JP4594080B2

JP4594080B2 - ２′‐ｐ‐ヒドロキシベンゾイルムッサエノシド酸の肝臓保護活性

Info

Publication number: JP4594080B2
Application number: JP2004503029A
Authority: JP
Inventors: アーニル、プラバカール; ビシャン、ダット、ガプタ; クリシャン、アブタール、スリ; ナレシュ、クマール、サッティ; スウォデッシュ、マロートラ; カルディップ、クマール、グプタ; ビジェイ、クマール、シャーマ; ラケッシュ、カマール、ジョーリ; バピンダー、シン、ジャッギ; バール、クリシャン、チャンダン; シャンカール、ラール; カストゥーリ、ラール、ベッディ; オム、パーカッシュ、スリー; グラム、ナービ、クァジ
Original assignee: カウンシル・オブ・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ
Priority date: 2002-05-10
Filing date: 2003-05-09
Publication date: 2010-12-08
Anticipated expiration: 2023-05-09
Also published as: EP1503773B1; AU2003224361B2; JP2005531551A; WO2003094946A1; US7259148B2; CN1652808A; DE60336549D1; EP1503773A1; AU2003224361A1; US20040014684A1; EP1503773B9; CN100391465C; ZA200409048B

Description

発明の分野

本発明は、気中部分／全植物をメタノール、エタノール、水性エタノールまたは水のような極性溶媒で抽出し、ネグンドシド(negundoside)がカラムクロマトグラフィーで分離されるフラクションを得るために、ヘキサン、塩化エチレン、塩化メチレン、クロロホルムまたは酢酸エチルのような溶媒で抽出物を摩砕することで、脂肪非極性成分を除去することにより、Vitex negundoから単離された、式１のイリドイドグリコシド、２′‐ｐ‐ヒドロキシベンゾイルムッサエノシド酸（2’-p-hydroxybenzoylmussaenosidic acid）（ネグンドシド）の肝臓保護活性に関する。ネグンドシドの肝臓保護活性は、ＣＣＵおよびガラクトサミン誘導性肝障害モデルに対するその保護作用の評価により確認された。背景および先行文献によると、Vitex negundo Linn（科：Verbenaceae）はインド伝承医学で広く用いられている。その植物の葉はAyurveda医学で用いられている数種の製剤の成分である。その植物の根および葉は、去痰剤、解熱剤、駆虫剤トニックおよび芳香剤として用いられている〔Chopra,R.N.Nayar,S.L.and Chopra,I.C;Glossary of Indian Medicinal Plants,CSIR,New Delhi,1956,p.256〕。

その植物は抗炎症および抗関節炎特性を有することが報告されている〔Wealth of India:Raw Materials,CSIR,New Delhi,1976,vol.X,p.522〕。様々な成分がこの植物から報告されてきた。葉から、GhoshおよびKrishnaは、グルコノニトール、ｐ‐ヒドロキシ安息香酸、５‐ヒドロキシイソフタル酸および３，４‐ジヒドロキシ安息香酸を、２種のグルコシドおよび非結晶アルカロイドと一緒に単離した〔Ghosh,T.P.and Krishna,S.,Indian Chem.1936,13,634〕。葉の精油からは、α‐ピネン、カンフェン、シトラールおよび３‐カリオフィレンが報告された〔Masilungan,V.A.,Philip.J.Sci,1955,84,275〕。

