JP4629563B2 - Antiphospholipid antibody measurement reagent - Google Patents
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Description
本発明は、梅毒感染の診断を精度良く行うことができるとともに、長期保存安定性に優れる抗リン脂質抗体測定試薬に関する。 The present invention relates to a reagent for measuring an antiphospholipid antibody that can accurately diagnose syphilis infection and has excellent long-term storage stability.
梅毒の病原体であるトレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ Ｐａｌｌｉｄｕｍ）が生体に感染すると、該病原体に対する抗体とともに、リン脂質と反応性を持つ抗体が産生される。抗リン脂質抗体測定試薬は、血中のリン脂質と反応性を持つ抗体の有無を測定することにより、梅毒の感染を判定する試薬である。 When Treponema Pallidum, a pathogen of syphilis, infects a living body, an antibody reactive with phospholipid is produced together with an antibody against the pathogen. The antiphospholipid antibody measurement reagent is a reagent for determining the infection of syphilis by measuring the presence or absence of an antibody reactive with phospholipid in blood.
従来、抗リン脂質測定には、判定板を用いたＲＰＲカードテスト等の用手法で行われていたが、近年、生化学自動分析装置に適用可能な試薬（自動化試薬）が発売されている。
この自動化試薬においては、患者の採血負担を軽減する目的で、用手法と比べて少量の血清で測定されることが多い。そのため、試薬と血中の抗体の反応により起こる抗原抗体反応量も少量となる。よって、自動化試薬においては、抗原抗体反応を促進する増感剤を添加する場合がある。一般に用いられる増感剤としては、ポリエチレングリコール、デキストラン等がある。また、抗リン脂質抗体測定試薬における増感剤としては、特許文献１にポリビニルピロリドン及びプルランに効果があることが示されている。
Conventionally, anti-phospholipid measurement has been performed by a technique such as an RPR card test using a judgment plate, but in recent years, a reagent (automated reagent) applicable to a biochemical automatic analyzer has been put on the market.
This automated reagent is often measured with a small amount of serum compared to the conventional method for the purpose of reducing the burden of blood collection on the patient. Therefore, the amount of antigen-antibody reaction caused by the reaction between the reagent and the antibody in the blood is also small. Therefore, in an automated reagent, a sensitizer that promotes an antigen-antibody reaction may be added. Commonly used sensitizers include polyethylene glycol and dextran. As a sensitizer in an antiphospholipid antibody measurement reagent, Patent Document 1 shows that polyvinylpyrrolidone and pullulan are effective.
しかしながら、このような増感剤は、抗原抗体反応を促進する効果には優れているが、試薬を長期保存した場合の安定性において問題があり、長期保存後感度が低下し、試薬性能を保つことができないという問題があった。
本発明は、上記現状に鑑み、梅毒感染の診断を精度良く行うことができるとともに、長期保存安定性に優れる抗リン脂質抗体測定試薬を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above situation, and an object of the present invention is to provide an antiphospholipid antibody measuring reagent that can accurately diagnose syphilis infection and has excellent long-term storage stability.
本発明は、リン脂質抗原を担持した不溶性担体と検体中の抗リン脂質抗体との抗原抗体反応により生じる凝集の度合いを光学的に測定又は目視にて観察することにより検体中の抗リン脂質抗体を測定する梅毒感染の診断に用いられる抗リン脂質抗体測定試薬であって、リン脂質抗原を担持した不溶性担体と、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンに由来するセグメント及び親水性モノマーに由来するセグメントを有する共重合体とを含有する抗リン脂質抗体測定試薬である。
以下に、本発明を詳述する。
The present invention relates to an antiphospholipid antibody in a sample by optically measuring or visually observing the degree of aggregation caused by an antigen-antibody reaction between an insoluble carrier carrying a phospholipid antigen and an antiphospholipid antibody in the sample. An anti-phospholipid antibody measurement reagent used for diagnosis of syphilis infection, comprising an insoluble carrier carrying a phospholipid antigen , a segment derived from 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, and a segment derived from a hydrophilic monomer An antiphospholipid antibody measurement reagent containing a copolymer.
The present invention is described in detail below.
本発明者らは、鋭意検討の結果、抗リン脂質抗体測定試薬中に、増感剤として２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンに由来するセグメント及び親水性モノマーに由来するセグメントを有する共重合体を含有させることにより、測定感度が向上するとともに、長期にわたり保存安定性を保つことが可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies, the present inventors include a copolymer having a segment derived from 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine and a segment derived from a hydrophilic monomer as a sensitizer in the antiphospholipid antibody measurement reagent. As a result, it has been found that the measurement sensitivity can be improved and the storage stability can be maintained over a long period of time, and the present invention has been completed.
本発明の抗リン脂質抗体測定試薬は、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンに由来するセグメント及び親水性モノマーに由来するセグメントを有する共重合体（以下、単に共重合体ともいう）とを含有する。
上記親水性モノマーとして、メタクリル酸を用いた場合における上記共重合体の構造を下記一般式（１）に示す。
The antiphospholipid antibody measurement reagent of the present invention contains a copolymer having a segment derived from 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine and a segment derived from a hydrophilic monomer (hereinafter also simply referred to as a copolymer).
The structure of the copolymer when methacrylic acid is used as the hydrophilic monomer is shown in the following general formula (1).
