JP4585072B2 - Heparin depolymerization method, depolymerized heparin, derivatives thereof and pharmaceutical composition - Google Patents

Description

【００１１】
ヘパリンは、グリコサミノグリカンの一種であり、アミノ糖(ヘキソサミン)であるD-グルコサミンおよびウロン酸であるD-グルクロン酸またはL-イズロン酸から成っている。多くのグルコサミン残基は、Ｎ−アセチル化ではなくＮ−硫酸化されている割合が多い。しかも単一のヘパリン鎖中でも硫酸基の割合にかなりの変動がある。ヘパリンの繰り返し単位はβ(１→４)結合であり、D-グルコサミンにD-グルクロン酸(あるいはL-イズロン酸)が、結合したものからなる。
【００１２】
上記に示した硫酸基、ウロン酸あるいはヘキソサミンはヘパリンが有する様々な生物活性に影響を与える因子として重要であり、中でも硫酸基の割合、残存硫酸基の位置は、抗凝血活性や癌転移抑制作用に関与しているものとして報告がある(J. Riesenfeld, et al. ; J. Biol. Chem., 256, 2389, 1981、U. Lindahl, et al. ; J. Biol. Chem., 258, 9826, 1983、T. Irimura, et al. ; Biochemistry, 25, 5322, 1986)。
【００１３】
近年、ヘパリンの解重合により得られる平均分子量約５,０００ダルトンの低分子量分画である低分子ヘパリンに、血液凝固第Ｘa因子に対する阻害活性と活性化部分トロンボプラスチン時間に対する延長作用の比(抗Ｘa活性／ＡＰＴＴ)の増大が確認され、出血傾向が比較的少ない薬剤として使用されつつある。現在までにヘパリンを亜硝酸分解して得られた低分子ヘパリンのナトリウム塩であるダルテパリンナトリウム、および過酸化水素による解重合で得られた低分子ヘパリンのナトリウム塩であるパルナパリンナトリウムが上市されている。
【００１４】
低分子量ヘパリンの一般的特徴としては、１)抗血栓作用(抗Ｘa活性)／出血誘発作用(抗IIa活性)の比率が高く、出血の危険性が少ない。２)血中半減期が長い(持続投与をせずに単回投与でよい)。３)脂質代謝・血小板に対する影響が少ない。４)血漿蛋白により中和される程度が低い。５)皮下注射時のバイオアベイラビリティーが高い等、その他様々な生理活性を有している。
【００１５】
本発明者らは、ヘパリンや低分子ヘパリンが有する優れた薬理作用を損なうことなく、該ヘパリン類特有の副作用を克服すべく鋭意研究した結果、平均分子量８,５００〜９,５００を有する中分子ヘパリン画分およびそのアミノ酸誘導体が、その目的に沿った性質を備えていることを見い出した(特願平８−３６６９３号)。
【００１６】
上記のような低分子ヘパリンや中分子ヘパリンなどの分画ヘパリン類を得るには、１)ヘパリンからの抽出、２)化学的合成、３)ヘパリンの解重合(分解)などの方法が知られている。しかしながら、１)の抽出法は生産効率が悪く、特に低分子ヘパリン画分はヘパリン全体の僅か数％しか存在しないため実用的ではない。２)の化学的合成法も収率は低く、製造コストが高い。ゆえに、現在では、３)のヘパリンの解重合によって分画ヘパリンを取得する方法が主流となっている。
【００１７】
ヘパリンの解重合方法にはこれまでに、亜硝酸分解法、過酸化物分解法、酵素(ヘパリナーゼ)分解法が知られており(E. Holmer, ed. by D. A. Lane, U. Lindahl, Arnold London, 1989, 575、C. P. Dietrichet al. ; Academic Press, New York, 1980, 317)、これらの方法でヘパリンを解重合した後、濾過クロマトグラフィーなどの手段を用いて目的の分子量を有する分画ヘパリンを調製するのが一般的である。
【００１８】
このように、分画ヘパリンは、ヘパリンの解重合(分解)によって得ることができ、分画ヘパリンの薬理活性は、低分子ヘパリンとヘパリンとの間には、硫酸含量や基本構造には、あまり差が見られないものの(J. I. Nielsen, et al. ; Ostergaard, Acta chir. Scand. Suppl., 543, 52, 1988)、分子量、解重合方法の違いや解重合により得られたヘパリンの末端化学構造の違いによって異なり、数種の低分子ヘパリンが上市されている。
【００１９】
解重合方法には上記のような種々の手段があり、その反応機構も様々である。
そのため、ヘパリンを解重合して分画ヘパリンを取得するという目的は同一であっても、使用する試薬や反応条件如何によってその分画ヘパリンの分子量や開裂した部位の末端構造は影響を受けて異なり、薬理活性(アンチトロンビンIII親和性等)や臨床使用時の抗凝固能等にも大きな差となって現れることになる。
【００２０】
今までに知られているヘパリンの解重合反応は、いずれの手段も何らかの不都合が存在するのが実状である。すなわち、亜硝酸を使用した解重合方法においては(特公昭６３−４４７６４、特公平２−３１０８１)、温度、pＨ等が正確に制御されなければならず、酢酸ナトリウム等のアルカリ性薬品で反応を停止させることが必要である。また、多数の汚染物、特に未反応の亜硝酸により生じた亜硝酸塩および硝酸塩を含有する解重合混合物が生成する。従って、治療に使用する前に補助段階を付加し、精製しなければならない。過酸化水素等の過酸化物を使用した解重合方法においては(特公平４−４２４０１)、オートクレーブを用いて約１〜２気圧の圧力下で加熱しなければならず操作が極めて危険かつ煩雑である。
【００２１】
ヘパリナーゼ等の酵素を使用した解重合方法においては(特公平２−３１７２１)、酵素の安定性、基質の分解温度のコントロール等の問題がある。これらの改良法も散見されるが、いずれも操作がさらに煩雑となり、大量生産には適していない。また、いずれの方法においても、反応終了を自在にコントロールするのが困難であり、結果的に幅広い分子量分布となることから、目的の分子量を有する分画ヘパリンを選択的に製造することができなかった。
【００２２】
ゆえに、操作が簡便であり、常温・常圧で反応し、かつ反応を任意に停止させることができる解重合方法が望まれており、さらに、生成した分画ヘパリンがヘパリンよりも優れた活性を有する物質であることが必要であった。
【００２３】
本発明者らは、出血傾向等の副作用の少ない抗凝固剤およびそれを得るための方法について検討した結果、ヘパリンが有する副作用を減少させ、かつヘパリンと同等あるいはそれ以上の生物活性を有する、中分子ヘパリンおよび中分子ヘパリン誘導体を得るために、新規合成方法を開発した。本発明の方法によれば、ヘパリンの低分子化の割合を反応時間あるいは試薬の量によって制御できる。
【００２４】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１は還元性金属および金属酸化物を用いることを特徴とするヘパリンの解重合方法である。
【００２５】
より具体的には、ヘパリンをリン酸緩衝液に溶解し、これに還元性金属および金属酸化物を加え、激しく攪拌した後、脱塩することにより時間依存的に効率よく特定の平均分子量を有する分画ヘパリンを得ることができる。この反応によれば、反応時間により効率よく目的の分子量を有する解重合ヘパリンを高い収率で得ることができる。
【００２６】
本発明のヘパリン解重合方法は、(１)ヘパリンを約ｐＨ６〜８の緩衝液に溶解し、ついで、(２)該溶解液に還元性金属および金属酸化物を添加した後、反応液を処理する工程を含む。試薬の量にかかわらず、経時的的に低分子化されるが、強いていえばヘパリン、還元性金属および金属酸化物の重量比は、ヘパリン：還元性金属：金属酸化物＝１：０.０１〜１：０.００５〜５である。
【００２７】
さらに、上記工程(２)の後に、反応液を(ａ)約ｐＨ３〜５.５に調製し、(ｂ)臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムを添加する工程、および(ｃ)ヨウ化ナトリウムのエタノール溶液を添加する工程を含むことができる。
【００２８】
本発明の第２は、本発明の方法によって得られ、紫外吸収スペクトルにて２５０ｎｍ〜３３０ｎｍの間に吸収を示す解重合ヘパリンである。
【００２９】
得られた解重合ヘパリンは平均分子量が約２,０００〜１３,０００ダルトンの範囲にあり、大部分は約５,０００〜１０,０００ダルトンの解重合中分子ヘパリンである。
【００３０】
本発明の第３は(１)紫外吸収スペクトルにて２５０ｎｍ〜３３０ｎｍの間に吸収を示し、(２)硫酸基含量が２０〜４０％、(３)ウロン酸含量が２０〜４５％、(４)ヘキソサミン含量が１０〜５０％である解重合ヘパリンである。
【００３１】
本発明の第４は、得られた解重合ヘパリンをアミン化合物を用いてアミド化する、アミド化解重合ヘパリンの製造方法である。用いられるアミン化合物は好ましくは第１級アミンである。
【００３２】
本発明のアミド化解重合ヘパリンは、(１)本発明によって得られた解重合ヘパリンを約ｐＨ２〜６の緩衝液に溶解する工程、(２)アミン化合物を添加する工程、(３)１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)を添加する工程を含む。
【００３３】
さらに、上記工程(３)後に、さらに(ａ)臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムを添加する工程、(ｂ)ヨウ化ナトリウムのエタノール溶液を添加、(ｃ)アルカリ化剤を添加する工程、および(ｄ)約ｐＨ３〜６.５に調整する工程をこの順序で含むことができる。
【００３４】
本発明の第５は、本発明の方法によって得られ、平均分子量が約２,０００〜１８,０００ダルトンである、アミド化解重合ヘパリンである。大部分は約５,０００〜１５,０００ダルトンのアミド化解重合中分子ヘパリンである。また、アミド化解重合ヘパリンは、(１)硫酸基含量が２０〜４０％、(２)ウロン酸含量が２０〜４５％、(３)ヘキソサミン含量が５〜５０％である。
【００３５】
さらに、これらの解重合ヘパリンおよびアミド化解重合ヘパリン誘導体化した化合物が医薬品として有用であることも見いだした。特に、本発明の実施例で得られたＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳの誘導体は、平均分子量が約７０００〜１２０００であるので、低分子ヘパリンのようにダイアライザーから漏出する恐れがなく有用である。また、本来ヘパリンが有している各種の生理活性を損なうことなく、出血傾向を軽減することができるため、従来、重篤な副作用ゆえに適用できなかった種々の疾病に対しても有効に使用することができる。
【００３６】
すなわち、本発明の第６は、得られた解重合ヘパリンまたはアミド化解重合ヘパリンを含む医薬組成物であり、具体的には抗凝固剤、腎疾患治療剤、血小板凝集阻害剤、ラジカルスカベンジャー剤、メサンギウム細胞増殖抑制剤または補体活性抑制剤である。
【００３７】
本明細書で用いられているヘパリンまたはアミド化ヘパリン誘導体の略号を以下に示す。
ＨＥ：ヘパリン
ＦＳまたは−ＦＳ：本発明で得られた新規ヘパリンまたはアミド化ヘパリン誘導体であることを示す接頭語または接尾語
ＭＨＥ−ＦＳ：中分子ヘパリン
ＦＳＦ：中分子ヘパリニルフェニルアラニン
ＦＳＲ：中分子ヘパリニルアルギニン
ＦＳＤ：中分子ヘパリニルアスパラギン酸
ＦＳＭ：中分子ヘパリニルメチオニン
ＦＳＳ：中分子ヘパリニルセリン
ＦＳＢＣ：中分子ヘパリニルベンジル-L-システイン
ＦＳＡＭＣ：中分子ヘパリニル-２-アミノ-４-メチルチオフェン-３
-カルボン酸
ＦＳＢＣＫ：中分子ヘパリニルベンジロキシカルボニル-L-リジン
ＦＳＰＡ：中分子ヘパリニル-L-フェニルアラニノール
ＦＳＰＥＡ：中分子ヘパリニル-R-フェニルエチルアミン
ＦＳＬＰＧ：中分子ヘパリニル-L-フェニルグリシン
ＦＳＤＰＧ：中分子ヘパリニル-D-フェニルグリシン
ＦＳＴＲ：中分子ヘパリニルタウリン
【００３８】
抗凝固剤として好ましいアミド化解重合ヘパリン誘導体としては、ＦＳＡＭＣ、ＦＳＢＣＫ、ＦＳＰＡ、ＦＳＬＰＧ、ＦＳＰＥＡおよびＦＳＤＰＧである。
【００３９】
腎疾患治療剤として好ましいアミド化解重合ヘパリン誘導体としては、ＦＳＦ、ＦＳＤＰＧおよびＦＳＬＰＧである。
【００４０】
血小板凝集阻害剤として好ましいアミド化解重合ヘパリン誘導体としては、ＦＳＦ、ＦＳＢＣ、ＦＳＢＣＫ、ＦＳＤＰＧおよびＦＳＬＰＧである。
【００４１】
ラジカルスカベンジャー剤として好ましいアミド化解重合ヘパリン誘導体としては、ＦＳＦ、ＦＳＲ、ＦＳＤ、ＦＳＭ、ＦＳＳ、ＦＳＢＣ、ＦＳＡＭＣ、ＦＳＢＣＫ、ＦＳＰＡ、ＦＳＰＥＡ、ＦＳＬＰＧ、ＦＳＤＰＧおよびＦＳＴＲである。
【００４２】
メサンギウム細胞増殖抑制剤として好ましいアミド化解重合ヘパリン誘導体としては、ＦＳＦ、ＦＳＬＰＧおよびＦＳＤＰＧである。
【００４３】
補体活性抑制剤として好ましいアミド化解重合ヘパリン誘導体としては、ＦＳＦ、ＦＳＢＣＫ、ＦＳＢＣ、ＦＳＭ、ＦＳＴＲ、ＦＳＤ、ＦＳＬＰＧおよびＦＳＤＰＧである。
【００４４】
【発明の実施の態様】
本発明のヘパリン解重合法は、ヘパリンをリン酸緩衝液(pＨ＝７.２)で溶解し、これに還元性金属(例えば、鉄、銅粉末等)および金属酸化物(例えば、カラムクロマト用シリカゲル等)を加え、激しく攪拌した後、脱塩することにより経時的に効率よく特定の平均分子量を有する解重合ヘパリンを得ることができる。
【００４５】
上記還元性金属の例としては、還元作用を有するものであれば特に制限はないが、銅、鉄、亜鉛、マグネシウム、スズ、アルミニウム等が好適に用いられる。
金属は表面積を大きくする意味から粉末状で用いるのが好ましい。これらの金属は単独であるいは混合物として用いられる。より好ましくは、銅および鉄またはそれらの塩であり、最も好ましくは鉄またはその塩である。
【００４６】
また、本発明の解重合方法で用いる金属酸化物は、例えば、酸化ケイ素（二酸化ケイ素を含む）、酸化亜鉛、酸化アルミニウム、酸化アンチモン、酸化硫黄、酸化ウラン、酸化オスミウム、酸化カドミウム、酸化カルシウム、酸化金、酸化銀、酸化クロム、酸化ゲルマニウム、酸化コバルト、酸化ジルコニウム、酸化水銀、酸化スズ、酸化ストロンチウム、酸化セレン、酸化タングステン、酸化タンタル、酸化チタン、酸化鉄、酸化テルル、酸化銅、酸化トリウム、酸化鉛、酸化ニオブ、酸化ニッケル、酸化白金、酸化バナジウム、酸化バリウム、酸化ビスマス、酸化ヒ素、酸化ベリリウム、酸化ホウ素、酸化マグネシウム、酸化マンガン、酸化モリブデン、酸化ヨウ素、酸化リチウム、酸化リン、酸化ルテニウム、酸化レニウム、酸化パラジウム等が好適に用いられる。酸化ケイ素が特に好ましく、この酸化ケイ素としてカラムクロマトグラフィー用充填剤として市販されているシリカゲルを用いることができる。
【００４７】
解重合中分子ヘパリンのアミド化誘導体の合成
さらに、本発明の製法により得られる解重合ヘパリンをアミド化してアミド化誘導体の合成を行う。解重合によって得られた新規の中分子ヘパリン(以下、ＭＨＥ−ＦＳと称す)を誘導体化してＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体の合成を行うことができる。すなわち、ＭＨＥ−ＦＳおよび各種誘導体化エステル試薬を酸性条件下、１-エチル-３-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を加えることにより反応を行う。反応終了後、４級アンモニウム塩とし、さらにアルカリ条件下で加水分解を行い、目的とする各種ＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体を合成する。
【００４８】
【化２】

