JP4613326B2 - タンパク質の不溶化方法、タンパク質由来樹脂の製造方法、並びに、タンパク質由来の樹脂及び生分解性プラスチック - Google Patents
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(1)生分解性 :微生物の作用により、定量的にCO2及びH2O又はCH4及びH2Oのいずれかに変換されるポリマー。
(2)加水分解性:加水分解のプロセスにより分解されるポリマー。
(3)光分解性 :光と酸素との総合作用により分解されるポリマー。
(4)酸化分解性:酸化分解プロセスにより分解されるポリマー。
(1)微生物産生系:糖等を原料として微生物の体内に蓄積させるタイプ。ポリヒドロキシブチレート等。
(2)天然物系:バイオマスを利用したタイプ。澱粉、酢酸セルロース、キトサン等。
(3)化学合成系:モノマーを重合するタイプ。ポリ乳酸、ポリビニルアルコール等。
生分解性プラスチック研究会、「生分解性プラスチックの本」、p.22−23、日刊工業新聞社、2004年8月30日発行 Nakamura, T. et al. "Interaction during heat induced gelatin in a mixed system of soybean 7S and 11S globulins" Agric. Biol. Chem. Vol. 50, PP. 2429-2435, 1986 Kitabatake, N. et al. "Rheological properties of heat induced ovalbumin gels prepared by two-step and one-step heating methods." J. Food Sci. Vol. 54, PP. 1632-1638, 1989
前記原料タンパク質のBSAは、市販の精製BSA(和光純薬工業株式会社製)を使用した。以下で使用する他の薬品類も同様に市販のものを使用した。なお、前記BSAは、SDS−PAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)において確認したところ均質的であり、また、その含水量が5%であった。
亜臨界水処理のためのバッチ式反応器として、ステンレス鋼(材質:SUS316製)のパイプの両端にそれぞれキャップ(SWAGELOK社製)を取り付けた反応器を作製した。前記反応器を、前記パイプの内径を変えて2つ作製したところ、内容積は、それぞれ9.0cm3及び34cm3であった。
反応器に充填する反応試料は、前記精製BSAを、純水(Milli-Q(ミリポア社製)で処理した水、以下同じ。)に溶解して調製した。特に言及しない場合、BSA濃度は、160g/Lである。
亜臨界水処理は、以下のように行った。まず、前記反応器に反応試料を充填し、密閉する。次に、この反応器を所定温度(例えば、127℃〜300℃)で安定しているソルトバス(Thomas Kagaku Co.Ltd.製)に投入し、所定時間の後、前記反応器を、前記ソルトバスからすみやかに取り出し、大量の冷却水中に投入して急冷した。なお、この亜臨界水処理においては、前記ソルトバスの温度を反応温度、前記反応器が前記ソルトバス内にある時間を反応時間とした。前記急冷後、不溶性固体と水相とからなる反応生成物を前記反応器から回収し、50mlの純水に稀釈後、室温、3,000 g、15分で遠心分離した。上澄み液を取り除き、ミリポアメンブレン(孔径2.2×10-7m、ミリポア社製)により不溶性固形成分として合成されたBSA樹脂を分離した。
亜臨界水処理時の反応温度及び反応時間が、BSA樹脂の収率に与える影響を確認した。その結果を図1に示す。同図に示すとおり、反応温度及び反応時間の増加とともに、生成されるBSA樹脂の収率が減少した。
前記BSA樹脂の性質を確認するため、200℃及び250℃で0.5分反応させて合成したBSA樹脂、並びに、天然(未処理)BSAについてSEM(走査型電子顕微鏡)観察した。前記SEMは、JEOL6700電界放出SEM(JEOL Inc.製)を使用した。観察試料は、乾燥させた前記BSA樹脂を固形試料として使用し、その他については、製造業者の取扱い説明書にしたがって行った。その結果の一例を図3に示す。同図に示すとおり、BSA樹脂(図3B,C)と天然BSA(図3A)とは、一見して区別できた。また、200℃で合成されたBSA樹脂では、BSAが、細い紐からなる多孔性の相互接続ネットワークを形成するように凝集していた(図3B)。他方、250℃で合成されたBSA樹脂では、BSAが、より大きな塊を形成するように凝集していた(図3C)。