上記２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンは、メタクリロイル基を有することから、他の重合性モノマーと共重合することが可能である。共重合可能な親水性モノマーとしては、例えば、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド等の（メタ）アクリル酸系単量体等が挙げられる。 Since the 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine has a methacryloyl group, it can be copolymerized with other polymerizable monomers. Examples of the copolymerizable hydrophilic monomer include (meth) acrylic acid monomers such as 2-hydroxyethyl methacrylate, (meth) acrylate, and (meth) acrylamide.
上記親水性モノマーとしては特に限定されないが、例えば、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。なかでも、血液成分中のタンパク質等と静電反発することが期待される理由から、カチオン性である（メタ）アクリル酸が好適である。
ここで、（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸又はメタクリル酸を意味する。
Although it does not specifically limit as said hydrophilic monomer, For example, (meth) acrylic acid, (meth) acrylamide, etc. are mentioned. Of these, cationic (meth) acrylic acid is preferred because it is expected to have electrostatic repulsion with proteins and the like in blood components.
Here, (meth) acrylic acid means acrylic acid or methacrylic acid.
上記共重合体における上記２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンに由来するセグメントと、親水性モノマーに由来するセグメントとの比としては特に限定されず、必要に応じて適宜選択されればよいが、モル比で５：５〜３：７であることが好ましい。上記２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンに由来するセグメントの比がこれ未満であると、抗トレポネーマ・パリダム抗体測定における血清干渉の発生を効果的に防ぐことができないことがある。 The ratio of the segment derived from the 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine and the segment derived from the hydrophilic monomer in the copolymer is not particularly limited, and may be appropriately selected as necessary. It is preferably 5: 5 to 3: 7. If the ratio of the segment derived from 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine is less than this, it may be impossible to effectively prevent the occurrence of serum interference in the measurement of anti-treponema / paridum antibody.
上記共重合体の重量平均分子量としては特に限定されないが、好ましい下限は５０００、好ましい上限は５００万である。５０００未満であると、凝集促進効果がなくなることがあり、５００万を超えると、試薬中に添加した場合に粘性が上がりすぎ、再現性等が悪化してしまうことがある。 Although it does not specifically limit as a weight average molecular weight of the said copolymer, A preferable minimum is 5000 and a preferable upper limit is 5 million. If it is less than 5,000, the aggregation promoting effect may be lost, and if it exceeds 5,000,000, when added to the reagent, the viscosity becomes too high and reproducibility may deteriorate.
本発明の抗リン脂質抗体測定試薬における上記共重合体の含有量の好ましい下限は０．１（ｗ／ｖ）％、好ましい上限は１．２（ｗ／ｖ）％である。０．１（ｗ／ｖ）％未満であると、血清干渉の発生を効果的に防止できないことがあり、１．２（ｗ／ｖ）％を超えると、試薬の粘性が上がりすぎ、再現性が低下することがある。
より好ましい下限は０．２（ｗ／ｖ）％、より好ましい上限は０．８（ｗ／ｖ）％である。
The preferable lower limit of the content of the copolymer in the antiphospholipid antibody measurement reagent of the present invention is 0.1 (w / v)%, and the preferable upper limit is 1.2 (w / v)%. If it is less than 0.1 (w / v)%, it may not be possible to effectively prevent the occurrence of serum interference. If it exceeds 1.2 (w / v)%, the reagent viscosity becomes too high and reproducibility. May decrease.
A more preferred lower limit is 0.2 (w / v)%, and a more preferred upper limit is 0.8 (w / v)%.
本発明の抗リン脂質抗体測定試薬は、リン脂質抗原を担持した不溶性担体を含有する。
上記リン脂質抗原としては、例えば、カルジオリピン、ホスファチジルコリン、及び、コレステロールからなる脂質抗原が好ましい。
The reagent for measuring an antiphospholipid antibody of the present invention contains an insoluble carrier carrying a phospholipid antigen .
As the phospholipid antigen , for example, a lipid antigen consisting of cardiolipin, phosphatidylcholine, and cholesterol is preferable.
上記カルジオリピンは、ウシの心臓から精製したものを用いることが好ましいが、化学的に合成されたものであってもよい。 The cardiolipin is preferably purified from bovine heart, but may be chemically synthesized.
上記ホスファチジルコリンは、ニワトリの卵黄から精製されたものを用いることが好ましいが、ホスファチジルコリンの含有量が６０〜８０％であるレシチンを用いてもよい。 The phosphatidylcholine is preferably purified from chicken egg yolk, but lecithin having a phosphatidylcholine content of 60 to 80% may be used.
上記コレステロールは、動物由来のものであってもよいし、化学的に合成されたものであってもよい。 The cholesterol may be derived from an animal or chemically synthesized.
上記カルジオリピン、ホスファチジルコリン、及び、コレステロールの混合比としては、梅毒の感染の有無が判定できる性能を持つもの程度であれば特に限定されないが、カルジオリピン１に対して、ホスファチジルコリン８〜１２、コレステロール１〜５であることが好ましい。 The mixing ratio of the cardiolipin, phosphatidylcholine, and cholesterol is not particularly limited as long as it has a performance capable of determining the presence or absence of syphilis infection. It is preferable that
上記不溶性担体としては特に限定されないが、フェニル基を有する重合性単量体及び／又は陰イオン性の重合性単量体の重合体からなるものを用いることが好ましい。 The insoluble carrier is not particularly limited, but it is preferable to use a carrier composed of a polymerizable monomer having a phenyl group and / or a polymer of an anionic polymerizable monomer.