【００４９】
また、アミン化合物としては、例えば第一級アミン化合物および第二級アミン化合物を挙げることができ、合成物、天然物を問わない。第一級アミン化合物としてはアミノ基を有する化合物で有れば特に制限はない。第一級アミン化合物および第二級アミン化合物として、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、プロリンなどのα−アミノ酸またはその誘導体が好適に用いられる。これらのアミノ酸はD体、L体またはDL体のいずれでもよい。
【００５０】
具体的に用いられる第一級アミン化合物は、L-フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩、L-アスパラギン酸ジメチルエステル塩酸塩、L-メチオニンメチルエステル塩酸塩、L-セリンメチルエステル塩酸塩、L-アルギニンメチルエステル二塩酸塩、２-アミノ-４-メチルチオフェン-３-エチルエステル、L-フェニルアラニノール、R-(+)-フェニルエチルアミン、L-２-フェニルグリシンメチルエステル一塩酸塩、S-ベンジル-L-システイン、Ｎ−ベンジロキシカルボニル-L-リジン、D-２-フェニルグリシンメチルエステル一塩酸塩、またはアミノエタンスルホン酸である。
【００５１】
上記の第一級アミンを用いて、中分子ヘパリニルフェニルアラニン(以下、ＦＳＦと称す)、中分子ヘパリニルアスパラギン酸(以下、ＦＳＤと称す)、中分子ヘパリニルメチオニン(以下、ＦＳＭと称す)、中分子ヘパリニルセリン(以下、ＦＳＳと称す)、中分子ヘパリニルアルギニン(以下、ＦＳＲと称す)、中分子ヘパリニル-２-アミノ-４-メチルチオフェン-３-カルボン酸(以下、ＦＳＡＭＣと称す)、中分子ヘパリニル-L-フェニルアラニノール(以下、ＦＳＰＡと称す)、中分子ヘパリニル-R-フェニルエチルアミン(以下、ＦＳＰＥＡと称す)、中分子ヘパリニル-L-フェニルグリシン(以下、ＦＳＬＰＧと称す)、中分子ヘパリニルベンジル-L-システイン(以下、ＦＳＢＣと称す)、中分子ヘパリニルベンジロキシカルボニル-L-リジン(以下、ＦＳＢＣＫと称す)、中分子ヘパリニルタウリン(以下、ＦＳＴＲと称す)および中分子ヘパリニル-D-フェニルグリシン(以下、ＦＳＤＰＧと称す)が得られる。これらの中分子ヘパリンのアミド化誘導体は新規化合物である。
【００５２】
ヘパリンの基本５糖構造中の硫酸基と様々な生物活性については既述したとおりであるが、結合硫酸基含量は変化させることができる。
【００５３】
１．硫酸基含量を増加させる方法
硫酸基含量を増加させる割合によって適宜変更されるところであるが、下記に一般的な方法を示す。まず、ＭＨＥ−ＦＳまたはＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体約１００mgに−４℃にて９５％硫酸２０mLおよびクロロスルホン酸１０mLを加える。次に適当な時間、例えば約1時間撹拌した後、室温に戻し、更に約1時間撹拌する。その後−４℃の冷ジエチルエーテル５０mLを加え、沈殿物を濾取する。該沈殿物を精製水に溶解し、０.５Ｎ ＮaＯＨで中和する。脱塩した後減圧濃縮を行い、硫酸基増加型ＭＨＥ−ＦＳまたはＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体を得ることができる。
【００５４】
２．硫酸基含量を減少させる方法
硫酸基含量を減少させる割合によって適宜変更されるところであるが、下記に一般的な方法を示す。まず、ＭＨＥ−ＦＳまたはＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体約３gを精製水２５mLに溶解する。該溶解液をDowex 50W-X8(H+、20〜50mesh)カラムに供す。カラム溶出液と洗浄液を合わせ、冷却下にてピリジンを加え、pＨ＝５.５〜６.０に調製した後濃縮する。得られたＭＨＥ−ＦＳまたはＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体のピリジニウム塩にメタノール（該ピリジニウム塩０.９gに対しメタノール１０mL）を加え、全体を湿潤させる。次に撹拌しながらＤＭＳＯ ６０mLを添加し、完全に溶解させた後、ジオキサン３０mLを加える。該溶液をガラス製耐圧容器内で９０℃に加熱する。２４時間後室温に戻し開栓する。さらにピリジン塩酸塩（ピリジン２gを精製水８mLと混和し、３Ｎ ＨＣｌ ７.５mLを少量ずつ撹拌しながら添加した後、濃縮乾燥する）のジオキサン−ＤＭＳＯ−メタノール（３：６：１ v/v）溶液4mLを添加し、再度密栓して３６時間、９０℃に加熱する。反応終了後、精製水３００mLを加え、１Ｎ ＮaＯＨにてｐＨ=９〜９.５に調製した後、再結晶（エタノール）し乾燥させることにより、硫酸基減少型ＭＨＥ−ＦＳまたはＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体を得ることができる。
【００５５】
本発明の解重合方法で得られる解重合ヘパリンおよびアミド化解重合ヘパリン誘導体は、通常の方法により製剤化し、注射剤や経口剤として投与することができる。また、解重合ヘパリンおよびアミド化解重合ヘパリン誘導体には一般に生体内において遊離型と実質的に同等の生理活性または薬理活性を発揮するもの、例えば、本発明の化合物の誘導体および医薬的に許容される塩、付加塩、水和物などは本発明の技術的範囲に含まれるものである。また、例えば以下のような投与方法によって投与されるが、その投与量あるいは投与速度は、通常、本剤投与後、全血凝固時間または全血活性化部分トロンボプラスチン時間を測定しつつ、年齢、症例、適応領域あるいは使用目的によって決定される。
【００５６】
例えば、静脈内点滴投与法では、解重合ヘパリンおよびアミド化解重合ヘパリン誘導体の５０００〜５００００ヘパリン単位に相当する量を５％ブドウ糖注射液、生理食塩液またはリンゲル液１０００mLで希釈し、１分間に２０〜３０滴前後の速度で静脈内に点滴投与する。また、静脈内間歇注射法では、解重合ヘパリンおよびアミド化解重合ヘパリン誘導体の２０００〜５００００ヘパリン単位に相当する量を４〜８時間毎に静脈内に注射する。皮下注射・筋肉内注射法では、１回２０００〜１００００ヘパリン単位に相当する量の解重合ヘパリンおよびアミド化解重合ヘパリン誘導体を４時間毎に注射する。更に１日１回〜数回の単回投与も可能である。
【００５７】
体外循環時(血液透析・人工心肺)における使用において、人工腎では各患者の適正使用量は透析前のヘパリン感受性試験の結果に基づいて算出されるが、全身ヘパリン化法の場合、通常、透析開始に先だって、１０００〜３０００ヘパリン単位に相当する量の解重合ヘパリンおよびアミド化解重合ヘパリン誘導体を投与し、透析開始後は、１時間当たり５００〜１５００ヘパリン単位に相当する量を間歇的に追加する。局所ヘパリン化法の場合は、１時間当たり１５００〜２５００ヘパリン単位に相当する量を持続注入する。また、人工心肺灌流時では、術式・方法によって異なるが、通常、１５０〜３００ヘパリン単位／kgに相当する量を投与し、更に体外循環時間の延長に応じて適宜追加投与する。特に、実施例で得られたＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体は、平均分子量が約７０００〜１２０００であるので、低分子ヘパリンのようにダイアライザーから漏出する恐れがなく、有用である。
【００５８】
経口投与の場合は、５００〜２０００ヘパリン単位／gに相当する量の解重合ヘパリンおよびアミド化解重合ヘパリン誘導体を１日１〜数回服用する。外用剤の場合は、１００〜５００ヘパリン単位／gに相当する量の解重合ヘパリンおよびアミド化解重合ヘパリン誘導体の軟膏として用いられ、適量を１日１〜数回塗布またはガーゼ等に延ばして貼付する。座剤の場合は、１０００〜４０００ヘパリン単位／gに相当する量の解重合ヘパリンおよびアミド化解重合ヘパリン誘導体を１日１〜２回肛門または膣に適用する。
【００５９】
【実施例】
実施例１ ＨＥ(ヘパリン)の解重合条件の検討
ヘパリン(Scientific Protein Laboratories)を５０mg秤取し、これを０.２５Ｍリン酸緩衝液４mL(pH７.２)で溶解し、鉄粉末(Ｆｅ)を２０または４０mg(和光純薬製)およびワコーゲル(シリカゲル)(ＳiＯ₂)１２.５、２５、５０または１００mg(和光純薬製)を加え、室温で密栓して激しく撹拌した。０、０.５、１、２、３、４、５および６時間後、反応物を濾過後、ＨＰＬＣに供し、ヘパリンの推定分子量の経時的変化を測定した。その結果を図１に示した。
【００６０】
いずれの条件の場合もヘパリンは、試薬の量にかかわらず経時的に低分子化されており、６時間の反応で平均分子量４,０００〜５,０００に低分子化されていた。
【００６１】
液体クロマトグラフ(HPLC)による分子量分画の確認は、ＭＨＥ−ＦＳを蒸留水にて溶解し、次の条件により、分子量の分画を行った。検出器：RID-１０A(島津製作所製)、光散乱検出器：mini dawn(Wyatt technology)、カラム：Shodex OH pak SB-５００３(昭和電工製)、ガードカラム：Shodex OH pak SB-５０００G(昭和電工製)。スタンダードにはポリエチレングリコール１０,０００(Mw.Av.＝１０,０００、ALDRICH)、＃６,０００(Mw.Av.＝８,５００、東京化成)、＃４,０００(Mw.Av.＝３,０００、東京化成)および＃１,５４０、(Mw＝１,４５０、関東化学)を用い、検量線を作成し、分子量分画部分を確認した。
【００６２】
以上の結果より反応時間および試薬量を調節することで特定の分子量を有するヘパリンを合成できることが明らかとなり、今回、これらの方法のうち比較的安定して反応が進行し、また、必要最小限の試薬を用いる方法(ヘパリン：Ｆｅ：ＳiＯ₂＝５：２：１.２５)で、大量のＭＨＥ−ＦＳ(中分子ヘパリン)の合成を行った。
【００６３】
実施例２ 最適条件下でのＭＨＥ−ＦＳ(中分子ヘパリン)の合成
ヘパリン１.０ｇを０.２５M リン酸緩衝液８０mL(pＨ=７.２)で溶解し、これに鉄粉末４００mgおよびワコーゲル２５０mgを加え、室温で密栓して激しく撹拌した。４時間後、反応生成物をセライト(和光純薬製)で濾過し、濾液を酢酸でpＨ=４.５に調製し、５％臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム水溶液をアンモニウム塩の沈澱物が生じなくなるまで加えた。次にこの沈澱物を遠心により完全に分離した後、沈澱物に５％ヨウ化ナトリウムのエタノール溶液(５０mL)を加え、１時間撹拌後に濾過し、沈澱をエタノールで再結晶を行い粗ＭＨＥ−ＦＳを得た。これを蒸留水に溶解し、HPLCに供し、分子量５,０００〜１０,０００の分画を分取した。減圧濃縮した後、エタノールで再結晶し、ＭＨＥ−ＦＳ(７２０mg)を得た。その結果、約７０％の収率で目的とするＭＨＥ−ＦＳ(中分子ヘパリン)が合成できた。
【００６４】
実施例３ ＭＨＥ−ＦＳの機器分析
フーリエ変換赤外分光計FTIR-８２００PC型(島津製作所製)を用いて赤外線吸収(ＩＲ)スペクトルの測定を行った。試料の調製はＫＢr錠剤法により行った。すなわち、ヘパリンおよびＭＨＥ−ＦＳを約３mg秤量し、ＫＢr約１００mgを混ぜ合わせ、ハンディープレスでペレットを作製しＩＲスペクトルの測定を行った。
【００６５】
自記分光光度計UV-２４０(島津製作所製)を用いて紫外線吸収(ＵＶ)スペクトルの測定を行った。ヘパリンおよびＭＨＥ−ＦＳを１mg秤量し、蒸留水で、１mg/mLの濃度に調製しＵＶスペクトルの測定を行った。
【００６６】
Varian XL-２００(２００MHz)を用いてヘパリンおよびＭＨＥ−ＦＳをD₂Oに溶解し、¹H ＮＭＲスペクトルの測定を行った。
【００６７】
その結果、ＭＨＥ−ＦＳのＩＲ、ＮＭＲスペクトルではヘパリンと略同一であったが、ＵＶスペクトルで２９０nmに極大吸収が認められた(図２)。
【００６８】
実施例４ ＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体合成方法
アミド化誘導体合成のために下記の試薬を用いた(かっこ内はアミド化誘導体になった場合の略号を示す)。
【００６９】
【化３】

