JP4619500B2

JP4619500B2 - Process for producing β1,3-N-acetylgalactosamine transferase

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Publication number: JP4619500B2
Application number: JP2000273835A
Authority: JP
Inventors: 鋼一古川; 徹也岡島
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 2000-09-08
Filing date: 2000-09-08
Publication date: 2011-01-26
Anticipated expiration: 2020-09-08
Also published as: JP2002085069A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、β１,３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素をコードするＤＮＡを利用した該酵素の製造方法、該酵素を利用したグロボシド(Ｇｂ４)をはじめとする各種糖脂質の糖鎖の製造方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グリコスフィンゴ脂質は糖転移酵素の連続した作用により合成される。ラクトシルセラミド(LacCer；Galβ1,4Glc-Cer)に、異なる３種の糖の内の一つが付加されると、３種の主要な糖脂質系、すなわち、ラクト／ネオラクト系（β1,3-Ｎ-アセチルグルコサミンが付加）、ガングリオ系（α2,3-シアル酸が付加）、およびグロボ系（α1,4-ガラクトースが付加）のいずれか１種となる。
グロボ系糖脂質の一種であるグロボトリアオシルセラミド(Ｇｂ３；Galα1,4Galβ1,4Glc-Cer)は、LacCerにガラクトースが転移してα1,4-結合することにより生成する。この反応を触媒するGb3/CD77合成酵素(α1,4-ガラクトース転移酵素)の遺伝子は、本発明者らによって既にクローニングされている(J.Biol.Chem., 275(20), p15152-15156 (2000))。
【０００３】
一方、グロボ系糖脂質の一種であるグロボシド(Ｇｂ４；GalNAcβ1,3Galα1,4Galβ1,4Glc-Cer)は、Ｇｂ３にN-アセチルガラクトサミンが転移してβ1,3-結合することにより生成するが、この反応を触媒するＧｂ４合成酵素(β1,3-N-アセチルガラクトサミン転移酵素)の遺伝子のクローニングについては報告されていない。
【０００４】
フォルスマン抗原(GalNAcα1,3GalNAcβ1,3Galα1,4Galβ1,4Glc-Cer)は、Ｇｂ４にN-アセチルガラクトサミンが転移してα1,3-結合することにより生成する。この反応を触媒するフォルスマン抗原合成酵素(α1,3-N-アセチルガラクトサミン転移酵素)の遺伝子のクローニングは既に報告されている（J.Biol.Chem., 274(41), p29390-29398 (1999)）。
【０００５】
従って、これらグロボ系糖脂質の合成酵素のなかでクローニングされていないのは、Ｇｂ４合成酵素の遺伝子のみである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Ｇｂ４合成酵素、すなわちβ1,3-N-アセチルガラクトサミン転移酵素をコードするＤＮＡを単離し、さらにその利用法を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、β1,3-N-アセチルガラクトサミン転移酵素をコードするＤＮＡを単離してその塩基配列を明らかにし、さらにこのＤＮＡが、β1,3-N-アセチルガラクトサミン転移酵素を発現することを確認して、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡを細胞に導入し、次いで該細胞を生育させてβ１,３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素を発現させ、これを採取する工程を少なくとも含む、β１,３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素（Ｇｂ４合成酵素）の製造方法（以下、「本発明酵素製造方法」という）を提供する。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
ここで（ｂ）に示すＤＮＡは、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体から、受容体であるＧｂ３糖鎖中のガラクトース残基のＣ３位に、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を転移する酵素活性を有するポリペプチドをコードしているものであることが好ましい。
【０００９】
また本発明は、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチド、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体およびＧｂ３糖鎖を接触させて酵素反応させる工程を少なくとも含む、Ｇｂ４糖鎖の製造方法（以下、「本発明Ｇｂ４製造方法１」という）を提供する。
（Ａ）配列番号２のアミノ酸番号１〜３３１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（Ｂ）アミノ酸配列（Ａ）において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ酸配列からなり、かつＮ−アセチルガラクトサミン供与体から、受容体であるＧｂ３糖鎖中のガラクトース残基のＣ３位に、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
【００１０】
また本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡをＧｂ３糖鎖発現細胞に導入し、次いで該細胞を生育させる工程を少なくとも含む、Ｇｂ４糖鎖の製造方法（以下、「本発明Ｇｂ４製造方法２」という）を提供する。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
ここで（ｂ）に示すＤＮＡは、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体から、受容体であるＧｂ３糖鎖中のガラクトース残基のＣ３位に、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を転移する酵素活性を有するポリペプチドをコードしているものであることが好ましい。
【００１１】
また本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡと、フォルスマン抗原合成酵素をコードするｃＤＮＡとを共にＧｂ３糖鎖発現細胞に導入し、次いで該細胞を生育させる工程を少なくとも含む、フォルスマン抗原糖鎖の製造方法（以下、「本発明フォルスマン製造方法」という）を提供する。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
ここで（ｂ）に示すＤＮＡは、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体から、受容体であるＧｂ３糖鎖中のガラクトース残基のＣ３位に、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を転移する酵素活性を有するポリペプチドをコードしているものであることが好ましい。
【００１２】
また本発明は、β１,３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素（Ｇｂ４合成酵素）の発現のための、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡの使用（以下、「本発明使用」という）を提供する。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本明細書において共通して用いる略号は以下の通りである。
Gal：ガラクトース
Glc：グルコース
GalNAc：N-アセチルガラクトサミン
Cer：セラミド
LacCer：ラクトシルセラミド(Galβ1,4Glc-Cer)
Gb3：グロボトリアオシルセラミド(Galα1,4Galβ1,4Glc-Cer)
Gb3糖鎖：Gb3の糖鎖(Galα1,4Galβ1,4Glc)。「Gb3糖鎖」といった場合、Gb3糖鎖を有しているあらゆる物質（例えば、Gb3自体(Gb3糖鎖にCerが結合した物質)等）も包含する。
Gb4：グロボシド(GalNAcβ1,3Galα1,4Galβ1,4Glc-Cer)
Gb4糖鎖：Gb4の糖鎖(GalNAcβ1,3Galα1,4Galβ1,4Glc)。「Gb4糖鎖」といった場合、Gb4糖鎖を有しているあらゆる物質（例えば、Gb4自体(Gb4糖鎖にCerが結合した物質)等）も包含する。
フォルスマン抗原：GalNAcα1,3GalNAcβ1,3Galα1,4Galβ1,4Glc-Cer
フォルスマン抗原糖鎖：フォルスマン抗原の糖鎖(GalNAcα1,3GalNAcβ1,3Galα1,4Galβ1,4Glc)。「フォルスマン抗原糖鎖」といった場合、フォルスマン抗原糖鎖を有しているあらゆる物質（例えば、フォルスマン抗原自体(フォルスマン抗原糖鎖にCerが結合した物質)等）も包含する。
GM3：SAα2,3Galβ1,4Glc-Cer (SAはシアル酸)
GD3：SAα2,8SAα2,3Galβ1,4Glc-Cer (SAはシアル酸)
UDP：ウリジン-5'-ジリン酸
なお、ガングリオシドの命名法は、Svennerholm (J. Neurochem. 10, p455-463, (1963))に従った。
【００１４】
また本明細書において、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体から、受容体であるＧｂ３糖鎖中のガラクトース残基のＣ３位に、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を転移してβ1,3-結合を形成する反応を触媒する酵素を、「β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素」という。本明細書において、「Ｇｂ４合成酵素」と表記することもある。
【００１５】
また、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体から、受容体であるＧｂ３糖鎖中のガラクトース残基のＣ３位に、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を転移してβ1,3-結合を形成する酵素活性を、「β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素活性」という。本明細書において、「Ｇｂ４合成酵素活性」と表記することもある。
【００１６】
＜１＞本発明酵素製造方法
本発明酵素製造方法は、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡを細胞に導入し、次いで該細胞を生育させてＧｂ４合成酵素を発現させ、これを採取する工程を少なくとも含む、Ｇｂ４合成酵素の製造方法である。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【００１７】
本発明酵素製造方法により製造されるＧｂ４合成酵素は、酵素活性を維持しているものが好ましい。
（ａ）について、配列番号１における塩基番号１０９〜１１０１からなる部分はＧｂ４合成酵素をコードしている領域であることから、この領域を含むＤＮＡを細胞に導入し、次いで該細胞を生育させることにより、Ｇｂ４合成酵素を発現させることができる。
【００１８】
また（ｂ）について、配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、上記（ａ）と同様の構造・機能・作用等を有していると考えられることから、上記（ａ）に代えて上記（ｂ）のＤＮＡを用いることができる。すなわち、上記（ｂ）のＤＮＡは、Ｇｂ４合成酵素活性を有するポリペプチドをコードしていると考えられ、このようなＤＮＡも、上記（ａ）のＤＮＡと同様に用いることができる。よって（ｂ）に示すＤＮＡは、Ｇｂ４合成酵素活性を有するポリペプチドをコードしているものであることが好ましい。
【００１９】
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等参照）。「ストリンジェントな条件」として具体的には、50％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、50mMＨＥＰＥＳ（pH7.0）、10×Denhardt's solution、100μg/mlサケ精子DNAを含む溶液中、42℃でハイブリダイズさせ、次いで室温で２×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液、50℃下で0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液で洗浄する条件が挙げられる。
