JP4688046B2

JP4688046B2 - 肥厚性瘢痕動物モデル

Info

Publication number: JP4688046B2
Application number: JP2004321368A
Authority: JP
Inventors: 裕之北島; 康友西森; 貴優五味; 啓貴竹内; まゆみ宍戸
Original assignee: Pola Pharma Inc
Current assignee: Pola Pharma Inc
Priority date: 2004-11-05
Filing date: 2004-11-05
Publication date: 2011-05-25
Anticipated expiration: 2024-11-05
Also published as: JP2006129758A

Description

本発明は肥厚性瘢痕治療薬のスクリーニングに有用な肥厚性瘢痕動物モデルに関するものである。

肥厚性瘢痕は、創傷が治癒した後に、創傷箇所が肥厚して痕として残る現象であり、この様な肥厚性瘢痕は、外観上極めて目立つものであり、その改善手段が望まれていたが、一度できてしまうと、その改善手段が殆ど無く、かかる肥厚性瘢痕の治療薬の開発が望まれていた。この様な肥厚性瘢痕の治療薬の開発が遅れている理由の一つに、肥厚性瘢痕の適切な動物モデルが存しないことが挙げられる。即ち、現在肥厚性瘢痕のモデルとしては、齧歯類の動物に創傷を作成しても、ウサギの耳を用いたモデル以外は、瘢痕が生じても、肥厚が生じず、その為、細胞を用いたコラーゲンゲル収縮等の細胞に置き換えた実験がなされている。（例えば、特許文献１を参照）唯一肥厚が確認されている動物モデルである、ウサギ耳介を用いた肥厚性瘢痕動物モデルにおいては、ウサギの耳介に軟骨が存在し、創傷治癒課程において軟骨組織の影響が大きく、ヒト皮膚における薬剤開発のための、肥厚性瘢痕モデルとしては適切であるとは言い難かった。（例えば、非特許文献１、非特許文献２を参照）マンチェスター大学のファーガソンらが開発した、ラットの背部を皮筋に至るまで切開し、２〜３週間静置して生じせしめた瘢痕モデルが、現在瘢痕モデルとして使用されているが、このモデルに於いては明確な肥厚は認められていない。（例えば、非特許文献３を参照）従って、この様なモデルで有効性が確かめられた有効成分であっても、肥厚性瘢痕の、特に肥厚に対する有効性は望めないのが現状であった。

即ち、肥厚性瘢痕の治療に於いて、有効な薬剤を見出すための適切なモデル動物の開発が望まれていた。

特開２００４−１２３５５１号公報 Richard J. et.al., J. Morph., 146, (1975),533-542 T.A.Mustoe et.al., J. Clin. Invvest. Vol87 (1991), 694-703 J.Fagason et.al., J.Cell Science 107 , (1994),1137-1157

本発明は、この様な状況下為されたものであり、肥厚性瘢痕の治療に於いて、有効な薬剤を見出すための適切なモデル動物を提供することを課題とする。

本発明者らは、この様な状況に鑑みて、肥厚性瘢痕の治療に於いて、有効な薬剤を見出すための適切なモデル動物を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、齧歯類の動物の皮膚の一部を、観察を行うのに十分な長さで皮筋を切開する深さで切開し、しかる後、１００日以上飼育することを特徴とする肥厚性瘢痕動物モデルがその様な特性を備えていることを見出し、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示すとおりである。
（１）創傷が治癒した後に生じる肥厚性瘢痕の治療薬の開発のための肥厚性瘢痕モデルであって、齧歯類の動物の皮膚の一部を、観察を行うのに十分な長さで皮筋を切開する深さで切開し、しかる後、１００日以上飼育し、処置部位のレプリカによるモニタおいて、該レプリカの体積が、創傷作成時期の少なくとも４倍になっていることが確認されていることを特徴とする、肥厚性瘢痕モデル。
（２）前記齧歯類の動物がラットであることを特徴とする、（１）に記載の肥厚性瘢痕動物モデル
（３）前記ラットがＳＤラットまたはＨＷＹヘアレスラットであることを特徴とする、（２）に記載の肥厚性瘢痕動物モデル
（４）（１）〜（３）いずれか１項に記載の肥厚性瘢痕動物モデルに検体を投与し、肥厚の変化をモニタし、肥厚が減じたものを有効として、判定することをすることを特徴とする肥厚性瘢痕治療薬のスクリーニング方法。
（５）（１）〜（３）何れか１項に記載の肥厚性瘢痕動物モデルの肥厚性瘢痕部において、検体の１ヶ月間の投与により、１０％以上の体積減少した場合、肥厚性瘢痕治療薬として有効であると判別することを特徴とする、（４）に記載のスクリーニング方法。

