JP4602547B2 - Methods and compositions for peptide synthesis - Google Patents

Abstract

The present invention relates, first, to methods for the synthesis of peptides, in particular T-20 (also referred to as "DP-178"; SEQ ID NO:1) and T-20-like peptides. Such methods utilize solid and liquid phase synthesis procedures to synthesize and combine groups of specific peptide fragments to yield the peptide of interest. The present invention further relates to individual peptide fragments which act as intermediates in the synthesis of the peptides of interest (e.g., T-20). The present invention still further relates to groups of such peptide intermediate fragments which can be utilized together to produce full length T-20 and T-20-like peptides.

Description

本発明は、さらにまた、目的のペプチドの合成において中間体として有用なペプチド断片の特定のグループに関する。本発明のペプチド断片のグループとしては、下記表２に指定される、グループ1〜20が挙げられる。
【０００７】
【表２】

この発明は、一部には、固相液相合成反応の特定の組合せによって初めて、高効率且つ高収量で大規模に高純度のT-20及びT-20様ペプチドの製造が可能になるという本発明者らの予期せざる発見に基づいている。特に、本発明の方法によれば、T-20及びT-20様ペプチドが、1キログラム以上の規模で合成できる。固相合成のための本発明の特定のT-20ペプチド断片を選択することによって、固相技術の高効率の結合(カップリング)が、3-、4-又は5-倍もの過剰のアミノ酸及び固相合成で通常必要とされる試薬を用いる必要なしに利用され得ることが見出された。本発明の方法では、本発明のペプチド断片の固相合成においてたった1.5倍ほどのアミノ酸しか使用しない。アミノ酸及び試薬の量におけるこのコスト低減により、本発明の方法はT-20及びT-20様ペプチドの大規模合成に適している。
【０００８】
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、特定のペプチド断片が、約0.8〜1 mmol/g(固相樹脂)のローディング量（loading）で固相合成され得ることを見出した。このローディング量は、固相ペプチド合成で一般に達成される0.25〜0.4 mmol/g(樹脂)のローディング範囲よりも顕著に高い。さらに、本発明者らは、超酸感受性樹脂を用いた固相で所定のペプチド断片を合成することが、異常に高純度のペプチド断片をもたらすことを見出した。クロマトグラフィー技術は、本発明によって製造されたペプチド断片を精製するのに必要ではなく、断片を使用の前に単に沈殿及び／又は粉砕(trituration)工程に付すか、又は樹脂から直接取得したままで使用する。超酸感受性樹脂を使用することによって、本発明の合成された保護ペプチドを、側鎖保護基の同時除去を行なうことなく樹脂から切断することが可能になる。これは、不純物を減らし、10個以上のアミノ酸を含むペプチドを、高純度で合成することを可能にする。本発明によって製造された高純度のペプチド断片を結合させることにより、本発明の方法に従って液相中で合成されるT-20及びT-20様ペプチドの不純物プロフィールは、主として、密接に関係した類似体よりもむしろ、結合しなかった断片からなる。従って、本発明によって製造されたT-20及びT-20様ペプチドは、従来技術によって製造されたものよりも精製するのがかなり容易である。下記第9及び11節に示す実施例では、T-20全長ペプチドのそのようなコンビナトリアル(組合せ)合成を実証する。第11節に示す実施例では、T-20及びT-20中間体ペプチドの大規模合成及び精製を実証する。従って、本発明の方法によれば、T-20及びT-20ペプチド中間体が、1キログラム以上の規模で製造できる。
【０００９】
本発明者らはまた、予期せざることに、T-20及び他のT-20様ペプチドなどのペプチド、並びに本明細書中に記載された特定のペプチド断片が、塩基性pH範囲で使用できる高容量材料（high capacity materials）を用いて精製できることを見出した。すなわち、本発明は、さらにまた、ペプチド、特にT-20及びT-20様ペプチド、並びに目的ペプチドの合成の中間体として有用な個々のペプチド断片の精製方法に関する。
【００１０】
3.1 定義
本明細書中で用いるアミノ酸表記は、慣用のものであり、以下の通りである：

４．図面の簡単な説明
（図面の簡単な説明については下記参照）
５．発明の詳細な説明
5.1 全長ペプチド
本発明は、T-20、あるいは、DP-178として知られるペプチドを合成するために使用できる方法、ペプチド断片、ペプチド断片のグループに関する。T-20は、HIV-1_LAI分離物由来の膜貫通タンパク質gp41のアミノ酸残基638-673に相当するペプチドであり、36個のアミノ酸配列（アミノNH₂末端からカルボキシCOOH末端へと読む）を有する：
NH₂−YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF−COOH
本発明の方法、断片及び断片のグループ、並びに断片及び断片のグループの選択に利用される技術は、T-20に加えてT-20様断片を合成するのにも使用できることが理解されるだろう。本明細書中で用いる語句「T-20様」とは、米国特許第5,464,933号；第5,656,480号又は国際公開公報第WO96/19495号(それぞれその全体が参照によって本明細書中に組み入れられる)に列挙されるいずれかのHIV又は非HIVペプチドを意味する。
【００１１】
上記のT-20及びT-20様ペプチドに加えて、本発明の方法、断片及び断片のグループは、修飾されたアミノ及び／又はカルボキシル末端を有するペプチドを合成するのに使用できる。T-20を例にとると、該ペプチドは、式：
X−YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF−Z
（式中、Xは、アミノ基；カルボベンゾキシル、ダンシル、及びt−ブチルオキシカルボニルからなる群から選択される疎水性基；アセチル基；9−フルオレニル−メトキシ−カルボニル（FMOC）基；又は脂質−脂肪酸コンジュゲート、ポリエチレングリコール、及び炭水化物からなる群から選択される巨大分子キャリアー基を示し；そしてZは、カルボキシル基；アミド基；t−ブチルオキシカルボニル基；p−ニトロベンジルエステル基；又は脂質−脂肪酸コンジュゲート、ポリエチレングリコール及び炭水化物からなる群から選択される巨大分子キャリアー基を示す）で示される。前記「X」及び「Z」基の付加技術は、当業者に周知である。
【００１２】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、上記式においてXがアセチル基であり、Zがアミド基であるペプチドを合成するのに用いられる。下記第9節に示される実施例は、下記第5.2節に記載されるペプチド中間体の結合によるT-20ペプチドの成功した合成を実証する。好ましい方法では、T-20及びT-20様ペプチド並びに中間体は、限定するものではないが、高い（7より高い）pH範囲で安定なジルコニウム系充填剤、ポリスチレン、ポリアクリル又は他のポリマー系充填剤を含めて（ローディング容量を最大化するための）非シリカ系充填剤を用いて精製できる。例えば、広範なpH範囲を示す非シリカ系カラム充填剤は、Tosohaus社（Montgomeryville, PA）によって販売されているものよりも高いpH値を含む。前記材料で充填されたカラムは、低、中又は高圧クロマトグラフィーで作動する。例えば、下記第10節に示される精製法を参照されたい。
【００１３】
5.2 ペプチド中間体
本発明は、限定するものではないが、上記表1に列挙された特定のアミノ酸配列を有するT-20及びT-20様ペプチドのペプチド断片中間体、及び表2に列挙されたペプチド断片中間体のグループを包含する。該ペプチド中間体、特に下記表2に列挙されるグループに含まれるものは、T-20及びT-20様ペプチドを製造するのに利用できる。
【００１４】
表1又は2に列挙されたペプチド断片のアミノ酸残基の側鎖のいずれか1個以上は、t−ブチル（t-Bu）、トリチル（trt）及びt−ブチルオキシカルボニル（Boc）などの標準的な保護基によって保護できる。t-Bu基は、アミノ酸残基Tyr(Y)、Thr(T)、Ser(S)及びAsp(D)の好ましい側鎖保護基であり；trt基は、アミノ酸残基His(H)、Gln(Q)及びAsn(N)の好ましい側鎖保護基であり；Boc基は、アミノ酸残基Lys(K)及びTrp(W)の好ましい側鎖保護基である。
【００１５】
表1に列挙された断片1、2、3及び4の合成の間、ヒスチジン残基の側鎖は、好ましくはトリチル（trt）保護基によって保護されていなければならない。もしそれが保護されていないと、樹脂からペプチド断片を切断するために使われる酸が、ヒスチジン残基と有害に反応し、ペプチド断片の分解を引き起こすだろう。
【００１６】
本発明のペプチド断片のグルタミン残基は、トリチル（trt）基によって保護されているのが好ましい。しかしながら、断片1-16及び9-16のカルボキシル末端ではグルタミン残基を保護しないことが好ましい。1-16断片のカルボキシ末端のグルタミン残基上に保護基が存在しないと、1-16断片と17-36断片との反応が促進され、たった約2％のラセミ化しか伴わずに断片同士を結合できることがわかった。さらに、有機溶媒中での本発明のいずれかのペプチド断片のより低い溶解性が望まれる場合は、トリチル保護基を、その断片のいずれか1個以上の他のグルタミン残基から除去し得る。
【００１７】
本発明の各ペプチド断片の全てのアスパラギン残基は保護されているのが好ましい。さらに、トリプトファン残基はBoc基によって保護されているのが好ましい。
【００１８】
上記表1に列挙されたペプチド式1〜18に従う保護されたペプチド断片としては、限定するものではないが、下記表3に列挙される化合物が挙げられる。
【００１９】
【表３】

上記表3に列挙されたペプチドのアミノ酸残基のいずれか1個以上の側鎖を、上記のように、tBu、trt及びBocなどの標準的な側鎖保護基によって保護できる。表3のペプチドの代表的な合成を下記第7及び8節に示し、そこでは下記第5.4節で述べる一般的技術を用いる。
【００２０】
5.3 ペプチド合成
上述のように、本発明の個々のペプチド断片の幾つかは、固相合成法を用いて作られるのが好ましいが、本発明の他のペプチドは、固相および液相合成法を組み合わせて用いて作られるのが好ましく、前記合成は本明細書中に記載されるようにT-20またはT-20様ペプチドの製造で完了する。しかしながら、本発明のペプチド断片は、当業界で周知の技術によって合成または製造できることが理解されるであろう。例えば、参照によってその全体が本明細書中に組み入れられる、Creighton, 1983, タンパク質：構造および分子原理（Proteins: Structures and Molecular Principles）, W. H. Freeman and Co., NYを参照されたい。
【００２１】
あるいは、本発明のペプチドは、ペプチドのアミノ酸残基を連結する1個以上の結合が非ペプチド結合であるように合成できる。これらの他の非ペプチド結合は、当業者に周知の反応を利用することによって形成でき、以下に限定されないが、2〜3の例を挙げると、イミノ、エステル、ヒドラジド、セミカルバジド、およびアゾ結合を挙げることができる。
【００２２】
本発明のまたもう１つの実施形態では、上記配列を含むT-20およびT-20様ペプチドは、例えば、ペプチドの安定性、反応性および／または溶解性が増強されるように、ペプチドのアミノおよび／またはカルボキシ末端に存在する付加的な化学基によって合成できる。例えば、カルボベンゾキシル、ダンシル、アセチルまたはt−ブチルオキシカルボニル基などの疎水性基を、ペプチドのアミノ末端に付加することができる。同様に、アセチル基または9−フルオロエニルメトキシ−カルボニル基を、ペプチドのアミノ末端に配置することができる。（上記のT-20の「X」修飾を参照されたい。）さらに、疎水性基、t−ブチルオキシカルボニル、またはアミド基を、ペプチドのカルボキシ末端に付加することができる。同様に、p−ニトロベンジルエステル基をペプチドのカルボキシ末端に配置することができる。（上記のT-20の「Z」修飾を参照されたい。）そのような修飾を導入する技術は、当業者に周知である。
【００２３】
さらに、T-20およびT-20様ペプチドは、その立体配置が変わるように合成することができる。例えば、ペプチドの1個以上のアミノ酸残基の、通常のL−アイソマーよりもむしろD−アイソマーを用いることができる。
【００２４】
さらにまた、本発明のペプチドの少なくとも1個のアミノ酸残基は、周知の自然に存在しないアミノ酸残基の１つによって置換できる。これらのような変更は、本発明のペプチドの安定性、反応性および／または溶解性を増加させるように働くことができる。
【００２５】
T-20またはT-20様ペプチドのいずれも、それらのアミノおよび／またはカルボキシ末端に共有結合によって結合する巨大分子キャリアー基を追加的に有するように合成できる。そのような巨大分子キャリアー基としては、例えば、脂質−脂肪酸コンジュゲート、ポリエチレングリコール、炭水化物または付加的なペプチドが挙げられる。従って、上記のT-20の「X」修飾は、ペプチドのアミノ末端に共有結合によって結合する上記の巨大分子キャリアー基のいずれかを追加的に示すことができ、好ましくは付加的なペプチド基である。同様に、上記のT-20の「Z」修飾は、上記の巨大分子キャリアー基のいずれかを追加的に示すことができる。
【００２６】
本発明のペプチド断片は、標準FMOCプロトコルを用いて固相ペプチド合成（SPPS）法によって合成されるのが好ましい。例えば、Carpinoら, 1970, J. Am. Chem. Soc. 92(19):5748-5749；Carpinoら, 1972, J. Org. Chem. 37(22):3404-3409を参照されたい。好ましい実施形態では、本発明のペプチド断片の固相合成は、以下に限定されないが、塩化2−クロロトリチル樹脂（例えば、Barlosら, 1989, Tetrahedron Letters 30(30):3943-3946を参照されたい。）および4−ヒドロキシメチル−3−メトキシフェノキシブチル酸樹脂（例えば、Seiber, 1987, Tetrahedron Letters 28(49):6147-6150、およびRichterら, 1994, Tetrahedron Letters 35(27):4705-4706を参照されたい。）を含む超酸感受性固相支持体上で行われる。塩化2−クロロトリチル樹脂および4−ヒドロキシメチル−3−メトキシフェノキシブチル酸樹脂の両者は、Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CAから購入できる。
【００２７】
固相ペプチド合成で利用できる一般的な製造工程および樹脂の装填は、本明細書中に記載されている。樹脂の装填は、例えば、次の方法によって行うことができる：樹脂、好ましくは2−クロロトリチル樹脂などの超酸感受性樹脂を、反応チャンバーにローディングする。ジクロロメタン（DCM）などの塩素化溶媒で該樹脂を洗浄する。ベッドの液体を排出し（brained）、約8〜10倍容量（volume）のジクロロエタン（DCE）中1.5当量のアミノ酸および2.7当量のジイソプロピルエチルアミン（DIEA）からなる溶液を添加する。該アミノ酸のN末端は、好ましくはFmocによって、保護されているべきであり、該アミノ酸の側鎖は、必要または適当である場合には、保護されているべきである。この混合物を窒素通気によって2時間攪拌する。
【００２８】
2−クロロトリチル樹脂を適度に膨潤させるために塩素化溶媒が必要であることに注意すべきである。文献によれば、DCEは、より高い装填効率を与えるが、DCMは、殆どまたは全く装填の低下を伴わずに置換できる。
【００２９】
攪拌後、ベッドの液体を排出し、DCMで洗浄する。樹脂の活性部位を、9:1のMeOH：DIEAの溶液で、約20〜30分間末端キャッピング（endcapped）する。ベッドの液体を排出し、DCMで4回洗浄し、窒素パージによって乾燥し、装填された樹脂を得る。
【００３０】
Fmocは、アミノ酸のN末端に対して好ましい保護基である。どのアミノ酸が装填されるかによって、その側鎖は、保護されていてもよいし、保護されていなくてもよい。例えば、Trpが装填されているときは、その側鎖は、Bocで保護されているべきである。同様に、Glnの側鎖は、trtで保護できる。しかしながら、1〜16ペプチド断片の合成のための調製物中にGlnが装填されているときは、その側鎖は、保護されるべきではない。Leuの側鎖は保護する必要がない。
【００３１】
樹脂装填およびペプチド合成で用いられるFmoc保護アミノ酸は、必要に応じて側鎖保護基を有するまたは有しないものが、Sean社またはGenzyme社から入手できる。上記工程の代わりに、適当なアミノ酸がすでに装填されている樹脂を購入できる。
【００３２】
下記第6節に示される実施例は、典型的な樹脂調製物を記載している。
【００３３】
固相ペプチド合成法は、例えば、次の方法に従って行うことができる：装填された樹脂を反応チャンバーに添加し、溶媒、好ましくは塩化メチレン（DCM；好ましくは約10倍容量）で窒素攪拌下、約15分間調整して、樹脂ビーズを膨潤させる。2−クロロトリチル樹脂を適度に膨潤させるためにDCMが必要である。樹脂容量は、ビーズが膨潤し、活性部位が折りたたまれずに、反応に利用できるようになるにつれて、反応チャンバー中で2倍または3倍になるだろう。樹脂が膨潤した後、溶媒を反応チャンバーから排出する。
【００３４】
末端アミンまたは樹脂からのFmoc（9−フルロエニル−メチルオキシカルボニル）保護基の除去は、その樹脂をN−メチル−2−ピロリジノン（NMP）中ピペリジンの20％溶液のアリコートで2回、それぞれ約10分間処理することによって達成される。各アリコートに必要な20％のピペリジンのNMP溶液の容量は、実施される反応規模に依存するだろう。次いで、NMP（約10倍容量）のアリコートで5〜7回樹脂を洗浄して、Fmoc副生成物（すなわち、ジベンゾフルベン（dibenzofulvene）およびそのピペリジン付加物）並びに残ったピペリジンを除去する。
【００３５】
クロルアニル試験を用いて、Fmoc副生成物および残りのピペリジンの除去が完了したか否かを決定することができる。クロルアニル試験溶液を、トルエン中のクロルアニルの飽和溶液の液滴を約1mLのアセトンに添加することによって調製する。NMP洗浄は、その洗浄液の液滴をクロルアニル試験溶液に添加することによって試験できる。青色または紫色は、第2級アミンの存在について陽性であることを示し、Fmoc副生成物および／または残りのピペリジンが未だ存在することを示す。NMP洗浄を、青色または紫色がもはや観察されなくなるまで繰り返す。
【００３６】
一方、樹脂に添加される、配列中の次のアミノ酸は、そのカルボキシ末端が反応のために活性化される。各アミノ酸のアミン末端は、Fmocで保護されているはずである。どのアミノ酸が添加されるかによって、その側鎖は、保護されていてもよいし、保護されていなくてもよい。好ましくは、tyr(Y)、Thr(T)、Ser(S)およびAsp(P)の側鎖はt-Buで保護され、His(H)、Gln(Q)およびAsn(N)の側鎖はtrtで保護され、そしてLys(K)およびTrp(W)の側鎖はBocで保護される。しかしながら、上記で考察したように、Hisの側鎖は保護されていなければならない。さらに、断片1〜16および9〜16のカルボキシ末端のGln残基の側鎖は保護されないことが好ましい。LeuまたはIleの側鎖は、保護する必要がない。
【００３７】
アミノ酸は、次のように活性化される。Fmoc保護アミノ酸（1.5当量）、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（HOBT）（1.5当量）、およびジイソプロピル−エチルアミン（DIEA）（1.5当量）を、室温でNMP（約7.5倍容量）に溶解する。この溶液を0〜5℃に冷却し、次いで、O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N',N'−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート（HBTU）（1.5当量）を添加し、次いで、5〜15分間攪拌して溶解させる。活性化は、低温で行い、アミノ酸のラセミ化を最小限にすることが重要である。活性化およびラセミ化は、HBTUの非存在下では起きないので、HBTUは、冷たい溶液に添加される最後の試薬である。
【００３８】
活性化されたアミノ酸の溶液を、液体を排出した樹脂にローディングし、DCM（約2.5倍容量）で洗浄する。アミノ酸の活性化は、HBTUがDCMに不溶性なので、NMP中で行うことに注意すべきである。しかしながら、樹脂ビーズの適度な膨潤を維持するために、DCMをこの時点で反応物に添加する。該反応物を窒素通気によって、約1時間攪拌する。結合の完了は、下記に記載される定性ニンヒドリン試験でモニターできる。
【００３９】
定性ニンヒドリン試験を用いて反応の完了を確認するには、2〜20 mgの樹脂サンプルを回収し、メタノールできれいに洗浄する。このサンプルに、76％のフェノールのエタノール溶液を3滴、0.2 mM KCNのピリジン溶液を4または5滴、および0.28 Mニンヒドリンのエタノール溶液を3滴添加する。このサンプルをエタノールで希釈して、約0.5 mL容量にし、約75℃の加熱ブロック中に5〜10分間置く。青色または紫色は、遊離アミンの存在について陽性であることを示し、反応が未だ完結していないことを示す。濃縮サンプル中の変色程度をより容易に判断するために、このサンプルをさらに希釈して約3mL容量とする。
【００４０】
1時間後にニンヒドリン試験が陽性なら、結合反応をさらに1時間続ける。2時間後にニンヒドリン試験の陽性が続くなら、樹脂の液体を排出し、約10倍容量のNMPで3回洗浄し、1当量の活性化アミノ酸を用いて結合反応を繰り返す。
【００４１】
結合サイクルの間、樹脂を一晩保存すべきなら、樹脂ベッドの液体を排出し、窒素ブランケット（nitrogen blanket）下でDCMで被覆することができる。あるいは、該ベッドの液体を排出し、窒素ブランケット下で保存し、次いで、次の結合サイクルを進める前にDCM洗浄で調整する。できた断片を切断する前に一晩保存すべきなら、顕著なFmoc脱保護がNMP中で起きるので、樹脂ベッドをDCMで洗浄してNMPを除去すべきである。
【００４２】
結合が完了したと判定された後、前記樹脂の液体を排出し、NMPのアリコート（約10倍容量）で3回洗浄する。ペプチド断片の次のアミノ酸の結合（mer）のために、このサイクルを繰り返す。最終の結合反応に続いて、樹脂をNMPのアリコート（約10倍容量）で4回洗浄し、次いで、DCMのアリコート（約10倍容量）で4回洗浄する。樹脂結合ペプチドは、窒素パージによって乾燥できる。
【００４３】
固相合成法によって合成されたペプチドを切断し、例えば、次の方法に従って単離できる：ペプチドは、当業者に周知の方法を用いて樹脂から切断できる。例えば、トリフルオロ酢酸（TFA）の1％または2％DCM溶液あるいはTFAの1％および2％DCM溶液を組み合わせて用いてペプチドを切断できる。酢酸（HOAC）も、ペプチドの切断に使用できる。切断に必要な特異的な切断試薬、溶媒および時間は、切断される特定のペプチドに依存するだろう。切断後、切断画分を標準的な後処理工程に付し、ペプチドを単離する。一般的には、混合された切断画分を減圧下で濃縮し、次いで、エタノール、メタノールまたはヘプタンなどの溶媒で再構成する（reconstitution）。一般に、水を添加してペプチドを沈殿させ、減圧濾過によって回収する。あるいは、ペプチドの単離の前に該生成物を粉砕することができる。
【００４４】
下記第7.1〜7.6節に示される実施例は、表1、2および／または3に示されるペプチド中間体の固相合成を示す。
【００４５】
完全長T-20ペプチドの合成のためには、上記表1のペプチド中間体を一緒に結合させて、T-20ペプチドを得ることができる。例えば、上記表2に列挙されたペプチド中間体のグループを一緒に結合させ、T-20の完全長ペプチドを製造できる。中間体ペプチド断片からの完全長T-20のそのような合成の代表例は、下記第9節に示されており、図1〜5に概略的に記載されている。
【００４６】
特定の実施形態では、T-20合成の4断片アプローチに従うことができる。例えば、「4断片アプローチ」合成とは、固相および液相合成法を用いて合成および結合した4つのT-20中間体ペプチド断片で始まる、完全長T-20ペプチドまでのT-20合成スキームをいう。上記表2に示される中間体ペプチド断片グループ5、6、8、9および12〜15は、好ましいグループを示す。図1および図2は、表2のペプチド中間体グループ6を利用し、完全長T-20を合成する、２種の4断片アプローチを示す。このグループについては、アミノ酸残基36（T-20カルボキシ1−末端アミノ酸残基）が、断片結合プロセスの間に個々に導入されることに注意する。図1に示されるT-20合成スキームの最高点（culmination）は、第9.1節で示される実施例で実証される。
【００４７】
さらに、実施形態、T-20合成のための3断片アプローチに従うことができる。「3断片アプローチ」合成とは、固相および液相合成法を用いて合成および結合した3つのT-20中間体ペプチド断片で始まる、完全長T-20ペプチドまでのT-20合成スキームをいう。上記表2に示される中間体断片グループ2〜4、7、10および11は、好ましい3つの断片グループを示す。図3および図4は、表2のペプチド中間体グループ3を利用して完全長T-20を合成する、２種の3断片アプローチを示す。このグループに関しては、アミノ酸残基36（T-20カルボキシル末端アミノ酸残基）は、断片結合プロセスの間に個々に導入されることに注意する。図3に示されるT-20合成図式の最高点は、下記第9.1に示される実施例で実証される。図4に示されるT-20合成スキームの最高点は、下記第9.2〜9.5節に示される実施例で実証される。
【００４８】
更なる実施形態では、T-20合成のための2断片アプローチに従うことができる。「2断片アプローチ」合成とは、固相および液相合成法を用いて合成および結合する2つのT-20中間体ペプチド断片で始まる、完全長T-20ペプチドまでのT-20合成スキームをいう。上記表2に示された中間体断片グループ1および16〜20は、好ましい断片グループを示す。図5は、表2のペプチド中間体グループ20を利用して、完全長T-20を合成する、2断片アプローチを示す。このグループについては、アミノ酸残基（T-20カルボキシル末端アミノ酸残基）は、断片結合プロセスの間に個々に導入されることに注意する。
【００４９】
当業者に周知の液相ペプチド合成法は、本発明のペプチド中間体断片の合成に利用できる。第8.1〜8.11節に示される実施例は、表1、2および／または3に列挙されたペプチド中間体の典型的な液相ペプチド合成を記載している。例えば、広いpH範囲を示す非シリカ装填カラムパッキングには、Tosohaus社（Montgomeryville, PA）によって販売されるものよりも高いpH値を含むものがある。
【００５０】
６．実施例：樹脂合成
本明細書第6.1〜6.3節に記載する実施例では、本明細書中に記載されたペプチドおよびペプチド中間体の固相合成と共に利用できるクロロトリチル樹脂を合成する。
【００５１】
6.1 Fmoc − Trp （ Boc ）− 2 −クロロトリチル樹脂の製造
材料： 分子量 当量 mmole グラム mL
塩化2−クロロトリチル − 1.0 25 25 −
樹脂
Fmoc−Trp(Boc)−OH − 526.60 1.5 37.5 19.7
ジイソプロピルエチル 129.25 1.7 42.5 5.5 7.4
アミン（DIEA）
ジクロロエタン（DCE） − − − − 250
ジクロロメタン（DCM） − − − − 6×250
9:1メタノール：DIEA − − − − 200
工程：
塩化2−クロロトリチル樹脂（25 g, 1当量）を、500 mLのペプチドチャンバーにローディングし、250 mLのDCMで洗浄した。ベッドの液体を排出し、10倍容量のDCE中のFmoc−Trp（Boc）−OH（1.5当量）およびDIEA（1.7当量）からなる溶液を添加した。この混合物を窒素通気によって2時間攪拌した。
【００５２】
ベッドの液体を排出し、250 mLのDCMで洗浄した。樹脂の活性部位を、200 mLの9:1のMeOH：DIEA溶液で20分間末端キャッピングした。このベッドの液体を排出し、250 mLのDCMで4回洗浄し、窒素パージによって乾燥し、34.3 gの装填された樹脂を得た。
【００５３】
樹脂からFmocアミノ酸を切断し、標準に対してアッセイすることによって、定量的HPLC分析を行った。材料のHPLCアッセイは、0.68 mmol/gで樹脂に装填されていることを示した。
【００５４】
カラム：Phenomenox Jupiter C18；300Å；5μ
流速：1 mL/分
検出：260 nm紫外線
移動相： A：0.1％TFA水溶液
B：アセトニトリル中0.1％TFA
65％ Bイソクラティック
保持時間：〜14分
6.2 Fmoc − Gln − 2 −クロロトリチル樹脂の製造
材料： 分子量 当量 mmole グラム mL
塩化2−クロロトリチル − 1.0 25 25 −
樹脂
FmocGlnOH 368.39 1.5 37.5 13.8 −
ジイソプロピルエチル 129.25 1.7 42.5 5.5 7.4
アミン（DIEA）
ジクロロエタン（DCE） − − − − 75
N,N−ジメチルホルム − − − − 200
アミド（DMF）
ジクロロメタン（DCM） − − − − 6×250
9:1メタノール：DIEA − − − − 200
工程：
75 mLのDCEおよび200 mLのDMFからなる混合物中でFmocGlnOH（1.5当量）およびDIEA（1.7当量）からなる溶液を用いて上記第6.1節に示す実施例で用いた工程を繰り返した。DMFの添加はFmocGlnOHを安定化する。反応により33.8 gの装填された樹脂を得た。0.74 mmol/gの樹脂の理論装填量を仮定し、材料を進展させた（carried forward）。
【００５５】
6.3 Fmoc − Leu − 2 −クロロトリチル樹脂の製造
材料： 分子量 当量 mmole グラム mL
塩化2−クロロトリチル − 1.0 250 250 −
樹脂
FmocLeuOH 353.42 1.5 375 132.5 −
ジイソプロピルエチル 129.25 1.7 425 55 75
アミン（DIEA）
ジクロロエタン（DCE） − − − − 2000
ジクロロメタン（DCM） − − − − 6×1500
9:1メタノール：DIEA − − − − 1500
工程：
3Lのペプチドチャンバーに樹脂をローディングし、1.5LのDCMで洗浄した。ベッドの液体を排出し、8倍容量のDCE中のFmocLeuOH（1.5当量）およびDIEA（1.7当量）からなる溶液を添加した。この混合物を、窒素通気によって2時間攪拌した。
【００５６】
ベッドの液体を排出し、1.5LのDCMで洗浄した。樹脂の活性部位を1.5Lの9:1のMeOH：DIEA溶液で30分間末端キャッピングした。このベッドの液体を排出し、1.5LのDCMで4回洗浄し、窒素パージによって乾燥して345 gの装填樹脂を得た。
【００５７】
樹脂からFmocアミノ酸を切断し、標準に対してアッセイすることによって、定量的HPLC分析を行った。材料のHPLCアッセイは、0.72 mmol/gでの樹脂の装填を示した。
【００５８】
カラム：Phenomenox Jupiter C18；300Å；5μ
流速：1 mL/分
検出：260 nmの紫外線
移動相： A：0.1％TFA水溶液
B：アセトニトリル中の0.1％TFA
65％ Bイソクラティック
保持時間：〜8分
７．実施例：ペプチドの固相合成
下記に示す、第7.1〜7.6節は、表1、2、および／または3に列挙されたペプチド中間体の固相合成の例である。
【００５９】
7.1 断片 Fmoc −アミノ酸（ 1 〜 8 ）− OH （断片 1b ）構造の製造
Fmoc−Tyr（tBu）−Thr（tBu）−Ser（tBu）−Leu−Ile−His（trt）−Ser（tBu）−Leu−OH（配列番号2）
Ｃ₉₃Ｈ₁₂₁Ｎ₁₀Ｏ₁₅
分子量1619.06
材料： 分子量 当量 mmole グラム mL
Fmoc−Leu−2−クロロ− − 1.0 15.6 20.0 −
トリチル樹脂
Fmoc−アミノ酸* − 1.5 23.4 − −
1-ヒドロキシベンゾトリ- 153.15 1.5 23.4 3.6 −
アゾール(HOBT)水和物*
O-ベンゾトリアゾール-1- 379.25 1.5 23.4 8.9 −
イル-N,N,N',N'-テトラ
メチルウロニウム ヘキサ
フルオロホスフェート
（HBTU）*
ジイソプロピルエチル 129.25 1.5 23.4 3.0 4.1
アミン（DIEA）*
N−メチル−2−ピロリジノン − − − − 150
（NMP）*
塩化メチレン（DCM）* − − − − 50
20％ピペリジン/NMP* − − − − 2×200
すすぎ用のNMP* − − − − (洗浄毎)200
DCM中1％トリフルオロ酢酸 − − − − 300
（TFA）
0.5％TFA/DCM − − − − 200
ピリジン − − − −
エチルアルコール − − − − 110
水 − − − − 200+100
*結合サイクル当たり
理論収量：25.3 g 予想収量：80〜90％
実収量：20.0 g
工程：
1Lのペプチド反応チャンバーに、20 gのFmoc−Leu−2−クロロトリチル樹脂をローディングした。窒素攪拌下で200 mL（〜10倍容量）のDCM中で約15分間樹脂を調整し、ビーズを膨潤させ、次いで液体を排出した。
【００６０】
末端アミンからのFmoc（9−フルオロエニルメチルオキシカルボニル）の除去は、NMP中ピペリジンの20％溶液200 mLで2回それぞれ10分間で達成した。次いで、樹脂を、200 mL（〜10倍容量）のNMPで5〜7回洗浄して、クロルアニル試験の陰性によって決定して、Fmoc副生成物（ジベンゾフルベンおよびそのピペリジン付加物）および残りのピペリジンを除去した。
【００６１】
一方、配列中の次のアミノ酸であるFmoc−Ser（tBu）を、カルボキシル末端で反応させるために活性化した。Fmoc保護アミノ酸（1.5当量）、HOBT（1.5当量）、およびDIEA（1.5当量）を、室温で、150 mL（〜7.5倍容量）のNMPに溶解した。この溶液を0〜5℃に冷却し、次いでHBTU（1.5当量）を添加し、5〜15分攪拌して溶解させた。活性化された酸の溶液を、液体を排出した樹脂にローディングし、50 mLのDCM（〜2.5倍容量）で洗浄した。反応物を窒素通気によって1時間攪拌した。結合の完了は、定性ニンヒドリン試験でモニターした。結合反応が完結したと判定された後、樹脂の液体を排出し、200 mL（1倍容量）のNMPで3回洗浄した。
【００６２】
それぞれ1.5当量のFmoc保護アミノ酸His（trt）、Ile、Leu、Ser（tBu）、Thr(tBu)およびTyr（tBu）を用いて、ペプチド断片の次の結合（mer）のためにサイクルを繰り返した。最終の結合反応に続いて、樹脂を200 mL（10倍容量）のNMPで4回、次いで、200 mL（10倍容量）のDCMで4回洗浄した。この樹脂を窒素パージによって乾燥して42 gの樹脂結合ペプチドを得た。
【００６３】
300 mLのDCM中1％TFAで約2分間、次いで、200 mLのDCM中0.5％TFAを用いて、このペプチドを21 gの量の樹脂から切断した。切断画分をピリジン（TFAに対して1:1の容量比）上に回収した。切断洗浄液を合わせ、減圧下に濃縮して、容量を約50 mLとし、次いで、濃縮を続けて残りのDCMを除去し、最終容量を〜250 mLにしながら、110 mLのエタノールで再構成した。生成物を200mLの無図を添加して沈殿させた。そのスラリーを室温で30分間攪拌した。この固体を減圧濾過によって回収し、約100 mLの水で洗浄した。生成物を空気乾燥して、95％のHPLC純度を有する20.0 g（79％）のFmoc−アミノ酸（1〜8）−OHを得た。
【００６４】
カラム：Phenomenox Jupiter C18
流速：1 mL/分
検出：260 nm紫外線
移動相： A：0.1％TFA水溶液
B：20分で80％Ｂ〜99％Ｂのアセトニトリル勾配中0.1％TFA
保持時間：約23分
7.2 断片 Fmoc −アミノ酸（ 9 〜 15 ）− OH （断片 5b ）構造の製造
Fmoc−Ile−Glu（tBu）−Glu（tBu）−Ser（tBu）−Gln（trt）−Asn（trt）−Gln（trt）−OH（配列番号6）
Ｃ₁₁₇Ｈ₁₂₉Ｎ₁₀Ｏ₁₈
分子量1963.39
材料： 分子量 当量 mmole グラム mL
Fmoc-Gln(trt)-2-クロロ- − 1.0 12.0 20.0 −
トリチル樹脂
Fmoc−アミノ酸* − 1.5 18.0 − −
1-ヒドロキシベンゾトリ- 153.15 1.5 18.0 2.8 −
アゾール(HOBT)水和物*
O-ベンゾトリアゾール-1- 379.25 1.5 18.0 6.8 −
イル-N,N,N',N'-テトラメチル-
ウロニウム ヘキサフルオロ-
ホスフェート（HBTU）*
ジイソプロピルエチルアミン 129.25 1.5 18.0 2.3 3.1
（DIEA）*
N-メチル-2-ピロリジノン − − − − 150
（NMP）*
塩化メチレン（DCM）* − − − − 50
20％ピペリジン/NMP* − − − − 2×200
すすぎ用のNMP* − − − − (洗浄毎)200
切断用DCM − − − − 160
酢酸（HOAc） − − − − 20
トリフルオロエタノール − − − − 20
ヘプタン − − − −250+250+100
メチル t-ブチルエーテル − − − − 100
イソプロパノール − − − − 60
水 − − − − 60+50
*結合サイクル当たり
理論収量：23.6 g 予想収量：89〜95％
実収量：21.1 g
工程：
20.0 gのFmoc−Gln（trt）−2−クロロトリチル樹脂、およびFmoc保護アミノ酸Asn（trt）、Gln（trt）、Ser（tBu）、Glu（tBu）、Glu（tBu）およびIleを用いて上記第7.1節に示される実施例で用いた工程を繰り返した。
【００６５】
最終のカップリング反応に続き、樹脂を4 X 200mL(10容)のNMP、次いで4 X 200mL(10容)のDCMで洗浄した。
【００６６】
ペプチドを200mLの8:1:1 DCM:TFE:HOAcを用いて2時間で樹脂から開裂させ、続いて2 X 100mLのDCMで洗浄した。溶出液を合わせて真空下で容量が約100mLになるまで濃縮し、次いで250mLのヘプタンで再構成する一方で、最終容量が約250mLになるまで濃縮を続けて残存しているDCMを除去した。形成した二相混合物からヘプタン層を分離した。250mLのヘプタンおよび100mLのMTBEを添加して生成物を沈殿させ、次いで室温で一晩粉砕すると所望の粘稠度の物質が得られた。固体を真空濾過によって回収して約100mLのヘプタンで洗浄した。生成物を再び後処理して残存している酢酸を除去した。濾過した固体を50℃で60mLのイソプロパノールに溶かした。溶液を氷浴中で0〜5℃に冷やし、次いで60mLの水を迅速な滴下速度で加えた。生成スラリーを氷浴中で約1時間攪拌しながら粉砕した。固体を真空濾過によって単離して約50mLの水で洗浄した。生成物を風乾すると95%HPLC純度のFmoc-AA(9-15)-OHが21.1g(90%)得られた。
【００６７】
カラム：Phenomenox Jupiter C18
流速：1mL/分
検出：260nmの紫外線
移動相：A: 0.1% 水性TFA
B:アセトニトリル中の0.1% TFA
20分間に80% B〜99% Bの勾配
保持時間：約23分
7.3 断片 Fmoc-AA(1-16)-OH( 断片 3d) の調製
構造：
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OH (配列番号４)

理論収量：48.9g 期待収率：85-90%
操作：
上記第7.1節で提示した実施例において用いられた操作を32.5gのFmoc-Gln-2-クロロトリチル樹脂および必要なFmoc保護アミノ酸を用いて繰り返した。上記の原料の節で示されたものとは若干異なる容量の溶媒を用いることを除けば、上記第6.1節で提示した実施例に記載された通りに反応を行った。
【００６８】
最終のカップリング反応に続き、樹脂を4 X 250mL(8容)のNMP、次いで4 X 250mL(8容)のDCMで洗浄した。樹脂を窒素パージ下で乾燥させると97.4gの結合ペプチドが得られた。
【００６９】
17.7gのスケールで、樹脂に結合したペプチドを2 X 190mLのDCM中の1% TFAを用いて1〜2分で樹脂から開裂させ、続いて1 X 120mLのDCMで洗浄した。開裂画分をピリジン（TFAに対して1:1の容量比）に回収した。画分および洗液を合わせて真空下で容量が約50mLになるまで濃縮し、次いで200mLのメタノールで再構成した。最終容量が約50mLになるまで濃縮を続けて残存しているDCMを除去した。250mLの水を添加して生成物を沈殿させ、室温で約30分間攪拌した。固体を真空濾過によって回収して約50mLの水で洗浄した。生成物を風乾すると12.8g(84%)が得られた。生成物を再び後処理してピリジニウム塩を除去した。濾過した固体を室温で150mLのメタノールに溶かした。室温で200mLの水を添加すると生成物が沈殿した。生成物を真空濾過によって単離して約50mLの水で洗浄した。物質を風乾すると12.8g(84%)のFmoc-AA(1-16)-OHが得られた。
【００７０】
カラム：Phenomenox Jupiter C18
流速：1mL/分
検出：260nmの紫外線
移動相：A: 0.1% 水性TFA
B:アセトニトリル中の0.1% TFA
20分間に75% B〜99% Bの勾配
保持時間：約25分
7.4 断片 Ac-AA(1-16)-OH( 断片 3c) の調製
構造：
Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OH (配列番号４)