【００２０】
Ｇｂ４合成酵素活性は、例えば後記実施例に示すように、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体としてUDP-GalNAcを用い、Ｇｂ３糖鎖へのGalNAcの転移反応を利用した測定方法を用いることによって測定できる。
【００２１】
上記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡは、例えば後述の実施例に記載した方法で製造することができ、この方法で製造されたものを用いることが好ましい。またこれらのＤＮＡのうち、（ａ）のＤＮＡを用いることが好ましい。なお、遺伝暗号の縮重による異なった塩基配列を有するＤＮＡを用いてもよいことは、当業者であれば容易に理解されるところである。
【００２２】
上記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡを細胞に導入し、次いでこの細胞（形質転換細胞）を生育させてＧｂ４合成酵素を発現させ、これを採取することにより、酵素活性を維持しているＧｂ４合成酵素を製造することができる。
ＤＮＡは、直接発現させてもよいし、Ｇｂ４合成酵素活性を維持している限りにおいて他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現させてもよい。また、ＤＮＡは全長を発現させてもよいし、Ｇｂ４合成酵素活性を維持している限りにおいて部分ペプチドとして発現させてもよい。
【００２３】
宿主細胞は、上記（ａ）又は（ｂ）に示されたＤＮＡ又はこれらＤＮＡを組み込んだ組換えベクターの機能を発揮できる限りにおいて特に限定されず、動物細胞、植物細胞、微生物細胞（菌体）が包含され、エシェリヒア・コリ等の原核細胞や、哺乳類細胞等の真核細胞が具体的に例示される。エシェリヒア・コリなどの原核細胞を用いた場合は、ＤＮＡの発現によって生じるポリペプチドに糖鎖の付加が起こらないため、糖鎖が付加されていないＧｂ４合成酵素を得ることが可能であり、また、哺乳類細胞等の真核細胞を用いた場合は、ＤＮＡの発現によって生じる酵素に糖鎖が付加しうるため、糖鎖を含むＧｂ４合成酵素の形態で得ることも可能である。
【００２４】
上記（ａ）又は（ｂ）に示されるＤＮＡを導入する宿主細胞としてより具体的には、マウスの線維芽細胞であるＬ細胞や、このＬ細胞をSV40のラージＴ抗原とGb3/CD77合成酵素をコードするcDNAとでトランスフェクトして得られる１Ｂ９細胞が例示される。
【００２５】
上記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡを細胞（宿主細胞）に導入するには、例えば、ＤＮＡを適当なベクターに組み込んで組換えベクターを作製し、この組換えベクターを用いてＤＮＡを宿主細胞に導入すればよい。ベクターとしては、発現ベクターが好ましい。具体的には、pcDNA3.1発現ベクター（インビトロジェン社）等が挙げられる。
【００２６】
ＤＮＡを細胞に導入する方法としては、例えば、DEAE-デキストラン法（J. Biol. Chem., 267, p12082-12089 (1992)）を用いてトランスフェクションを行う方法が例示される。
【００２７】
細胞の生育は、ＤＮＡを導入することによって形質転換された細胞を好適な培地中で培養することにより行っても良く、また、形質転換された細胞を生体内で生育させてもよい。
【００２８】
発現した酵素は、形質転換細胞の培養物から採取できるが、酵素が形質転換細胞の細胞質中又は膜画分に生成、蓄積する場合は形質転換細胞から、また、培地中に蓄積する場合は、培地から、採取する。さらに、酵素が発現した細胞を利用する場合は、形質転換細胞又はその処理物をそのまま、又は適当な固相に結合し、もしくはゲルに包括させ、固定化して、利用することができる。なお培養物には、培地および当該培地中で培養された形質転換細胞が包含される。
【００２９】
培養物からの酵素の採取は、酵素についての公知の抽出、精製方法によって行うことができる。
【００３０】
酵素の抽出方法として具体的には、窒素キャビテーション装置を用いる方法、ホモジナイズ、ガラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、またはこれらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
【００３１】
ＤＮＡとして、前記（ａ）で示されるＤＮＡを１Ｂ９細胞で発現させると、Ｇｂ４合成酵素は細胞の膜画分に局在する。またＤＮＡを、Ｇｂ４合成酵素のポリペプチド又はその一部を欠くポリペプチドと他のポリペプチドとの融合タンパク質として、可溶性の形態で発現させると、同融合タンパク質は細胞質中に局在し得る。また、ＤＮＡを、Ｇｂ４合成酵素のポリペプチド又はその一部を欠くポリペプチドと分泌シグナルとの融合タンパク質として発現させると、培地中に分泌し得る。尚、Ｇｂ４合成酵素のポリペプチドの一部を欠くポリペプチドをコードするＤＮＡは、そのように設計されたプライマーを用いてＰＣＲ(ポリメラーゼ連鎖反応法)を行うことにより、ヒト由来mRNAもしくはcDNAライブラリー、または染色体ＤＮＡから単離することができる。
【００３２】
細胞又は培地から抽出されるＧｂ４合成酵素の精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。なおＧｂ４合成酵素は、必ずしも完全精製する必要もなく、酵素活性を維持している限りにおいて部分精製に止めてもよい。
【００３３】
このようにして得られたＧｂ４合成酵素のアミノ酸配列、分子サイズ、作用、基質特異性等を分析することによって、Ｇｂ４合成酵素の製造が確認できる。
【００３４】
＜２＞各種グロボ系糖脂質の製造方法
(1)本発明Ｇｂ４製造方法１
本発明Ｇｂ４製造方法１は、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチド、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体およびＧｂ３糖鎖を接触させて酵素反応させる工程を少なくとも含む、Ｇｂ４糖鎖の製造方法である。
（Ａ）配列番号２のアミノ酸番号１〜３３１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（Ｂ）アミノ酸配列（Ａ）において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ酸配列からなり、かつＧｂ４合成酵素活性を有するポリペプチド。
【００３５】
（Ａ）について、配列番号２のアミノ酸番号１〜３３１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、Ｇｂ４合成酵素のポリペプチドそのものであり、触媒部位を含んでいる。したがって、このポリペプチド、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体およびＧｂ３糖鎖を接触させて酵素反応させることにより、Ｇｂ４糖鎖を製造することができる。
【００３６】
また（Ｂ）について、「１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ酸配列からなり、かつＧｂ４合成酵素活性を有するポリペプチド」とは、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体から、受容体であるＧｂ３糖鎖中のガラクトース残基のＣ３位に、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を転移する酵素活性（β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素活性）を実質的に害さない１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を有していてもよいポリペプチドを意味する。
【００３７】
すなわち、天然に存在するポリペプチドには、それをコードするＤＮＡの多形や変異の他、生成後のポリペプチドの細胞内および精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように構造的に若干の差違があってもその機能については大きな違いが認められないものも、ここで用いられるポリペプチドに包含される。人為的にポリペプチドのアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（IL-2）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている(Science,224,1431(1984))。また、ある種のポリペプチドは、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるポリペプチドに存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、または活性型ポリペプチドへの転換に際して除去される。このようなポリペプチドは、一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を有するポリペプチドである。したがってこのようなポリペプチドも、上記（Ａ）のポリペプチドと同様に用いることができる。
【００３８】
なお本明細書における「数個のアミノ酸」とは、Ｇｂ４合成酵素活性が失われない程度の変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば４００アミノ酸残基からなるポリペプチドの場合、２〜２０程度、好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜５以下の数を示す。
【００３９】
Ｇｂ４合成酵素活性は、例えば後記実施例に示すように、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体としてUDP-GalNAcを用い、Ｇｂ３糖鎖へのGalNAcの転移反応を利用した測定方法を用いることによって測定できる。よって当業者であれば、Gb4合成酵素活性の有無を指標として、該活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を容易に選択することができる。
【００４０】
上記（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドは、例えば本発明酵素製造方法により製造することができ、この方法で製造されたものを用いることが好ましい。またこれらのポリペプチドのうち、（Ａ）のポリペプチドを用いることが好ましい。
ここで用いる「Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体」としては、UDP-GalNAc等の糖ヌクレオチド化したGalNAcが例示され、かつ好ましい。この供与体は、目的に応じて放射性標識等されていてもよく、例えばUDP-[³H]GalNAc等を用いてもよい。
【００４１】
Ｇｂ３糖鎖は、ここではGalNAcの受容体として用いている。Ｇｂ３糖鎖は市販のものを用いることもできる。
上記の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチド、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体およびＧｂ３糖鎖の接触のさせ方は、これら三者の分子が相互に接触して酵素反応が生ずる限りにおいて特に限定されない。例えば、これら三者が溶解した溶液中で接触させてもよい。また（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドを適当な固相（ビーズ等）に結合させた固定化酵素や、限外濾過膜、透析膜等を用いる膜型リアクター等を用いて連続的に酵素反応させることもできる。また、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体を再生（合成）するバイオリアクターを組み合わせて用いてもよい。
【００４２】
酵素反応させる条件は、Ｇｂ４合成酵素が作用する条件である限りにおいて特に限定されないが、中性ｐＨ付近（例えばpH6.5程度）で反応させることが好ましく、該ｐＨ下で緩衝作用を有する緩衝液中で反応を行うことがより好ましい。またこの時の温度は、Ｇｂ４合成酵素の活性が保持されている限りにおいて特に限定されないが、30〜40℃程度が例示される。またＧｂ４合成酵素の活性を増加させる物質がある場合にはその物質を添加してもよい。例えばＭｎ⁺等を共存させることが好ましい。反応時間は、用いるＧｂ３糖鎖、GalNAc供与体およびＧｂ４合成酵素の量、並びにその他の反応条件に応じて当業者が適宜決定することができる。
【００４３】