肥厚性瘢痕治療薬のスクリーニングをする際、肥厚性瘢痕動物モデルを用いることが出来き、よりヒトに近く精度よく試験が出来る。

本発明の肥厚性瘢痕動物モデルは、齧歯類の動物の皮膚の一部を、観察を行うのに十分な長さで皮筋を切開する深さで切開し、しかる後、１００日以上飼育することを特徴とする。この様な肥厚性瘢痕作成用の動物としては、ウシ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ等の家畜用の動物や、カニクイザル、メガネザル、リスザル、ヨザルの様な齧歯類以外の実験動物も使用できるが、取り扱いの容易性、再現性の良好性から齧歯類の動物を用いることを本発明では選択する。かかるモデルに使用できる齧歯類の動物としては、通常試験などに用いられている齧歯類の動物であれば、特段の限定無く使用することが出来、例えば、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ラット、マウスなどが好ましく例示できる。これらのストレインとしては、実験動物として確立しているものであれば、特段の限定無く使用することが出来、ハートレー系白色種、Ｎｏ２種、Ｎｏ１３種などが例示でき、ハムスターであれば、チャイニーズ種やゴールデン種などが例示でき、ラットであれば、ＳＤ種、ウィスター種、ドンリュウ種、ＨＷＹヘアレス種などが例示でき、マウスであれば、ＩＣＲ種、ｄｄＹ種、Ｃ３Ｈ種等が好ましく例示できる。特に好ましいものは、ラットであり、ＳＤラット種とＨＷＹヘアレスラット種等が特に好ましく例示できる。これは、肥厚するのに要する時間が長いため、ある程度の寿命が必要なことと、肥厚が検知できる適切な皮膚厚を有することによる。

本発明の動物モデルでは、前記齧歯類の動物の背部の皮膚を皮筋を切開する程度に深く切開し、傷を作成する。皮筋を切開しても、内臓部に傷が至らないことが必要である。又、傷には、抗生物質や消毒剤を塗布して、感染症の併発を予防することも出来、この様な処置を行うことが好ましい。又、かかる傷の長さは、１ｃｍ〜１０ｃｍが好ましく、２ｃｍ〜５ｃｍがより好ましい。この様に傷を付けた後、動物は少なくとも１００日、処置を受けずに飼育される。７０日程度の飼育期間では、後記実施例に示す如くに、傷の部位は瘢痕を生じるものの、肥厚は殆ど生じない。８０日を経過するあたりより、肥厚は顕著になり始め、１００日を越すと、元の体積の４倍程度の体積になり、肥厚が明瞭に検知できる。この様な肥厚経過は、創傷部位のレプリカをとり、その体積を計測することにより、非侵襲的にモニタすることが出来、この様なモニタを行うことが、実験の精度を上げる上で好ましい。かかる肥厚の程度が、元の創傷に比して４倍程度になった時点を以て、動物モデルの完成と判断し、かかる動物モデルを実験に使用することが出来る。尚、この様な創傷作成後に創傷部位を固定器で開いたままに固定し肥厚性瘢痕の生成を促進することも可能であるが、そのまま静置し、自然治癒と肥厚性瘢痕の自然形成に任せておく方が、組織学的に実際のヒトの肥厚性瘢痕と類似性の高いモデルが作成できるので好ましい。

この様な実験モデルを使用したスクリーニング方法は、かかる動物モデルの肥厚性瘢痕生成部位に、被験物質を投与して、その後の肥厚性瘢痕の体積変化をモニタすることにより、行われる。この様な体積変化のモニタは、前記レプリカにより行えばよい。被験物質の投与経路としては、経皮投与、皮内注射による投与、皮下注射による投与、筋肉内注射による投与のいずれもが可能であるが、経皮投与が、投与行為による肥厚性瘢痕形成の可能性が最も少ないので、特に好ましい。この様な投与により、肥厚性瘢痕の体積を減じる物質が、肥厚性瘢痕の治療に有効な物質と判定される。減じる程度としては、１ヶ月間の投与で１０％、より好ましくは１５％以上の体積減少が目処と出来る。