【００７０】
具体的には、L-アルギニンメチルエステル二塩酸塩(SIGMA)、L-アスパラギン酸ジメチルエステル塩酸塩(SIGMA)、L-メチオニンメチルエステル塩酸塩(SIGMA)、L-フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩(Aldrich)、L-セリンメチルエステル塩酸塩(半井テスク)、２-アミノ-４-メチルチオフェン-３-エチルエステル(Lancaster)、L-フェニルアラニノール(東京化成)、R-(+)-フェニルエチルアミン(東京化成)、L-２-フェニルグリシンメチルエステル一塩酸塩(Aldrich)、D-２-フェニルグリシンメチルエステル一塩酸塩(Aldrich)、アミノエタンスルホン酸(タウリン)(和光純薬)、Ｎ−ベンジロキシカルボニル-L-リジン(Lancaster)、S-ベンジル-L-システイン(Lancaster)である。
【００７１】
中分子へパリニルフェニルアラニン(ＦＳＦ)の合成
ＭＨＥ−ＦＳ５６０mgの水溶液１５mLにpＨ=４.７５においてL-フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩９００mg、１-エチル-３-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)７００mg(半井テスク)の水溶液５.１mLを徐々に加え、４時間撹拌した後、少量の水および５％臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム(半井テスク)水溶液をアンモニウム塩の沈澱物が生じなくなるまで加えた。次にこの沈澱物を遠心により完全に分離した後、沈澱物に５％ヨウ化ナトリウム(半井テスク)のエタノール溶液５０mLを加え、１時間撹拌後、濾過し、沈澱をエタノールで再結晶を行うことにより、白色粉末のヘパリニルフェニルアラニンメチルエステルを得た。次いで、この化合物に０.１mol/L水酸化ナトリウム溶液１０mLを加えて０〜５℃で窒素気圧下２日間撹拌した。反応後反応液に酢酸を加えpH=５とした後、濾過し、濾液にエタノールを加え生成する白色粉末の中分子へパリニルフェニルアラニン(以下、ＦＳＦと称す)を６８％の収率で３８０mg得た。
【００７２】
ＭＨＥ−ＦＳの各種アミド化誘導体を上記のアミド化試薬を用いて、上記のＦＳＦの合成方法と同様に、それぞれＦＳＲ、ＦＳＤ、ＦＳＭ、ＦＳＳ、ＦＳＢＣ、ＦＳＡＭＣ、ＦＳＢＣＫ、ＦＳＰＡ、ＦＳＰＥＡ、ＦＳＬＰＧ、ＦＳＤＰＧおよびＦＳＴＲを合成した。また、各誘導体の合成収率を表１に示した。
【００７３】
【表１】
MHE-FSのアミド化誘導体の収率

【００７４】
実施例５ ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体の機器分析 フーリエ変換赤外分光計FTIR-８２００PC型を用いて赤外線吸収(ＩＲ)スペクトルの測定を行った。試料の調製はＫＢr錠剤法により行った。すなわち、ヘパリンおよびＭＨＥ−ＦＳを約３mg秤量し、ＫＢr約１００mgを混ぜ合わせ、ハンディープレスでペレットを作製した。そして、以下の条件によりＩＲスペクトルの測定を行った。
【００７５】
自記分光光度計UV-２４０(島津製作所製)を用いて紫外線吸収(ＵＶ)スペクトルの測定を行った。各種中分子ヘパリンを１mg秤量し、蒸留水で、０.５mg/mLの濃度に調製し、ＵＶスペクトルの測定を行った。
【００７６】
Varian XL-２００(２００MHz)を用いてヘパリンおよび新規中分子ヘパリンをD₂Oに溶解し、¹H ＮＭＲスペクトルの測定を行った、
【００７７】
各誘導体のＩＲおよびＵＶスペクトルの結果を表２に示した。
【表２】
HE、MHE-FSおよびMHE-FSのアミド化誘導体のIRおよびUVスペクトルのデータ

【００７８】
実施例６ ＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体の絶対分子量測定
ヘパリンのような複雑な構造を有する生理活性物質は、分子量分布、分子サイズ、レセプターとの親和性などから多様な活性を示すと考えられる。今まで低分子ヘパリンの分子量を測定する際には、分子量スタンダードを使って校正曲線を作成し、相対的な分子量を求めていたために、精度はスタンダードの品質に依存されていた。また、各スタンダードの分子量は固有粘度や超遠心などを用いて求めており、そのため各社における低分子ヘパリンの分子量分布が大きく異なっていた。今回、絶対分子量の測定にＳＥＣ／ＭＡＬＬＳ法(James, E. Knobloch et al. ; Anal. Biochem., 245, 231-241, 1997)を用い、ヘパリン、本発明で得られた中分子ヘパリン並びに各中分子ヘパリン誘導体１３種ＦＳＦ、ＦＳＤ、ＦＳＭ、ＦＳＳ、ＦＳＲ、ＦＳＡＭＣ、ＦＳＰＡ、ＦＳＰＥＡ、ＦＳＬＰＧ、ＦＳＢＣ、ＦＳＢＣＫ、ＦＳＴＲおよびＦＳＤＰＧの絶対分子量を多角度光散乱検出器を用い、分子排除クロマトグラフ法(SEC/MALLS)にて測定するとともに、ヘパリンおよびダルテパリン(キッセイ薬品、フラグミン注、Lot No ７０４７AH)との違いを検討した。なお、本実験の標準物質として単分散で分子量が明確なpullulan P-１０(昭和電工製、Mw.Av.=１１,８００)を用い、絶対分子量の正確性を確認した。その結果、pullulanは単分散であり、平均分子量は１１,７６０であった。
ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳ、ダルテパリンおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体を２.５〜３mg秤取し、２５mg/mLの濃度に調製した。これをＨＰＬＣに注入し、ＳＥＣ／ＭＡＬＬＳ法により分子量を測定した。次の条件で分析を行った。検出器：RID-１０A(島津製作所製)、光散乱検出器：mini dawn(Wyatt technology)、カラム：Shodex OH pak SB-８０３HQ(昭和電工製)、ガードカラム：Shodex OH pak SB-G(昭和電工製)。また、スタンダードについても同様の方法で行った。得られたデータについては解析ソフトASTRAを用いて解析し、それぞれの平均絶対分子量を求めた。
【００７９】
ＳＥＣ／ＭＡＬＬＳ法によるヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体の分子量の測定結果を表３(Ｍｗ：絶対分子量(重量分子量)、Ｍｎ：数平均分子量)に示す。すなわち、今回使用したヘパリンの平均分子量は１４,１７０であり、また、このヘパリンより合成したＭＨＥ−ＦＳの平均分子量は、８,３２７であった。ダルテパリンの平均分子量は、６,６３５であり、ＭＨＥ−ＦＳと大きく異なっていた。Ｍｗ／Ｍｎが１であれば単分散を示し、１より大きくなるに従って多分散性を示す。測定結果を表３に示した。
【００８０】
【表３】
HE、MHE-FSおよびMHE-FSのアミド化誘導体のSEC/MALLS 分析