Ｇｂ４合成酵素の作用により、GalNAc供与体からＧｂ３糖鎖にGalNAcが転移され、Ｇｂ４糖鎖が生成する。生成したＧｂ４糖鎖を回収するには、通常の糖鎖または糖脂質の分離、精製の手法を用いることができる。例えば吸着クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、濾紙電気泳動法、濾紙クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、有機溶媒（例えばアルコール、アセトン等）による分画、あるいはこれらの組み合わせ等の操作により行うことができる。
このようにして得られたＧｂ４糖鎖の、薄層クロマトグラフィー上での移動度や、Ｇｂ４糖鎖に対するモノクローナル抗体への反応性等を分析することによって、Ｇｂ４糖鎖の製造が確認できる。
【００４４】
モノクローナル抗体を用いた確認は、公知の免疫学的手法を用いることができる。例えばイムノブロッティング法、標識化免疫測定法(例えばEIA法、ELISA法、ラジオイムノアッセイ法、蛍光イムノアッセイ法等)を用いることができる。もちろん、公知の糖鎖構造解析技術を用いて確認することもできる。
【００４５】
(2)本発明Ｇｂ４製造方法２
本発明Ｇｂ４製造方法２は、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡをＧｂ３糖鎖発現細胞に導入し、次いで該細胞を生育させる工程を少なくとも含む、Ｇｂ４糖鎖の製造方法である。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【００４６】
ここで（ｂ）に示すＤＮＡは、Ｇｂ４合成酵素活性を有するポリペプチドをコードしているものであることが好ましい。（ａ）又は（ｂ）で示されるＤＮＡの説明は、前記した「本発明酵素製造方法」における（ａ）又は（ｂ）で示されるＤＮＡと同じである。
【００４７】
宿主細胞は、Ｇｂ３糖鎖を発現する細胞である限りにおいて特に限定されないが、後述の実施例に示す１Ｂ９細胞が好ましい。
【００４８】
上記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡをＧｂ３糖鎖発現細胞に導入する方法、その際に用いるベクター、ＤＮＡが導入された細胞を生育させる方法等は、前記した「本発明酵素製造方法」と同様である。上記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡをＧｂ３糖鎖発現細胞に導入し、次いで該細胞を生育させることにより、Ｇｂ４合成酵素が発現し、この作用によってＧｂ３糖鎖にGalNAcが転移してβ1,3-結合が形成され、細胞の表面にＧｂ４糖鎖が発現する。
【００４９】
Ｇｂ４糖鎖の採取は、公知の糖鎖または糖脂質の抽出、精製方法によって行うことができる。
【００５０】
糖脂質の抽出方法として具体的には、メタノール、クロロホルム等による有機溶媒抽出、ホモジナイズ、音波処理等の細胞破砕による抽出、またはこれらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。培養物中の細胞に対してこのような抽出操作を行うことによりＧｂ４糖鎖を含有する抽出物を得ることができる。
抽出液からのＧｂ４糖鎖の分離、精製は、通常の糖鎖または糖脂質の分離、精製の手法を用いることができる。例えば吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、濾紙電気泳動法、濾紙クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、有機溶媒（例えばアルコール、アセトン等が好ましい）による分画、あるいはこれらの組み合わせ等の操作により行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
なお、Ｇｂ４糖鎖は必ずしも細胞から分離、精製する必要はなく、Ｇｂ４糖鎖が細胞表面に発現した細胞自体を所望の場合は、培養物中の細胞を採取してそのまま用いることもできる。
【００５２】
製造されたＧｂ４糖鎖は、前記の「本発明Ｇｂ４製造方法１」に記載の方法と同様に確認することができる。また、Ｇｂ４糖鎖が細胞表面に発現された細胞における当該Ｇｂ４糖鎖を確認する場合は、抗体等を用いて、フローサイトメトリー等の手法により行うことができる。
【００５３】
(3)本発明フォルスマン製造方法
本発明フォルスマン製造方法は、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡと、フォルスマン抗原合成酵素をコードするｃＤＮＡとを共にＧｂ３糖鎖発現細胞に導入し、次いで該細胞を生育させる工程を少なくとも含む、フォルスマン抗原糖鎖の製造方法である。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【００５４】
ここで（ｂ）に示すＤＮＡは、Ｇｂ４合成酵素活性を有するポリペプチドをコードしているものであることが好ましい。（ａ）又は（ｂ）で示されるＤＮＡの説明、用いる宿主細胞、ＤＮＡをＧｂ３糖鎖発現細胞に導入する方法、その際に用いるベクター、ＤＮＡが導入された細胞を生育させる方法等は、前記した「本発明酵素製造方法」と同様である。本発明フォルスマン製造方法は、フォルスマン抗原合成酵素をコードするｃＤＮＡを、（ａ）又は（ｂ）で示されるＤＮＡと共に宿主細胞に導入する点に特徴がある。フォルスマン抗原合成酵素をコードするｃＤＮＡは公知のもの（例えば、J.Biol.Chem., 274(41), p29390-29398 (1999)）を用いることができる。
【００５５】
上記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡと、フォルスマン抗原合成酵素をコードするｃＤＮＡとを共にＧｂ３糖鎖発現細胞に導入し、次いで該細胞を生育させることにより、Ｇｂ４合成酵素の作用によりＧｂ４糖鎖が発現し、これにフォルスマン抗原合成酵素の作用によってGalNAcが転移してα1,3-結合が形成され、細胞の表面にフォルスマン抗原糖鎖が発現する。
【００５６】
フォルスマン抗原糖鎖の採取および、製造されたフォルスマン抗原糖鎖の確認は、前記の「本発明Ｇｂ４製造方法２」と同様に行うことができる。この際、フォルスマン抗原に対するモノクローナル抗体等を用いればよい。
【００５７】
＜３＞本発明使用
本発明使用は、Ｇｂ４合成酵素の発現のための、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡの使用である。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【００５８】
ここで（ｂ）に示すＤＮＡは、Ｇｂ４合成酵素活性を有するポリペプチドをコードしているものであることが好ましい。（ａ）又は（ｂ）で示されるＤＮＡの説明は、前記した「本発明酵素製造方法」と同様である。
【００５９】
本発明使用は、上記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが、Ｇｂ４合成酵素の発現のために使用される限りにおいて、あらゆる態様を包含する。すなわち、上記酵素活性を利用する際に上記ＤＮＡを利用するあらゆる態様が包含される。例えば、本発明酵素製造方法、本発明Ｇｂ４製造方法２および本発明フォルスマン製造方法は、いずれも上記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡがＧｂ４合成酵素の発現のために使用されていることから、本発明使用に包含される。またＧｂ４合成酵素の発現は、生体外で行われる場合のみならず、生体内で行われる場合をも包含する。例えば、上記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡを生体内の細胞に導入して、生体内でＧｂ４合成酵素を発現させる態様も、本発明使用に包含される。
【００６０】
Ｇｂ３はベロ毒素に対するレセプターであることが知られていることから、Ｇｂ４合成酵素をコードするＤＮＡを細胞に導入して発現させることによってＧｂ３糖鎖をＧｂ４糖鎖に変換し、これによってベロ毒素の細胞への結合性を失わせることができる可能性もあり、このような実施態様も本発明使用に包含される。
【００６１】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、これにより本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。
【００６２】
まず、本実施例で用いた試薬等について説明する。
UDP-GalNAc、LacCer、Ｇｂ３およびＧｂ４は、シグマ(Sigma)社より購入した。ＧＭ３およびＧＤ３は、雪印乳業株式会社より購入した。UDP-[³H]GalNAcは、NENライフサイエンスプロダクツ社(NEN Life Science Products, Inc)より入手した。抗-フォルスマン糖脂質(anti-Forssman glycolipid)モノクローナル抗体であるM1/22.25.8.HLは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)から入手したハイブリドーマ(ATCC TIB-121)の培養上清から調製した。
【００６３】
ＳＶ４０のラージＴ抗原の発現ベクターであるｐＢＳ-ＳＶＴは、ＪＣＲＢ(Japanese Cancer Research Resources Bank) より入手した。
【００６４】
フォルスマン抗原合成酵素(Forssman antigen synthase；FS)の発現ベクターは、ｐＦＳ-３５(14)のHindIII/XhoI-消化断片をｐＣＤＭ８（インビトロジェン社）に挿入することにより構築し、pCDM8/FSと命名した。
【００６５】
Gb3/CD77合成酵素の発現ベクターは、ｐＶＴＲ-１(J.Biol.Chem. 275, p15152-15156 (2000))のXhoI断片をｐＣＤＮＡ3.1(インビトロジェン社)のXhoIサイトに挿入することにより構築し、pCDNA3.1/VTR-1と命名した。
【００６６】
マウスの繊維芽細胞（Ｌ１細胞）は、スローン−ケタリング（Sloan-Kettering）癌センターのＡ．Ｐ．アルビノ（Albino）博士により恵与され、ウシ胎仔血清(fetal bovine serum；ＦＣＳ)を7.5％含有する、ダルベッコの改変イーグル最小必須培地（Dulbecco's modified Eagle's minimal essential medium；D-MEM）で培養した。Ｌ細胞はα1,4-ガラクトース転移酵素活性を有しておらず、また、Gb3/CD77も発現しないが、大量のLacCerを発現する。
【００６７】
一過性の発現系でレシピエント細胞として用いたマウスの繊維芽細胞株（１Ｂ９）は、Ｌ細胞を、pBS-SVT(SV40のラージＴ抗原)およびpCDNA3.1/VTR-1(Gb3/CD77合成酵素をコードするcDNA)でトランスフェクトし、ネオマイシン(neo)耐性細胞のうち、Ｇｂ３およびＳＶ４０ラージＴ抗原の発現が陽性のものをスクリーニングすることにより確立した。Ｇｂ３およびＳＶ４０ラージＴ抗原の発現は、それぞれラット抗Gb3モノクローナル抗体 38.13(Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 78, p6485-6488 (1981))およびマウス抗SV40ラージＴ抗原モノクローナル抗体 Pab101 (Santa Cruz. Biotechnology, Inc)を用い、それぞれ間接免疫蛍光アッセイおよびフローサイトメトリーにより行った。安定なトランスフェクタントは、7.5％ＦＣＳおよび300μg/ml Ｇ４１８を含有するD-MEM中で培養した。
【００６８】
１Ｂ９は、Ｇｂ３を大量に含有するが、Ｇｂ４とフォルスマン抗原は無視できる程度にしか含有していないのが特徴である。
【００６９】
【実施例１】
＜１＞１，３−Ｎ―アセチルガラクトサミン転移酵素 cDNAの発現クローニング成人ヒト腎臓cDNAライブラリーのプラスミド(インビトロジェン社)を、pCDM8/FSと共に、ＤＥＡＥ-デキストラン法(J. Biol. Chem., 267, p12082-12089 (1992))によって１Ｂ９細胞（ＳＶ４０ラージＴ抗原およびＧｂ３を発現している）にトランスフェクトした。４８時間後、トランスフェクトされた細胞をトリプシン処理してはがし、ラットモノクローナル抗体 M1/22.25.8.HLと共に氷冷下で１時間インキュベートした。細胞を洗浄後、細胞をヤギ抗ラットIgM(ICN)でコートしたディッシュ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 84, p3365-3369 (1987))に播いた。panned cellからHirt抽出によってプラスミドＤＮＡを回収し、E.coli XL-1 Blue (ストラタジーン社)を形質転換した。この工程を４回繰り返した。小規模の免疫蛍光アッセイによって、約１０００個のバクテリアのコロニーが陽性として同定された。このコロニーから抽出したcDNAとpCDM8/FSとを共に１Ｂ９細胞に移入した場合にフォルスマン抗原を発現するクローンを選択した結果、３つの独立したクローンが同定された。
【００７０】