上記フェニル基を有する重合性単量体としては特に限定されず、例えば、スチレン、ジビニルベンゼン、エチルスチレン、α−メチルスチレン、ｐ−クロロスチレン、クロロメチルスチレン等が挙げられる。これらは、単独で用いられてもよいし、併用されてもよい。 The polymerizable monomer having a phenyl group is not particularly limited, and examples thereof include styrene, divinylbenzene, ethylstyrene, α-methylstyrene, p-chlorostyrene, and chloromethylstyrene. These may be used alone or in combination.
上記陰イオン性の重合性単量体としては特に限定されず、例えば、スチレンスルホン酸塩、（メタ）アクリル酸、ジビニルベンゼンスルホン酸塩、エチルスチレンスルホン酸塩、α−メチルスルホン酸塩等が挙げられる。この場合の塩としては特に限定されず、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。これらは、単独で用いられてもよいし、２種以上が併用してもよい。なかでも、スチレンスルホン酸塩及び／又は（メタ）アクリル酸が好ましい。上記メチレンスルホン酸塩及び／又は（メタ）アクリル酸を含有することにより、得られる不溶性担体自身が良好な乳化力を有するものとなる。 The anionic polymerizable monomer is not particularly limited, and examples thereof include styrene sulfonate, (meth) acrylic acid, divinylbenzene sulfonate, ethyl styrene sulfonate, and α-methyl sulfonate. Can be mentioned. The salt in this case is not particularly limited, and examples thereof include sodium salt, potassium salt, lithium salt, ammonium salt and the like. These may be used alone or in combination of two or more. Of these, styrene sulfonate and / or (meth) acrylic acid are preferable. By containing the methylene sulfonate and / or (meth) acrylic acid, the obtained insoluble carrier itself has a good emulsifying power.
上記陰イオン性の重合性単量体を用いて得られる不溶性担体は、表面電荷を有するものとなるので、乳化剤がなくても溶液中に良好に分散されるものとなる。なお、不溶性担体の懸濁液中に乳化剤が存在すると、これに脂質抗原を担持させて抗リン脂質抗体測定試薬とした場合に、乳化剤が特異的な抗原抗体反応による高分子球状体の凝集を阻害したり、場合によっては非特異的な反応に関与したりする場合があるため、乳化剤を含有しないことが好ましい。 The insoluble carrier obtained by using the above anionic polymerizable monomer has a surface charge, so that it can be well dispersed in the solution without an emulsifier. If an emulsifier is present in the suspension of the insoluble carrier, when the lipid antigen is supported on this suspension to prepare an antiphospholipid antibody measurement reagent, the emulsifier causes aggregation of polymer spheres due to a specific antigen-antibody reaction. It is preferable not to contain an emulsifier because it may inhibit or possibly participate in a non-specific reaction.
上記フェニル基を有する重合性単量体及び陰イオン性の重合性単量体の重合体からなる不溶性担体を用いる場合、それぞれの重合性単量体の共重合体成分の含有量としては特に限定されないが、上記フェニル基を有する重合性単量体の共重合体成分１００重量部に対して、陰イオン性の重合性単量体の共重合体成分が５０重量部以下であることが好ましい。陰イオン性の重合性単量体の共重合部分が５０重量部を超えると、得られる不溶性担体が分散しにくくなることがある。より好ましくは３０重量部以下である。 When an insoluble carrier comprising a polymer of the above-mentioned polymerizable monomer having a phenyl group and an anionic polymerizable monomer is used, the content of the copolymer component of each polymerizable monomer is particularly limited. However, the copolymer component of the anionic polymerizable monomer is preferably 50 parts by weight or less with respect to 100 parts by weight of the copolymer component of the polymerizable monomer having a phenyl group. When the copolymerization part of the anionic polymerizable monomer exceeds 50 parts by weight, the resulting insoluble carrier may be difficult to disperse. More preferably, it is 30 parts by weight or less.
上記不溶性担体は、表面電荷を有するものであるが、この表面電荷は、上述した共重合成分である陰イオン性の重合性単量体に基づくものと、重合時に使用される重合開始剤の切片の陰イオンに基づくものとによるものである。上記重合開始剤の切片の陰イオンに基づくものとは、例えば、過硫酸カリウム等の過流酸塩を用いた場合には、切片である硫酸根（−ＯＳＯ３ −）が共重合粒子表面に存在し、この硫酸根が徐々に加水分解を受けて、下記式のように変化したものである。
−ＳＯ３ −＋Ｈ２Ｏ→−ＯＨ＋ＨＯＳＯ３ −
The insoluble carrier has a surface charge. This surface charge is based on the above-described anionic polymerizable monomer which is a copolymerization component, and a segment of a polymerization initiator used during polymerization. This is based on the negative anion. For example, when a persulfate such as potassium persulfate is used, the radical based on the anion in the section of the polymerization initiator has a sulfate radical (-OSO 3 − ) as a section on the copolymer particle surface. This sulfate group is gradually hydrolyzed and changed as shown in the following formula.