BSA樹脂及び天然BSAの炭素、窒素、硫黄の各元素成分の割合を、CHNSコーダ(PerkinElmerJapan製、商品名:PE2400SeriesII)を用いて測定した。測定試料は、天然BSA及び200℃〜300℃、0.5分〜1.5分で合成されたBSA樹脂を使用した。前記測定試料は、測定前に、75℃のオーブンで2日間乾燥させた。その結果の一例を図4に示す。同図に示すとおり、0.5分の段階では、全ての温度で変化がなかったが、300℃のBSA樹脂の場合、1.0分後に、窒素の含有量が減少し、炭素及び硫黄の含有量が増加した。これは、300℃のBSA樹脂では、反応1.0分後に既に加水分解が始まっていることを示す。
BSA樹脂において形成される結合を、FT-IR分光法により確認した。BSA樹脂試料のIRスペクトルは、FT/IR-410フーリエ変換赤外線分光器(JASCO CO.Ltd.製)により記録した。IR解析の固形試料は、KBrパウダーとともに圧縮成形して調製した。前記固形試料として、天然BSA及び250℃、0.5分及び20分で合成したBSA樹脂を使用した。その結果の一例を図5に示す。同図に示すとおり、天然BSAのIRスペクトルの特徴と、250℃、0.5分のBSA樹脂のそれとは、同一であった。このことは、前記BSA樹脂が、天然BSAから、新たな結合形成や結合切断をすることなく、結合されたものであることを示す。また、250℃20分のBSA樹脂のIRスペクトルからは、タンパク質構造の劇的な変形が読み取れた。すなわち、815〜560cm-1及び710〜695cm-1の-R-O-N-結合を示すピーク、並びに、690〜685cm-1の-CS-SS-CS-結合を示すピークが現れた。
反応試料のBSA濃度を、5〜160g/Lの範囲で変化させて、250℃、1分の条件でBSA樹脂を合成した。その結果の一例を図7Aに示す。同図に示すとおり、反応開始時の濃度が、上記範囲のどの濃度にであっても、不溶化反応が起こり、樹脂が合成されることが示された。なお、50g/Lは、BSAの一般的な血清中の濃度である。また、図7Bに、それぞれのBSA濃度における収率を示す。同図に示すとおり、BSA濃度が高くなるにつれ収率は落ちてはいるものの、いずれの濃度においても非常に高い収率を示した。
所定の温度で形成されたBSA樹脂への熱流(heat flow)を、DSC(示差走査熱量計、商品名:DSC 6200、セイコーインストルメント社製)で測定した。スキャンレートは、5℃/minに設定し、較正試料として、インジウム(ΔH=28.5J/g、Tm=156℃)を使用した。測定試料として、天然BSA並びに200、250、275及び300℃、1分で合成したBSA樹脂を使用した。測定は、製造業者の取扱い説明書に従い行った。DSCによれば、熱により誘導されてタンパク質分子構造が溶解や変性する変換点(転移温度)が、スペクトルのピークとして検出できる。前記測定の結果、天然BSAの転移温度が66℃であったのに対して、200、250、275及び300℃のBSA樹脂の転移温度は、それぞれ、66、77、78及び85.5℃であり、BSA樹脂の合成反応温度が高くなるほど、転移温度が高くなった。このことから、反応温度が高くなるほど、BSA樹脂の結合力、すなわち、架橋の程度が大きくなることが示された。
BSA樹脂の最大吸水度の測定は、乾燥させたBSA樹脂を3日間4℃で純水中に浸し平衡最大吸収に達したところで重量を測定し、乾燥時の重量に対する増加分の重量の割合として算出することで行った。200、250、275及び300℃のBSA樹脂の最大吸水度の結果の一例を図8に示す。同図に示すとおり、BSAの不溶化反応温度が高くなるほど、BSA樹脂の最大吸水度が減少した。
BSA樹脂の機械的性質を、一軸方向の引張試験を行い確認した。測定装置は、100kNのスタティックロードセル(ASTM D638)を備えた商品名Instron 5582を用いた。測定試料は、10mm×15mm×40mmの大きさに調製した、最大吸水状態の250℃及び275℃のBSA樹脂、並びに、60%の乾燥状態の275℃のBSA樹脂を用いた。測定は、室温、10mm/分の引張り速度で行った。その応力・歪み曲線の一例を図9に示す。同図に示すとおり、全ての試料において、降伏点まで応力と歪みとは直線の比例関係であり、降伏点を過ぎると、応力が減少し、破断するまで歪みが増加した。また、全ての試料において、塑性を示す部分が少なかったが、特に、60%乾燥試料において顕著であった。250及び275℃の最大吸水試料の平均降伏強さは、それぞれ、0.026MPa及び0.024MPaであり、平均引張り弾性率は、それぞれ、0.0016及び0.0014であった。60%乾燥試料は、前記最大吸水試料よりも剛性が高く、平均降伏強さ及び平均引張り弾性率は、それぞれ、0.06MPa及び0.0032であった。