理論収量：48.9g 期待収率：85-90%
操作：
上記第7.1節で提示した実施例において用いられた操作を32.5gのFmoc-Gln-2-クロロトリチル樹脂および必要なFmoc保護アミノ酸、ならびに上記の原料の節で示された溶媒容量を用いて繰り返した。
【００７１】
最終のカップリング反応に続き、樹脂を4 X 250mL(8容)のNMP、次いで4 X 250mL(8容)のDCMで洗浄した。樹脂を窒素パージ下で乾燥させると97.4gの結合ペプチドが得られた。
【００７２】
10gのスケールで、樹脂に結合したペプチドを100mLの3:1 NMP:DCM中で30分間無水酢酸およびピリジン（各5等量）でアセチル化し、次いで2 X 25mLのDCMで洗浄した。ペプチドを3 X 50mLのDCM中の1% TFAを用いて樹脂から開裂させ、続いて２ X 50mLのDCMで洗浄した。開裂画分をピリジン（TFAに対して1:1の容量比）中に回収した。画分および洗液を合わせて真空下で容量が約100mLになるまで濃縮し、次いで3 X 50mLのヘプタンを少量ずつ加えて再構成する一方で、最終容量が約50mLになるまで濃縮を続けて残存しているDCMを除去した。生成物は最初はややべとつく粘稠度で沈殿したが、0〜5℃の氷浴中で約30分間攪拌しながら粉砕すると濾過可能な固体となった。固体を真空濾過によって回収して約150mLのヘプタンで洗浄した。生成物を再び後処理してピリジニウム塩を除去した。濾過した固体を室温で50mLのメタノールに溶かした。溶液を氷浴中で0〜5℃に冷やし、次いで50mLの水を迅速な滴下速度で加えた。生成物は最初は粘稠な固体として沈殿し、それを氷浴中で約1時間攪拌しながら粉砕すると濾過可能な粘稠度となった。生成物を真空濾過によって単離して約25mLの水で洗浄した。生成物を風乾すると7.0g(90%)のAcAA(1-16)-OHが得られた。続いて生成物を前述のように再び後処理すると96% HPLC純度の物質が6.2g(回収率89%)得られた。
【００７３】
カラム：Zorbax LP C8, 100Å, 20μ
流速：1mL/分
検出：220nmの紫外線
移動相：A: 0.1% 水性TFA
B: 1:1 ACN:IPA中の0.05%TFA
20分間に80% B〜99% Bの勾配
保持時間：約15分
7.5 断片 Fmoc-AA(17-26)-OH( 断片 10b) の調製
構造：
Fmoc-Glu(tBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(tBu)-Gln(trt)-Glu(tBu)-Leu-Leu-Glu(tBu)-Leu-OH (配列番号11)

理論収量：44.4g 期待収率：90-105%
実際の収率：46.9(105%)
操作：
上記第7.1節で提示した実施例において用いられた操作を25.0gのFmoc-Leu-2-クロロトリチル樹脂、必要なFmoc保護アミノ酸、および上記の原料の節で示された溶媒容量を用いて繰り返した。
【００７４】
最終のカップリング反応に続き、樹脂を4 X 250mL(10容)のNMP、次いで4 X 250mL(10容)のDCMで洗浄した。
【００７５】
ペプチドを3 X 400mL（約15容）のDCM中の1% TFAを用いて樹脂から開裂させ、次いで1 X 200mL（7.5容）のDCMで洗浄した。開裂画分をピリジン（TFAに対して1:1の容量比）中に回収し、次いで画分および洗液について生成物含量を分析した。生成物を含む画分を合わせて真空下で容量が約100mLになるまで濃縮し、次いで300mLのエタノールで再構成した。最終容量が約250mLになるまで濃縮を続けて残存しているDCMを除去した。攪拌した溶液に300mLの水を加えて生成物を沈殿させた。固体を真空濾過によって回収して約50mLの水で洗浄した。生成物を風乾すると97% HPLC純度のFmoc-AA(17-26)-OHが46.4g(105%)得られた。
【００７６】
カラム：Phenomenox Jupiter C18
流速：1mL/分
検出：260nmの紫外線
移動相：A: 0.1% 水性TFA
B:アセトニトリル中の0.1% TFA
20分間に75% B〜99% Bの勾配
保持時間：約25分
7.6 断片 Fmoc-AA(27-35)-OH( 断片 16b) の調製
構造：
Fmoc-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-OH (配列番号17)

理論収量：48.9g 期待収率：85-90%
操作：
上記第7.1節で提示した実施例において用いられた操作を33.0gのFmoc-Trp(Boc)-2-クロロトリチル樹脂、必要なFmoc保護アミノ酸、および上記の原料の節で示された物質を用いて繰り返した。
【００７７】
最終のカップリング反応に続き、樹脂を4 X 250mL(7.5容)のNMP、次いで4 X 250mL(7.5容)のDCMで洗浄した。
【００７８】
ペプチドを8:1:1 DCM:TFE:HOAcの300mL（約10容）の溶液で2時間処理することによって樹脂から開裂させた。樹脂の水分を切り、2 X 250mLのDCMで洗浄した。開裂溶液および洗液を合わせて約50mLの容量になるまで濃縮し、次いで250mLのエタノールで再構成した。溶液を氷浴中で攪拌しながら0〜5℃に冷やした。攪拌した溶液に125mLの水を加えて生成物を沈殿させた。固体を真空濾過によって回収して約50mLの水で洗浄した。生成物を風乾すると95% HPLC純度のFmoc-AA(27-35)-OHが32.0g(65.4%)得られた。
【００７９】
樹脂を2 X 250mLのDCM中のTFAの1%溶液で処理し、続いて100mLのDCMで洗浄した。開裂画分をTFAと1:1の容量比であるピリジン中に回収した。溶出液および洗液を合わせて容量が約50mLになるまで濃縮した。この溶液に100mLのエタノール、次いで150mLの水を加えた。生成スラリーを真空濾過すると10.7g(21.9%)(95% HPLC純度)の二次収量が得られ、合わせた収率は87.3%となった。1% TFA/DCM開裂が、より高い効率およびより低い容量であるために好ましい。
【００８０】
カラム：Phenomenox Jupiter C5, 300Å, 5μ
流速：0.75mL/分
検出：260nmの紫外線
移動相：A: 0.05% 水性TFA
B: 1:1 IPA:MeOH中の0.1%TFA
10分間に70% B〜97% Bの勾配
保持時間：約25分
8. 実施例：ペプチド断片の液相合成
下記の第8.1−8.11節において提示するのは表1、2、および／または3に挙げたペプチド中間体の液相合成の例である。
【００８１】
8.1 グルタミンのパラニトロベンジルエステル (OPNB) の Fmoc-AA9-15OH へのカップリングによる断片 Fmoc-AA9-16OPNB の調製
構造：
Fmoc-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (配列番号7)

理論収量：21.5g 期待収率：90-105%
操作：
FmocAA9-15OH（上記第7.2節で合成）、HBrGlnOPNB、HOATおよびEtPr₂Nを磁気攪拌棒を備えた1Lの丸底フラスコ中で混合してNMP(200mL)を添加した。得られた溶液を窒素雰囲気下に置き、攪拌しながら0〜5℃に冷却した。冷却した溶液にHBTUを加えた。溶液を0〜5℃で15分間攪拌し、氷浴を外して攪拌を2.5時間続けた（注1）。
【００８２】
反応混合物を0〜5℃に冷却し、0.5N 水性HCl(250mL)を添加して保護されたペプチドを沈殿させた。固体を真空濾過によって回収し、濾過フラスコ中で乾燥させると24gの粗FmocAA9-16OPNBが得られた。この固体を酢酸エチル(250mL)に溶かし、硫酸マグネシウム(10g)で乾燥させ、濾過して容量が100mLになるまで濃縮した。溶液を0〜5℃に冷却し、ヘキサン(250mL)を添加してペプチドを沈殿させた。固体を真空濾過によって回収して乾燥させると21.5gのFmocAA9-16OPNBが100%の収率および91-94% HPLC純度で得られた（注2）。
【００８３】
注：
1. 薄層クロマトグラフィー(TLC)による工程内管理(IPC)。
【００８４】
90/10 クロロホルム／エタノール
紫外線、ヨウ素検出
Rt FmocAA9-15OH 0.46
Rt FmocAA9-16OPNB 0.57
2. Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300Å
0.75mL/分, 260nm
A H₂O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10分以上で70-97%B、8分で97%B
保持時間：13.3分
8.2 断片 HCl HAA9-16OPNB の調製
構造：
HCl H-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-
Gln(trt)-Gln-OPNB (配列番号7)

理論収量：19.2g 期待収率：85-105%
操作：
磁気攪拌棒を備えた1Lの丸底フラスコにFmocAA9-16OPNB（上記第8.2節で合成）および20:1 テトラヒドロフラン／ピペリジンを仕込んだ。得られた溶液を窒素雰囲気下室温で60分間攪拌した（注1）。ヘキサン(350mL)を添加してペプチドを沈殿させた。溶媒を粘性のある固体からデカントした。室温で18時間固体をMTBE(200mL)を用いて粉砕した。この固体を真空濾過によって回収して乾燥させると18.9gのHAA9-16OPNBが得られた（注2）。
【００８５】
この固体をメタノール(150mL)に溶かし、攪拌しながら0〜5℃に冷却した。0.5N 水性塩酸(100mL)を添加してペプチドを沈殿させた。固体を真空濾過によって回収し、水(50mL)、次いで2-プロパノール(50mL)で洗浄して乾燥させると17.7gのHCl HAA9-16OPNBが92%の収率および92A% HPLC純度で得られた（注3）。
【００８６】
注：
1. 工程内管理, HPLC
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300Å
0.75mL/分, 260nm
A H₂O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10分以上で70-97%B、8分で97%B
保持時間：FmocAA9-16OPNB, 13.3分; HAA9-16OPNB, 10.7分
2. この時点で単離されたHAA9-16OPNBは微量のピペリジンおよびベン
ジルフルベンピペリジン付加物を含んでいる。両方をRAA1-8OHとカ
ップリングする前に除去する。
【００８７】
3. Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300Å
0.75mL/分, 260nm
A H₂O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10分以上で80-100%B、5分で100%B
保持時間：HAA9-16OPNB, 7.2分
TLC条件：
90/10 ジクロロメタン／エタノール
紫外線、ヨウ素検出
Rf: HAA9-16OPNB, 0.64
8.3 断片 AcAA1-8OH と HAA9-16OPMB との液相カップリングによる断片 AcAA1-16OPNB の調製
構造：
Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (配列番号４)

理論収量：0.38 期待収率：85-105%
操作：
磁気攪拌棒を備えた25mLの丸底フラスコにAA1-8OH（上記第7.1節で合成）、HCl HAA9-16OPNB（上記第8.2節で合成）およびHOATを仕込んだ。固体をEtPr₂Nを含む9:1 DMF:DMSO(5mL)に溶かし、次いで窒素雰囲気下0〜5℃に冷却した（注1）。冷却した溶液にHBTUを加えた。反応混合物を0〜5℃で15分間攪拌し、次いで室温まで温めてさらに60分間攪拌した（注2）。水(7mL)の添加によってペプチドを溶液から沈殿させた。固体を真空濾過によって回収し、水(10mL)で洗浄して乾燥させると0.36gの粗AcAA1-16OPNBが得られた。この固体を室温で1.5時間MTBE(3.5mL)を用いて粉砕し、真空濾過によって回収して乾燥させると0.335gのAcAA1-16OPNBが88%の収率および82A% HPLC純度で得られた（注3）。
【００８８】
注：
1. 0〜5℃に冷却してHBTUを添加する前にすべての固体を溶液にする
ことが重要である。
【００８９】
2. 工程内管理, TLC, HPLC
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300Å
0.75mL/分, 260nm
A H₂O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10分以上で80-100%B、5分で100%B.
保持時間：HAA9-16OPNB, 7.2分(Ac1-8OHは260nmに吸光度をもたな
い).
保持時間：AcAA1-16OPNB, 12.45
TLC条件：
90/10 クロロホルム／エタノール
紫外線、ヨウ素検出
Rf: HAA9-16OPNB, 0.64
Rf: Ac1-8OH, 0.35
Rf: Ac1-16OH, 0.48
3. Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300Å
0.75mL/分, 260nm
A H₂O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10分以上で70-97%B、8分で97%B
保持時間：Ac1-16OPNB, 16.4.
8.4 断片 FmocAA1-8OH と HCl HAA9-16OPNB との液相カップリングによる断片 FmocAA1-16OPNB の調製
構造：
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (配列番号４)

理論収量：28.3g 期待収率：85-100%
操作：
磁気攪拌棒を備えた1Lの丸底フラスコにFmocAA1-8OH（上記第7.1節で合成）、HCl HAA9-16OPNB（上記第8.2節で合成）、HOATおよびDMF(250mL)を仕込んだ。溶液にEtPr₂Nを添加した。この溶液を0〜5℃に冷却し、HBTUを加えた。反応混合物を0〜5℃で15分間攪拌し、次いで室温まで温めてさらに70分間攪拌した（注1）。反応混合物を0〜5℃に冷却し、10% 塩化ナトリウム／水(200mL)を添加してペプチドを沈殿させた。固体を真空濾過によって回収し、水(50mL)で洗浄して乾燥させると27gの粗FmocAA1-16OPNBが得られた。固体をメタノール(200mL)に溶かして、攪拌した塩化ナトリウムの水溶液(10% wt/vol, 300mL)に加えた。この固体を真空濾過によって回収し、水(50mL)で洗浄して乾燥させると26gのFmocAA1-16OPNBが92%の収率およびHPLCでは90A%純度で得られた（注1）。
【００９０】
注：
1. 工程内管理, HPLC
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300Å
0.75mL/分, 260nm
A H₂O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10分以上で80-100%B、5分で100%B.
保持時間：HAA9-16OPNB, 7.2分, FmocAA1-8OH, 7.9分
保持時間：FmocAA1-16OPNB, 14.5分
8.5 断片 H-AA1-16OPNB の調製
構造：
H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (配列番号４)

理論収量：0.94g 期待収率：90-105%
操作：
磁気攪拌棒を備えた50mLの丸底フラスコにFmocAA1-16OPNB（上記第8.4節で合成）、ジクロロメタン(11.4mL)およびピペリジン(0.6mL)を仕込んだ。溶液を窒素雰囲気下、室温で90分間攪拌した（注1）。ヘキサン(45mL)を反応混合物に添加し、溶媒の容量を真空蒸留によって25mLに減らした。得られた固体を真空濾過によって回収し、乾燥させると0.96gのHAA1-16OPNBが102%の収率で得られた。この固体のHPLC分析によって72A%のHAA1-16OPNBおよび18A%のフルベンおよびピペリジン−フルベン付加物が示された。
【００９１】
注：
1. Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300Å
0.8mL/分, 260nm
A H₂O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10分以上で80-100%B、5分で100%B.
保持時間：FmocAA1-16OPNB, 14.1分
保持時間：HAA1-16OPNB, 11.6分
保持時間：フルベンおよびピペリジン−フルベン付加物, 5.5分および4.8分。
【００９２】
8.6 HAA1-16OPNB の N 末端のアセチル化による断片 Ac-AA1-16OPNB の調製
構造：
Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (配列番号４)

理論収量：0.96g 期待収率：80-100%
操作：
磁気攪拌棒を備えた50mLの丸底フラスコにHAA1-16OPNB（上記第8.5節で合成）、DMF(10mL)、無水酢酸およびピリジンを仕込んだ。反応混合物を窒素雰囲気下、室温で60分間攪拌した（注1）。水(20mL)を添加してペプチドを沈殿させた。固体を真空濾過によって回収し、水(10mL)で洗浄して乾燥させると0.87gのAcAA1-16OPNBが得られた。残存しているフルベンおよびピペリジン−フルベン付加物を除去するために、この固体を室温で4.5時間1:1 MTBE/ヘキサン(20mL)を用いて粉砕した。固体を真空濾過によって回収して乾燥させると0.82gのAcAA1-16OPNBが85%の収率およびHPLCでは90A%以上の純度で得られた（注1）。
【００９３】
注：
1. 工程内管理, HPLC
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300Å
0.8mL/分, 260nm
A H₂O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10分以上で80-100%B、15分で100%B.
保持時間：HAA1-16OPNB, 11.6分
保持時間：AcAA1-16OPNB, 12.1分
TLC, ジクロロメタン中の10%エタノール
紫外線、ヨウ素検出
Rf: AcAA1-16OPNB, 0.69
8.7 His(trt) の存在下で AcAA1-16OPNB からパラニトロベンジル保護基を選択的に除去することによる断片 AcAA1-16OH の調製
構造：
Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OH (配列番号４)

理論収量：0.76g 期待収率：70〜85%
操作：
磁気攪拌棒を備えた25mLの丸底フラスコにAcAA1-16OPNB（上記の第8.6節で合成）およびDMF(10mL)を仕込んだ。この溶液にギ酸アンモニウム水溶液(0.5mL)、次いで湿らせたパラジウムカーボン(Degussa, 10%, 50%水) を添加した。スラリーを窒素雰囲気下、室温で120分間攪拌した（注1）。このスラリーをセライトの密な充填層で濾過し、90mLの水に取った。濾過ケーキをDMF(5mL)で洗浄した。この水性懸濁液を酢酸エチル(100mL)で洗浄した。次いで酢酸エチルを容量が20mLになるまで濃縮した（注意2）。ヘキサン(40mL)を添加して沈殿を完了させ、溶媒を固体からデカンテーションした。固体をメタノール(10mL)に溶かし、4:1の 水／塩化ナトリウム飽和水溶液(25mL)を添加してペプチドを沈殿させた。固体を減圧濾過によって回収し、水(10mL)で洗浄して乾燥させると0.62gのAcAA1-16OHが得られた。この固体を室温で15時間50% MTBE/ヘキサン(8mL)とともに粉砕し、回収して乾燥させると0.59gのAcAA1-16OHが77%の収率およびHPLCでは90A%の純度で得られた（注3）。
【００９４】
注：
1. 工程内管理, TLC
80/20 ジクロロメタン／エタノール
紫外線、ヨウ素検出
Rf: AcAA1-16OPNB, 0.90
Rf: Ac1-16OH, 69
2. AcAA1-16OHは溶媒容量を減じるにつれ沈殿し始める。
【００９５】
3. Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300オームストロング
0.8mL/分, 260nm
A H₂O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10分以上で80〜100%B、100%Bで5分間
保持時間：AcAA1-16OH, 10.73分
8.8 FmocAA27-35OH と HPheNH ₂ との液相カップリングによる断片 FmocAA27-36NH ₂ の調製
構造：
Fmoc-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH₂ (配列番号18)

理論収量：42.8g 期待収率：90〜105%
操作：
磁気攪拌棒を備えた2Lの丸底フラスコにFmocAA27-35OH（上記の第7.6節で合成）、HOAT、HpheNH₂およびDMF(500mL)を仕込んだ。EtPr₂Nを添加して溶液を0〜5℃に冷却し、次いでHBTUを添加した。反応混合物を0〜5℃で15分間攪拌し、次いで室温まで温めてさらに70分間攪拌した（注1）。溶液を0〜5℃に冷却し、水(500mL)を添加してペプチドを沈殿させた。固体を減圧濾過によって回収し、水(100mL)で洗浄して乾燥させると43gのFmocAA27-36NH₂が100%の収率およびHPLCでは93A%の純度で得られた（注2）。
【００９６】
注：
1. 工程内管理, TLC
88/12 ジクロロメタン／メタノール
紫外線、ヨウ素検出
Rf: FmocAA27-35OH, 0.49
Rf: FmocAA27-36NH₂, 0.63
2. Phenomenox Jupiter, C18, 5μ, 300オームストロング
1.0mL/分, 260nm
A H₂O/0.1% TFA
B ACN
20分以上で75〜99%B、99%Bで5分間
保持時間：29.4分
8.9 断片 H-AA(27-36)-NH ₂ の調製
構造：
H-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-NH₂ (配列番号17)

理論収量：19.6g 期待収率：85〜95%
操作：
磁気攪拌棒および窒素ブランケットを備えた250mLの丸底フラスコに上記の第8.8節で合成したFmoc断片、塩化メチレン(約5容)、およびピペリジンを仕込んだ。溶液が得られ、室温で1.5時間攪拌した（注1）。
【００９７】
この溶液を2 X 100mLの水で洗浄した。層が分離し、有機層を減圧下で元の容量の約2分の1になるまで濃縮した。MTBEをわけて(2 X 50mL)加えつつ、濃縮を続け、重沈殿点までおよび最終ポット容量が約150mLになるまでDCMを除去した。
【００９８】
生成スラリーを攪拌し、0〜5℃の氷浴中で約1時間冷却した。固体を減圧濾過によって単離し、2 X 15mLのMTBEで洗浄した。生成物を空気乾燥させると95% HPLC純度のH-AA(27-36)NH₂が17.6g（89.6%）得られた（注2）。
【００９９】
注：
1) 反応の完了はHPLCによってモニターした。
【０１００】
カラム：Phenomenox Jupiter, C18; 300オームストロング; 5μ
流速：1mL/分
検出：260nmの紫外線
移動相：A: 0.1% TFA水溶液
B: アセトニトリル中の0.1% TFA
20分間で75%B〜99%Bの勾配
保持時間：約18分
2) Fmoc副生成物であるジベンゾフルベンおよびそのピペリジン付加物は双方とも後処理において効果的に除去される。しかしながら、この物質を先へ進める前に使用テストを行わねばならない。物質が使用テストを通らなければ、DCM(5容)に固体を溶かし、次いで前述の工程を続けることにより後処理操作を繰り返す。
【０１０１】
8.10 FmocAA17-26OH と HAA27-36NH ₂ との液相カップリングによる断片 FmocAA17-36NH ₂ の調製
構造：
Fmoc-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH₂ (配列番号12)

理論収量：41.5g 期待収率：80〜85%
操作：
磁気攪拌棒を備えた2Lの丸底フラスコにFmocAA17-26OH（上記の第7.5節で合成）、HAA27-36NH₂（上記の第8.9節で合成）、HOATおよびDMF(４00mL)を仕込んだ。EtPr₂Nを添加し、攪拌した溶液を窒素雰囲気下0〜5℃に冷却してHBTUを添加した。反応混合物を0〜5℃で15分間攪拌し、次いで室温まで温めてさらに2.5時間攪拌した（注1）。水(500mL)を反応混合物に添加してペプチドを沈殿させた（注2）。得られたスラリーを45分間攪拌し、固体を減圧濾過によって回収し、水(100mL)で洗浄して乾燥させた。固体を磁気攪拌棒を備えた2Lの丸底フラスコに戻し、60℃の2-プロパノール(1.1L)を添加した。スラリーを室温まで冷ましながら窒素雰囲気下で攪拌した（一晩）。固体を減圧濾過によって回収して乾燥させると37.5gのFmocAA17-36NH₂が90%の収率およびHPLCでは95.5A%の純度で得られた（注1）。
【０１０２】
注：
1. 工程内管理, HPLC
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300オームストロング
0.75mL/分, 260nm
A H₂O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10分以上で80〜100%B、100%Bで25分間
保持時間：FmocAA17-26OH, 8.2分, HAA26-36 NH₂, 8.4分
保持時間：FmocAA17-36NH₂, 13.3分
2. 水を添加するときに反応混合物を38℃に温めた。
【０１０３】
8.11 断片 H-AA(17-36)-NH ₂ の調製
構造：
H-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-NH₂ (配列番号19)

理論収量：21.6g 期待収率：95〜100%
操作：
磁気攪拌棒および窒素ブランケットを備えた250mLの丸底フラスコに上記の第8.10節で合成したFmoc断片、THF(約7.5容)、および5N NaOH(約2.5容)を仕込んだ。2相溶液が得られ、室温で10〜15分間攪拌した（注1）。
【０１０４】
層を分離し、有機相を1N HClでpH 2〜3に調整した。次いで溶液を2 X 55mL(2.5容)の飽和食塩水で洗浄した（注2）。層を分離し、有機層を減圧下、15〜20℃で元の容量の約２分の１になるまで濃縮した。ヘプタンをわけて(3 X 25mL)加えつつ、濃縮を続け、重沈殿点までおよび最終ポット容量が約100mLになるまでTHFを除去した(注2)。
【０１０５】
生成スラリーを室温で約2時間攪拌した。固体を減圧濾過によって単離し、約50mLのヘプタンで洗浄した。生成物を空気乾燥させると21.0g(97.5%)H-AA(17-36)NH₂が得られた。
【０１０６】
残存しているジベンゾフルベン副生成物を除去するために再度後処理を行ってもよい。生成物を室温で3時間200mLのヘプタン中でスラリー化した。物質を濾過し、約50mLのヘプタンで洗浄して空気乾燥させると95%以上のHPLC純度の生成物が20.8g（96.6%）得られた。
【０１０７】
注：
1) 反応の完了はHPLCによってモニターした。
【０１０８】
カラム：Zorbax LP C8; 1 OOオームストロング; 2011 流速：1mL/分
検出：260nmの紫外線
移動相：A: 0.1% TFA水溶液
B: 1:1 ACN:IPA中の0.05% TFA
20分間で80%B〜99%Bの勾配
保持時間：約18分
2) 固体は最初は、ろう状ゴムとして沈殿するが、それは依然として攪拌可能であり、さらに濃縮しながら粉砕すると濾過可能な固体となる。
【０１０９】
9. 実施例：全長 T-20 ペプチドの合成
本明細書の下記の第9.1〜9.5節において提示されているのは、全長T-20ペプチドを産生するために中間体ペプチド断片を利用する実施例である。
【０１１０】
この節において提示された実施例は中間体ペプチド断片から全長T-20ペプチドを産生する固相および液相の首尾よくいったカップリング合成技術を実証する。
【０１１１】
9.1 AcAA1-16OH と HAA17-36NH ₂ との液相カップリングによる断片 AcAA1-36NH ₂ の調製
ここに記載した合成経路は図1および3に図示したT-20の4つの断片からのアプローチの最終段階を表している。AcAA1-16OHが固相技術によって合成される場合には、図1のアプローチに従い、AcAA1-16OHが液相技術によって合成される場合には、図3のアプローチに従う。ここで合成されたT-20全長ペプチドはそのアミノ末端にアセチル基修飾（すなわち、「X」）およびそのカルボキシル末端にアミド基修飾（すなわち、「Z」）をもつ配列番号1のアミノ酸配列を有する。
【０１１２】
構造：
AC-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH₂ (配列番号1)

理論収量：1.77g 期待収率：85〜100%
操作：
磁気攪拌棒を備えた100mLの丸底フラスコにAcAA1-16OH（固相技術により上記の第7.4節で、または液相技術により上記の第8.7節のいずれかで合成）、HOAT、DMF(20mL)を仕込み、続いてEtPr₂N(0.074mL)を仕込んだ。溶液を窒素雰囲気下で0〜5℃に冷却してHBTUを添加した。溶液を0〜5℃で15分間攪拌し、HCl HAA17-36NH₂（上記の第8.11節で合成）を添加し、続いてさらに0.041mLのEtPr₂Nを添加した。冷却浴を外し、反応混合物を2時間攪拌した（注1）。ペプチドを沈殿させるために、水(25mL)および飽和食塩水(5mL)を添加した。固体を減圧濾過によって回収し、水(10mL)で洗浄して乾燥させると1.74gの粗製AcAA1-36NH₂が得られた（注2）。この固体を室温で2.5時間50% MTBE/ヘキサンとともに粉砕し、減圧濾過によって回収して乾燥させると96%の収率およびHPLCでは92A%の純度で1.70gが得られた。
【０１１３】
注：
1)工程内管理, HPLC
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300オームストロング
0.8mL/分, 260nm
A H₂O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10分以上で80〜100%B、100%Bで15分間
保持時間：AcAA1-16OH, 11.8分
保持時間：HCl HAA17-36 NH₂, 12.7分
保持時間：AcAA1-36NH₂, 22.9分
2) 脱水によって非常に微細な沈殿が生成する。濾過を2回行うことが必要かもしれない。
【０１１４】
9.2 FmocAA1-16OH と HAA17-36NH ₂ との液相カップリングによる断片 FmocAA1-36NH ₂ (T-20) の調製
この節において提示された実施例は中間体ペプチド断片からT-20ペプチドを産生する固相および液相の首尾よくいったカップリング合成技術を実証する。特に、ここに記載した合成経路は図4に図示したT-20の3つの断片からのアプローチを表しており、その図の中でFmocAA1-36NH₂が合成されるまでを示している。
【０１１５】
構造：
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH₂ (配列番号1)

理論収量：0.91g 期待収率：85〜100%
操作：
磁気攪拌棒を備えた25mLの丸底フラスコにFmocAA1-16OH（上記の第7.3節で合成）、HCl HAA17-36NH₂（上記の第8.11節で合成）、HOAT、DMF(10mL)を仕込み、EtPr₂Nを添加した。溶液を窒素雰囲気下で0〜5℃に冷却してHBTUを添加した。反応混合物を0〜5℃で15分間攪拌し、次いで室温まで温めて1.5時間攪拌した（注1）。ペプチドを沈殿させるために水を添加し、固体を減圧濾過によって回収して乾燥させた。固体を室温で15時間、2プロパノール(14mL)とともに粉砕し、次いで水(3mL)を添加して溶液から所望の生成物を得た。固体を減圧濾過によって回収して乾燥させると0.80gのFmocAA1-36NH₂が88%の収率および85A%のHPLC純度で得られた。
【０１１６】
注：
1) 工程内管理, HPLC
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300オームストロング
0.8mL/分, 260nm
A H₂O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10分以上で80〜100%B、100%Bで15分間
保持時間：FmocAA1-16OH, 11.4分
保持時間：HCl HAA17-36 NH₂, 12.分
保持時間：FmocAA1-36NH₂, 20.4分
TLC, 9/1 ジクロロメタン／エタノール
紫外線、ヨウ素検出
Rft: FmocAA1-36NH₂, 0.71
9.3 断片 HAA1-36NH ₂ (T-20)の調製
この節において提示された実施例は中間体ペプチド断片からT-20ペプチドを産生するための固相および液相の首尾よくいったカップリング合成技術を実証する。特に、ここに記載した合成経路は図4に図示したT-20の3つの断片からのアプローチを表しており、その図の中でH-AA1-36NH₂が合成されるまでを示している。
【０１１７】
構造：
H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH₂ (配列番号1)

理論収量：0.77g 期待収率：85〜95%
操作：
磁気攪拌棒を備えた25mLの丸底フラスコにFmocAA1-36NH₂（上記の第9.2節で合成）、DMF(9.5mL)およびピペリジン(0.5mL)を仕込んだ。溶液を窒素雰囲気下、室温で2時間攪拌した（注1、2）。水(20mL)および塩化ナトリウム飽和水溶液(5mL)を添加して保護されたペプチドを沈殿させた。固体を減圧濾過によって回収して乾燥させるとフルベンおよびピペリジン−フルベン付加物が混在した0.77gのHAA1-36NH₂が得られた。固体を室温で15時間50% MTBE/ヘキサンとともに粉砕してフルベンおよびピペリジン−フルベン付加物を除去した。固体を減圧濾過によって回収して乾燥させると0.73gのHAA1-36NH₂が95%の収率およびHPLCでは90A%の純度で得られた。
【０１１８】
注：
1) 工程内管理, HPLC
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300オームストロング
0.8mL/分, 260nm
A H₂O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10分以上で80〜100%B、100%Bで15分間
保持時間：FmocAA1-36OH, 20.4分
保持時間：HCl HAA1-36 NH₂, 19.9分
保持時間：フルベンおよびピペリジン−フルベン付加物, 5分
TLC, 9/1 ジクロロメタン／エタノール
紫外線、ヨウ素検出
Rt: FmocAA1-36NH₂, 0.71
2） 生成物および出発原料はTLCまたは逆相HPLCでは十分に分離しない。生成物の形成の後、フルベンおよびピペリジン−フルベン付加物を測定する。
【０１１９】
9.4 HAA1-36NH ₂ の N 末端アセチル化による断片 AcAA1-36NH ₂ (T-20)の調製
この節において提示された実施例は中間体ペプチド断片からT-20ペプチドを産生する固相および液相の首尾よくいったカップリング合成技術を実証する。特に、ここに記載した合成経路は図4に図示したT-20の3つの断片からのアプローチを表しており、その図の中でAc-AA1-36NH₂が合成されるまでを示している。
【０１２０】
構造：
AC-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH₂ (配列番号1)

理論収量：0.71g 期待収率：85〜100%
操作：
磁気攪拌棒を備えた25mLの丸底フラスコにHAA1-36NH₂（上記の第9.3節で合成）、DMF(10mL)およびピリジン(0.046mL)および無水酢酸(0.027mL)を仕込んだ（注1）。溶液を窒素雰囲気下、室温で4時間攪拌した（注2）。水(7.5mL)および塩化ナトリウム飽和水溶液(7.5mL)を添加して保護されたペプチドを沈殿させた。固体を減圧濾過によって回収し、水(10mL)で洗浄して乾燥させると0.65gのAcAA1-36NH₂が91%の収率およびHPLCでは90A%の純度で得られた（注3）。
【０１２１】
注：
1) ジクロロメタンをこの反応の溶媒として使用してもよい。
【０１２２】
2) 工程内管理, HPLC
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300オームストロング
0.8mL/分, 260nm
A H₂O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10分以上で80〜100%B、100%Bで15分間
保持時間：HAA1-36OH, 23.3分
保持時間：AcAA1-36 NH₂, 22.7分
3） 生成物および出発原料はTLCまたは逆相HPLCでは十分に分離しない。
9.5 AcAA1-36NH ₂ の側鎖脱保護による T-20 側の調製
この節において提示された実施例は中間体ペプチド断片からT-20ペプチドを産生する固相および液相の首尾よくいったカップリング合成技術を実証する。特に、ここに記載した合成経路は図4に示したT-20の3つの断片からのアプローチを表している。
【０１２３】
構造：
Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH₂
(配列番号1)

理論収量：157mg 期待収率：25〜50%
操作：
90：5：5（v/v/wt %）トリフルオロ酢酸／水／ジチオスレイトール溶液から窒素を脱気して0〜5℃に冷却した。冷却した溶液にAcAA1-36NH₂（上記の第9.4節で合成）を添加した。固体が溶けるまで（約5分間）スラリーを0〜5℃で攪拌し、次いで室温まで温めて2.5時間攪拌した。溶液を0〜5℃のMTBE(70mL)に添加してペプチドを沈殿させた。スラリーを遠心分離機にて2200rpmで5分間回転させ、MTBEを固体からデカンテーションした。固体を再びMTBE(50mL)に懸濁させ、遠心分離機において２２００rpmで5分間回転させ、MTBEをデカンテーションした。この工程をもう1度繰り返し、次いで固体を1容量%酢酸を含む1:1水／アセトニトリル(30mL)に溶かして室温で24時間保持した（注1）。溶液を凍結させ、次いで凍結乾燥機を用いて凍結乾燥させると155mgの粗製T-20が得られた。分取HPLCによる精製によって55mgの全長T-20ペプチドがHPLCでは95A%の純度で得られた（注2）。
【０１２４】
注：
1)Trp(Boc)のtBu側鎖を速やかに除去してTrpCOOHにする。TrpCOOHの脱カルボキシル化には、周囲温度、酢酸水溶液中において最低24時間を必要とする。
【０１２５】
2)分取HPLC
2” YMC, 120A, 10μ, C18
220nm, 50mL/分
A H₂O/0〜1% TFA
B ACN/0.1% TFA
39〜49% B/40分
10 実施例： T-20 ペプチドの精製
本明細書中に提示された実施例は、全体を通してペプチド精製を著しく増加させる条件下でT-20およびT-20様ペプチドを精製することができる方法を記載している。
【０１２６】
材料
使用カラム：Amberchrom CG-300S(Tosohaus; Montgomeryville, PA)の35μm粒子を充填した20 x 30cmのもの。
【０１２７】
バッファーの調製
バッファーA=NH₄OHでpH 8.5に調整した100mM酢酸アンモニウム。
【０１２８】
バッファーB=アセトニトリル。
【０１２９】
1. 約6カラム容の20%Bを有するカラム。
【０１３０】
2. T-20を50〜100mLのペプチド1グラム当たり85%A/15%Bに溶かす。2M K₂CO₃でpHを8〜10に調整する。T-20サンプル中のアセトニトリル濃度は15〜20%を超えない。
【０１３１】
3. カラム圧をモニターしながら、T-20溶液を500mL/分でロードする。
【０１３２】
4. T-20溶液をロードした後に3カラム容(10L)の85%A/15%Bの溶液をロードしてラインを洗い落とす。
【０１３３】
5. カラム溶出液を303nmでモニターし、全ロード工程中の溶出液を回収する。
目盛り上にピークを維持するために実験中に波長またはアテニュエーションを調整する。吸光度は波長とセルの経路長との関数である。
【０１３４】
6. 全実験中に圧力をモニターしながら勾配操作を以下のように始める(B/時で1.6%の変化)。
【０１３５】
時間（分） %B 流速(mL/分)
0 15 330
788 36 330
7. 主要ピークが溶出し始めると、10分の画分を回収する(3.3L)。すべてのT-20が35%Bにおいて溶出するはずである。平均して35〜40の画分が回収される。プールする画分の決定がなされるまで画分を0〜5℃で貯蔵する。
【０１３６】
8. 検出器の吸光度が0.1AU未満になるまで、または主要ピークが溶出した後に主要変曲点が到達するまで画分を回収する。
【０１３７】
9. 各画分の純度は分析逆相HPLCによってモニターする。
【０１３８】
結果
T-20ペプチドは7より高いpH範囲で非常に可溶性が高い。ペプチドの精製に通常用いられるカラム支持体はシリカベースのものであり、シリカ支持体はより高いpH範囲で溶解する傾向にあるので、それゆえ一定のpH範囲でのみ使用することができる。
【０１３９】
本明細書中に記載された方法では、広いpH範囲で(pH 1〜14)安定なポリスチレンベースの樹脂支持体を利用する。この方法はカラム能力を著しく増加させ、ここでT-20の溶出量は10gから250〜450gまで増加した（直径8” x 30cmのカラムに関して）。
【０１４０】
11. 実施例：T-20 ペプチド樹脂ローディングの大規模合成及び精製
FmocTrp(Boc)OHは、原料樹脂1グラムあたり1.2ミリモル以上のレベルで、非常に活性な2-CTC樹脂上にローディングすることができる。FmocTrp(Boc)OHの量が原料樹脂1グラムあたり1.1ミリモルを超えると(ローディングされた樹脂で1グラムあたり0.72ミリモルを超える量)、当該断片のアミノ酸のうち最後の3個について、ニンヒドリン試験が陰性となるのは難しい。同様に、FmocLeuO-樹脂を1グラムあたり0.85ミリモルより多くローディングすると、FmocAA17-26O-樹脂を作るのは困難になり、FmocGlnOH-樹脂を1グラムあたり0.75ミリモルより多くローディングすると、AcAA1-16O樹脂を作るのが難しくなる。
【０１４１】
ベンダーから樹脂を受領する際には、ローディングされるアミノ酸それぞれについて、2-CTC約1グラムで使用テストを行う。使用テストの目的は、ローディング中に使用されるアミノ酸量を決定して所望のローディング範囲を得ることにある。それぞれについて0.5当量過剰(報告された樹脂活性に対して)のDIEAと共に、0.8、1.0及び1.5当量のFmocGlnOH、1.0、1.2及び1.5当量のFmocTrp(Boc)OH、並びに0.8、1.0及び1.5当量のFmocLeuOHを使用する。2-CTC樹脂1キログラムに1モルのFmocLeuOHをローディングできない場合には、ベンダーから2-CTCを受け取るべきではない。以下、FmocLeuOH、FmocGlnOH及びFmocTrp(Boc)OHに対する標的樹脂について記述する。
【０１４２】
2-CTC樹脂には各キログラムあたり1.0〜1.1モルのFmocLeuOHをローディングすることができる。HClの損失を考慮すると、FmocLeuOHローディング後の樹脂乾燥重量は、原料樹脂重量の1.32〜1.35倍でなければならず、実測ローディングは1グラムあたり0.75〜0.81ミリモルでなければならない。
【０１４３】
2-CTC樹脂には各キログラムあたり0.8〜1.0モルのFmocGlnOHをローディングすることができる。HCLの損失を考慮すると、FmocGlnOHローディング後の樹脂乾燥重量は、原料樹脂重量の1.27〜1.33倍でなければならず、実測ローディングは1グラムあたり0.63〜0.75ミリモルでなければならない。
【０１４４】
2-CTC樹脂には各キログラムあたり0.9〜1.1モルのFmocTrp(Boc)OHをローディングすることができる。HCLの損失を考慮すると、FmocTrp(Boc)OHローディング後の樹脂乾燥重量は、原料樹脂重量の1.44〜1.54倍でなければならず、実測ローディングは1グラムあたり0.63〜0.72ミリモルでなければならない。
【０１４５】
重量増加を正確に解析するには、出発原料となる樹脂の乾燥損失(LOD)を測定しなければならない。LODは1%を超えてはならない。(ローディング後の)乾燥中、樹脂から完全に残留溶媒(すなわちDIEA/HCl)を除去しないと、単離される質量が多くなり、実測ローディングは低くなる。しかしながら、ローディングされる全モル数(質量×実測ローディング)は上記範囲内に収まるようにするべきである。上記アミノ酸のいずれに対してもローディング量(すなわち出発樹脂1キログラムあたりにローディングされる総モル数)の上限を10％以上超える場合には、より少ないアミノ酸を用いて使用テストをする。FmocGlnOHの場合、これは特に重要である。
【０１４６】
11.1 Fmoc-AA(Boc)-2- クロロトリチル樹脂の大規模製造
以下に続くセクションの目的は、固相ペプチド合成(solid phase peptide synthesis: SPPS)用のペプチド類を大量に製造するのに適した樹脂の大規模ローディングを行うことにある。以下のFmocTrp(Boc)OH、FmocGln(Boc)OH及びFmocLeu(Boc)OHそれぞれに樹脂を添加する。2-CTC樹脂約4キログラムを各出発残基に添加した。
【０１４７】

