JP4649571B2 - Methods for introducing RNA into cells - Google Patents

Methods for introducing RNA into cells Download PDF

Info

Publication number
JP4649571B2
JP4649571B2 JP2005511930A JP2005511930A JP4649571B2 JP 4649571 B2 JP4649571 B2 JP 4649571B2 JP 2005511930 A JP2005511930 A JP 2005511930A JP 2005511930 A JP2005511930 A JP 2005511930A JP 4649571 B2 JP4649571 B2 JP 4649571B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
sirna
cyclodextrin
cells
dendrimer
rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2005511930A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JPWO2005007850A1 (en
Inventor
英俊 有馬
文俊 平山
兼人 上釜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of JPWO2005007850A1 publication Critical patent/JPWO2005007850A1/en
Application granted granted Critical
Publication of JP4649571B2 publication Critical patent/JP4649571B2/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6949—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes
    • A61K47/6951—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes using cyclodextrin
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

本発明は、細胞にＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡを導入する方法に関する。より詳細には、本発明は、シクロデキストリン・デンドリマー結合体を用いて細胞にＲＮＡを導入する方法に関する。  The present invention relates to a method for introducing RNA, particularly siRNA, into a cell. More specifically, the present invention relates to a method for introducing RNA into a cell using a cyclodextrin / dendrimer conjugate.

二本鎖ＲＮＡによって配列特異的にｍＲＮＡが分解され、その結果，ＲＮＡの発現が抑制される現象は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ／ＲＮＡｉ）と称されている。このＲＮＡｉは線虫をはじめ、昆虫、植物、菌類など様々な生物種間で保存されており、生物共通の核酸レベルの防御システムである。
最近、このＲＮＡｉの現象を利用してノックアウトマウス等を作成し、ＲＮＡの働きを研究することが広まってきている。
ＲＮＡｉ用のＲＮＡ導入剤としてカチオニックリポソーム、カチオニックリピッド、カチオニックペプチドなどのいわゆるカチオニックキャリアーを用いる技術に関する報告がなされており、最近では、いくつかのｓｉＲＮＡ導入剤が市販されている。例えば、例えば、リポフェクタミン２０００ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、トランスファストＴＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、リポフェクチンＴＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、オリゴフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＲＮＡｉフェクト（ＱＩＡＧＥＮ）等が知られている。しかし、これらのｓｉＲＮＡ導入剤は高価で、化学的安定性に乏しく、かつ導入効果も満足のいく水準にない。
一方、Ｊ．Ｓｕｈら，ＢＩＯＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ２５，６３−７５（１９９７）には、シクロデキストリンとデンドリマーからなる結合体が開示されているが、非ウイルス性ベクターとして機能することについての記載はない。また、特開２００１−１０３９６９号公報には、シクロデキストリン・デンドリマー結合体からなる遺伝子導入剤が、非ウイルス性ベクターとして使用可能であることが開示されている。しかし、非ウイルス性ベクターの全てがＲＮＡ導入剤、特にｓｉＲＮＡ導入剤として適しているわけではない。The phenomenon in which mRNA is degraded in a sequence-specific manner by double-stranded RNA, and as a result, the expression of RNA is suppressed is called RNA interference (RNA interference / RNAi). This RNAi is conserved among various species such as nematodes, insects, plants and fungi, and is a defense system at the nucleic acid level common to organisms.
Recently, it has become widespread to create knockout mice and the like using this phenomenon of RNAi to study the function of RNA.
There have been reports on techniques using so-called cationic carriers such as cationic liposomes, cationic lipids, and cationic peptides as RNA introducing agents for RNAi, and recently several siRNA introducing agents are commercially available. For example, Lipofectamine 2000TM (manufactured by Invitrogen), Transfast TM (manufactured by Promega), LipofectinTM (GIBCO BRL), Oligofectamine (manufactured by Invitrogen), RNAifect (QIAGEN) and the like are known. However, these siRNA introduction agents are expensive, poor in chemical stability, and the introduction effect is not at a satisfactory level.
On the other hand, J.H. Suh et al., BIOORGANIC CHEMISTRY 25, 63-75 (1997) discloses a conjugate consisting of cyclodextrin and dendrimer, but does not describe that it functions as a non-viral vector. Japanese Patent Laid-Open No. 2001-103969 discloses that a gene introduction agent comprising a cyclodextrin / dendrimer conjugate can be used as a non-viral vector. However, not all non-viral vectors are suitable as RNA introduction agents, particularly siRNA introduction agents.

本発明の目的は、ＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡを細胞内に効率よく導入する方法を提供することである。本発明の他の目的は、ＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡを細胞内に安価に導入する方法を提供することである。本発明のさらに他の目的は、生体に害を及ぼす可能性の少ない方法で、ＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡを細胞内に導入する方法を提供することである。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、導入すべきＲＮＡとシクロデキストリン・デンドリマー結合体の存在下で細胞をインキュベーションすることによって細胞にＲＮＡを効率よく導入することができ、導入したＲＮＡによるＲＮＡ干渉により標的遺伝子の発現を抑制することができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
すなわち、本発明によれば、導入すべきＲＮＡとシクロデキストリン・デンドリマー結合体の存在下で細胞をインキュベーションする工程を含む、細胞にＲＮＡを導入する方法が提供される。
好ましくは、シクロデキストリンは、α−シクロデキストリンである。
好ましくは、ジェネレーションが２〜３のデンドリマーを使用する。
好ましくは、ＲＮＡは２本鎖ＲＮＡであり、さらに好ましくは、ＲＮＡはｓｉＲＮＡである。
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の方法により細胞にＲＮＡを導入し、導入したＲＮＡによるＲＮＡ干渉により標的遺伝子の発現を抑制する方法が提供される。
本発明の別の側面によれば、シクロデキストリン・デンドリマー結合体を含む、ＲＮＡ導入用ベクターが提供される。上記ＲＮＡ導入用ベクターは、ＲＮＡ干渉による遺伝子発現の抑制のために使用することができる。An object of the present invention is to provide a method for efficiently introducing RNA, particularly siRNA, into cells. Another object of the present invention is to provide a method for introducing RNA, particularly siRNA, into cells at low cost. Still another object of the present invention is to provide a method for introducing RNA, particularly siRNA, into a cell in a manner that is less likely to cause harm to the living body.
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have been able to efficiently introduce RNA into cells by incubating the cells in the presence of RNA to be introduced and a cyclodextrin / dendrimer conjugate, It was found that the expression of the target gene can be suppressed by RNA interference by the introduced RNA. The present invention has been completed based on these findings.
That is, according to the present invention, there is provided a method for introducing RNA into a cell, comprising the step of incubating the cell in the presence of the RNA to be introduced and a cyclodextrin / dendrimer conjugate.
Preferably, the cyclodextrin is α-cyclodextrin.
Preferably, a dendrimer with a generation of 2-3 is used.
Preferably, the RNA is double stranded RNA, more preferably the RNA is siRNA.
According to another aspect of the present invention, there is provided a method of introducing RNA into a cell by the above-described method of the present invention and suppressing the expression of a target gene by RNA interference by the introduced RNA.
According to another aspect of the present invention, a vector for introducing RNA comprising a cyclodextrin / dendrimer conjugate is provided. The RNA introduction vector can be used for suppressing gene expression due to RNA interference.