—SO 3 − + H 2 O → —OH + HOSO 3 −
上記不溶性担体は、懸濁液としたときの表面荷電密度が陰イオンの乖離濃度で０．０１〜０．４μｍｏｌ／ｍ２であることが好ましい。なお、上記懸濁液の媒体は、免疫学的測定試験に用いられるものであり、例えば、水、生理食塩水、血清等が挙げられる。
０．０１μｍｏｌ／ｍ２未満であると、粒子間の反発力が弱いので、不溶性担体自体が有する乳化力が損なわれることがあり、０．４μｍｏｌ／ｍ２を超えると、不溶性担体間の電気的反発力が強くなり、自己凝集は起こさず、安定であるが、抗原抗体反応による凝集も妨げられるので、高感度な測定ができなくなることがある。
The insoluble carrier preferably has a surface charge density of 0.01 to 0.4 μmol / m 2 in terms of anion dissociation concentration when made into a suspension. The suspension medium is used for immunological measurement tests, and examples thereof include water, physiological saline, and serum.
If it is less than 0.01μmol / m 2, since the repulsive force between the particles is weak, it may emulsifying power possessed by the insoluble carrier itself is impaired, exceeds 0.4μmol / m 2, the electrical between the insoluble carrier The repulsive force becomes strong and self-aggregation does not occur and is stable, but aggregation due to the antigen-antibody reaction is also hindered, so that highly sensitive measurement may not be possible.
また、上記不溶性担体は、粒子径が０．１〜０．７μｍの球状体であることが好ましい。０．１μｍ未満であると、凝集による光学的変化量が小さく、測定に必要な高い感度が得られないことがあり、０．７μｍを超えると、粒子の凝集による光学的変化量が測定可能域を超えてしまい、測定範囲が小さくなることがある。より好ましい下限は０．２μｍ、より好ましい上限は０．５μｍである。 The insoluble carrier is preferably a spherical body having a particle size of 0.1 to 0.7 μm. If it is less than 0.1 μm, the amount of optical change due to aggregation is small, and high sensitivity required for measurement may not be obtained. If it exceeds 0.7 μm, the amount of optical change due to particle aggregation is measurable. The measurement range may become smaller. A more preferable lower limit is 0.2 μm, and a more preferable upper limit is 0.5 μm.
上記重合性単量体を重合する方法としては特に限定されず、重合開始剤を用いて、乳化重合、懸濁重合、シード重合、分散重合等を行う方法が挙げられる。
上記重合開始剤としては特に限定されず、例えば、過硫酸カリウム等の過硫酸塩等が挙げられる。
The method for polymerizing the polymerizable monomer is not particularly limited, and examples thereof include a method of performing emulsion polymerization, suspension polymerization, seed polymerization, dispersion polymerization and the like using a polymerization initiator.
The polymerization initiator is not particularly limited, and examples thereof include persulfates such as potassium persulfate.
上記不溶性担体に、上記リン脂質抗原を担持する方法としては特に制限されず、従来公知の方法により、物理的及び／又は化学的結合により担持させる方法等が挙げられる。 The method for supporting the phospholipid antigen on the insoluble carrier is not particularly limited, and examples thereof include a method of supporting the phospholipid antigen by physical and / or chemical bonding by a conventionally known method.
本発明の抗リン脂質抗体測定試薬は、上記リン脂質抗原を担持した不溶性担体と、上記共重合体とを同一の媒体に分散及び溶解させることにより１液系のラテックス試薬として使用してもよく、また、上記リン脂質抗原を担持した不溶性担体を含有する第１試薬と、上記共重合体を媒体に添加した緩衝液からなる第２試薬とで構成された２液系の試薬として使用してもよい。 The antiphospholipid antibody measurement reagent of the present invention may be used as a one-component latex reagent by dispersing and dissolving the insoluble carrier carrying the phospholipid antigen and the copolymer in the same medium. In addition, it is used as a two-component reagent composed of a first reagent containing an insoluble carrier carrying the phospholipid antigen and a second reagent comprising a buffer solution in which the copolymer is added to a medium. Also good.
上記媒体としては特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。
また、上記媒体のｐＨとしては特に限定されないか、好ましい下限は５．５、好ましい上限は８．５であり、より好ましい下限は６．５である。
The medium is not particularly limited, and examples thereof include a phosphate buffer, a glycine buffer, a Tris salt buffer, and a Good buffer.
Moreover, it does not specifically limit as pH of the said medium, A preferable minimum is 5.5, a preferable upper limit is 8.5, and a more preferable minimum is 6.5.
上記１液系のラテックス試薬中には、更に、ウシ血清アルブミン、ショ糖、塩化ナトリウム、ＥＤＴＡ・２Ｎａ、界面活性剤等を適宜溶解させもよい。
また、上記ラテックス試薬と溶液状試薬との２液系試薬として使用する場合にも、それぞれにウシ血清アルブミン、ショ糖、塩化ナトリウム、ＥＤＴＡ・２Ｎａ、界面活性剤等を適宜溶解させてもよい。
In the one-component latex reagent, bovine serum albumin, sucrose, sodium chloride, EDTA · 2Na, a surfactant and the like may be appropriately dissolved.
Also, when used as a two-component reagent of the latex reagent and the solution reagent, bovine serum albumin, sucrose, sodium chloride, EDTA · 2Na, a surfactant and the like may be appropriately dissolved in each.