結果的に、異なった5'-非翻訳領域を有し、グロボシド合成酵素遺伝子と推定される２つのクローン（「タイプ１」と「タイプ２」と命名した）を同定した。エキソン-イントロン結合部における全てのイントロン配列は、GT-AGコンセンサスに合致していた。タイプ１および２ともに、オープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列が本質的に一致していたので、タイプ１のクローンを以後の解析に用いることとし、これをβ1,3GalNAcT-1と命名した。
【００７１】
＜２＞配列の解析
クローニングされたcDNAのヌクレオチド配列は、PRISM dye terminator cycle sequencing kitおよびモデル310 ＤＮＡシーケンサー(Applied Biosystems)を用いたジデオキシヌクレオチド・ターミネーション法により決定した。
アミノ酸配列およびヒドロパシー解析は、Genetyx-Macソフトウエアバージョン8.0(ソフトウエア開発)を用いて行った。
β1,3GalNAcT-1のタイプ１についての配列解析結果を結果を図１に示す。
AUG開始コドンの位置は、Kozakのコンセンサス配列(Cell 44, p283-292 (1986))に従って決定した。その結果、クローニングされたcDNAのヌクレオチド配列は単一のオープンリーディングフレームを有していた。図１中、推定アミノ酸配列をヌクレオチド配列の下に示した。このオープンリーデイングから、３３１アミノ酸からなる分子量39,511のタンパク質が推定された。また推定される膜貫通疎水ドメインを下線で示し、Ｎ−結合グリコシレーションされる可能性がある部位（５箇所）は四角で囲った。ポリアデニル化シグナルも下線で示した。
【００７２】
驚くべきことに、このアミノ酸配列をデータベースを用いて他のcDNAと比較した結果、Amadoら(J.Biol.Chem. 273, p12770-12778 (1998))により報告されているヒトβ3GalT-3と同一であることが判明した。ヒトβ3GalT-3は、β3-ガラクトース転移酵素遺伝子ファミリーに属すると考えられてきているが、ガラクトース転移酵素活性は報告されていない。
【００７３】
β1,3GalNAcT-1のタイプ２についての5'-非翻訳部位のヌクレオチド配列を図２に示す。エキソン-イントロン結合を併せて示した。
また、KyteとDoolittleの方法(J.Mol.Biol. 157, p105-132 (1982))により、1７アミノ酸のウインドウでハイドロパシープロットを行った。結果を図３に示す。
なお図３中の "Hydrophobicity" は疎水性の程度を意味する。
この結果から、アミノ末端側に、２３アミノ酸残基からなる顕著な疎水性領域が１箇所存在することが示された。このことからこのタンパク質は、現在知られている他の多くのグリコシルトランスフェラーゼと同様に、II型の膜貫通トポロジーを有していることが推定される。
【００７４】
＜３＞膜抽出物の調製
８０％コンフレントに達したＬ細胞を、ＤＥＡＥ-デキストラン法によって発現ベクターでトランスフェクトした。８０時間後に細胞を回収し、この細胞を、1mMフェニルメチルスルフォニルフルオリドを含有する氷冷したリン酸緩衝生理食塩水中で、窒素キャビテーション装置を用いて破砕した(J.Biol.Chem., 270, p6149-6155 (1995))。核を低速の遠心分離で除去し、この上清を４℃下、100,000 xｇで１時間遠心分離した。沈殿を氷冷した100mM MES緩衝液(pH 6.5)で再懸濁し、酵素源として用いた。
【００７５】
＜４＞酵素アッセイ
β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素アッセイは、10mM MnCl₂、0.3％ Triton X-100、100mM MES緩衝液(pH6.5)、0.1mM UDP-[³H]GalNAc (160dpm/pmol：GalNAcの供与体)、200μgの下記膜抽出物、および20μgの基質(受容体)を含む混合液(全量50μl)中で行った。３７℃で３時間インキュベートした後、0.5mlの水を添加することによって酵素反応を停止させた。生成物をC18 Sep-Pakカートリッジ(Waters社)を用いて単離し、alminium-backed シリカゲル-60 HPTLCプレート(メルク社)にスポットし、クロロホルム/メタノール/水(65:25:5)の溶媒系で展開することにより、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を行った。その後プレートを乾燥させ、En³Hance^TM(NEN Life Science Products社)でスプレーし、放射標識された産物をオートラジオグラフィーによって可視化した。なお、ＴＬＣにおける移動度のスタンダードとしては、LacCer、Gb3およびGb4を用いた。
【００７６】
膜抽出物として、pCDNA3.1ベクター(コントロール)、またはpCDNA3.1ベクターに挿入したβ1,3GalNAcT-1（pCDNA3.1/β1,3GalNAcT-1）でトランスフェクトしたＬ細胞からの膜抽出物を用い、基質(受容体)としてＧｂ３糖脂質を用いてアッセイした。
その結果、この酵素は[³H]GalNAcをＧｂ３に有効に転移(79pmol/時間/mgタンパク質)し、スタンダードであるGb4と同じ移動度の新たな成分を生成することが明らかとなった。一方、基質(受容体)として種々の糖脂質(LacCer、ＧＭ３、ＧＤ３またはＧｂ４)を用いてアッセイした結果、[³H]GalNAcは、LacCer、GM3、GD3およびGb4には転移されなかった。このことから、この酵素はGA2/GM2/GD2合成酵素やフォルスマン抗原合成酵素とは異なることが示された。
なお、pCDNA3.1ベクター(コントロール)をトランスフェクトした細胞の抽出物では、活性は検出されなかった。
【００７７】
＜５＞糖脂質の抽出
糖脂質は、Biochemistry 24, p7820-7826 (1985)に記載の方法で単離した。すなわち、 pCDNA3.1のみでトランスフェクトされた１Ｂ９細胞、またはpCDNA3.1/β1,3GalNAcT-1でトランスフェクトされた１Ｂ９細胞(いずれもパックされた状態で約0.24ml)から、クロロホルム/メタノール(2:1、1:1、1:2の順)を用いて脂質を抽出した。アセチル化した後、フロリジル(Florisil)カラムを用いて糖脂質画分を単離した。脱アセチル化および脱塩した後、全糖脂質をクロロホルム/メタノール(2:1)に溶解し、ＴＬＣプレートにスポットした。ヒトＢ赤血球細胞から抽出した中性糖脂質、およびＧｂ４も同様にスポットし、展開後、オルシノール(orcinol)またはプリムリン(primulin)をスプレーしてバンドを検出した結果、ヒトＢ赤血球細胞から抽出した中性糖脂質をスポットしたレーンにおいては、Ｇｂ４の移動位置に極めて濃いバンドが、LacCerおよびＧｂ３の移動位置には中程度のバンドが検出された。
Ｇｂ４をスポットしたレーンにはＧｂ４の移動位置にのみ濃いバンドが検出された。
【００７８】
pCDNA3.1のみでトランスフェクトされた１Ｂ９細胞から抽出した糖脂質をスポットしたレーンにおいては、Ｇｂ３の移動位置にのみバンドが検出された。
pCDNA3.1/β1,3GalNAcT-1でトランスフェクトされた１Ｂ９細胞から抽出した糖脂質をスポットしたレーンにおいては、Ｇｂ３およびＧｂ４の移動位置にバンドが検出された。
【００７９】
＜６＞ＴＬＣ―免疫染色
ＴＬＣ―免疫染色は、Anal.Biochem. 221, p312-316 (1994)に記載の方法に従い、Biochemistry 24, p7820-7826 (1985)に記載の方法で行った。すなわち、上記と同様に脂質を抽出してＴＬＣプレートにスポットして展開した後、ＴＬＣプレートをポリビニリデンジフルオリド膜にヒート・ブロット(heat-blot)した。この膜を、1:100希釈したヒト抗 Gb4 モノクローナル抗体(９Ｈ６)と共に１時間インキュベートして洗浄した後、ビオチン化ヤギ抗ヒトIgM(シグマ社)と共に１時間インキュベートした。抗体の結合は、ＡＢＣ−ＰＯ^TM（ベクター社）およびＨＲＰ−１０００^TM（コニカ）を用い、これらの説明書に従って検出した。
Ｇｂ４をスポットしたレーン、ヒトＢ赤血球細胞から抽出した中性糖脂質をスポットしたレーン、およびpCDNA3.1/β1,3GalNAcT-1でトランスフェクトした１Ｂ９の抽出物をスポットしたレーンには、Ｇｂ４に相当する移動位置にのみバンドが検出された。
【００８０】
これに対し、LacCerをスポットしたレーン、Ｇｂ３をスポットしたレーン、およびpCDNA3.1のみでトランスフェクトした１Ｂ９の抽出物をスポットしたレーンでは、バンドは全く検出されなかった。これらのことから、pCDNA3.1/β1,3GalNAcT-1でトランスフェクトした１Ｂ９の抽出物をスポットしたレーンに現れたバンドは、Ｇｂ４であることが確認された。
【００８１】
＜７＞フローサイトメトリー解析
ＤＥＡＥ―デキストラン法により、１Ｂ９細胞をpCDNA3.1、pCDNA3.1/β1,3GalNAcT-1、pCDM8/FS、またはpCDNA3.1/β1,3GalNAcT-1とpCDM8/FSで一過性にトランスフェクトした。２日後に細胞をAb M1/22.25.8.HLと共にインキュベートし、次いでフルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗ラットIgM(薄い線で示す)で染色し、フォルスマン抗原の発現の程度をフローサイトメトリーで解析した。結果を図４に示す。なお図４中の濃い線は、二次抗体のみを反応させたコントロールを示す。また、図４中の "ＭＯＣＫ"、"β1,3GalNAc-T"、"ＦＳ" および "β1,3GalNAc-T＋ＦＳ" は、それぞれ、pCDNA3.1、pCDNA3.1/β1,3GalNAcT-1、pCDM8/FS、およびpCDNA3.1/β1,3GalNAcT-1とpCDM8/FSでトランスフェクトしたものであることを示す。また図４中、Relative fluorescence intensity" は、相対蛍光強度を意味する。
【００８２】
この結果、pCDNA3.1/β1,3GalNAcT-1とpCDM8/FSとを共にトランスフェクトした細胞、すなわちＧｂ４合成酵素をコードするcDNAとフォルスマン抗原合成酵素をコードするcDNAとを共に導入した１Ｂ９細胞にのみ、フォルスマン抗原の明確な発現が見られた。β1,3GalNAcT-1またはpCDM8/FSを単独で導入した場合には、いずれもフォルスマン抗原の発現は見られなかった。これらのデータから、β1,3GalNAcT-1はＧｂ４の発現に必要であることが示された。
【００８３】
ノーザンブロッティング
Multiple Choice^TM ノーザンブロットメンブレン（OriGene Technologies社）、並びにヒトの脳、結腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、胎盤、小腸、脾臓、胃および精巣のポリ(Ａ)⁺ＲＮＡ(2μg)を用いて、ノーザンブロッティングを行った。ハイブリダイズは、[³²P]dCTPラベルしたβ1,3GalNAcT-1のcDNAプローブ（配列番号１の塩基番号１〜８１８で示される配列からなる）または、アクチンのプローブ（コントロール）を用いて行った。
【００８４】
この結果、脳および心臓において強い遺伝子発現が見られた。また中程度の発現が肺、胎盤および精巣で見られ、弱い発現が腎臓、肝臓、脾臓および胃で見られた。
【００８５】
【発明の効果】
本発明により、新規なＧｂ４合成酵素の製造方法、Ｇｂ４糖鎖の製造方法およびフォルスマン抗原糖鎖の製造方法等が提供される。本発明酵素製造方法は、Ｇｂ４合成酵素の大量調製に有用であり、またこれにより製造されたＧｂ４合成酵素は本発明Ｇｂ４製造方法に利用できることから極めて有用である。本発明Ｇｂ４製造方法および本発明フォルスマン製造方法は、これらのグロボ系糖脂質の大量調製に有用である。
また本発明使用は、Ｇｂ４合成酵素をコードするＤＮＡを、Ｇｂ４合成酵素発現のために使用する方法である。本発明使用によれば、例えばＧｂ４合成酵素をコードするＤＮＡを細胞に導入して発現させることによってＧｂ３糖鎖（ベロ毒素に対するレセプター）をＧｂ４糖鎖に変換し、これによってベロ毒素の細胞への結合性を失わせることができる可能性もある。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】 β1,3GalNAcT-1(Ｇｂ４合成酵素)のタイプ１についての配列解析結果を示す図である。
【図２】 β1,3GalNAcT-1(Ｇｂ４合成酵素)のタイプ２についての5'-非翻訳部位のヌクレオチド配列を示す図である。
【図３】Ｇｂ４合成酵素の推定アミノ酸配列のハイドロパシープロットを示す図である。
【図４】１Ｂ９細胞に各種ＤＮＡを導入した場合の、フォルスマン抗原の発現の程度を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing the enzyme using DNA encoding β1,3-N-acetylgalactosamine transferase, a method for producing sugar chains of various glycolipids including globoside (Gb4) using the enzyme, etc. About.