図１は、本発明で用いることができるシクロデキストリン・デンドリマー結合体の構造の一例を示す。
図２は、シクロデキストリン・デンドリマー結合体のｓｉＲＮＡ導入作用を示す模式図である。
図３は、本発明の実施例で用いた遺伝子発現ベクターｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡおよびｐＧＬ２−ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡの構造を示す。
図４は、ｓｉＲＮＡの量を変化させた場合における、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ発現に及ぼすｐＧＬ３ ｓｉＲＮＡの効果を測定した結果を示す。
図５は、デンドリマー／シクロデキストリン結合体と遺伝子発現ベクターの比率を変化させた場合における、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ発現に及ぼすｐＧＬ３ ｓｉＲＮＡの効果を測定した結果を示す。
図６は、各種のＲＮＡ導入剤を用いた場合における、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ発現に及ぼすｐＧＬ３ ｓｉＲＮＡの効果を測定した結果を示す。
図７は、ｓｉＲＮＡの量を変化させた場合における、ＨｅｐＧ２細胞におけるルシフェラーゼ発現に及ぼすｐＧＬ３ ｓｉＲＮＡの効果を測定した結果を示す。
図８は、各種の細胞におけるｓｉＲＮＡ効果を比較した結果を示す。
図９は、ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼすｓｉＲＮＡの配列特異的な効果を測定した結果を示す。
図１０は、ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の三成分複合体をトランスフェクションした各種細胞（ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ａ５４９細胞及びＨｅｐＧ２細胞）におけるｐＧＬ３ ｓｉＲＮＡの濃度依存的な効果を測定した結果を示す。
図１１は、ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の三成分複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ発現に及ぼす投与比率（ｐＤＮＡ／α−ＣＤＥ結合体）の効果を測定した結果を示す。
図１２は、ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ／各種担体の三成分複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼすｐＧＬ３ｓｉＲＮＡ用の各種ベクターの効果を測定した結果を示す。
図１３は、ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ／担体の三成分複合体をトランスフェクションした各種細胞における当該ベクターの阻害効果を比較した結果を示す。
図１４は、ｐＤＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼすｐＧＬ３ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の複合体のトランスフェクション後の効果を測定した結果を示す。
図１５は、ｐＤＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の複合体をトランスフェクションした後のＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼすｓｉＲＮＡ／担体の複合体の投与量の比率の効果を測定した結果を示す。
図１６は、ｐＤＮＡ／担体の複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼす、ｐＧＬ３ｓｉＲＮＡ／担体の複合体のポストトランスフェクションにおける各種担体の阻害効果を示す。FIG. 1 shows an example of the structure of a cyclodextrin / dendrimer conjugate that can be used in the present invention.
FIG. 2 is a schematic diagram showing the siRNA introduction action of the cyclodextrin / dendrimer conjugate.
FIG. 3 shows the structures of the gene expression vectors pGL3-control DNA and pGL2-control DNA used in the examples of the present invention.
FIG. 4 shows the results of measuring the effect of pGL3 siRNA on luciferase expression in NIH3T3 cells when the amount of siRNA was changed.
FIG. 5 shows the results of measuring the effect of pGL3 siRNA on luciferase expression in NIH3T3 cells when the ratio of dendrimer / cyclodextrin conjugate and gene expression vector was changed.
FIG. 6 shows the results of measuring the effect of pGL3 siRNA on luciferase expression in NIH3T3 cells when using various RNA introduction agents.
FIG. 7 shows the results of measuring the effect of pGL3 siRNA on luciferase expression in HepG2 cells when the amount of siRNA is changed.
FIG. 8 shows the results of comparing siRNA effects in various cells.
FIG. 9 shows the results of measuring the sequence-specific effect of siRNA on luciferase activity in NIH3T3 cells transfected with a complex of pDNA / siRNA / α-CDE conjugate.
FIG. 10 shows the results of measuring the concentration-dependent effect of pGL3 siRNA in various cells (NIH3T3 cells, A549 cells, and HepG2 cells) transfected with a pDNA / siRNA / α-CDE conjugate ternary complex.
FIG. 11 shows the results of measuring the effect of the administration ratio (pDNA / α-CDE conjugate) on luciferase expression in NIH3T3 cells transfected with the pDNA / siRNA / α-CDE conjugate ternary complex.
FIG. 12 shows the results of measuring the effects of various vectors for pGL3 siRNA on the luciferase activity in NIH3T3 cells transfected with a pDNA / siRNA / various carrier ternary complex.
FIG. 13 shows the results of comparing the inhibitory effects of the vectors in various cells transfected with a pDNA / siRNA / carrier ternary complex.
FIG. 14 shows the results of measuring the effect of the pGL3 siRNA / α-CDE conjugate complex after transfection on luciferase activity in NIH3T3 cells transfected with the pDNA / α-CDE conjugate complex.
FIG. 15 shows the results of measuring the effect of the siRNA / carrier complex dose ratio on luciferase activity in NIH3T3 cells after transfection with the pDNA / α-CDE conjugate complex.
FIG. 16 shows the inhibitory effect of various carriers in post-transfection of pGL3siRNA / carrier complex on luciferase activity in NIH3T3 cells transfected with pDNA / carrier complex.

本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、導入すべきＲＮＡとシクロデキストリン・デンドリマー結合体の存在下で細胞をインキュベーションする工程を含む、細胞にＲＮＡを導入する方法に関する。
１．シクロデキストリン・デンドリマー結合体
本発明の方法では、ＲＮＡ導入剤として、図１に例示する構造のシクロデキストリン・デンドリマー結合体を用いることができる。このシクロデキストリン・デンドリマー結合体は、デンドリマーとシクロデキストリンを溶媒中で加熱・混合することにより容易に製造することができる。
（シクロデキストリン）
シクロデキストリン・デンドリマー結合体を構成するシクロデキストリンは、α、β、またはγシクロデキストリンである。これらα、β、またはγシクロデキストリンは、化学修飾型または非修飾型のシクロデキストリンであることもできる。これらα、β、またはγシクロデキストリンは市販品を容易に入手できる。本発明ではこれらのうちα−シクロデキストリンがその導入剤としての効果が最も優れているため、好ましい。
シクロデキストリンはその水酸基の一部もしくは全部がアセチル化されていてもよく、またはグルコース、マンノース、サッカロース等の糖で修飾されていてもよい。これらの修飾剤と、シクロデキストリンとの反応は、両者を例えば水溶液にし、加熱・攪拌することにより製造することができる。導入剤として用いる場合は、変性しない方が導入効率が高いため好ましい。
（デンドリマー）
本発明で用いられるシクロデキストリン・デンドリマー結合体のひとつの構成成分であるデンドリマー（Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）は、アンモニアあるいはエチレンジアミンをコア分子とし、その分子にマイケル付加反応でアクリル酸メチルおよびエチレンジアミンを付加し、この反応を繰り返すこと（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）により得られる高度に枝分かれした樹枝状構造を特徴とし、その末端に多数の一級アミノ基を有した新しいタイプの合成ポリマーである。本発明で用いるデンドリマーとしては、ポリアミドアミン型であることが好ましい。
ポリアミドアミン型デンドリマーは、アンモニアにアクリル酸メチルとエチレンジアミンとを反応させて（アンモニア：アクリル酸メチル：エチレンジアミン＝１：３：３（モル比））、ジェネレーション０（Ｇ０）と呼ばれる中心核を合成する。ジェネレーション０はアンモニアに由来する窒素の周りに、アクリル酸メチルとエチレンジアミンの縮合体（アミドアミン）が３つ結合した形を有する。ジェネレーション０（Ｇ０）のアミドアミンの末端にエチレンジアミンの一方のアミノ基が存在する。そこで、この中心核（ジェネレーション０（Ｇ０））にアクリル酸メチル：エチレンジアミン＝３：３（モル比）を反応させることで、上記アミドアミンの末端のアミノ基に２つのアクリル酸メチルとエチレンジアミンの縮合体（アミドアミン）が結合する。このようにＧ０のアミノ基由来の窒素に２つのアクリル酸メチルとエチレンジアミンの縮合体（アミドアミン）が結合したものは、ジェネレーション１（Ｇ１）と呼ばれる。このようにして順次、アクリル酸メチルとエチレンジアミンの縮合体を結合させていくことで、ジェネレーション２、３、４、５、６（Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６）が得られる。この状態を下記の反応スキームに示す。