以下に、実施例を挙げて、本発明について、更に詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ、限定されないのは言うまでもない。

以下に示す手順に従って、本発明の肥厚性瘢痕動物モデルを作成した。即ち、実験動物としては、ＳＤラットを用い、背部をバリカンで除毛した後、メスを用いて、皮筋に達するまで切開し、内臓に達しない程度に切創（長さ約１ｃｍ）を作成し、図１、２に示す手技にて、レプリカを作成し、その体積を計測した。この動物の創傷について、前記レプリカ法で体積をモニタしながら４４５日間飼育を続けた。この瘢痕の体積の経時変化を図３、４に示す。これより、１００日を過ぎると明瞭な肥厚性瘢痕が形成されているのが判る。この肥厚性瘢痕部位の組織所見を図６に示す。肥厚性瘢痕の組織学的特徴であるコラーゲン線維の充填が判る。実験手技の詳細は次に示す。

（実験手技の詳細）
・使用動物：ＳＤラット
・観察日数：創傷後４２、８４、１２６、１６４、２７０、３５７および４４５日後の７回行った。
・瘢痕面積測定：全てのサンプリング時に瘢痕部位のシリコンレプリカを作成し、レプリカを基にした画像解析により瘢痕面積を評価した。瘢痕面積は時間をおいて拡大した。
・シリコンレプリカの作成は、ラット背部をバリカンにて除毛しアルコール綿で背部を拭き取った後、Silflo（フレスコデベロップメンツ社製）を適量ラット背部に塗布し固める。その後はがして、ガラス板に固定し保存する。
・瘢痕体積および高さ測定：レプリカをレーザースキャナー（LIP-50：国際システムサイエンス株式会社）でスキャンすることによって、瘢痕部分の体積およびその高さの測定をした。瘢痕部位の体積および高さは時間と共に増大し、肥厚していることが確認できた。また、４４５日後には、減弱の傾向があり、ヒトの肥厚性瘢痕と類似していた。
・組織科学的解析： 42、70、445日のサンプリングのみ、瘢痕部位のHE染色、ピクロシリウスレッド染色を行った。瘢痕の肥厚部位は、コラーゲンの増加による真皮の増加であることが確認でき、ヒトの肥厚性瘢痕と類似している。

動物をＨＷＹヘアレスラットに代えて、実施例１と同様に検討を行った。図３、４に肥厚性瘢痕の状況の時間経過を、図５に組織図を示す。肥厚性瘢痕が形成されていることが判る。

本発明は、肥厚性瘢痕治療薬のスクリーニングに応用できる。

シリコンレプリカ作成法を示す図である。肥厚性瘢痕の体積および高さの測定方法を示す図である。肥厚性瘢痕の面積の時間的推移を示す図である。肥厚性瘢痕の体積およびその高さを示す図である。 HWYヘアレスラット肥厚性瘢痕部位のH.E.染色像を示す図である。（図面代用写真）ＳＤラット肥厚性瘢痕部位のH.E.染色像を示す図である。図面代用写真）

Claims

創傷が治癒した後に生じる肥厚性瘢痕の治療薬の開発のための肥厚性瘢痕モデルであって、齧歯類の動物の皮膚の一部を、観察を行うのに十分な長さで皮筋を切開する深さで切開し、しかる後、１００日以上飼育し、処置部位のレプリカによるモニタにおいて、該レプリカの体積が、創傷作成時期の少なくとも４倍になっていることが確認されていることを特徴とする、肥厚性瘢痕モデル。
前記齧歯類の動物がラットであることを特徴とする、請求項１に記載の肥厚性瘢痕動物モデル。
前記ラットがＳＤラットまたはＨＷＹヘアレスラットであることを特徴とする、請求項２に記載の肥厚性瘢痕動物モデル。
請求項１〜３いずれか１項に記載の肥厚性瘢痕動物モデルに検体を投与し、肥厚の変化をモニタし、肥厚が減じたものを有効として、判定することをすることを特徴とする肥厚性瘢痕治療薬のスクリーニング方法。
請求項１〜３何れか１項に記載の肥厚性瘢痕動物モデルの肥厚性瘢痕部において、検体の１ヶ月間の投与により、１０％以上の体積減少した場合、肥厚性瘢痕治療薬として有効であると判別することを特徴とする、請求項４に記載のスクリーニング方法。