【００８１】
実施例７ 硫酸基の測定
合成したＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体に含まれる硫酸基の割合を測定した。標準液として硫酸アンモニウム０、５、１０、２５、５０、７５、１００μmol/mL(和光純薬)を蒸留水に溶解したものを使用した。
【００８２】
ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体における硫酸基の含量を求めるためにＸ軸に硫酸アンモニウム濃度、Ｙ軸に吸光度(５００nm)として検量線を作成した。
【００８３】
ヘパリン約１mgを１mol/Lの塩酸で１mg/２mLの濃度に調製し、１、３、５および６時間加水分解し、硫酸含量を測定した。
【００８４】
ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体における硫酸基の含量をK.S.Dodgsonらの方法(K. S. Dodgson, et al. ; Biochem. J., 84, 106, 1962)に基づいて測定した。ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体を約５mg秤取し、１mol/Lの塩酸で１０mg/mLの濃度に調製した。次にこの溶液１００μLを共栓付試験管に移し、ドラフト中にて沸騰水浴中で、５時間加水分解を行った。加水分解後、減圧濃縮し、これに０.１mol/Lの塩酸４.５mLを加え、沈澱をよく溶解した後、３０００rpm、１０min遠心した。標準液については各々１００μLを共栓付試験管に採取し、０.１mol/L塩酸４.４mLを加えた。次に標準液および試料液(遠心上清)を２mLずつ試験管に２本(空試験用、本試験用)分けて採取し、空試験にはゼラチン溶液(０.５ｇのゼラチン(DIFCO)に１００mLの蒸留水を加え、湯浴(６０〜７０℃)で溶解し、４℃で一晩放置したもの)、本試験にはゼラチン-塩化バリウム溶液(左記のゼラチン溶液５０mLに０.５ｇの塩化バリウム(無水)(和光純薬)を加え、４時間以上撹拌したもの)を０.２５mL加えよく混合し、室温で２０分間放置した後、１時間以内にUVIDEC ７７Σ(日本分光)を用いて５００nmで吸光度を測定した。結果を表４に示した。
【００８５】
【表４】
HE, MHE-FSおよびMHE-FSのアミド化誘導体の硫酸基含量

【００８６】
ヘパリンおよびＭＨＥ−ＦＳの硫酸基の割合はそれぞれ３１.７５％および３４.５２％であったのに対し、ＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体では２３.５１〜３１.８０％であった。従って、ヘパリンおよびＭＨＥ−ＦＳと比較してＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体の硫酸基の割合が低くなっていることからＭＨＥ−ＦＳをアミド化誘導体化することによりヘパリンのもつ抗血液凝固活性が軽減されたと考えられる。
【００８７】
実施例８ ウロン酸含量の測定
合成したＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体に含まれるウロン酸(L-イズロン酸およびD-グルクロン酸)を測定した。標準液としてグルクロン酸ナトリウム０、０.０５、０.１、０.２５、０.５mg/mL(和光純薬、Lot No ECK４８５４)を蒸留水に溶解したものを使用した。
【００８８】
ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体におけるウロン酸の含量を求めるためにＸ軸にグルクロン酸ナトリウムの濃度、Ｙ軸に５３０nmにおける吸光度として検量線を作成した。
【００８９】
ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体のウロン酸含量をT.Bitterらの方法(T. Bitter, et al. ; Anal.Biochem., 4, 330, 1962)を用い、測定した。ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体を秤取し、１mg/mLの濃度に蒸留水を用いて調製した後、これらの試料、ブランク(蒸留水)および標準物質をそれぞれ２００μL共栓付試験管に採取した。次に室温以上にならないように注意しながら氷冷した四硼酸ナトリウム硫酸溶液(四硼酸ナトリウム十水和物０.９５ｇ(和光純薬、Lot No ACN３４５６)を氷冷した濃硫酸１００mL(キシダ、Lot No ES６０４２４H)に溶解したもの)３.０mLを試料の入った試験管に滴下し、さらに、カルバゾール液(カルバゾール１２.５mg(和光純薬、Lot No ＣAJ００３４)を無水エタノール１０mLで溶解したもの)を１００μL加えた。十分に混合した後、沸騰水浴中で２０分間加熱し、室温まで氷冷し吸光度(５３０nm)を島津自記分光光度計 UV-２４０を用いて測定した。結果を表５に示した。
【００９０】
【表５】
HE、MHE-FSおよびMHE-FSのアミド化誘導体のウロン酸含量

【００９１】
ウロン酸(L-イズロン酸およびD-グルクロン酸)の含量は、ＦＳＤＰＧが４３.４３％と最も多く含有しており、他は２８〜４０％ウロン酸を含有していた。
【００９２】
実施例９ アミノ糖(ヘキソサミン)含量の分析
一般にヘキソサミンは、硫酸基およびウロン酸と同様、ヘパリンのもつ様々な生物活性に影響を与える因子として大変重要であるとされている。一方、このヘキソサミンの測定には、今まで比色分析法が主として使用されていたが、微量での分析が困難であった。今回、我々はヘキソサミンがアミノ糖であり、ニンヒドリン反応で呈色することを利用し、微量のＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体を用い、ヘキソサミン含量の測定を行った。
【００９３】
標準液には、D-(+)-グルコサミン塩酸塩(和光純薬、Lot No TPH６５２５)０、１０、１００、１０００μg/mLを０.０２mol/L塩酸に溶解したものを使用した。
また、測定には日立高速アミノ酸分析計L-８５００形を使用し、アミノ酸クロマトグラフ法で測定した。分析条件は次の通りである。注入量：３０μL、カラム：日立カスタムイオン交換樹脂#２６２２を内径４.６mm、長さ６０mmのステンレス管に充填したもの、緩衝液(表６)：Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４およびＢ５、反応液：和光純薬製ニンヒドリン試液Ｌ-８５００セット、化学反応槽温度：１３５℃、検出器：可視部吸光光度計(測定波長：４４０nmおよび５７０nm)。
【００９４】
【表６】
アミノ酸分析装置用緩衝液

【００９５】
１)和光純薬製ニンヒドリン試薬Ｌ-８５００セット。
ニンヒドリン溶液(１Ｌ中、ニンヒドリン０.２２moL、水素化ホウ素ナトリウムおよびプロピレングリコールモノメチルエーテルを含む)と緩衝液(１Ｌ中、酢酸リチウム二水和物２.０moL、プロピレングリコールモノメチルエーテルを含む)を等量混合した液。
２)pＨ９.０のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸緩衝液 トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン６０.５７mgを希塩酸３２.５mLに溶かし、水を加えて１０００mLとした。
３)０.１Mジトレイトール試液 ジトレイトール７７mgをpＨ９.０のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸緩衝液に溶かし、５mLとする。
４)酸性ニンヒドリン試液
ニンヒドリン２.５gを氷酢酸に溶かし、塩酸４０mLを加える。用時調製。
５)クエン酸試液
クエン酸一水和物２４.２gを量り、水で１０００mLとする。
【００９６】
ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体について各々約１００μgを試料用試験管に秤量し、この試験管を反応バイアル内に入れ減圧乾燥させた。次に反応バイアル底に加水分解用６mol/L塩酸(１％フェノール含有)を１００μL入れ、減圧下、反応バイアル内を窒素で置換した後、１０５℃で１８時間加水分解を行った。乾燥後、試験管を取り出し、０.０２mol/L塩酸１００μLを加えてよく混合し、フィルターで濾過し、濾液を試料溶液とした。この試料溶液についてアミノ酸分析装置を用い、各誘導体におけるヘキソサミンの含量を測定した。結果を表７に示した。
【００９７】
【表７】
HE、MHE-FSおよびMHE-FSのアミド化誘導体のヘキソサミン含量

【００９８】
ヘパリンのヘキソサミン含量は約１４％であり、ＭＨＥ−ＦＳは約１５％であった。また、ＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体では約１３〜４０％であった。ＦＳＤＰＧにおいては４０％と高い値を示した。
【００９９】
実施例１０ 元素分析
ヘパリンの構成成分はウロン酸とアミノ糖そして硫酸である。これらの成分は、Ｃ、Ｈ、Ｏ、ＮおよびＳの五種類の元素から成り立っており、これらの元素の割合がヘパリンの持つ薬効を左右している可能性も考えられている。ゆえに、今回合成したＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体について、一分子中に含まれる個々の元素含量を元素分析により求めた。元素分析機は、CHN CORDER(柳本製)を用いた。
【０１００】
ヘパリンおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体について約３mg／バイアルを秤取した後、十分に乾燥させ燃焼法にて各元素(Ｃ、Ｈ、Ｎ、ＯあるいはＳ)含量を測定した。結果を表８に示した。
【０１０１】
【表８】
HEおよびMHE-FSのアミド化誘導体の元素分析

【０１０２】
今回合成した誘導体は、硫黄含量(Ｓ)が７.８４〜９.７２％、酸素含量(Ｏ)が５２.４８〜５７.９６％とヘパリンの硫黄含量(１０.５８％)および酸素含量(６１.２５％)と比較して減少していたが、水素含量(Ｈ)、炭素含量(Ｃ)および窒素含量(Ｎ)は増加していた。
【０１０３】
実施例１１ 抗血液凝固剤
ＭＨＥ−ＦＳ ５０００ 低分子ヘパリン国際単位(抗第Ｘa因子活性)生理食塩水 適量
pＨを５.０〜７.５に調整し、全量を５mLとした。得られた抗血液凝固剤は浸透圧比が約１(対生理食塩水比)であった。
【０１０４】
実施例１２ 抗血液凝固剤
ＭＨＥ−ＦＳの代わりにＦＳＬＰＧを用いる以外は実施例１１と同様にして調製した。得られた抗血液凝固剤は浸透圧比が約１(対生理食塩水比)であった。
【０１０５】
薬理試験
薬理試験１． in vitro血液凝固系に及ぼす影響
ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体のin vitroにおける血液凝固系に及ぼす影響を検討した。すなわち、ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体におけるＡＰＴＴの延長作用と抗Ｘa活性を調べるためにヒト正常血漿(Coagulation Control Plasma (Normal) Level l:Pacific Hemostasis 製)を用いて、以下の項目について測定を行った。
【０１０６】
１) 活性化部分トロンボプラスチン時間(ＡＰＴＴ)の測定
ＡＰＴＴ測定にはＡＰＴＴ-テストワコー(ＡＰＴＴ-P試薬、ケファリン)(和光純薬)、Amelung-Coagulometer、デカベット(エム・シー・メディカル)を使用した。ヒト正常血漿９容にヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体あるいはPBS(-)(対照)１容を加えて被験血漿を調製し、これらの被験血漿１００μLに活性化部分トロンボプラスチン試薬１００μLを加え、３７℃、３分加温後、塩化カルシウム溶液を１００μL添加し、血液凝固時間自動測定器Amelung-Coagulometerを用いて、凝固するまでの時間を測定した。
【０１０７】
２) 抗Ｘa活性の測定
抗Ｘa活性測定には、テストチームＲヘパリンＳ(第一化学薬品)を使用した。ヒト正常血漿２容にヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体あるいは緩衝液(５０mM ２-アミノ-２-ヒドロキシル-１、３-プロパンジオール、pH８.４)(対照)２容および緩衝液６容加えて被験血漿を調製し、これらの被験血漿１００μLを３７℃で５分間加温した後、ウシ由来Ｘa試液(７.１ nkat／mL)５０μLを加えた。さらに３０秒間加温した後にあらかじめ加温しておいた基質液(Ｎ−ベンゾイル-L-イソロイシル-L-グルタミル-グリシル-L-アルギニル-p-ニトロアニリド・塩酸塩)１００μLを添加し、３分間加温を続けた後、反応停止液(１０％酢酸)９５０μLを加え、波長４０５nmの吸光度で残存するＸa因子を測定した。測定結果を表９に示した。
【０１０８】
【表９】
HE、MHE-FSおよびMHE-FSのアミド化誘導体の抗Xa活性/APTT活性