Figure 0004649571
ポリアミドアミン型デンドリマーは、市販さており、市販品を容易に入手できる。本発明の結合体に用いるデンドリマーは、ポリアミドアミン型デンドリマーであれば特に制限はないが、例えば、Ｇ２に属するものであることができる。
デンドリマー・シクロデキストリン結合体は、デンドリマーとシクロデキストリンとを混合し、水性媒体の存在下で加熱攪拌するというわずか２段階の反応で合成できることから、市販のＲＮＡ導入剤に比べコスト的に有利であると考えられる。
本発明で用いるシクロデキストリン・デンドリマー結合体におけるシクロデキストリンとデンドリマーとのモル比は通常１．５〜５：１、好ましくは２〜４：１程度であることが好ましい。
シクロデキストリン・デンドリマー結合体は、後述の実施例で示すように、トシル化シクロデキストリンとデンドリマーとを加温条件下で数時間反応させることで合成できる。トシル化（トルエンスルホニル化）シクロデキストリンは、ｐ−トルエンスルホニルクロライドとシクロデキストリンとをピリジン中で反応させることで得られる。
２．ｓｉＲＮＡ
本発明では、上記したシクロデキストリン・デンドリマー結合体は、細胞内の特に細胞質に対してＲＮＡを導入する働きをなす。即ち、上記したシクロデキストリン・デンドリマー結合体はＲＮＡ導入剤として使用することができ、この中でも特にｓｉＲＮＡの導入剤として有効である。ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）とは、重合度が２０前後（例えば、１８〜２３塩基程度）の低重合度のＲＮＡで、そのＲＮＡを導入することによりＲＮＡの発現を阻害する働きを有するＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは通常、二本鎖からなっている。なお、ｓｉＲＮＡは、哺乳動物細胞系でも細胞毒性を示さずにＲＮＡｉを誘導できることが実証されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭ，ｅｔ ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４１１：４９４−４９８）。
シクロデキストリン・デンドリマー結合体とｓｉＲＮＡは、図２の上の模式図に示す通り、静電的相互作用により複合体を形成する。
本発明で用いるシクロデキストリン・デンドリマー結合体とＲＮＡとのモル配合比は、通常１：５〜１０：１、好ましくは１；３〜３：１の範囲であることが好ましい。
３．ＤＮＡ発現ベクターとの併用
本発明の方法で用いることのできるシクロデキストリン・デンドリマー結合体はそのまま単独でＲＮＡ導入剤として使用することもできるが、他のＤＮＡ発現ベクターと併用して用いることもできる。
上記の場合、シクロデキストリン・デンドリマー結合体とＤＮＡ発現ベクターとの配合割合（モル比）は、通常１００００：１〜１：１、好ましくは１０００；１〜１０：１の範囲であることが好ましい。
４．細胞にＲＮＡを導入する方法
本発明のＲＮＡ導入方法では、導入すべきＲＮＡとシクロデキストリン・デンドリマー結合体の存在下で細胞をインキュベーションする。例えば、ＲＮＡを導入すべき細胞を含有する培地０．５〜１ｍｌ（細胞量約２×１０５個）に、導入すべきＲＮＡを含有する溶液とシクロデキストリン・デンドリマー結合体含有溶液を添加する。導入すべきＲＮＡを含有する溶液は、例えば、ＲＮＡ量が１〜２μｇ／μｌとなるように添加し、シクロデキストリン・デンドリマー結合体含有溶液は、例えば、シクロデキストリン・デンドリマー結合体が１ｍＭとなるように添加する。添加後、約２４時間インキュベートすることにより、トランスフェクションすることができる。ＲＮＡを導入すべき細胞を含有する培地の種類や量は、使用する細胞に応じて適宜決定することができ、また、ＲＮＡ及びシクロデキストリン・デンドリマー結合体の添加量やインキュベーション時間も適宜変化させることができる。
５．シクロデキストリン・デンドリマー結合体のｓｉＲＮＡ導入作用
本発明で用いる特定のシクロデキストリン・デンドリマー結合体は、ｓｉＲＮＡ導入剤として、図２のようにエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれた後、エンドソームに移行する。シクロデキストリン・デンドリマー結合体のシクロデキストリン部分はエンドソーム部分の膜成分と相互作用し、膜成分を破壊することによりｓｉＲＮＡを細胞内に効果的に放出すると考えられる。放出されたｓｉＲＮＡは配列特異的にｍＲＮＡの分解を引き起こすと考えられる。
６．用途：試薬
本発明の細胞内へのＲＮＡの導入方法によれば、遺伝子の任意の部位の機能を阻害する働きをするため、遺伝子操作により遺伝子の本来の発現が阻害にされたノックアウト哺乳動物を産生することができる。このことは遺伝子創薬の研究等に有用に使用することができる。
７．ＲＮＡ導入用ベクター
本発明のＲＮＡ導入用ベクターは、シクロデキストリン・デンドリマー結合体からなる。シクロデキストリン・デンドリマー結合体は、前記シクロデキストリンが、例えば、非修飾型又は化学修飾型のα、β又はγシクロデキストリンであり、デンドリマーが例えば、ポリアミドアミン型またはポリ（エチレンイミン）型であることができ、またデンドリマーが例えば、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７またはＧ８に属するものであることができる。このベクターは上記のように、細胞へのＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡの導入に使用することができる。
以下に実施例を挙げて本発明につき更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例になんら制約されるものではない。Embodiments of the present invention will be described in detail.
The present invention relates to a method for introducing RNA into a cell, comprising the step of incubating the cell in the presence of the RNA to be introduced and a cyclodextrin / dendrimer conjugate.
1. Cyclodextrin / dendrimer conjugate In the method of the present invention, a cyclodextrin / dendrimer conjugate having the structure exemplified in FIG. 1 can be used as the RNA introduction agent. This cyclodextrin / dendrimer conjugate can be easily produced by heating and mixing the dendrimer and cyclodextrin in a solvent.
(Cyclodextrin)
The cyclodextrin constituting the cyclodextrin-dendrimer conjugate is α, β, or γ cyclodextrin. These α, β, or γ cyclodextrins can also be chemically modified or unmodified cyclodextrins. These α, β, or γ cyclodextrins are readily available as commercial products. Of these, α-cyclodextrin is preferred in the present invention because it has the most excellent effect as an introducing agent.
Cyclodextrin may be partially or wholly acetylated, or may be modified with a sugar such as glucose, mannose, or saccharose. The reaction between these modifiers and cyclodextrin can be produced by making them both aqueous solutions, and heating and stirring. When used as an introducing agent, it is preferable not to modify it because the introduction efficiency is high.
(Dendrimer)
Dendrimer, which is one component of the cyclodextrin / dendrimer conjugate used in the present invention, has ammonia or ethylenediamine as a core molecule, and methyl acrylate and ethylenediamine are added to the molecule by Michael addition reaction. It is a new type of synthetic polymer characterized by a highly branched dendritic structure obtained by repeating (Generation) and having a number of primary amino groups at its ends. The dendrimer used in the present invention is preferably a polyamidoamine type.
The polyamidoamine type dendrimer synthesizes a central nucleus called generation 0 (G0) by reacting ammonia with methyl acrylate and ethylenediamine (ammonia: methyl acrylate: ethylenediamine = 1: 3: 3 (molar ratio)). . Generation 0 has a form in which three condensates (amidoamine) of methyl acrylate and ethylenediamine are bonded around nitrogen derived from ammonia. One amino group of ethylenediamine is present at the end of the amidoamine of generation 0 (G0). Therefore, by reacting this central core (generation 0 (G0)) with methyl acrylate: ethylenediamine = 3: 3 (molar ratio), a condensate of two methyl acrylates and ethylenediamine with the amino group at the terminal of the amidoamine. (Amidoamine) binds. Thus, what combined the condensate (amidoamine) of two methyl acrylates and ethylenediamine to nitrogen derived from the amino group of G0 is called generation 1 (G1). In this way, generations 2, 3, 4, 5, 6 (G2, G3, G4, G5, G6) are obtained by sequentially combining the condensate of methyl acrylate and ethylenediamine. This state is shown in the following reaction scheme.
Figure 0004649571
The polyamidoamine type dendrimer is commercially available, and a commercially available product can be easily obtained. The dendrimer used in the conjugate of the present invention is not particularly limited as long as it is a polyamidoamine type dendrimer, but for example, it can belong to G2.
The dendrimer-cyclodextrin conjugate can be synthesized in a two-step reaction in which a dendrimer and cyclodextrin are mixed and heated and stirred in the presence of an aqueous medium, which is advantageous in terms of cost compared to a commercially available RNA introduction agent. it is conceivable that.
The molar ratio of cyclodextrin and dendrimer in the cyclodextrin / dendrimer conjugate used in the present invention is usually 1.5 to 5: 1, preferably about 2 to 4: 1.
A cyclodextrin / dendrimer conjugate can be synthesized by reacting a tosylated cyclodextrin and a dendrimer for several hours under heating conditions, as shown in the examples described later. Tosylated (toluenesulfonylated) cyclodextrin is obtained by reacting p-toluenesulfonyl chloride and cyclodextrin in pyridine.
2. siRNA
In the present invention, the above-mentioned cyclodextrin / dendrimer conjugate functions to introduce RNA into the cytoplasm, particularly into the cytoplasm. That is, the above cyclodextrin / dendrimer conjugate can be used as an RNA introducing agent, and is particularly effective as an siRNA introducing agent. siRNA (small interfering RNA) is a low-polymerization RNA having a polymerization degree of around 20 (for example, about 18 to 23 bases), and is an RNA having a function of inhibiting RNA expression by introducing the RNA. . siRNA usually consists of double strands. It has been demonstrated that siRNA can induce RNAi without showing cytotoxicity even in mammalian cell lines (Elbashir SM, et al: Nature (2001) 411: 494-498).
The cyclodextrin / dendrimer conjugate and siRNA form a complex by electrostatic interaction as shown in the schematic diagram of FIG.
The molar ratio of the cyclodextrin / dendrimer conjugate and RNA used in the present invention is usually in the range of 1: 5 to 10: 1, preferably 1: 3 to 3: 1.
3. Combination with DNA expression vector The cyclodextrin / dendrimer conjugate that can be used in the method of the present invention can be used alone as an RNA introduction agent, but can also be used in combination with other DNA expression vectors.
In the above case, the compounding ratio (molar ratio) of the cyclodextrin / dendrimer conjugate and the DNA expression vector is usually in the range of 10,000: 1 to 1: 1, preferably 1000: 1 to 10: 1.
4). Method for Introducing RNA into Cells In the RNA introduction method of the present invention, cells are incubated in the presence of RNA to be introduced and a cyclodextrin / dendrimer conjugate. For example, a solution containing RNA to be introduced and a solution containing a cyclodextrin / dendrimer conjugate are added to 0.5 to 1 ml of a medium containing cells to be introduced with RNA (amount of cells of about 2 × 10 5 cells). The solution containing RNA to be introduced is added, for example, so that the RNA amount is 1-2 μg / μl, and the cyclodextrin / dendrimer conjugate-containing solution is, for example, 1 mM of cyclodextrin / dendrimer conjugate. Add to. Transfection can be accomplished by incubation for about 24 hours after addition. The type and amount of the medium containing the cells into which RNA should be introduced can be determined appropriately according to the cells used, and the addition amount and incubation time of the RNA and cyclodextrin / dendrimer conjugate should be changed appropriately. Can do.
5. SiRNA Introduction Action of Cyclodextrin / Dendrimer Conjugate The specific cyclodextrin / dendrimer conjugate used in the present invention is incorporated into cells by endocytosis as shown in FIG. . The cyclodextrin portion of the cyclodextrin / dendrimer conjugate is considered to interact with the membrane component of the endosome portion and effectively release siRNA into the cell by destroying the membrane component. The released siRNA is considered to cause degradation of mRNA in a sequence-specific manner.
6). Use: Reagent According to the method for introducing RNA into cells of the present invention, a knockout mammal whose original expression of the gene is inhibited by genetic manipulation is used to function to inhibit the function of an arbitrary site of the gene. Can be produced. This can be usefully used for gene drug research and the like.
7). RNA introduction vector The RNA introduction vector of the present invention comprises a cyclodextrin-dendrimer conjugate. In the cyclodextrin / dendrimer conjugate, the cyclodextrin is, for example, an unmodified or chemically modified α, β or γ cyclodextrin, and the dendrimer is, for example, a polyamidoamine type or a poly (ethyleneimine) type. And the dendrimer can belong to, for example, G2, G3, G4, G5, G6, G7 or G8. This vector can be used to introduce RNA, particularly siRNA, into cells as described above.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