BSA樹脂の変性剤に対する溶解度を確認した。乾燥させたBSA樹脂をグラインドしてパウダー状にし、下記1〜5に示す溶液に混合し、溶解したタンパク質を測定した。タンパク濃度は、分光光度計(商品名:UV-2100、島津製作所製)を用いて、ε=0.55(g/L)-1cm-1として、波長279nmで測定した。
1:水
2:6M 尿素
3:6M グアニジン塩酸
4:6M 尿素 + 20mM EDTA + 0.2M ジチオスレイトール(DTT)
5:6M グアニジン塩酸 + 20mM EDTA + 0.2M DTT
その結果、BSA樹脂は、1の水には、不溶であり、2及び3の尿素及びグアニジン塩酸には、10%未満の溶解度であった。そして、4及び5に対しては、80%以上の溶解度を示した。尿素やグアニジン塩酸は、水の構造を壊すことによって、水等の極性溶媒に対する非極性物質の溶解を促進することができる。BSA樹脂が、尿素やグアニジン塩酸に対して難溶性を示したことから、BSA樹脂の合成における重合には、例えば、ジスルフィド結合等のタンパク分子間の共有結合が関与していることが確認できた。
250℃、1分の条件で合成したBAS樹脂を乾燥させてグラインドして得たBSA樹脂のパウダーを用いて、BSA樹脂を板状に成形した。まず、前記BSA樹脂パウダー100重量部に対し、水を150重量部混合してペースト状の混合物を調製した。次に、前記混合物を平らに塗布した後、120℃、20MPa、30分の熱プレスを行い、板状に加工されたBSA樹脂を得た。加工前のBSA樹脂と加工後のBSA樹脂についてSEM(走査型電子顕微鏡)観察した結果を図10に示す。図10Aは、加工前のBSA樹脂、図10Bは、加工後のBSA樹脂のSEM写真である。これらの図に示すとおり、加工後には、BSA樹脂が均一化されたことが分かる。
前記BSA樹脂パウダーを100重量部使用することに代えて、改質剤としてグリセリン及び/又はスターチを10又は25重量%含むBSA樹脂パウダーを100重量部使用した他は、実施例2と同様にして加工し、板状のBSA樹脂を得た。得られた加工BSA樹脂について、一軸方向の引張試験を行い、機械的性質を確認した。測定装置は、100kNのスタティックロードセル(ASTM D638)を備えた商品名Instron 5582を用いた。その結果を下記表1に示す。
試料 BSA樹脂 スターチ グリセリン 水 引張応力 引張歪み 伸び
番号 wt% wt% wt% wt% MPa % mm
1 100 0 0 150 12.7 1.7 1
2 90 0 10 150 10.3 4.4 2.4
3 75 0 25 150 8.0 7.8 4.7
4 90 10 0 150 8.6 1.3 0.5
5 75 25 0 150 0.6 2.8 1.7
6 80 10 10 150 5.8 1.2 0.7
BSA樹脂の生分解性を示すため、BSA樹脂試料を発酵培地に加えて嫌気条件下で培養し、BSA樹脂が分解されることによって発生するメタンガス(CH4)を測定した。
Claims (12)
- タンパク質を不溶化する方法であって、温度180〜280℃、圧力0.27MPa以上22.1MPa未満、時間15秒以上5分以下の条件でタンパク質の亜臨界水処理を行うことにより前記タンパク質を不溶化物とすることを含む、方法。
- 前記亜臨界水処理を、前記不溶化物を分解する反応が優勢となる前に止めることを含む、請求項1記載の方法。
- さらに、亜臨界水処理後に処理物を急冷する工程を含む請求項1又は2に記載の方法。
- 前記タンパク質が、水溶性タンパク質を含む請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- タンパク質由来の樹脂の製造方法であって、請求項1から4のいずれかに記載の方法によりタンパク質を不溶化する工程を含む製造方法。
- 請求項5に記載の製造方法により製造されるタンパク質由来の樹脂。
- 請求項6に記載の樹脂のパウダーを含む混合物をプレス成形することを含む、前記樹脂の成形物の製造方法。
- タンパク質の不溶化物の製造方法であって、請求項1から4のいずれかに記載の方法によりタンパク質を不溶化する工程を含む製造方法。
- 請求項8に記載の製造方法により製造されるタンパク質の不溶化物。
- 請求項6に記載の樹脂及び請求項9に記載の不溶化物の少なくとも一方を含む生分解性プラスチック。
- さらに、改質剤を含む請求項10に記載の生分解性プラスチック。
- 請求項10又は11に記載の生分解性プラスチックを用いて成形及び積層の少なくとも一方をすることにより得られる生分解性プラスチック製品。
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