1. 最初の数はFmoc-AA標準に対する重量ベースHPLCアッセイにより計算した。カッコ内の数値は出発物質2-CTC樹脂のLODが12%であることを考慮して、重量増加により算出した。
【０１４８】
出発の2-CTC樹脂はコロラド・バイオテク社（Colorado BioTech）から入手した。ローディングは1.4 meq/gと公表されている。1.5当量のFmocTrp(Boc)OH、DCM (5 vol)中1.7当量のDIEA、周囲温度で2時間という標準的なローディング手法を用い、当初の2-CTC量を3.7キログラムとした。こうしてFmocTrp(Boc)O-樹脂4.493キログラムを得たが、これは、樹脂開裂後のFmocTrp(Boc)OHの重量ベースHPLCアッセイによる0.56 mmol/gでの理論ローディングをもっていた（合計2.52モル）。製造した合計1.62モルについて、ローディングは樹脂の重量増加により1グラムあたり0.36ミリモルになると算出されている。しかしながら、合計2.52モルは樹脂4キログラムあたり4モルのFmocTrp(Boc)OHという目的のローディングからはほど遠いが、出発物質である2-CTC樹脂のLODが12%であることを考慮した場合、重量増加により算出されたローディングは0.56 mmole/gでは同じである。
【０１４９】
標準的なローディング法を用いた２実験で、2-CTC 3.9キログラムから合計4.59キログラムのFmocLeuO-樹脂を製造した。
【０１５０】
しかしながら、予想したよりも実質的に低いローディングが得られた。樹脂開裂後のFmocLeuOHを重量ベースHPLCによりアッセイしたところ、最初のバッチは1グラムあたり1.07ミリモルの理論ローディングを示した。出発物質2-CTC樹脂のLODが12%であることを考慮すると、重量増加による理論ローディングは1グラムあたり0.647ミリモル(500グラム)であるから、これは明らかに不可能である。ローディングされた合計1.577モルに対して実際のローディングは1グラムあたり0.647ミリモルに近いようである。
【０１５１】
2-CTC 1.7キログラムから製造した第2バッチのFmocLeuO-樹脂(2.154キログラム)は、0.68ミリモル/グラムの理論ローディングを有していたのに対し、重量増加ローディングは0.66ミリモル/グラムであった。
【０１５２】
0.8当量のFmocGlnOH及び7容量の5/2 DMF/DCM中1当量のDIEAを用い、3.65キログラムの2-CTCを出発物質として、シングルバッチ法によりFmocGlnO-樹脂を合計3.856キログラム作った。合計2.12モルのFmocGlnO-樹脂に対し、重量ベースHPLCアッセイによる理論置換量は1グラムあたり0.55ミリモルであった。出発2-CTC樹脂のLODが12%であることを考慮すると、合計2.0モルのFmocGlnO-樹脂に対し、重量増加による理論ローディングは、1グラムあたり0.52ミリモルである。
【０１５３】
一般に、重量増加によるローディングは、ローディングしたAAもしくは除去したフルベンについては、重量ベースHPLCアッセイによって算出されたローディングよりも大きいかまたは同等でなければならない。出発の2-CTCはそのLODが1%より小さくなければならず、単離されたFmocAAO樹脂は、少量のNMP、塩及び/または残留FmocAAOHを含む可能性がある。
【０１５４】
11.1.1 Fmoc-AA(Boc)-2- クロロトリチル樹脂の好ましい大規模製造法
FmocTrp(Boc)OH 及び FmocLeuOH
空気感受性2-クロロトリチルクロリド樹脂(1当量、3.7キログラム、5.18モル)をSPPSチェンバーに入れ、DCM5容量で洗浄する。溶媒を除去し、FmocTrp(Boc)OHもしくはFmocLeu(Boc)OH(1.5当量)溶液及びDCM (5容量)中DIEA(1.7当量)を加える(注1)。このスラリーを2時間撹拌しながらかき混ぜる。溶媒を除去した後、樹脂に残留する活性部位を30分間9:1 MeOH:DIEA (5容量)でエンドキャッピングする。溶媒を除去した後、樹脂を5容量のDCMで6回洗浄する。恒量になるまで樹脂を乾燥した後、これをサンプリングし、ローディングについて分析する(注2)。同じ方法を用いてFmocLeuOHをローディングする。
【０１５５】
FmocGluOH
窒素雰囲気下、空気感受性2-CTC(3.65キログラム、1.4ミリモル/グラム)樹脂を40LのSPPSチェンバーに入れ、DCM(5容量)で洗浄する。20Lの反応容器にFmocGlnOH(1.506キログラム、0.8当量)、DMF (5容量)及びDIEA(1.0当量)を入れる。SPPSチェンバーをドレーンし、DMF溶液を添加する。DCM(2容量)で反応容器を洗浄し、洗液はSPPSチェンバーに加える。窒素雰囲気下2時間SPPSチェンバーで樹脂を撹拌した後、ドレーンを行う。樹脂に残留する活性部位はすべて30分間9:1 MeOH:DIEA (5容量)でキャッピングする。樹脂をドレーンした後、DCM(5容量、6回)で洗浄する。恒量になるまで樹脂を乾燥した後（3.856kg）、これをサンプリングし、ローディングレベルについて試験する(注2)。
【０１５６】
注：
1. 2-クロロトリチルクロリド樹脂は湿度には非常に感受性が高い。水は樹脂の表面を覆うとHClを与える。溶媒が乾燥している限り、DCEとDCMとの間にはほとんど差がない。
【０１５７】
2. 樹脂ローディングは樹脂からFmocアミノ酸を開裂し、定量wt/wt HPLC分析により標準に対してアッセイすることにより決定する。
【０１５８】
フェノメネックス・ジュピターC18、300A、Sm
1 mL/min、260 nm
A: 0.1% 水性TFA
B: アセトニトリル中0.1% TFA
65%B、アイソクラチック（isocratic）
保持時間: 約8分
樹脂乾燥前の洗浄回数が不十分で樹脂からNMPを完全に除去できない場合には、樹脂の重量増加によるローディング量の測定は不正確になることがある。計算は以下の通りである。
【０１５９】
(Fmoc-AA-OH 樹脂質量−出発 2-CTC 質量)/Fmoc-AA-OH樹脂質量(ローディングされたAAの分子量−HClの分子量)
DCM中長期間(日)本発明のペプチド断片を保存すると、樹脂から実質的な開裂が起こることが観察された。例えば、FmocAA17-26OHを構築する際、部分的に構築された断片をDCM中で2度週末にかけて保存した。合成を終了して樹脂から取り出した後、8%の収率でFmocAA17-26OHが得られた。週末にかけての保存中、DCMに存在する微量のHClが、部分的に構築された断片を樹脂から徐々に開裂したのではないかと考えられる。
【０１６０】
FmocAA17-26O-樹脂、AcAA1-16O-樹脂及びFrmoAA27-35O-樹脂のサンプルを室温で1週間DCM及びIPA中に放置した。各樹脂の上清をHPLCにより分析した。定量的な結果は得られなかったが、DCM中ではすべての断片が有意な程度まで樹脂から開裂したのに対し、IPA中では開裂は観察されなかった。部分的に構築された断片を２〜３日(週末にかけて)保存する必要がある場合には、固形物をNMPで洗浄し、ベッドをドレーンして窒素雰囲気下NMPで飽和させておいた方がよい。
【０１６１】
FmocLeuO-樹脂、FmocGlnO-樹脂、FmocTrp(Boc)O-樹脂、FmocAA17-26O-樹脂、AcAA1-16O-樹脂及びFrmoAA27-35O-樹脂を最終洗浄するため、DCMをIPAで置換した。IPAで飽和したFmocLeuO-樹脂、FmocGlnO-樹脂及びFmocTrp(Boc)O-樹脂を40℃で乾燥した。4℃で乾燥したそれらローディング樹脂からFmocAA17-26O-樹脂、AcAA1-16O-樹脂及びFrmoAA27-35O-樹脂を構築した。合成終了時に、樹脂結合断片をきれいになるまでDOMで、次にIPAで洗った。IPAで飽和した樹脂結合断片を分けて周囲温度及び40℃で乾燥した。断片を樹脂から開裂し、HPLCにより分析した。断片の純度に差は観察されなかった。IPAで飽和した樹脂結合断片を40℃で乾燥した場合、乾燥は単離された断片の性質や量には影響しない。
【０１６２】
NMP/DCMに対しDMF中で断片のSPPSを調べた(樹脂1グラムは両溶媒系で5 mLに膨潤する)。溶媒としてDMFを用い、カップリング試薬としてTBTU対HBTUを使用してFmocAA27-35OH断片を合成した。収率77%、純度89.5A%でFmocAA27-35OHを単離した。
【０１６３】
FmocAA17-36NH2断片及びAcAA1-36NH2断片の仕上げ(work up)手順によりカップリングしなかった断片を除去する。固相合成を行う間、これらの断片を欠失部位でアセチル化(エンドキャッピング)すると、欠失断片は確実に溶液相カップリングでカップリングしなくなる。FmocAA17-36NH2及びAcAA1-36NH2両断片の合成中カップリングしなかった断片はIPA及びACN仕上げの際に除去しなければならない。
【０１６４】
11.2 AcAA(1-16)-OH 断片 (3c 断片 ) の大規模製造
SPPSによるAcAA1-16-OH断片の大規模製造を2回行って、FmocGlnOH-樹脂3.53キログラムから合計7.941キログラムの樹脂結合断片を得た。2回とも出発物質であるFmocGlnOH-樹脂のローディング値は、重量ベースHPLCアッセイにより得られた若干過大な0.55ミリモル/グラムという値であり、むしろ出発物質2-CTCの12%LODを考慮した重量増加により得られる0.52ミリモル/グラムのほうがより正確な値である。望ましい値より低い樹脂ローディングを持つほか、アミノ酸はSPPSの間それぞれ6%過剰量を使用した。
【０１６５】
SPPSでは樹脂に第1のFmocGln(trt)OHを2.5当量使用し、断片において次に続くアミノ酸についてはそれぞれ1.7当量を使用した(0.55ミリモル/グラムローディングに対し)。8容量の3:1 NMP:DCM中でカップリング反応を行ったところ、32カップリング反応(アセチル化を含む)の内2例を除いて残り全部の反応は2時間以内に完了した。洗浄はすべて5容量のNMPで行った。
【０１６６】
3.4容量(乾燥AcAA1-16O-樹脂の重量に対し)の1% TFA/DCM中0〜5℃で、1洗浄あたり5分間ずつ5、6回、樹脂結合断片を洗浄する。各洗液を1.36容量の0.33 M NaHCO3水溶液に集めてTFAを中和する。3相洗液を合わせて水(2容量)を加える。DCMを溜去すると重炭酸ナトリウム水溶液中に濾過可能な沈澱が残る。蒸留する間に多相スラリーは粘稠となってクリーム状を呈した後、DCMが最後まで除去されると濾過可能なスラリーになる。このスラリーを0〜5℃まで冷却し、pHを0.1 N HClで3.0に調整する。スラリーを0〜5℃で1〜2時間撹拌し、濾過して集め、洗浄して乾燥する。続く実験で固形物を集め、反応容器に戻し、水で1〜2時間トリチュレーションした後、集めて乾燥する。
【０１６７】
DCM中1% TFAを用い、4実験で樹脂からのAcAA1-16OH開裂を行った。3.53キログラムのFmocGlnO-樹脂から合計4.814キログラムのAcAA1-16OHが93〜96A%の純度で得られた。出発物質である2-CTC(理論量5.83キログラム)のLODが12%であることを考慮して重量増加により決定した0.52ミリモル/グラムのローディングにもとづく総収率は83%である。
【０１６８】
AcAA1-16OHのナトリウム塩はDMFにもNMPにも不溶であるので、カルボキシル末端をプロトン化するにはpH調整が必要である。水洗により生成物から確実にトリフルオロ酢酸ナトリウムを除去する。wt/wtベースでごく少量のトリフルオロ酢酸ナトリウムが存在すると、HAA17-36NH₂との溶液相カップリングは妨害される。
【０１６９】
この断片は周囲温度で乾燥しなければならない。湿ったAcAA1-16OHを40℃で乾燥する安定性検査を行ったところ、3日間で約4%の分解を示した。興味深いことに、乾燥した固形物は80℃で24時間安定である。
【０１７０】
11.2.1 Ac-AA(1-16)-OH 断片 (3c 断片 ) の好ましい大規模製造法
40 Lのペプチドチェンバーに樹脂結合FmocGlnOH(1.53キログラム、0.55ミリモル/グラム、0.84モル)を加える。15分間撹拌しながら、窒素下でDCM(5容量)により樹脂のコンディショニングを行った後、ドレーンする。20%ピペリジンNMP溶液(5容量)を加え、得られた懸濁液を窒素下で20分間撹拌する。溶液をドレーンし、このプロセスを繰り返す。5容量のNMPで5回樹脂を洗浄してジベンゾフルベンを除去し、クロロアニル試験により判定されるピペリジンを除去する(注1)。
【０１７１】
樹脂を洗浄してピペリジンを除去しながら、配列中の次のアミノ酸(1.5当量)、HOBT (1.5当量)及びDIEA(1.5当量)をNMP(6〜7容量)中で混合して0℃に冷却する。冷却した溶液にHBTU (1.5当量)を加え、溶液を10〜15分間撹拌してHBTUを溶解する。活性アミノ酸の冷却溶液を樹脂に加えた後、DCMで洗浄する(2.5容量)(注2)。窒素パージ下で2時間、懸濁液を撹拌する。その後、定性ニンヒドリン試験用に樹脂サンプルを取り出す(注3)。ニンヒドリン試験が陰性であれば、反応容器をドレーンし、5容量のNMPで3回洗浄する(注4)。そして配列中の次のアミノ酸についてこのサイクルを繰り返す。ニンヒドリン試験が陽性である場合には、懸濁液をさらに1時間撹拌して再試験を行う。ニンヒドリン試験が陰性であれば、次のサイクルに進む。ニンヒドリン試験がなお陽性の場合には、アミノ酸1当量と試薬との再カップリングを行う。1時間後ニンヒドリン試験が陽性になれば、NMP(10容量)中5当量（Seq）の無水酢酸と5当量（Seq）のピリジンで1時間エンドキャッピングを行う。
【０１７２】
断片合成終了後、記載したように最後のアミノ酸からFmocを除去した後、3:1 NMP:DCM（10容量）における無水酢酸とピリジン(それぞれ5当量)の溶液中で、20〜30分間、もしくは、ニンヒドリン試験が陰性になるまで、樹脂を撹拌する。樹脂をドレーンした後、5容量のNMPで2回、5容量のDCMで5回洗浄して乾燥すると、3.49キログラムのAcAA1-16O-樹脂が得られる。
【０１７３】
40 LのSPPSチェンバーに乾燥した樹脂結合AcAA1-16(3.49キログラム)を入れる。6 x 3.4容量の1% TFA/DCM を用いて、樹脂結合ペプチドをその樹脂から開裂する(注7)。各開裂洗液を1.36容量の0.33 M 重炭酸ナトリウム水溶液に集める。2相フラクションを合わせて2容量の水で希釈する。減圧下(15Hg、20℃)2相混合物を濃縮してDCMを除去する。撹拌を続けるのに必要であれば蒸留中さらに水(2容量)を加える(注6)。DCMを除去する場合(数時間)には、懸濁液を0℃に冷却し、1N HCl水溶液でpHを3に調整する。スラリーは0℃で1時間撹拌した後集める。なお湿っている固形物は反応容器に戻し、水(7容量)でトリチュレーションして残っているTFAとトリフルオロ酢酸ナトリウムを除去する。減圧濾過により固形物を集めて恒量になるまで乾燥する(1.12キログラム、95A%)。0.52ミリモル/グラムローディングに基づくAcAA1-16OHの収率は86%である(注7)。
【０１７４】
注 :
1. アセトン約1ミリリットルにクロロアニルのトルエン飽和溶液1滴を加えた後、流出液を1滴加える。青もしくは紫色はピペリジンの存在について陽性であることを示す。ベッド高が高くなればなるほど、ピペリジンを洗い流すのにはさらに大量のNMPが必要になる。
【０１７５】
2. 樹脂の適当な膨潤を確実にするため、DCMを添加する。
【０１７６】
3. カップリング効率をモニターするには定量ニンヒドリン試験が適切である。樹脂試料2〜20ミリグラムを取り出し、メタノールできれいになるまで洗浄する。試料に76%フェノールのエタノール液を3滴、0.2 mM KCNピリジン液を4滴及び0.28 Mニンヒドリンのエタノール液を3滴加える。溶液をエタノールで0.5〜1ミリリットルに希釈し、5〜10分間75℃の加熱ブロックに置く。青もしくは紫色は遊離アミンを示す(陽性)。澄んだ青色または淡青色は陰性の結果を示す。定量ニンヒドリン試験方法の文献: Sarin, V.K., Kent, S.B.H., Tam, J.P., & Merrifield, R.B. (1981) Analytical Biochem. iii, 147-157。
【０１７７】
4. 樹脂を1昼夜保存する場合には、5容量のNMPで2回洗浄した後、ドレーンして窒素下に保存のこと。DCM下に保存してはならない。この場合樹脂からペプチドが開裂して実質的な量損失を生じる。
【０１７８】
5. 各フラクションについては、254 nmでTLC可視化により生成物の内容を調べる。生成物の大部分は最初の5回洗浄により除去される。
【０１７９】
6. DCMを除去するにつれ、反応物はマシュマロクリームの固さを呈するようになる。蒸留を続けると、懸濁液は徐々に固いスラリーへと変わっていく。生成物からオイルが出るのを防ぐためDCMを徐々に除去することが重要である。
【０１８０】
7. バイダク(Vydac) C8、5μ、300A
1 mL/min、30℃、230 nm
A 1000:1 水/TFA
B 800:200:1 IPA:ACN:TFA
60-95%B/30 min
保持時間: 13.1分
11.3 FmocAA(17-26)-OH 断片 (10b 断片 ) の大規模製造
同等サイズの2実験でFmocLeuO樹脂2.4キログラムからFmocAA17-26O-樹脂を合計5.3キログラム作った。同等サイズの4実験で、この樹脂からFmocLeuO-樹脂5.3キログラムを開裂したところ、平均して純度94.4A%、収率90%のFmocAA17-26OHが3.184キログラム得られた。
【０１８１】
ローディングファクターに対しアミノ酸をそれぞれ1.5当量用いて反応を行ったが、各カップリングサイクルについて65%過剰のアミノ酸を使用する結果となった。カップリング反応はすべて2時間以内に完了した(ニンヒドリン試験陰性)。
【０１８２】
20%ピペリジンNMP(5容量)に20分間保ってFmoc保護基を外し、これを繰り返した。5容量のNMPで5回洗ってピペリジンを樹脂から洗い流した。カップリング反応は8容量の3:1 NMP:DCM中で行った。カップリング溶液を除去し、固形物を5容量のNMPで3回洗浄した。配列の次のアミノ酸について、このサイクルを繰り返した。断片完了後、樹脂ベッドを5容量のNMPで2回、5容量のDCMで5回洗った後、恒量になるまで乾燥した。
【０１８３】
樹脂から断片を除去するため、DCM中1% TFAで数回洗浄する。1% TFAのDCM溶液は冷却する必要はない。この断片は1% TFA/DCM(1%/日)中ではAcAA1-16OHよりもはるかに安定だからである。生成物含有酸性DCM洗液を集め、ピリジンで中和する。合わせた洗液を蒸留してDCMを除去し、エタノールを添加して溶液を維持すると共に、蒸留する間に残留DCMを追い出す。DCMを除去した後(蒸留物が除去される温度の上昇によって判断する)、水を加えて断片を沈澱させる。減圧濾過により固形物を集める(60分以内)。なお湿っている固形物は反応容器に戻し、80/20のエタノール/水(5容量)で60分間0〜5℃でトリチュレーションする。減圧濾過により沈澱したFmocAA17-26OHを集め、最小量の80/20エタノール/水で洗浄して乾燥する(減圧、加熱なし、10日間)。
【０１８４】
11.3.1 FmocAA(17-26)-OH 断片 (10b 断片 ) の好ましい大規模製造法
40 LのSPPSチェンバーにFmocLeuO-樹脂(1.2キログラム、0.776モル)を入れた後、DCM（5容量）で樹脂を膨潤させる。DCMは乾燥した原料樹脂を確実に完全膨潤させるのに必要である。懸濁液を20〜30分間撹拌した後、液体を除去する。20%ピペリジンNMP溶液を加え（５容量）、溶液を20分間撹拌する。溶媒を除去した後、このプロセスを繰り返す。溶媒を除去し、樹脂ベッドを5容量のNMPで5回洗浄してピペリジンを除去する(注1)。
【０１８５】
脱保護しながら、配列中の次のアミノ酸(1.95当量)、HOBT (1.95当量)、DIEA(1.95当量)及びNMP(6容量)を機械的撹拌機を備えた20リットルの丸底フラスコに入れる。固形物が溶解するまで溶液を撹拌し、次いで、0〜5℃に冷却して、HBTU (1.95当量)を加える。HBTUが溶解するまで溶液を撹拌するか、またはピペリジンを含まない場合には樹脂を撹拌(どちらが最初でもよい)した後、樹脂に加える。反応容器をDCM(2容量)で洗浄し、これをSPPS反応容器へ移す。注: アミノ酸と試薬の化学量論は1.5当量でなければならない。
【０１８６】
穏やかに撹拌しながら、樹脂をカップリング溶液に懸濁する。2時間後、樹脂試料をSPPSチェンバーから取り出して定性ニンヒドリン試験を行う(注2)。ニンヒドリン試験が陰性であれば、反応容器をドレーンし、5容量のNMPで3回洗浄する。そして配列中の次のアミノ酸についてこのサイクルを繰り返す(DCMによる膨潤はローディングされた最初のアミノ酸についてだけ行う)。
【０１８７】
ニンヒドリン試験が陽性である場合には、懸濁液をさらに1時間撹拌して再試験を行う。ニンヒドリン試験が陰性であれば、次のサイクルに進む。ニンヒドリン試験がなお陽性の場合には、1当量のアミノ酸と試薬との再カップリングを行う。1時間後ニンヒドリン試験が陽性の場合、NMP(10容量)中の無水酢酸5当量とピリジン5当量で1時間エンドキャッピングを行う。
【０１８８】
断片合成終了後、樹脂をドレーンし、5容量のNMPで2回、5容量のDCMで5回洗浄した後乾燥すると、2.67キログラムのFmocAA17-26O-樹脂が得られる。
【０１８９】
1.7容量のDCM中1% TFAを、1回5分間で5〜6回用いて、樹脂(1.33キログラム)からFmocAA17-26OHを開裂する。1% TFA/DCM洗液をピリジン含有フラスコに集める(洗液中のTFAについては容量比1:1)。生成物含有洗液を合わせ(約14リットル)、最小ポット容量になるまでDCMを溜去する(元の容量の約3分の1)。減圧度を調整してポット温度を15〜25℃に保つ。エタノール(6.5容量)を加え、DCMがなくなるまで蒸留を続ける(蒸留物の温度によって判断する；注3)。再び減圧度を調整してポット温度を15〜20℃に保つ。最終ポット容量は約8〜10容量でなければならない。溶液を5〜10℃に冷却し、30分間にわたって水(6.5容量)を加え、FmocAA17-26OHを沈澱させる。減圧濾過により固形物を集めて水洗する（２〜３容量）。残存するピリジン及び／又は塩を除去するため、なお湿っている固形物は反応容器に戻し、予め0℃まで冷却した80/20エタノール/水(5容量)を加える。懸濁液を60分間0℃で撹拌する。減圧濾過により固形物を集め、最小量の80/20エタノール/水で洗浄し、恒量になるまで乾燥すると、収率90.6%、純度96A%のFmocAA17-26OHが0.806キログラム得られる(注4)。
【０１９０】
注 :
1. アセトン1ミリリットルにクロロアニルのトルエン飽和溶液1滴を加えた後、流出液を1滴加える。青もしくは紫色はピペリジンの存在について陽性であることを示す。
【０１９１】
2. カップリング効率をモニターするには定量ニンヒドリン試験が適切である。樹脂試料2〜20ミリグラムを取り出しメタノールできれいになるまで洗浄する。試料に76%フェノールのエタノール液を3滴、0.2 mM KCNピリジン液を4滴及び0.28 Mニンヒドリンのエタノール液を3滴加える。溶液をエタノールで0.5〜1ミリリットルに希釈し、5〜10分間75℃の加熱ブロックに置く。青もしくは紫色は遊離アミンを示す(陽性)。澄んだ青色または淡青色は陰性の結果を示す。
【０１９２】
3. DCMの減圧蒸留中の頭部温度は10〜15℃であった。DCMを除去すると、頭部温度は3500まで上昇した。
【０１９３】
4. バイダクC8、5μ、300A
1 mL/min、262 nm、30℃
A 水/0.1% TFA
B ACN/0.1% TFA
80-99%B/20 min
保持時間: 15.2分
11.4 FmocAA(27-35)-OH 断片 (16b 断片 ) の大規模製造
FmocTrp(Boc)O-樹脂4.45キログラムから合計4.694キログラムのFmocAA27-35-OHを合成した。固相合成は2個のバッチで行い、樹脂からの開裂は4バッチであった。1バッチから得られたFmocAA27-35-OHは他のバッチから得られた物質よりも約5%純度が低かった。これはFmocAA17-36-NH2へ処理する際に除去された、同定されていない不純物5A%によるものであった。樹脂にローディングされたFmocTrp(Boc)OHの合計量は2.5モルであった。約63%の容量でローディングされた樹脂について予想される通りに、固相合成が進行した。カップリングはすべて最初の2時間のチェックポイントで完了した。SPPS及び開裂に使用した反応及び洗浄量はFmocAA17-26OH合成に使用した量と同じであった。樹脂からの開裂は上記の通りであった。濾過は迅速であった(15分)。90/10エタノール/水トリチュレーション後の固形物乾燥には3日間かかった(減圧、加熱なし)。断片は40℃の乾燥にも安定である。
【０１９４】
11.4.1 Ac-AA(27-35)-OH 断片 (16b 断片 ) の好ましい大規模製造法
FmocTrp(Boc)-樹脂(1当量、2.2キログラム、1.23モル)を含有するSPPSチェンバーにDCM(5容量)を加える。得られた懸濁液を15分間撹拌した後ドレーンする。20%ピペリジンのNMP溶液(5容量)を加え、得られた懸濁液を10〜15分間撹拌してFmoc保護基を外す。このプロセスを繰り返した後、クロロアニル試験が陰性を示すまで、樹脂をNMP(5容量)で5〜7回洗浄する(注1)。
【０１９５】
NMP(6容量)中で、次に続くアミノ酸(1.5当量)、HOBT (1.5当量)及びDIEA(1.7当量)を合わせ、0〜5℃に冷却する(注2)。HBTU を加え、溶液を10〜15分間撹拌してHBTUを溶解する。活性アミノ酸の溶液を樹脂に加える。DCMで反応容器を洗浄した後樹脂に加える(注3)。窒素雰囲気下1〜2時間この懸濁液を撹拌する。カップリングが完了したかどうかは定性ニンヒドリン試験によりモニターする(注4)。ニンヒドリン試験が陰性であれば、反応容器をドレーンし、5容量のNMPで3回洗浄し、配列中の次のアミノ酸についてこのサイクルを繰り返す(ローディングされた最初のアミノ酸についてのみDCMによる膨潤を行う)。
【０１９６】
ニンヒドリン試験が陽性である場合には、懸濁液をさらに1時間撹拌して再試験を行う。ニンヒドリン試験が陰性であれば、次のサイクルに進む。ニンヒドリン試験がなお陽性の場合には、1当量のアミノ酸と試薬との再カップリングを行う。1時間後ニンヒドリン試験が陽性になれば、NMP(10容量)中で1時間無水酢酸5当量とピリジン5当量のエンドキャッピングを行う。
【０１９７】
断片合成終了後、樹脂をドレーンし、5容量のNMPで2回、5容量のDCMで5回洗浄して乾燥すると、4.11キログラムのFmocAA27-35O-樹脂が得られる。
【０１９８】
樹脂から断片を開裂するには、1.7容量のDCM中1% TFAを用い、1回5分間で6回、樹脂(2.05キログラム)から樹脂を開裂する。1% TFA/DCM洗液をピリジン(洗液中のTFAに対して容量比1:1)含有フラスコに集める。生成物含有洗液を合わせ、元のポット容量の約半量になるまでDCMを溜去する(ポット温度は減圧度を調整して約15℃に保つ)。徐々にエタノール(5容量)を加え、DCMがなくなるまで(蒸留物の温度によって判断する。注5)蒸留（減圧度を調整してポット温度を約20℃に保つ）を続ける。ポット容量は約6〜7容量でなければならない。濁った溶液を10〜15℃に冷却し、素早く撹拌しながら30分間にわたって水(3.5容量)を加えると、FmocAA27-35-OHが沈澱する。減圧濾過(15分間)により固形物を集めて水(1容量)で洗浄する。残留ピリジンを除去するため、湿っている固形物を反応容器に戻し、予め0〜5℃に冷却した90/10エタノール/水(10容量)を加える。スラリーを0〜5℃で60分間撹拌する。減圧濾過により固形物を集め、90/10エタノール/水(0.5容量)で洗浄し、恒量になるまで乾燥すると、収率89%、純度89.2A%のFmocAA27-35-OHが1.19キログラム得られた(注6)。
【０１９９】
このプロトコールは、12時間撹拌しながら固形物を9:1エタノール/水15容量でトリチュレーションした後、集めて乾燥することにより再処理することができる。
【０２００】
注 :
1. アセトン1ミリリットルにクロロアニルのトルエン飽和溶液1滴を加えた後、流出液を1滴加える。青もしくは紫色はピペリジンの存在について陽性であることを示す。
【０２０１】
2. 溶解を補助するためHBTUを除いた試薬を室温で添加する。HBTUを冷却溶液に加えるとラセミ化が低減する。
【０２０２】
3. HBTUはDCMに溶けないため、活性化はNMP中で行う。DCMは反応容器を洗浄するのに使用されると同時に、適当な樹脂膨潤を維持するため樹脂に添加される。
【０２０３】
4. カップリング効率をモニターするには定量ニンヒドリン試験が適切である。樹脂試料2〜20ミリグラムを取り出し、メタノールできれいになるまで洗浄する。試料に76%フェノールのエタノール液を3滴、0.2 mM KCNピリジン液を4滴及び0.28 Mニンヒドリンのエタノール液を3滴加える。溶液をエタノールで0.5〜1ミリリットルに希釈し、5〜10分間75℃の加熱ブロックに置く。青もしくは紫色は遊離アミンを示す(陽性)。澄んだ青色または淡青色は陰性の結果を示す。
【０２０４】
5. DCMを減圧蒸留する間の頭部温度は10〜15℃に保った。DCMが除去されると頭部温度は35℃まで上昇した。
【０２０５】
6. バイダクC8、5μ、300A
1 mL/min、262 nm、30℃
A 水/0.1% TFA
B ACN/0.1% TFA
80-99%B/20 min
保持時間: 15.3分
11.5 FmocAA(27-35)-OH と HPheNH2 の固相カップリングによる FmocAA(27-36)-OH 断片の大規模製造
4.676キログラムのFmocAA27-35-OHから4実験で合計5.226キログラムのFmocAA27-36NH2を作った。残留するカップリング試薬もしくは溶媒は収率100%以上になる。これらは次の段階で除去される。
【０２０６】
水のドロップアウト後反応容器壁に付着している固形物はこの段階で重要な問題となった。減圧濾過により粗固形物を分離するのに30分を要した。これら実験の平均乾燥時間(減圧、加熱なし)は8日間であった。固形物はオーブンへ入れる前に濾紙上で圧縮して過剰の水を除去する必要がある。この断片は40℃の乾燥に安定であり、減圧オーブンは加熱する必要がある。
【０２０７】
使用テストは、使用する出発物質1ロットあたりのバッチ0.5〜1グラムについて行い、性質及び同一性を確定する助けとする。薄層クロマトグラフィ(TCL)及びHPLCを用いて出発物質から生成物への変換をモニターする。FmocAA27-35OH断片において探さなければならない最初の不純物はトリフルオロ酢酸(またはその塩)である。FmocAA27-35OHに存在するトリフルオロ酢酸のフェニルアラニンアミドによる活性化及び反応は迅速なプロセスである。存在するトリフルオロ酢酸を消費するのに小過剰のフェニルアラニンアミドを使用することができる。さらに重要な性質の問題は購入したフェニルアラニンアミドについてである。ほとんどのベンダーはこれを塩酸塩として販売する。フェニルアラニンアミド塩酸塩のロットのうちいくつかでは、HPLCの際出発物質と一緒に共溶出する不純物(5〜15A%)が生成している。この不純物はTLCによって出発原料断片及び生成物から分離することができる。フェニルアラニンアミド塩酸塩に存在する塩化アンモニウムから生じるFmocAA27-35NH2は不純物である。
【０２０８】
11.5.1 FmocAA(27-35)-OH と HPheNH2 の液相カップリングによる FmocAA(27-36)-OH 断片の大規模製造
機械的攪拌機を備えた40リットルのジャケット反応容器にFmocAA27-35OH(1当量、1.185キログラム)、HOAT (1.1当量)、HCl.HPheNH2(1.15当量)及びDMF(12.5容量)を入れる。DIEA (2.1当量)を加え、溶液を0〜5℃に冷却してHBTU(1.2当量)を添加する。反応混合物を0〜5℃で15分間撹拌した後、室温まで加温し、さらに70分間撹拌する(注1、プロセスチェックのためHPLCを用いた)。HPLCにより反応が完了したと判断できた後、水(12.5容量)を15〜30分かけて加えるとペプチドが沈澱する。スラリーを周囲温度で15分間撹拌する。減圧濾過によって固形物を集め、水(3容量)で洗浄後乾燥すると、FmocAA27-36NH2が得られる(収率107%で1.357キログラム、HPLCによる純度87.1A%)(注2)。
【０２０９】
12時間撹拌しながら固形物を9:1アセトニトリル/水15容量でトリチュレーションした後集めて乾燥することにより、再度反応を行うこともできる。
【０２１０】
注 :
1. プロセス制御において、TLC:
88/12ジクロロメタン/メタノール
UV、ヨード検出
Rf: FmocAA27-35OH、0.49
Rf: FmocAA27-36NH2、0.63
バイダクC8、5 m、300A
30℃、1 mL/min、262 nm
A 水/0.1% TFA
B ACN/0.15 TFA
80-99%B/20 分
保持時間: FmocAA27-35OH、15.8
保持時間: FmocAA27-36NH2、17.12
2. 一般に、単離された固形物を反応容器に戻して水でトリチュレーションをしない限り、得られる収率は理論収率より大きい。
【０２１１】
11.6 FmocAA(27-36)OH からの HAA(27-36)-OH 断片の大規模製造
5.221キログラムのFmocAA27-36NH2から平均2段階収率86.4%で、4実験で合計3.897キログラムのHAA27-36NH2を製造した。これらの実験で観察された収率の範囲、74〜97%は1実験から次の実験への持ち込みを反映していると考えられる。
【０２１２】
この段階では製造も生成物単離も非常にうまくいく。正確な量のDCMがMTBEに残っており、固形物の物理的な性質が迅速な濾過・乾燥をもたらす。この生成物単離法は、以下のセクション11.6.2に記載の新段階に組み込まれている。
【０２１３】
DCMは、FmocAA27-36NH₂の脱保護の際に使用する溶媒である。脱保護の完了時に、有機溶液を水で２回洗浄することにより、過剰ピペリジンのほとんどを除去し、次に、元の容量の約１／３に濃縮する。MTBEを添加して、フラグメントを沈殿させる。蒸留を続けることにより、残ったDCMの大部分を除去し、フラグメントの沈殿を完了する。沈殿中の質量損失を防止する上で、DCMのほとんどを除去することが重要である。また、生成物の清浄化を確実にするために、MTBE中にDCMをいくらか残すことも重要である。ジベンゾフルベン、ピペリジン／フルベン付加物および残留ピペリジンは、MTBEに可溶性である。HAA27-36NH₂を回収し、乾燥させる。必要であれば、MTBEを用いた該固体の２次粉砕（12時間）により、残留ジベンゾフルベン、およびさらに重要なことにはHAA27-36NH₂に存在する可能性のあるピペリジン／フルベン付加物を除去する。ヘキサンを用いた粉砕では、ジベンゾフルベンは除去されるが、ピペリジン／フルベン付加物は除去されない。MTBEから単離した固体の乾燥時間は、１日である。
【０２１４】
HAA27-36NH₂およびDCM／MTBE中の関連不純物の高い可溶性のため、分析方法には、溶媒交換の終点を正確に決定することが求められた。MTBE中のDCMを定量するために、ＧＣ法が開発されている。蒸留は、MTBE中のDCM含有率が、６％を下回る時点で、完了する。
【０２１５】
11．６．１ FmocAA(27-36)-OH からのフラグメント HAA(27-36)-OH の大規模製造
撹拌機と温度計を備えた40Ｌのガラスジャケット付き反応器に、FmocAA27-36NH₂（1当量、1.356kg）、DCM（５容）およびピペリジン（0.2容）を導入する。該溶液を周囲温度で1.5時間撹拌する（注１）。有機溶液を水（２ｘ５容）で洗浄する。蒸留（約25mmHg、尚、固体の融解を防ぐため、ジャケット温度は45℃未満）により、上記有機層の容量を元の有機容量の約１／３に減少させる。MTBE（５容）を反応器に徐々に導入しながら、重沈殿点まで濃縮を続け、ポット容量を約５容とする。DCM含有率が６％を下回った時点で、溶媒交換を停止する。該スラリーを０〜５℃に冷却し、60分間撹拌した後、減圧濾過（急速）により回収する。固体をMTBE（２ｘ0.5容）で洗浄し、恒量まで乾燥させて、1.022kgのHAA27-36NH₂を得た。収率は89.2％（２ステップ）で、純度は、91.1Ａ％であった（注１）。
【０２１６】
MTBE（12.5容）を用いた、23℃、13時間の粉砕により該反応を再実施し、減圧濾過および乾燥により、回収してもよい。
【０２１７】
注：
１．HPLCにより測定するIPCおよび純度：
Vydac、Ｃ８、５、300A
１mL／分、262nm、30℃
Ａ 水／0.1％TFA
Ｂ ＡＣＮ／0.1％TFA
80〜99％Ｂ／20分
保持時間：FmocAA27-36NH₂、16.5, HAA27-36NH₂、8.4
11．６．２ FmocAA(27-36)-OH と HPheNH ₂ の液相カップリングによる、フラグメント HAA(27-36)-OH の改良された製造
FmocAA27-35OHから直接HAA27-36NH₂を得る第11．５節から第11．６．１節を組み合わせた新しい方法が開発されている。この新しい方法は、FmocAA27-36NH₂の単離に付随する問題と長い乾燥時間を解消する。以下に、詳しく説明する。この新しい方法は、合成工程から、長い乾燥時間と、一段階を排除する。
【０２１８】
磁気撹拌器および窒素供給口を備えた100mLの丸底フラスコに、FmocAA27-35OH（5.0ｇ、１当量）、HOAT（0.459、1.2当量）およびPhe-NH₂（0.389、1.2当量）を導入する。該フラスコに、10容のNMP（50mL）とDIEA（0.45ｇ、1.5当量）を添加し、窒素雰囲気下で、固体が溶解するまで撹拌する。該溶液を０〜５℃に冷却した後、HBTU（1.04ｇ、1.2当量）を添加する。窒素雰囲気下で、０〜５℃にて30分間撹拌する。反応混合物を20℃まで暖め、撹拌を継続する。HBTUを添加してから90分後に、プロセス中検査（IPC）を実施する。
【０２１９】
プロセス中検査（IPC）により、反応の完了が明らかにされた後、反応混合物にピペリジン（1.379、7当量）を添加し、窒素雰囲気下で1.5時間撹拌する。IPCを実施する（注１）。Fmoc除去が完全ではない場合には、さらに30分間撹拌し、IPCを実施する。
【０２２０】
完全であれば、この反応混合物を、温度が35℃を超えないような速度で、５％酢酸水溶液に添加する（30容）。得られたスラリーを１〜２時間撹拌し、減圧濾過により回収する（注２）。その固体を10容（50mL）の水で洗浄する。
【０２２１】
湿った固体を反応器に戻し、20容の水（100mL）を添加し、周囲温度で１〜２時間撹拌する。減圧濾過により固体を回収し、10容の水（50mL）で洗浄した後、乾燥する（注３）。
【０２２２】
乾燥した（注４）固体を、MTBE（20容）を用いて、周囲温度で２〜５時間粉砕することにより、ジベンゾフルベンとジベンゾフルベンピペリジン付加物を除去する。減圧濾過により固体を回収し、恒量まで乾燥する。その結果、4.55g（94.3％）のHAA27-36NH₂が得られ、純度は85〜90Ａ％であった（注１）。
【０２２３】
Fmoc副産物（ジベンゾフルベンおよびそのピペリジン付加物）は、一般に、このプロトコルで除去されるが、再処理が必要な場合には、10容のMTBE中の固体を20℃で２〜３時間撹拌し、回収および乾燥する。
【０２２４】
注：
１．逆相HPLCによるプロセス中検査（IPC）：
カラム：Vydac C8、300A、５μ、30℃
流量：１mL／分
検出：262nmのＵＶ
移動相：Ａ．水／0.1％TFA
Ｂ．アセトニトリル／0.1%TFA
方法：20分間にわたり、80〜99％Ｂ
保持時間：FmocAA27-36NH₂（16.5分、HAA27-36NH₂（8.4分）
２．合計濾過時間は10分であった。
【０２２５】
３．湿ったフィルターケークは反応器に戻し、直ちに水で洗浄することにより、固体の油状化またはゴム質化を防がなければならない。
【０２２６】
４．MTBE粉砕によるジベンゾフルベン副産物の除去を確実にするため、粗生成物は、完全に乾燥させなければならない。
【０２２７】
11．７ FmocAA(17-26)-OH と HAA(27-36)-OH の液相合成融合によるフラグメント FmocAA(17-36)-OH の大規模製造
４回の実施で、2.993kgのHAA27-36NH₂と3.176kgのFmocAA17-26OHから、合計5.115kgのFmocAA17-36NH₂を製造した。平均収率は84.3％であった。反応混合物からの水ドロップアウト（dropout）後の粗生成物の濾過には、平均40〜50分かかった。
【０２２８】
カップリング反応を実施する前に、使用されるHBTUおよびフラグメントの両方を試験する使用試験を１〜２ｇスケールで行う。使用試験から、出発物質および試薬の計算量を決定する。使用試験では、出発物質の可溶性も記録した。濁りのある溶液は、FmocAA17-26OH中の塩の存在を示し、該フラグメントの水洗浄の根拠となるものである。ラセミ化および副産物の生成が最小限であるように出発物を完全に生成物に転化させるようにするため、HBTUの添加前に、反応混合物の全成分が、明らかに溶液中に存在していなければならない。
【０２２９】
水ドロップアウトから単離した粗FmocAA17-36NH₂の純度を、IPAからの沈殿により大幅に増加させる。FmocAA17-36NH₂は、IPAに部分的に可溶性である。予め60〜70℃に保温した約15容の95／５のIPA／水を用いて、FmocAA17-36NH₂を粉砕した後、撹拌しながら、数時間にわたり室温に冷却し、フラグメントの純度を高める。出発物質、ならびに、FmocAA17-26OHのピペリジンアミドおよびHAA27-36NH₂のエナミン尿素付加物は共に、95％IPAに可溶性である。室温で95％IPAを用いた粗FmocAA17-36NH2の粉砕にかける時間を延長しても、不純物の除去にはそれほど効果的ではない。60〜70℃での安定性試験を完了した。IPA溶液を52℃を上回る温度に加熱しない場合、単離した生成物の品質に及ぼす影響が最小限に抑えられるようだ。
【０２３０】
11．７．１ FmocAA(17-26)OH と HAA(27-36)-OH の液相合成融合によるフラグメント FmocAA(17-26)-OH の改良された大規模製造の好ましい方法
撹拌機と窒素供給口を備えた40Ｌのジャケット付き反応器に、FmocAA17-26OH（１当量、0.770kg）、HAA27-36NH₂（１当量、0.720kg）、HOAT（1.5当量）およびDMF（FmocAA17-26OHに対して12.5容）を導入する。EtPr₂N（1.5当量）を添加し、この懸濁液を、室温で、固体が溶解するまで（見た目で）撹拌する。この溶液を窒素雰囲気下で０〜５℃に冷却した後、HBTU（１〜1.05当量）を添加する。この反応混合物を、０〜５℃で、HBTUが溶解するまで（見た目で、約15分間））撹拌する。反応混合物を25℃に温め、２時間撹拌を継続する（注１）。DMF溶液を０〜５℃に冷却した後、25℃を超えないような速度で、低温のプロセス水（12.5容）を添加する。得られたスラリーを１〜24時間撹拌し、固体を減圧濾過により回収した後、水で洗浄する（３ｘ４容）。該固体をフィルター上で16〜24時間乾燥させ、理論質量の２倍にする。40Ｌ反応器に、95／５のイソプロパノール／水（25容）を導入し、45℃に温める。急速に撹拌しながら、半乾燥状態のFmocAA17-36NH₂をIPA溶液に添加する。この懸濁液を52℃に温めた後、12〜16時間撹拌しながら、室温まで冷却させる（注２）。固体を減圧濾過により回収した後、最小量のIPAで洗浄して、乾燥し、1.261kgのFmocAA17-36NH₂を得た。収率は、85％、HPLCによる純度は90.SA％であった（注１）。95／５のIPA／水粉砕を繰り返すことにより、反応を再実施してもよい。
【０２３１】
注：
１．プロセス中検査および純度、HPLC：
Vydac C8、５μ、300A
１mL／分、262nm、30℃
Ａ．水／0.1％TFA
Ｂ．80／20 IPA／ACN／0.1％TFA
60〜95％Ｂ／20分
保持時間：HAA27-36NH₂、6.73分
FmocAA17-26OH、10.67分
FmocAA17-36NH₂、20.2分、
２．FmocAA17-36NH₂は、この温度では、この容量中に完全に溶解しない。固体を回収する前に、撹拌を停止し、固体を沈降させる。濾液のサンプルを採取し、HPLCにより分析する。濾液が多量のFmocAA17-36NH₂を含んでいる場合には、固体を回収する前に０℃まで冷却する。
【０２３２】
11．８ FmocAA(17-36)-OH からのフラグメント HAA(17-36)-OH の大規模製造
４回の実施で、5.112kgのFmocAA17-36NH₂から、合計4.965kgのHAA17-36NH₂を製造した。単離した収率およびHPLCトレースはどちらも、ジベンゾフルベン、および恐らくは溶媒の存在を示している。存在するジベンゾフルベンは、ピペリジンではなく、炭酸カリウムで除去するため、次のカップリング反応を妨害しない。従って、ジベンゾフルベンのピペリジン付加物は、化学的には問題ではない。
【０２３３】
この方法には、いくつかの問題が付随する。この反応は、12容のDMF中で実施する。Fmoc基を除去する基剤は、１容の1.1Ｍ炭酸カリウムであり、これは、除去が困難な、ジベンゾフルベンとの塩基性付加物を生成することはできない。脱保護は、室温で、約90分間進行させる。
【０２３４】
予め０℃に冷却した１：１で飽和した塩化ナトリウム：水-水溶液を添加し、フラグメントとジベンゾフルベンを共沈殿させる。これによって、濾過するのに数（５〜８）時間を要して、微細な乳白色の固体が生成された。単離した後、湿った固体を完全に乾燥させて（１％LOD未満）、ジベンゾフルベン不純物を除去しなければならない。乾燥には10日間かける（減圧、加熱なし）。乾燥したら、固体を反応器に戻し、３：１のヘプタン：MTBE（20容）を用いて、周囲温度で18時間粉砕することにより、ジベンゾフルベンを除去する。これより粉砕時間が短いと、ジベンゾフルベンを完全に除去することはできず、また、固体に水が少しでも存在すると、除去することができない。ジベンゾフルベンが残っている場合には、３：１のヘプタン：MTBE（20容）による再処理を実施することができる。
【０２３５】
これらの問題を解決するために、次のような新しい方法が開発された。FmocAA17-36NH₂（2.0ｇ、１当量）およびヘプタン（８容）を、撹拌機、温度調節器および還流コンデンサーを備えた100mLの丸底フラスコに添加する。２容のMTBE（４mL）を添加し、該スラリーを45〜50℃に加熱する（注１）。ピペリジン（1 0当量）を添加する。窒素雰囲気下で、45〜50℃にて24〜36時間撹拌する（注２）。反応混合物を45〜50℃で、保温濾過し（注３）、次に、５容（10mL）の60：40のヘプタン：MTBEで、ケークを洗浄する。
【０２３６】
注：
１．MTBEが反応器から漏れ、そのために、ヘプタン：MTBE比が変化するようなことがある場合には、反応が遅くなる恐れがある。反応温度が50℃を超える場合には、反応固体のゴム質化が起こる可能性がある。Fmocは、５時間で大部分が除去される。
【０２３７】
２．反応の完了は、RP-HPLCにより監視する：

