complex and is transported to the liver, which is a metabolic pathway. However, if the amount of haptoglobin is less than the amount of free hemoglobin, free hemoglobin will be present in the plasma, resulting in hemoglobinemia and hemoglobinuria. During burns, blood transfusions, and surgery, hemolysis produces a large amount of free hemoglobin in tissues and blood. Is considered valid. It is known that haptoglobin is extracted and purified from, for example, α- and β-globulin fractions of human plasma (Japanese Patent No. 958774). By the way, since the fraction contains impurities such as lipids (for example, lipoproteins), the aqueous solution of the fraction is turbid. Therefore, it is necessary to clarify the aqueous solution and smoothly proceed with subsequent operations. This method includes adding acrinol to an aqueous solution of α- and β-globulin fractions of human plasma to precipitate impurities, collecting the supernatant, and then performing dialysis or adsorption treatment to remove acrinol, Alternatively, a method of contacting with colloidal silicic acid (Japanese Patent Laid-Open No. 63-17899) is known. However, these methods, the operation Ri complex Oh, the effect was not sufficient.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Under such circumstances, the present invention can easily and quickly separate and remove lipids from a human plasma-derived protein solution containing lipids to quickly and easily remove proteins with reduced lipid content, particularly haptoglobin. The purpose is to get.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
As a result of repeating various studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors include, as a raw material, for example, the IV, IV-1 or IV-4 fractions obtained by low-temperature ethanol fractionation of corn, which contain a water-soluble polymer. When contacted with a buffer solution, the lipid does not dissolve and the protein dissolves. Therefore, a protein fraction with reduced lipid content can be obtained easily and quickly by collecting protein, particularly haptoglobin, from the supernatant. The present invention was completed through further research based on this knowledge.
[0005]
That is, the present invention
(1) A method for purifying a protein comprising contacting the IV-4 precipitate fraction by a low temperature ethanol fractionation method of corn with a buffer containing a water-soluble polymer, and collecting the protein from the supernatant,
(2) 蛋 white matter is haptoglobin (1) purification method described,
(3) The purification method according to (1) or (2), wherein the water-soluble polymer is polyoxyethylene glycol having a molecular weight of 400 to 10,000.
(4) The purification method according to (1) or (2), wherein the buffer is at least one selected from a phosphate buffer, an acetate buffer, and a citrate buffer, and (5) a buffer containing a water-soluble polymer. The purification method according to (1) or (2), wherein the liquid is a buffer solution having a concentration of 0.1 to 300 mM containing 0.5 to 10.0 w / v% of a water-soluble polymer,
It is.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The protein fraction derived from human plasma used as a raw material of the present invention is prepared from the α- and β-globulin fractions and the precipitated fractions such as IV, IV-1 and IV-4 of the corn cold ethanol fractionation method. be able to. These proteins precipitated fraction is usually cholesterol, often contain lipids such as Li down lipids relatively rich.
[0007]
In the present invention, a raw material protein containing lipid is first brought into contact with a buffer containing a water-soluble polymer. By this operation, the protein is dissolved in the buffer solution, and the lipid remains as an insoluble matter in the solution. The water-soluble polymer is a polymer having a hydrophilic group such as a hydroxyl group in the molecule and having a property of being mixed with water, such as polyethylene glycol (molecular weight 400 to 10,000), dextran, methylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, etc. As an example, polyethylene glycol having a molecular weight of 1000 to 6000 is preferable. Examples of the buffer solution include a phosphate buffer solution, an acetate buffer solution, and a citrate buffer solution, and a phosphate buffer solution and a phosphate-NaCl buffer solution are preferable. The pH of the buffer is usually 4.5 to 7.0, preferably 4.8 to 6.0. Moreover, the density | concentration of the buffer solution in a liquid mixture is 0.1-300 mM, Preferably, it is 1-100 mM, More preferably, it is 5-50 mM .
[0008]
The concentration of the water-soluble polymer in the buffer containing the water-soluble polymer is usually 0.5 to 10% (w / v), preferably 2 to 6% (w / v) . Contact touch is 1 minute to 2 hours, preferably performed 10 minutes to 1 hour. The temperature at the time of contact is preferably normal temperature or under cooling. Contact may be batch-wise or continuous. The insoluble matter containing lipid is removed from the liquid thus obtained. Any method may be used to remove the insoluble matter, but filtration by a filter or centrifugation is usually preferred.
[0009]
For example, ammonium sulfate is added to the filtrate, and the precipitate is collected. The precipitate is dissolved in water and subjected to a heat treatment (usually 50 to 70 ° C. for 1 to 24 hours) for so-called virus inactivation.
If necessary, the heat-treated liquid is purified by anion exchange chromatography. The obtained protein solution, especially a haptoglobin solution, can be made into a protein preparation that can be clinically applied, particularly a haptoglobin preparation, by combining known formulation techniques. For example, addition of stabilizers, excipients, etc., aliquoting, dialysis, ultrafiltration, lyophilization and the like can be performed.
[0010]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, comparative examples, and experimental examples.
Example 1
15 ml of 20 mM phosphate-10 mM NaCl buffer (pH 4.9) containing 0 to 10 w / v% of PEG4000 was added to each 14 g of the IV-4 precipitate fraction fractionated by the corn cryogenic ethanol fractionation method derived from human plasma. The mixture was stirred at room temperature for about 15 minutes, filtered through a filter, and the filtrate was collected.
[0011]
Comparative Example 1
Extraction operation was performed in the same manner as in Example 1 using 20 mM phosphate-10 mM NaCl buffer (pH 4.9) not containing PEG4000.
Test example 1
The total phospholipid, the amount of cholesterol and the amount of protein (haptoglobin) in the filtrates obtained in Example 1 and Comparative Example 1 were measured, and the results shown in [Table 1] were obtained.
[0012]
[Table 1]

As is clear from the above [Table 1], when PEG 4000 was used in combination, the lipid content was significantly reduced as compared with the use of the phosphate-NaCl buffer alone.
[0013]
【The invention's effect】
The present invention is simple and quick by simply treating (extracting) a protein fraction derived from human plasma, particularly the IV- 4 precipitate fraction by the corn low temperature ethanol fractionation method, with a buffer containing a water-soluble polymer. A protein solution with a reduced lipid content can be obtained.

Claims

A method for purifying a protein comprising contacting the IV-4 precipitate fraction by a low temperature ethanol fractionation method of corn with a buffer containing a water-soluble polymer, and collecting the protein from the supernatant.

Purification method of claim 1 蛋 white matter is haptoglobin.

The purification method according to claim 1 or 2, wherein the water-soluble polymer is polyoxyethylene glycol having a molecular weight of 400 to 10,000.

The purification method according to claim 1 or 2, wherein the buffer is at least one selected from a phosphate buffer, an acetate buffer, and a citrate buffer.

The purification method according to claim 1 or 2, wherein the buffer solution containing the water-soluble polymer is a buffer solution having a concentration of 0.1 to 300 mM containing 0.5 to 10.0 w / v% of the water-soluble polymer.