多数のフラボノイド類、即ちカスチシン、オリエンチン、イソオリエンチン、ルテオリン、ルテオリン‐７‐０‐グルコシド、コリンボシン、ガーデニンＡおよびＢ、３‐０‐デスメチルアルテメチン、５‐０‐デスメチルノビレチン、３＼４＼５，５＼６Ｊ，８‐ヘプタメトキシフラボン、３＼５‐ジヒドロキシ‐４′，７，８‐トリメトキシフラバノンおよび３′，５‐ジヒドロキシ‐４′，６，７‐トリメトキシフラバノンが、この植物から報告された〔Sirait,L.M.,Rimpler,H.and Haensal,R.,Experientia,1962,18,72；Haensal,R.et al.Phytochemistry,1965,4,19；Banerji A.et al.Phytochemistry,1969,8,511；Ferdous,A.J.et al.Bangladesh Acad.Sci.1984,8,23；Dayrit,F.M.Philipp.J.Sci.1987,116,403；Banerji,J.et al.Indian J.Chem.1988,27B,597；Achari,B.et al.Phytochemistry,1984,23,703〕。茎‐樹皮は、ルテオリンおよびアセロシンと一緒に、５種の新規フラボングリコシドをもたらした。新規フラボングリコシドは、６ｐ‐グルコピラノシル‐７‐ヒドロキシ‐３′，４′，５′，８‐テトラメトキシフラボン‐５‐Ｏ‐α‐Ｌ‐ラムノピラノシド、３′，７‐ジヒドロキシ‐４′，６，８‐トリメトキシフラボン‐５‐Ｏ‐（６″‐Ｏ‐アセチル‐ｐ‐Ｄ‐グルコピラノシド）、３，３′，４′，６，７‐ペンタメトキシフラボン‐５′‐Ｏ‐（４″‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐ｃｃ‐ラムノピラノシド）、４′，５，７‐トリヒドロキシフラボン‐８‐（２″‐カフェオイル‐ａ‐グルコピラノシド）および３′，５，５′，７‐テトラヒドロキシ‐４‐メトキシフラボン‐３′‐Ｏ‐（４″‐Ｏ‐α‐Ｄ‐ガラクトピラノシル）ガラクトピラノシドである〔Rao,V.K.et al.Indian J.Pharm.1977,39,41；Subramamian,P.M.and Misra,G.S.Indian J.Chem.1978,16B,615；Subramanian,P.M.and Misra,G.S.J.Nat.Prod.1979,42,540〕。ジテルペノイド、５β‐ヒドロ‐８，１１，１３‐アビエタトリエン‐６ａ‐オールおよび３種のトリテルペノイド、２ｃｃ，３ａ‐ジヒドロキシオレアナ‐５，１２‐ジエ‐２８‐ン酸、２ａ，３ａ‐ジアセトキシオレアナ‐５，１２‐ジエ‐２８‐ン酸、２，３ａ‐ジアセトキシ‐１８‐ヒドロキシオレアナ‐５，１２‐ジエ‐２８‐ン酸が種子から単離された。これらの化合物は抗炎症活性を示した〔Chawla,A.S.,Sharma,A.K.,Handa,S.S.and Dhar,K.L.Indian J.Chem.1991,30B,773およびJ.Nat.Prod.1992,55,163〕。根からアセチルオレアノール酸が単離された〔Vishnol,S.P.,Shoeb,A.,Kapil,R.S.and Popli,S.P.Phytochemistry,1983,22,597〕。５種のイリドイドグリコシドがV.negundoの葉から報告された。これらはアレアウクビン、アグヌシド（Hansal et al.Phytochemistry,4,1965,9）、ネグンドシド、６′‐ヒドロキシベンゾイルムッサエノシド酸（Sehgal et al.Phytochemistry,21,1982,363）およびニシンダシドである（Datta et al.Tetrahedron,39,1983,3067）。

肝障害は、都会および地方双方の人々で、なお大きな有害要因である。伝統的医学で行われる肝障害の管理および指導に関する我々の理解の科学的進展にもかかわらず、化学的に不明確ないくつかのハーブ処方物を除き、肝疾患で特別な治療は行われていない〔Subeamonium and Puspagandan,Indian Journal of Pharmacology,31,166-175(199)〕。植物起源の肝臓保護剤に関する我々の調査に際して、V.negundoの水性アルコール抽出物およびそれから単離されたフラクションは、強い肝臓保護および免疫刺激活性を示した。V.negundoの葉から免疫刺激活性を有するフラクションの単離方法が開発され、それに関する特許がRegional Research Laboratory,Jammuに付与された〔Sun,J.L.et al.インド特許Ｎｏ．１７８３８８、日付１９‐０３‐９７〕。肝臓保護および免疫刺激活性を有する生物活性組成物の単離方法に関する他の特許出願が、Regional Research Laboratory,Jammuにより提出された（出願Ｎｏ．１１６／ＤＥＬ９８、日付１６．１．９８）。Picrorhiza kurroaのイリドイドグリコシドは、強い肝臓保護活性を示す（Ansari,R.A.et al.,Indian J.Med.Research,1988,87,401）。V.negundoも数種のイリドイドグリコシドを含有することがわかった。イリドイドグリコシド、２′‐ｐ‐ヒドロキシベンゾイルムッサエノシド酸（ネグンドシド）が単離され、植物のアルコール抽出物と一緒に、その肝臓保護活性について評価された。アルコール抽出物（０３３としてコード）およびネグンドシド（０３３（２）としてコード）双方が、ラットにおいてＣＣｌ_４およびガラクトサミン（ＧａｌＮ）で実験的に誘導された肝障害で顕著な肝臓保護活性を示した。公知の肝臓保護剤シリマリンとの比較から、０３３および０３３（２）は、高レベルの血清および肝臓ホモゲネートパラメーターに及ぼすそれらの効果に関して、ほとんどのパラメーターで高い肝臓保護ポテンシャルを示すことを明らかにした（表１および２）。そのため、本発明の主目的は、V.negundoの葉から単離された生物活性分子、即ちこの明細書に添付した図面で示されるような式１のネグンドシドの肝臓保護活性を提供することである。