[0002]
[Prior art]
Glycosphingolipids are synthesized by the continuous action of glycosyltransferases. When one of three different sugars is added to lactosylceramide (LacCer; Galβ1,4Glc-Cer), three major glycolipid systems, namely the lacto / neolacto system (β1,3-N -Acetylglucosamine is added), ganglio (addition of α2,3-sialic acid), or globo (addition of α1,4-galactose).
Globotriosylceramide (Gb3; Galα1,4Galβ1,4Glc-Cer), which is a kind of globo-based glycolipid, is produced by galactose transfer to LacCer and α1,4-bonding. The gene of Gb3 / CD77 synthase (α1,4-galactosyltransferase) that catalyzes this reaction has already been cloned by the present inventors (J. Biol. Chem., 275 (20), p15152-15156 ( 2000)).
[0003]
On the other hand, globoside (Gb4; GalNAcβ1,3Galα1,4Galβ1,4Glc-Cer), which is a kind of globo-based glycolipid, is produced by transfer of N-acetylgalactosamine to Gb3 and β1,3-linkage. The cloning of the gene for Gb4 synthase (β1,3-N-acetylgalactosamine transferase) that catalyzes is not reported.
[0004]
Forssman antigen (GalNAcα1,3GalNAcβ1,3Galα1,4Galβ1,4Glc-Cer) is generated by N-acetylgalactosamine transferred to Gb4 and α1,3-linked. Cloning of the gene for Forsman antigen synthase (α1,3-N-acetylgalactosamine transferase) that catalyzes this reaction has already been reported (J. Biol. Chem., 274 (41), p29390-29398 (1999). )).
[0005]
Therefore, only the gene for Gb4 synthase is not cloned in these globo-based glycolipid synthases.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to isolate a Gb4 synthase, that is, a DNA encoding β1,3-N-acetylgalactosamine transferase, and to provide a method for using the DNA.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies in order to solve the above problems, the present inventors have isolated DNA encoding β1,3-N-acetylgalactosamine transferase and clarified its base sequence. After confirming that β1,3-N-acetylgalactosamine transferase was expressed, the present invention was completed.
[0008]
That is, the present invention comprises at least a step of introducing the DNA shown in the following (a) or (b) into a cell, then growing the cell to express β1,3-N-acetylgalactosamine transferase, and collecting this. And a method for producing β1,3-N-acetylgalactosamine transferase (Gb4 synthase) (hereinafter referred to as “the enzyme production method of the present invention”).
(A) DNA containing a base sequence consisting of base numbers 109 to 1101 among the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(B) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence, or a DNA having a part of these nucleotide sequences.
Here, the DNA shown in (b) is a polypeptide having an enzyme activity that transfers an N-acetylgalactosamine residue from the N-acetylgalactosamine donor to the C3 position of the galactose residue in the acceptor Gb3 sugar chain. It is preferable that it codes.
[0009]
The present invention also includes a method for producing a Gb4 sugar chain (hereinafter referred to as “the following (A) or (B)”, an N-acetylgalactosamine donor and a Gb3 sugar chain at least in the step of causing an enzymatic reaction) This invention Gb4 manufacturing method 1 ") is provided.
(A) A polypeptide having the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 331 of SEQ ID NO: 2.
(B) Galactose in the Gb3 sugar chain consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or translocated in the amino acid sequence (A), and from an N-acetylgalactosamine donor A polypeptide having an enzymatic activity to transfer an N-acetylgalactosamine residue to the C3 position of the residue.
[0010]
The present invention also includes a method for producing a Gb4 sugar chain (hereinafter referred to as “the present invention Gb4”) comprising at least a step of introducing the DNA shown in the following (a) or (b) into a Gb3 sugar chain-expressing cell and then growing the cell. Manufacturing method 2 ”).
(A) DNA containing a base sequence consisting of base numbers 109 to 1101 among the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(B) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence, or a DNA having a part of these nucleotide sequences.
Here, the DNA shown in (b) is a polypeptide having an enzyme activity that transfers an N-acetylgalactosamine residue from the N-acetylgalactosamine donor to the C3 position of the galactose residue in the acceptor Gb3 sugar chain. It is preferable that it codes.
[0011]
The present invention also includes at least a step of introducing both the DNA shown in the following (a) or (b) and a cDNA encoding Forssman antigen synthase into a Gb3 sugar chain-expressing cell and then growing the cell. A method for producing a Forssman antigen sugar chain (hereinafter referred to as “the Forssman production method of the present invention”) is provided.
(A) DNA containing a base sequence consisting of base numbers 109 to 1101 among the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(B) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence, or a DNA having a part of these nucleotide sequences.
Here, the DNA shown in (b) is a polypeptide having an enzyme activity that transfers an N-acetylgalactosamine residue from the N-acetylgalactosamine donor to the C3 position of the galactose residue in the acceptor Gb3 sugar chain. It is preferable that it codes.
[0012]
The present invention also relates to the use of DNA shown in the following (a) or (b) for expression of β1,3-N-acetylgalactosamine transferase (Gb4 synthase) (hereinafter referred to as “use of the present invention”). provide.
(A) DNA containing a base sequence consisting of base numbers 109 to 1101 among the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(B) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence, or a DNA having a part of these nucleotide sequences.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail. Abbreviations commonly used in the present specification are as follows.
Gal: Galactose
Glc: Glucose
GalNAc: N-acetylgalactosamine
Cer: Ceramide
LacCer: Lactosylceramide (Galβ1,4Glc-Cer)
Gb3: Globotriaosylceramide (Galα1,4Galβ1,4Glc-Cer)
Gb3 sugar chain: Gb3 sugar chain (Galα1,4Galβ1,4Glc). The term “Gb3 sugar chain” includes any substance having a Gb3 sugar chain (for example, Gb3 itself (a substance in which Cer is bound to a Gb3 sugar chain)).
Gb4: Globoside (GalNAcβ1,3Galα1,4Galβ1,4Glc-Cer)
Gb4 sugar chain: Gb4 sugar chain (GalNAcβ1,3Galα1,4Galβ1,4Glc). The term “Gb4 sugar chain” includes any substance having a Gb4 sugar chain (for example, Gb4 itself (a substance in which Cer is bound to a Gb4 sugar chain)).
Forssman antigen: GalNAcα1,3GalNAcβ1,3Galα1,4Galβ1,4Glc-Cer
Forssman antigen sugar chain: Forssman antigen sugar chain (GalNAcα1,3GalNAcβ1,3Galα1,4Galβ1,4Glc). In the case of “Forssman antigen sugar chain”, any substance having Forssman antigen sugar chain (for example, Forssman antigen itself (a substance in which Cer is bound to Forssman antigen sugar chain) and the like) is also included.
GM3: SAα2,3Galβ1,4Glc-Cer (SA is sialic acid)
GD3: SAα2,8SAα2,3Galβ1,4Glc-Cer (SA is sialic acid)
UDP: Uridine-5'-diphosphate
The nomenclature of ganglioside was according to Svennerholm (J. Neurochem. 10, p455-463, (1963)).
[0014]
Further, in the present specification, a reaction in which an N-acetylgalactosamine residue is transferred from an N-acetylgalactosamine donor to the C3 position of a galactose residue in the acceptor Gb3 sugar chain to form a β1,3-linkage. The enzyme that catalyzes is called “β1,3-N-acetylgalactosamine transferase”. In this specification, it may be described as “Gb4 synthase”.
[0015]
In addition, the enzyme activity of transferring an N-acetylgalactosamine residue from the N-acetylgalactosamine donor to the C3 position of the galactose residue in the acceptor Gb3 sugar chain to form a β1,3-linkage is represented by “ It is referred to as “β1,3-N-acetylgalactosamine transferase activity”. In this specification, it may be described as “Gb4 synthase activity”.
[0016]
<1> Method for producing enzyme of the present invention
The enzyme production method of the present invention includes at least a step of introducing the DNA shown in the following (a) or (b) into a cell, then growing the cell to express Gb4 synthase, and collecting the Gb4 synthase. It is a manufacturing method.
(A) DNA containing a base sequence consisting of base numbers 109 to 1101 among the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(B) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence, or a DNA having a part of these nucleotide sequences.
[0017]
The Gb4 synthase produced by the enzyme production method of the present invention is preferably one that maintains the enzyme activity.
Regarding (a), since the part consisting of base numbers 109 to 1101 in SEQ ID NO: 1 is a region encoding Gb4 synthase, DNA containing this region is introduced into cells and then the cells are grown. Thus, Gb4 synthase can be expressed.
[0018]
In addition, regarding (b), a DNA that hybridizes under stringent conditions with a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence, or a DNA having a part of these nucleotide sequences is also the above ( Since it is considered to have the same structure, function, action and the like as in a), the DNA in (b) can be used in place of (a). That is, the DNA of (b) is considered to encode a polypeptide having Gb4 synthase activity, and such DNA can also be used in the same manner as the DNA of (a). Therefore, the DNA shown in (b) preferably encodes a polypeptide having Gb4 synthase activity.
[0019]
Here, “stringent conditions” refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) etc.). Specifically, the “stringent conditions” are hybridized at 42 ° C. in a solution containing 50% formamide, 4 × SSC, 50 mM HEPES (pH 7.0), 10 × Denhardt's solution, 100 μg / ml salmon sperm DNA, Next, the conditions include washing with 2 × SSC, 0.1% SDS solution at room temperature, and 0.1 × SSC, 0.1% SDS solution at 50 ° C.
[0020]
Gb4 synthase activity can be measured, for example, by using UDP-GalNAc as an N-acetylgalactosamine donor and using a measurement method utilizing the transfer reaction of GalNAc to Gb3 sugar chain, as shown in Examples below.
[0021]
The DNA of (a) or (b) can be produced, for example, by the method described in Examples described later, and it is preferable to use the one produced by this method. Of these DNAs, the DNA (a) is preferably used. A person skilled in the art can easily understand that DNAs having different base sequences due to the degeneracy of the genetic code may be used.
