JP4691968B2 - 微生物検出方法及び微生物検出装置 - Google Patents
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Description
吉田 雅一、「酸素電極法(DOX)による微生物検出技術の現状と将来像」、ジャパンフードサイエンス、日本食品出版株式会社、2003年1月、42巻、p.73−79
前記測定対象物を添加した一般生菌用液体培地または前記特定の微生物を含む広範囲の菌種類を培養可能な液体培地で前記液体培地に含まれる微生物群を培養するとともに微生物群濃度が所定値に達するまで培養を行い、前記微生物群濃度が所定値に達することに基づいて前記特定の微生物が存在している旨を推定する第1工程と、触媒で標識した免疫測定試薬を用いて、前記微生物群濃度が前記所定値である前記液体培地に含まれる特定の微生物に対して特定の特異反応を生じせしめる第2工程と、前記特定の微生物を前記特異反応に基づいて分離して前記触媒と反応する基質を含む溶液中に加え、前記触媒と前記基質による反応に基づいて変化する特定物質の溶存量を電極により測定することにより、前記特定の微生物を検出する第3工程とを含むことを要旨としている。
これによれば、微生物群濃度が所定値に達した場合に、電極を用いて、免疫測定試薬に標識された触媒と基質との反応に基づいて特定の微生物を検出することにより、特定の微生物の検出を、より簡易かつ迅速に行うことができる。
これによれば、第1工程における微生物群濃度の測定と、第3工程における特定の微生物の検出とを同じ方法を用いて行うことができる。
(4)請求項4に記載の発明は、請求項1〜3のいずれか一項に記載の微生物検出方法において、前記免疫測定試薬は、前記触媒で標識された標識体と前記特定の微生物を捕捉可能な捕捉体とを含むものであり、前記標識体および前記捕捉体は、前記特定の微生物と特異反応する抗体またはリガンドであることを要旨としている。
これによれば、触媒で標識された抗体と捕捉体とを特定の微生物に結合させることができる。このため、捕捉体を用いて、触媒で標識された抗体が結合した特定の微生物を分離できる。そして、分離された微生物に結合した抗体に標識された触媒と基質による反応に基づいて、特定の微生物を検出できる。
(5)請求項5に記載の発明は、請求項1〜3のいずれか一項に記載の微生物検出方法において、前記免疫測定試薬は、前記触媒により標識された標識体と前記特定の微生物を構成する抗原と結合可能な捕捉体とを含むものであり、前記標識体および前記捕捉体は、前記抗原であることを要旨としている。
これによれば、特定の微生物の抗原と免疫測定試薬中の抗原とが、競合的に捕捉体に結合する。つまり、特定の微生物と触媒により標識された抗原とが、競合的に捕捉体に結合する。従って、これらが結合した捕捉体を、基質を含む溶液に投入することにより、特定の微生物の検出を行うことができる。
これによれば、電極を用いて特定物質の溶存量を測定する測定手段を用いて、微生物の代謝に基づく微生物の濃度の測定と、特定の微生物の検出のための免疫測定試薬に標識された触媒による反応に基づく特定の微生物の検出とを行うことができる。
本発明における微生物検出方法では、まず、特定の微生物を培養可能な液体培地で微生物群濃度が所定値に達するまで培養する(第1工程)。そして、この液体培地に含まれる特定の微生物に対して、触媒で標識した免疫測定試薬を用いて、特定の免疫反応を生じせしめる(第2工程)。そして、この免疫反応に基づいて検出対象の特定の微生物を分離して、これを免疫測定試薬に標識された触媒と反応する基質を含む溶液と反応させ、この触媒と基質による反応に基づく特定物質の溶存量を電極により測定することにより、特定の微生物を検出する(第3工程)。
は特許請求の範囲に記載の微生物群濃度測定手段として機能し、第3工程における測定を行う場合は特許請求の範囲に記載の特定微生物検出手段として機能する。
図1は、本発明の微生物検出装置の原理を示す概略図である。図1に示すように、微生物検出装置は、溶液を収容するセル中に、作用極(作用電極)11と参照極(参照電極)12と対極(対電極)13から構成される酸素電極を備えている。溶液中で作用極11において、O2+4H+→2H2Oの反応が生じて4e-の電子の授受が行われ、これに対応する電流が流れる。この反応は、溶存酸素濃度に依存するため、流れる電流量も溶存酸素濃度に依存する。従って、電流値の測定により、後述するように、第1工程では液体培地中の溶存酸素量に基づいて微生物群濃度を測定でき、第3工程では基質を含む溶液中の溶存酸素量に基づいて特定の微生物を検出できる。