［実施例１］：デンドリマー／シクロデキストリン結合体の調製
（トシル化α−ＣｙＤの調製）
Ｍｅｌｔｏｎらの方法に準じて合成した。ベンゼンで水分を共沸除去した乾燥α−シクロデキストリン（α−ＣｙＤ）８ｇを無水ピリジン５００ｍＬに溶解後、５℃以下に冷却、攪拌しながらｐ−トルエンスルホニルクロライド６ｇを加え、室温で２時間攪拌した。反応溶液に水（約１００ｍＬ）を注ぎ込み反応を停止させた後、減圧濃縮し、アセトン１００ｍＬを添加して析出した沈殿物を濾取した。沈殿物は吸着クロマトグラフィーを用いて分離、精製した。
（多孔性ポリスチレン樹脂（ＤＩＡＩＯＮＲ ＨＰ−２０）；溶離液：メタノール／水＝０：１００ｖ／ｖ→１００：０ｖ／ｖ；２．３ｇ，収率２９％）．ＦＡＢ−Ｍａｓｓ［Ｍ−Ｈ］−ｍ／ｚ１１２５．
（α−シクロデキストリン／デンドリマー（Ｇ３）結合体（置換度２．４）の合成）
デンドリマー（スターバーストポリアミドアミンデンドリマーであるＳｔａｒｂｕｒｓｔ ＰＡＭＡＭ Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ（Ｇ２．０、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製））０．５ｍＬ（１．４５×１０−５ｍｏｌ）を試験管エバポレーターに加えて減圧下メタノールを完全に留去した。その後、トシル化α−ＣｙＤ（３．４７×１０−５ｍｏｌ）３９ｍｇを加え、軽く混合し、試験管内を窒素置換後、油浴中、６０℃で２４時間攪拌した。反応物をＴＯＳＯＨ ＴＳＫＧｅｌ ＨＷ−４０Ｓ（５．３ｃｍ２×７０ｃｍ，溶出緩衝液：０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム）を用いてゲルろ過した。結合体を含むフラクション画分を濃縮後、濃縮液を０．５ｍＬの水に再溶解し、メタノール３ｍＬを加えて十分に白濁するまで混和した。沈殿物を含む溶液を１５００ｒｐｍ、１５分間遠心分離後、上清を取り除き、再びメタノール３ｍＬを添加してよく混合し、同様に遠心分離した後上清を取り除き、残渣中のメタノールを試験管エバポレーターにより完全に留去した。α−ＣＤＥ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＤＳ２．４）：収量１８％；１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ（ｐｐｍ ｆｒｏｍ ＴＭＳ）４．９４（Ｈ１，α−ＣｙＤ），３．８６−３．７４（Ｈ３，Ｈ５，Ｈ６，α−ＣｙＤ），３．５３−３．４７（Ｈ２，Ｈ４，α−ＣｙＤ），３．２７−３．１３（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ），３．０５−２．８１（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ），２．７２−２．５１（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ），２．３６−２．３１（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ）．
物性測定
（ＮＭＲスペクトル測定）
１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲは、日本電子（株）製α−５００ＦＴ−ＮＭＲスペクトロメータを用いて２５℃で測定した。溶媒はＤＭＳＯ−ｄ６あるいはＤ２Ｏを用い、サンプルの濃度は１０ｍＭとした。１Ｈ−ならびに１３Ｃ−シグナルの化学シフトは、ＤＭＳＯあるいはＨ２Ｏのピークを用いてテトラメチルシラン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ，ＴＭＳ）からの低磁場シフトとして表した。
（ＦＡＢマススペクトル測定）
日本電子（株）製ＪＭＳ−ＤＸ ３０３質量分析計を用いて室温で測定した。マトリックスにはＤＭＳＯ：ジエタノールアミン（１：１）混合溶媒を用いた。
［実施例２］：ＲＮＡの導入
（１）遺伝子発現ベクター
遺伝子発現ベクターとして図３に示したｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡとｐＧＬ２−ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡの２種類のベクターを使用した。
ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡとｐＧＬ２−ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡの増幅は以下の通り行った。各プラスミドＤＮＡを導入した大腸菌株ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地（ＢＡＣＴＯＴＲＹＰＴＯＮＥ １０ｇ，ＢＡＣＴＯ ＹＥＡＳＴ ＥＸＴＲＡＣＴ ５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇ／１０００ｍＬ）３ｍＬ中、３７℃で一晩前培養し、その６０μＬを新たなＬＢ培地２５ｍＬに加え、３７℃で１６〜２４時間旋回培養した。プラスミドＤＮＡの精製はＱＩＡＧＥＮ製Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＭＡＸＩを用いて行った。精製操作はマニュアルに準じて行い、精製後のＤＮＡ濃度は、ＴＥに溶解して日立製作所（株）製Ｕ−２０００Ａ型分光光度計を用い、１０Ｄ２６０＝５０μｇＤＮＡ／ｍＬとして算出した。また、ＯＤ２６０／ＯＤ２８０の値から、タンパク混入の有無を判定し、ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１．８以上のものを実験に使用した。
（２）ｓｉＲＮＡ
上記（１）に記載した遺伝子発現ベクターｐＧＬ２とｐＧＬ３による遺伝子の細胞内での発現を、下記の塩基配列を有するｓｉＲＮＡを導入することにより抑制した。なお、ｓｉＲＮＡは通常の化学合成法により合成した。