本発明の抗リン脂質抗体測定試薬を用い、検体中の抗リン脂質抗体との抗原抗体反応により生じる凝集の度合いを光学的に測定又は目視にて観察することにより、検体中の抗リン脂質抗体を測定することができる。 By using the antiphospholipid antibody measurement reagent of the present invention and optically measuring or visually observing the degree of aggregation caused by the antigen-antibody reaction with the antiphospholipid antibody in the sample, the antiphospholipid antibody in the sample Can be measured.
上記凝集の度合いを光学的に測定する方法としては、公知の方法が用いられ、例えば、用いる不溶性担体の粒子の大きさ、濃度の選択、反応時間の設定により、散乱光強度、吸収光度、透過光強度の増減を測定する。また、これらの方法を併用することも可能である。なお、上記測定を行う際の光の波長としては、３００〜９００ｎｍが好ましい。 As a method for optically measuring the degree of aggregation, a known method is used. For example, the size, concentration, and reaction time of insoluble carrier particles to be used are selected according to the scattered light intensity, absorbed light intensity, and transmission. Measure the increase or decrease of light intensity. Also, these methods can be used in combination. In addition, as a wavelength of the light at the time of performing the said measurement, 300-900 nm is preferable.
上記の光学的測定方法に用いる装置としては、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を検出できる光学機器が挙げられ、一般的に使用されている生化学自動分析機であればいずれのものであっても使用することができる。 Examples of the apparatus used for the above optical measurement method include optical instruments capable of detecting scattered light intensity, transmitted light intensity, absorbance, etc., and any commonly used biochemical automatic analyzer can be used. It can be used even if it exists.
上記凝集の度合いを目視にて観察する方法としては、通常、検体と本発明の抗リン脂質抗体測定試薬とを判定板上で混合し、混合液を揺り動かした後、凝集の有無を判定する方法等を用いることができる。なお、凝集の度合いの観察には、目視による方法以外に、凝集状態をビデオカメラで撮影し、画像処理を施す方法を用いることも可能である。 As a method for visually observing the degree of aggregation, a method of determining the presence or absence of aggregation is usually performed by mixing a specimen and the antiphospholipid antibody measurement reagent of the present invention on a determination plate, shaking the mixed solution, and Etc. can be used. For observation of the degree of aggregation, in addition to the visual method, a method of photographing the aggregation state with a video camera and performing image processing can be used.
本発明によれば、梅毒感染の診断を精度良く行うことができるとともに、長期保存安定性に優れる抗リン脂質抗体測定試薬を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, while being able to diagnose a syphilis infection accurately, the antiphospholipid antibody measuring reagent excellent in long-term storage stability can be provided.
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
（実施例１）
（１）抗リン脂質抗体測定試薬の調製
下記の手順に従い、第１試薬と第２試薬とからなる２液系の試薬を調製した。
Example 1
(1) Preparation of reagent for measuring antiphospholipid antibody A two-component reagent comprising a first reagent and a second reagent was prepared according to the following procedure.
（１−１）第１試薬の調製
ウシ血清アルブミン（ＬｏｔＡ：セロロジカル社製）を１％含有するリン酸緩衝液にＬｉｐｉｄｕｒｅＤ０２（日本油脂社製、分子量５５万）をＮａＯＨで中和した後、１．２重量％添加することにより第１試薬を調製した。
(1-1) Preparation of First Reagent After neutralizing Lipidure D02 (manufactured by NOF Corporation, molecular weight 550,000) with NaOH in a phosphate buffer containing 1% of bovine serum albumin (LotA: manufactured by Serological), 1 The first reagent was prepared by adding 2 wt%.
（１−２）第２試薬の調製
メディエースＲＰＲ（積水化学工業社製）ラテックス液をそのまま用いることにより第２試薬とした。このラテックス液は、平均粒子径０．４００μｍ、スルホン基量０．３８μｍｏｌ／ｍ２のポリスチレンラテックスに、カルジオリピン、ホスファチジルコリン及びコレステロールからなる脂質抗原を感作したものである。
(1-2) Preparation of second reagent Mediace RPR (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) latex solution was used as it was to obtain the second reagent. This latex solution is obtained by sensitizing a polystyrene latex having an average particle size of 0.400 μm and a sulfone group amount of 0.38 μmol / m 2 with a lipid antigen composed of cardiolipin, phosphatidylcholine and cholesterol.
（実施例２）
（１−１）第１試薬の調製において、ウシ血清アルブミン（ＬｏｔＡ：セロロジカル社製）を１％含有するリン酸緩衝液に、ＬｉｐｉｄｕｒｅＤ０３（日本油脂社製、分子量１００万）をＮａＯＨで中和した後、０．７０重量％添加することにより第１試薬を調製したこと以外は、実施例１と同様にして、抗リン脂質抗体測定試薬を調製した。
(Example 2)
(1-1) In preparation of the first reagent, Lipidure D03 (manufactured by NOF Corporation, molecular weight 1 million) was neutralized with NaOH in a phosphate buffer containing 1% of bovine serum albumin (LotA: manufactured by Serological). Thereafter, an antiphospholipid antibody measurement reagent was prepared in the same manner as in Example 1 except that the first reagent was prepared by adding 0.70% by weight.