まず、第1工程として、特定の微生物を培養可能な液体培地で微生物群濃度が所定値に達するまで、35℃で培養する。この特定の微生物を培養可能な液体培地とは、一般生菌用液体培地、もしくは特定の微生物を含む広い範囲の菌種類を培養可能な液体培地、もしくは特定の微生物を培養可能な液体培地である。このような液体培地としては、公知のものを用いることができる。そして、この液体培地に、測定対象物の抽出液を懸濁して調整する。測定対象物としては、肉、野菜、海産物、総菜、乳製品等の食材、医薬品、化学製品等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
化をそれぞれ示す。液体培地中に微生物が存在しない場合、電流値は緩やかに減少する。一方、培養開始時に微生物が存在していた場合、電流値は培養開始からある時点までは緩やかに減少するが、ある時点を過ぎると急激に減少し、電流値がほぼゼロになる。これは、液体培地中の微生物がある程度まで増殖した場合に、呼吸により液体培地中の溶存酸素を使い切り、作用極における上記の反応が起こらなくなるため、急激に電流値が低下するものである。初期菌数が多いほど、より短い培養時間で液体培地中の微生物の濃度が一定以上になるため、ここでは、初期菌数が105の場合に、最も短い培養時間で電流値が急
激に減少している。そして、初期菌数が少なくなるに従って、電流値の急激な減少が起こるまでの培養時間が長くなっている。
電流値がしきい値に達した場合、電流値の測定を終了し、触媒で標識した免疫測定試薬を用いて、液体培地に含まれる特定の微生物に対して特定の免疫反応を生じせしめる。なお、この第2工程においては、後述するように、液体培地に含まれる特定の微生物を、この微生物の選択培地を用いて増菌培養する。以下、免疫測定試薬を標識する触媒として酸化還元酵素であるグルコースオキシダーゼを用いる場合について説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
。捕捉体としては、例えば、検出対象の微生物の細胞表層の構成成分に結合可能なリガンドを固定化した磁気ビーズを用いる。具体的には、例えば、検出対象の微生物がサルモネラ等のグラム陰性菌である場合、ポリミキシンBを固定化した磁気ビーズを用いる。なお、ポリミキシンBは、グラム陰性菌の外膜の構成成分であるリポポリサッカライドと特異的に結合することが知られている。なお、ここでは、捕捉体としてリガンドを固定化した磁気ビーズを用いたが、捕捉体はこれに限られるものではなく、検出対象の微生物を捕捉可能であればよい。例えば、ウェルにリガンドを固定化したものを捕捉体として用いてもよい。
次に、分離された捕捉体を、基質を含む溶液に投入する。そして、捕捉体に捕捉された微生物に結合した抗体に標識された触媒と、この触媒と基質による反応に基づく特定物質の溶存量を電極により測定することにより、特定の微生物を検出する。
)とペルオキシダーゼを共存させることにより、ペルオキシダーゼにより触媒されるH2
O2とOPDとの反応によりH2O2を除去することで防止できる。この場合、OPDが発
色するため、吸光度の測定によっても、グルコースオキシダーゼにより触媒される反応によりH2O2が発生したことを確認できる。
上記の実施形態では、特定の微生物の検出をサンドイッチ法により行う場合について説明したが、特定の微生物の検出は競合法により行ってもよい。ここでは、他の実施形態として、特定の微生物の検出を競合法により行う場合について説明する。この場合、第2工程における反応や第3工程における反応及び電流値の測定結果が上記の実施形態の場合と異なるため、ここでは、第2工程及び第3工程について説明する。
競合法による場合、免疫測定試薬として、検出対象の微生物を構成する抗原であって触媒により標識されたもの(標識抗原)とこの抗原と結合可能であって検出対象の微生物を捕捉可能な捕捉体とを構成成分に含む試薬を用いる。ここで、標識抗原は、この微生物に含まれる抗原が触媒により標識されている。ここでは、グルコースオキシダーゼにより標識された標識抗原(グルコースオキシダーゼ標識抗原)を用いる。また、検出対象の微生物を捕捉可能な捕捉体として、この抗原と結合可能なリガンドを固定化した磁気ビーズを用いる。
合的に捕捉体に結合する。そして、捕捉体を分離すると、捕捉体とともに、捕捉された微生物等(検出対象の微生物又は標識抗原)が分離される。ここでは、培養された検出対象の微生物とグルコースオキシダーゼ標識抗原とが競合的にリガンドを固定化した磁気ビーズに結合し、捕捉された微生物等(液体培地で培養された検出対象の微生物又はグルコースオキシダーゼ標識抗原)が分離される。