[0022]
The DNA shown in (a) or (b) above is introduced into a cell, then this cell (transformed cell) is grown to express Gb4 synthase, and this is collected to maintain the enzyme activity. Gb4 synthase can be produced.
DNA may be expressed directly or as a fusion polypeptide with other polypeptides as long as it maintains Gb4 synthase activity. The DNA may be expressed in its full length or as a partial peptide as long as Gb4 synthase activity is maintained.
[0023]
The host cell is not particularly limited as long as the function of the DNA shown in (a) or (b) above or the recombinant vector incorporating these DNAs can be exhibited. Animal cell, plant cell, microbial cell (bacteria) And eukaryotic cells such as Escherichia coli and eukaryotic cells such as mammalian cells are specifically exemplified. When prokaryotic cells such as Escherichia coli are used, addition of a sugar chain to a polypeptide generated by the expression of DNA does not occur, so that it is possible to obtain a Gb4 synthase without an added sugar chain. When a eukaryotic cell such as a mammalian cell is used, a sugar chain can be added to an enzyme generated by the expression of DNA. Therefore, it can be obtained in the form of a Gb4 synthase containing a sugar chain.
[0024]
More specifically, as a host cell for introducing the DNA shown in (a) or (b) above, an L cell that is a mouse fibroblast, or a large T antigen of SV40 and a Gb3 / CD77 synthase Examples are 1B9 cells obtained by transfecting with cDNA encoding.
[0025]
In order to introduce the DNA shown in (a) or (b) into a cell (host cell), for example, a recombinant vector is prepared by incorporating the DNA into an appropriate vector, and the DNA is converted into a host using this recombinant vector. What is necessary is just to introduce | transduce into a cell. As the vector, an expression vector is preferable. Specifically, pcDNA3.1 expression vector (Invitrogen) and the like can be mentioned.
[0026]
Examples of the method for introducing DNA into cells include a method of transfection using the DEAE-dextran method (J. Biol. Chem., 267, p12082-12089 (1992)).
[0027]
Cell growth may be carried out by culturing cells transformed by introducing DNA in a suitable medium, or the transformed cells may be grown in vivo.
[0028]
The expressed enzyme can be collected from the culture of the transformed cell, but if the enzyme is produced and accumulates in the cytoplasm or membrane fraction of the transformed cell, it will be collected from the transformed cell, and if it is accumulated in the medium, Collect from the medium. Furthermore, when using cells in which an enzyme is expressed, transformed cells or processed products thereof can be used as they are, or can be bound to an appropriate solid phase, or included in a gel and immobilized. The culture includes a medium and transformed cells cultured in the medium.
[0029]
The enzyme can be collected from the culture by a known extraction and purification method for the enzyme.
[0030]
Specific examples of enzyme extraction methods include a method using a nitrogen cavitation device, homogenization, glass bead mill method, sonication, osmotic shock method, freeze-thaw method extraction by cell disruption, surfactant extraction, or a combination thereof. These processing operations are mentioned.
[0031]
When the DNA shown in (a) is expressed in 1B9 cells as DNA, Gb4 synthase is localized in the cell membrane fraction. When DNA is expressed in a soluble form as a fusion protein of a polypeptide of Gb4 synthase or a polypeptide lacking a part thereof and another polypeptide, the fusion protein can be localized in the cytoplasm. In addition, when DNA is expressed as a fusion protein of a Gb4 synthase polypeptide or a polypeptide lacking a part thereof and a secretion signal, it can be secreted into the medium. In addition, DNA encoding a polypeptide lacking a part of the polypeptide of Gb4 synthase can be obtained by performing PCR (polymerase chain reaction method) using primers designed as described above, so that a human-derived mRNA or cDNA library can be obtained. Or can be isolated from chromosomal DNA.
[0032]
Specific examples of methods for purifying Gb4 synthase extracted from cells or culture media include salting out with ammonium sulfate (ammonium sulfate) or sodium sulfate, centrifugation, dialysis, ultrafiltration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, and the like. , Hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, gel filtration, gel permeation chromatography, affinity chromatography, electrophoresis, etc., and combinations thereof. The Gb4 synthase is not necessarily completely purified, and may be stopped by partial purification as long as the enzyme activity is maintained.
[0033]
The production of Gb4 synthase can be confirmed by analyzing the amino acid sequence, molecular size, action, substrate specificity, and the like of the Gb4 synthase thus obtained.
[0034]
<2> Methods for producing various globo-based glycolipids
(1) Invention Gb4 production method 1
The Gb4 production method 1 of the present invention is a method for producing a Gb4 sugar chain, comprising at least a step of bringing the following polypeptide (A) or (B), an N-acetylgalactosamine donor, and a Gb3 sugar chain into contact with each other to cause an enzymatic reaction. is there.
(A) A polypeptide having the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 331 of SEQ ID NO: 2.
(B) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or translocated in amino acid sequence (A) and having Gb4 synthetase activity.
[0035]
With regard to (A), the polypeptide having the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 331 of SEQ ID NO: 2 is a polypeptide itself of Gb4 synthase and includes a catalytic site. Therefore, the Gb4 sugar chain can be produced by bringing this polypeptide, N-acetylgalactosamine donor and Gb3 sugar chain into contact with each other to cause an enzymatic reaction.
[0036]
Regarding (B), “a polypeptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or rearranged and having Gb4 synthase activity” refers to an acceptor from an N-acetylgalactosamine donor. 1 or several enzymes that do not substantially harm the enzyme activity (β1,3-N-acetylgalactosamine transferase activity) that transfers the N-acetylgalactosamine residue to the C3 position of the galactose residue in the Gb3 sugar chain. The polypeptide which may have substitution, deletion, insertion or rearrangement of amino acid residues.
[0037]
In other words, naturally occurring polypeptides have amino acid substitutions and deletions in their amino acid sequences due to polymorphisms and mutations of the DNA that encodes them, as well as modification reactions within the resulting polypeptide during intracellular and purification. It is known that there may be mutations such as loss, insertion or rearrangement, but nonetheless exhibiting substantially the same physiological and biological activity as a polypeptide having no mutation. Polypeptides used here also include those in which there is no significant difference in function even though there are some structural differences. The same is true when the above mutations are artificially introduced into the amino acid sequence of a polypeptide. In this case, a wider variety of mutants can be prepared. For example, it is known that a polypeptide obtained by substituting a certain cysteine residue with serine in the amino acid sequence of human interleukin 2 (IL-2) retains interleukin 2 activity (Science, 224, 1431 (1984). )). Also, certain polypeptides are known to have peptide regions that are not essential for activity. This includes, for example, signal peptides present in polypeptides secreted outside the cell and pro-sequences found in protease precursors, etc. Most of these regions are post-translational or upon conversion to active polypeptides. Removed. Such polypeptides exist in different forms on the primary structure, but are finally polypeptides having equivalent functions. Accordingly, such a polypeptide can also be used in the same manner as the polypeptide (A).
[0038]
In the present specification, “several amino acids” indicates the number of amino acids that may be mutated to such an extent that Gb4 synthase activity is not lost. For example, in the case of a polypeptide consisting of 400 amino acid residues, The number is about 20, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 5 or less.
[0039]
Gb4 synthase activity can be measured, for example, by using UDP-GalNAc as an N-acetylgalactosamine donor and using a measurement method utilizing the transfer reaction of GalNAc to Gb3 sugar chain, as shown in Examples below. Therefore, those skilled in the art can easily select substitution, deletion, insertion or rearrangement of one or more amino acid residues that do not substantially impair the activity, using the presence or absence of Gb4 synthase activity as an index.
[0040]
The polypeptide (A) or (B) can be produced, for example, by the method for producing an enzyme of the present invention, and it is preferable to use one produced by this method. Of these polypeptides, the polypeptide (A) is preferably used.
Examples of the “N-acetylgalactosamine donor” used herein include GalNAc that is sugar nucleotide such as UDP-GalNAc, and is preferred. This donor may be radiolabeled according to the purpose, for example, UDP- [ ^Three H] GalNAc or the like may be used.
[0041]
The Gb3 sugar chain is used here as a receptor for GalNAc. A commercially available Gb3 sugar chain can also be used.
The method for contacting the above-mentioned polypeptide (A) or (B), N-acetylgalactosamine donor and Gb3 sugar chain is not particularly limited as long as these three molecules come into contact with each other to cause an enzyme reaction. . For example, these three members may be contacted in a dissolved solution. In addition, the enzyme can be continuously produced using an immobilized enzyme in which the polypeptide (A) or (B) is bound to an appropriate solid phase (beads), a membrane reactor using an ultrafiltration membrane, a dialysis membrane, or the like. It can also be reacted. A bioreactor that regenerates (synthesizes) an N-acetylgalactosamine donor may be used in combination.
[0042]
The conditions for the enzyme reaction are not particularly limited as long as Gb4 synthase acts, but the reaction is preferably performed near neutral pH (for example, about pH 6.5), and a buffer solution having a buffering action under the pH. It is more preferable to carry out the reaction in the inside. Further, the temperature at this time is not particularly limited as long as the activity of the Gb4 synthase is maintained, but an example is about 30 to 40 ° C. Moreover, when there exists a substance which increases the activity of Gb4 synthetase, you may add the substance. For example, Mn ⁺ Etc. are preferably present together. The reaction time can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the amounts of Gb3 sugar chain, GalNAc donor and Gb4 synthase used, and other reaction conditions.
[0043]
By the action of Gb4 synthase, GalNAc is transferred from the GalNAc donor to the Gb3 sugar chain, and a Gb4 sugar chain is generated. In order to recover the produced Gb4 sugar chain, a usual method for separating and purifying sugar chains or glycolipids can be used. For example, adsorption chromatography, hydrophobic chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration, gel permeation chromatography, filter paper electrophoresis, filter paper chromatography, thin layer chromatography, fractionation with organic solvents (eg alcohol, acetone, etc.) , Or a combination thereof.
The production of the Gb4 sugar chain can be confirmed by analyzing the mobility of the Gb4 sugar chain thus obtained on thin layer chromatography, the reactivity of the Gb4 sugar chain to the monoclonal antibody against the Gb4 sugar chain, and the like.
[0044]
A known immunological technique can be used for confirmation using a monoclonal antibody. For example, an immunoblotting method or a labeled immunoassay method (for example, EIA method, ELISA method, radioimmunoassay method, fluorescent immunoassay method, etc.) can be used. Of course, it can also be confirmed using a known sugar chain structure analysis technique.
[0045]
(2) Invention Gb4 production method 2
The Gb4 production method 2 of the present invention is a method for producing a Gb4 sugar chain comprising at least a step of introducing the DNA shown in the following (a) or (b) into a Gb3 sugar chain-expressing cell and then growing the cell.