保温濾過は、ジベンゾフルベンのピペリジン付加物の除去に役立つ。
【０２３８】
11．８．１ FmocAA(17-36)-OH からのフラグメント HAA(17-36)-OH の大規模製造
40Ｌのジャケット付き反応器に、FmocAA17-36NH₂（１当量、1.26kg）およびDMF（12容）を室温で導入する。1.11Ｍ炭酸カリウム水溶液（１容、５当量）を一度に添加する（注１）。この反応混合物を、室温で、3.5時間撹拌する（注２）。反応混合物を、予め０℃に冷却した飽和塩化ナトリウム／水（10容）の１：１水溶液に徐々に添加するが、その速度は、温度10℃を超えないようなものとする（約１〜２時間）。ラバーダム（rubber dam）を用いて、固体を減圧濾過により回収し、フィルターケークから水を圧搾する（注３）。湿ったケークを反応容器に戻し、水（10容）を用いて１〜２時間粉砕（撹拌）し、残留する無機塩を除去する。固体を減圧濾過により回収し、ラバーダムで圧縮して、減圧オーブンに移し、恒量まで乾燥させる。乾燥した固体（注４）を、３：１のヘプタン：MTBE（20容）で、室温にて最低14時間粉砕（撹拌）し、ジベンゾフルベンを除去する。固体を減圧濾過により回収した後、ヘプタン（２容）で洗浄して、乾燥し、1.20kgのHAA17-36NH₂を得た。収率は、99.5％、純度は75Ａ％であった。このHAA17-36NH₂は、５Ａ％ジベンゾフルベンを含有していた。へプタン：MTBE粉砕を繰り返すことにより、反応を再実施する。
【０２３９】
注：
１．炭酸カリウム水溶液を添加すると、溶液は濁るが、撹拌を続けると透明になる。
【０２４０】
４〜５℃の発熱量を記録した。
【０２４１】
２．IPCおよび純度測定のために用いたHPLC：
Vydac C8、260nm
１mL／分、262nm、30℃
Ａ．水／0.1％TFA
Ｂ．80／20 IPA／アセトニトリル／0.1％TFA
60〜95％Ｂ／30分
３．微細な粒子サイズの生成物が沈殿するため、濾過が遅くなる。
【０２４２】
４．ヘプタンが、ジベンゾフルベンを効果的に除去するように、この物質は無水でなければならない。
【０２４３】
11．９ AcAA(1-16)-OH および FmocAA(17-36)-OH からの液相合成によるフラグメント AcAA(1-36)-OH の大規模製造
AcAA1-16-OHを、HOATおよびDIEAと共に、DMFに溶解して０℃に冷却した後、HBTUを添加した。これを15分間、もしくはHBTUが溶解するまで撹拌し、HAA17-36NH₂を添加する。HAA17-36NH₂の不在におけるAcAA1-16-OHの前活性化は、予備措置であったが、後に必要がないことがわかった。さらに、活性化AcAA1-16-OHを含む０℃のDMF溶液へのHAA17-36NH₂の溶解は、規模が大きくなると、遅くなることが証明された。
【０２４４】
４回の実施で、3.92kgのAcAA1-16-OHと、4.96kgのHAA17-36NH₂から、合計6.972kｇのAcAA1-36NH₂を製造したが、平均収率は80.1％であった。この段階での２回の実施の平均収率は、87％であり、２回の実施の平均収率は、73％であった。
【０２４５】
カップリング反応を実施する前に、使用されるHBTUおよびフラグメントの両方を試験する使用試験を１〜２ｇスケールで行う。使用試験から、出発物質および試薬の計算量を決定する。また、出発物質の可溶性も使用試験に記録する。濁りのある溶液は、AcAA1-16-OH中の塩の存在を示し、フラグメントの水洗浄の根拠となるものである。ラセミ化および副産物の生成が最小限であるように出発物質を生成物に完全に転化させるためには、HBTUの添加前に、反応混合物の全成分が、明らかに溶液中に存在していなければならない。
【０２４６】
フラグメントAcAA1-16-OHおよびHAA17-36NH₂、ならびに試薬HOATおよびDIEAをDMFに溶解させ、０℃に冷却し、HBTUを添加する。全実施のうち１回は、HAA17-36NH₂に対しHClをピックアップするために、追加当量のDIEAを必要とした。水ドロップアウトにより、反応混合物から粗生成物を単離する（濾過時間、10分）。まだ湿っている固体を、55℃に予め保温したアセトニトリルを含む反応器に戻し、急速に撹拌しながら、３時間かけて35℃まで冷却した後、20℃で一晩放置する。このスラリーを０〜５℃に冷却し、１〜２時間さらに撹拌した後、固体を濾過により回収する。この工程の間に、AcAA1-36NH₂は、55℃で溶液へとほぼ移行した。溶液が冷却するにつれ、AcAA1-36NH₂は、溶液から沈殿していった（油状化した）。溶液が冷却するにつれて、油は凝固し、最終的には、鮮やかな白色の固体へと変化する。この変化の最中に、反応器の壁や撹拌棒上に多量の固体沈殿が生成する可能性がある。これらのほとんどは、スラリーを一晩20℃で撹拌するにつれて取れる。固体を回収した後、反応器に、反応器壁や撹拌棒に付着した固体全てを浸すのに十分な水を充填する。
【０２４７】
壁や撹拌棒から残りの固体がすべて落ちるまで（約１時間）、スラリーを撹拌した後、フィルターケークの洗浄物（wash）として用いる。アセトニトリル洗浄により、未反応の出発物質と、20アミノ酸に満たない切端フラグメントを除去する。
【０２４８】
11．９．１ AcAA(1-16)-OH および FmocAA(17-36)-OH からの液相合成によるフラグメント AcAA(1-36)-OH の好ましい大規模製造
40リットルの反応器に、AcAA1-16-OH（938kg、１当量）、HAA17-36NH₂（1.19kg、１当量）、HOAT（１当量）、DMF（AcAA1-16-OHに対して19容）およびDIEA（１当量）を導入する。このスラリーを、固体が溶解するまで撹拌し、０〜５℃に冷却した後、HBTU（1.03当量）を添加する。この溶液を、０〜５℃で、15分間、もしくは固体が溶解するまで撹拌した後、20℃に保温し、２時間撹拌する。反応混合物から、IPCに付すためのサンプルを採取する（注１）。反応が完全であると判断したら、温度が35℃を超えないような速度で、水（19容）を添加する（注２）。
【０２４９】
得られたスラリーを１〜24時間撹拌し、固体を真空濾過（10分）により回収した後、水で洗浄する（２ｘ３容量）。濾過ケークを圧縮し、水を出来る限り除去する。その間、反応器に、95％アセトニトリル／水（AcAA1-16OHの導入量に対して、30容量）を導入し、撹拌しながら、55℃に保温する。
【０２５０】
湿った固体を、凝集しないように、少しずつ反応器に添加する。スラリーを撹拌しながら、３時間かけて35℃に冷却し、その後、20℃で一晩放置する。０〜５℃に冷却し、２時間撹拌して、撹拌を停止した後、溶液をサンプリングする。
【０２５１】
固体を真空濾過により回収する。反応器および管路を90％アセトニトリル／水（3.6容量）で洗浄する。
【０２５２】
反応器に、反応器壁や撹拌棒に付着した固体を浸すのに十分な量の水を充填する（約30容量）。反応器壁や撹拌棒に付着した固体が落ちるまで、室温で、撹拌する（約１時間）。固体を残り部分と共に回収し、恒量まで乾燥させる（1.83kg、収率86％）。
【０２５３】
90／10のアセトニトリル／水を用いて、固体の摩砕を繰り返す。
【０２５４】
注：
１．ＩＰＣおよび純度、HPLC：
YMC ODS-A、150 x 4.6mm、５μ、120A
１mL／分、260nm、30℃
Ａ．水／0.1％TFA
Ｂ．THF／0.1％TFA
60〜90％Ｂ／30分、90〜95％Ｂ／１分、95％Ｂ／５分
AcAA1-16-OH 6.37分
HAA27-36NH₂ 8.91分
AcAA1-36NH₂ 18.07分、
２．水を添加する間、温度が35℃を超えると、沈殿する固体が融解し、凝集および／または反応器壁への付着を起こす恐れがある。
【０２５５】
11 ． 10 AcAA(1-16)-OH の側鎖の脱保護
この実験の目的は、沈殿物へのMTBEの添加速度を変化させて、温度を20℃以下に維持し、粗T-20固体を単離し、脱炭酸反応させる（すなわち、溶液脱炭酸反応を排除する）ことである。
【０２５６】
HPLCカラムに供給する前の固体として、ACN／水から、沈殿により粗T20を単離した。固体のT20含有率（％）を、重量に基づくHPLC検定により測定した。
【０２５７】
側鎖保護基を、90／５／５のＴＦＡ／水／ジチオトレイトール中で除去した後、溶液を０℃に冷却し、MTBE（AcAA1-36NH₂導入量に対して45容量）を添加する。これは、T20の完全な沈殿を確実にするのに必要なMTBEの最小量である。混合の際に発熱があるため、温度を20℃以下に保持するように、最初の５容量はゆっくりと添加しなければならない（約60分）。さらにMTBEを添加するにつれて、添加速度を高めることができる。沈殿中、温度を20℃以下に維持することにより、固体が溶液から沈殿する際の凝集を防止する。
【０２５８】
上記開裂／精製プロトコルは、クロマトグラフィーによる精製に適合する規模で脱保護を実施することを含む。TFA塩として脱保護混合物から単離した粗T20を、pH５のアセトニトリル／水に溶解させ、濾過し、15時間静置することにより、トリプトファンインドールの脱炭酸反応を実施する。脱炭酸反応が完了した後、溶液を希釈し、精製装置に移して、カラムに供給した。希釈の間、溶液には曇りが生じ、この濁った溶液をポンプによりカラムに供給する。この結果、精製工程中に、固体がカラムのヘッドに付着し、徐々にカラムの性能が低下した。pH5のアセトニトリル／水中で、数時間T-20を脱炭酸反応させると、極めて不溶性の凝集体が形成される。
【０２５９】
溶液中の脱炭酸反応を回避するための方法が開発されている。MTBE沈殿物からTFA塩として単離した粗T-20を、室温で約５〜７日にわたり、減圧下で脱炭酸反応させる。減圧下40℃で、３日のうちに脱炭酸反応の完了が認められた。単離した固体のTFA含有率は、９％であった。材料は、０℃で、１カ月まで、1％重量／重量損失で貯蔵することができる。
【０２６０】
HOAcを用いたエタノール／水（１：９）における塩交換は、MTBEからのT-20-TFAの単離後に実施することができる。粗T-20の酢酸塩は、有意により安定であり、好ましいものであろう。いずれの単離方法でも、側鎖脱保護をこれまでより大きな規模で実施することが可能であり、T-20を、凝集を引き起こすことが知られている脱炭酸反応に使用されるアセトニトリル／水／HOAc条件にさらす必要はない。
【０２６１】
AcAA(1-36)-OH の側鎖の脱保護のための新しい方法：
90／５／５のＴＦＡ／水／ジチオトレイトール溶液（13容量）を作製し、３分間、窒素でパージする。窒素雰囲気下で、周囲温度にて、AcAA1-36NH₂の一部を90／５／５のＴＦＡ／水／ジチオトレイトール溶液（13容量）に添加する。溶液状にしたら、周囲温度にて４時間撹拌し、次に０℃に冷却する。T-20を沈殿させるために、０〜５℃に冷却したMTBE（45容量）を、初めは、温度を20℃以下に維持しながら、遅い速度で滴下しながら添加する（添加時間は、約１〜２時間）。固体を減圧濾過により回収する（注１）。反応器、管路および濾過ケークを直ちに３ｘ５容量のMTBEで洗浄する。固体を除去し、ｔ＝０のIPC（注２）用にサンプルを採取し、５日間、もしくは、HPLCが変化を示さなくなるまで、減圧下で乾燥させる。
【０２６２】
注：
１．脱保護溶液は吸湿性であるため、この濾過の間、固体に空気を通過させないようにする。ＴＦＡ溶液を洗浄する前に固体に空気を通過させると、粘着質または油状の固体が得られる恐れがある。
【０２６３】
２．HPLC方法TM2-0003-01（TFA法）を使用する。酢酸アンモニウム法（TM2-0006-01）では、様々なカルボキシル化中間体を分離できない。
【０２６４】
AcAA(1-36)-OH の側鎖の脱保護
12回の工程で、合計7.226kgのAcAA1-36NH₂を脱保護した。製造した6.972kgのAcAA1-36NH2だけが、中間体が吸湿性であることを示した。MTBEドロップアウトから単離した固体を、10容量の１：１ACN／水に溶解し、濾過した後、炭酸水素ナトリウムでpH3.5に調整した。酢酸（1.5容量％）を添加し（pH4.5〜５）、溶液を周囲温度で15時間撹拌することにより、脱炭酸反応を実施した。溶液を25容量の水で希釈し、合計40容量の85／15の水／ACN溶液を得た。この溶液は、いずれの場合も濁っており、中には、微細な固体（凝集したT-20）を含むものもあった。IPC用のサンプルを採取し、溶液を精製装置に移した。工程あたりの粗T-20の収率を、重量／重量HPLC検定を用いて計算した。
【０２６５】
AcAA1-36NH₂の脱保護は、室温の90／５／５のTFA／水／DTTで、４〜５時間で完了する。８時間後には、顕著な分解（２％）が起こった。５℃の同じ混合物では、脱保護は８時間では完了しないが、23時間で完了する。室温で５時間後に得た粗T-20と、５℃で23時間後に得たものとの間に、純度の差はなかった。単離容量（約55容量）は、反応（脱保護）容量（13容量）よりはるかに大きいため、20Ｌカーボイ中のTFA溶液にAcAA1-36NH₂を溶解させてから、この溶液を40Ｌ反応器に移す必要があった。
【０２６６】
脱保護混合物からの、粗カルボキシル化T-20（TFA塩として）の単離を、MTBEを用いた沈殿により達成する。ペプチドを沈殿させるのに必要なMTBEの量は、脱保護混合物量の３〜４倍である。MTBEを開裂混合物の容量の２倍使用することにより、ペプチドが残留する。
【０２６７】
開裂混合物にMTBEを添加すると、容易に濾過される固体が得られるのに対し、MTBEに開裂混合物を添加すると、濾過が難しい微細な沈殿物が生成する。TFA溶液にMTBEを添加する間、５℃から40〜45℃への温度上昇がある。温度上昇は、単離した粗T-20の純度（187／117、119）に影響を与えない。MTBE添加の間、いくらか固体の凝集が生じた。スラリーを１〜２時間撹拌して、凝集物を破壊した。MTBE添加の間、温度を20℃以下に維持することにより、より均質な固体が生成し、この固体は濾過が容易である（196／31）。MTBEの添加速度は、将来制御されるであろう。窒素雰囲気下での濾過により、粗T-20を回収した。TFAを洗浄する前の濾過中に、湿った空気にさらすと、固体は粘着質になる。TFAを洗浄した後、固体は、空気に対して安定する。
【０２６８】
方法工程：
90／５／５のTFA／水／ジチオトレイトール溶液（13容量）を20Ｌカーボイ中に製造し、窒素で３分間パージする。凝集を防ぐため、AcAA1-36NH₂（650ｇ）を少量ずつ添加する。固体が液状になったら、溶液を70Ｌ反応器に移す。カーボイと管路を最小量の90／５／５のTFA／水／ジチオトレイトールで洗浄する。窒素雰囲気下、周囲温度で溶液を４時間撹拌し、その後、０〜５℃に冷却する。MTBE（45容量）を、内部温度が30℃を超えないような速度で添加する。窒素流の下、減圧濾過により固体を回収する。２ｘ２容量のMTBEで反応器、管路および固体を洗浄し、恒量まで乾燥させる（594ｇ、70Ａ％）。
【０２６９】
固体（594ｇ）を50％ACN／水（AcAA1-36NH₂導入量に対して８容量）に溶解させ、濾過する。50％ACN／水（２容量）で容器と管路を洗浄する。炭酸水素ナトリウムを用いて溶液のpHを3.5〜4.0に調整した後、酢酸（0.18容量）を添加して、pHを4.9にする。溶液を周囲温度で15時間撹拌し（IPC、注１）、１Ｍ炭酸カリウムでpHを９〜9.5に調整する。水（25容量）を添加することにより、溶液を85／15の水／ACNに希釈する。このようにして得られた濁った溶液から、重量/重量HPLC分析用のサンプルを採取し、精製装置に移す。
【０２７０】
注：
１．方法TM2-0003-01
２．方法TM2-0006-01
11 ． 11 HAA(1-36)-OH の精製
精製、凍結乾燥法およびパッケージングを、３段階に分類する：
％wt/wt＝100 − ％不純物 − ％酢酸塩 − ％水 − ％TFA。バッチ中の酢酸塩の含有率は６〜８％であった。
【０２７１】
合計2.08kgのT-20（正味）を6.97kgのAcAA1-36NH₂から単離した。これは、AcAA1-36NH₂からの収率が49.3％であることを示す。クロマトグラフィー精製における平均収率は、55％であった。個々の工程についての収率は、41〜55％までと差があった。最低収率は、カラムまたはポンプの故障により、複数箇所で通過（passes）が生じたためである。一般に、クロマトグラフィーが機能すれば、収率は、50〜55％の範囲である。単離したT-20の純度は93〜95A％であった。
【０２７２】
工程時間を最小限にする目的で、方法を比較するために、精製中、四つの勾配を検定した：
１．15〜22％ACN／60分、330mL／分で、26〜36％ACN／525分。
【０２７３】
２．16〜26％ACN／60分、330mL／分で、26〜40％のACN／525分。
【０２７４】
３．第２トリメリス（Trimeris）勾配。330mL／分で、15〜36％ACN1788分
４．元のトリメリス（Trimeris）勾配20〜23％ACN／１ 12分、330mL／分で、23〜36％ACN／488分。
【０２７５】
20センチメートル（cm）のカラムをアンバークロム(Amberchrom)樹脂（台高さ35cm）で充填した（軸方向圧縮）。500〜700ｇのAcAA1-36NH₂のバッチを脱保護し、溶液中で脱炭酸反応させた。この規模では、約400グラムのペプチド（約75A％T-20）を含有するカラム供給原材料が生成される。原液は、典型的には、曇っており、懸濁した固体を含むこともある。濁った溶液を、15％Ｂを用いて、500mL／分でカラムに供給する。いずれの工程のカラム供給中にも、圧力増大はなかった。流速を330mL／分に減少させ、指示された時間、特定の勾配を実施する。画分を回収し、78％以上のT-20を含有する画分をプールした（100〜110Ｌ）後、水で希釈することにより、アセトニトリル含有率を約15〜20％（約140リットル）にする。カラムを洗浄した後、15％Ｂで平衡させる。T-20含有溶液を、８インチカラムに、900mL／分で送り返す。％Ｂを50％に増加し、T-20をカラムから約25Ｌでフラッシュする。
【０２７６】
溶液を１リットルガラス鐘中で凍結し、凍結乾燥して、粉末にする。単離したT-20は、典型的には、HPLCにより、92〜94Ａ％であり、６〜８％の酢酸塩と３〜４％の水を含有する。
【０２７７】
好ましい方法：
pH9.2で、85／15の水／アセトニトリル（27Ｌ）中のT-20溶液を、500mL／分で、８インチHPLCカラムにポンプ供給した。流速を30分かけて330mL／分に減少させた（５分毎に30〜40mL／分の増加量）。20％Ｂから36％Ｂまでの線状勾配を600分にわたり開始する。吸光度が0.2AUFSを下回るまで、画分を回収する。画分を、含有率について、HPLCにより分析する（注１）。カラムを80％Ｂで900 mL/分にて10分間洗浄し、15％Ｂに戻し、900mL／分で平衡化する。78Ａ％以上のT-20を含有する画分をプールし（113Ｌ）、バッファー（28.2Ｌ）で希釈することにより、アセトニトリル濃度を15〜20％にする。溶液を900mL／分でカラムにポンプ供給する。％Ｂを50％に増加し、T-20を、900mL／分でカラムから約25Ｌ溶出させる。T-20の濃度は、約９〜10mg／mLである。溶液を１リットル凍結乾燥ジャーに移し、凍結させ、凍結乾燥して、収率54.9％、純度94.1Ａ％の216.29ｇのT-20を得る。
【０２７８】
注：
１．画分は、含有率および純度について、HPLCにより分析する。
【０２７９】
YMC ODS-A、150ｘ4.6mm、５μm、120Ａ
１mL／分、220nm、30℃
Ａ 70／30、50mM NH₄OAc @ pH7（NH₄OHで調整する）：ＡＣＮ
Ｂ ５：95 50mM NH₄OAc @ pH7（NH₄OHで調整する）：ＡＣＮ
０〜15％Ｂ／50分、15〜100％Ｂ／２分、100％Ｂ／３分
T-20保持時間、29.0分
11 ． 12 ペプチドの熱安定性
一連の実験を実施して、中間T-20フラグメントの熱安定性を特性評価した。T-20フラグメントを水で飽和させ、濾過した後、密閉容器に導入して、高温に暴露した。いくつかの時点で、サンプルを回収し、HPLC法により分析することによって、純度変化を得た。また、乾燥したT-20フラグメントの安定性は、熱重量分析（TGA）により特性評価した。
【０２８０】
AcAA1-16OHを除くすべてのフラグメントを40℃で３日間乾燥させることができる。80℃で24時間後、２つのフラグメント、すなわちFmocAA27-35OH（３％）とFmocAA27-36NH₂（1.4％）に、ほんのわずかな分解が認められる。フラグメントAcAA1-16OHは、初め97Ａ％の純度であった。40℃で３日間後、93.4Ａ％の純度および乾燥度になった。さらに80℃で24時間後にも、93.9Ａ％を維持した。尚、湿ったAcAA1-16OHは、周囲温度で乾燥させなければならない。
【０２８１】
安定性試験の要点は、フラグメントを、周囲温度ではなく、40℃で乾燥することができるかどうかを決定することであった。この試験から、フラグメントが、40℃の乾燥で安定であることがわかった。これにより、乾燥時間が大幅に短縮されるであろう。
【０２８２】
単離および精製を模倣した様々な溶剤および温度条件の下で、フラグメントAc(1-16)-OH、Fmoc(27-35)-OH、Fmoc(17-26)-OH、Fmoc(27-36)-NH₂、Fmoc(17-36)-NH₂、H(17-36)-NH₂、ならびにAc(1-36)-NH₂の安定性を検定するために設計された試験が完了した。フラグメントはすべて、それらが単離および／または精製された溶剤系において、安定である。尚、安定性はＸで表す。
【０２８３】

本発明は、本明細書に記載した特定の実施形態によって範囲を制限されるわけではない。これらの実施形態は、本発明の個々の態様を示すことを目的とするに過ぎず、機能的に同等の方法および要素は、本発明の範囲内に含まれるものとする。実際に、当業者には、本明細書に記載したもの以外にも、本発明の様々な変更が、これまでの説明および添付の図面から明らかとなるであろう。このような変更は、添付した請求の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1：T-20の4断片アプローチ。この図面は、上記表2中に示される、中間体ペプチド断片グループ6から出発して全長T-20を合成するための、下記第9.1節に示される実施例に従うスキームを示す。
【図２】 図2：T-20の4断片アプローチ、第２経路。この図面は、全長T-20を合成するための、上記表2に示されるペプチド中間体グループ6を結合させる追加的な4断片スキームを示す。
【図３】 図3：T-20の3断片アプローチ。この図面は、全長T-20を合成するための、下記第9.1節に示される実施例に従うスキームを示す。
【図４】 図4：T-20の3断片アプローチ、第２経路。この図面は、全長T-20を合成するための、下記第9.2、9.3、9.4及び9.5節に示される実施例に従うスキームを示す。
【図５】 図5：T-20の2断片アプローチ。この図面は、全長T-20を合成するための、上記表2に示されるペプチド中間体グループ18を結合させるスキームを示す。[0001]
1.Introduction
The present invention first relates to a method for the synthesis of peptides, in particular T-20 (also referred to as “DP-178”; SEQ ID NO: 1) and T-20-like peptides. In this method, a specific peptide fragment group is synthesized using solid phase and liquid phase synthesis methods, and these are combined to obtain a target peptide. The present invention further relates to individual peptide fragments useful as intermediates in the synthesis of a peptide of interest (eg, T-20). The present invention further relates to a group of said peptide intermediate fragments that can be used together to produce full-length T-20 and T-20-like peptides. The present invention further relates to methods for purifying peptides, in particular T-20 and T-20-like peptides, and individual peptide fragments useful as intermediates in the synthesis of the desired peptide.
[0002]
2.background
In recent years, a number of peptides have been identified that exhibit the ability to suppress phenomena associated with fusion and, more importantly, also exhibit potent antiviral activity. See, for example, US Pat. Nos. 5,464,933; 5,656,480 and International Publication No. WO96 / 19495T-20. Since these peptides are widely used as therapeutic agents, there is an increasing demand for, for example, the ability to synthesize on a large scale.
[0003]
Techniques for peptide synthesis (eg, Mergler et al., 1988, Tetrahedron Letters 29: 4005-4008; Mergler et al., 1988, Tetrahedron Letters 29: 4009-4012; Kamber et al. (Edit), “Peptides, Chemistry and Biology (Peptides Chemistry and Biology), ESCOM, Leiden, 1992, 525-526; and Riniker et al., 1993, Tetrahedron Letters 49: 9307-9320)), but T-20 and T-20 like peptides There is currently no technology available for large-scale and economical production of easily purified peptides such as
[0004]
3.Summary of the Invention
The present invention first relates to a method for the synthesis of peptides, in particular T-20 (also referred to as “DP-178”; SEQ ID NO: 1) and T-20-like peptides. In this method, a specific peptide fragment group is synthesized using solid phase and liquid phase synthesis methods, and these are combined to obtain a target peptide. In general, the method of the invention synthesizes specific peptide fragment intermediates in which the side chain of a T-20 or T-20-like peptide on a solid support is protected and binds the protected fragment in solution. Forming a protected T-20 or T-20-like peptide and then deprotecting the side chain to obtain the final T-20 or T-20-like peptide. A preferred embodiment of the invention relates to the synthesis of a T-20 peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
[0005]
The present invention further relates to individual peptide fragments useful as intermediates in the synthesis of peptides of interest (eg, T-20). The peptide fragments of the present invention include, but are not limited to, those having the amino acid sequences shown in Table 1 below.
[0006]
[Table 1]

The invention further relates to a specific group of peptide fragments useful as intermediates in the synthesis of peptides of interest. Examples of the peptide fragment group of the present invention include groups 1 to 20 specified in Table 2 below.
[0007]
[Table 2]

In part, the present invention enables the production of high-efficiency, high-yield, high-purity T-20 and T-20-like peptides only in a specific combination of solid-phase liquid-phase synthesis reactions. Based on our unexpected discovery. In particular, according to the method of the present invention, T-20 and T-20-like peptides can be synthesized on a scale of 1 kilogram or more. By selecting specific T-20 peptide fragments of the present invention for solid phase synthesis, the high efficiency coupling (coupling) of solid phase technology can result in a 3-, 4- or 5-fold excess of amino acids and It has been found that it can be utilized without the need to use reagents normally required for solid phase synthesis. In the method of the present invention, only about 1.5 times as many amino acids are used in the solid phase synthesis of the peptide fragment of the present invention. This cost reduction in the amount of amino acids and reagents makes the method of the invention suitable for large scale synthesis of T-20 and T-20-like peptides.
[0008]
Furthermore, the inventors have surprisingly found that certain peptide fragments can be synthesized on solid phase with a loading of about 0.8-1 mmol / g (solid phase resin). This loading is significantly higher than the loading range of 0.25 to 0.4 mmol / g (resin) commonly achieved in solid phase peptide synthesis. Furthermore, the present inventors have found that synthesizing a predetermined peptide fragment in a solid phase using a super acid sensitive resin results in an abnormally high purity peptide fragment. Chromatographic techniques are not necessary to purify the peptide fragments produced according to the present invention; the fragments are simply subjected to a precipitation and / or trituration step prior to use or left directly obtained from the resin. use. By using a super acid sensitive resin, the synthesized protected peptide of the present invention can be cleaved from the resin without simultaneous removal of side chain protecting groups. This reduces impurities and makes it possible to synthesize peptides containing 10 or more amino acids with high purity. By binding the high purity peptide fragments produced by the present invention, the impurity profiles of T-20 and T-20-like peptides synthesized in the liquid phase according to the method of the present invention are mainly related closely. Rather than the body, it consists of unbound fragments. Thus, T-20 and T-20-like peptides produced by the present invention are much easier to purify than those produced by the prior art. The examples shown in Sections 9 and 11 below demonstrate such combinatorial synthesis of T-20 full-length peptides. The examples shown in Section 11 demonstrate large-scale synthesis and purification of T-20 and T-20 intermediate peptides. Therefore, according to the method of the present invention, T-20 and T-20 peptide intermediates can be produced on a scale of 1 kilogram or more.
[0009]
The inventors also unexpectedly allow peptides such as T-20 and other T-20-like peptides, as well as certain peptide fragments described herein, to be used in the basic pH range. It has been found that it can be refined using high capacity materials. That is, the present invention further relates to a method for purifying peptides, particularly T-20 and T-20-like peptides, and individual peptide fragments useful as intermediates in the synthesis of the target peptide.
[0010]
3.1Definition
As used herein, the amino acid notation is conventional and is as follows:

4).Brief Description of Drawings
(See below for a brief description of the drawings)
5.Detailed Description of the Invention
5.1Full-length peptide
The present invention relates to methods, peptide fragments, and groups of peptide fragments that can be used to synthesize peptides known as T-20 or DP-178. T-20 is HIV-1_LAIA peptide corresponding to amino acid residues 638-673 of the isolated transmembrane protein gp41, which has a 36 amino acid sequence (amino NH₂Read from end to carboxy COOH end):
NH₂−YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF−COOH
It will be appreciated that the methods, fragments and fragment groups of the invention, and techniques utilized for selection of fragments and fragment groups can be used to synthesize T-20-like fragments in addition to T-20. Let's go. As used herein, the phrase “like T-20” refers to US Pat. Nos. 5,464,933; 5,656,480 or International Publication No. WO96 / 19495, each incorporated herein by reference in its entirety. Means any HIV or non-HIV peptide listed.
[0011]
In addition to the T-20 and T-20-like peptides described above, the methods, fragments and fragment groups of the present invention can be used to synthesize peptides with modified amino and / or carboxyl termini. Taking T-20 as an example, the peptide has the formula:
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
Wherein X is an amino group; a hydrophobic group selected from the group consisting of carbobenzoxyl, dansyl, and t-butyloxycarbonyl; an acetyl group; a 9-fluorenyl-methoxy-carbonyl (FMOC) group; or a lipid -Represents a macromolecular carrier group selected from the group consisting of fatty acid conjugates, polyethylene glycols and carbohydrates; and Z is a carboxyl group; an amide group; a t-butyloxycarbonyl group; a p-nitrobenzyl ester group; or a lipid -Represents a macromolecular carrier group selected from the group consisting of fatty acid conjugates, polyethylene glycols and carbohydrates). Techniques for adding the “X” and “Z” groups are well known to those skilled in the art.
[0012]
In a preferred embodiment, the method of the invention is used to synthesize peptides where X is an acetyl group and Z is an amide group in the above formula. The examples shown in Section 9 below demonstrate the successful synthesis of T-20 peptides by conjugation of peptide intermediates described in Section 5.2 below. In preferred methods, T-20 and T-20-like peptides and intermediates include, but are not limited to, zirconium-based fillers, polystyrene, polyacrylic or other polymer systems that are stable in the high (greater than 7) pH range. It can be purified using non-silica based fillers (to maximize loading capacity) including fillers. For example, non-silica-based column fillers that exhibit a broad pH range contain higher pH values than those sold by Tosohaus (Montgomeryville, PA). Columns packed with the material operate with low, medium or high pressure chromatography. For example, see the purification method shown in Section 10 below.
[0013]
5.2Peptide intermediate
The present invention includes, but is not limited to, peptide fragment intermediates of T-20 and T-20-like peptides having the specific amino acid sequences listed in Table 1 above, and peptide fragment intermediates listed in Table 2 Includes groups. The peptide intermediates, particularly those included in the groups listed in Table 2 below, can be used to produce T-20 and T-20-like peptides.
[0014]
Any one or more of the side chains of the amino acid residues of the peptide fragments listed in Table 1 or 2 are standards such as t-butyl (t-Bu), trityl (trt) and t-butyloxycarbonyl (Boc). Can be protected by a protective group. The t-Bu group is the preferred side chain protecting group for amino acid residues Tyr (Y), Thr (T), Ser (S) and Asp (D); the trt group is the amino acid residue His (H), Gln Preferred side chain protecting groups for (Q) and Asn (N); the Boc group is the preferred side chain protecting group for amino acid residues Lys (K) and Trp (W).
[0015]
During the synthesis of fragments 1, 2, 3 and 4 listed in Table 1, the side chain of the histidine residue should preferably be protected by a trityl (trt) protecting group. If it is not protected, the acid used to cleave the peptide fragment from the resin will react detrimentally with histidine residues, causing degradation of the peptide fragment.
[0016]
The glutamine residue of the peptide fragment of the present invention is preferably protected by a trityl (trt) group. However, it is preferred not to protect the glutamine residue at the carboxyl terminus of fragments 1-16 and 9-16. In the absence of a protecting group on the carboxy terminal glutamine residue of the 1-16 fragment, the reaction between the 1-16 fragment and the 17-36 fragment is facilitated, and the fragments are separated from each other with only about 2% racemization. It turns out that they can be combined. Further, if lower solubility of any peptide fragment of the invention in an organic solvent is desired, the trityl protecting group can be removed from any one or more other glutamine residues of the fragment.
[0017]
All asparagine residues of each peptide fragment of the present invention are preferably protected. Furthermore, the tryptophan residue is preferably protected by a Boc group.
[0018]
Protected peptide fragments according to peptide formulas 1-18 listed in Table 1 above include, but are not limited to, the compounds listed in Table 3 below.
[0019]
[Table 3]

Any one or more side chains of the amino acid residues of the peptides listed in Table 3 above can be protected by standard side chain protecting groups such as tBu, trt and Boc as described above. Representative syntheses of the peptides in Table 3 are shown below in Sections 7 and 8, where the general techniques described in Section 5.4 below are used.
[0020]
5.3Peptide synthesis
As noted above, some of the individual peptide fragments of the present invention are preferably made using solid phase synthesis methods, while other peptides of the present invention use a combination of solid phase and liquid phase synthesis methods. Preferably, the synthesis is completed with the production of a T-20 or T-20-like peptide as described herein. However, it will be understood that the peptide fragments of the present invention can be synthesized or produced by techniques well known in the art. See, for example, Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, which is incorporated herein by reference in its entirety.
[0021]
Alternatively, the peptides of the present invention can be synthesized such that one or more bonds linking the amino acid residues of the peptide are non-peptide bonds. These other non-peptide bonds can be formed by utilizing reactions well known to those skilled in the art and include, but are not limited to, imino, ester, hydrazide, semicarbazide, and azo bonds, to name a few. Can be mentioned.
[0022]
In yet another embodiment of the invention, a T-20 and T-20-like peptide comprising the above sequence is a peptide amino acid such that, for example, the stability, reactivity and / or solubility of the peptide is enhanced. And / or by additional chemical groups present at the carboxy terminus. For example, hydrophobic groups such as carbobenzoxyl, dansyl, acetyl or t-butyloxycarbonyl groups can be added to the amino terminus of the peptide. Similarly, an acetyl group or 9-fluoroenylmethoxy-carbonyl group can be placed at the amino terminus of the peptide. (See the "X" modification of T-20 above.) In addition, a hydrophobic group, t-butyloxycarbonyl, or amide group can be added to the carboxy terminus of the peptide. Similarly, a p-nitrobenzyl ester group can be placed at the carboxy terminus of the peptide. (See the “Z” modification of T-20 above.) Techniques for introducing such modifications are well known to those skilled in the art.
[0023]
Furthermore, T-20 and T-20-like peptides can be synthesized such that their configuration changes. For example, the D-isomer rather than the normal L-isomer of one or more amino acid residues of the peptide can be used.
[0024]
Furthermore, at least one amino acid residue of the peptides of the invention can be replaced by one of the well-known non-naturally occurring amino acid residues. Changes such as these can serve to increase the stability, reactivity and / or solubility of the peptides of the invention.
[0025]
Either T-20 or T-20-like peptides can be synthesized with an additional macromolecular carrier group covalently linked to their amino and / or carboxy termini. Such macromolecular carrier groups include, for example, lipid-fatty acid conjugates, polyethylene glycols, carbohydrates or additional peptides. Thus, the “X” modification of T-20 above can additionally indicate any of the above macromolecular carrier groups covalently linked to the amino terminus of the peptide, preferably with an additional peptide group. is there. Similarly, the “Z” modification of T-20 above can additionally indicate any of the macromolecular carrier groups described above.
[0026]
The peptide fragments of the present invention are preferably synthesized by solid phase peptide synthesis (SPPS) methods using standard FMOC protocols. See, for example, Carpino et al., 1970, J. Am. Chem. Soc. 92 (19): 5748-5749; Carpino et al., 1972, J. Org. Chem. 37 (22): 3404-3409. In a preferred embodiment, solid phase synthesis of peptide fragments of the invention is not limited to the following, see 2-chlorotrityl chloride resin (see, eg, Barlos et al., 1989, Tetrahedron Letters 30 (30): 3943-3946). And 4-hydroxymethyl-3-methoxyphenoxybutyric acid resin (eg, Seiber, 1987, Tetrahedron Letters 28 (49): 6147-6150, and Richter et al., 1994, Tetrahedron Letters 35 (27): 4705-4706. See super-acid sensitive solid phase support. Both 2-chlorotrityl chloride resin and 4-hydroxymethyl-3-methoxyphenoxybutyric acid resin can be purchased from Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA.
[0027]
General manufacturing processes and resin loadings available for solid phase peptide synthesis are described herein. The resin can be loaded, for example, by the following method: A resin, preferably a superacid sensitive resin such as 2-chlorotrityl resin, is loaded into the reaction chamber. The resin is washed with a chlorinated solvent such as dichloromethane (DCM). The bed liquid is brained and a solution consisting of 1.5 equivalents of amino acid and 2.7 equivalents of diisopropylethylamine (DIEA) in about 8-10 volumes of dichloroethane (DCE) is added. The N-terminus of the amino acid should be protected, preferably by Fmoc, and the side chain of the amino acid should be protected if necessary or appropriate. The mixture is stirred for 2 hours with nitrogen bubbling.
[0028]
It should be noted that a chlorinated solvent is required to moderately swell the 2-chlorotrityl resin. According to the literature, DCE gives higher loading efficiency, but DCM can be replaced with little or no loading reduction.
[0029]
After stirring, drain the bed liquid and wash with DCM. The active site of the resin is endcapped with a 9: 1 MeOH: DIEA solution for about 20-30 minutes. Drain the bed liquid, wash 4 times with DCM, and dry by nitrogen purge to obtain the loaded resin.
[0030]
Fmoc is a preferred protecting group for the N-terminus of amino acids. Depending on which amino acid is loaded, the side chain may or may not be protected. For example, when Trp is loaded, its side chain should be protected with Boc. Similarly, the side chain of Gln can be protected with trt. However, when Gln is loaded in a preparation for the synthesis of 1-16 peptide fragments, its side chain should not be protected. The side chain of Leu does not need to be protected.
[0031]
Fmoc protected amino acids used in resin loading and peptide synthesis can be obtained from Sean or Genzyme with or without side chain protecting groups as required. As an alternative to the above steps, a resin already loaded with the appropriate amino acid can be purchased.
[0032]
The examples shown in Section 6 below describe typical resin preparations.
[0033]
The solid phase peptide synthesis method can be performed, for example, according to the following method: The charged resin is added to the reaction chamber, and nitrogen is stirred in a solvent, preferably methylene chloride (DCM; preferably about 10 times volume), Adjust for about 15 minutes to swell the resin beads. DCM is required to adequately swell the 2-chlorotrityl resin. The resin volume will double or triple in the reaction chamber as the beads swell and the active site becomes unfolded and available for reaction. After the resin swells, the solvent is drained from the reaction chamber.
[0034]
Removal of the Fmoc (9-fluroenyl-methyloxycarbonyl) protecting group from the terminal amine or resin can be accomplished by aliquoting the resin twice with 20% solutions of piperidine in N-methyl-2-pyrrolidinone (NMP), about 10 each. Achieved by processing for minutes. The volume of 20% piperidine in NMP solution required for each aliquot will depend on the scale of the reaction being performed. The resin is then washed 5-7 times with aliquots of NMP (approximately 10 volumes) to remove the Fmoc byproduct (ie, dibenzofulvene and its piperidine adduct) and any remaining piperidine.
[0035]
The chloranil test can be used to determine if removal of the Fmoc byproduct and remaining piperidine is complete. A chloranil test solution is prepared by adding a drop of a saturated solution of chloranil in toluene to about 1 mL of acetone. NMP cleaning can be tested by adding a droplet of the cleaning solution to the chloranil test solution. Blue or purple indicates positive for the presence of secondary amine and indicates that Fmoc by-product and / or remaining piperidine is still present. The NMP wash is repeated until a blue or purple color is no longer observed.
[0036]
On the other hand, the next amino acid in the sequence added to the resin has its carboxy terminus activated for reaction. The amine terminus of each amino acid should be protected with Fmoc. Depending on which amino acid is added, the side chain may or may not be protected. Preferably, the side chains of tyr (Y), Thr (T), Ser (S) and Asp (P) are protected with t-Bu and the side chains of His (H), Gln (Q) and Asn (N) Is protected with trt and the side chains of Lys (K) and Trp (W) are protected with Boc. However, as discussed above, the His side chain must be protected. Furthermore, it is preferred that the side chain of the Gln residue at the carboxy terminus of fragments 1-16 and 9-16 is not protected. The side chain of Leu or Ile need not be protected.
[0037]
Amino acids are activated as follows. Fmoc protected amino acid (1.5 eq), 1-hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) (1.5 eq), and diisopropyl-ethylamine (DIEA) (1.5 eq) are dissolved in NMP (approximately 7.5 volumes) at room temperature. The solution was cooled to 0-5 ° C. and then O-benzotriazol-1-yl-N, N, N ′, N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) (1.5 eq) was added. Then, stir for 5-15 minutes to dissolve. It is important that activation be performed at low temperatures to minimize amino acid racemization. Since activation and racemization do not occur in the absence of HBTU, HBTU is the last reagent added to the cold solution.
[0038]
The activated amino acid solution is loaded onto the resin that drained the liquid and washed with DCM (approximately 2.5 volumes). It should be noted that amino acid activation is performed in NMP because HBTU is insoluble in DCM. However, DCM is added to the reaction at this point to maintain proper swelling of the resin beads. The reaction is stirred for about 1 hour with nitrogen bubbling. The completion of binding can be monitored with the qualitative ninhydrin test described below.
[0039]
To confirm the completion of the reaction using the qualitative ninhydrin test, collect a 2-20 mg resin sample and cleanly wash with methanol. To this sample, add 3 drops of 76% phenol in ethanol, 4 or 5 drops of 0.2 mM KCN in pyridine, and 3 drops of 0.28 M ninhydrin in ethanol. The sample is diluted with ethanol to a volume of about 0.5 mL and placed in a heating block at about 75 ° C. for 5-10 minutes. Blue or purple indicates positive for the presence of free amine, indicating that the reaction is not yet complete. To more easily determine the degree of discoloration in the concentrated sample, the sample is further diluted to a volume of about 3 mL.
[0040]
If the ninhydrin test is positive after 1 hour, continue the binding reaction for an additional hour. If the ninhydrin test continues to be positive after 2 hours, drain the resin liquid, wash 3 times with about 10 volumes of NMP, and repeat the binding reaction with 1 equivalent of activated amino acid.
[0041]
If the resin should be stored overnight during the binding cycle, the resin bed liquid can be drained and coated with DCM under a nitrogen blanket. Alternatively, the bed liquid is drained and stored under a nitrogen blanket and then adjusted with a DCM wash before proceeding with the next binding cycle. If the resulting fragment should be stored overnight before cleaving, significant Fmoc deprotection occurs in NMP, so the resin bed should be washed with DCM to remove NMP.
[0042]
After determining the binding is complete, drain the resin liquid and wash three times with NMP aliquots (approximately 10 volumes). This cycle is repeated for the next amino acid bond (mer) of the peptide fragment. Following the final binding reaction, the resin is washed 4 times with an aliquot of NMP (approximately 10 volumes) and then 4 times with an aliquot of DCM (approximately 10 volumes). The resin bound peptide can be dried by nitrogen purge.
[0043]
Peptides synthesized by solid phase synthesis can be cleaved and isolated, for example, according to the following methods: Peptides can be cleaved from the resin using methods well known to those skilled in the art. For example, peptides can be cleaved using a combination of 1% or 2% DCM in trifluoroacetic acid (TFA) or 1% and 2% DCM in TFA. Acetic acid (HOAC) can also be used for peptide cleavage. The specific cleavage reagent, solvent and time required for cleavage will depend on the particular peptide being cleaved. After cleavage, the cleaved fraction is subjected to standard post-processing steps to isolate the peptide. In general, the combined cut fractions are concentrated under reduced pressure and then reconstitution with a solvent such as ethanol, methanol or heptane. In general, the peptide is precipitated by adding water and recovered by vacuum filtration. Alternatively, the product can be ground prior to peptide isolation.
[0044]
The examples shown in Sections 7.1-7.6 below show solid phase synthesis of the peptide intermediates shown in Tables 1, 2 and / or 3.
[0045]
For the synthesis of full-length T-20 peptide, the peptide intermediates in Table 1 above can be joined together to give the T-20 peptide. For example, the group of peptide intermediates listed in Table 2 above can be linked together to produce the full-length peptide of T-20. A representative example of such synthesis of full-length T-20 from an intermediate peptide fragment is shown in Section 9 below and is schematically described in FIGS.
[0046]
In certain embodiments, a four fragment approach of T-20 synthesis can be followed. For example, a “four-fragment approach” synthesis is a T-20 synthesis scheme up to a full-length T-20 peptide, starting with four T-20 intermediate peptide fragments synthesized and bound using solid and liquid phase synthesis methods. Say. Intermediate peptide fragment groups 5, 6, 8, 9 and 12-15 shown in Table 2 above represent preferred groups. FIG. 1 and FIG. 2 show two four-fragment approaches utilizing peptide intermediate group 6 of Table 2 to synthesize full-length T-20. Note that for this group, amino acid residue 36 (T-20 carboxy 1-terminal amino acid residue) is individually introduced during the fragment binding process. The culmination of the T-20 synthesis scheme shown in FIG. 1 is demonstrated in the examples shown in Section 9.1.
[0047]
Furthermore, an embodiment, a three-fragment approach for T-20 synthesis can be followed. “Three-fragment approach” synthesis refers to a T-20 synthesis scheme up to the full-length T-20 peptide, starting with three T-20 intermediate peptide fragments synthesized and bound using solid and liquid phase synthesis methods. . Intermediate fragment groups 2-4, 7, 10, and 11 shown in Table 2 above represent three preferred fragment groups. FIGS. 3 and 4 show two three-fragment approaches utilizing peptide intermediate group 3 of Table 2 to synthesize full-length T-20. Note that for this group, amino acid residue 36 (T-20 carboxyl terminal amino acid residue) is introduced individually during the fragment binding process. The highest point of the T-20 synthesis scheme shown in FIG. 3 is demonstrated in the example shown in Section 9.1 below. The highest point of the T-20 synthesis scheme shown in FIG. 4 is demonstrated in the examples shown in Sections 9.2-9.5 below.
[0048]
In a further embodiment, a two fragment approach for T-20 synthesis can be followed. “Two-fragment approach” synthesis refers to a T-20 synthesis scheme up to the full-length T-20 peptide, starting with two T-20 intermediate peptide fragments that are synthesized and bound using solid and liquid phase synthesis methods. . Intermediate fragment groups 1 and 16-20 shown in Table 2 above represent preferred fragment groups. FIG. 5 shows a two-fragment approach utilizing peptide intermediate group 20 of Table 2 to synthesize full-length T-20. Note that for this group, the amino acid residues (T-20 carboxyl terminal amino acid residues) are individually introduced during the fragment binding process.
[0049]
Liquid phase peptide synthesis methods well known to those skilled in the art can be used to synthesize the peptide intermediate fragments of the present invention. The examples shown in Sections 8.1-8.11 describe typical liquid phase peptide synthesis of the peptide intermediates listed in Tables 1, 2 and / or 3. For example, some non-silica loaded column packings that exhibit a wide pH range include those with higher pH values than those sold by Tosohaus (Montgomeryville, PA).
[0050]
6).Example: Resin synthesis
In the examples described in Sections 6.1-6.3 herein, a chlorotrityl resin is synthesized that can be used in conjunction with the solid phase synthesis of the peptides and peptide intermediates described herein.
[0051]
6.1Fmoc − Trp ( Boc ) − 2 -Production of chlorotrityl resin
material:                  Molecular weight  Equivalent    mmole    G    mL
2-chlorotrityl chloride-1.0 25 25-
resin
Fmoc-Trp (Boc) -OH-526.60 1.5 37.5 19.7
Diisopropylethyl 129.25 1.7 42.5 5.5 7.4
Amine (DIEA)
Dichloroethane (DCE) − − − − 250
Dichloromethane (DCM) − − − − 6 × 250
9: 1 methanol: DIEA − − − − 200
Process:
2-Chlorotrityl chloride resin (25 g, 1 eq) was loaded into a 500 mL peptide chamber and washed with 250 mL DCM. The bed liquid was drained and a solution consisting of Fmoc-Trp (Boc) -OH (1.5 eq) and DIEA (1.7 eq) in 10 volumes of DCE was added. The mixture was stirred for 2 hours by bubbling nitrogen.
[0052]
The bed liquid was drained and washed with 250 mL DCM. The active site of the resin was end-capped with 200 mL of 9: 1 MeOH: DIEA solution for 20 minutes. The bed liquid was drained, washed 4 times with 250 mL DCM, and dried by nitrogen purge to give 34.3 g charged resin.
[0053]
Quantitative HPLC analysis was performed by cleaving Fmoc amino acids from the resin and assaying against standards. An HPLC assay of the material showed that the resin was loaded at 0.68 mmol / g.
[0054]
Column: Phenomenox Jupiter C18; 300Å; 5μ
Flow rate: 1 mL / min
Detection: 260 nm UV
      Mobile phase: A: 0.1% TFA aqueous solution
B: 0.1% TFA in acetonitrile
65% B isocratic
      Retention time: ~ 14 minutes
6.2Fmoc − Gln − 2 -Production of chlorotrityl resin
material:                    Molecular weight    Equivalent    mmole    G    mL
2-chlorotrityl chloride-1.0 25 25-
resin
FmocGlnOH 368.39 1.5 37.5 13.8 −
Diisopropylethyl 129.25 1.7 42.5 5.5 7.4
Amine (DIEA)
Dichloroethane (DCE) − − − − 75
N, N-dimethylform − − − − 200
Amide (DMF)
Dichloromethane (DCM) − − − − 6 × 250
9: 1 methanol: DIEA − − − − 200
Process:
The steps used in the example shown in Section 6.1 above were repeated using a solution consisting of FmocGlnOH (1.5 eq) and DIEA (1.7 eq) in a mixture consisting of 75 mL DCE and 200 mL DMF. Addition of DMF stabilizes FmocGlnOH. The reaction yielded 33.8 g of charged resin. Assuming a theoretical loading of 0.74 mmol / g resin, the material was advanced (carried forward).
[0055]
6.3Fmoc − Leu − 2 -Production of chlorotrityl resin
material:                    Molecular weight    Equivalent    mmole    G    mL
2-chlorotrityl chloride-1.0 250 250-
resin
FmocLeuOH 353.42 1.5 375 132.5 −
Diisopropylethyl 129.25 1.7 425 55 75
Amine (DIEA)
Dichloroethane (DCE) − − − − 2000
Dichloromethane (DCM) − − − − 6 × 1500
9: 1 methanol: DIEA − − − − 1500
Process:
The resin was loaded into a 3 L peptide chamber and washed with 1.5 L DCM. The bed liquid was drained and a solution consisting of FmocLeuOH (1.5 eq) and DIEA (1.7 eq) in 8 volumes of DCE was added. The mixture was stirred for 2 hours by bubbling nitrogen.
[0056]
The bed liquid was drained and washed with 1.5 L DCM. The active site of the resin was end-capped with 1.5 L of 9: 1 MeOH: DIEA solution for 30 minutes. The bed liquid was drained, washed 4 times with 1.5 L DCM and dried by nitrogen purge to give 345 g of loaded resin.
[0057]
Quantitative HPLC analysis was performed by cleaving Fmoc amino acids from the resin and assaying against standards. Material HPLC assay showed resin loading at 0.72 mmol / g.
[0058]
Column: Phenomenox Jupiter C18; 300Å; 5μ
Flow rate: 1 mL / min
Detection: 260 nm UV
Mobile phase: A: 0.1% TFA aqueous solution
B: 0.1% TFA in acetonitrile
65% B isocratic
      Retention time: ~ 8 minutes
7).Example: Solid phase synthesis of peptides
Sections 7.1-7.6, shown below, are examples of solid phase synthesis of the peptide intermediates listed in Tables 1, 2, and / or 3.
[0059]
7.1fragment Fmoc -Amino acids ( 1 ~ 8 ) − OH (fragment 1b ) Manufacturing of structures
Fmoc-Tyr (tBu) -Thr (tBu) -Ser (tBu) -Leu-Ile-His (trt) -Ser (tBu) -Leu-OH (SEQ ID NO: 2)
                          C₉₃H₁₂₁N_TenO₁₅
Molecular weight 1619.06
material:                    Molecular weight    Equivalent    mmole    G    mL
Fmoc-Leu-2-chloro--1.0 15.6 20.0-
Trityl resin
Fmoc-amino acid *-1.5 23.4--
1-hydroxybenzotri-153.15 1.5 23.4 3.6 −
Azol (HOBT) hydrate *
O-benzotriazole-1- 379.25 1.5 23.4 8.9 −
Il-N, N, N ', N'-Tetra
Methyluronium hexa
Fluorophosphate
(HBTU) *
Diisopropylethyl 129.25 1.5 23.4 3.0 4.1
Amine (DIEA) *
N-methyl-2-pyrrolidinone----150
(NMP) *
Methylene chloride (DCM) * − − − − 50
20% piperidine / NMP * − − − − 2 × 200
NMP for rinsing *----(Each cleaning) 200
1% trifluoroacetic acid in DCM − − − − 300
(TFA)
0.5% TFA / DCM − − − − 200
Pyridine----
Ethyl alcohol − − − − 110
Water − − − − 200 + 100
* Per binding cycle
Theoretical yield:25.3 gExpected yield:80-90%
Actual yield:20.0 g
Process:
A 1 L peptide reaction chamber was loaded with 20 g Fmoc-Leu-2-chlorotrityl resin. The resin was conditioned for about 15 minutes in 200 mL (˜10 volumes) DCM under nitrogen agitation to swell the beads and then drain the liquid.
[0060]
Removal of Fmoc (9-fluoroenylmethyloxycarbonyl) from the terminal amine was accomplished twice with 200 mL of a 20% solution of piperidine in NMP, each for 10 minutes. The resin was then washed 5-7 times with 200 mL (~ 10 volumes) NMP and determined by negative chloranil test, Fmoc byproduct (dibenzofulvene and its piperidine adduct) and the remaining piperidine Was removed.
[0061]
On the other hand, Fmoc-Ser (tBu), the next amino acid in the sequence, was activated to react at the carboxyl terminus. Fmoc protected amino acid (1.5 eq), HOBT (1.5 eq), and DIEA (1.5 eq) were dissolved in 150 mL (˜7.5 volumes) NMP at room temperature. The solution was cooled to 0-5 ° C., then HBTU (1.5 eq) was added and stirred for 5-15 minutes to dissolve. The activated acid solution was loaded onto the resin that drained the liquid and washed with 50 mL DCM (˜2.5 volumes). The reaction was stirred with nitrogen bubbling for 1 hour. The completion of binding was monitored with a qualitative ninhydrin test. After it was determined that the binding reaction was complete, the resin liquid was drained and washed with 200 mL (1 volume) NMP three times.
[0062]
The cycle was repeated for the next mer of peptide fragments using 1.5 equivalents of Fmoc protected amino acids His (trt), Ile, Leu, Ser (tBu), Thr (tBu) and Tyr (tBu), respectively. . Following the final binding reaction, the resin was washed 4 times with 200 mL (10 volumes) NMP and then 4 times with 200 mL (10 volumes) DCM. The resin was dried by nitrogen purge to give 42 g of resin bound peptide.
[0063]
The peptide was cleaved from an amount of 21 g of resin with 300% 1% TFA in DCM for about 2 minutes and then with 200% 0.5% TFA in DCM. The cut fraction was collected on pyridine (1: 1 volume ratio to TFA). Cleavage washes were combined and concentrated under reduced pressure to a volume of approximately 50 mL, then concentrated to remove remaining DCM and reconstituted with 110 mL of ethanol with a final volume of ~ 250 mL. The product was precipitated by adding 200 mL of illustration. The slurry was stirred at room temperature for 30 minutes. This solid was collected by vacuum filtration and washed with about 100 mL of water. The product was air dried to give 20.0 g (79%) of Fmoc-amino acid (1-8) -OH with 95% HPLC purity.
[0064]
Column: Phenomenox Jupiter C18
Flow rate: 1 mL / min
Detection: 260 nm UV
      Mobile phase: A: 0.1% TFA aqueous solution
B: 0.1% TFA in acetonitrile gradient from 80% B to 99% B in 20 minutes
      Retention time: about 23 minutes
          7.2fragment Fmoc -Amino acids ( 9 ~ 15 ) − OH (fragment 5b ) Manufacturing of structures
Fmoc-Ile-Glu (tBu) -Glu (tBu) -Ser (tBu) -Gln (trt) -Asn (trt) -Gln (trt) -OH (SEQ ID NO: 6)
C₁₁₇H₁₂₉N_TenO₁₈
Molecular weight 1963.39
material:                        Molecular weight  Equivalent    mmole  G    mL
Fmoc-Gln (trt) -2-chloro- − 1.0 12.0 20.0 −
Trityl resin
Fmoc-amino acid *-1.5 18.0--
1-hydroxybenzotri-153.15 1.5 18.0 2.8 −
Azol (HOBT) hydrate *
O-benzotriazole-1- 379.25 1.5 18.0 6.8 −
IL-N, N, N ', N'-tetramethyl-
Uronium hexafluoro-
Phosphate (HBTU) *
Diisopropylethylamine 129.25 1.5 18.0 2.3 3.1
(DIEA) *
N-methyl-2-pyrrolidinone----150
(NMP) *
Methylene chloride (DCM) * − − − − 50
20% piperidine / NMP * − − − − 2 × 200
NMP for rinsing *----(Each cleaning) 200
DCM for cutting − − − − 160
Acetic acid (HOAc)----20
Trifluoroethanol----20
Heptane − − − −250 + 250 + 100
Methyl t-butyl ether − − − − 100
Isopropanol − − − − 60
Water − − − − 60 + 50
* Per binding cycle
Theoretical yield: 23.6 gExpected yield: 89-95%
Actual yield: 21.1 g
Process:
Above using 20.0 g Fmoc-Gln (trt) -2-chlorotrityl resin and Fmoc protected amino acids Asn (trt), Gln (trt), Ser (tBu), Glu (tBu), Glu (tBu) and Ile The steps used in the examples shown in section 7.1 were repeated.
[0065]
Following the final coupling reaction, the resin was washed with 4 × 200 mL (10 vol) NMP followed by 4 × 200 mL (10 vol) DCM.
[0066]
The peptide was cleaved from the resin with 200 mL of 8: 1: 1 DCM: TFE: HOAc for 2 hours followed by washing with 2 × 100 mL of DCM. The eluates were combined and concentrated under vacuum to a volume of about 100 mL and then reconstituted with 250 mL of heptane while concentrating continued to remove the remaining DCM until the final volume was about 250 mL. The heptane layer was separated from the formed biphasic mixture. The product was precipitated by adding 250 mL heptane and 100 mL MTBE, then triturated overnight at room temperature to give the desired consistency of material. The solid was collected by vacuum filtration and washed with about 100 mL heptane. The product was worked up again to remove residual acetic acid. The filtered solid was dissolved in 60 mL isopropanol at 50 ° C. The solution was cooled to 0-5 ° C. in an ice bath and then 60 mL of water was added at a rapid drop rate. The resulting slurry was ground in an ice bath with stirring for about 1 hour. The solid was isolated by vacuum filtration and washed with about 50 mL water. The product was air dried to yield 21.1 g (90%) of 95% HPLC purity Fmoc-AA (9-15) -OH.
[0067]
Column: Phenomenox Jupiter C18
Flow rate: 1mL / min
Detection: 260nm UV
Mobile phase: A: 0.1% aqueous TFA
B: 0.1% TFA in acetonitrile
80% B to 99% B gradient over 20 minutes
Retention time: about 23 minutes
7.3fragment Fmoc-AA (1-16) -OH ( fragment 3d) Preparation of
Construction:
Fmoc-Tyr (tBu) -Thr (tBu) -Ser (tBu) -Leu-Ile-His (trt) -Ser (tBu) -Leu-Ile-Glu (tBu) -Glu (tBu) -Ser (tBu) Gln (trt) -Asn (trt) -Gln (trt) -Gln-OH (SEQ ID NO: 4)

Theoretical yield: 48.9gExpected yield: 85-90%
operation:
The procedure used in the examples presented in section 7.1 above was repeated using 32.5 g of Fmoc-Gln-2-chlorotrityl resin and the required Fmoc protected amino acid. The reaction was carried out as described in the examples presented in Section 6.1 above, except that a slightly different volume of solvent was used than that shown in the raw materials section above.
[0068]
Following the final coupling reaction, the resin was washed with 4 × 250 mL (8 vol) NMP followed by 4 × 250 mL (8 vol) DCM. The resin was dried under a nitrogen purge to yield 97.4 g of bound peptide.
[0069]
On a 17.7 g scale, the peptide bound to the resin was cleaved from the resin with 1% TFA in 2 × 190 mL DCM in 1-2 minutes followed by washing with 1 × 120 mL DCM. The cleavage fraction was collected in pyridine (1: 1 volume ratio to TFA). Fractions and washings were combined and concentrated under vacuum to a volume of approximately 50 mL and then reconstituted with 200 mL of methanol. Concentration was continued until the final volume was about 50 mL to remove any remaining DCM. 250 mL of water was added to precipitate the product and stirred at room temperature for about 30 minutes. The solid was collected by vacuum filtration and washed with about 50 mL water. The product was air dried to give 12.8 g (84%). The product was worked up again to remove the pyridinium salt. The filtered solid was dissolved in 150 mL of methanol at room temperature. The product precipitated upon addition of 200 mL water at room temperature. The product was isolated by vacuum filtration and washed with about 50 mL water. The material was air dried to yield 12.8 g (84%) of Fmoc-AA (1-16) -OH.
[0070]
Column: Phenomenox Jupiter C18
Flow rate: 1mL / min
Detection: 260nm UV
Mobile phase: A: 0.1% aqueous TFA
B: 0.1% TFA in acetonitrile
75% B to 99% B gradient over 20 minutes
Retention time: about 25 minutes
7.4fragment Ac-AA (1-16) -OH ( fragment 3c) Preparation of
Construction:
Ac-Tyr (tBu) -Thr (tBu) -Ser (tBu) -Leu-Ile-His (trt) -Ser (tBu) -Leu-Ile-Glu (tBu) -Glu (tBu) -Ser (tBu)- Gln (trt) -Asn (trt) -Gln (trt) -Gln-OH (SEQ ID NO: 4)

Theoretical yield: 48.9gExpected yield: 85-90%
operation:
The procedure used in the examples presented in Section 7.1 above was repeated using 32.5 g Fmoc-Gln-2-chlorotrityl resin and the required Fmoc protected amino acid, and the solvent capacity indicated in the raw materials section above. It was.
[0071]
Following the final coupling reaction, the resin was washed with 4 × 250 mL (8 vol) NMP followed by 4 × 250 mL (8 vol) DCM. The resin was dried under a nitrogen purge to yield 97.4 g of bound peptide.
[0072]
On a 10 g scale, the resin-bound peptide was acetylated with 100 mL of 3: 1 NMP: DCM for 30 minutes with acetic anhydride and pyridine (5 equivalents each) and then washed with 2 × 25 mL DCM. The peptide was cleaved from the resin with 1% TFA in 3 × 50 mL DCM followed by washing with 2 × 50 mL DCM. The cleavage fraction was collected in pyridine (1: 1 volume ratio to TFA). Fractions and washings are combined and concentrated under vacuum to a volume of about 100 mL, then reconstituted by adding 3 × 50 mL of heptane in small portions while continuing to concentrate until the final volume is about 50 mL. Residual DCM was removed. The product initially precipitated with a slightly sticky consistency but became a filterable solid when ground in an ice bath at 0-5 ° C. with stirring for about 30 minutes. The solid was collected by vacuum filtration and washed with about 150 mL heptane. The product was worked up again to remove the pyridinium salt. The filtered solid was dissolved in 50 mL of methanol at room temperature. The solution was cooled to 0-5 ° C. in an ice bath and then 50 mL of water was added at a rapid drop rate. The product initially precipitated as a viscous solid, which became a filterable consistency when ground in an ice bath with stirring for about 1 hour. The product was isolated by vacuum filtration and washed with about 25 mL water. The product was air dried to yield 7.0 g (90%) of AcAA (1-16) -OH. The product was subsequently worked up again as described above to yield 6.2 g (89% recovery) of 96% HPLC pure material.
[0073]
Column: Zorbax LP C8, 100Å, 20μ
Flow rate: 1mL / min
Detection: 220nm UV
Mobile phase: A: 0.1% aqueous TFA
B: 0.05% TFA in 1: 1 ACN: IPA
80% B to 99% B gradient over 20 minutes
Retention time: about 15 minutes
7.5fragment Fmoc-AA (17-26) -OH ( fragment 10b) Preparation of
Construction:
Fmoc-Glu (tBu) -Lys (Boc) -Asn (trt) -Glu (tBu) -Gln (trt) -Glu (tBu) -Leu-Leu-Glu (tBu) -Leu-OH (SEQ ID NO: 11)

Theoretical yield: 44.4gExpected yield: 90-105%
Actual yield: 46.9 (105%)
operation:
The procedure used in the examples presented in section 7.1 above was repeated using 25.0 g Fmoc-Leu-2-chlorotrityl resin, the required Fmoc protected amino acid, and the solvent capacity indicated in the raw materials section above. It was.
[0074]
Following the final coupling reaction, the resin was washed with 4 × 250 mL (10 vol) NMP followed by 4 × 250 mL (10 vol) DCM.
[0075]
The peptide was cleaved from the resin with 1% TFA in 3 × 400 mL (about 15 volumes) DCM and then washed with 1 × 200 mL (7.5 volumes) DCM. The cleavage fraction was collected in pyridine (1: 1 volume ratio to TFA) and then the product content was analyzed for fractions and washings. Fractions containing product were combined and concentrated under vacuum to a volume of approximately 100 mL, then reconstituted with 300 mL ethanol. Concentration was continued until the final volume was about 250 mL to remove any remaining DCM. 300 mL of water was added to the stirred solution to precipitate the product. The solid was collected by vacuum filtration and washed with about 50 mL water. The product was air dried to yield 46.4 g (105%) of 97% HPLC purity Fmoc-AA (17-26) -OH.
[0076]
Column: Phenomenox Jupiter C18
Flow rate: 1mL / min
Detection: 260nm UV
Mobile phase: A: 0.1% aqueous TFA
B: 0.1% TFA in acetonitrile
75% B to 99% B gradient over 20 minutes
Retention time: about 25 minutes
7.6fragment Fmoc-AA (27-35) -OH ( fragment 16b) Preparation of
Construction:
Fmoc-Asp (tBu) -Lys (Boc) -Trp (Boc) -Ala-Ser (tBu) -Leu-Trp (Boc) -Asn (trt) -Trp (Boc) -OH (SEQ ID NO: 17)

Theoretical yield: 48.9gExpected yield: 85-90%
operation:
The procedure used in the examples presented in section 7.1 above was performed using 33.0 g Fmoc-Trp (Boc) -2-chlorotrityl resin, the necessary Fmoc protected amino acids, and the materials indicated in the raw materials section above. And repeated.
[0077]
Following the final coupling reaction, the resin was washed with 4 × 250 mL (7.5 vol) NMP followed by 4 × 250 mL (7.5 vol) DCM.
[0078]
The peptide was cleaved from the resin by treatment with 300 mL (approximately 10 volumes) of 8: 1: 1 DCM: TFE: HOAc for 2 hours. The resin was drained and washed with 2 × 250 mL DCM. The cleavage solution and washings were combined and concentrated to a volume of about 50 mL and then reconstituted with 250 mL ethanol. The solution was cooled to 0-5 ° C. with stirring in an ice bath. 125 mL of water was added to the stirred solution to precipitate the product. The solid was collected by vacuum filtration and washed with about 50 mL water. The product was air dried to give 32.0 g (65.4%) of 95% HPLC purity Fmoc-AA (27-35) -OH.
[0079]
The resin was treated with a 1% solution of TFA in 2 × 250 mL DCM followed by washing with 100 mL DCM. The cleavage fraction was collected in pyridine in a 1: 1 volume ratio with TFA. The eluate and washing were combined and concentrated to a volume of about 50 mL. To this solution was added 100 mL ethanol followed by 150 mL water. The resulting slurry was vacuum filtered to give a secondary yield of 10.7 g (21.9%) (95% HPLC purity) for a combined yield of 87.3%. 1% TFA / DCM cleavage is preferred due to higher efficiency and lower capacity.
[0080]
Column: Phenomenox Jupiter C5, 300Å, 5μ
Flow rate: 0.75mL / min
Detection: 260nm UV
Mobile phase: A: 0.05% aqueous TFA
B: 1: 1 IPA: 0.1% TFA in MeOH
70% B to 97% B gradient in 10 minutes
Retention time: about 25 minutes
8.Example: Liquid phase synthesis of peptide fragments
Presented in Sections 8.1-8.11 below are examples of liquid phase synthesis of the peptide intermediates listed in Tables 1, 2, and / or 3.
[0081]
8.1Glutamine paranitrobenzyl ester (OPNB) of Fmoc-AA9-15OH Fragment by coupling to Fmoc-AA9-16OPNB Preparation of
Construction:
Fmoc-Ile-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ser (tBu) -Gln (trt) -Asn (trt) -Gln (trt) -Gln-OPNB (SEQ ID NO: 7)