次に、分離された捕捉体を、基質を含む溶液に投入し、電極を用いて電流値を測定する。上記の例では、培養された検出対象の微生物又はグルコースオキシダーゼ標識抗原を捕捉した磁気ビーズを、グルコースを含む溶液に投入し、酸素電極を用いて電流値を測定する。
・ 上記実施形態では、特定の微生物を培養可能な液体培地で微生物群濃度が所定値に達するまで培養を行う。そして、触媒で標識した免疫測定試薬を用いて、この液体培地に含まれる特定の微生物に対して特定の免疫反応を生じせしめる。そして、この免疫反応に基づいて分離した特定の微生物を、標識された触媒と反応する基質を含む溶液中に加え、この触媒と基質による反応に基づいて変化する特定物質の溶存量を電極により測定することにより、特定の微生物を検出する。これにより、微生物群濃度が所定値に達した場合に、免疫測定試薬に標識された触媒と基質との反応に基づいて、特定の微生物を、電極を用いて検出することができる。従って、公定法のような煩雑なステップを経ずに、より簡易かつ迅速に特定の微生物を検出できる。また、微生物群濃度が所定値に達した場合は、検出対象の微生物が存在する可能性が高いため、微生物群濃度が高いものだけを調べることは有効であり、これにより、効率よく特定の微生物の検出を行うことができる。
きる。このため、より簡易かつ迅速に特定の微生物を検出できる。
Claims (7)
- 測定対象物に含まれる特定の微生物を検出する微生物検出方法において、
前記測定対象物を添加した一般生菌用液体培地または前記特定の微生物を含む広範囲の菌種類を培養可能な液体培地で前記液体培地に含まれる微生物群を培養するとともに微生物群濃度が所定値に達するまで培養を行い、前記微生物群濃度が所定値に達することに基づいて前記特定の微生物が存在している旨を推定する第1工程と、
触媒で標識した免疫測定試薬を用いて、前記微生物群濃度が前記所定値である前記液体培地に含まれる特定の微生物に対して特定の特異反応を生じせしめる第2工程と、
前記特定の微生物を前記特異反応に基づいて分離して前記触媒と反応する基質を含む溶液中に加え、前記触媒と前記基質による反応に基づいて変化する特定物質の溶存量を電極により測定することにより、前記特定の微生物を検出する第3工程とを含む
ことを特徴とする微生物検出方法。 - 請求項1に記載の微生物検出方法において、
前記第1工程において、前記液体培地での微生物群濃度は、微生物の代謝に基づいて変化する前記特定物質の溶存量を電極により測定することにより求め、
前記第1工程の電極による測定方法と同じ方法で前記第3工程の測定を実行する
ことを特徴とする微生物検出方法。 - 請求項1または2に記載の微生物検出方法において、
前記特定物質の溶存量は溶存酸素量であり、前記触媒は酸化還元触媒である
ことを特徴とする微生物検出方法。 - 請求項1〜3のいずれか一項に記載の微生物検出方法において、
前記免疫測定試薬は、前記触媒で標識された標識体と前記特定の微生物を捕捉可能な捕捉体とを含むものであり、前記標識体および前記捕捉体は、前記特定の微生物と特異反応する抗体またはリガンドである
ことを特徴とする微生物検出方法。 - 請求項1〜3のいずれか一項に記載の微生物検出方法において、
前記免疫測定試薬は、前記触媒により標識された標識体と前記特定の微生物を構成する抗原と結合可能な捕捉体とを含むものであり、前記標識体および前記捕捉体は、前記抗原である
ことを特徴とする微生物検出方法。 - 電極を用いて特定物質の溶存量を測定する測定手段を備えた微生物検出装置であって、
前記測定手段は、
測定対象物を添加した一般生菌用液体培地または特定の微生物を含む広範囲の菌種類を培養可能な液体培地で、前記液体培地に含まれる微生物の代謝に基づいて変化する前記特定物質の溶存量を電極により測定し、前記液体培地中の前記特定の微生物の存在を推定するために微生物群濃度が所定値に達したか否かを確認する前記微生物群濃度を測定する微生物群濃度測定手段と、
触媒で標識した免疫測定試薬を用いて、前記微生物群濃度が前記所定値である前記液体培地に含まれる特定の微生物に対して生じせしめた特定の特異反応に基づいて前記特定の微生物を分離して、前記触媒と反応する基質を含む溶液中に加え、前記触媒と前記基質による反応に基づいて変化する前記特定物質の溶存量を電極により測定することにより、前記測定対象物に含まれる前記特定の微生物を検出する特定微生物検出手段とを備える
ことを特徴とする微生物検出装置。 - 請求項6に記載の微生物検出装置において、
前記特定物質の溶存量は溶存酸素量であり、前記触媒は酸化還元触媒である
ことを特徴とする微生物検出装置。
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