（実施例３）
（１−１）第１試薬の調製において、ウシ血清アルブミン（ＬｏｔＡ：セロロジカル社製）を１％含有するリン酸緩衝液に、ＬｉｐｉｄｕｒｅＤ０５（日本油脂社製、分子量１００万）をＮａＯＨで中和した後、０．４５重量％添加することにより第１試薬を調製したこと以外は、実施例１と同様にして、抗リン脂質抗体測定試薬を調製した。
(Example 3)
(1-1) In preparation of the first reagent, Lipidure D05 (manufactured by NOF Corporation, molecular weight 1 million) was neutralized with NaOH in a phosphate buffer containing 1% bovine serum albumin (LotA: made by Cellological). Thereafter, an antiphospholipid antibody measurement reagent was prepared in the same manner as in Example 1 except that the first reagent was prepared by adding 0.45% by weight.
（比較例１）
（１−１）第１試薬の調製において、ウシ血清アルブミン（ＬｏｔＡ：セロロジカル社製）を１％含有するリン酸緩衝液に、ＬｉｐｉｄｕｒｅＤ０２の代わりにプルラン（林原社製）を１．２重量％添加し、溶解したこと以外は、実施例１と同様にして、抗リン脂質抗体測定試薬を調製した。
(Comparative Example 1)
(1-1) In preparation of the first reagent, 1.2% by weight of pullulan (Hayashibara) was added to a phosphate buffer containing 1% of bovine serum albumin (LotA: Cellological) instead of Lipidure D02. Then, an antiphospholipid antibody measurement reagent was prepared in the same manner as in Example 1 except that it was dissolved.
（比較例２）
（１−１）第１試薬の調製において、ウシ血清アルブミン（ＬｏｔＡ：セロロジカル社製）を１％含有するリン酸緩衝液に、ＬｉｐｉｄｕｒｅＤ０２の代わりにポリビニルピロリドンを１．０重量％添加し、溶解したこと以外は、実施例１と同様にして、抗リン脂質抗体測定試薬を調製した。
(Comparative Example 2)
(1-1) In preparation of the first reagent, 1.0% by weight of polyvinylpyrrolidone instead of Lipidure D02 was added and dissolved in a phosphate buffer containing 1% of bovine serum albumin (LotA: manufactured by Serological). Except for this, an antiphospholipid antibody measurement reagent was prepared in the same manner as in Example 1.
（比較例３）
（１−１）第１試薬の調製において、ウシ血清アルブミン（ＬｏｔＡ：セロロジカル社製）を１％含有するリン酸緩衝液に、ＬｉｐｉｄｕｒｅＤ０２の代わりにデキストラン（分子量５０万：シグマ社製）を２．０重量％添加し、溶解したこと以外は、実施例１と同様にして、抗リン脂質抗体測定試薬を調製した。
(Comparative Example 3)
(1-1) In the preparation of the first reagent, dextran (molecular weight: 500,000: manufactured by Sigma) is used instead of Lipidure D02 in a phosphate buffer containing 1% of bovine serum albumin (LotA: manufactured by Serological). An antiphospholipid antibody measurement reagent was prepared in the same manner as in Example 1 except that 0% by weight was added and dissolved.
（評価）
実施例１〜３及び比較例１〜３で得られた抗リン脂質抗体測定試薬について、以下の評価を行った。
(Evaluation)
The antiphospholipid antibody measurement reagents obtained in Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 3 were evaluated as follows.
（１）調製直後の吸光度変化量測定
抗リン脂質抗体標準液として、ＲＰＲ標準血清（積水化学工業社製、０．０、１．０、２．０、４．０及び８．０Ｒ．Ｕ．の５濃度）２０μＬを採取し、これに第１試薬１８０μｍを混和し、３７℃で適時保持した後、更に第２試薬６０μＬを添加、攪拌した。その後、波長７００ｎｍにおける約８０秒から３００秒までの間の吸光度の変化量を測定し、吸光度変化量（Δａｂｓ）とした。吸光度測定には自動分析装置日立７１７０型を使用した。なお、Ｒ．Ｕ．は抗リン脂質抗体測定試薬であるメディエースＲＰＲ（積水化学工業社製）を用いて血清を測定した場合の梅毒感染由来の抗リン脂質抗体の抗体価を表す単位である。
結果を表１に示した。
(1) Absorbance change measurement immediately after preparation As an antiphospholipid antibody standard solution, RPR standard serum (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd., 0.0, 1.0, 2.0, 4.0 and 8.0 RU. 20 μL) was collected, 180 μm of the first reagent was mixed with this, and kept at 37 ° C. for an appropriate time, and then 60 μL of the second reagent was further added and stirred. Thereafter, the amount of change in absorbance between about 80 seconds and 300 seconds at a wavelength of 700 nm was measured and used as the amount of change in absorbance (Δabs). An automatic analyzer Hitachi 7170 type was used for the absorbance measurement. R.A. U. Is a unit representing the antibody titer of an antiphospholipid antibody derived from syphilis infection when serum is measured using Mediace RPR (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) which is an antiphospholipid antibody measuring reagent.
The results are shown in Table 1.