(A) DNA containing a base sequence consisting of base numbers 109 to 1101 among the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(B) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence, or a DNA having a part of these nucleotide sequences.
[0046]
Here, the DNA shown in (b) preferably encodes a polypeptide having Gb4 synthase activity. The description of the DNA represented by (a) or (b) is the same as the DNA represented by (a) or (b) in the above-mentioned “enzyme production method of the present invention”.
[0047]
The host cell is not particularly limited as long as it is a cell that expresses a Gb3 sugar chain, but 1B9 cells shown in the examples described later are preferred.
[0048]
The method for introducing the DNA shown in (a) or (b) above into a Gb3 sugar chain-expressing cell, the vector used at that time, the method for growing the cell into which the DNA has been introduced, etc. are described above. It is the same. When the DNA shown in (a) or (b) above is introduced into a Gb3 sugar chain-expressing cell and then the cell is grown, Gb4 synthase is expressed. As a result, GalNAc is transferred to the Gb3 sugar chain and β1 , 3-bonds are formed, and Gb4 sugar chains are expressed on the surface of cells.
[0049]
The Gb4 sugar chain can be collected by a known sugar chain or glycolipid extraction and purification method.
[0050]
Specific examples of the glycolipid extraction method include organic solvent extraction with methanol, chloroform, etc., homogenization, extraction by cell disruption such as sonication, or a combination thereof. By performing such an extraction operation on the cells in the culture, an extract containing a Gb4 sugar chain can be obtained.
Separation and purification of Gb4 sugar chains from the extract can be carried out using conventional methods for separation and purification of sugar chains or glycolipids. For example, by adsorption chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, gel permeation chromatography, filter paper electrophoresis, filter paper chromatography, thin layer chromatography, organic solvents (eg, alcohol, acetone, etc. are preferred) Although it can carry out by operations, such as fractionation or these combination, it is not limited to these.
[0051]
Note that the Gb4 sugar chain does not necessarily need to be separated and purified from the cell, and if the cell itself in which the Gb4 sugar chain is expressed on the cell surface is desired, the cells in the culture can be collected and used as they are.
[0052]
The produced Gb4 sugar chain can be confirmed in the same manner as described in the above-mentioned “present invention Gb4 production method 1”. Moreover, when confirming the said Gb4 sugar chain in the cell by which Gb4 sugar chain was expressed on the cell surface, it can carry out by techniques, such as a flow cytometry, using an antibody etc.
[0053]
(3) Forsman production method of the present invention
The Forssman production method of the present invention comprises the steps of introducing the DNA shown in (a) or (b) below and a cDNA encoding Forssman antigen synthase into a Gb3 sugar chain-expressing cell and then growing the cell. This is a method for producing a Forssman antigen sugar chain.
(A) DNA containing a base sequence consisting of base numbers 109 to 1101 among the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(B) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence, or a DNA having a part of these nucleotide sequences.
[0054]
Here, the DNA shown in (b) preferably encodes a polypeptide having Gb4 synthase activity. The description of the DNA shown in (a) or (b), the host cell to be used, the method for introducing the DNA into the Gb3 sugar chain-expressing cell, the vector used in that case, the method for growing the cell into which the DNA has been introduced, etc. This is the same as the “method for producing the enzyme of the present invention”. The Forssman production method of the present invention is characterized in that cDNA encoding Forssman antigen synthase is introduced into a host cell together with the DNA represented by (a) or (b). A known cDNA (for example, J. Biol. Chem., 274 (41), p29390-29398 (1999)) can be used as the cDNA encoding Forssman antigen synthase.
[0055]
By introducing both the DNA shown in (a) or (b) above and the cDNA encoding Forssman antigen synthase into a Gb3 sugar chain-expressing cell, and then growing the cell, the Gb4 synthase action causes Gb4 A sugar chain is expressed, and GalNAc is transferred to this by the action of Forssman antigen synthase to form α1,3-linkage, and Forssman antigen sugar chain is expressed on the surface of the cell.
[0056]
The collection of the Forsman antigen sugar chain and the confirmation of the produced Forsman antigen sugar chain can be carried out in the same manner as in the above-mentioned “Gb4 production method 2 of the present invention”. In this case, a monoclonal antibody against Forssman antigen may be used.
[0057]
<3> Use of the present invention
The use of the present invention is the use of DNA shown in the following (a) or (b) for the expression of Gb4 synthase.
(A) DNA containing a base sequence consisting of base numbers 109 to 1101 among the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(B) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence, or a DNA having a part of these nucleotide sequences.
[0058]
Here, the DNA shown in (b) preferably encodes a polypeptide having Gb4 synthase activity. The description of the DNA shown in (a) or (b) is the same as the above-described “method for producing the enzyme of the present invention”.
[0059]
The use of the present invention encompasses all aspects as long as the DNA shown in (a) or (b) above is used for the expression of Gb4 synthase. That is, all aspects of using the DNA when using the enzyme activity are included. For example, in the enzyme production method of the present invention, the Gb4 production method 2 of the present invention, and the Forsman production method of the present invention, the DNA shown in (a) or (b) above is used for the expression of Gb4 synthase. From this, the present invention is included in the use. In addition, expression of Gb4 synthase includes not only in vitro but also in vivo. For example, an embodiment in which the DNA shown in the above (a) or (b) is introduced into cells in a living body and Gb4 synthase is expressed in the living body is also included in the use of the present invention.
[0060]
Since Gb3 is known to be a receptor for verotoxin, a Gb3 sugar chain is converted into a Gb4 sugar chain by introducing and expressing DNA encoding Gb4 synthase into cells, thereby There is a possibility that the binding to cells may be lost, and such an embodiment is also encompassed in the use of the present invention.
[0061]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, this should not limit the technical scope of the present invention.
[0062]
First, reagents and the like used in this example will be described.
UDP-GalNAc, LacCer, Gb3 and Gb4 were purchased from Sigma. GM3 and GD3 were purchased from Snow Brand Milk Products Co., Ltd. UDP- [ ^Three H] GalNAc was obtained from NEN Life Science Products, Inc. M1 / 22.25.8.HL, an anti-Forssman glycolipid monoclonal antibody, is a culture of hybridoma (ATCC TIB-121) obtained from the American Type Culture Collection. Prepared from the supernatant.
[0063]
PBS-SVT, an expression vector for SV40 large T antigen, was obtained from JCRB (Japanese Cancer Research Resources Bank).
[0064]
A Forssman antigen synthase (FS) expression vector was constructed by inserting the HindIII / XhoI-digested fragment of pFS-35 (14) into pCDM8 (Invitrogen) and named pCDM8 / FS. .
[0065]
An expression vector for Gb3 / CD77 synthase was constructed by inserting the XhoI fragment of pVTR-1 (J. Biol. Chem. 275, p15152-15156 (2000)) into the XhoI site of pCDNA3.1 (Invitrogen). PCDNA3.1 / VTR-1.
[0066]
Mouse fibroblasts (L1 cells) were obtained from A. Sloan-Kettering Cancer Center. P. Cultured in Dulbecco's modified Eagle's minimal essential medium (D-MEM), which was kindly provided by Dr. Albino and contained 7.5% fetal bovine serum (FCS). L cells do not have α1,4-galactosyltransferase activity and do not express Gb3 / CD77 but express large amounts of LacCer.
[0067]
A mouse fibroblast cell line (1B9) used as a recipient cell in a transient expression system was obtained by transforming L cells into pBS-SVT (SV40 large T antigen) and pCDNA3.1 / VTR-1 (Gb3 / CD77). It was established by screening for neomycin (neo) resistant cells that were positive for Gb3 and SV40 large T antigen expression. The expression of Gb3 and SV40 large T antigen was determined by rat anti-Gb3 monoclonal antibody 38.13 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, p6485-6488 (1981)) and mouse anti-SV40 large T antigen monoclonal antibody Pab101 (Santa Cruz Biotechnology, Inc) was performed by indirect immunofluorescence assay and flow cytometry, respectively. Stable transfectants were cultured in D-MEM containing 7.5% FCS and 300 μg / ml G418.
[0068]
1B9 is characterized in that it contains a large amount of Gb3, but contains only a negligible amount of Gb4 and Forssman antigen.
[0069]
[Example 1]
<1> Expression cloning of 1,3-N-acetylgalactosamine transferase cDNA A plasmid (Invitrogen) of an adult human kidney cDNA library together with pCDM8 / FS was used in DEAE-dextran method (J. Biol. Chem., 267, p12082-12089 (1992)) were transfected into 1B9 cells (expressing SV40 large T antigen and Gb3). After 48 hours, transfected cells were trypsinized and peeled and incubated with rat monoclonal antibody M1 / 22.25.8.HL for 1 hour under ice cooling. After washing the cells, the cells were seeded on a dish (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, p3365-3369 (1987)) coated with goat anti-rat IgM (ICN). Plasmid DNA was recovered from the panned cell by Hirt extraction, and E. coli XL-1 Blue (Stratagene) was transformed. This process was repeated 4 times. A small-scale immunofluorescence assay identified approximately 1000 bacterial colonies as positive. When a clone extracted from this colony and pCDM8 / FS were both transferred to 1B9 cells, a clone expressing Forssman antigen was selected. As a result, three independent clones were identified.
[0070]
As a result, two clones (named “type 1” and “type 2”) having different 5′-untranslated regions and presumed to be globoside synthase genes were identified. All intron sequences at the exon-intron junction were consistent with the GT-AG consensus. In both

types

1 and 2, the nucleotide sequence of the open reading frame was essentially the same. Therefore, the type 1 clone was decided to be used for the subsequent analysis, and this was named β1,3GalNAcT-1.
[0071]
<2> Sequence analysis
The nucleotide sequence of the cloned cDNA was determined by the dideoxynucleotide termination method using PRISM dye terminator cycle sequencing kit and model 310 DNA sequencer (Applied Biosystems).
Amino acid sequence and hydropathy analysis was performed using Genetyx-Mac software version 8.0 (software development).
The results of the sequence analysis for β1,3GalNAcT-1 type 1 are shown in FIG.
The position of the AUG start codon was determined according to the Kozak consensus sequence (Cell 44, p283-292 (1986)). As a result, the nucleotide sequence of the cloned cDNA had a single open reading frame. In FIG. 1, the deduced amino acid sequence is shown below the nucleotide sequence. From this open reading, a protein having a molecular weight of 39,511 consisting of 331 amino acids was estimated. In addition, the presumed transmembrane hydrophobic domain is underlined, and the sites (5 locations) that may be N-linked glycosylated are boxed. Polyadenylation signals are also underlined.