Theoretical yield: 21.5gExpected yield: 90-105%
operation:
FmocAA9-15OH (synthesized in section 7.2 above), HBrGlnOPNB, HOAT and EtPr₂N was mixed in a 1 L round bottom flask equipped with a magnetic stir bar and NMP (200 mL) was added. The resulting solution was placed under a nitrogen atmosphere and cooled to 0-5 ° C. with stirring. HBTU was added to the cooled solution. The solution was stirred at 0-5 ° C. for 15 minutes, the ice bath was removed and stirring was continued for 2.5 hours (Note 1).
[0082]
The reaction mixture was cooled to 0-5 ° C. and 0.5N aqueous HCl (250 mL) was added to precipitate the protected peptide. The solid was collected by vacuum filtration and dried in a filtration flask to give 24 g of crude FmocAA9-16OPNB. This solid was dissolved in ethyl acetate (250 mL), dried over magnesium sulfate (10 g), filtered and concentrated to a volume of 100 mL. The solution was cooled to 0-5 ° C. and hexane (250 mL) was added to precipitate the peptide. The solid was collected by vacuum filtration and dried to give 21.5 g of FmocAA9-16OPNB in 100% yield and 91-94% HPLC purity (Note 2).
[0083]
note:
1. In-process control (IPC) by thin layer chromatography (TLC).
[0084]
90/10 chloroform / ethanol
UV and iodine detection
Rt FmocAA9-15OH 0.46
Rt FmocAA9-16OPNB 0.57
2. Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300Å
0.75mL / min, 260nm
A H₂O / 0.05% TFA
B 50% IPA / MeOH / 0.05% TFA
70-97% B over 10 minutes, 97% B over 8 minutes
Retention time: 13.3 minutes
8.2fragment HCl HAA9-16OPNB Preparation of
Construction:
HCl H-Ile-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ser (tBu) -Gln (trt) -Asn (trt)-
Gln (trt) -Gln-OPNB (SEQ ID NO: 7)

Theoretical yield: 19.2gExpected yield: 85-105%
operation:
A 1 L round bottom flask equipped with a magnetic stir bar was charged with FmocAA9-16OPNB (synthesized in Section 8.2 above) and 20: 1 tetrahydrofuran / piperidine. The resulting solution was stirred for 60 minutes at room temperature under a nitrogen atmosphere (Note 1). Hexane (350 mL) was added to precipitate the peptide. The solvent was decanted from the viscous solid. The solid was triturated with MTBE (200 mL) for 18 hours at room temperature. This solid was collected by vacuum filtration and dried to obtain 18.9 g of HAA9-16OPNB (Note 2).
[0085]
This solid was dissolved in methanol (150 mL) and cooled to 0-5 ° C. with stirring. 0.5N aqueous hydrochloric acid (100 mL) was added to precipitate the peptide. The solid was collected by vacuum filtration, washed with water (50 mL), then 2-propanol (50 mL) and dried to give 17.7 g HCl HAA9-16OPNB in 92% yield and 92A% HPLC purity ( Note 3).
[0086]
note:
1. In-process control, HPLC
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300Å
0.75mL / min, 260nm
A H₂O / 0.05% TFA
B 50% IPA / MeOH / 0.05% TFA
70-97% B over 10 minutes, 97% B over 8 minutes
Retention time: FmocAA9-16OPNB, 13.3 minutes; HAA9-16OPNB, 10.7 minutes
2. HAA9-16OPNB isolated at this point is trace amounts of piperidine and
Contains dilfulvenpiperidine adduct. Both with RAA1-8OH
Remove before pulling.
[0087]
3. Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300Å
0.75mL / min, 260nm
A H₂O / 0.05% TFA
B 50% IPA / MeOH / 0.05% TFA
80-100% B in 10 minutes or more, 100% B in 5 minutes
Retention time: HAA9-16OPNB, 7.2 minutes
TLC conditions:
90/10 dichloromethane / ethanol
UV and iodine detection
Rf: HAA9-16OPNB, 0.64
8.3fragment AcAA1-8OH When HAA9-16OPMB By liquid phase coupling with AcAA1-16OPNB Preparation of
Construction:
Ac-Tyr (tBu) -Thr (tBu) -Ser (tBu) -Leu-Ile-His (trt) -Ser (tBu) -Leu-Ile-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ser (tBu)- Gln (trt) -Asn (trt) -Gln (trt) -Gln-OPNB (SEQ ID NO: 4)

Theoretical yield: 0.38Expected yield: 85-105%
operation:
A 25 mL round bottom flask equipped with a magnetic stir bar was charged with AA1-8OH (synthesized in section 7.1 above), HCl HAA9-16OPNB (synthesized in section 8.2 above) and HOAT. Solid EtPr₂It was dissolved in 9: 1 DMF: DMSO (5 mL) containing N, and then cooled to 0 to 5 ° C. under a nitrogen atmosphere (Note 1). HBTU was added to the cooled solution. The reaction mixture was stirred at 0-5 ° C. for 15 minutes, then warmed to room temperature and stirred for an additional 60 minutes (Note 2). The peptide was precipitated from the solution by the addition of water (7 mL). The solid was collected by vacuum filtration, washed with water (10 mL) and dried to give 0.36 g of crude AcAA1-16OPNB. This solid was triturated with MTBE (3.5 mL) at room temperature for 1.5 hours, collected by vacuum filtration and dried to give 0.335 g of AcAA1-16OPNB in 88% yield and 82A% HPLC purity. 3).
[0088]
note:
1. Cool to 0-5 ° C and bring all solids into solution before adding HBTU
This is very important.
[0089]
2. In-process control, TLC, HPLC
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300Å
0.75mL / min, 260nm
A H₂O / 0.05% TFA
B 50% IPA / MeOH / 0.05% TFA
80-100% B in 10 minutes or more, 100% B in 5 minutes.
Retention time: HAA9-16OPNB, 7.2 minutes (Ac1-8OH has no absorbance at 260 nm.
I).
Retention time: AcAA1-16OPNB, 12.45
TLC conditions:
90/10 chloroform / ethanol
UV and iodine detection
Rf: HAA9-16OPNB, 0.64
Rf: Ac1-8OH, 0.35
Rf: Ac1-16OH, 0.48
3. Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300Å
0.75mL / min, 260nm
A H₂O / 0.05% TFA
B 50% IPA / MeOH / 0.05% TFA
70-97% B over 10 minutes, 97% B over 8 minutes
Retention time: Ac1-16OPNB, 16.4.
8.4fragment FmocAA1-8OH When HCl HAA9-16OPNB By liquid phase coupling with FmocAA1-16OPNB Preparation of
Construction:
Fmoc-Tyr (tBu) -Thr (tBu) -Ser (tBu) -Leu-Ile-His (trt) -Ser (tBu) -Leu-Ile-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ser (tBu)- Gln (trt) -Asn (trt) -Gln (trt) -Gln-OPNB (SEQ ID NO: 4)

Theoretical yield: 28.3gExpected yield: 85-100%
operation:
A 1 L round bottom flask equipped with a magnetic stir bar was charged with FmocAA1-8OH (synthesized in Section 7.1 above), HCl HAA9-16OPNB (synthesized in Section 8.2 above), HOAT and DMF (250 mL). EtPr in solution₂N was added. The solution was cooled to 0-5 ° C. and HBTU was added. The reaction mixture was stirred at 0-5 ° C. for 15 minutes, then warmed to room temperature and stirred for an additional 70 minutes (Note 1). The reaction mixture was cooled to 0-5 ° C. and 10% sodium chloride / water (200 mL) was added to precipitate the peptide. The solid was collected by vacuum filtration, washed with water (50 mL) and dried to give 27 g of crude FmocAA1-16OPNB. The solid was dissolved in methanol (200 mL) and added to a stirred aqueous solution of sodium chloride (10% wt / vol, 300 mL). This solid was collected by vacuum filtration, washed with water (50 mL) and dried to give 26 g of FmocAA1-16OPNB in 92% yield and 90 A% purity by HPLC (Note 1).
[0090]
note:
1. In-process control, HPLC
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300Å
0.75mL / min, 260nm
A H₂O / 0.05% TFA
B 50% IPA / MeOH / 0.05% TFA
80-100% B in 10 minutes or more, 100% B in 5 minutes.
Retention time: HAA9-16OPNB, 7.2 minutes, FmocAA1-8OH, 7.9 minutes
Retention time: FmocAA1-16OPNB, 14.5 minutes
8.5fragment H-AA1-16OPNB Preparation of
Construction:
H-Tyr (tBu) -Thr (tBu) -Ser (tBu) -Leu-Ile-His (trt) -Ser (tBu) -Leu-Ile-Glu (tBu) -Glu (tBu) -Ser (tBu)- Gln (trt) -Asn (trt) -Gln (trt) -Gln-OPNB (SEQ ID NO: 4)

Theoretical yield: 0.94gExpected yield: 90-105%
operation:
A 50 mL round bottom flask equipped with a magnetic stir bar was charged with FmocAA1-16OPNB (synthesized in Section 8.4 above), dichloromethane (11.4 mL) and piperidine (0.6 mL). The solution was stirred at room temperature for 90 minutes under a nitrogen atmosphere (Note 1). Hexane (45 mL) was added to the reaction mixture and the solvent volume was reduced to 25 mL by vacuum distillation. The resulting solid was collected by vacuum filtration and dried, yielding 0.96 g of HAA1-16OPNB in 102% yield. HPLC analysis of this solid showed 72A% HAA1-16OPNB and 18A% fulvene and piperidine-fulvene adduct.
[0091]
note:
1. Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300Å
0.8mL / min, 260nm
A H₂O / 0.05% TFA
B 50% IPA / MeOH / 0.05% TFA
80-100% B in 10 minutes or more, 100% B in 5 minutes.
Retention time: FmocAA1-16OPNB, 14.1 minutes
Retention time: HAA1-16OPNB, 11.6 minutes
Retention times: fulvene and piperidine-fulvene adduct, 5.5 min and 4.8 min.
[0092]
8.6HAA1-16OPNB of N Fragment by terminal acetylation Ac-AA1-16OPNB Preparation of
Construction:
Ac-Tyr (tBu) -Thr (tBu) -Ser (tBu) -Leu-Ile-His (trt) -Ser (tBu) -Leu-Ile-Glu (tBu) -Glu (tBu) -Ser (tBu)- Gln (trt) -Asn (trt) -Gln (trt) -Gln-OPNB (SEQ ID NO: 4)

Theoretical yield: 0.96gExpected yield: 80-100%
operation:
A 50 mL round bottom flask equipped with a magnetic stir bar was charged with HAA1-16OPNB (synthesized in Section 8.5 above), DMF (10 mL), acetic anhydride and pyridine. The reaction mixture was stirred at room temperature for 60 minutes under a nitrogen atmosphere (Note 1). Water (20 mL) was added to precipitate the peptide. The solid was collected by vacuum filtration, washed with water (10 mL) and dried to give 0.87 g of AcAA1-16OPNB. The solid was triturated with 1: 1 MTBE / hexane (20 mL) for 4.5 hours at room temperature to remove residual fulvene and piperidine-fulvene adduct. The solid was collected by vacuum filtration and dried to give 0.82 g of AcAA1-16OPNB in 85% yield and HPLC purity of over 90A% (Note 1).
[0093]
note:
1. In-process control, HPLC
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300Å
0.8mL / min, 260nm
A H₂O / 0.05% TFA
B 50% IPA / MeOH / 0.05% TFA
80-100% B in 10 minutes or more, 100% B in 15 minutes.
Retention time: HAA1-16OPNB, 11.6 minutes
Retention time: AcAA1-16OPNB, 12.1 minutes
TLC, 10% ethanol in dichloromethane
UV and iodine detection
Rf: AcAA1-16OPNB, 0.69
8.7His (trt) In the presence of AcAA1-16OPNB By selective removal of the paranitrobenzyl protecting group from AcAA1-16OH Preparation of
Construction:
Ac-Tyr (tBu) -Thr (tBu) -Ser (tBu) -Leu-Ile-His (trt) -Ser (tBu) -Leu-Ile-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ser (tBu)- Gln (trt) -Asn (trt) -Gln (trt) -Gln-OH (SEQ ID NO: 4)

Theoretical yield: 0.76gExpected yield: 70-85%
operation:
A 25 mL round bottom flask equipped with a magnetic stir bar was charged with AcAA1-16OPNB (synthesized in Section 8.6 above) and DMF (10 mL). To this solution was added aqueous ammonium formate solution (0.5 mL) followed by wet palladium carbon (Degussa, 10%, 50% water). The slurry was stirred for 120 minutes at room temperature under a nitrogen atmosphere (Note 1). The slurry was filtered through a close packed bed of celite and taken up in 90 mL of water. The filter cake was washed with DMF (5 mL). This aqueous suspension was washed with ethyl acetate (100 mL). The ethyl acetate was then concentrated to a volume of 20 mL (caution 2). Hexane (40 mL) was added to complete the precipitation and the solvent was decanted from the solid. The solid was dissolved in methanol (10 mL) and 4: 1 water / saturated aqueous sodium chloride solution (25 mL) was added to precipitate the peptide. The solid was collected by vacuum filtration, washed with water (10 mL) and dried to give 0.62 g of AcAA1-16OH. This solid was triturated with 50% MTBE / hexane (8 mL) for 15 hours at room temperature, collected and dried to give 0.59 g of AcAA1-16OH in 77% yield and 90 A% purity by HPLC (Note). 3).
[0094]
note:
1. In-process control, TLC
80/20 dichloromethane / ethanol
UV and iodine detection
Rf: AcAA1-16OPNB, 0.90
Rf: Ac1-16OH, 69
2. AcAA1-16OH begins to precipitate as the solvent capacity is reduced.
[0095]
3. Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300 Ohm Strong
0.8mL / min, 260nm
A H₂O / 0.05% TFA
B 50% IPA / MeOH / 0.05% TFA
80 to 100% B for 10 minutes or more, 5 minutes at 100% B
Retention time: AcAA1-16OH, 10.73 minutes
8.8FmocAA27-35OH When HPheNH ₂ By liquid phase coupling with FmocAA27-36NH ₂ Preparation of
Construction:
Fmoc-Asp (tBu) -Lys (Boc) -Trp (Boc) -Ala-Ser (tBu) -Leu-Trp (Boc) -Asn (trt) -Trp (Boc) -Phe-NH₂ (SEQ ID NO: 18)

Theoretical yield: 42.8gExpected yield: 90 to 105%
operation:
FmocAA27-35OH (synthesized in section 7.6 above), HOAT, HpheNH in a 2 L round bottom flask equipped with a magnetic stir bar₂And DMF (500 mL) was charged. EtPr₂N was added to cool the solution to 0-5 ° C., then HBTU was added. The reaction mixture was stirred at 0-5 ° C. for 15 minutes, then warmed to room temperature and stirred for an additional 70 minutes (Note 1). The solution was cooled to 0-5 ° C. and water (500 mL) was added to precipitate the peptide. The solid was collected by vacuum filtration, washed with water (100 mL) and dried to yield 43 g of FmocAA27-36NH₂Was obtained with a yield of 100% and a purity of 93 A% by HPLC (Note 2).
[0096]
note:
1. In-process control, TLC
88/12 Dichloromethane / Methanol
UV and iodine detection
Rf: FmocAA27-35OH, 0.49
Rf: FmocAA27-36NH₂, 0.63
2. Phenomenox Jupiter, C18, 5μ, 300 ohm strong
1.0mL / min, 260nm
A H₂O / 0.1% TFA
B ACN
75-99% B for 20 minutes or more, 5 minutes at 99% B
Retention time: 29.4 minutes
8.9fragment H-AA (27-36) -NH ₂ Preparation of
Construction:
H-Asp (tBu) -Lys (Boc) -Trp (Boc) -Ala-Ser (tBu) -Leu-Trp (Boc) -Asn (trt) -Trp (Boc) -NH₂ (SEQ ID NO: 17)

Theoretical yield: 19.6gExpected yield: 85-95%
operation:
A 250 mL round bottom flask equipped with a magnetic stir bar and nitrogen blanket was charged with the Fmoc fragment synthesized in Section 8.8 above, methylene chloride (approximately 5 volumes), and piperidine. A solution was obtained and stirred at room temperature for 1.5 hours (Note 1).
[0097]
This solution was washed with 2 × 100 mL of water. The layers were separated and the organic layer was concentrated under reduced pressure to approximately one half of the original volume. Concentration was continued while MTBE was added (2 × 50 mL), and DCM was removed to the heavy precipitation point and to a final pot volume of about 150 mL.
[0098]
The resulting slurry was stirred and cooled in an ice bath at 0-5 ° C. for about 1 hour. The solid was isolated by vacuum filtration and washed with 2 × 15 mL MTBE. The product is air dried and 95% HPLC purity H-AA (27-36) NH₂17.6 g (89.6%) was obtained (Note 2).
[0099]
note:
1) The completion of the reaction was monitored by HPLC.
[0100]
Column: Phenomenox Jupiter, C18; 300 ohm strong; 5μ
Flow rate: 1mL / min
Detection: 260nm UV
Mobile phase: A: 0.1% TFA aqueous solution
B: 0.1% TFA in acetonitrile
Gradient from 75% B to 99% B in 20 minutes
Retention time: about 18 minutes
2) Both the Fmoc by-product dibenzofulvene and its piperidine adduct are effectively removed in the workup. However, a use test must be performed before proceeding with this material. If the material does not pass the use test, the work up procedure is repeated by dissolving the solid in DCM (5 vol) and then continuing the above steps.
[0101]
8.10FmocAA17-26OH When HAA27-36NH ₂ By liquid phase coupling with FmocAA17-36NH ₂ Preparation of
Construction:
Fmoc-Glu (OtBu) -Lys (Boc) -Asn (trt) -Glu (OtBu) -Gln (trt) -Glu (OtBu) -Leu-Leu-Glu (OtBu) -Leu-Asp (tBu) -Lys ( Boc) -Trp (Boc) -Ala-Ser (tBu) -Leu-Trp (Boc) -Asn (trt) -Trp (Boc) -Phe-NH₂  (SEQ ID NO: 12)

Theoretical yield: 41.5gExpected yield: 80-85%
operation:
FmocAA17-26OH (synthesized in section 7.5 above), HAA27-36NH in a 2 L round bottom flask equipped with a magnetic stir bar₂(Synthesized in Section 8.9 above), charged with HOAT and DMF (400 mL). EtPr₂N was added and the stirred solution was cooled to 0-5 ° C. under a nitrogen atmosphere and HBTU was added. The reaction mixture was stirred at 0-5 ° C. for 15 minutes, then warmed to room temperature and stirred for an additional 2.5 hours (Note 1). Water (500 mL) was added to the reaction mixture to precipitate the peptide (Note 2). The resulting slurry was stirred for 45 minutes and the solid was collected by vacuum filtration, washed with water (100 mL) and dried. The solid was returned to a 2 L round bottom flask equipped with a magnetic stir bar and 2-propanol (1.1 L) at 60 ° C. was added. The slurry was stirred under a nitrogen atmosphere while cooling to room temperature (overnight). The solid was recovered by vacuum filtration and dried to yield 37.5 g FmocAA17-36NH₂Was obtained with 90% yield and 95.5 A% purity by HPLC (Note 1).
[0102]
note:
1. In-process control, HPLC
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300 Ohm Strong
0.75mL / min, 260nm
A H₂O / 0.05% TFA
B 50% IPA / MeOH / 0.05% TFA
80 to 100% B for 10 minutes or more, 25 minutes at 100% B
Retention time: FmocAA17-26OH, 8.2 minutes, HAA26-36 NH₂, 8.4 minutes
Retention time: FmocAA17-36NH₂, 13.3 minutes
2. The reaction mixture was warmed to 38 ° C. when water was added.
[0103]
8.11fragment H-AA (17-36) -NH ₂ Preparation of
Construction:
H-Glu (OtBu) -Lys (Boc) -Asn (trt) -Glu (OtBu) -Gln (trt) -Glu (OtBu) -Leu-Leu-Glu (OtBu) -Leu-Asp (tBu) -Lys ( Boc) -Trp (Boc) -Ala-Ser (tBu) -Leu-Trp (Boc) -Asn (trt) -Trp (Boc) -NH₂  (SEQ ID NO: 19)

Theoretical yield: 21.6gExpected yield: 95-100%
operation:
A 250 mL round bottom flask equipped with a magnetic stir bar and nitrogen blanket was charged with the Fmoc fragment synthesized in Section 8.10 above, THF (about 7.5 volumes), and 5N NaOH (about 2.5 volumes). A two-phase solution was obtained and stirred at room temperature for 10-15 minutes (Note 1).
[0104]
The layers were separated and the organic phase was adjusted to pH 2-3 with 1N HCl. The solution was then washed with 2 × 55 mL (2.5 vol) saturated brine (Note 2). The layers were separated and the organic layer was concentrated under reduced pressure at 15-20 ° C. to about one half of the original volume. Concentration was continued while adding heptanes (3 × 25 mL), and THF was removed to the heavy precipitation point and to a final pot volume of approximately 100 mL (Note 2).
[0105]
The resulting slurry was stirred at room temperature for about 2 hours. The solid was isolated by vacuum filtration and washed with about 50 mL heptane. The product was air dried to 21.0 g (97.5%) H-AA (17-36) NH₂was gotten.
[0106]
A post-treatment may be performed again to remove the remaining dibenzofulvene by-product. The product was slurried in 200 mL heptane for 3 hours at room temperature. The material was filtered, washed with about 50 mL heptane and air dried to yield 20.8 g (96.6%) of product with> 95% HPLC purity.
[0107]
note:
1) The completion of the reaction was monitored by HPLC.
[0108]
Column: Zorbax LP C8; 1 OO Ohmstrong; 2011 Flow rate: 1 mL / min
Detection: 260nm UV
Mobile phase: A: 0.1% TFA aqueous solution
B: 0.05% TFA in 1: 1 ACN: IPA
Gradient from 80% B to 99% B in 20 minutes
Retention time: about 18 minutes
2) The solid initially precipitates as a waxy gum, but it is still stirrable and becomes a filterable solid upon further grinding with concentration.
[0109]
9.Example: Full length T-20 Peptide synthesis
Presented in Sections 9.1-9.5 herein below are examples that utilize intermediate peptide fragments to produce full-length T-20 peptides.
[0110]
The examples presented in this section demonstrate solid phase and liquid phase successful coupling synthesis techniques that produce full-length T-20 peptides from intermediate peptide fragments.
[0111]
9.1AcAA1-16OH When HAA17-36NH ₂ By liquid phase coupling with AcAA1-36NH ₂ Preparation of
The synthetic pathway described here represents the final stage of the approach from the four fragments of T-20 illustrated in FIGS. When AcAA1-16OH is synthesized by solid phase technology, the approach of FIG. 1 is followed, and when AcAA1-16OH is synthesized by liquid phase technology, the approach of FIG. 3 is followed. The T-20 full-length peptide synthesized here has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 having an acetyl group modification (ie, “X”) at its amino terminus and an amide group modification (ie, “Z”) at its carboxyl terminus. .
[0112]
Construction:
AC-Tyr (tBu) -Thr (tBu) -Ser (tBu) -Leu-Ile-His (trt) -Ser (tBu) -Leu-Ile-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ser (tBu)- Gln (trt) -Asn (trt) -Gln (trt) -Gln-Glu (OtBu) -Lys (Boc) -Asn (trt) -Glu (OtBu) -Gln (trt) -Glu (OtBu) -Leu-Leu -Glu (OtBu) -Leu-Asp (tBu) -Lys (Boc) -Trp (Boc) -Ala-Ser (tBu) -Leu-Trp (Boc) -Asn (trt) -Trp (Boc) -Phe-NH₂  (SEQ ID NO: 1)

Theoretical yield: 1.77gExpected yield: 85-100%
operation:
AcAA1-16OH (synthesized in either section 7.4 above by solid phase technology or section 8.7 above by liquid phase technique) in a 100 mL round bottom flask equipped with a magnetic stir bar, HOAT, DMF (20 mL) Followed by EtPr₂N (0.074 mL) was charged. The solution was cooled to 0-5 ° C. under a nitrogen atmosphere and HBTU was added. Stir the solution at 0-5 ° C for 15 min, HCl HAA17-36NH₂(Synthesized in Section 8.11 above) followed by an additional 0.041 mL of EtPr₂N was added. The cooling bath was removed and the reaction mixture was stirred for 2 hours (Note 1). Water (25 mL) and saturated brine (5 mL) were added to precipitate the peptide. The solid was collected by vacuum filtration, washed with water (10 mL) and dried to give 1.74 g of crude AcAA1-36NH.₂Was obtained (Note 2). The solid was triturated with 50% MTBE / hexane for 2.5 hours at room temperature, collected by vacuum filtration and dried to give 1.70 g in 96% yield and 92 A% purity by HPLC.
[0113]
note:
1) In-process control, HPLC
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300 Ohm Strong
0.8mL / min, 260nm
A H₂O / 0.05% TFA
B 50% IPA / MeOH / 0.05% TFA
80 to 100% B for 10 minutes or more, 15 minutes at 100% B
Retention time: AcAA1-16OH, 11.8 minutes
Retention time: HCl HAA17-36 NH₂, 12.7 minutes
Retention time: AcAA1-36NH₂, 22.9 minutes
2) A very fine precipitate is formed by dehydration. It may be necessary to perform the filtration twice.
[0114]
9.2FmocAA1-16OH When HAA17-36NH ₂ By liquid phase coupling with FmocAA1-36NH ₂ (T-20) Preparation of
The examples presented in this section demonstrate successful solid phase and liquid phase coupling synthesis techniques to produce T-20 peptides from intermediate peptide fragments. In particular, the synthetic pathway described here represents an approach from the three fragments of T-20 illustrated in FIG. 4, in which FmocAA1-36NH₂Is shown until is synthesized.
[0115]
Construction:
Fmoc-Tyr (tBu) -Thr (tBu) -Ser (tBu) -Leu-Ile-His (trt) -Ser (tBu) -Leu-Ile-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ser (tBu)- Gln (trt) -Asn (trt) -Gln (trt) -Gln-Glu (OtBu) -Lys (Boc) -Asn (trt) -Glu (OtBu) -Gln (trt) -Glu (OtBu) -Leu-Leu -Glu (OtBu) -Leu-Asp (tBu) -Lys (Boc) -Trp (Boc) -Ala-Ser (tBu) -Leu-Trp (Boc) -Asn (trt) -Trp (Boc) -Phe-NH₂  (SEQ ID NO: 1)

Theoretical yield: 0.91gExpected yield: 85-100%
operation:
FmocAA1-16OH (synthesized in section 7.3 above), HCl HAA17-36NH in a 25 mL round bottom flask equipped with a magnetic stir bar₂(Synthesized in section 8.11 above), charged with HOAT, DMF (10 mL), EtPr₂N was added. The solution was cooled to 0-5 ° C. under a nitrogen atmosphere and HBTU was added. The reaction mixture was stirred at 0-5 ° C. for 15 minutes, then warmed to room temperature and stirred for 1.5 hours (Note 1). Water was added to precipitate the peptide and the solid was collected by vacuum filtration and dried. The solid was triturated with 2 propanol (14 mL) for 15 hours at room temperature, then water (3 mL) was added to give the desired product from solution. The solid was collected by vacuum filtration and dried to 0.80 g FmocAA1-36NH₂Was obtained in 88% yield and 85A% HPLC purity.
[0116]
note:
1) In-process control, HPLC
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300 Ohm Strong
0.8mL / min, 260nm
A H₂O / 0.05% TFA
B 50% IPA / MeOH / 0.05% TFA
80 to 100% B for 10 minutes or more, 15 minutes at 100% B
Retention time: FmocAA1-16OH, 11.4 minutes
Retention time: HCl HAA17-36 NH₂, 12.min
Retention time: FmocAA1-36NH₂, 20.4 minutes
TLC, 9/1 dichloromethane / ethanol
UV and iodine detection
Rft: FmocAA1-36NH₂, 0.71
9.3fragment HAA1-36NH ₂ (T-20)Preparation of
The examples presented in this section demonstrate successful solid phase and liquid phase coupling synthesis techniques for producing T-20 peptides from intermediate peptide fragments. In particular, the synthetic route described here represents an approach from the three fragments of T-20 illustrated in FIG. 4, in which H-AA1-36NH₂Is shown until is synthesized.
[0117]
Construction:
H-Tyr (tBu) -Thr (tBu) -Ser (tBu) -Leu-Ile-His (trt) -Ser (tBu) -Leu-Ile-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ser (tBu)- Gln (trt) -Asn (trt) -Gln (trt) -Gln-Glu (OtBu) -Lys (Boc) -Asn (trt) -Glu (OtBu) -Gln (trt) -Glu (OtBu) -Leu-Leu -Glu (OtBu) -Leu-Asp (tBu) -Lys (Boc) -Trp (Boc) -Ala-Ser (tBu) -Leu-Trp (Boc) -Asn (trt) -Trp (Boc) -Phe-NH₂  (SEQ ID NO: 1)

Theoretical yield: 0.77gExpected yield: 85-95%
operation:
FmocAA1-36NH in a 25 mL round bottom flask equipped with a magnetic stir bar₂(Synthesized in Section 9.2 above), DMF (9.5 mL) and piperidine (0.5 mL) were charged. The solution was stirred at room temperature for 2 hours under a nitrogen atmosphere (Notes 1 and 2). Water (20 mL) and saturated aqueous sodium chloride (5 mL) were added to precipitate the protected peptide. The solid was recovered by vacuum filtration and dried to mix 0.77g HAA1-36NH mixed with fulvene and piperidine-fulvene adduct₂was gotten. The solid was triturated with 50% MTBE / hexane for 15 hours at room temperature to remove the fulvene and piperidine-fulvene adduct. The solid was recovered by vacuum filtration and dried to give 0.73g HAA1-36NH₂Was obtained with a yield of 95% and a purity of 90 A% by HPLC.
[0118]
note:
1) In-process control, HPLC
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300 Ohm Strong
0.8mL / min, 260nm
A H₂O / 0.05% TFA
B 50% IPA / MeOH / 0.05% TFA
80 to 100% B for 10 minutes or more, 15 minutes at 100% B
Retention time: FmocAA1-36OH, 20.4 minutes
Retention time: HCl HAA1-36 NH₂, 19.9 minutes
Retention time: fulvene and piperidine-fulvene adduct, 5 minutes
TLC, 9/1 dichloromethane / ethanol
UV and iodine detection
Rt: FmocAA1-36NH₂, 0.71
2) Products and starting materials are not well separated by TLC or reverse phase HPLC. Following product formation, fulvene and piperidine-fulvene adducts are measured.
[0119]
9.4HAA1-36NH ₂ of N Fragment by terminal acetylation AcAA1-36NH ₂ (T-20)Preparation of
The examples presented in this section demonstrate successful solid phase and liquid phase coupling synthesis techniques to produce T-20 peptides from intermediate peptide fragments. In particular, the synthetic pathway described here represents an approach from the three fragments of T-20 illustrated in FIG. 4, in which Ac-AA1-36NH₂Is shown until is synthesized.
[0120]
Construction:
AC-Tyr (tBu) -Thr (tBu) -Ser (tBu) -Leu-Ile-His (trt) -Ser (tBu) -Leu-Ile-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ser (tBu)- Gln (trt) -Asn (trt) -Gln (trt) -Gln-Glu (OtBu) -Lys (Boc) -Asn (trt) -Glu (OtBu) -Gln (trt) -Glu (OtBu) -Leu-Leu -Glu (OtBu) -Leu-Asp (tBu) -Lys (Boc) -Trp (Boc) -Ala-Ser (tBu) -Leu-Trp (Boc) -Asn (trt) -Trp (Boc) -Phe-NH₂  (SEQ ID NO: 1)

Theoretical yield: 0.71gExpected yield: 85-100%
operation:
HAA1-36NH in a 25 mL round bottom flask equipped with a magnetic stir bar₂(Synthesized in Section 9.3 above), DMF (10 mL) and pyridine (0.046 mL) and acetic anhydride (0.027 mL) were charged (Note 1). The solution was stirred at room temperature for 4 hours under a nitrogen atmosphere (Note 2). Water (7.5 mL) and saturated aqueous sodium chloride (7.5 mL) were added to precipitate the protected peptide. The solid was collected by vacuum filtration, washed with water (10 mL) and dried to give 0.65 g AcAA1-36NH.₂Was obtained in 91% yield and 90A purity by HPLC (Note 3).
[0121]
note:
1) Dichloromethane may be used as a solvent for this reaction.
[0122]
2) In-process control, HPLC
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300 Ohm Strong
0.8mL / min, 260nm
A H₂O / 0.05% TFA
B 50% IPA / MeOH / 0.05% TFA
80 to 100% B for 10 minutes or more, 15 minutes at 100% B
Retention time: HAA1-36OH, 23.3 minutes
Retention time: AcAA1-36 NH₂, 22.7 minutes
3) Products and starting materials are not well separated by TLC or reverse phase HPLC.
9.5AcAA1-36NH ₂ By side chain deprotection T-20 Side preparation
The examples presented in this section demonstrate successful solid phase and liquid phase coupling synthesis techniques to produce T-20 peptides from intermediate peptide fragments. In particular, the synthetic pathway described here represents an approach from the three fragments of T-20 shown in FIG.
[0123]
Construction:
Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu- Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH₂
(SEQ ID NO: 1)

Theoretical yield: 157mgExpected yield: 25-50%
operation:
Nitrogen was degassed from a 90: 5: 5 (v / v / wt%) trifluoroacetic acid / water / dithiothreitol solution and cooled to 0-5 ° C. AcAA1-36NH in the cooled solution₂(Synthesized in Section 9.4 above) was added. The slurry was stirred at 0-5 ° C. until the solid dissolved (about 5 minutes), then warmed to room temperature and stirred for 2.5 hours. The solution was added to MTBE (70 mL) at 0-5 ° C. to precipitate the peptide. The slurry was spun at 2200 rpm for 5 minutes in a centrifuge and MTBE was decanted from the solid. The solid was again suspended in MTBE (50 mL) and spun at 2200 rpm for 5 minutes in a centrifuge to decant the MTBE. This process was repeated once more, then the solid was dissolved in 1: 1 water / acetonitrile (30 mL) containing 1% by volume acetic acid and kept at room temperature for 24 hours (Note 1). The solution was frozen and then lyophilized using a lyophilizer to give 155 mg of crude T-20. Purification by preparative HPLC yielded 55 mg of full-length T-20 peptide with a purity of 95 A% by HPLC (Note 2).
[0124]
note:
1) Remove tBu side chain of Trp (Boc) quickly to TrpCOOH. Decarboxylation of TrpCOOH requires a minimum of 24 hours at ambient temperature in aqueous acetic acid.
[0125]
2) Preparative HPLC
2 ”YMC, 120A, 10μ, C18
220nm, 50mL / min
A H₂O / 0 ~ 1% TFA
B ACN / 0.1% TFA
39-49% B / 40 min
Ten Example: T-20 Peptide purification
The examples presented herein describe methods by which T-20 and T-20-like peptides can be purified under conditions that significantly increase peptide purification throughout.
[0126]
material
Column used: 20 × 30 cm packed with 35 μm particles of Amberchrom CG-300S (Tosohaus; Montgomeryville, PA).
[0127]
Buffer preparation
Buffer A = NH_Four100 mM ammonium acetate adjusted to pH 8.5 with OH.
[0128]
Buffer B = acetonitrile.
[0129]
1. A column with 20% B of about 6 column volumes.
[0130]
2. Dissolve T-20 in 85% A / 15% B per gram of 50-100 mL peptide. 2M K₂CO_ThreeTo adjust the pH to 8-10. The acetonitrile concentration in the T-20 sample does not exceed 15-20%.
[0131]
3. While monitoring column pressure, load T-20 solution at 500 mL / min.
[0132]
4. After loading T-20 solution, load 3 column volumes (10 L) of 85% A / 15% B solution to wash out the line.
[0133]
5. Monitor the column eluate at 303 nm and collect the eluate during the entire loading process.
Adjust the wavelength or attenuation during the experiment to keep the peak on the scale. Absorbance is a function of wavelength and cell path length.
[0134]
6. Begin the gradient operation as follows (monitoring 1.6% at B / hr) while monitoring pressure during the entire experiment.
[0135]
Time (min)% B Flow rate (mL / min)
0 15 330
788 36 330
7. When the main peak begins to elute, collect the 10 minute fraction (3.3 L). All T-20 should elute at 35% B. On average 35-40 fractions are collected. Store fractions at 0-5 ° C. until determination of fractions to pool is made.
[0136]
8. Collect fractions until the absorbance of the detector is less than 0.1 AU or until the major inflection point is reached after the major peak elutes.
[0137]
9. The purity of each fraction is monitored by analytical reverse phase HPLC.
[0138]
result
T-20 peptide is very soluble in the pH range above 7. Column supports commonly used for peptide purification are silica-based, and silica supports tend to dissolve in higher pH ranges and can therefore be used only in certain pH ranges.
[0139]
The methods described herein utilize polystyrene-based resin supports that are stable over a wide pH range (pH 1-14). This method significantly increased the column capacity, where the T-20 elution volume increased from 10 g to 250-450 g (for a 8 "x 30 cm diameter column).
[0140]
11. Example:T-20 Large scale synthesis and purification of peptide resin loading
FmocTrp (Boc) OH can be loaded onto highly active 2-CTC resin at a level of 1.2 mmol or more per gram of raw resin. If the amount of FmocTrp (Boc) OH exceeds 1.1 millimoles per gram of raw resin (over 0.72 millimoles per gram of loaded resin), the ninhydrin test is negative for the last 3 amino acids of the fragment It is difficult to become. Similarly, loading more than 0.85 mmol of FmocLeuO-resin makes it difficult to make FmocAA17-26O-resin, and loading more than 0.75 mmol of FmocGlnOH-resin makes AcAA1-16O resin It becomes difficult.
[0141]
When receiving the resin from the vendor, perform a usage test with approximately 1 gram of 2-CTC for each amino acid loaded. The purpose of the usage test is to determine the amount of amino acid used during loading to obtain the desired loading range. 0.8, 1.0 and 1.5 equivalents of FmocGlnOH, 1.0, 1.2 and 1.5 equivalents of FmocTrp (Boc) OH, and 0.8, 1.0 and 1.5 equivalents of FmocLeuOH, with 0.5 equivalent excess (relative to the reported resin activity) of DIEA for each Is used. If you cannot load 1 mole of FmocLeuOH into 1 kilogram of 2-CTC resin, you should not receive 2-CTC from the vendor. Hereinafter, target resins for FmocLeuOH, FmocGlnOH and FmocTrp (Boc) OH will be described.
[0142]
2-CTC resin can be loaded with 1.0-1.1 moles of FmocLeuOH per kilogram. Considering the loss of HCl, the resin dry weight after FmocLeuOH loading should be 1.32 to 1.35 times the raw resin weight and the measured loading should be 0.75 to 0.81 mmol per gram.
[0143]
2-CTC resin can be loaded with 0.8-1.0 moles of FmocGlnOH per kilogram. Considering the loss of HCL, the resin dry weight after FmocGlnOH loading should be 1.27 to 1.33 times the raw resin weight and the actual loading should be 0.63 to 0.75 mmol per gram.
[0144]
2-CTC resin can be loaded with 0.9-1.1 moles of FmocTrp (Boc) OH per kilogram. Considering the loss of HCL, the resin dry weight after FmocTrp (Boc) OH loading must be 1.44 to 1.54 times the raw resin weight, and the actual loading should be 0.63 to 0.72 mmol per gram.
[0145]
To accurately analyze the weight gain, the loss of drying (LOD) of the starting resin must be measured. LOD should not exceed 1%. If the residual solvent (ie, DIEA / HCl) is not completely removed from the resin during drying (after loading), the isolated mass will increase and the measured loading will be low. However, the total number of moles loaded (mass × actual loading) should be within the above range. When the upper limit of the loading amount (that is, the total number of moles loaded per kilogram of the starting resin) exceeds 10% or more for any of the above amino acids, the use test is performed using fewer amino acids. This is particularly important in the case of FmocGlnOH.
[0146]
11.1Fmoc-AA (Boc) -2- Large-scale production of chlorotrityl resin
The purpose of the following sections is to perform large-scale loading of resins suitable for producing large quantities of peptides for solid phase peptide synthesis (SPPS). Resin is added to each of the following FmocTrp (Boc) OH, FmocGln (Boc) OH and FmocLeu (Boc) OH. Approximately 4 kilograms of 2-CTC resin was added to each starting residue.
[0147]