（２）保存安定性の評価
第１試薬を３０℃で保存した後、（１）抗リン脂質抗体標準液の測定を行い、調製直後を１００％とした場合のΔａｂｓの低下率を求めることにより保存安定性を評価した。通常、抗リン脂質抗体試薬は２〜１０℃保存されるが、３０℃で保存することで加速試験として保存安定性を評価することができる。
なお、測定は、調製から５日後、１５日後、１８日後及び２５日後について行った。
１．０、２．０、４．０及び８．０Ｒ．Ｕ．の抗リン脂質抗体標準液を使用した場合の結果をそれぞれ図１〜４に示した。
(2) Evaluation of storage stability After storing the first reagent at 30 ° C., (1) Measure the anti-phospholipid antibody standard solution and obtain the decrease rate of Δabs when the immediately after preparation is 100%. Storage stability was evaluated. Usually, the antiphospholipid antibody reagent is stored at 2 to 10 ° C., but storage stability can be evaluated as an accelerated test by storing at 30 ° C.
The measurement was performed 5 days, 15 days, 18 days and 25 days after the preparation.
1.0, 2.0, 4.0, and 8.0R. U. The results when the antiphospholipid antibody standard solution was used are shown in FIGS.
図１、図２に示すように、１．０Ｒ．Ｕ．や２．０Ｒ．Ｕ．の抗リン脂質抗体標準液を用いたときには、２５日後において、プルラン、ＰＶＰ、デキストランを使用した場合における吸光度変化量が１５〜３０％低下していることがわかる。一方、ＬｉｐｉｄｕｒｅＤ０２、Ｄ０３及びＤ０５を使用した場合は、５％以内の低下しか認められない。 As shown in FIG. 1 and FIG. U. And 2.0R. U. When the antiphospholipid antibody standard solution was used, it can be seen that the absorbance change when pullulan, PVP, and dextran were used was reduced by 15 to 30% after 25 days. On the other hand, when Lipidure D02, D03 and D05 are used, only a decrease of 5% or less is observed.
（実施例４）
（１−１）第１試薬の調製において、ウシ血清アルブミン（ＬｏｔＢ）を１％含有するリン酸緩衝液に、ＬｉｐｉｄｕｒｅＤ０３（日本油脂社製）をＮａＯＨで中和した後、０．６６重量％添加したこと以外は、実施例１と同様にして、抗リン脂質抗体測定試薬を調製した。
Example 4
(1-1) In preparation of the first reagent, Lipidure D03 (manufactured by NOF Corporation) was neutralized with NaOH in a phosphate buffer containing 1% bovine serum albumin (LotB), and then added by 0.66% by weight Except that, an antiphospholipid antibody measurement reagent was prepared in the same manner as in Example 1.
（実施例５）
（１−１）第１試薬の調製において、ウシ血清アルブミン（ＬｏｔＣ）を１％含有するリン酸緩衝液に、ＬｉｐｉｄｕｒｅＤ０３（日本油脂社製）をＮａＯＨで中和した後、０．６６重量％添加したこと以外は、実施例１と同様にして、抗リン脂質抗体測定試薬を調製した。
(Example 5)
(1-1) In the preparation of the first reagent, after neutralizing Lipidure D03 (manufactured by NOF Corporation) with NaOH in a phosphate buffer containing 1% bovine serum albumin (LotC), 0.66% by weight is added Except that, an antiphospholipid antibody measurement reagent was prepared in the same manner as in Example 1.
（実施例６）
（１−１）第１試薬の調製において、ウシ血清アルブミン（ＬｏｔＤ）を１％含有するリン酸緩衝液に、ＬｉｐｉｄｕｒｅＤ０３（日本油脂社製）をＮａＯＨで中和した後、０．６６重量％添加したこと以外は、実施例１と同様にして、抗リン脂質抗体測定試薬を調製した。
(Example 6)
(1-1) In preparation of the first reagent, Lipidure D03 (manufactured by NOF Corporation) was neutralized with NaOH in a phosphate buffer containing 1% bovine serum albumin (LotD), and then 0.66% by weight was added Except that, an antiphospholipid antibody measurement reagent was prepared in the same manner as in Example 1.
（比較例４）
（１−１）第１試薬の調製において、ウシ血清アルブミン（ＬｏｔＢ）を１％含有するリン酸緩衝液に、ＬｉｐｉｄｕｒｅＤ０２の代わりにプルラン（林原社製）を１．１重量％添加し、溶解したこと以外は、実施例１と同様にして、抗リン脂質抗体測定試薬を調製した。
(Comparative Example 4)
(1-1) In preparation of the first reagent, 1.1% by weight of pullulan (manufactured by Hayashibara) was added to a phosphate buffer containing 1% bovine serum albumin (LotB) instead of Lipidure D02 and dissolved. Except for this, an antiphospholipid antibody measurement reagent was prepared in the same manner as in Example 1.
（比較例５）
（１−１）第１試薬の調製において、ウシ血清アルブミン（ＬｏｔＣ）を１％含有するリン酸緩衝液に、ＬｉｐｉｄｕｒｅＤ０２の代わりにプルラン（林原社製）を１．１重量％添加し、溶解したこと以外は、実施例１と同様にして、抗リン脂質抗体測定試薬を調製した。
(Comparative Example 5)
(1-1) In preparation of the first reagent, 1.1% by weight of pullulan (manufactured by Hayashibara) was added and dissolved in a phosphate buffer containing 1% of bovine serum albumin (LotC) instead of Lipidure D02. Except for this, an antiphospholipid antibody measurement reagent was prepared in the same manner as in Example 1.