*: ＡＰＴＴを100秒に延長する濃度
【０１０９】
表９ではＡＰＴＴの延長作用をヘパリン比で表した場合、値が大きい程、出血傾向がヘパリンより軽減されており、例えばＭＨＥ−ＦＳでは約２倍軽減されていることになる。また、抗Ｘa活性を１/ヘパリン比で表した場合、この値が１より大きい程、抗Ｘa活性(抗血栓作用)が、ヘパリンよりも優れていることになる。従って、抗凝固能の表現方法の一つとして用いられている抗Ｘa活性とＡＰＴＴの延長作用の比(抗Ｘa活性/ＡＰＴＴ比)が大きい程、より安全性の高いヘパリン代用薬としての可能性がある。つまり、ヘパリンを１とした時、ＭＨＥ−ＦＳが２.４４、ＦＳＡＭＣが２.１５、ＦＳＢＣＫが４.８９、ＦＳＰＡが１.２４、ＦＳＬＰＧが１.２７と高い値を示した。このことから、これらの誘導体は、抗Ｘa活性が保持されＡＰＴＴの延長作用が弱められた結果、出血助長が少なく、かつ抗血栓作用をもったより安全性の高い抗凝固薬として期待される。
【０１１０】
ＭＨＥ−ＦＳのカルボン酸を置換した誘導体のうち、Ｃ末端の官能基の種類(水酸基(ＦＳＰＡ)、カルボン酸(ＦＳＦ))ではＡＰＴＴ活性にほとんど差がなかったが、抗Ｘa活性は、水酸基(ＦＳＰＡ)の方がカルボン酸(ＦＳＦ)の約７倍の活性を示した。また、Ｃ末端の官能基がカルボン酸(ＦＳＬＰＧ)と比較してメチル基(ＦＳＰＥＡ)の場合、ＡＰＴＴは、約１/２.５に軽減されていたが、抗Ｘa活性は、約１/４に低下していた。ベンゼン環が、ヘパリンとの結合部位より遠隔になるＦＳＤＰＧ、ＦＳＦ、ＦＳＢＣ、ＦＳＢＣＫの順でＡＰＴＴの延長作用が軽減されていた。さらに天然型のＬ体と非天然型のＤ体を比較するとＡＰＴＴはほとんど変わらないが、抗Ｘa活性はＬ体のほうが約１０倍高かった。
【０１１１】
薬理試験２． ex vivo血液凝固系に及ぼす影響
ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体のex vivoにおける血液凝固系に及ぼす影響を検討した。雄性マウス(１群３〜５匹)にヘパリンおよびＭＨＥ−ＦＳを０.１、０.３および１.０mg/kg、ＦＳＬＰＧおよびＦＳＤＰＧを０.３、１.０、３.０および１０.０mg/kg、その他のＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体を１.０、３.０、１０.０および３０.０mg/kg(対照はPBS(-))の用量で尾静脈内に投与し、投与１５分後にエーテルおよびネンブタール麻酔下で腹部大動脈より３.８％クエン酸ナトリウム(血液９容に対して１容)を用いて採血し、以下の項目について測定を行った。
【０１１２】
１) 活性化部分トロンボプラスチン時間(ＡＰＴＴ)の測定
ＡＰＴＴ測定にはＡＰＴＴ-テストワコー(ＡＰＴＴ-P試薬、ケファリン)(和光純薬)、Amelung-Coagulometer、デカベット(エム・シー・メディカル)を使用した。採血した血液より得た血漿１００μLに活性化部分トロンボプラスチン試薬１００μLを加え、３７℃、３分加温後、塩化カルシウム溶液を１００μL添加し、血液凝固時間自動測定器Amelung-Coagulometerを用いて、凝固するまでの時間を測定した。
【０１１３】
２) 抗Ｘa活性
抗Ｘa活性測定には、テストチームＲヘパリンＳ(第一化学薬品)を使用した。採血した血液より得た血漿２容に緩衝液(５０mM ２-アミノ-２-ヒドロキシル-１、３-プロパンジオール、pＨ８.４)８容加えて被験血漿を調製し、この被験血漿１００μLを３７℃で５分間加温した後、ウシ由来Ｘa試液(７.１ nkat/mL)５０μLを加えた。さらに３０秒間加温した後にあらかじめ加温しておいた基質液(Ｎ−ベンゾイル-L-イソロイシル-L-グルタミル-グリシル-L-アルギニル-p-ニトロアニリド・塩酸塩)１００μLを添加し、３分間加温を続けた後、反応停止液(１０％酢酸)９５０μLを加え、波長４０５nmの吸光度で残存するＸa因子を測定した。結果を表１０に示した。
【０１１４】
【表１０】
HE、MHE-FSおよびMHE-FSのアミド化誘導体の抗Xa活性/APTT活性

*: ＡＰＴＴを100秒に延長する投与量
【０１１５】
表１０においてはＡＰＴＴの延長作用をヘパリン比で表した場合、値が大きい程、出血傾向がヘパリンより軽減されている。また、抗Ｘa活性を１/ヘパリン比で表した場合、この値が１より大きい程、抗Ｘa活性(抗血栓作用)が、ヘパリンよりも優れていることになる。従って、抗凝固能の表現方法の１つとして用いられている抗Ｘa活性とＡＰＴＴの延長作用の比(抗Ｘa活性/ＡＰＴＴ比)が大きい程、より安全性の高いヘパリン代用薬としての可能性がある。つまり、ヘパリンを１とした時、ＦＳＡＭＣが１.９１、ＦＳＰＡが２.１４、ＦＳＰＥＡが１.８１、ＦＳＬＰＧが２.４８、ＦＳＢＣＫが２.２２と、高い値を示した。すなわち、これらの誘導体については、臨床においてヘパリンより安全性の高い抗凝固薬としての応用が期待される。
【０１１６】
ＭＨＥ−ＦＳのカルボン酸を置換した誘導体の内、Ｃ末端の官能基の種類(水酸基(ＦＳＰＡ)、カルボン酸(ＦＳＦ))ではin vitroでの結果と同様、ＡＰＴＴ活性にほとんど差がなかったが、抗Ｘa活性は、水酸基(ＦＳＰＡ)の方がカルボン酸(ＦＳＦ)の約７倍の活性を示した。また、Ｃ末端の官能基がカルボン酸(ＦＳＬＰＧ)と比較してメチル基(ＦＳＰＥＡ)の場合もin vitroでの結果同様、ＡＰＴＴは、約１/３に軽減されていたが、抗Ｘa活性は、約１/４.５に低下していた。天然型のＬ体(ＦＳＬＰＧ)と非天然型のＤ体(ＦＳＤＰＧ)を比較するとＡＰＴＴの延長はＤ体では、Ｌ体と比較して約１/３に軽減されているが、抗Ｘa活性はＬ体のほうが約１０倍高い活性を示していた。
【０１１７】
薬理試験３． ＰＡＮ腎症に及ぼす影響
ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体のpuromycin aminonucleoside(ＰＡＮ)腎症に及ぼす影響を検討した。
【０１１８】
生理食塩液に溶解したＰＡＮ(和光純薬)を１１０mg/５mL/kgの用量でラットに１回腹腔内投与することによりＰＡＮ腎症を惹起した。ＰＡＮ腎症惹起１、４、７、１０および１４日後にラットに水道水２５mL/kgを経口投与した後、代謝ケージ(CT-１０型、日本クレア)に収容し、絶食・給水下の条件で１６時間採尿を行った。採取した尿は尿量を計測し、尿中蛋白濃度をマイクロTPテストワコー(和光純薬)を用いて測定し、尿蛋白排泄量／日を算出した。
【０１１９】
試験物質は０.１５〜５mg/mL/kgの用量で静脈内投与し、メチルプレドニゾロン(注射用メプレドロン、富士レビオ、MP)は１０mg/５mL/kgの用量で経口投与した。投与期間はＰＡＮ投与３０分前および投与１日後より１回／日、連日１４日間とした。
【０１２０】
動物は４週齢のJcl:SD系雄性ラットを使用した。各群の動物数は６〜７匹とした。また、陽性対照物質はＭＰを添付溶解液(全量２mL)に溶解した後、PBS(-)で希釈し２mg/mLの濃度に調製し使用した。
【０１２１】
測定値は平均値±標準誤差で表示した。対照群と試験物質投与群間については多重比較検討を行った。まずLevene法で各群の分散の一様性を検定し、等分散の場合には一元配置分散分析を、不等分散の場合にはデータを順位変換した後Kruskal-Wallis検定を行った後、Tukey法により検定した。また、対照群と陽性対照群間についてはｔ検定を実施した。結果を図３に示した。各測定値は１群当たりの動物数６〜７匹の平均値±Ｓ.Ｅ.示す。*(Ｐ＜０.０５)、**(Ｐ＜０.０１)において対照との間に有意差が見られた。
【０１２２】
対照群における尿蛋白排泄量はＰＡＮ投与４日後に５８.６±３１.９mg/dayと増加し始め、１０日後に１３０±２４.７mg/日とピークを示し、その後減少した。これに対して、陽性対照物質であるＭＰ投与群における尿蛋白排泄量はＰＡＮ投与７日後以降有意に減少した(図３Ａ)。ＦＳＦ１mg/kg投与群においては尿蛋白排泄量の減少傾向が認められ、３mg/kg投与群の尿蛋白排泄量はＰＡＮ投与１０日後において対照群の３２％まで減少した(図３Ｂ)。ＦＳＤＰＧ １mg/kg投与群においては尿蛋白排泄量の減少傾向が認められた(図３Ｃ)。ＦＳＬＰＧ １mg/kg投与群における尿蛋白排泄量は、ＰＡＮ投与７および１０日後において有意に減少した(図３Ｄ)。ゆえに、ＦＳＦおよびＦＳＬＰＧはＰＡＮ腎症における尿蛋白排泄を抑制することが明らかとなったことから、急性・慢性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、腎硬化症、間質性腎炎、慢性腎盂腎炎、急性尿細管壊死、通風腎、重金属・薬剤中毒、薬剤による副作用、尿細管性アシドーシス、腎不全、ループス腎炎等の腎性蛋白尿をきたす、各種腎疾患の予防・治療剤に応用できる。
【０１２３】
薬理試験４． in vitro血小板凝集能に及ぼす影響
ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体のラット血小板に対するコラーゲンおよびトロンビン誘発凝集の影響を検討した。
【０１２４】
１)ラット血小板の採取
ペントバルビタールナトリウム(ネンブタール注、大日本製薬)４０mg/kg、i.p.麻酔下にてSD系雄性ラットを開腹し、腹部大動脈を露出した。３.８％クエン酸ナトリウム溶液(診断用チトラミン“フソー”、扶桑薬品)０.８mLを含む２０mLシリンジポンプに１８ゲージ注射針を装着し、腹部大動脈より８mL以上の血液を採取した。採血後、直ちにクエン酸ナトリウム溶液の添加比率が採血量の１０％となるよう、同溶液をシリンジポンプ内に添加し、転倒混和した。この血液を低速遠心(６５０〜７５０rpm、２５℃にて２０分)し、上清を採取した。これを多血小板血漿(PRP)とした。さらに残りの血液を遠心(３０００rpm、４℃にて、１０分)し、上清を採取した。これを乏血小板血漿(PPP)とした。
【０１２５】
２)洗浄血小板溶液の調製
PRPに１/１００容の２００mmol/L EDTA-２Na溶液を添加し、穏やかに混和した。これを遠心(２３００rpm、４℃にて、１０分)し、上清を吸引除去した。沈渣をもとのPPPとほぼ同量の０.３mmol/L EDTA-２Naを含むトリス塩酸緩衝生理食塩液(pH ７.４)に懸濁した。再び遠心(２３００rpm、４℃にて、１０分)し、上清を吸引除去した。沈渣を元のPPPとほぼ同量の０.１％ウシ血清アルブミン(Fraction V、生化学工業)を含むＣa²⁺-freeタイロード(BSA-Tyrode)液に懸濁し、これを洗浄血小板溶液とした。
【０１２６】
３)コラーゲン誘発血小板凝集に対する影響
PRPを測定に使用した。PRPは、多項目自動血球測定装置にて血小板数をカウントし、いずれも５×１０⁵/mLとなるようPPPにて調製した。対照用のキュベットにPPP、測定用のキュベットに調製PRP各々１８０μLを添加した。添加したキュベットを予め５分間以上３７℃で加温した後、測定を開始した。測定開始１分後にPBS(-)１０μLあるいは種々の濃度の試験物質(ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳあるいはＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体)の１０μLを測定用キュベットに添加した。さらに３分後に、血小板凝集物質として０.４mg/mLコラーゲンの１０μL(終濃度２０μg/mL)を添加し、その後１０分間測定を行った。測定開始時におけるPPPの光透過率を１００％、調製PRPを０％とし、凝集物質添加後の光透過率の変化を血小板凝集率として測定した。
コラーゲン(コラーゲンリエージェント“ホルム”、Nycomed Arzneimittel−モリヤ産業)は試薬に付属のＳＫＦバッファーにて希釈した。
血小板数の測定には多項目自動血球測定装置(K-１０００、日本分光)を、血小板凝集能の測定には血小板凝集能測定装置(PAM-８C、メバニクス)を使用した。
【０１２７】
４)トロンビン誘発血小板凝集に対する影響
洗浄血小板溶液を測定に使用した。前項と同様に洗浄血小板溶液の血小板数をカウントし、５×１０⁵/mLとなるようBSA-Tyrode液にて希釈した。対照用のキュベットにBSA-Tyrode液、測定用のキュベットに洗浄血小板溶液各々１８０μLを添加し、前項と同様に測定を行った。但し、凝集物質としては４０ unit/mLトロンビン溶液の１０μL(終濃度０.２ unit/mL)を添加した。トロンビン(トロンビン５,０００単位モチダ、持田製薬)はPBS(−)にて溶解した。
【０１２８】
５)統計解析
各凝集物質添加１０分後までの最大凝集率を求めた。ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳまたはＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体の血小板凝集に対する阻害率は以下の式により算出した。但し、阻害率を算出に用いるデータは、各々同一個体の血小板より得られたデータとした。
【０１２９】
抑制率(％)
=(１−各試験物質添加時の最大凝集率／PBS(-)添加時の最大凝集率)×１００
また測定は、各々異なる個体の血小板を用いて３〜５回繰り返して行い、その平均値と標準偏差を算出した。また濃度依存的な血小板凝集抑制を示した被験物質につき、抑制率が５０％の前後となる２〜４用量における直線回帰式を求め、５０％抑制率(IC₅₀)を算出した。
【０１３０】
６)試験物質 ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳ、ＦＳＦ、ＦＳＲ、ＦＳＤ、ＦＳＭ、ＦＳＳ、ＦＳＡＭＣ、ＦＳＰＡ、ＦＳＰＥＡ、ＦＳＬＰＧ、ＦＳＢＣ、ＦＳＢＣＫ、ＦＳＤＰＧおよびＦＳＴＲを使用した。ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体は種々の濃度にPBS(-)を用いて調製し、０.４５μmのフィルター(ザルトリウス)で濾過した後使用した。陰性対照物質としてPBS(-)を使用した。
【０１３１】
その結果、コラーゲンおよびトロンビン凝集に対してはヘパリンをはじめ、すべての薬物で濃度依存的な凝集抑制作用が観察されたが、そのＩＣ₅₀は薬物によって大きく異なっていた。コラーゲン誘発凝集に対してはＦＳＬＰＧとＦＳＤＰＧがヘパリンの作用を上回る強い抑制作用を示した(表１１)。トロンビン凝集に対してはＦＳＦ、ＦＳＬＰＧ、ＦＳＤＰＧ、ＦＳＢＣおよびＦＳＢＣＫがヘパリンの作用を上回る強い抑制作用を示した(表１２)。以上の結果より、ヘパリンより強い作用を示した誘導体は、いずれもヘパリンに替わる抗凝固剤、DIC治療剤あるいは血小板凝集阻害に基づく腎疾患治療剤としての応用が期待される。
【０１３２】
【表１１】
ラットにおけるコラーゲン(20μg/mL)誘導血小板凝集に対する
HE、MHE-FSおよびMHE-FSのアミド化誘導体に対する５０％抑制濃度