Figure 0004649571
Figure 0004649571
（３）各種細胞の培養
（ＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養）
マウス繊維芽細胞由来の株化細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞８×１０５個を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地（５９０ｍｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン、１６０ｍｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ３、１×１０５Ｕ／Ｌペニシリン、０．１ｇ／Ｌストレプトマイシン）２０ｍＬに懸濁し、旭テクノグラス（株）製組織培養ディッシュ（１５０ｍｍ）に播種して、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。セミコンフルエントに達した細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ法によりディッシュから剥離し、２０００ｒｐｍ１０分間遠心分離後、上清をすべて取り除き、得られたペレットを１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に１×１０５個／ｍＬの密度で分散した。この細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅに５×１０４／５００μＬになるように播種し、２４時間培養した細胞をトランスフェクション実験に用いた。
（ＨｅｐＧ２細胞の培養）
ヒト肝芽細胞癌由来の株化細胞であるＨｅｐＧ２細胞８×１０５個を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地（５９０ｍｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン、１６０ｍｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ３、１×１０５Ｕ／Ｌペニシリン、０．１ｇ／Ｌストレプトマイシン）１０ｍＬに懸濁し、旭テクノグラス（株）製組織培養ディッシュ（１００ｍｍ）に播種して、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。セミコンフルエントに達した細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ法によりディッシュから剥離し、２０００ｒｐｍ１０分間遠心分離後、上清をすべて取り除き、得られたペレットを１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に１×１０５個／ｍＬの密度で分散した。この細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅに５×１０４／５００μＬになるように播種し、２４時間培養した細胞をトランスフェクション実験に用いた。
（Ａ５４９細胞の培養）
ヒト肺上皮細胞癌由来の株化細胞であるＡ５４９細胞８×１０５個を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地（５９０ｍｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン、１６０ｍｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ３、１×１０５Ｕ／Ｌペニシリン、０．１ｇ／Ｌストレプトマイシン）１０ｍＬに懸濁し、旭テクノグラス（株）製組織培養ディッシュ（１００ｍｍ）に播種して、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。セミコンフルエントに達した細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ法によりディッシュから剥離し、２０００ｒｐｍ１０分間遠心分離後、上清をすべて取り除き、得られたペレットを１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に１×１０５個／ｍＬの密度で分散した。この細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅに５×１０４／５００μＬになるように播種し、２４時間培養した細胞をトランスフェクション実験に用いた。
（ＭＤＣＫ細胞の培養）
イヌ腎臓細胞癌由来の株化細胞であるＭＤＣＫ細胞８×１０５個を１０％ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地（５９０ｍｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、１６０ｍｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ３、１×１０５Ｕ／Ｌペニシリン、０．１ｇ／Ｌストレプトマイシン）１０ｍＬに懸濁し、旭テクノグラス（株）製組織培養ディッシュ（１００ｍｍ）に播種して、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。セミコンフルエントに達した細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ法によりディッシュから剥離し、２０００ｒｐｍ１０分間遠心分離後、上清をすべて取り除き、得られたペレットを１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に１×１０５個／ｍＬの密度で分散した。この細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅに５×１０４／５００μＬになるように播種し、２４時間培養した細胞をトランスフェクション実験に用いた。
（４）デンドリマー／シクロデキストリン結合体／プラスミドＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ複合体の作製
１．５ｍＬエッペンドルフチューブに各種培地を添加し、ＴＥに溶解したｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡあるいはｐＧＬ２−ｃｏｎｔｒｏｌＤＮＡ２μＬ（１μｇ／μＬ）とｐＧＬ３ ｓｉＲＮＡあるいはｐＧＬ２ｓｉＲＮＡ（０．４２−０．８４μｇ）を添加し、穏やかに攪拌した。その後、ＨＢＳＳに溶解した各種濃度のデンドリマー／シクロデキストリン結合体を添加し、１０秒間ボルテックスを用いて攪拌後、１５分間室温でインキュベートした。この試料を、デンドリマー／シクロデキストリン結合体／ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ複合体としてトランスフェクション実験に用いた。
（５）トランスフェクション
細胞を１０％ＦＣＳを含む培地で２４時間前培養した。培地を取り除き、デンドリマー／シクロデキストリン結合体／ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ複合体２００μＬを添加し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２下で１時間インキュベートしてトランスフェクションを行った。その後さらにＦＣＳ２２．２μＬを添加（最終濃度１０％ＦＣＳ）し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２下で２３時間インキュベートした。
（６）細胞抽出液の調製
トランスフェクション終了後の各種細胞をＣａ２＋，Ｍｇ２＋不含等張リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））２ｍＬで２回洗浄後、ＰＢＳ（−）で５倍希釈した細胞溶解剤２００μＬを添加し、１５分間室温でインキュベートして細胞を溶解し、凍結（−８０℃）・融解（３７℃）を３回繰り返した後、得られた細胞溶解液を１０，０００ｒｐｍ、５分間で遠心分離した。得られた上清を細胞抽出液とした。
（７）ルシフェラーゼ活性測定
細胞抽出液２０μＬをルミノメーター用試験管に採取し、これにＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μＬを添加し、３０秒後にルミノメーター（Ｌｕｍａｔ：ＬＢ９５０６）で１０秒間の発光量を測定した。ここで得られた値と、タンパク濃度をＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）により測定した結果から、単位タンパク量あたりのＲｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ（ＲＬＵ）を算出した。
上記実験の結果を図４〜図８に示す。
図４は、ｓｉＲＮＡの量を０．４２μｇ、０．５μｇ、０．６μｇ、０．７μｇ、又は０．８４μｇとした場合における、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ発現に及ぼすｐＧＬ３ ｓｉＲＮＡの効果を測定した結果を示す。
ｐＤＮＡ（ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡあるいはｐＧＬ２−ｃｏｎｔｒｏｌＤＮＡ）は２．０μｇ使用した。デンドリマー／シクロデキストリン結合体：ｐＤＮＡの添加量の比率は１００：１である。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
＊、ｐＧＬ２に対してｐ＜０．０５
†、対照に対してｐ＜０．０５
図５は、デンドリマー／シクロデキストリン結合体と遺伝子発現ベクター（ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡとｐＧＬ２−ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡ）の比率を変化させた場合における、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ発現に及ぼすｐＧＬ３ ｓｉＲＮＡの効果を測定した結果を示す。ｐＤＮＡは２．０μｇ使用し、ｓｉＲＮＡは０．７μｇ使用した。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
＊、ｐＧＬ２に対してｐ＜０．００５
†、対照に対してｐ＜０．００５
図６は、各種のＲＮＡ導入剤を用いた場合における、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ発現に及ぼすｐＧＬ３ ｓｉＲＮＡの効果を測定した結果を示す。ｐＤＮＡは２．０μｇ使用し、ｓｉＲＮＡは０．７μｇ使用した。ＴｒａｎｓＦａｓｔ，Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００およびｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ／ｐＤＮＡの添加量の比率は、それぞれ１／１とした。Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ Ｇ３及びα−ＣＤＥｓ／ｐＤＮＡの添加量の比率は１００／１とした。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
＊、ｐＧＬ２に対してｐ＜０．０５
†、対照に対してｐ＜０．０５
図７は、ｓｉＲＮＡの量を０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、０．６μｇ、又は０．７μｇとした場合のＨｅｐＧ２細胞におけるルシフェラーゼ発現に及ぼすｐＧＬ３ ｓｉＲＮＡの効果を測定した結果を示す。
ｐＤＮＡ（ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡあるいはｐＧＬ２−ｃｏｎｔｒｏｌＤＮＡ）は２．０μｇ使用した。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
＊、ｐＧＬ２に対してｐ＜０．０５
†、対照に対してｐ＜０．０５
図８は、各種の細胞におけるｓｉＲＮＡ効果を比較した結果を示す。ｐＤＮＡは２．０μｇ使用し、ｓｉＲＮＡは０．７μｇ使用した。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
上記実験のさらに別の結果を図９〜図１２に示す。
図９は、ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼすｓｉＲＮＡの配列特異的な効果を測定した結果を示す。
ｐＤＮＡ（ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌＤＮＡあるいはｐＧＬ２−ｃｏｎｔｒｏｌＤＮＡ）は２．０μｇ使用し、ｓｉＲＮＡは０．７μｇ使用した。ｐＤＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の添加量の比率は１／１００である。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
＊、コントロールに対してｐ＜０．０５
†、ｐＧＬ２に対してｐ＜０．０５
‡、ｐＧＬ３に対してｐ＜０．０５
図１０は、ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の三成分複合体をトランスフェクションした各種細胞（ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ａ５４９細胞及びＨｅｐＧ２細胞）におけるｐＧＬ３ ｓｉＲＮＡの濃度依存的な効果を測定した結果を示す。ｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。各値は３〜４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
図１１は、ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の三成分複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ発現に及ぼす投与比率（ｐＤＮＡ／α−ＣＤＥ結合体）の効果を測定した結果を示す。左図の上方の線はｐＧＬ３ｓｉＲＮＡなしの場合、左図の下方の線はｐＧＬ３ｓｉＲＮＡありの場合を示す。ｐＤＮＡは２．０μｇ使用し、ｓｉＲＮＡは０．７μｇ使用した。阻害（％）は、（ｐＧＬ３ｓｉＲＮＡありの場合のルシフェラーゼ活性）／（ｐＤＮＡのみの場合のルシフェラーゼ活性）の百分率を示す。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
＊、コントロールに対してｐ＜０．０５
図１２は、ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ／各種担体の三成分複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼすｐＧＬ３ｓｉＲＮＡ用の各種ベクターの効果を測定した結果を示す。ｐＤＮＡは２．０μｇ使用し、ｓｉＲＮＡは０．７μｇ使用した。市販のトランスフェクション試薬／ｐＤＮＡの投与量の比率は、１／１とした。ｐＤＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の投与比率は１／１００とした。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
＊、コントロールに対してｐ＜０．０５
†、ｐＧＬ２に対してｐ＜０．０５
上記実験のさらに別の結果を表１〜表４に示す。
表１は、ｐＤＮＡ（ｐＧＬ３）／ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の三成分複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼす各種ベクターの阻害効果を比較した結果を示す。
表２は、ｐＤＮＡ（ｐＧＬ２）／ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の三成分複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼす各種ベクターの阻害効果を比較した結果を示す。
表３は、ｐＤＮＡ（ｐＧＬ３）／ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の三成分複合体をトランスフェクションしたＡ５４９細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼす各種ベクターの阻害効果を比較した結果を示す。
表４は、ｐＤＮＡ（ｐＧＬ２）／ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の三成分複合体をトランスフェクションしたＡ５４９細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼす各種ベクターの阻害効果を比較した結果を示す。
なお、表１〜４において、１）ＣＶは変動係数を示す。
Figure 0004649571
Figure 0004649571
Figure 0004649571
Figure 0004649571
上記実験のさらに別の結果を図１３〜図１６に示す。
図１３は、ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ／担体の三成分複合体をトランスフェクションした各種細胞における当該ベクターの阻害効果を比較した結果を示す。ｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ｐＤＮＡは２．０μｇ使用し、ｓｉＲＮＡは０．７μｇ使用した。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
図１４は、ｐＤＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼすｐＧＬ３ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の複合体のポストトランスフェクションの効果を測定した結果を示す。
実験の手順は以下の通りである。ＮＩＨ３Ｔ３細胞（５×１０４細胞／ウエル）を２４時間インキュベートした後に、ｐＤＮＡ／α−ＣＤＥ複合体を添加し、さらに１時間インキュベートした。細胞を２回洗浄した後、ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ複合体を添加し、１時間インキュベートした。ＦＣＳ（牛胎児血清）を終濃度１０％となるように添加し、２２時間インキュベートした後、Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ（ＲＬＵ）とタンパク質含量を測定した。
ここではｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ｐＤＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の投与量の比率は１／１００とした。ｐＤＮＡは２．０μｇ使用し、ｓｉＲＮＡは０．７μｇ使用した。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
＊、コントロールに対してｐ＜０．０５
†、ｐＧＬ２に対してｐ＜０．０５
図１５は、ｐＤＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の複合体をポストトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼすｓｉＲＮＡ／担体の複合体の投与量の比率の効果を測定した結果を示す。グラフ中、各群には３列ずつ結果が存在するが、左の列はコントロールを示し、真中の列はｐＧＬ２ｓｉＲＮＡを用いた結果を示し、右の列はｐＧＬ３ｓｉＲＮＡを用いた結果を示す。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。ＰＥＩはポリエチレンイミンを示す。
＊、コントロールに対してｐ＜０．０５
図１６は、ｐＤＮＡ／担体の複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼす、ｐＧＬ３ｓｉＲＮＡ／担体の複合体のポストトランスフェクションにおける各種担体の阻害効果を示す。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
図４〜図１６及び表１〜４に示した結果から、本発明の方法に従って、導入すべきＲＮＡとシクロデキストリン・デンドリマー結合体の存在下で細胞をインキュベーションすることによって細胞に効率的にＲＮＡを導入することができ、導入したＲＮＡによるＲＮＡｉ効果により標的遺伝子の発現を効果的に抑制できることが実証された。また、上記したＲＮＡｉ効果による標的遺伝子の発現抑制は、試験した様々な細胞（ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ａ５４９細胞、及びＨｅｐＧ２細胞）において配列特異的に観察された。α−ＣＤＥ結合体を用いた発現抑制効果は、市販のトランスフェクション試薬（ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭ、及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００）を用いた場合よりも優れていることが実証された。[Example 1]: Preparation of dendrimer / cyclodextrin conjugate (Preparation of tosylated α-CyD)
Synthesized according to the method of Melton et al. After dissolving 8 g of dry α-cyclodextrin (α-CyD) azeotropically removed with benzene in 500 mL of anhydrous pyridine, 6 g of p-toluenesulfonyl chloride was added while cooling to 5 ° C. or lower and stirring, and stirring at room temperature for 2 hours did. Water (about 100 mL) was poured into the reaction solution to stop the reaction, followed by concentration under reduced pressure, 100 mL of acetone was added, and the deposited precipitate was collected by filtration. The precipitate was separated and purified using adsorption chromatography.
(Porous polystyrene resin (DIAION R HP-20); eluent: methanol / water = 0: 100v / v → 100 : 0v / v; 2.3g, 29% yield). FAB-Mass [M−H] − m / z 1125.
(Synthesis of α-cyclodextrin / dendrimer (G3) conjugate (substitution degree 2.4))
Add 0.5 mL (1.45 × 10 −5 mol) of a dendrimer (Starburst PAMAM Dendrimer (G2.0, manufactured by Aldrich Chemical)) which is a starburst polyamidoamine dendrimer to the test tube evaporator and completely remove methanol under reduced pressure. Left. Thereafter, 39 mg of tosylated α-CyD (3.47 × 10 −5 mol) was added and mixed gently. After the atmosphere in the test tube was replaced with nitrogen, the mixture was stirred in an oil bath at 60 ° C. for 24 hours. The reaction was gel filtered using TOSOH TSKGel HW-40S (5.3 cm 2 × 70 cm, elution buffer: 0.1 M ammonium bicarbonate). After concentrating the fraction fraction containing the conjugate, the concentrate was redissolved in 0.5 mL of water, and 3 mL of methanol was added and mixed until it became sufficiently cloudy. After centrifuging the solution containing the precipitate at 1500 rpm for 15 minutes, remove the supernatant, add 3 mL of methanol again and mix well. After centrifuging in the same manner, remove the supernatant, and remove the methanol in the residue using a test tube evaporator. Distilled completely. α-CDE conjugate (DS 2.4): Yield 18%; 1 H-NMR (500 MHz, D 2 O) δ (ppm from TMS) 4.94 (H1, α-CyD), 3.86-3.74 ( H3, H5, H6, α-CyD), 3.53-3.47 (H2, H4, α-CyD), 3.27-3.13 (dendrimer methylene), 3.05-2.81 (dendrimer methylene) ), 2.72-2.51 (dendrimer methylene), 2.36-2.31 (dendrimer methylene).
Physical property measurement (NMR spectrum measurement)
1 H- and 13 C-NMR were measured at 25 ° C. using an α-500 FT-NMR spectrometer manufactured by JEOL Ltd. The solvent used was DMSO-d 6 or D 2 O, and the sample concentration was 10 mM. Chemical shifts of 1 H- and 13 C-signals were expressed as low magnetic field shifts from tetramethylsilane (TMS) using DMSO or H 2 O peaks.
(FAB mass spectrum measurement)
The measurement was performed at room temperature using a JMS-DX 303 mass spectrometer manufactured by JEOL Ltd. A DMSO: diethanolamine (1: 1) mixed solvent was used for the matrix.
[Example 2]: Introduction of RNA (1) Gene Expression Vector Two types of vectors, pGL3-control DNA and pGL2-control DNA shown in FIG. 3, were used as gene expression vectors.
Amplification of pGL3-control DNA and pGL2-control DNA was performed as follows. E. coli strain JM109 into which each plasmid DNA was introduced was pre-cultured overnight at 37 ° C. in 3 mL of LB medium (BACOTRYPTONE 10 g, BACTO YEST EXTRACT 5 g, NaCl 5 g / 1000 mL) containing 100 μg / mL ampicillin. In addition to 25 mL of LB medium, swirling culture was performed at 37 ° C. for 16 to 24 hours. Purification of the plasmid DNA was performed using a Plasmid Purification Kit MAXI manufactured by QIAGEN. The purification operation was performed according to the manual, and the DNA concentration after purification was calculated as 10D 260 = 50 μg DNA / mL by dissolving in TE and using a U-2000A spectrophotometer manufactured by Hitachi, Ltd. Further, the value of OD 260 / OD 280, determines the presence of protein contamination, was used for the experiments OD 260 / OD 280 = 1.8 or more.