したがって、本発明は
（ａ）植物物質を公知の方法により粉末化し；
（ｂ）水性アルコール抽出物を浸出により調製し；
（ｃ）アルコール抽出物を常法により濃縮し；
（ｄ）塩化エチレン、塩化メチレン、クロロホルムまたは酢酸エチルのような溶媒で抽出物を摩砕することにより、脂肪非極性成分を除去し；
（ｅ）残留抽出物をシリカゲルに吸着させ；
（ｆ）カラムクロマトグラフィーによる吸着抽出物からのアグヌシドの単離；
（ｇ）肝臓保護活性
からなる、明細書に添付された式１の化合物の肝臓保護活性を提供する。

ネグンドシド１の特徴
結晶化合物として得られた１，ｍｐ１４８‐５０℃，Ｍ^＋：４９６，ＵＶ‐２６０ｎｍ（ＭｅＯＨ）ｎｍ，（ＫＢｒ）スペクトルは３４００，１７００，１６４０および１６１０ｃｍ^−１で吸収を示した。^１ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ５．４８（Ｊ３，Ｈ‐１），７．０９（ｓ，Ｈ‐３），２５（ｍ，Ｈ‐５），２．１９（ｍ，Ｈ‐９），１．２５（ｓ，Ｈ‐１０），６．８０（ｄｄ，２，７，Ｈ‐３″，Ｈ‐５″），７．８３（ｄ，２，７，Ｈ‐２″，６″），４．９９（ｄ，７，Ｈ‐１′），４．６９（ｄ，Ｊ７，Ｈ‐２″）．^１３ＣＮＭＲ：１２２．９９（Ｃ‐１），１３３．６７（Ｃ‐２″，６″），１１６．９２（Ｃ‐３″，５″），１６４．１１（Ｃ‐４″），１６８．０８（ＣＯ），９５．８３（Ｃ‐１），１５１．９８（Ｃ‐３），１１６．９２（Ｃ‐４），３０．９６（Ｃ‐５），３１．９８（Ｃ‐６），４２．０４（Ｃ‐７），８０．６４（Ｃ‐８），５３．１９（Ｃ‐９），２５．１５（Ｃ‐１０），１７０．７１（Ｃ‐１１），９８．６４（Ｃ‐１′），７６．８５（Ｃ‐２′），７５．７０（Ｃ‐３′），７２．５５（Ｃ‐４′），７９．３０（Ｃ‐５′），６３．５４（Ｃ‐６′）．

発明の詳細な説明

したがって、本発明はヒトを含めた対象哺乳動物で肝疾患症状を治療および／または予防するための方法を提供し、その方法は植物Vitex negundoからの２′‐ｐ‐ヒドロキシベンゾイルムッサエノシド酸を場合により単独でまたは１種以上の製薬上の添加物と一緒に含んでなる組成物の有効量を哺乳動物へ投与するステップからなる。

該組成物は、高レベルの血清グルタミン酸‐ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）を約７０％減少させる。

本発明の他の態様において、上記の組成物は高レベルの血清グルタミン酸‐オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）を約６０％減少させる。

本発明の更に他の態様において、上記の組成物は高レベルの血清アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）を約６０％減少させる。