（比較例６）
（１−１）第１試薬の調製において、ウシ血清アルブミン（ＬｏｔＤ）を１％含有するリン酸緩衝液に、ＬｉｐｉｄｕｒｅＤ０２の代わりにプルラン（林原社製）を１．１重量％添加し、溶解したこと以外は、実施例１と同様にして、抗リン脂質抗体測定試薬を調製した。
(Comparative Example 6)
(1-1) In preparation of the first reagent, 1.1% by weight of pullulan (manufactured by Hayashibara) was added and dissolved in a phosphate buffer containing 1% of bovine serum albumin (LotD) instead of Lipidure D02. Except for this, an antiphospholipid antibody measurement reagent was prepared in the same manner as in Example 1.
（評価）
実施例４〜６及び比較例４〜６で得られた、抗リン脂質抗体測定試薬を用いて、以下の評価を行った。
(Evaluation)
The following evaluation was performed using the antiphospholipid antibody measurement reagents obtained in Examples 4 to 6 and Comparative Examples 4 to 6.
（１）調製直後の吸光度変化量測定
抗リン脂質抗体標準液として、ＲＰＲ標準血清（積水化学工業社製、０．０、１．０、２．０、４．０及び８．０Ｒ．Ｕ．の５濃度）２０μＬを採取し、これに第１試薬１８０μｍを混和し、３７℃で適時保持した後、更に第２試薬６０μＬを添加、攪拌した。その後、波長７００ｎｍにおける約８０秒から３００秒までの間の吸光度の変化量を測定し、吸光度変化量（Δａｂｓ）とした。なお、吸光度測定には自動分析装置日立７１７０型を使用した。結果を表２に示した。
(1) Absorbance change measurement immediately after preparation As an antiphospholipid antibody standard solution, RPR standard serum (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd., 0.0, 1.0, 2.0, 4.0 and 8.0 RU. 20 μL) was collected, 180 μm of the first reagent was mixed with this, and kept at 37 ° C. for an appropriate time, and then 60 μL of the second reagent was further added and stirred. Thereafter, the amount of change in absorbance between about 80 seconds and 300 seconds at a wavelength of 700 nm was measured and used as the amount of change in absorbance (Δabs). An automatic analyzer Hitachi 7170 type was used for the absorbance measurement. The results are shown in Table 2.
（２）保存安定性の評価
第１試薬を３０℃で保存した後、（１）抗リン脂質抗体標準液の測定を行い、調製直後を１００％とした場合のΔａｂｓの低下率を求めることにより保存安定性を評価した。通常、抗リン脂質抗体試薬は２〜１０℃保存されるが、３０℃で保存することで加速試験として保存安定性を評価することができる。
なお、測定は、調製から７日後及び１４日後について行った。
１．０及び２．０Ｒ．Ｕ．の抗リン脂質抗体標準液を使用した場合の結果をそれぞれ図５、６に示した。
(2) Evaluation of storage stability After storing the first reagent at 30 ° C., (1) Measure the anti-phospholipid antibody standard solution and obtain the decrease rate of Δabs when the immediately after preparation is 100%. Storage stability was evaluated. Usually, the antiphospholipid antibody reagent is stored at 2 to 10 ° C., but storage stability can be evaluated as an accelerated test by storing at 30 ° C.
The measurement was performed 7 days and 14 days after preparation.
1.0 and 2.0R. U. The results of using the antiphospholipid antibody standard solution are shown in FIGS. 5 and 6, respectively.
図５、６に示すように、ＢＳＡのＬｏｔＤとプルランとを合わせて用いた場合は、３０℃で１４日間保存後に大幅な感度の低下が認められるが、ＢＳＡのＬｏｔＤとＬｉｐｉｄｕｒｅＤ０３とを合わせて用いた場合は、わずかな感度の低下しか認められない。従って、保存安定性についてＢＳＡによる影響を受けにくくなっていることが判明した。 As shown in FIGS. 5 and 6, when BSA LotD and pullulan are used together, a significant decrease in sensitivity is observed after storage at 30 ° C. for 14 days, but BSA LotD and Lipidure D03 are used together. If so, only a slight decrease in sensitivity is observed. Therefore, it was found that the storage stability is less affected by BSA.
本発明によれば、長期保存安定性に優れ、梅毒の感染の診断等を行うことができる抗リン脂質抗体測定試薬を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the antiphospholipid antibody measuring reagent which is excellent in long-term storage stability and can diagnose a syphilis infection etc. can be provided.
Claims (6)
リン脂質抗原を担持した不溶性担体と、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンに由来するセグメント及び親水性モノマーに由来するセグメントを有する共重合体とを含有することを特徴とする抗リン脂質抗体測定試薬。 Syphilis to measure antiphospholipid antibody in specimen by optically measuring or visually observing the degree of aggregation caused by antigen-antibody reaction between insoluble carrier carrying phospholipid antigen and antiphospholipid antibody in specimen An antiphospholipid antibody measurement reagent used for diagnosis of infection,
An antiphospholipid antibody measuring reagent comprising an insoluble carrier carrying a phospholipid antigen , and a copolymer having a segment derived from 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine and a segment derived from a hydrophilic monomer.
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