(2) siRNA
Expression of the gene in the cells by the gene expression vectors pGL2 and pGL3 described in (1) above was suppressed by introducing siRNA having the following base sequence. In addition, siRNA was synthesize | combined by the normal chemical synthesis method.
Figure 0004649571
Figure 0004649571
(3) Culture of various cells (NIH3T3 cell culture)
8 × 10 5 NIH3T3 cells, a cell line derived from mouse fibroblasts, were added to 10% FCS-containing DMEM medium (590 mg / L L-glutamine, 160 mg / L NaHCO 3 , 1 × 10 5 U / L penicillin; 1 g / L streptomycin), suspended in Asahi Techno Glass Co., Ltd. tissue culture dish (150 mm), and cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 . Cells that have reached semi-confluence are detached from the dish by trypsin-EDTA method, centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes, all the supernatant is removed, and the resulting pellet is placed in DMEM medium containing 10% FCS at a density of 1 × 10 5 cells / mL. Dispersed. The cell suspension was seeded to be 5 × 10 4 / 500μL in 24 well micro plate, using cells cultured for 24 hours in the transfection experiments.
(Culture of HepG2 cells)
8 × 10 5 HepG2 cells derived from human hepatoblastoma cell lines were added to 10% FCS-containing DMEM medium (590 mg / L L-glutamine, 160 mg / L NaHCO 3 , 1 × 10 5 U / L penicillin, 0 (1 g / L streptomycin) suspended in 10 mL, seeded on a tissue culture dish (100 mm) manufactured by Asahi Techno Glass Co., Ltd., and cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 . Cells that have reached semi-confluence are detached from the dish by trypsin-EDTA method, centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes, all the supernatant is removed, and the resulting pellet is placed in DMEM medium containing 10% FCS at a density of 1 × 10 5 cells / mL. Dispersed. The cell suspension was seeded to be 5 × 10 4 / 500μL in 24 well micro plate, using cells cultured for 24 hours in the transfection experiments.
(Culture of A549 cells)
8 × 10 5 A549 cells, which are cell lines derived from human lung epithelial cell carcinoma, were added to 10% FCS-containing DMEM medium (590 mg / L L-glutamine, 160 mg / L NaHCO 3 , 1 × 10 5 U / L penicillin, 0 (1 g / L streptomycin) suspended in 10 mL, seeded on a tissue culture dish (100 mm) manufactured by Asahi Techno Glass Co., Ltd., and cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 . Cells that have reached semi-confluence are detached from the dish by trypsin-EDTA method, centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes, all the supernatant is removed, and the resulting pellet is placed in DMEM medium containing 10% FCS at a density of 1 × 10 5 cells / mL. Dispersed. The cell suspension was seeded to be 5 × 10 4 / 500μL in 24 well micro plate, using cells cultured for 24 hours in the transfection experiments.
(Culture of MDCK cells)
8 × 10 5 MDCK cells derived from canine renal cell carcinoma are cultured in 10% FCS-containing MEM medium (590 mg / L L-glutamine, 1% non-essential amino acid, 160 mg / L NaHCO 3 , 1 × 10 5 U. / L penicillin, 0.1 g / L streptomycin), suspended in a tissue culture dish (100 mm) manufactured by Asahi Techno Glass Co., Ltd., and cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 . . Cells that have reached semi-confluence are detached from the dish by trypsin-EDTA method, centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes, all the supernatant is removed, and the resulting pellet is placed in DMEM medium containing 10% FCS at a density of 1 × 10 5 cells / mL. Dispersed. The cell suspension was seeded to be 5 × 10 4 / 500μL in 24 well micro plate, using cells cultured for 24 hours in the transfection experiments.
(4) Preparation of dendrimer / cyclodextrin conjugate / plasmid DNA / siRNA complex Various media were added to a 1.5 mL Eppendorf tube and pGL3-control DNA or pGL2-control DNA 2 μL (1 μg / μL) and pGL3 siRNA dissolved in TE Alternatively, pGL2 siRNA (0.42-0.84 μg) was added and gently stirred. Thereafter, various concentrations of dendrimer / cyclodextrin conjugates dissolved in HBSS were added, and the mixture was stirred for 10 seconds using a vortex and then incubated at room temperature for 15 minutes. This sample was used in transfection experiments as a dendrimer / cyclodextrin conjugate / pDNA / siRNA complex.
(5) Transfection Cells were pre-cultured for 24 hours in a medium containing 10% FCS. The medium was removed, 200 μL of dendrimer / cyclodextrin conjugate / pDNA / siRNA complex was added, and transfection was performed by incubating in a CO 2 incubator at 37 ° C. under 5% CO 2 for 1 hour. After that, 22.2 μL of FCS was further added (final concentration: 10% FCS) and incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C. under 5% CO 2 for 23 hours.
(6) Preparation of cell extract After transfection, various cells were washed twice with 2 mL of Ca 2+ , Mg 2+ -free isotonic phosphate buffer (PBS (−)) and then diluted 5-fold with PBS (−). 200 μL of the cell lysing agent was added, and the cells were lysed by incubation at room temperature for 15 minutes. After freezing (−80 ° C.) and thawing (37 ° C.) three times, the obtained cell lysate was added at 10,000 rpm Centrifuged for 5 minutes. The obtained supernatant was used as a cell extract.
(7) Measurement of luciferase activity 20 μL of cell extract is collected in a luminometer test tube, and 100 μL of Luciferase Assay Substrate (Promega) is added thereto. It was measured. The relative light unit (RLU) per unit protein amount was calculated from the value obtained here and the result of measuring the protein concentration by BCA protein Assay Kit (PIERCE).
The results of the above experiment are shown in FIGS.
FIG. 4 shows the results of measuring the effect of pGL3 siRNA on luciferase expression in NIH3T3 cells when the amount of siRNA is 0.42 μg, 0.5 μg, 0.6 μg, 0.7 μg, or 0.84 μg. .
2.0 μg of pDNA (pGL3-control DNA or pGL2-control DNA) was used. The ratio of the addition amount of dendrimer / cyclodextrin conjugate: pDNA is 100: 1. Each value is the mean ± SEM of 4 experiments. E is shown.
*, P <0.05 vs. pGL2
†, p <0.05 vs. control
FIG. 5 shows the results of measuring the effect of pGL3 siRNA on luciferase expression in NIH3T3 cells when the ratio of dendrimer / cyclodextrin conjugate and gene expression vector (pGL3-control DNA and pGL2-control DNA) was changed. Show. 2.0 μg of pDNA was used and 0.7 μg of siRNA was used. Each value is the mean ± SEM of 4 experiments. E is shown.
*, P <0.005 for pGL2
†, p <0.005 vs control
FIG. 6 shows the results of measuring the effect of pGL3 siRNA on luciferase expression in NIH3T3 cells when using various RNA introduction agents. 2.0 μg of pDNA was used and 0.7 μg of siRNA was used. The ratio of the amounts of TransFast, Lipofectamine 2000 and lipofection / pDNA added was 1/1. The ratio of the addition amount of Dendrimer G3 and α-CDEs / pDNA was 100/1. Each value is the mean ± SEM of 4 experiments. E is shown.
*, P <0.05 vs. pGL2
†, p <0.05 vs. control
FIG. 7 shows the results of measuring the effect of pGL3 siRNA on luciferase expression in HepG2 cells when the amount of siRNA is 0.3 μg, 0.4 μg, 0.5 μg, 0.6 μg, or 0.7 μg.
2.0 μg of pDNA (pGL3-control DNA or pGL2-control DNA) was used. Each value is the mean ± SEM of 4 experiments. E is shown.
*, P <0.05 vs. pGL2
†, p <0.05 vs. control
FIG. 8 shows the results of comparing siRNA effects in various cells. 2.0 μg of pDNA was used and 0.7 μg of siRNA was used. Each value is the mean ± SEM of 4 experiments. E is shown.
Further results of the above experiment are shown in FIGS.
FIG. 9 shows the results of measuring the sequence-specific effect of siRNA on luciferase activity in NIH3T3 cells transfected with a complex of pDNA / siRNA / α-CDE conjugate.
2.0 μg of pDNA (pGL3-control DNA or pGL2-control DNA) was used, and 0.7 μg of siRNA was used. The ratio of the added amount of pDNA / α-CDE conjugate is 1/100. Each value is the mean ± SEM of 4 experiments. E is shown.
*, P <0.05 vs control
†, p <0.05 vs. pGL2
‡ p <0.05 vs. pGL3
FIG. 10 shows the results of measuring the concentration-dependent effect of pGL3 siRNA in various cells (NIH3T3 cells, A549 cells, and HepG2 cells) transfected with a pDNA / siRNA / α-CDE conjugate ternary complex. A pGL3 control vector was used. Each value is the mean ± SEM of 3-4 experiments. E is shown.
FIG. 11 shows the results of measuring the effect of the administration ratio (pDNA / α-CDE conjugate) on luciferase expression in NIH3T3 cells transfected with the pDNA / siRNA / α-CDE conjugate ternary complex. The upper line in the left figure shows the case without pGL3 siRNA, and the lower line in the left figure shows the case with pGL3 siRNA. 2.0 μg of pDNA was used and 0.7 μg of siRNA was used. Inhibition (%) indicates the percentage of (luciferase activity with pGL3 siRNA) / (luciferase activity with pDNA alone). Each value is the mean ± SEM of 4 experiments. E is shown.
*, P <0.05 vs control
FIG. 12 shows the results of measuring the effects of various vectors for pGL3 siRNA on the luciferase activity in NIH3T3 cells transfected with a pDNA / siRNA / various carrier ternary complex. 2.0 μg of pDNA was used and 0.7 μg of siRNA was used. The dose ratio of commercially available transfection reagent / pDNA was 1/1. The administration ratio of pDNA / α-CDE conjugate was 1/100. Each value is the mean ± SEM of 4 experiments. E is shown.
*, P <0.05 vs control
†, p <0.05 vs. pGL2
Further results of the above experiments are shown in Tables 1 to 4.
Table 1 shows the results of comparing the inhibitory effects of various vectors on luciferase activity in NIH3T3 cells transfected with a pDNA (pGL3) / siRNA / α-CDE conjugate ternary complex.
Table 2 shows the results of comparing the inhibitory effects of various vectors on luciferase activity in NIH3T3 cells transfected with a pDNA (pGL2) / siRNA / α-CDE conjugate ternary complex.
Table 3 shows the results of comparing the inhibitory effects of various vectors on luciferase activity in A549 cells transfected with a pDNA (pGL3) / siRNA / α-CDE conjugate ternary complex.
Table 4 shows the results of comparing the inhibitory effects of various vectors on luciferase activity in A549 cells transfected with a pDNA (pGL2) / siRNA / α-CDE conjugate ternary complex.
In Tables 1 to 4, 1) CV represents a coefficient of variation.
Figure 0004649571
Figure 0004649571
Figure 0004649571
Figure 0004649571
Further results of the above experiment are shown in FIGS.
FIG. 13 shows the results of comparing the inhibitory effects of the vectors in various cells transfected with a pDNA / siRNA / carrier ternary complex. A pGL3 control vector was used. 2.0 μg of pDNA was used and 0.7 μg of siRNA was used. Each value is the mean ± SEM of 4 experiments. E is shown.
FIG. 14 shows the results of measuring the effect of post-transfection of pGL3 siRNA / α-CDE conjugate complex on luciferase activity in NIH3T3 cells transfected with the pDNA / α-CDE conjugate complex.
The experimental procedure is as follows. After NIH3T3 cells (5 × 10 4 cells / well) were incubated for 24 hours, the pDNA / α-CDE complex was added and incubated for an additional hour. After washing the cells twice, siRNA or siRNA / α-CDE complex was added and incubated for 1 hour. FCS (fetal bovine serum) was added to a final concentration of 10% and incubated for 22 hours, and then the relative light unit (RLU) and protein content were measured.
Here, a pGL3 control vector was used. The dose ratio of pDNA / α-CDE conjugate was 1/100. 2.0 μg of pDNA was used and 0.7 μg of siRNA was used. Each value is the mean ± SEM of 4 experiments. E is shown.
*, P <0.05 vs control
†, p <0.05 vs. pGL2
FIG. 15 shows the results of measuring the effect of the dose ratio of siRNA / carrier complex on luciferase activity in NIH3T3 cells post-transfected with the pDNA / α-CDE conjugate complex. In the graph, there are three results for each group, but the left column shows the control, the middle column shows the result using pGL2 siRNA, and the right column shows the result using pGL3 siRNA. Each value is the mean ± SEM of 4 experiments. E is shown. PEI indicates polyethyleneimine.
*, P <0.05 vs control
FIG. 16 shows the inhibitory effect of various carriers in post-transfection of pGL3siRNA / carrier complex on luciferase activity in NIH3T3 cells transfected with pDNA / carrier complex. Each value is the mean ± SEM of 4 experiments. E is shown.
From the results shown in FIGS. 4 to 16 and Tables 1 to 4, according to the method of the present invention, RNA can be efficiently transferred to cells by incubating the cells in the presence of the RNA to be introduced and the cyclodextrin / dendrimer conjugate. It was demonstrated that the expression of the target gene can be effectively suppressed by the RNAi effect of the introduced RNA. Moreover, the suppression of target gene expression by the RNAi effect described above was observed in a sequence-specific manner in various cells tested (NIH3T3 cells, A549 cells, and HepG2 cells). It was demonstrated that the expression-suppressing effect using the α-CDE conjugate is superior to that when using commercially available transfection reagents (TransFast ™ , Lipofection ™ , and Lipofectamine ™ 2000).