【０１３３】
【表１２】
ラットにおけるトロンビン(0.2単位/mL)誘導血小板凝集に対する
HE、MHE-FSおよびMHE-FSのアミド化誘導体に対する５０％抑制濃度

【０１３４】
今回、スクリーニングに使用したＭＨＥ−ＦＳ誘導体のうち、ベンゼン環の配置をＭＨＥ−ＦＳとの結合部位に最も近くしたＦＳＬＰＧとＦＳＤＰＧは、コラーゲンおよびトロンビンによる血小板凝集をともに強く抑制し、いずれもヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳより強い作用であった。またＦＳＦおよびベンゼン環の配置を若干遠くしたＦＳＢＣおよび最も遠い配置のＦＳＢＣＫは、トロンビン誘発凝集は強く阻害したが、コラーゲン誘発凝集に対してはヘパリンと同程度(ＦＳＦ)か約１/４(ＦＳＢＣ)または１/８(ＦＳＢＣＫ)程度弱い作用であった。これらの事実は、ＭＨＥ−ＦＳに結合させる化合物がベンゼン環とカルボン酸を有することにより、トロンビンによる血小板凝集を強く抑制するようになるが、コラーゲン誘発凝集については、ベンゼン環の配置をＭＨＥ−ＦＳとの結合部位付近に近づけることによって、強い抑制作用を有するようになることを示唆している。
【０１３５】
薬理試験５． ラジカルスカベンジ作用に及ぼす影響
ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体のラジカルスカベンジ作用を検討した。
【０１３６】
腎炎の発症にフリーラジカルの関与が報告されている。特に、抗原抗体複合体が関与する腎炎、尿毒素の一種であるメチルグアニジンが生体に蓄積することに起因する腎炎においてはフリーラジカルの関与が明らかにされている(大柳善彦；活性酸素と病気、化学同人、京都(１９８４)、大柳善彦；ＳＯＤと活性酵素調節剤−その薬理作用と臨床応用−、日本医学館、東京(１９８９)、佐中孜他；腎と透析臨時増刊号、１２２-１２６、東京医学社(１９９４)、青柳一正他；腎と透析臨時増刊号、１２７-１３４、東京医学社(１９９４))。
【０１３７】
１)被験物質
ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳ、ＦＳＦ、ＦＳＲ、ＦＳＤ、ＦＳＭ、ＦＳＳ、ＦＳＡＭＣ、ＦＳＰＡ、ＦＳＰＥＡ、ＦＳＬＰＧ、ＦＳＢＣ、ＦＳＢＣＫ、ＦＳＤＰＧおよびＦＳＴＲを用いた。調製は各々１mg/mLに培地を用いて調製した。
【０１３８】
２)方法
L.M.hiebertとJi-min Liuの方法(L.M.Hiebert and Ji-min Liu : Atherosclerosis, ８３、４７-５１、１９９０)に準じて行った。すなわち、正常ブタ肺動脈血管内皮細胞(ＰＰＡ−ＥＣ)(大日本製薬)、またはヒトさい帯動脈血管内皮細胞(ＨＵＡ−ＥＣ)(ダイアトロン)をタイプＩコラーゲンコーティングフラスコ(７５cm²;ファルコン)で２０％ウシ胎児血清(Bio-whittaker)および細胞増殖添加因子(EGM-２添加因子セット；三光純薬)含有のM１９９アール培地(ギブコ)(２mL)により培養した。３回目の継代時に細胞を１×１０⁵ cells/wellの細胞密度でタイプＩコラーゲンコーティング６穴プレート(ファルコン)に分注し、実験を行った。すなわち被験物質(１mg/mL)を全培地量の１/２０容処置し、その後培地で調製したヒポキサンチン(０.２μM/mL)(シグマ)およびキサンチンオキシダーゼ(４U/mL)(ベーリンガーマンハイム)をいずれも全培地量の１/２０容ずつ加えてフリーラジカルを発生させ放置した。その、２４時間後培地上清を回収し、EDTA-トリプシン(０.０２％-０.２５％=１:１)処理により細胞を回収し、コールターカウンター(コールター社)を用いて生細胞数を計測した。その後被験物質を適用しない細胞(Normal)の平均生細胞数を１００％としてcell viabilityを算出した。
群間の有意性はBartlett法にて分散の均一性を確認した後、Tukey法により検定した。結果を表１３に示した。
【０１３９】
【表１３】
ピポキサンチンおよびキサンチンオキシダーゼ処理による
PPA-ECEに対するHE、MHE-FSおよびMHE-FSのアミド化誘導体の作用

＊＊P<0.01, V.S. PBS.(Tukey's test)
【０１４０】
その結果、ＰＰＡ−ＥＣを用いた検討におけるcell viabilityは被験物質を適用していない細胞と比べ、ＦＳＰＡ以外の被験物質処置細胞において有意(P<０.０１;Tukey's test)に高かった(表１３)。すなわち、ＦＳＰＡ以外の被験物質においてラジカルスカベンジ作用が確認された。
【０１４１】
薬理試験６． in vitroにおけるラットメサンギウム細胞(ＭＣ)および正常ヒトメサンギウム細胞(ＮＨＭＣ)に及ぼす影響
ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体のin vitroにおけるラットメサンギウム細胞(ＭＣ)および正常ヒトメサンギウム細胞(ＮＨＭＣ)増殖抑制作用について検討した。インスリン(Sigma)、L-グルタミン(コスモバイオ)、抗生物質としてAntibiotic-antimycotic(GIBCO)を使用した。試験薬物は３００〜３０００μg/mLの濃度に培地を用いて調製し、０.４５μmフィルターでろ過した後使用した。
【０１４２】
１)ＭＣ増殖抑制作用の検討
ＭＣを２０％FCS含有RPMI１６４０(GIBCO)培養液に加え、６-wellマイクロプレート(FALCON)に４.０×１０⁴cells/well播種し、２４時間培養した。その後０.４％FCS(FCS、Biowhittaker)含有RPMI 1640培養液に置換し、３日間培養した。
さらに、１０％FCS含有RPMI 1640培養液に置換し、各試験物質を全容量の１/１０容添加した。４日後にTrypsin−EDTA液にて細胞をすべてはがし、コールターカウンターを用いて細胞数を測定した。結果を図４Ａに示した。
【０１４３】
２)ＮＨＭＣ増殖抑制作用の検討
ＮＨＭＣ(TaKaRa)を２０％FCS含有ＭsＢＭ培養液(Biowhittaker)に加え、６-wellマイクロプレートに細胞数を３.５×１０⁴cells/well播種し、２４時間培養した。その後０.４％FCS(FCS、Biowhittaker)含有MsBM培養液に置換し、３日間培養した。さらに、１０％FCS含有ＭsＢＭ培養液に置換し、各試験物質を全容量の１/１０容添加した。６日後にTrypsin−EDTA液にて細胞をすべてはがし、コールターカウンターにて細胞数を測定した。結果を図４Ｂに示した。
【０１４４】
ＭＣおよびＮＨＭＣ増殖抑制作用に対する試験物質の評価は、下式に示す抑制率により行った。
抑制率(％)＝
[１−(試験物質処置時の細胞数−０.４％FCS含有培養液添加７又は９日後の細胞数／無処置対照の細胞数−０.４％FCS含有培養液添加７又は９日後の細胞数)]
×１００
【０１４５】
その結果、ヘパリン適用群は３０〜３００μg/mLの用量においてＭＣ増殖を用量依存的に３１.３２〜４６.０５％抑制した。ＦＳＦ、ＦＳＬＰＧおよびＦＳＤＰＧ適用群においては３０〜３００μg/mLの用量においてそれぞれ用量依存的に抑制し、その抑制率はヘパリン適用群と比べてすべての用量において上回った(図４Ａ)。
【０１４６】
また、ヘパリン適用群は５０〜２００μg/mLの用量においてＮＨＭＣ増殖を用量依存的に５７.９３〜７７.２７％抑制した。ＦＳＦおよびＦＳＤＰＧ適用群において、それぞれ用量依存的に増殖抑制が見られた。またＦＳＦ、ＦＳＬＰＧおよびＦＳＤＰＧ各中分子ヘパリン誘導体適用群においてその抑制率はヘパリン適用群と比べて上回るものであった(図４Ｂ)。以上の結果より、今回用いたＦＳＦ、ＦＳＬＰＧおよびＦＳＤＰＧがヘパリンよりも優れた腎メサンギウム細胞増殖抑制作用を有する化合物であることが明らかとなった。
【０１４７】
薬理試験７． in vitro補体活性化抑制作用に及ぼす影響
ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体のin vitroにおける補体活性化抑制作用について検討した。
【０１４８】
感作ヒツジ赤血球(８.５％感作ヒツジ赤血球、デンカ生研、以下ＥＡ)を５×１０⁸ cells/mLの濃度になるようにゼラチンベロナール緩衝液(以下、ＧＶＢ)に浮遊させ、このＥＡ浮遊液２００μLにＧＶＢで溶解・希釈したモルモット補体(乾燥補体、デンカ生研)を加えＧＶＢを用いて全量１.５mLとした。３７℃の恒温槽中で１時間反応させた後、３０００rpmで１０分間遠心分離し、上清のヘモグロビン量をUVIDEC−７７Σ(日本分光)を用いて測定波長５４２nmで測定した。同時に物理的溶血として補体の代わりにＧＶＢを加えたものおよび１００％溶血として補体およびＧＶＢの代わりに純水を加えた検体を作製し、同様の操作を行った後にその上清のヘモグロビン量を測定した。各被験物質の作用の検討は、補体活性化による溶血率が約５０％になる条件で行った。また被験物質の添加量は全容量の１/１００容となるように添加した。各被験物質の補体活性化によるＥＡの溶血に対する阻害率を下記の式により算出した。
【０１４９】
抑制率(％)＝
[１−(各試験物質添加時の溶血率／コントロール(溶媒のみを添加)の溶血率)]
×１００
【０１５０】
ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳ、ＦＳＦ、ＦＳＲ、ＦＳＤ、ＦＳＭ、ＦＳＳ、ＦＳＡＭＣ、ＦＳＰＡ、ＦＳＰＥＡ、ＦＳＬＰＧ、ＦＳＢＣ、ＦＳＢＣＫ、ＦＳＤＰＧおよびＦＳＴＲを使用した。陽性対照薬としてNafamostat mesilate(注射用フサン^ョ、鳥居薬品)を使用した。結果を表１５に示した。
【０１５１】
【表１４】