本発明の更に他の態様において、上記の組成物は高レベルの血清トリグリセリドを約５８％減少させる。

本発明の更に他の態様において、上記の組成物は高レベルのビリルビンを約６６％減少させる。

本発明の更に他の態様において、化合物アグヌシドは全植物から得られる。

本発明の更に他の態様において、２′‐ｐ‐ヒドロキシベンゾイルムッサエノシド酸は約２０〜２００ｍｇ／ｋｇ体重の濃度である。

本発明の更に他の態様において、２′‐ｐ‐ヒドロキシベンゾイルムッサエノシド酸は約５０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度である。

本発明の更に他の態様において、対象は哺乳動物、好ましくはヒトである。

本発明の更に他の態様において、上記の組成物は単独でまたは製薬上許容されるキャリアと一緒に用いられる。

本発明の更に他の態様において、上記の組成物は製薬上許容される添加物、キャリア、希釈物、溶媒、フィラー、滑沢剤、賦形剤、結合剤または安定剤と一緒に対象へ投与される。

本発明の更に他の態様において、望ましい投与量は予防および治療双方の目的で投与される。

本発明の更に他の態様において、上記の組成物は経口、または臨床上／医学上許容される何らかの方法で投与される。

本発明の更に他の態様において、ヒトで好ましい投与量は約５ｍｇ／ｋｇ体重である。

本発明の更に他の態様において、該投与量は摂取上安全であり、いかなる副作用も有しない。

本発明の更に他の態様において、上記の組成物は様々な物理的形態、例えば粉末、錠剤、カプセル、シロップ、顆粒、エマルジョン、エアゾルまたはビーズで利用しうる。

本発明の更に他の態様において、上記の組成物は肝硬変、ガラクトース血症、血管腫、血色素症、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、Ｇ型肝炎、アルコール性肝疾患、自己免疫性肝炎、肝臓の癌、胆道閉鎖症、Ｉ型糖原病、α‐１‐抗トリプシン欠損症、Alagille症候群、バイラー病、カロリ病、脂肪肝、肝臓のかゆみ、原発胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎または赤芽球増殖性プロトポルフィリン症に有用である。

本発明の別な態様は、式１の化合物２′‐ｐ‐ヒドロキシベンゾイルムッサエノシド酸の単離方法を提供し、該化合物は気中部分／全植物から単離され、該方法は下記ステップ：
１．植物物質を公知の方法により粉末化し、
２．水性アルコール抽出物を浸出により調製し、
３．アルコール抽出物を常法により濃縮し、
４．塩化エチレン、塩化メチレン、クロロホルムまたは酢酸エチルのような溶媒で抽出物を摩砕することにより、脂肪非極性成分を除去し、
５．残留抽出物をシリカゲルに吸着させ、
６．カラムクロマトグラフィーによる吸着抽出物からの２′‐ｐ‐ヒドロキシベンゾイルムッサエノシド酸の単離
からなる。

下記例は一部の好ましい態様を実証するためにあり、決して本発明の範囲を制限するためと解釈するべきではない。当業者であれば、本発明の一部とみなされる別な処方をデザインすることができる。

例１
V.negundoの陰干し粉末葉を浸出により８０％エタノール（４＋ｘ−３Ｌ）で抽出した。プールした抽出物を減圧下で１Ｌ以下の水性濃縮物に濃縮した。水性濃縮物を酢酸エチル（３×５００ｍｌ）で洗浄し、更に４００ｍｌに濃縮した。シロップ状残渣をシリカゲル４００ｇに吸着させ、室温で乾燥させた。スラリーをシリカゲルカラムにのせ、クロロホルム‐メタノール（９：１）の混合液で溶出させ、（０３３（２）としてコードされる）１（１．５ｇ）を得た。

例２
Vitex negundoの微粉砕葉（２００ｇ）を石油（６０〜８０°）（初回の抽出は１Ｌ、次いで２回の抽出は各々６００ｍｌ）で３回抽出した。薬物から室温で溶媒を除去した。次いでそれをエタノール（初回の抽出は１Ｌ、次いで同溶媒で３回各々６００ｍｌ）で抽出した。ロータリーフィルムエバポレーターでエタノールの蒸発により、（０３３としてコードされる）抽出物３０ｇを得た。