本発明の方法によれば、ＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡを細胞内に効率よく導入できる。また、ＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡを細胞内に安価に導入できる。更に本発明によれば、生体に害を及ぼす可能性の少ないＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡを細胞内に安価に導入する方法を提供することができる。ＲＮＡｉは配列が知られている標的遺伝子のｍＲＮＡをノックアウト（破壊）することによりその遺伝子の機能を探索することができる方法であり、また細胞レベルで確認できるため、動物を使用して確認する従来の遺伝子ノックアウト法に比べ、非常に簡単で安価であり、短時間で結果が得られる。本発明の方法をＲＮＡｉ法に適用することにより、安価かつ簡便に効率よく遺伝子の機能を解析することが可能になる。  According to the method of the present invention, RNA, particularly siRNA, can be efficiently introduced into cells. In addition, RNA, particularly siRNA, can be introduced into cells at low cost. Furthermore, according to the present invention, it is possible to provide a method for introducing RNA, particularly siRNA, which has little possibility of harming a living body into cells at low cost. RNAi is a method that can search for the function of a gene by knocking out (destroying) the mRNA of a target gene whose sequence is known, and since it can be confirmed at the cellular level, it is conventionally confirmed using animals. Compared with this gene knockout method, it is very simple and inexpensive, and results can be obtained in a short time. By applying the method of the present invention to the RNAi method, it becomes possible to analyze the function of a gene inexpensively, simply and efficiently.