【０１５２】
補体活性化抑制作用などの抗凝固作用以外のヘパリンの生理活性を臨床に応用する場合、出血傾向などの副作用が問題になってくる。補体活性化抑制作用が強く、かつ出血傾向の少ないＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体を検出するための指標として(ヘパリンがＡＰＴＴを１００秒に延長した用量を１とした時のそれぞれのＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体の用量比)×(ヘパリンの補体活性化抑制作用のＩＣ₅₀を１にした時のそれぞれのＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体のＩＣ₅₀の比の逆数)を算出した。その結果、陽性対照薬として用いたNafamostatのIndex,１５.３０よりも小さい値ではあったが、L-フェニルグリシン(LPG)、フェニルアラニン(F)、D-フェニルグリシン(DPG)、ベンジル-L-システイン(BC)、ベンジロキシカルボニル-L-リジン(BCK)、メチオニン(M)、アスパラギン酸(D)を導入することによってIndexは８.７８〜１.１５となりヘパリンの１より大きな値を示した(表１５)。このことからＦＳＦ、ＦＳＢＣＫ、ＦＳＢＣ、ＦＳＤＰＧ、ＦＳＬＰＧ、ＦＳＭおよびＦＳＤはヘパリンよりも副作用が少なくかつ補体活性化抑制作用が強いことが示唆された。
【０１５３】
今回の結果からＦＳＦ、ＦＳＢＣＫ、ＦＳＢＣ、ＦＳＤＰＧ、ＦＳＬＰＧ、ＦＳＭ、ＦＳＤ、特にＦＳＦは補体の活性化が病態の発症あるいは進展に関与していると考えられている腎炎等の疾患の治療薬としての臨床応用が示唆された。また、ＭＨＥ−ＦＳにベンゼン環およびＯＨ、ＯＣＨ₃、-ＯＣＯＣＨ₃、-ＮＨＣＯＣＨ₃等の電子供与基を有した物質を導入する事によって更に強い補体活性抑制作用が得られると推測される。
【図面の簡単な説明】
【図１】反応時間および試薬量によるヘパリンの推定分子量の時間的変化を示す折線グラフである。
【図２】ヘパリンおよびＭＨＥ−ＦＳのＵＶスペクトルを示す
【図３】ヘパリン誘導体のＰＡＮ腎症ラットに及ぼす影響を示す折線グラフである。*(Ｐ＜０.０５)、**(Ｐ＜０.０１)
【図４】ヘパリン誘導体のin vitroにおけるラットメサンギウム細胞(ＭＣ)(Ａ)および正常ヒトメサンギウム細胞(ＮＨＭＣ)(Ｂ)に及ぼす影響を示す棒グラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a heparin depolymerization method, a novel depolymerized heparin obtained by this depolymerization method, and an amidated derivative thereof. The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising depolymerized heparin and its amidated derivative as active ingredients.
[0002]
[Background Art and Problems to be Solved by the Invention]
Heparin (HE) is a sulfuric acid ester of acidic mucopolysaccharide having an average molecular weight of 15,000 to 20,000, which is mainly present in granules in mast cells. Heparin binds to antithrombin III (hereinafter referred to as ATIII) in plasma, thereby increasing the ability to bind factor Xa and inhibiting factor Xa. In addition, it has strong anticoagulant activity in order to suppress the conversion of prothrombin to thrombin.
[0003]
Therefore, in the current clinical practice, treatment of generalized intravascular blood coagulation syndrome (DIC), various thromboembolism (venous thrombosis, myocardial infarction, pulmonary embolism, cerebral embolism, limb arterial thromboembolism, In addition to the treatment and prevention of postoperative thromboembolism, etc., it is also used to prevent blood coagulation when using extracorporeal circulation devices such as hemodialysis and cardiopulmonary bypass, vascular catheter insertion, blood transfusion, and blood tests. .
[0004]
However, since heparin also has a bleeding-inducing action (anti-IIa action), there is a concern that the bleeding tendency becomes prominent as the blood coagulation time is prolonged. For this reason, attempts have been made to prevent this by means such as local heparinization or reduced heparinization for patients with hemorrhagic lesions and dialysis patients immediately after surgery.
There is a problem in convenience and the like.
[0005]
In recent years, with the development of dialysis therapy, increase in dialysis target patients, and prolonged dialysis therapy, activation of platelet function, thrombocytopenia, neutral lipolysis by promoting release of lipoprotein lipase from the vascular wall, Side effects such as osteoporosis based on affinity with calcium have been reported. Furthermore, since heparin has a blood half-life of about 60 minutes, when administered as an anticoagulant when using an extracorporeal circulation device, there is a problem that an excessive amount of heparin remains in the blood. Moreover, since hemodialysis usually takes 4 to 5 hours, it is necessary to pay attention to the maintenance of an appropriate blood heparin concentration. To prevent heparin from disappearing from the blood, heparin is not replenished during dialysis. There was the complication of having to administer continuously.
[0006]
Protease inhibitors such as gabexate mesilate and nafamostat mesylate are also used to prevent coagulation of perfused blood during extracorporeal blood circulation and to treat DIC, but these drugs are metabolites of guanidine compounds. Causes gastrointestinal disorders. In addition, since the molecular weight is low and dialysis is removed from the dialyzer, blood clotting occurs in the circuit, particularly in the venous drip chamber after the dialyzer.
[0007]
As described above, drugs such as the above-mentioned heparin and nafamostat mesylate may cause serious side effects such as increased bleeding tendency. However, it is indispensable for preventing blood coagulation, especially when using extracorporeal circulation devices such as hemodialysis and cardiopulmonary bypass, and there are no other appropriate drugs to replace. The current situation is that it must be used.
[0008]
In addition to the anticoagulant activity described above, heparin is known to have many physiological activities such as lipoprotein lipase activation, antiplatelet aggregation, blood pressure lowering, anticomplement and cancer metastasis. Yes. However, the bleeding tendency associated with anticoagulant activity was so strong that it could not be used for other than anticoagulant purposes.
[0009]
The biological activity of heparin depends on the following five sugars (formula 1) that form the basis of heparin. In particular, the sulfate group and various biological activities in the basic pentasaccharide structure of heparin have been well investigated. . For example, the following 3-O-sulfate is present only in ATIII-binding five sugars and is essential for binding to ATIII with 3 and 5 N-sulfate and 1 6-O-sulfate. Further, 4 2-O-sulfate and 5 6-O-sulfate are not absolutely necessary for binding to ATIII, but are important for the expression of maximum activity. Ca²⁺The binding activity depends on the N-sulfate group regardless of the presence of O-sulfate, and the anti-cell proliferative activity depends on the molecular size and charge (SO_Four ^2-). Furthermore, the strength of thrombin inhibitory activity in heparin cofactor II is considered to depend on the total amount of bound sulfate regardless of the position of bound sulfate substitution.
[0010]
[Chemical 1]