1. Initial numbers were calculated by weight-based HPLC assay against Fmoc-AA standard. The numerical value in parentheses was calculated by weight increase in consideration of the LOD of the starting material 2-CTC resin being 12%.
[0148]
The starting 2-CTC resin was obtained from Colorado BioTech. The loading is announced as 1.4 meq / g. A standard loading procedure of 1.5 equivalents of FmocTrp (Boc) OH, 1.7 equivalents of DIEA in DCM (5 vol), 2 hours at ambient temperature was used, and the initial 2-CTC amount was 3.7 kilograms. This gave 4.493 kilograms of FmocTrp (Boc) O-resin, which had a theoretical loading at 0.56 mmol / g by weight-based HPLC assay of FmocTrp (Boc) OH after resin cleavage (total 2.52 moles). For a total of 1.62 moles produced, the loading is calculated to be 0.36 millimoles per gram due to the increase in resin weight. However, a total of 2.52 moles is far from the intended loading of 4 moles of FmocTrp (Boc) OH per 4 kilograms of resin, but weight increases when considering the LOD of the starting 2-CTC resin as 12% The loading calculated by is the same at 0.56 mmole / g.
[0149]
In two experiments using standard loading methods, a total of 4.59 kilograms of FmocLeuO-resin was produced from 3.9 kilograms of 2-CTC.
[0150]
However, a substantially lower loading than expected was obtained. FmocLeuOH after resin cleavage was assayed by weight-based HPLC and the first batch showed a theoretical loading of 1.07 mmol per gram. Considering that the LOD of the starting material 2-CTC resin is 12%, this is clearly impossible because the theoretical loading due to weight gain is 0.647 millimoles (500 grams) per gram. The actual loading appears to be close to 0.647 millimoles per gram for a total of 1.577 moles loaded.
[0151]
A second batch of FmocLeuO-resin (2.154 kilograms) made from 1.7 kilograms of 2-CTC had a theoretical loading of 0.68 mmol / gram, while the weight gain loading was 0.66 mmol / gram.
[0152]
A total of 3.856 kilograms of FmocGlnO-resin was made by a single batch method using 0.8 equivalents of FmocGlnOH and 1 equivalent of DIEA in 7 volumes of 5/2 DMF / DCM, starting from 3.65 kilograms of 2-CTC. For a total of 2.12 moles of FmocGlnO-resin, the theoretical substitution amount by weight-based HPLC assay was 0.55 mmol per gram. Considering the LOD of the starting 2-CTC resin is 12%, the theoretical loading due to weight gain is 0.52 mmol per gram for a total of 2.0 mol FmocGlnO-resin.
[0153]
In general, the loading due to weight gain should be greater than or equal to the loading calculated by the weight-based HPLC assay for loaded AA or removed fulvene. The starting 2-CTC must have an LOD of less than 1% and the isolated FmocAAO resin may contain small amounts of NMP, salt and / or residual FmocAAOH.
[0154]
11.1.1Fmoc-AA (Boc) -2- Preferred large-scale production of chlorotrityl resin
FmocTrp (Boc) OH as well as FmocLeuOH
Air sensitive 2-chlorotrityl chloride resin (1 eq, 3.7 kg, 5.18 mol) is placed in a SPPS chamber and washed with 5 volumes of DCM. The solvent is removed and a solution of FmocTrp (Boc) OH or FmocLeu (Boc) OH (1.5 eq) and DIEA (1.7 eq) in DCM (5 vol) are added (Note 1). Stir the slurry with stirring for 2 hours. After removing the solvent, the active sites remaining in the resin are endcapped with 9: 1 MeOH: DIEA (5 volumes) for 30 minutes. After removing the solvent, the resin is washed 6 times with 5 volumes of DCM. After the resin is dried to a constant weight, it is sampled and analyzed for loading (Note 2). The same method is used to load FmocLeuOH.
[0155]
FmocGluOH
Under a nitrogen atmosphere, air sensitive 2-CTC (3.65 kg, 1.4 mmol / gram) resin is placed in a 40 L SPPS chamber and washed with DCM (5 vol). A 20 L reaction vessel is charged with FmocGlnOH (1.506 kilograms, 0.8 eq), DMF (5 vol) and DIEA (1.0 eq). Drain the SPPS chamber and add the DMF solution. Wash the reaction vessel with DCM (2 volumes) and add the wash to the SPPS chamber. The resin is stirred in the SPPS chamber for 2 hours under a nitrogen atmosphere and then drained. All active sites remaining on the resin are capped with 9: 1 MeOH: DIEA (5 volumes) for 30 minutes. The resin is drained and then washed with DCM (5 volumes, 6 times). After the resin is dried to a constant weight (3.856 kg), it is sampled and tested for loading level (Note 2).
[0156]
note:
1. 2-Chlorotrityl chloride resin is very sensitive to humidity. Water gives HCl when it covers the surface of the resin. As long as the solvent is dry, there is little difference between DCE and DCM.
[0157]
2. Resin loading is determined by cleaving Fmoc amino acids from the resin and assaying against a standard by quantitative wt / wt HPLC analysis.
[0158]
Phenomenex Jupiter C18, 300A, Sm
1 mL / min, 260 nm
A: 0.1% aqueous TFA
B: 0.1% TFA in acetonitrile
65% B, isocratic
Retention time: about 8 minutes
When the number of washings before resin drying is insufficient and NMP cannot be completely removed from the resin, the loading amount measurement due to an increase in resin weight may be inaccurate. The calculation is as follows.
[0159]
(Fmoc-AA-OH Resin mass-starting 2-CTC mass) / Fmoc-AA-OH resin mass (molecular weight of loaded AA-molecular weight of HCl)
It was observed that substantial cleavage from the resin occurred when the peptide fragments of the present invention were stored in DCM for long periods (days). For example, when constructing FmocAA17-26OH, the partially constructed fragment was stored twice in DCM over the weekend. After completion of the synthesis and removal from the resin, FmocAA17-26OH was obtained in 8% yield. During storage over the weekend, it is believed that traces of HCl present in DCM may have gradually cleaved partially constructed fragments from the resin.
[0160]
Samples of FmocAA17-26O-resin, AcAA1-16O-resin and FrmoAA27-35O-resin were left in DCM and IPA for 1 week at room temperature. The supernatant of each resin was analyzed by HPLC. Although quantitative results were not obtained, all fragments were cleaved from the resin to a significant degree in DCM, whereas no cleavage was observed in IPA. If the partially constructed piece needs to be stored for 2-3 days (over the weekend), the solid should be washed with NMP and the bed drained and saturated with NMP under a nitrogen atmosphere. Good.
[0161]
To finally wash FmocLeuO-resin, FmocGlnO-resin, FmocTrp (Boc) O-resin, FmocAA17-26O-resin, AcAA1-16O-resin and FrmoAA27-35O-resin, DCM was replaced with IPA. FmocLeuO-resin, FmocGlnO-resin and FmocTrp (Boc) O-resin saturated with IPA were dried at 40 ° C. FmocAA17-26O-resin, AcAA1-16O-resin and FrmoAA27-35O-resin were constructed from those loading resins dried at 4 ° C. At the end of synthesis, the resin-bound fragments were washed with DOM until clean and then with IPA. Resin-bound fragments saturated with IPA were separated and dried at ambient temperature and 40 ° C. Fragments were cleaved from the resin and analyzed by HPLC. No difference in fragment purity was observed. When resin-bound fragments saturated with IPA are dried at 40 ° C., drying does not affect the nature or amount of the isolated fragments.
[0162]
The SPPS of the fragments was examined in DMF against NMP / DCM (1 gram of resin swells to 5 mL in both solvent systems). The FmocAA27-35OH fragment was synthesized using DMF as the solvent and TBTU vs. HBTU as the coupling reagent. FmocAA27-35OH was isolated with a yield of 77% and a purity of 89.5 A%.
[0163]
Uncoupled fragments are removed by a work up procedure of FmocAA17-36NH2 and AcAA1-36NH2 fragments. During solid phase synthesis, acetylation (end-capping) of these fragments at the deletion site ensures that the deletion fragments are not coupled by solution phase coupling. Fragments that were not coupled during the synthesis of both FmocAA17-36NH2 and AcAA1-36NH2 fragments must be removed during IPA and ACN finishing.
[0164]
11.2AcAA (1-16) -OH fragment (3c fragment ) Large-scale manufacturing
Large scale production of AcAA1-16-OH fragments by SPPS was performed twice to obtain a total of 7.941 kilograms of resin-bound fragments from 3.53 kilograms of FmocGlnOH-resin. Both loadings of the starting material, FmocGlnOH-resin, were a little over 0.55 mmol / gram obtained by the weight-based HPLC assay, but rather increased weight considering the 12% LOD of the starting material 2-CTC The more accurate value is 0.52 mmol / gram obtained by. Besides having a lower resin loading than desired, amino acids were used in excess of 6% each during SPPS.
[0165]
SPPS used 2.5 equivalents of the first FmocGln (trt) OH in the resin and 1.7 equivalents for each subsequent amino acid in the fragment (relative to 0.55 mmol / gram loading). When the coupling reaction was performed in 8 volumes of 3: 1 NMP: DCM, all but 2 of the 32 coupling reactions (including acetylation) were completed within 2 hours. All washes were performed with 5 volumes of NMP.
[0166]
Wash the resin-bound fragments in 3.4 volumes (based on dry AcAA1-16O-resin weight) of 1% TFA / DCM at 0-5 ° C., 5-6 times for 5 minutes per wash. Each wash is collected in 1.36 volumes of 0.33 M aqueous NaHCO3 to neutralize TFA. Combine the three-phase washings and add water (2 volumes). Distilling off the DCM leaves a filterable precipitate in the aqueous sodium bicarbonate solution. The multi-phase slurry becomes viscous and creamy during distillation and then becomes a filterable slurry when DCM is removed to the end. The slurry is cooled to 0-5 ° C. and the pH is adjusted to 3.0 with 0.1 N HCl. The slurry is stirred at 0-5 ° C. for 1-2 hours, collected by filtration, washed and dried. In subsequent experiments, the solid is collected, returned to the reaction vessel, triturated with water for 1-2 hours, then collected and dried.
[0167]
AcAA1-16OH cleavage from the resin was performed in 4 experiments using 1% TFA in DCM. A total of 4.814 kilograms of AcAA1-16OH was obtained from 3.53 kilograms of FmocGlnO-resin with a purity of 93-96 A%. The total yield based on a loading of 0.52 mmol / gram determined by weight gain considering that the LOD of the starting material 2-CTC (theoretical 5.83 kg) is 12% is 83%.
[0168]
Since the sodium salt of AcAA1-16OH is insoluble in both DMF and NMP, pH adjustment is necessary to protonate the carboxyl terminus. Water washing ensures removal of sodium trifluoroacetate from the product. HAA17-36NH in the presence of a small amount of sodium trifluoroacetate on a wt / wt basis₂Solution phase coupling with is hindered.
[0169]
This piece must be dried at ambient temperature. A stability test in which wet AcAA1-16OH was dried at 40 ° C. showed about 4% degradation in 3 days. Interestingly, the dried solid is stable at 80 ° C. for 24 hours.
[0170]
11.2.1Ac-AA (1-16) -OH fragment (3c fragment ) Preferred large-scale production method
Resin-bound FmocGlnOH (1.53 kilograms, 0.55 mmol / gram, 0.84 mole) is added to a 40 L peptide chamber. Condition the resin with DCM (5 vol) under nitrogen with stirring for 15 minutes and then drain. 20% piperidine NMP solution (5 volumes) is added and the resulting suspension is stirred under nitrogen for 20 minutes. Drain the solution and repeat this process. Wash the resin 5 times with 5 volumes of NMP to remove dibenzofulvene and remove piperidine as determined by the chloroanil test (Note 1).
[0171]
Wash the resin to remove piperidine, mix the next amino acid in sequence (1.5 eq), HOBT (1.5 eq) and DIEA (1.5 eq) in NMP (6-7 vol) and cool to 0 ° C To do. HBTU (1.5 eq) is added to the cooled solution and the solution is stirred for 10-15 minutes to dissolve the HBTU. A cooled solution of the active amino acid is added to the resin and then washed with DCM (2.5 vol) (Note 2). Stir the suspension for 2 hours under a nitrogen purge. Thereafter, a resin sample is taken out for the qualitative ninhydrin test (Note 3). If the ninhydrin test is negative, drain the reaction vessel and wash 3 times with 5 volumes of NMP (Note 4). This cycle is then repeated for the next amino acid in the sequence. If the ninhydrin test is positive, the suspension is stirred for an additional hour and retested. If the ninhydrin test is negative, proceed to the next cycle. If the ninhydrin test is still positive, recouple 1 equivalent of amino acid with the reagent. If the ninhydrin test is positive after 1 hour, endcapping with 5 equivalents (Seq) of acetic anhydride and 5 equivalents (Seq) of pyridine in NMP (10 volumes) for 1 hour.
[0172]
After fragment synthesis, after removing Fmoc from the last amino acid as described, in a solution of acetic anhydride and pyridine (5 equivalents each) in 3: 1 NMP: DCM (10 vol) for 20-30 minutes, or The resin is agitated until the ninhydrin test is negative. After draining the resin, it is washed twice with 5 volumes of NMP, 5 times with 5 volumes of DCM and dried to give 3.49 kilograms of AcAA1-16O-resin.
[0173]
Place dry resin-bound AcAA1-16 (3.49 kilograms) in a 40 L SPPS chamber. The resin-bound peptide is cleaved from the resin using 6 x 3.4 volumes of 1% TFA / DCM (Note 7). Collect each cleavage wash in 1.36 volumes of 0.33 M aqueous sodium bicarbonate. Combine the two-phase fractions and dilute with 2 volumes of water. Concentrate the two-phase mixture under reduced pressure (15 Hg, 20 ° C.) to remove DCM. If necessary to continue stirring, add more water (2 vol) during distillation (Note 6). If DCM is removed (several hours), the suspension is cooled to 0 ° C. and the pH is adjusted to 3 with 1N aqueous HCl. The slurry is collected after stirring for 1 hour at 0 ° C. The wet solid is returned to the reaction vessel and triturated with water (7 vol) to remove any remaining TFA and sodium trifluoroacetate. Collect the solids by vacuum filtration and dry to constant weight (1.12 kilograms, 95 A%). The yield of AcAA1-16OH based on 0.52 mmol / gram loading is 86% (Note 7).
[0174]
note :
1. Add 1 drop of saturated chloroanil toluene solution to about 1 ml of acetone, then add 1 drop of effluent. Blue or purple indicates positive for the presence of piperidine. The higher the bed height, the more NMP is needed to wash away piperidine.
[0175]
2. Add DCM to ensure proper swelling of the resin.
[0176]
3. A quantitative ninhydrin test is appropriate for monitoring coupling efficiency. Remove 2-20 milligrams of resin sample and wash with methanol until clean. Add 3 drops of 76% phenol ethanol solution, 4 drops of 0.2 mM KCN pyridine solution and 3 drops of 0.28 M ninhydrin ethanol solution to the sample. The solution is diluted to 0.5-1 ml with ethanol and placed on a heating block at 75 ° C. for 5-10 minutes. Blue or purple indicates free amine (positive). A clear blue or light blue indicates a negative result.Quantitative ninhydrin test method literature: Sarin, V.K., Kent, S.B.H., Tam, J.P., & Merrifield, R.B. (1981) Analytical Biochem. Iii, 147-157.
[0177]
4. If the resin is stored overnight, wash it twice with 5 volumes of NMP, then drain and store under nitrogen. Do not store under DCM. In this case, the peptide is cleaved from the resin, causing a substantial amount of loss.
[0178]
5. For each fraction, examine product content by TLC visualization at 254 nm. Most of the product is removed by the first 5 washes.
[0179]
6. As the DCM is removed, the reaction will become marshmallow cream firm. As distillation continues, the suspension gradually turns into a hard slurry. It is important to gradually remove DCM to prevent oil from leaving the product.
[0180]
7. Vydac C8, 5μ, 300A
1 mL / min, 30 ° C, 230 nm
A 1000: 1 water / TFA
B 800: 200: 1 IPA: ACN: TFA
60-95% B / 30 min
Retention time: 13.1 minutes
11.3FmocAA (17-26) -OH fragment (10b fragment ) Large-scale manufacturing
A total of 5.3 kilograms of FmocAA17-26O-resin was made from 2.4 kilograms of FmocLeuO resin in two experiments of the same size. In 4 experiments of the same size, 5.3 kg of FmocLeuO-resin was cleaved from this resin, and 3.184 kg of FmocAA17-26OH with a purity of 94.4 A% and a yield of 90% was obtained on average.
[0181]
The reaction was carried out using 1.5 equivalents of each amino acid for the loading factor, resulting in a 65% excess of amino acid for each coupling cycle. All coupling reactions were completed within 2 hours (negative ninhydrin test).
[0182]
The Fmoc protecting group was removed by keeping in 20% piperidine NMP (5 vol) for 20 minutes and this was repeated. The piperidine was washed from the resin by washing 5 times with 5 volumes of NMP. The coupling reaction was performed in 8 volumes of 3: 1 NMP: DCM. The coupling solution was removed and the solid was washed 3 times with 5 volumes of NMP. This cycle was repeated for the next amino acid in the sequence. After fragmentation, the resin bed was washed twice with 5 volumes of NMP and 5 times with 5 volumes of DCM and then dried to constant weight.
[0183]
Wash several times with 1% TFA in DCM to remove fragments from the resin. The DCM solution of 1% TFA does not need to be cooled. This fragment is much more stable than AcAA1-16OH in 1% TFA / DCM (1% / day). The product-containing acidic DCM wash is collected and neutralized with pyridine. The combined washings are distilled to remove DCM, ethanol is added to maintain the solution, and residual DCM is driven off during the distillation. After removing DCM (as judged by the increase in temperature at which the distillate is removed), water is added to precipitate the fragments. Collect the solid by vacuum filtration (within 60 minutes). The wet solid is returned to the reaction vessel and triturated with 0/20 ethanol / water (5 volumes) for 60 minutes at 0-5 ° C. FmocAA17-26OH precipitated by vacuum filtration is collected, washed with a minimum amount of 80/20 ethanol / water and dried (vacuum, no heat, 10 days).
[0184]
11.3.1FmocAA (17-26) -OH fragment (10b fragment ) Preferred large-scale production method
FmocLeuO-resin (1.2 kilograms, 0.776 mol) is placed in a 40 L SPPS chamber and then the resin is swollen with DCM (5 volumes). DCM is necessary to ensure complete swelling of the dried raw resin. After the suspension is stirred for 20-30 minutes, the liquid is removed. 20% piperidine NMP solution is added (5 volumes) and the solution is stirred for 20 minutes. The process is repeated after removing the solvent. The solvent is removed, and the resin bed is washed 5 times with 5 volumes of NMP to remove piperidine (Note 1).
[0185]
While deprotecting, place the next amino acid in the sequence (1.95 eq), HOBT (1.95 eq), DIEA (1.95 eq) and NMP (6 vol) in a 20 liter round bottom flask equipped with a mechanical stirrer. Stir the solution until the solid dissolves, then cool to 0-5 ° C. and add HBTU (1.95 eq). Stir the solution until the HBTU is dissolved, or if not containing piperidine, stir the resin (whichever is first) and then add to the resin. The reaction vessel is washed with DCM (2 volumes) and transferred to the SPPS reaction vessel. Note: The amino acid and reagent stoichiometry should be 1.5 equivalents.
[0186]
Suspend the resin in the coupling solution with gentle agitation. After 2 hours, remove the resin sample from the SPPS chamber and perform a qualitative ninhydrin test (Note 2). If the ninhydrin test is negative, drain the reaction vessel and wash 3 times with 5 volumes of NMP. This cycle is then repeated for the next amino acid in the sequence (swelling with DCM only for the first amino acid loaded).
[0187]
If the ninhydrin test is positive, the suspension is stirred for an additional hour and retested. If the ninhydrin test is negative, proceed to the next cycle. If the ninhydrin test is still positive, re-couple 1 equivalent of amino acid and reagent. If the ninhydrin test is positive after 1 hour, endcapping with 5 equivalents of acetic anhydride and 5 equivalents of pyridine in NMP (10 volumes) for 1 hour.
[0188]
After fragment synthesis, the resin is drained, washed twice with 5 volumes of NMP, washed 5 times with 5 volumes of DCM, and dried to give 2.67 kilograms of FmocAA17-26O-resin.
[0189]
Cleavage FmocAA17-26OH from the resin (1.33 kilograms) using 1.7 volumes of 1% TFA in DCM 5-6 times over 5 min. Collect 1% TFA / DCM wash in a pyridine-containing flask (volume ratio 1: 1 for TFA in wash). Combine product wash (about 14 liters) and distill DCM to minimum pot volume (about one third of the original volume). Adjust the degree of vacuum to maintain the pot temperature at 15-25 ° C. Add ethanol (6.5 vol) and continue distillation until no DCM is present (determined by distillate temperature; Note 3). Adjust the degree of vacuum again to keep the pot temperature at 15-20 ° C. The final pot capacity should be about 8-10 volumes. The solution is cooled to 5-10 ° C. and water (6.5 vol) is added over 30 minutes to precipitate FmocAA17-26OH. Collect the solid by vacuum filtration and wash with water (2-3 volumes). To remove residual pyridine and / or salt, the still wet solids are returned to the reaction vessel and 80/20 ethanol / water (5 vol) pre-cooled to 0 ° C. is added. The suspension is stirred for 60 minutes at 0 ° C. Solids are collected by vacuum filtration, washed with a minimum amount of 80/20 ethanol / water, and dried to constant weight, yielding 0.806 kilograms of FmocAA17-26OH with 90.6% yield and 96 A% purity (Note 4).
[0190]
note :
1. Add 1 drop of saturated chloroanil toluene to 1 ml of acetone, then add 1 drop of effluent. Blue or purple indicates positive for the presence of piperidine.
[0191]
2. The quantitative ninhydrin test is appropriate for monitoring coupling efficiency. Take 2-20 milligrams of resin sample and wash with methanol until clean. Add 3 drops of 76% phenol ethanol solution, 4 drops of 0.2 mM KCN pyridine solution and 3 drops of 0.28 M ninhydrin ethanol solution to the sample. The solution is diluted to 0.5-1 ml with ethanol and placed on a heating block at 75 ° C. for 5-10 minutes. Blue or purple indicates free amine (positive). Clear blue or light blue indicates a negative result.
[0192]
3. Head temperature during vacuum distillation of DCM was 10-15 ° C. When DCM was removed, the head temperature rose to 3500.
[0193]
4. Bydak C8, 5μ, 300A
1 mL / min, 262 nm, 30 ° C
A Water / 0.1% TFA
B ACN / 0.1% TFA
80-99% B / 20 min
Retention time: 15.2 minutes
11.4FmocAA (27-35) -OH fragment (16b fragment ) Large-scale manufacturing
A total of 4.694 kg FmocAA27-35-OH was synthesized from 4.45 kg FmocTrp (Boc) O-resin. Solid phase synthesis was performed in 2 batches and cleavage from the resin was 4 batches. FmocAA27-35-OH obtained from one batch was about 5% less pure than the material obtained from the other batch. This was due to the unidentified impurity 5A% removed during processing to FmocAA17-36-NH2. The total amount of FmocTrp (Boc) OH loaded on the resin was 2.5 mol. Solid phase synthesis proceeded as expected for a resin loaded at approximately 63% volume. All couplings were completed with the first two hour checkpoint. The amount of reaction and washing used for SPPS and cleavage was the same as the amount used for FmocAA17-26OH synthesis. Cleavage from the resin was as described above. Filtration was rapid (15 minutes). It took 3 days to dry the solid after 90/10 ethanol / water trituration (vacuum, no heating). The fragments are stable to drying at 40 ° C.
[0194]
11.4.1Ac-AA (27-35) -OH fragment (16b fragment ) Preferred large-scale production method
DCM (5 vol) is added to a SPPS chamber containing FmocTrp (Boc) -resin (1 eq, 2.2 kg, 1.23 mol). The resulting suspension is stirred for 15 minutes and then drained. 20% piperidine in NMP (5 vol) is added and the resulting suspension is stirred for 10-15 minutes to remove the Fmoc protecting group. After repeating this process, the resin is washed 5-7 times with NMP (5 vol) until the chloroanil test is negative (Note 1).
[0195]
In NMP (6 vol), the following amino acids (1.5 eq), HOBT (1.5 eq) and DIEA (1.7 eq) are combined and cooled to 0-5 ° C. (Note 2). HBTU is added and the solution is stirred for 10-15 minutes to dissolve the HBTU. Add the active amino acid solution to the resin. Wash the reaction vessel with DCM and add to the resin (Note 3). The suspension is stirred for 1-2 hours under a nitrogen atmosphere. The completion of coupling is monitored by a qualitative ninhydrin test (Note 4). If the ninhydrin test is negative, drain the reaction vessel, wash 3 times with 5 volumes of NMP and repeat this cycle for the next amino acid in the sequence (swell with DCM only for the first amino acid loaded) .
[0196]
If the ninhydrin test is positive, the suspension is stirred for an additional hour and retested. If the ninhydrin test is negative, proceed to the next cycle. If the ninhydrin test is still positive, re-couple 1 equivalent of amino acid and reagent. If the ninhydrin test is positive after 1 hour, endcapping 5 equivalents of acetic anhydride and 5 equivalents of pyridine in NMP (10 volumes) for 1 hour.
[0197]
After fragment synthesis, the resin is drained, washed twice with 5 volumes of NMP, washed 5 times with 5 volumes of DCM and dried to give 4.11 kilograms of FmocAA27-35O-resin.
[0198]
To cleave the fragments from the resin, the resin is cleaved from the resin (2.05 kilograms) using 1.7 volumes of 1% TFA in DCM, 6 times for 5 minutes at a time. The 1% TFA / DCM wash is collected in a flask containing pyridine (1: 1 volume ratio to TFA in the wash). Combine the product-containing washings and distill off DCM until it is about half the original pot volume (pot temperature is maintained at about 15 ° C. by adjusting the vacuum). Gradually add ethanol (5 vol) and continue distillation until the DCM is gone (determined by the temperature of the distillate. Note 5) Distillation (adjust the vacuum to keep the pot temperature at about 20 ° C). Pot capacity should be about 6-7 capacity. Cool the cloudy solution to 10-15 ° C. and add water (3.5 vol) over 30 minutes with rapid stirring to precipitate FmocAA27-35-OH. Collect the solid by vacuum filtration (15 min) and wash with water (1 volume). To remove residual pyridine, the wet solid is returned to the reaction vessel and 90/10 ethanol / water (10 vol) previously cooled to 0-5 ° C. is added. The slurry is stirred for 60 minutes at 0-5 ° C. The solid was collected by vacuum filtration, washed with 90/10 ethanol / water (0.5 vol) and dried to constant weight, yielding 1.19 kilograms of FmocAA27-35-OH with 89% yield and 89.2 A purity. (Note 6).
[0199]
This protocol can be reprocessed by triturating the solids with 15 volumes of 9: 1 ethanol / water with stirring for 12 hours, then collecting and drying.
[0200]
note :
1. Add 1 drop of saturated chloroanil toluene to 1 ml of acetone, then add 1 drop of effluent. Blue or purple indicates positive for the presence of piperidine.
[0201]
2. Add reagent without HBTU at room temperature to aid lysis. Adding HBTU to the cooled solution reduces racemization.
[0202]
3. Since HBTU does not dissolve in DCM, activation is performed in NMP. While DCM is used to wash the reaction vessel, it is added to the resin to maintain proper resin swelling.
[0203]
4. A quantitative ninhydrin test is appropriate to monitor coupling efficiency. Remove 2-20 milligrams of resin sample and wash with methanol until clean. Add 3 drops of 76% phenol ethanol solution, 4 drops of 0.2 mM KCN pyridine solution and 3 drops of 0.28 M ninhydrin ethanol solution to the sample. The solution is diluted to 0.5-1 ml with ethanol and placed on a heating block at 75 ° C. for 5-10 minutes. Blue or purple indicates free amine (positive). Clear blue or light blue indicates a negative result.
[0204]
5. The head temperature was kept at 10-15 ° C during DCM distillation under reduced pressure. The head temperature rose to 35 ° C when DCM was removed.
[0205]
6. Baidak C8, 5μ, 300A
1 mL / min, 262 nm, 30 ° C
A Water / 0.1% TFA
B ACN / 0.1% TFA
80-99% B / 20 min
Retention time: 15.3 minutes
11.5FmocAA (27-35) -OH When HPheNH2 By solid phase coupling FmocAA (27-36) -OH Large-scale production of fragments
A total of 5.226 kilograms of FmocAA27-36NH2 was made in 4. experiments from 4.676 kilograms of FmocAA27-35-OH. The remaining coupling reagent or solvent yields 100% or more. These are removed in the next step.
[0206]
Solid matter adhering to the reaction vessel wall after water dropout became an important issue at this stage. It took 30 minutes to separate the crude solid by vacuum filtration. The average drying time (reduced pressure, no heating) for these experiments was 8 days. Solids need to be compressed on filter paper to remove excess water before entering the oven. This piece is stable to dry at 40 ° C. and the vacuum oven needs to be heated.
[0207]
Use tests are conducted on 0.5-1 gram batches per lot of starting material used to help establish properties and identity. The conversion of starting material to product is monitored using thin layer chromatography (TCL) and HPLC. The first impurity that must be explored in the FmocAA27-35OH fragment is trifluoroacetic acid (or its salt). Activation and reaction of trifluoroacetic acid present in FmocAA27-35OH with phenylalanine amide is a rapid process. A small excess of phenylalanine amide can be used to consume the existing trifluoroacetic acid. A further important property problem is with purchased phenylalaninamide. Most vendors sell this as the hydrochloride salt. Some of the lots of phenylalaninamide hydrochloride produce impurities (5-15 A%) that co-elute with the starting material during HPLC. This impurity can be separated from the starting material fragments and product by TLC. FmocAA27-35NH2 resulting from ammonium chloride present in phenylalaninamide hydrochloride is an impurity.
[0208]
11.5.1FmocAA (27-35) -OH When HPheNH2 By liquid phase coupling FmocAA (27-36) -OH Large-scale production of fragments
A 40 liter jacketed reaction vessel equipped with a mechanical stirrer is charged with FmocAA27-35OH (1 eq, 1.185 kg), HOAT (1.1 eq), HCl.HPheNH2 (1.15 eq) and DMF (12.5 vol). DIEA (2.1 eq) is added, the solution is cooled to 0-5 ° C. and HBTU (1.2 eq) is added. The reaction mixture is stirred at 0-5 ° C. for 15 minutes, then warmed to room temperature and stirred for an additional 70 minutes (Note 1, using HPLC for process check). After the reaction is judged complete by HPLC, the peptide precipitates when water (12.5 vol) is added over 15-30 minutes. The slurry is stirred for 15 minutes at ambient temperature. The solid is collected by vacuum filtration, washed with water (3 vol) and dried to give FmocAA27-36NH2 (1.357 kg in 107% yield, 87.1 A% purity by HPLC) (Note 2).
[0209]
The reaction can be carried out again by triturating the solid with 15 volumes of 9: 1 acetonitrile / water, collecting and drying for 12 hours with stirring.
[0210]
note :
1. In process control, TLC:
88/12 Dichloromethane / Methanol
UV and iodine detection
Rf: FmocAA27-35OH, 0.49
Rf: FmocAA27-36NH2, 0.63
Baidak C8, 5 m, 300A
30 ° C, 1 mL / min, 262 nm
A Water / 0.1% TFA
B ACN / 0.15 TFA
80-99% B / 20 min
Retention time: FmocAA27-35OH, 15.8
Retention time: FmocAA27-36NH2, 17.12
2. Generally, the yield obtained is greater than the theoretical yield unless the isolated solid is returned to the reaction vessel and triturated with water.
[0211]
11.6FmocAA (27-36) OH from HAA (27-36) -OH Large-scale production of fragments
A total of 3.897 kilograms of HAA27-36NH2 was produced in 4. experiments from 5.221 kilograms of FmocAA27-36NH2 with an average two-step yield of 86.4%. The range of yields observed in these experiments, 74-97%, is thought to reflect the carry-in from one experiment to the next.
[0212]
At this stage, both production and product isolation are very successful. The exact amount of DCM remains in the MTBE, and the physical properties of the solids result in rapid filtration and drying. This product isolation method is incorporated into a new step described in Section 11.6.2 below.
[0213]
DCM is FmocAA27-36NH₂It is a solvent used in the deprotection. Upon completion of deprotection, the organic solution is washed twice with water to remove most of the excess piperidine and then concentrated to about 1/3 of the original volume. MTBE is added to precipitate the fragments. By continuing the distillation, most of the remaining DCM is removed, completing the precipitation of the fragments. It is important to remove most of the DCM to prevent mass loss during precipitation. It is also important to leave some DCM in the MTBE to ensure product purification. Dibenzofulvene, piperidine / fulvene adduct and residual piperidine are soluble in MTBE. HAA27-36NH₂Is recovered and dried. If necessary, secondary trituration of the solid with MTBE (12 hours) may result in residual dibenzofulvene and, more importantly, HAA27-36NH.₂Remove any piperidine / fulvene adduct that may be present in Grinding with hexane removes dibenzofulvene but not the piperidine / fulvene adduct. The drying time of the solid isolated from MTBE is 1 day.
[0214]
HAA27-36NH₂And because of the high solubility of the relevant impurities in DCM / MTBE, the analytical method was required to accurately determine the end point of the solvent exchange. A GC method has been developed to quantify DCM in MTBE. The distillation is complete when the DCM content in MTBE is below 6%.
[0215]
11.6.1FmocAA (27-36) -OH Fragment from HAA (27-36) -OH Large-scale manufacturing
FmocAA27-36NH was added to a 40L glass jacketed reactor equipped with a stirrer and thermometer.₂(1 equivalent, 1.356 kg), DCM (5 vol) and piperidine (0.2 vol) are introduced. The solution is stirred at ambient temperature for 1.5 hours (Note 1). The organic solution is washed with water (2 × 5 volumes). The volume of the organic layer is reduced to about 1/3 of the original organic capacity by distillation (about 25 mmHg, yet the jacket temperature is less than 45 ° C. to prevent melting of the solid). While gradually introducing MTBE (5 volumes) into the reactor, the concentration is continued to the heavy sedimentation point, and the pot volume is set to about 5 volumes. When the DCM content falls below 6%, the solvent exchange is stopped. The slurry is cooled to 0-5 ° C., stirred for 60 minutes and then collected by vacuum filtration (rapid). Wash the solid with MTBE (2x0.5 vol), dry to constant weight, 1.022 kg of HAA27-36NH₂Got. The yield was 89.2% (2 steps), and the purity was 91.1 A% (Note 1).
[0216]
The reaction may be re-executed by grinding with MTBE (12.5 vol) at 23 ° C. for 13 hours and recovered by vacuum filtration and drying.
[0217]
note:
1. IPC and purity measured by HPLC:
Vydac, C8, 5, 300A
1mL / min, 262nm, 30 ℃
A Water / 0.1% TFA
B ACN / 0.1% TFA
80-99% B / 20 minutes
Retention time: FmocAA27-36NH₂, 16.5, HAA27-36NH₂8.4
11.6.2FmocAA (27-36) -OH When HPheNH ₂ Fragment due to liquid phase coupling of HAA (27-36) -OH Improved manufacturing of
HAA27-36NH directly from FmocAA27-35OH₂New methods have been developed that combine Sections 11.5 through 11.6.1. This new method is FmocAA27-36NH₂Eliminates the problems associated with isolation and long drying times. This will be described in detail below. This new method eliminates long drying times and one step from the synthesis process.
[0218]
A 100 mL round bottom flask equipped with a magnetic stirrer and nitrogen inlet was charged with FmocAA27-35OH (5.0 g, 1 eq), HOAT (0.459, 1.2 eq) and Phe-NH.₂(0.389, 1.2 eq) is introduced. To the flask is added 10 volumes of NMP (50 mL) and DIEA (0.45 g, 1.5 eq) and stirred under a nitrogen atmosphere until the solid dissolves. After the solution is cooled to 0-5 ° C., HBTU (1.04 g, 1.2 eq) is added. Stir at 0-5 ° C. for 30 minutes under nitrogen atmosphere. The reaction mixture is warmed to 20 ° C. and stirring is continued. Perform in-process inspection (IPC) 90 minutes after adding HBTU.
[0219]
After in-process inspection (IPC) reveals that the reaction is complete, piperidine (1.379, 7 eq) is added to the reaction mixture and stirred for 1.5 hours under a nitrogen atmosphere. Implement IPC (Note 1). If Fmoc removal is not complete, stir for an additional 30 minutes and perform IPC.
[0220]
When complete, the reaction mixture is added to a 5% aqueous acetic acid solution (30 volumes) at such a rate that the temperature does not exceed 35 ° C. The resulting slurry is stirred for 1-2 hours and collected by vacuum filtration (Note 2). The solid is washed with 10 volumes (50 mL) of water.
[0221]
The wet solid is returned to the reactor and 20 volumes of water (100 mL) is added and stirred at ambient temperature for 1-2 hours. The solid is recovered by vacuum filtration, washed with 10 volumes of water (50 mL), and then dried (Note 3).
[0222]
Dibenzofulvene and dibenzofulvene piperidine adduct are removed by grinding the dried (Note 4) solid with MTBE (20 vol) at ambient temperature for 2-5 hours. Collect the solid by vacuum filtration and dry to constant weight. As a result, 4.55 g (94.3%) of HAA27-36NH₂And the purity was 85 to 90 A% (Note 1).
[0223]
Fmoc by-products (dibenzofulvene and its piperidine adduct) are generally removed with this protocol, but if reprocessing is required, the solid in 10 volumes of MTBE is stirred at 20 ° C. for 2-3 hours, Collect and dry.
[0224]
note:
1. In-process inspection by reverse phase HPLC (IPC):
Column: Vydac C8, 300A, 5μ, 30 ° C
Flow rate: 1 mL / min
Detection: 262nm UV
Mobile phase: A.1. Water / 0.1% TFA
B. Acetonitrile / 0.1% TFA
Method: 80-99% B over 20 minutes
Retention time: FmocAA27-36NH₂(16.5 minutes, HAA27-36NH₂(8.4 minutes)
2. The total filtration time was 10 minutes.
[0225]
3. The wet filter cake must be returned to the reactor and immediately washed with water to prevent solid oiling or gumming.
[0226]
4). To ensure removal of dibenzofulvene by-product by MTBE grinding, the crude product must be completely dried.
[0227]
11.7FmocAA (17-26) -OH When HAA (27-36) -OH Fragment of liquid phase synthesis fusion of FmocAA (17-36) -OH Large-scale manufacturing
In 4 runs, 2.993 kg of HAA27-36NH₂And 3.176 kg of FmocAA17-26OH, total 5.115 kg of FmocAA17-36NH₂Manufactured. The average yield was 84.3%. Filtration of the crude product after water dropout from the reaction mixture took an average of 40-50 minutes.
[0228]
Before conducting the coupling reaction, a usage test is performed on a 1-2 g scale to test both the HBTU and the fragments used. From usage tests, the calculated amounts of starting materials and reagents are determined. In use tests, the solubility of the starting material was also recorded. A cloudy solution indicates the presence of salt in FmocAA17-26OH and is the basis for water washing of the fragment. All components of the reaction mixture must clearly be present in the solution prior to the addition of HBTU to ensure that the starting material is completely converted to product so that racemization and by-product formation are minimal. I must.
[0229]
Crude FmocAA17-36NH isolated from water dropout₂The purity of is greatly increased by precipitation from IPA. FmocAA17-36NH₂Is partially soluble in IPA. FmocAA17-36NH using about 15 volumes of 95/5 IPA / water previously kept at 60-70 ° C₂After grinding, cool to room temperature over several hours with stirring to increase the purity of the fragments. Starting material, and piperidine amide of FmocAA17-26OH and HAA27-36NH₂Both enamine urea adducts are soluble in 95% IPA. Increasing the time for grinding the crude FmocAA17-36NH2 with 95% IPA at room temperature is not very effective in removing impurities. The stability test at 60-70 ° C was completed. If the IPA solution is not heated to temperatures above 52 ° C, the effect on the quality of the isolated product appears to be minimal.
[0230]
11.7.1FmocAA (17-26) OH When HAA (27-36) -OH Fragment of liquid phase synthesis fusion of FmocAA (17-26) -OH Preferred method for improved large-scale production of
To a 40 L jacketed reactor equipped with a stirrer and nitrogen supply port, FmocAA17-26OH (1 equivalent, 0.770 kg), HAA27-36NH₂(1 eq, 0.720 kg), HOAT (1.5 eq) and DMF (12.5 vol to FmocAA17-26OH) are introduced. EtPr₂N (1.5 eq) is added and the suspension is stirred at room temperature until the solid is dissolved (appearance). The solution is cooled to 0-5 ° C. under a nitrogen atmosphere before HBTU (1-1.05 eq) is added. The reaction mixture is stirred at 0-5 ° C. until the HBTU is dissolved (appearing about 15 minutes). The reaction mixture is warmed to 25 ° C. and stirring is continued for 2 hours (Note 1). After the DMF solution is cooled to 0-5 ° C, cold process water (12.5 vol) is added at a rate not exceeding 25 ° C. The resulting slurry is stirred for 1-24 hours and the solid is collected by vacuum filtration and washed with water (3 × 4 volumes). The solid is dried on the filter for 16-24 hours to double the theoretical mass. Into a 40 L reactor, 95/5 isopropanol / water (25 vol) is introduced and warmed to 45 ° C. FmocAA17-36NH in semi-dry state with rapid stirring₂Is added to the IPA solution. The suspension is warmed to 52 ° C. and then cooled to room temperature with stirring for 12-16 hours (Note 2). The solid was collected by vacuum filtration, then washed with a minimum amount of IPA, dried and 1.261 kg FmocAA17-36NH₂Got. The yield was 85%, and the purity by HPLC was 90.SA% (Note 1). The reaction may be re-run by repeating 95/5 IPA / water milling.
[0231]
note:
1. In-process inspection and purity, HPLC:
Vydac C8, 5μ, 300A
1mL / min, 262nm, 30 ℃
A. Water / 0.1% TFA
B. 80/20 IPA / ACN / 0.1% TFA
60-95% B / 20 minutes
Retention time: HAA27-36NH₂6.73 minutes
FmocAA17-26OH, 10.67 minutes
FmocAA17-36NH₂, 20.2 minutes,
2. FmocAA17-36NH₂Does not dissolve completely in this volume at this temperature. Prior to collecting the solid, stirring is stopped and the solid is allowed to settle. A sample of the filtrate is taken and analyzed by HPLC. FmocAA17-36NH with a large amount of filtrate₂If so, cool to 0 ° C. before recovering the solid.
[0232]
11.8FmocAA (17-36) -OH Fragment from HAA (17-36) -OH Large-scale manufacturing
In 4 runs, 5.112kg FmocAA17-36NH₂Total of 4.965kg HAA17-36NH₂Manufactured. Both isolated yield and HPLC trace indicate the presence of dibenzofulvene and possibly solvent. Dibenzofulvene present is removed with potassium carbonate rather than piperidine, so it does not interfere with the next coupling reaction. Therefore, the piperidine adduct of dibenzofulvene is not a chemical problem.
[0233]
There are several problems associated with this method. This reaction is carried out in 12 volumes of DMF. The base that removes the Fmoc group is 1 volume of 1.1 M potassium carbonate, which cannot produce a basic adduct with dibenzofulvene that is difficult to remove. Deprotection is allowed to proceed for approximately 90 minutes at room temperature.
[0234]
Add 1: 1 saturated sodium chloride: water-water solution previously cooled to 0 ° C. to coprecipitate the fragment and dibenzofulvene. This took a few (5-8) hours to filter and produced a fine milky white solid. After isolation, the wet solid must be thoroughly dried (less than 1% LOD) to remove dibenzofulvene impurities. Dry for 10 days (vacuum, no heat). Once dried, the solid is returned to the reactor to remove dibenzofulvene by grinding with 3: 1 heptane: MTBE (20 vol) for 18 hours at ambient temperature. If the pulverization time is shorter than this, dibenzofulvene cannot be completely removed, and if any water is present in the solid, it cannot be removed. If dibenzofulvene remains, reprocessing with 3: 1 heptane: MTBE (20 vol) can be performed.
[0235]
In order to solve these problems, the following new methods have been developed. FmocAA17-36NH₂(2.0 g, 1 eq) and heptane (8 vol) are added to a 100 mL round bottom flask equipped with stirrer, temperature controller and reflux condenser. Two volumes of MTBE (4 mL) are added and the slurry is heated to 45-50 ° C. (Note 1). Piperidine (10 eq) is added. Stir for 24 to 36 hours at 45 to 50 ° C. in a nitrogen atmosphere (Note 2). The reaction mixture is hot filtered at 45-50 ° C. (Note 3), then the cake is washed with 5 volumes (10 mL) of 60:40 heptane: MTBE.
[0236]
note:
1. If MTBE leaks from the reactor, which may change the heptane: MTBE ratio, the reaction may be slowed. When the reaction temperature exceeds 50 ° C., the reaction solid may become rubbery. Fmoc is largely removed in 5 hours.
[0237]
2. The completion of the reaction is monitored by RP-HPLC:

Thermal filtration helps remove the piperidine adduct of dibenzofulvene.
[0238]
11.8.1FmocAA (17-36) -OH Fragment from HAA (17-36) -OH Large-scale manufacturing
FmocAA17-36NH in a 40L jacketed reactor₂(1 equivalent, 1.26 kg) and DMF (12 vol) are introduced at room temperature. 1.11M aqueous potassium carbonate solution (1 volume, 5 equivalents) is added in one portion (Note 1). The reaction mixture is stirred at room temperature for 3.5 hours (Note 2). The reaction mixture is gradually added to a 1: 1 aqueous solution of saturated sodium chloride / water (10 vol) previously cooled to 0 ° C., but the rate is such that the temperature does not exceed 10 ° C. (about 1 to 2 hours). Using a rubber dam, the solid is recovered by vacuum filtration and water is squeezed from the filter cake (Note 3). Return the wet cake to the reaction vessel and grind (stir) with water (10 vol) for 1-2 hours to remove residual inorganic salts. The solid is recovered by vacuum filtration, compressed with a rubber dam, transferred to a vacuum oven and dried to constant weight. The dried solid (Note 4) is ground (stirred) with 3: 1 heptane: MTBE (20 vol) at room temperature for a minimum of 14 hours to remove dibenzofulvene. The solid was collected by vacuum filtration, washed with heptane (2 volumes), dried and 1.20 kg HAA17-36NH₂Got. The yield was 99.5%, and the purity was 75A%. This HAA17-36NH₂Contained 5A% dibenzofulvene. Heptane: Repeat the reaction by repeating the MTBE milling.
[0239]
note:
1. When an aqueous potassium carbonate solution is added, the solution becomes cloudy, but becomes clear when stirring is continued.
[0240]
A calorific value of 4-5 ° C was recorded.
[0241]
2. HPLC used for IPC and purity determination:
Vydac C8, 260nm
1mL / min, 262nm, 30 ℃
A. Water / 0.1% TFA
B. 80/20 IPA / acetonitrile / 0.1% TFA
60-95% B / 30 minutes
3. Filtration is slowed down because the fine particle size product precipitates.
[0242]
4). This material must be anhydrous so that heptane effectively removes dibenzofulvene.
[0243]
11.9AcAA (1-16) -OH and FmocAA (17-36) -OH Fragment by liquid phase synthesis from AcAA (1-36) -OH Large-scale manufacturing
AcAA1-16-OH was dissolved in DMF together with HOAT and DIEA and cooled to 0 ° C., and then HBTU was added. Stir this for 15 minutes or until HBTU is dissolved, then HAA17-36NH₂Add. HAA17-36NH₂It was found that preactivation of AcAA1-16-OH in the absence of was a precaution but was not necessary later. In addition, HAA17-36NH in 0 ° C DMF solution containing activated AcAA1-16-OH₂It was proved that the dissolution of the solution slowed as the scale increased.
[0244]
In 4 runs, 3.92 kg AcAA1-16-OH and 4.96 kg HAA17-36NH₂Total 6.972kg AcAA1-36NH₂The average yield was 80.1%. The average yield of the two runs at this stage was 87% and the average yield of the two runs was 73%.
[0245]
Before conducting the coupling reaction, a usage test is performed on a 1-2 g scale to test both the HBTU and the fragments used. From usage tests, the calculated amounts of starting materials and reagents are determined. The solubility of the starting material is also recorded in the use test. A cloudy solution indicates the presence of salts in AcAA1-16-OH and is the basis for water washing of the fragments. In order to completely convert the starting material to product so that racemization and by-product formation are minimal, all components of the reaction mixture must be clearly present in solution prior to the addition of HBTU. Don't be.
[0246]
Fragments AcAA1-16-OH and HAA17-36NH₂, And the reagents HOAT and DIEA are dissolved in DMF, cooled to 0 ° C. and HBTU is added. One out of every implementation is HAA17-36NH₂An additional equivalent of DIEA was required to pick up HCl. The crude product is isolated from the reaction mixture by water dropout (filtration time, 10 minutes). The still wet solid is returned to the reactor containing acetonitrile pre-warmed at 55 ° C., cooled to 35 ° C. over 3 hours with rapid stirring, and then left at 20 ° C. overnight. The slurry is cooled to 0-5 ° C. and further stirred for 1-2 hours, after which the solid is collected by filtration. During this process, AcAA1-36NH₂Almost transferred to the solution at 55 ° C. As the solution cools, AcAA1-36NH₂Precipitated from the solution (oiled). As the solution cools, the oil solidifies and eventually turns into a bright white solid. During this change, a large amount of solid precipitate may form on the reactor walls and stir bar. Most of these can be taken as the slurry is stirred overnight at 20 ° C. After collecting the solids, the reactor is filled with sufficient water to immerse all solids adhering to the reactor walls and stir bar.
[0247]
The slurry is stirred until all the remaining solids have fallen off the walls and stir bar (about 1 hour) and then used as a filter cake wash. Acetonitrile wash removes unreacted starting material and truncated fragments of less than 20 amino acids.
[0248]
11.9.1AcAA (1-16) -OH and FmocAA (17-36) -OH Fragment by liquid phase synthesis from AcAA (1-36) -OH Preferred large-scale production of
In a 40 liter reactor, AcAA1-16-OH (938 kg, 1 equivalent), HAA17-36NH₂(1.19 kg, 1 eq), HOAT (1 eq), DMF (19 vol to AcAA1-16-OH) and DIEA (1 eq) are introduced. The slurry is stirred until the solid is dissolved and cooled to 0-5 ° C. before HBTU (1.03 eq) is added. The solution is stirred at 0-5 ° C. for 15 minutes or until the solid is dissolved, then kept at 20 ° C. and stirred for 2 hours. A sample is taken from the reaction mixture to be subjected to IPC (Note 1). When the reaction is judged to be complete, water (19 vol) is added at such a rate that the temperature does not exceed 35 ° C. (Note 2).
[0249]
The resulting slurry is stirred for 1-24 hours and the solid is collected by vacuum filtration (10 minutes) and then washed with water (2 × 3 volumes). Compress the filter cake and remove as much water as possible. Meanwhile, 95% acetonitrile / water (30 volumes with respect to the introduced amount of AcAA1-16OH) is introduced into the reactor and kept at 55 ° C. with stirring.
[0250]
Wet solids are added to the reactor in small portions to avoid agglomeration. The slurry is cooled to 35 ° C. over 3 hours with stirring and then left at 20 ° C. overnight. Cool to 0-5 ° C., stir for 2 hours, stop stirring, and then sample the solution.
[0251]
The solid is collected by vacuum filtration. Wash the reactor and lines with 90% acetonitrile / water (3.6 vol).
[0252]
The reactor is filled with a sufficient amount of water to immerse the solid adhering to the reactor wall and stir bar (approximately 30 volumes). Stir at room temperature (about 1 hour) until the solid adhering to the reactor wall and stir bar drops. The solid is collected with the rest and dried to constant weight (1.83 kg, 86% yield).
[0253]
Repeat trituration of the solid with 90/10 acetonitrile / water.
[0254]
note:
1. IPC and purity, HPLC:
YMC ODS-A, 150 x 4.6mm, 5μ, 120A
1mL / min, 260nm, 30 ℃
A. Water / 0.1% TFA
B. THF / 0.1% TFA
60-90% B / 30 minutes, 90-95% B / 1 minute, 95% B / 5 minutes
AcAA1-16-OH 6.37min
HAA27-36NH₂    8.91 minutes
AcAA1-36NH₂    18.07 minutes,
2. If the temperature exceeds 35 ° C. during the addition of water, the precipitated solid may melt and cause aggregation and / or adhesion to the reactor wall.
[0255]
11 . Ten AcAA (1-16) -OH Side chain deprotection
The purpose of this experiment was to change the rate of MTBE addition to the precipitate to maintain the temperature below 20 ° C and to isolate and decarboxylate the crude T-20 solid (ie eliminate the solution decarboxylation reaction) It is to be.
[0256]
Crude T20 was isolated by precipitation from ACN / water as a solid before feeding to the HPLC column. The solid T20 content (%) was determined by weight-based HPLC assay.
[0257]
After removal of the side chain protecting group in 90/5/5 TFA / water / dithiothreitol, the solution was cooled to 0 ° C. and MTBE (AcAA1-36NH₂45 volumes) is added to the amount introduced. This is the minimum amount of MTBE required to ensure complete precipitation of T20. Due to the exotherm during mixing, the first 5 volumes must be added slowly (about 60 minutes) to keep the temperature below 20 ° C. Furthermore, the addition rate can be increased as MTBE is added. Maintaining the temperature below 20 ° C. during precipitation prevents aggregation when solids precipitate from solution.
[0258]
The cleavage / purification protocol involves performing deprotection on a scale compatible with chromatographic purification. The tryptophan indole is decarboxylated by dissolving the crude T20 isolated from the deprotection mixture as a TFA salt in acetonitrile / water at pH 5, filtered and allowed to stand for 15 hours. After the decarboxylation reaction was complete, the solution was diluted, transferred to a purifier, and fed to the column. During dilution, the solution becomes cloudy and this turbid solution is pumped into the column. As a result, solids adhered to the column head during the purification process, and the performance of the column gradually deteriorated. When T-20 is decarboxylated in acetonitrile / water at pH 5 for several hours, extremely insoluble aggregates are formed.
[0259]
Methods have been developed to avoid decarboxylation in solution. Crude T-20 isolated as a TFA salt from MTBE precipitate is decarboxylated at room temperature for about 5-7 days under reduced pressure. Completion of decarboxylation was observed within 3 days at 40 ° C. under reduced pressure. The TFA content of the isolated solid was 9%. The material can be stored at 0 ° C. with 1% weight / weight loss for up to 1 month.
[0260]
Salt exchange in ethanol / water (1: 9) with HOAc can be performed after isolation of T-20-TFA from MTBE. Crude T-20 acetate would be significantly more stable and preferred. In any isolation method, side chain deprotection can be performed on a larger scale, and T-20 is used in acetonitrile / water used in decarboxylation reactions known to cause aggregation. / No need to be exposed to HOAc conditions.
[0261]
AcAA (1-36) -OH A new method for side-chain deprotection:
Make a 90/5/5 TFA / water / dithiothreitol solution (13 vol) and purge with nitrogen for 3 min. AcAA1-36NH at ambient temperature under nitrogen atmosphere₂A portion of is added to a 90/5/5 TFA / water / dithiothreitol solution (13 volumes). Once in solution, stir for 4 hours at ambient temperature and then cool to 0 ° C. To precipitate T-20, MTBE (45 vol) cooled to 0-5 ° C is added dropwise at a slow rate, initially maintaining the temperature below 20 ° C (addition time is approximately 1-2 hours). The solid is recovered by vacuum filtration (Note 1). The reactor, line and filter cake are immediately washed with 3 × 5 volumes of MTBE. Remove the solid and take a sample for t = 0 IPC (Note 2) and dry under reduced pressure for 5 days or until HPLC shows no change.
[0262]
note:
1. Since the deprotection solution is hygroscopic, air should not be passed through the solid during this filtration. If air is passed through the solid before washing the TFA solution, a sticky or oily solid may be obtained.
[0263]
2. Use HPLC method TM2-0003-01 (TFA method). Various carboxylated intermediates cannot be separated by the ammonium acetate method (TM2-0006-01).
[0264]
AcAA (1-36) -OH Side chain deprotection
A total of 7.226 kg of AcAA1-36NH in 12 processes₂Was deprotected. Only 6.972 kg of AcAA1-36NH2 produced showed that the intermediate was hygroscopic. The solid isolated from the MTBE dropout was dissolved in 10 volumes of 1: 1 ACN / water, filtered and adjusted to pH 3.5 with sodium bicarbonate. The decarboxylation reaction was carried out by adding acetic acid (1.5% by volume) (pH 4.5-5) and stirring the solution at ambient temperature for 15 hours. The solution was diluted with 25 volumes of water to give a total of 40 volumes of 85/15 water / ACN solution. This solution was cloudy in all cases, and some contained fine solids (aggregated T-20). A sample for IPC was taken and the solution was transferred to a purifier. The yield of crude T-20 per process was calculated using a weight / weight HPLC assay.
[0265]
AcAA1-36NH₂Deprotection is completed in 4-5 hours with 90/5/5 TFA / water / DTT at room temperature. After 8 hours, significant degradation (2%) occurred. With the same mixture at 5 ° C., deprotection is not complete in 8 hours, but is complete in 23 hours. There was no difference in purity between the crude T-20 obtained after 5 hours at room temperature and that obtained after 23 hours at 5 ° C. Since the isolation volume (approximately 55 volumes) is much larger than the reaction (deprotection) volume (13 volumes), AcAA1-36NH is added to the TFA solution in a 20 L carboy.₂Had to be dissolved before transferring the solution to a 40 L reactor.
[0266]
Isolation of the crude carboxylated T-20 (as a TFA salt) from the deprotected mixture is achieved by precipitation with MTBE. The amount of MTBE required to precipitate the peptide is 3-4 times the amount of the deprotected mixture. By using MTBE twice the volume of the cleavage mixture, the peptide remains.
[0267]
Adding MTBE to the cleavage mixture yields a solid that is easily filtered, while adding the cleavage mixture to MTBE produces a fine precipitate that is difficult to filter. There is a temperature rise from 5 ° C to 40-45 ° C during the addition of MTBE to the TFA solution. The temperature increase does not affect the purity of the isolated crude T-20 (187/117, 119). During solid MTBE, some solid agglomeration occurred. The slurry was stirred for 1-2 hours to break up aggregates. By maintaining the temperature below 20 ° C. during the MTBE addition, a more homogeneous solid is produced, which is easy to filter (196/31). The rate of MTBE addition will be controlled in the future. Crude T-20 was recovered by filtration under a nitrogen atmosphere. During filtration before washing the TFA, the solid becomes sticky when exposed to moist air. After washing the TFA, the solid is stable to air.
[0268]
Method steps:
A 90/5/5 TFA / water / dithiothreitol solution (13 volumes) is prepared in a 20 L carboy and purged with nitrogen for 3 minutes. AcAA1-36NH to prevent aggregation₂(650 g) is added in small portions. When the solid becomes liquid, transfer the solution to a 70 L reactor. Wash the carboy and line with a minimum amount of 90/5/5 TFA / water / dithiothreitol. The solution is stirred for 4 hours at ambient temperature under a nitrogen atmosphere and then cooled to 0-5 ° C. MTBE (45 vol) is added at a rate such that the internal temperature does not exceed 30 ° C. The solid is recovered by vacuum filtration under a stream of nitrogen. Wash the reactor, lines and solids with 2 × 2 volumes of MTBE and dry to constant weight (594 g, 70 A%).
[0269]
Solid (594 g) with 50% ACN / water (AcAA1-36NH₂8 volume) with respect to the amount introduced and filtered. Wash containers and lines with 50% ACN / water (2 volumes). After adjusting the pH of the solution to 3.5-4.0 using sodium bicarbonate, acetic acid (0.18 vol) is added to bring the pH to 4.9. The solution is stirred for 15 hours at ambient temperature (IPC, Note 1) and the pH is adjusted to 9-9.5 with 1M potassium carbonate. The solution is diluted to 85/15 water / ACN by adding water (25 vol). A sample for weight / weight HPLC analysis is taken from the cloudy solution thus obtained and transferred to a purifier.
[0270]
note:
1. Method TM2-0003-01
2. Method TM2-0006-01
11 . 11 HAA (1-36) -OH Purification
Classify purification, lyophilization and packaging into three stages:
% Wt / wt = 100-% impurities-% acetate-% water-% TFA. The acetate content in the batch was 6-8%.
[0271]
Total 2.08kg T-20 (net) 6.97kg AcAA1-36NH₂Isolated from. This is AcAA1-36NH₂It shows that the yield from is 49.3%. The average yield in chromatographic purification was 55%. The yield for each step varied from 41 to 55%. The lowest yield is due to passes occurring at multiple locations due to column or pump failure. In general, if the chromatography works, the yield is in the range of 50-55%. The purity of isolated T-20 was 93-95 A%.
[0272]
In order to minimize process time, four gradients were tested during purification to compare methods:
1. 15-22% ACN / 60 min, 330 mL / min, 26-36% ACN / 525 min.
[0273]
2. 16-26% ACN / 60 min, 330 mL / min, 26-40% ACN / 525 min.
[0274]
3. Second Trimeris gradient. 330mL / min, 15-36% ACN1788min
4). Original Trimeris gradient 20-23% ACN / 11 min, 330 mL / min, 23-36% ACN / 488 min.
[0275]
A 20 centimeter (cm) column was packed with Amberchrom resin (35 cm height) (axial compression). 500-700g AcAA1-36NH₂Were deprotected and decarboxylated in solution. At this scale, a column feedstock containing about 400 grams of peptide (about 75 A% T-20) is produced. Stock solutions are typically cloudy and may contain suspended solids. The cloudy solution is fed to the column at 500 mL / min with 15% B. There was no pressure increase during column feeding in any step. Reduce the flow rate to 330 mL / min and perform the specified gradient for the indicated time. Fractions were collected and fractions containing more than 78% T-20 were pooled (100-110 L) and then diluted with water to bring the acetonitrile content to about 15-20% (about 140 liters) To do. After washing the column, equilibrate with 15% B. The T-20 containing solution is sent back to the 8-inch column at 900 mL / min. Increase% B to 50% and flush T-20 from column about 25L.
[0276]
The solution is frozen in a 1 liter glass bell and lyophilized to a powder. Isolated T-20 is typically 92-94 A% by HPLC and contains 6-8% acetate and 3-4% water.
[0277]
Preferred method:
A T-20 solution in pH 9.2, 85/15 water / acetonitrile (27 L) was pumped to an 8-inch HPLC column at 500 mL / min. The flow rate was reduced to 330 mL / min over 30 minutes (increased 30-40 mL / min every 5 minutes). A linear gradient from 20% B to 36% B is started over 600 minutes. Collect fractions until absorbance is below 0.2 AUFS. Fractions are analyzed by HPLC for content (Note 1). The column is washed with 80% B at 900 mL / min for 10 minutes, returned to 15% B and equilibrated at 900 mL / min. Fractions containing 78 A% or more of T-20 are pooled (113 L) and diluted with buffer (28.2 L) to bring the acetonitrile concentration to 15-20%. Pump the solution to the column at 900 mL / min. Increase% B to 50% and elute about 25 L of T-20 from the column at 900 mL / min. The concentration of T-20 is about 9-10 mg / mL. The solution is transferred to a 1 liter lyophilization jar, frozen and lyophilized to give 216.29 g of T-20 in 54.9% yield and 94.1 A% purity.
[0278]
note:
1. Fractions are analyzed by HPLC for content and purity.
[0279]
YMC ODS-A, 150x4.6mm, 5μm, 120A
1mL / min, 220nm, 30 ℃
A 70/30, 50mM NH_FourOAc @ pH7 (NH_FourAdjust with OH): ACN
B 5:95 50mM NH_FourOAc @ pH7 (NH_FourAdjust with OH): ACN
0-15% B / 50 minutes, 15-100% B / 2 minutes, 100% B / 3 minutes
T-20 retention time, 29.0 minutes
11 . 12 Peptide thermal stability
A series of experiments was performed to characterize the thermal stability of the intermediate T-20 fragment. The T-20 fragment was saturated with water, filtered, then introduced into a sealed container and exposed to high temperatures. At some point, samples were collected and analyzed for purity by HPLC. The stability of the dried T-20 fragment was also characterized by thermogravimetric analysis (TGA).
[0280]
All fragments except AcAA1-16OH can be dried at 40 ° C. for 3 days. After 24 hours at 80 ° C, the two fragments, FmocAA27-35OH (3%) and FmocAA27-36NH₂(1.4%) shows only slight degradation. Fragment AcAA1-16OH was initially 97A% pure. After 3 days at 40 ° C., it was 93.4 A% pure and dry. Furthermore, 93.9 A% was maintained even after 24 hours at 80 ° C. In addition, wet AcAA1-16OH must be dried at ambient temperature.
[0281]
The main point of the stability test was to determine whether the fragments could be dried at 40 ° C. rather than ambient temperature. From this test, it was found that the fragments were stable upon drying at 40 ° C. This will significantly reduce the drying time.
[0282]
Under various solvent and temperature conditions that mimic isolation and purification, fragments Ac (1-16) -OH, Fmoc (27-35) -OH, Fmoc (17-26) -OH, Fmoc (27-36 ) -NH₂, Fmoc (17-36) -NH₂, H (17-36) -NH₂, And Ac (1-36) -NH₂A test designed to test the stability of the was completed. All fragments are stable in the solvent system in which they are isolated and / or purified. The stability is represented by X.
[0283]

The present invention is not to be limited in scope by the specific embodiments described herein. These embodiments are merely intended to illustrate individual aspects of the invention, and functionally equivalent methods and elements are intended to be included within the scope of the invention. Indeed, various modifications of the invention in addition to those described herein will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description and accompanying drawings. Such modifications are intended to fall within the scope of the appended claims.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1: T-20 4-fragment approach. This figure shows a scheme according to the example shown in section 9.1 below for the synthesis of full-length T-20 starting from the intermediate peptide fragment group 6 shown in Table 2 above.
FIG. 2: T-20 four-fragment approach, second pathway. This figure shows an additional four-fragment scheme for joining the peptide intermediate group 6 shown in Table 2 above to synthesize full-length T-20.
FIG. 3: T-20 three-fragment approach. This figure shows a scheme for synthesizing full-length T-20 according to the example shown in Section 9.1 below.
FIG. 4: T-20 three-fragment approach, second pathway. This figure shows a scheme according to the examples shown in Sections 9.2, 9.3, 9.4 and 9.5 below for synthesizing full-length T-20.
FIG. 5: T-20 two-fragment approach. This figure shows a scheme for binding the peptide intermediate group 18 shown in Table 2 above to synthesize full-length T-20.

Claims (29)

A method for the synthesis of a peptide having the formula: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 1),
(a) A side chain protected peptide of the formula: Fmoc-EKNEQELLEL-COOH (SEQ ID NO: 11) is reacted with a side chain protected peptide of the formula: NH ₂ -DKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 18) to obtain the formula: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF Generate a side chain protected peptide of -NH ₂ (SEQ ID NO: 12);
(b) deprotecting the amino terminus of the peptide obtained in step (a),
(c) The peptide obtained in step (b) is reacted with a side chain-protected peptide of formula: Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4), and the side of formula: Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 1) Producing a chain-protecting peptide,
(d) modifying the amino terminus of the peptide obtained in step (c) to acetyl group modification;
(e) Deprotecting the side chain of the side chain protected peptide obtained in step (d) to obtain a peptide of the formula: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 1).
A method comprising that. A method for the synthesis of a peptide having the formula: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 1),
(a) A side chain protected peptide of the formula: Fmoc-EKNEQELLEL-COOH (SEQ ID NO: 11) is reacted with a side chain protected peptide of the formula: NH ₂ -DKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 18) to obtain the formula: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF Generate a side chain protected peptide of -NH ₂ (SEQ ID NO: 12);
(b) deprotecting the amino terminus of the peptide obtained in step (a),
(c) The peptide obtained in step (b) is reacted with a side chain-protected peptide of the formula: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4), and the side of the formula: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 1) Producing a chain-protecting peptide,
(d) Deprotecting the side chain of the side chain protected peptide obtained in step (c) to obtain a peptide of the formula: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 1).
A method comprising that. A method for the synthesis of a peptide having the formula: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 1),
(a) Deprotecting the amino terminus of the side chain protecting peptide of the formula: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 12),
(b) The peptide obtained in step (a) is reacted with a side chain-protected peptide of formula: Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4), and the side of formula: Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 1) Producing a chain-protecting peptide,
(c) deprotecting the amino terminus of the peptide obtained in step (b);
(d) modifying the amino terminus of the peptide obtained in step (c) to acetyl group modification;
(e) Deprotecting the side chain of the side chain protected peptide obtained in step (d) to obtain a peptide of the formula: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 1).
A method comprising that. A method for the synthesis of a peptide having the formula: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 1),
(a) Deprotecting the amino terminus of the side chain protecting peptide of the formula: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 12),
(b) The peptide obtained in step (a) is reacted with a side chain protected peptide of the formula: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4), and the side of the formula: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 1) Producing a chain-protecting peptide,
(c) Deprotecting the side chain of the side chain protected peptide obtained in step (b) to obtain a peptide of the formula: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 1)
A method comprising that. The side chain protective peptide of formula: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 12)
(a) A side-chain protected peptide of formula: Fmoc-DKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 17) is reacted with HPheNH ₂ to produce a side-chain protected peptide of formula: Fmoc-DKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 18),
(b) deprotecting the amino terminus of the peptide obtained in step (a),
(c) The peptide obtained in step (b) is reacted with a side-chain-protected peptide of the formula: Fmoc-EKNEQELLEL-COOH (SEQ ID NO: 11), and the side of the formula: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 12) Producing a chain-protecting peptide,
The method according to claim 3 or 4, which is synthesized by a method comprising: The side chain protective peptide of formula: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 12)
(a) reacting a side-chain protected peptide of formula: Fmoc-LELDKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 15) with HPheNH ₂ to produce a side-chain protected peptide of formula: Fmoc-LELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 16);
(b) deprotecting the amino terminus of the peptide obtained in step (a),
(c) The peptide obtained in step (b) is reacted with a side-chain-protected peptide of the formula: Fmoc-EKNEQEL-COOH (SEQ ID NO: 10), and the side of the formula: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 12) Producing a chain-protecting peptide,
The method according to claim 3 or 4, which is synthesized by a method comprising: The side chain protective peptide of formula: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 12)
(a) deprotecting the amino terminus of the peptide of formula: Fmoc-DKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 18);
(b) The peptide obtained in step (a) is reacted with a side-chain-protected peptide of formula: Fmoc-EKNEQELLEL-COOH (SEQ ID NO: 11), and the side of formula: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 12) Producing a chain-protecting peptide,
The method according to claim 3 or 4, which is synthesized by a method comprising: The side chain protective peptide of formula: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 12)
(a) A side chain protected peptide of formula: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 19) is reacted with HPheNH ₂ to produce a side chain protected peptide of formula: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 12).
The method according to claim 3 or 4, which is synthesized by a method comprising: The side chain protecting peptide of the formula: Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4) is
(a) deprotecting the amino terminus of the side chain protected peptide of formula: Fmoc-IEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 7);
(b) The side-chain protected peptide obtained in step (a) is reacted with the side-chain protected peptide of formula: Fmoc-YTSLIHSL-COOH (SEQ ID NO: 2) to obtain the formula: Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4) A side-chain protecting peptide of
The method according to claim 1 or 3, which is synthesized by a method comprising: The side chain protecting peptide of the formula: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4) is
(a) A side chain protective peptide of the formula: Fmoc-IEESQNQ-COOH (SEQ ID NO: 6) is reacted with HGlnOPNB to produce a side chain protective peptide of the formula: Fmoc-IEESQNQQ-OPNB (SEQ ID NO: 7).
(b) deprotecting the amino terminus of the side chain protected peptide obtained in step (a),
(c) The side chain protected peptide obtained in step (b) is reacted with the side chain protected peptide of the formula: Ac-YTSLIHSL-COOH (SEQ ID NO: 2) to obtain the formula: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OPNB (SEQ ID NO: 4). A side-chain protecting peptide of
(d) Deprotecting the carboxyl terminus of the side chain protected peptide obtained in step (c) to produce a side chain protected peptide of the formula: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4).
The method according to claim 2 or 4, which is synthesized by a method comprising: The side chain protecting peptide of the formula: Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4) is
(a) A side chain protective peptide of formula: Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQ-COOH (SEQ ID NO: 3) is reacted with HGlnOPNB to produce a side chain protective peptide of formula: Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-OPNB (SEQ ID NO: 4),
(b) Deprotecting the carboxyl terminus of the peptide obtained in step (a) to produce a side chain protected peptide of the formula: Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4).
The method according to claim 1 or 3, which is synthesized by a method comprising: A method for the synthesis of a peptide having the formula: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 1),
(a) deprotecting the amino terminus of the side chain protecting peptide of the formula: Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 9);
(b) The peptide obtained in step (a) is reacted with a side-chain protected peptide of formula: Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQ-COOH (SEQ ID NO: 3), and the side of formula: Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 1) Producing a chain-protecting peptide,
(c) modifying the amino terminus of the peptide obtained in step (b) to acetyl group modification,
(d) Deprotecting the side chain of the side chain protected peptide obtained in step (c) to obtain a peptide of the formula: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 1).
A method comprising that. The side chain protecting peptide of formula: Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 9) is
(a) The side chain protected peptide of formula: Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNW-NH ₂ (SEQ ID NO: 8) is reacted with HPheNH ₂ to produce the side chain protected peptide of formula: Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 9) ,
13. The method of claim 12, wherein the method is synthesized by a method comprising: A method of synthesizing a peptide of formula: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 1),
(a) Deprotecting the amino terminus of the side chain protecting peptide of the formula: Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 14),
(b) The peptide obtained in step (a) is reacted with a side-chain-protected peptide of formula: Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQEK-COOH (SEQ ID NO: 5), and the side of formula: Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 1) Producing a chain-protecting peptide,
(c) modifying the amino terminus of the peptide obtained in step (b) to acetyl group modification,
(d) Deprotecting the side chain of the side chain protected peptide obtained in step (c) to obtain a peptide of the formula: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 1).
A method comprising that. Formula: Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 14) side chain protecting peptide
(a) A side chain protected peptide of formula: Fmoc-NEQELLELDKWASLWNW-NH ₂ (SEQ ID NO: 13) is reacted with HPheNH2 to produce a side chain protected peptide of formula: Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 14).
15. The method of claim 14, wherein the method is synthesized by a method comprising: The method according to claim 1, 2, 3, 4, 12 or 14, wherein the side chain protecting peptide of the formula: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 1) is synthesized in an amount of 1 kg or more. The method according to claim 1 or 2, wherein the side chain protected peptide of the formula: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 12) is synthesized in an amount of 1 kg or more. The method according to claim 5, wherein the side-chain-protected peptide of the formula: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 12) is synthesized in an amount of 1 kg or more. The method according to claim 6, wherein the side-chain protected peptide of the formula: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 12) is synthesized in an amount of 1 kg or more. The method according to claim 7, wherein the side-chain protected peptide of the formula: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 12) is synthesized in an amount of 1 kg or more. The method according to claim 8, wherein the side-chain protected peptide of the formula: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 12) is synthesized in an amount of 1 kg or more. The method according to claim 9, wherein the side-chain-protected peptide of the formula: Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4) is synthesized in an amount of 1 kg or more. 11. The method according to claim 10, wherein the side chain protected peptide of the formula: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4) is synthesized in an amount of 1 kg or more. 12. The method according to claim 11, wherein the side chain protecting peptide of the formula: Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4) is synthesized in an amount of 1 kg or more. Wherein: the side chain protected peptide of Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 9) is synthesized in an amount of more than 1 kg, The method of claim 13. 16. The method according to claim 15, wherein the side chain protected peptide of the formula: Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 14) is synthesized in an amount of 1 kg or more. Next set:
(a) YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO: 4),
EKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO: 12);
(b) YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO: 4),
EKNEQELLEL (SEQ ID NO: 11),
DKWASLWNWF (SEQ ID NO: 18);
(c) YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO: 4),
EKNEQELLEL (SEQ ID NO: 11),
DKWASLWNW (SEQ ID NO: 17);
(d) YTSLIHSL (SEQ ID NO: 2),
IEESQNQ (SEQ ID NO: 6),
EKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO: 12);
(e) YTSLIHSL (SEQ ID NO: 2),
IEESQNQ (SEQ ID NO: 6),
EKNEQELLEL (SEQ ID NO: 11),
DKWASLWNWF (SEQ ID NO: 18);
(f) YTSLIHSL (SEQ ID NO: 2),
IEESQNQ (SEQ ID NO: 6),
EKNEQELLEL (SEQ ID NO: 11),
DKWASLWNW (SEQ ID NO: 17);
(g) YTSLIHSL (SEQ ID NO: 2),
IEESQNQQ (SEQ ID NO: 7),
EKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO: 12);
(h) YTSLIHSL (SEQ ID NO: 2),
IEESQNQQ (SEQ ID NO: 7),
EKNEQELLEL (SEQ ID NO: 11),
DKWASLWNWF (SEQ ID NO: 18);
(i) YTSLIHSL (SEQ ID NO: 2),
IEESQNQQ (SEQ ID NO: 7),
EKNEQELLEL (SEQ ID NO: 11),
DKWASLWNW (SEQ ID NO: 17);
(j) YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO: 4),
EKNEQEL (SEQ ID NO: 10),
LELDKWASLWNWF (SEQ ID NO: 16);
(k) YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO: 4),
EKNEQEL (SEQ ID NO: 10),
LELDKWASLWNW (SEQ ID NO: 15);
(l) YTSLIHSL (SEQ ID NO: 2),
IEESQNQ (SEQ ID NO: 6),
EKNEQEL (SEQ ID NO: 10),
LELDKWASLWNWF (SEQ ID NO: 16);
(m) YTSLIHSL (SEQ ID NO: 2),
IEESQNQ (SEQ ID NO: 6),
EKNEQEL (SEQ ID NO: 10),
LELDKWASLWNW (SEQ ID NO: 15);
(n) YTSLIHSL (SEQ ID NO: 2),
IEESQNQQ (SEQ ID NO: 7),
EKNEQEL (SEQ ID NO: 10),
LELDKWASLWNWF (SEQ ID NO: 16);
(o) YTSLIHSL (SEQ ID NO: 2),
IEESQNQQ (SEQ ID NO: 7),
EKNEQEL (SEQ ID NO: 10),
LELDKWASLWNW (SEQ ID NO: 15);
(p) YTSLIHSLIEESQNQ (SEQ ID NO: 3),
QEKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO: 8);
(q) YTSLIHSLIEESQNQ (SEQ ID NO: 3),
QEKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO: 9);
(r) YTSLIHSLIEESQNQQEK (SEQ ID NO: 5),
NEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO: 14);
(s) YTSLIHSLIEESQNQQEK (SEQ ID NO: 5),
NEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO: 13); and
(t) YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO: 4),
EKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO: 19)
A set of peptide fragments selected from the group consisting of: The following peptide fragment:
YTSLIH S L (SEQ ID NO: 2);
YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO: 4);
IEESQNQ (SEQ ID NO: 6);
IEESQNQQ (SEQ ID NO: 7);
QEKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO: 8);
EKNEQEL (SEQ ID NO: 10);
EKNEQELLEL (SEQ ID NO: 11);
EKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO: 12);
NEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO: 13);
LELDKWASLWNW (SEQ ID NO: 15);
LELDKWASLWNWF (SEQ ID NO: 16);
DKWASLWNW (SEQ ID NO: 17);
DKWASLWNWF (SEQ ID NO: 18); and
EKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO: 19)
Use of a peptide fragment for peptide synthesis selected from the group consisting of: The following protected peptide fragments:
Ac-YTSLIHSL-COOH (SEQ ID NO: 2);
FMOC-YTSLIHSL-COOH (SEQ ID NO: 2);
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OPNB (SEQ ID NO: 4);
FMOC-YTSLIHSLIEESQNQQ-OPNB (SEQ ID NO: 4);
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4);
FMOC-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4);
Ac-IEESQNQ-COOH (SEQ ID NO: 6);
FMOC-IEESQNQ-COOH (SEQ ID NO: 6);
NH ₂ -IEESQNQQ-OPNB (SEQ ID NO: 7);
FMOC-IEESQNQQ-OPNB (SEQ ID NO: 7);
Ac-EKNEQEL-COOH (SEQ ID NO: 10);
FMOC-EKNEQEL-COOH (SEQ ID NO: 10);
Ac-EKNEQELLEL-COOH (SEQ ID NO: 11);
FMOC-EKNEQELLEL-COOH (SEQ ID NO: 11);
NH ₂ -EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 12);
FMOC-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 12);
Ac-LELDKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 15);
FMOC-LELDKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 15);
NH ₂ -LELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 16);
FMOC-LELDKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 16);
Ac-DKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 17);
FMOC-DKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 17);
NH ₂ -DKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 18);
FMOC-DKWASLWNWF-NH ₂ (SEQ ID NO: 18); and
FMOC-EKNEQELLELDKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 19)
Use of a protected peptide fragment for peptide synthesis selected from the group consisting of:

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