Claims (6)

導入すべきｓｉＲＮＡとシクロデキストリン・デンドリマー結合体の存在下で細胞をインキュベーションする工程を含む、細胞にｓｉＲＮＡを導入する方法において、シクロデキストリン・デンドリマー結合体におけるシクロデキストリンとデンドリマーとのモル比が１．５〜５：１である、上記方法。 Comprising the step of incubating the cells in the presence of siRNA and cyclodextrin dendrimer conjugate to be introduced, a method of introducing siRNA into cells, the molar ratio of cyclodextrin and dendrimers in cyclodextrin dendrimer conjugate 1. The above process, which is 5-5: 1. シクロデキストリンが、α−シクロデキストリンである、請求項１記載の細胞にＲＮＡを導入する方法。The method for introducing RNA into a cell according to claim 1, wherein the cyclodextrin is α-cyclodextrin. ジェネレーションが２〜３のデンドリマーを使用する、請求項１又は２に記載の細胞にｓｉＲＮＡを導入する方法。The method for introducing siRNA into a cell according to claim 1 or 2, wherein a dendrimer having a generation of 2 to 3 is used. 請求項１から３の何れかに記載の方法により細胞にｓｉＲＮＡを導入し、導入したｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉により標的遺伝子の発現を抑制する方法。Introducing siRNA into the cell by the method according to any one of claims 1 to 3, a method of suppressing the expression of a target gene by RNA interference by the introduced siRNA. シクロデキストリン・デンドリマー結合体（ここで、デンドリマー結合体におけるシクロデキストリンとデンドリマーとのモル比は１．５〜５：１である）を含む、ｓｉＲＮＡ導入剤。 A siRNA introduction agent comprising a cyclodextrin-dendrimer conjugate (wherein the molar ratio of cyclodextrin to dendrimer in the dendrimer conjugate is 1.5 to 5: 1 ) . ＲＮＡ干渉による遺伝子発現の抑制のために使用する、請求項５に記載のｓｉＲＮＡ導入剤。The siRNA introduction agent according to claim 5 , which is used for suppression of gene expression due to RNA interference.
JP2005511930A 2003-07-16 2004-07-16 Methods for introducing RNA into cells Active JP4649571B2 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003197773 2003-07-16
JP2003197773 2003-07-16
PCT/JP2004/010548 WO2005007850A1 (en) 2003-07-16 2004-07-16 Method of infusing rna in cell

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2005007850A1 JPWO2005007850A1 (en) 2006-08-31
JP4649571B2 true JP4649571B2 (en) 2011-03-09

Family

ID=34074352

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2005511930A Active JP4649571B2 (en) 2003-07-16 2004-07-16 Methods for introducing RNA into cells

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP4649571B2 (en)
WO (1) WO2005007850A1 (en)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003508456A (en) * 1999-09-01 2003-03-04 ジェネキュア プライベート リミティド Pharmaceutical delivery method and composition

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003508456A (en) * 1999-09-01 2003-03-04 ジェネキュア プライベート リミティド Pharmaceutical delivery method and composition

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2005007850A1 (en) 2006-08-31
WO2005007850A1 (en) 2005-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Takahashi et al. Synthesis of novel cationic lipids having polyamidoamine dendrons and their transfection activity
KR101590652B1 (en) Means for delivery of nucleic acids active for gene silencing using synthetic polymers
JP5697123B2 (en) Method for introducing nucleic acid into cells using acidified polyethylenimine
CN103153347A (en) Novel low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
US8017742B2 (en) Gene carrier
CN110724687A (en) Compositions and methods for modulating complement factor B expression
JP4064108B2 (en) Gene carrier
JP2011505826A5 (en)
JPWO2005078084A1 (en) Polyion complex carrying double-stranded oligonucleic acid, process for producing the same and pharmaceutical composition containing the same
JP6873418B2 (en) Method for producing transgenic cells and substitute polymer of polyethyleneimine
JP2011511776A (en) Cationic siRNA for RNA interference, synthesis and use
JP4649571B2 (en) Methods for introducing RNA into cells
JP5092123B2 (en) Gene transfer agent
EP2552460A1 (en) Polymers for delivering molecules of interest
WO2022054801A1 (en) siRNA AND USE THEREOF
Hagiwara et al. Development of prodrug type circular siRNA for in vivo knockdown by systemic administration
JP2023533124A (en) Double-stranded oligonucleotides and compositions for treating coronavirus infection-19 (COVID-19) containing the same
IL293589A (en) Peptide docking vehicle for targeted nucleic acid delivery and uses thereof
JP2011103811A (en) Rna delivery reagent specific to hepatocyte
US11434317B2 (en) Lipid-polymer based complexation and delivery of nucleic acids
FR2941152A1 (en) VECTORS COMPRISING ANIONIC MACROMOLECULE AND CATIONIC LIPID FOR THE ADMINISTRATION OF SMALL NUCLEIC ACIDS
Nainytė Synthesis of modified oligonucleotides for prebiotic studies and as novel CoV-2 therapeutics
JP2011098959A (en) Rna delivery reagent specific to tumor cell
KR101995142B1 (en) Small interfering rna and pharmaceutical composition for inhibiting galectin-12 expression and/or enhancing lipolysis containing the same and use thereof
JP2001103969A (en) Cyclodextrin-dendrimer conjugation and its use

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20070711

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100629

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100827

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20100827

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20101019

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20101110

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20101109

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20101109

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Ref document number: 4649571

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131224

Year of fee payment: 3

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131224

Year of fee payment: 3

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131224

Year of fee payment: 3

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250