[0072]
Surprisingly, when this amino acid sequence was compared with other cDNAs using a database, it was identical to human β3GalT-3 reported by Amado et al. (J. Biol. Chem. 273, p12770-12778 (1998)). It turned out to be. Human β3GalT-3 has been considered to belong to the β3-galactosyltransferase gene family, but no galactosyltransferase activity has been reported.
[0073]
The nucleotide sequence of the 5′-untranslated site for type 2 of β1,3GalNAcT-1 is shown in FIG. Exon-intron bonds are also shown.
Hydropathy plots were performed in a 17 amino acid window by the method of Kyte and Doolittle (J. Mol. Biol. 157, p105-132 (1982)). The results are shown in FIG.
"Hydrophobicity" in Fig. 3 means the degree of hydrophobicity.
From this result, it was shown that there was one remarkable hydrophobic region consisting of 23 amino acid residues on the amino terminal side. This suggests that this protein, like many other glycosyltransferases currently known, has a type II transmembrane topology.
[0074]
<3> Preparation of membrane extract
L cells reaching 80% confluence were transfected with the expression vector by the DEAE-dextran method. After 80 hours, the cells were collected, and the cells were disrupted in an ice-cold phosphate buffered saline containing 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride using a nitrogen cavitation apparatus (J. Biol. Chem., 270, p6149-6155 (1995)). Nuclei were removed by low speed centrifugation and the supernatant was centrifuged at 100,000 xg for 1 hour at 4 ° C. The precipitate was resuspended in ice-cold 100 mM MES buffer (pH 6.5) and used as the enzyme source.
[0075]
<4> Enzyme assay
The β1,3-N-acetylgalactosamine transferase assay is performed using 10 mM MnCl. ₂ , 0.3% Triton X-100, 100 mM MES buffer (pH 6.5), 0.1 mM UDP- [ ^Three H] GalNAc (160 dpm / pmol: donor of GalNAc), 200 μg of the following membrane extract, and 20 μg of substrate (acceptor) were mixed (total amount: 50 μl). After incubating at 37 ° C. for 3 hours, the enzyme reaction was stopped by adding 0.5 ml of water. The product was isolated using a C18 Sep-Pak cartridge (Waters), spotted on an aluminum-backed silica gel-60 HPTLC plate (Merck) and washed with a chloroform / methanol / water (65: 25: 5) solvent system. By developing, thin layer chromatography (TLC) was performed. The plate is then dried and the En ^Three Hance ^TM Sprayed with (NEN Life Science Products) and radiolabeled products were visualized by autoradiography. Note that LacCer, Gb3, and Gb4 were used as the mobility standards in TLC.
[0076]
As a membrane extract, a pCDNA3.1 vector (control) or a membrane extract from L cells transfected with β1,3GalNAcT-1 (pCDNA3.1 / β1,3GalNAcT-1) inserted into the pCDNA3.1 vector was used. Assayed using Gb3 glycolipid as substrate (receptor).
As a result, this enzyme [ ^Three It was revealed that H] GalNAc was effectively transferred to Gb3 (79 pmol / hour / mg protein), and a new component having the same mobility as that of the standard Gb4 was generated. On the other hand, as a result of assay using various glycolipids (LacCer, GM3, GD3 or Gb4) as substrates (receptors), [ ^Three H] GalNAc was not transferred to LacCer, GM3, GD3 and Gb4. This indicates that this enzyme is different from GA2 / GM2 / GD2 synthase and Forssman antigen synthase.
In addition, no activity was detected in the cell extract transfected with the pCDNA3.1 vector (control).
[0077]
<5> Glycolipid extraction
Glycolipids were isolated by the method described in Biochemistry 24, p7820-7826 (1985). That is, from 1B9 cells transfected only with pCDNA3.1 or 1B9 cells transfected with pCDNA3.1 / β1,3GalNAcT-1 (both packed in about 0.24 ml), chloroform / methanol (2 : 1, 1: 1, 1: 2). After acetylation, the glycolipid fraction was isolated using a Florisil column. After deacetylation and desalting, total glycolipids were dissolved in chloroform / methanol (2: 1) and spotted on TLC plates. Neutral glycolipids extracted from human B erythrocytes and Gb4 were also spotted in the same manner, and after development, the band was detected by spraying orcinol or primulin. In the lane where the natural glycolipid was spotted, a very dark band was detected at the Gb4 movement position, and an intermediate band was detected at the LacCer and Gb3 movement positions.
In the lane spotted with Gb4, a dark band was detected only at the moving position of Gb4.
[0078]
In the lane spotted with glycolipid extracted from 1B9 cells transfected with only pCDNA3.1, a band was detected only at the Gb3 migration position.
In the lane spotted with glycolipid extracted from 1B9 cells transfected with pCDNA3.1 / β1,3GalNAcT-1, bands were detected at the movement positions of Gb3 and Gb4.
[0079]
<6> TLC-immunostaining
TLC-immunostaining was performed according to the method described in Anal. Biochem. 221, p312-316 (1994) and according to the method described in Biochemistry 24, p7820-7826 (1985). Specifically, lipids were extracted and spotted on a TLC plate and developed as described above, and then the TLC plate was heat-blotted onto a polyvinylidene difluoride membrane. This membrane was incubated for 1 hour with a 1: 100 diluted human anti-Gb4 monoclonal antibody (9H6), washed, and then incubated with biotinylated goat anti-human IgM (Sigma) for 1 hour. Antibody binding is determined by ABC-PO. ^TM (Vector) and HRP-1000 ^TM (Konica) was detected according to these instructions.
The lane spotted with Gb4, the lane spotted with neutral glycolipid extracted from human B red blood cells, and the lane spotted with the extract of 1B9 transfected with pCDNA3.1 / β1,3GalNAcT-1 corresponded to Gb4 A band was detected only at the moving position.
[0080]
In contrast, no band was detected in the lane spotted with LacCer, the lane spotted with Gb3, and the lane spotted with the extract of 1B9 transfected with only pCDNA3.1. From these results, it was confirmed that the band that appeared in the lane spotted with the extract of 1B9 transfected with pCDNA3.1 / β1,3GalNAcT-1 was Gb4.
[0081]
<7> Flow cytometry analysis
1B9 cells were transiently transfected with pCDNA3.1, pCDNA3.1 / β1,3GalNAcT-1, pCDM8 / FS, or pCDNA3.1 / β1,3GalNAcT-1 and pCDM8 / FS by the DEAE-dextran method. Two days later, the cells were incubated with Ab M1 / 22.25.8.HL, then stained with fluorescein isothiocyanate-conjugated goat anti-rat IgM (shown in light lines) and analyzed for the extent of Forsman antigen expression by flow cytometry. . The results are shown in FIG. The dark line in FIG. 4 shows the control in which only the secondary antibody was reacted. In addition, “MOCK”, “β1,3GalNAc-T”, “FS” and “β1,3GalNAc-T + FS” in FIG. 4 are pCDNA3.1, pCDNA3.1 / β1,3GalNAcT-1, pCDM8 / FS, respectively. And transfected with pCDNA3.1 / β1,3GalNAcT-1 and pCDM8 / FS. In FIG. 4, “Relative fluorescence intensity” means relative fluorescence intensity.
[0082]
As a result, cells transfected with both pCDNA3.1 / β1,3GalNAcT-1 and pCDM8 / FS, ie, 1B9 cells into which a cDNA encoding Gb4 synthase and a cDNA encoding Forssman antigen synthase were introduced together. Only a clear expression of Forssman antigen was seen. When β1,3GalNAcT-1 or pCDM8 / FS was introduced alone, no Forssman antigen expression was observed. These data indicated that β1,3GalNAcT-1 is required for Gb4 expression.
[0083]
Northern blotting
Multiple Choice ^TM Northern blot membrane (OriGene Technologies) and poly (A) of human brain, colon, heart, kidney, liver, lung, muscle, placenta, small intestine, spleen, stomach and testis ⁺ Northern blotting was performed using RNA (2 μg). Hybridization is [ ³² P] dCTP-labeled β1,3GalNAcT-1 cDNA probe (consisting of the sequence represented by nucleotide numbers 1 to 818 of SEQ ID NO: 1) or actin probe (control) was used.
[0084]
As a result, strong gene expression was observed in the brain and heart. Moderate expression was seen in lung, placenta and testis, and weak expression was seen in kidney, liver, spleen and stomach.
[0085]
【The invention's effect】
The present invention provides a novel method for producing Gb4 synthase, a method for producing a Gb4 sugar chain, a method for producing a Forssman antigen sugar chain, and the like. The enzyme production method of the present invention is useful for the large-scale preparation of Gb4 synthase, and the Gb4 synthase produced thereby is extremely useful because it can be used in the method of producing Gb4 of the present invention. The Gb4 production method and the Forssman production method of the present invention are useful for the large-scale preparation of these globo-based glycolipids.
The use of the present invention is also a method of using DNA encoding Gb4 synthase for Gb4 synthase expression. According to the use of the present invention, a Gb3 sugar chain (receptor for verotoxin) is converted into a Gb4 sugar chain, for example, by introducing a DNA encoding Gb4 synthase into a cell and expressing it. There is also a possibility that the connectivity can be lost.
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the results of sequence analysis for β1,3GalNAcT-1 (Gb4 synthase) type 1. FIG.
FIG. 2 shows the nucleotide sequence of the 5′-untranslated site for type 2 of β1,3GalNAcT-1 (Gb4 synthase).
FIG. 3 is a diagram showing a hydropathy plot of a deduced amino acid sequence of Gb4 synthase.
FIG. 4 is a graph showing the degree of Forssman antigen expression when various DNAs are introduced into 1B9 cells.

Claims

A method for producing a Gb4 sugar chain, comprising at least a step of bringing the following polypeptide (A) or (B), an N-acetylgalactosamine donor and a Gb3 sugar chain into contact with each other to cause an enzymatic reaction.
(A) A polypeptide having the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 331 of SEQ ID NO: 2.
(B) Galactose in the Gb3 sugar chain consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or translocated in the amino acid sequence (A), and from an N-acetylgalactosamine donor A polypeptide having an enzymatic activity to transfer an N-acetylgalactosamine residue to the C3 position of the residue.

A method for producing a Gb4 sugar chain, comprising at least a step of introducing the DNA shown in the following (a) or (b) into a Gb3 sugar chain-expressing cell and then growing the cell.
(A) DNA containing a base sequence consisting of base numbers 109 to 1101 among the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(B) DNA set forth in SEQ ID NO: 1 .

Forsman antigen sugar chain comprising at least the steps of introducing the DNA shown in (a) or (b) below and cDNA encoding Forsman antigen synthase into a Gb3 sugar chain-expressing cell and then growing the cell. Manufacturing method.
(A) DNA containing a base sequence consisting of base numbers 109 to 1101 among the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(B) DNA set forth in SEQ ID NO: 1 .