例３
０３３および０３３（２）は、肝毒素としてＣＣＵを用いてげっ歯類で実験的に誘導された肝障害において、顕著な肝臓保護活性を示した。０３３および０３３（２）は、高レベルの血清ＧＰＴ、ＧＯＴ、ＡＬＰ、ビリルビン、ＴＧおよび肝臓ホモゲネート脂質過酸化を減少させ、ＧＳＨレベルを増加させた。０３３および０３３（２）はシリマリンとほぼ同程度に有効であり、高レベルのＧＴＰを各々６７．５２＆６０．３４％、ＧＯＴを５８．９１＆５８．０５％、ＡＬＰを５８．２６＆５３．９５％、ビリルビンを６０．００＆６６．６６％、ＴＧを４６．４７＆４４．１９％および肝臓ホモゲネートＬＰを５５．７１＆４５．８５％およびＧＳＨを６１．４２＆４５．５６％減少させた。シリマリンの場合は各々５８．４４、５１．６３、５２．２６、５７．５０、４１．３０、６２．０５＆６０．１５％であった（表１）。

例４
ガラクトサミン（ＧａｌＮ）誘導性肝障害の実験動物の治療において、０３３および０３３（２）で観察された肝臓保護活性は、血清ＧＰＴ、ＧＯＴ、ビリルビン、ＡＬＰおよびＴＧで各々５９．５８＆５０．７５、５６．６２＆４３．６４、５４．２８＆５０．１１、５７．７１＆５７．５７、５７．８９＆４４．７６％、肝臓ホモゲネート脂質過酸化(ＬＰ)およびＧＳＨで各々６７．５１＆３８．６５、６６．５６＆４８．１０％であった。シリマリンの場合は各々５７．３８、５５．４０、６０．００、５３．５４、４６．１７、６９．５９、６７．１８％であった（表２）。現行使用の植物と比較した本発明の利点は、肝臓保護活性に基づいている：
１．ネグンドシドは市販ハーブ肝臓保護剤シリマリンよりも強力である。
２．シリマリンは３成分の混合物であり、その相対的割合はバッチ毎に異なるが、ネグンドシドは純粋化合物である。

ネグンドシドを示している。２′‐ｐ‐ヒドロキシベンゾイルムッサエノシド酸（ネグンドシド）の単離のためのフローシートを示している。

Claims

２′‐ｐ‐ヒドロキシベンゾイルムッサエノシド酸の単離工程を含む方法により植物Vitex negundoから得られた２′‐ｐ‐ヒドロキシベンゾイルムッサエノシド酸を含んでなる、ヒトを含めた対象哺乳動物に於ける肝疾患症状の治療および／または予防用組成物であって、
上記２′‐ｐ‐ヒドロキシベンゾイルムッサエノシド酸を場合により単独でまたは１種以上の製薬上の添加物と共に含んでなる上記組成物。
２′‐ｐ‐ヒドロキシベンゾイルムッサエノシド酸の濃度が２０〜２００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である、請求項１に記載の組成物。
２′‐ｐ‐ヒドロキシベンゾイルムッサエノシド酸の濃度が５０ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項２に記載の組成物。
治療の対象がヒトである、請求項１に記載の組成物。
組成物が、単独でまたは製薬上許容されるキャリアと共に用いられる、請求項１に記載の組成物。
組成物が、製薬上許容される添加物、キャリア、希釈物、溶媒、フィラー、滑沢剤、賦形剤、結合剤または安定剤と共に対象へ投与される、請求項１に記載の組成物。
組成物が、経口、または臨床上／医学上許容される方法で投与される、請求項１に記載の組成物。
ヒトのための投与量が５ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項１に記載の組成物。
投与量が摂取上安全であり、いかなる副作用も有しない、請求項１に記載の組成物。
粉末、錠剤、カプセル、シロップ、顆粒、エマルジョン、エアゾルおよびビーズからなる群より選択される様々な物理的形態にある、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
肝硬変、ガラクトース血症、血管腫、血色素症、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、Ｇ型肝炎、アルコール性肝疾患、自己免疫性肝炎、肝臓の癌、胆道閉鎖症、Ｉ型糖原病、α‐１‐抗トリプシン欠損症、Alagille症候群、バイラー病、カロリ病、脂肪肝、原発胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎または赤芽球増殖性プロトポルフィリン症に有用である、請求項１に記載の組成物。