[0011]
Heparin is a kind of glycosaminoglycan, and consists of D-glucosamine, which is an amino sugar (hexosamine), and D-glucuronic acid or L-iduronic acid, which are uronic acids. Many glucosamine residues are often N-sulfated rather than N-acetylated. Moreover, even in a single heparin chain, the ratio of sulfate groups varies considerably. The repeating unit of heparin is a β (1 → 4) bond, and consists of D-glucosamine bound with D-glucuronic acid (or L-iduronic acid).
[0012]
The sulfate group, uronic acid or hexosamine shown above are important as factors affecting various biological activities of heparin. Among them, the ratio of sulfate group and the position of residual sulfate group are the anticoagulant activity and the suppression of cancer metastasis. Have been reported to be involved in the action (J. Riesenfeld, et al .; J. Biol. Chem., 256, 2389, 1981, U. Lindahl, et al .; J. Biol. Chem., 258, 9826, 1983, T. Irimura, et al .; Biochemistry, 25, 5322, 1986).
[0013]
In recent years, the ratio of the inhibitory activity against blood coagulation factor Xa and the prolongation effect against activated partial thromboplastin time has been applied to low molecular weight heparin, which is a low molecular weight fraction with an average molecular weight of about 5,000 daltons obtained by depolymerization of heparin (anti-Xa (Activity / APTT) has been confirmed, and it is being used as a drug with a relatively low tendency to bleed. To date, dalteparin sodium, a sodium salt of low molecular weight heparin obtained by nitrous acid decomposition of heparin, and sodium parnaparin, a sodium salt of low molecular weight heparin obtained by depolymerization with hydrogen peroxide, are marketed. ing.
[0014]
General characteristics of low molecular weight heparin are as follows: 1) The ratio of antithrombotic action (anti-Xa activity) / bleeding induction action (anti-IIa activity) is high, and the risk of bleeding is low. 2) Long blood half-life (single administration may be used without continuous administration). 3) Little effect on lipid metabolism and platelets. 4) The degree of neutralization by plasma proteins is low. 5) It has various other physiological activities such as high bioavailability upon subcutaneous injection.
[0015]
As a result of earnest research to overcome the side effects peculiar to the heparins without impairing the excellent pharmacological action possessed by heparin or low molecular weight heparin, the present inventors have found that the medium molecule having an average molecular weight of 8,500 to 9,500. It has been found that the heparin fraction and its amino acid derivative have properties in accordance with the purpose (Japanese Patent Application No. 8-36693).
[0016]
In order to obtain fractional heparins such as low molecular weight heparin and medium molecular weight heparin as described above, methods such as 1) extraction from heparin, 2) chemical synthesis, 3) depolymerization (decomposition) of heparin are known. ing. However, the extraction method of 1) is not practical because the production efficiency is poor, and especially the low molecular weight heparin fraction is only a few percent of the total heparin. The chemical synthesis method 2) is also low in yield and high in production cost. Therefore, at present, the method of obtaining fractionated heparin by depolymerization of heparin of 3) has become mainstream.
[0017]
The depolymerization methods for heparin have been known to date such as nitrite decomposition method, peroxide decomposition method and enzyme (heparinase) decomposition method (E. Holmer, ed. By DA Lane, U. Lindahl, Arnold London 1989, 575, CP Dietrich et al .; Academic Press, New York, 1980, 317), after depolymerizing heparin by these methods, fractionated heparin having the desired molecular weight is obtained using means such as filtration chromatography. It is common to prepare.
[0018]
Thus, fractionated heparin can be obtained by depolymerization (decomposition) of heparin, and the pharmacological activity of fractionated heparin is not much between the low molecular weight heparin and heparin due to the sulfate content and basic structure. Although there is no difference (JI Nielsen, et al .; Ostergaard, Acta chir. Scand. Suppl., 543, 52, 1988), the molecular weight, the difference in depolymerization method, and the terminal chemical structure of heparin obtained by depolymerization There are several types of low-molecular-weight heparin on the market.
[0019]
There are various means as described above for the depolymerization method, and the reaction mechanism is also various.
Therefore, even if the purpose of depolymerizing heparin to obtain fractionated heparin is the same, the molecular weight of the fractionated heparin and the terminal structure of the cleaved site differ depending on the reagent and reaction conditions used. In addition, pharmacological activity (antithrombin III affinity, etc.), anticoagulant ability at the time of clinical use, and the like will appear with a large difference.
[0020]
As for the depolymerization reaction of heparin known until now, it is a fact that any means has some disadvantages. That is, in the depolymerization method using nitrous acid (JP-B-63-44764, JP-B-2-31081), the temperature, pH and the like must be accurately controlled, and the reaction is stopped with an alkaline chemical such as sodium acetate. It is necessary to make it. Also, a depolymerized mixture is formed containing a number of contaminants, particularly nitrite and nitrate produced by unreacted nitrous acid. Therefore, an auxiliary step must be added and purified before use in therapy. In the depolymerization method using a peroxide such as hydrogen peroxide (Japanese Patent Publication No. 4-44001), the operation must be heated under a pressure of about 1 to 2 atm using an autoclave, and the operation is extremely dangerous and complicated. is there.
[0021]
In the depolymerization method using an enzyme such as heparinase (JP-B-2-31721), there are problems such as stability of the enzyme and control of the decomposition temperature of the substrate. Although some of these improved methods can be seen, the operations become more complicated and are not suitable for mass production. In any of the methods, it is difficult to freely control the completion of the reaction, resulting in a wide molecular weight distribution, and therefore it is not possible to selectively produce fractionated heparin having the desired molecular weight. It was.
[0022]
Therefore, there is a demand for a depolymerization method that is easy to operate, reacts at room temperature and pressure, and can arbitrarily stop the reaction.Furthermore, the produced fractional heparin has an activity superior to that of heparin. It was necessary to have a substance.
[0023]
As a result of studying an anticoagulant with few side effects such as bleeding tendency and a method for obtaining the same, the present inventors have reduced the side effects of heparin and have a biological activity equivalent to or higher than heparin. In order to obtain molecular heparin and medium molecular heparin derivatives, a novel synthetic method was developed. According to the method of the present invention, the rate of heparin molecular weight reduction can be controlled by the reaction time or the amount of reagent.
[0024]
[Means for Solving the Problems]
A first aspect of the present invention is a method for depolymerizing heparin, wherein a reducing metal and a metal oxide are used.
[0025]
More specifically, heparin is dissolved in a phosphate buffer, a reducing metal and a metal oxide are added thereto, vigorously stirred, and then desalted to efficiently have a specific average molecular weight in a time-dependent manner. Fractionated heparin can be obtained. According to this reaction, depolymerized heparin having a target molecular weight can be obtained in a high yield more efficiently depending on the reaction time.
[0026]
The heparin depolymerization method of the present invention comprises (1) dissolving heparin in a buffer solution of about pH 6 to 8, and then (2) adding a reducing metal and a metal oxide to the solution, and then treating the reaction solution. The process of carrying out. Regardless of the amount of the reagent, the molecular weight decreases with time. For example, the weight ratio of heparin, reducing metal and metal oxide is heparin: reducing metal: metal oxide = 1: 0.01. ~ 1: 0.005-5.
[0027]
Further, after the step (2), the reaction solution is (a) adjusted to about pH 3 to 5.5, (b) a step of adding hexadecyltrimethylammonium bromide, and (c) an ethanol solution of sodium iodide. The step of adding can be included.
[0028]
The second of the present invention is depolymerized heparin obtained by the method of the present invention and exhibiting absorption between 250 nm and 330 nm in the ultraviolet absorption spectrum.
[0029]
The resulting depolymerized heparin has an average molecular weight in the range of about 2,000-13,000 daltons, most of which is molecular heparin during depolymerization of about 5,000-10,000 daltons.
[0030]
The third aspect of the present invention is (1) absorption between 250 nm and 330 nm in the ultraviolet absorption spectrum, (2) 20-40% sulfate group content, (3) 20-45% uronic acid content, (4 ) Depolymerized heparin having a hexosamine content of 10-50%.
[0031]
A fourth aspect of the present invention is a method for producing amidated depolymerized heparin, wherein the obtained depolymerized heparin is amidated using an amine compound. The amine compound used is preferably a primary amine.
[0032]
The amidated depolymerized heparin of the present invention comprises (1) a step of dissolving the depolymerized heparin obtained by the present invention in a buffer solution of about pH 2 to 6, (2) a step of adding an amine compound, (3) 1-ethyl Adding -3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC).
[0033]
Further, after the step (3), (a) a step of adding hexadecyltrimethylammonium bromide, (b) a solution of sodium iodide in ethanol, (c) a step of adding an alkalizing agent, and (d ) Adjusting to about pH 3 to 6.5 can be included in this order.
[0034]
A fifth aspect of the present invention is amidated depolymerized heparin obtained by the method of the present invention and having an average molecular weight of about 2,000 to 18,000 daltons. The majority is molecular heparin during amidation depolymerization of about 5,000 to 15,000 daltons. The amidated depolymerized heparin has (1) a sulfate group content of 20 to 40%, (2) a uronic acid content of 20 to 45%, and (3) a hexosamine content of 5 to 50%.
[0035]
Furthermore, it has also been found that these depolymerized heparin and amidated depolymerized heparin derivatized compounds are useful as pharmaceuticals. In particular, the MHE-FS and MHE-FS derivatives obtained in the examples of the present invention have an average molecular weight of about 7000 to 12000, and thus are not likely to leak from a dialyzer like low molecular weight heparin. In addition, since the bleeding tendency can be reduced without impairing the various physiological activities inherently possessed by heparin, it is effectively used for various diseases that could not be applied due to serious side effects. be able to.
[0036]
That is, the sixth of the present invention is a pharmaceutical composition containing the obtained depolymerized heparin or amidated depolymerized heparin, specifically an anticoagulant, a renal disease therapeutic agent, a platelet aggregation inhibitor, a radical scavenger agent, It is a mesangial cell growth inhibitor or a complement activity inhibitor.
[0037]
Abbreviations of heparin or amidated heparin derivatives used in the present specification are shown below.
HE: Heparin
FS or -FS: Prefix or suffix indicating the novel heparin or amidated heparin derivative obtained in the present invention
MHE-FS: Medium molecular heparin
FSF: Medium molecular heparinylphenylalanine
FSR: Medium molecular heparinyl arginine
FSD: Medium molecular heparinyl aspartic acid
FSM: Medium molecular heparinyl methionine
FSS: Medium molecular heparinylserine
FSBC: medium molecular heparinylbenzyl-L-cysteine
FSMC: medium molecular heparinyl-2-amino-4-methylthiophene-3
-carboxylic acid
FSBCK: Medium molecular heparinyl benzyloxycarbonyl-L-lysine
FSPA: Medium molecular heparinyl-L-phenylalaninol
FSPEA: Medium molecular heparinyl-R-phenylethylamine
FSLPG: Medium molecular heparinyl-L-phenylglycine
FSDPG: Medium molecular heparinyl-D-phenylglycine
FSTR: Medium molecular heparinyl taurine
[0038]
Preferred amidated depolymerized heparin derivatives as anticoagulants are FSMCC, FSBCK, FSPA, FSLPG, FSPEA and FSDPG.
[0039]
Preferred amidated depolymerized heparin derivatives as therapeutic agents for renal diseases are FSF, FSDPG and FSLPG.
[0040]
Preferred amidated depolymerized heparin derivatives as platelet aggregation inhibitors are FSF, FSBC, FSBCK, FSDPG and FSLPG.
[0041]
Preferred amidated depolymerized heparin derivatives as radical scavenger agents are FSF, FSR, FSD, FSM, FSS, FSBC, FSAMC, FSBCK, FSPA, FSPEA, FSLPG, FSDPG and FSTR.
[0042]
Preferred amidated depolymerized heparin derivatives as mesangial cell growth inhibitors are FSF, FSLPG and FSDPG.
[0043]
Preferred amidated depolymerized heparin derivatives as complement activity inhibitors are FSF, FSBCK, FSBC, FSM, FSTR, FSD, FSLPG and FSDPG.
[0044]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the heparin depolymerization method of the present invention, heparin is dissolved in a phosphate buffer (pH = 7.2), and reduced metal (eg, iron, copper powder, etc.) and metal oxide (eg, for column chromatography) Depolymerized heparin having a specific average molecular weight can be efficiently obtained over time by adding silica gel or the like and stirring vigorously, followed by desalting.
[0045]
Examples of the reducing metal are not particularly limited as long as they have a reducing action, but copper, iron, zinc, magnesium, tin, aluminum and the like are preferably used.
The metal is preferably used in the form of powder in order to increase the surface area. These metals are used alone or as a mixture. More preferred are copper and iron or a salt thereof, and most preferred is iron or a salt thereof.
[0046]
Examples of the metal oxide used in the depolymerization method of the present invention include silicon oxide (including silicon dioxide), zinc oxide, aluminum oxide, antimony oxide, sulfur oxide, uranium oxide, osmium oxide, cadmium oxide, calcium oxide, Gold oxide, silver oxide, chromium oxide, germanium oxide, cobalt oxide, zirconium oxide, mercury oxide, tin oxide, strontium oxide, selenium oxide, tungsten oxide, tantalum oxide, titanium oxide, iron oxide, tellurium oxide, copper oxide, thorium oxide , Lead oxide, niobium oxide, nickel oxide, platinum oxide, vanadium oxide, barium oxide, bismuth oxide, arsenic oxide, beryllium oxide, boron oxide, magnesium oxide, manganese oxide, molybdenum oxide, iodine oxide, lithium oxide, phosphorus oxide, oxide Ruthenium, rhenium oxide, para oxide Um or the like is preferably used. Silicon oxide is particularly preferred, and silica gel commercially available as a column chromatography filler can be used as this silicon oxide.
[0047]
Synthesis of amidated derivatives of molecular heparin during depolymerization.
Furthermore, depolymerized heparin obtained by the production method of the present invention is amidated to synthesize an amidated derivative. A novel medium molecular heparin (hereinafter referred to as MHE-FS) obtained by depolymerization can be derivatized to synthesize an amidated derivative of MHE-FS. That is, the reaction is carried out by adding 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) under acidic conditions to MHE-FS and various derivatized ester reagents. After completion of the reaction, a quaternary ammonium salt is obtained and further hydrolyzed under alkaline conditions to synthesize various desired amidated derivatives of MHE-FS.
[0048]
[Chemical 2]

[0049]
Moreover, as an amine compound, a primary amine compound and a secondary amine compound can be mentioned, for example, regardless of a synthetic product and a natural product. The primary amine compound is not particularly limited as long as it is a compound having an amino group. Examples of the primary amine compound and the secondary amine compound include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, serine, threonine, cysteine, methionine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine, lysine, arginine, Α-amino acids such as histidine, tryptophan and proline or derivatives thereof are preferably used. These amino acids may be D-form, L-form or DL-form.
[0050]
Specifically used primary amine compounds are L-phenylalanine methyl ester hydrochloride, L-aspartic acid dimethyl ester hydrochloride, L-methionine methyl ester hydrochloride, L-serine methyl ester hydrochloride, L-arginine methyl ester Dihydrochloride, 2-amino-4-methylthiophene-3-ethyl ester, L-phenylalaninol, R-(+)-phenylethylamine, L-2-phenylglycine methyl ester monohydrochloride, S-benzyl-L -Cysteine, N-benzyloxycarbonyl-L-lysine, D-2-phenylglycine methyl ester monohydrochloride, or aminoethanesulfonic acid.
[0051]
Using the above primary amine, medium molecular heparinyl phenylalanine (hereinafter referred to as FSF), medium molecular heparinyl aspartic acid (hereinafter referred to as FSD), medium molecular heparinyl methionine (hereinafter referred to as FSM), Medium molecular heparinyl serine (hereinafter referred to as FSS), medium molecular heparinyl arginine (hereinafter referred to as FSR), medium molecular heparinyl-2-amino-4-methylthiophene-3-carboxylic acid (hereinafter referred to as FSAMC), Molecular heparinyl-L-phenylalaninol (hereinafter referred to as FSPA), medium molecular heparinyl-R-phenylethylamine (hereinafter referred to as FSPEA), medium molecular heparinyl-L-phenylglycine (hereinafter referred to as FSLPG), medium molecule Heparinylbenzyl-L-cysteine (hereinafter referred to as FSBC), medium molecular heparinylbenzyloxycarbonyl-L-lysine (hereinafter referred to as FSBCK) Thus, medium molecular heparinyl taurine (hereinafter referred to as FSTR) and medium molecular heparinyl-D-phenylglycine (hereinafter referred to as FSDPG) are obtained. These amidated derivatives of medium molecular heparin are novel compounds.
[0052]
The sulfate group and various biological activities in the basic pentasaccharide structure of heparin are as described above, but the bound sulfate group content can be changed.
[0053]
1. Method for increasing sulfate group content
Although it is appropriately changed depending on the ratio of increasing the sulfate group content, a general method is shown below. First, 20 mL of 95% sulfuric acid and 10 mL of chlorosulfonic acid are added to about 100 mg of MHE-FS or amidated derivative of MHE-FS at −4 ° C. Next, after stirring for an appropriate time, for example, about 1 hour, the mixture is returned to room temperature and further stirred for about 1 hour. Thereafter, 50 mL of cold diethyl ether at −4 ° C. is added, and the precipitate is collected by filtration. The precipitate is dissolved in purified water and neutralized with 0.5N NaOH. After desalting, concentration under reduced pressure can be performed to obtain an amidated derivative of sulfate-increased MHE-FS or MHE-FS.
[0054]
2. Method for reducing sulfate group content
The method is appropriately changed depending on the ratio of decreasing the sulfate group content, but the following is a general method. First, about 3 g of amidated derivative of MHE-FS or MHE-FS is dissolved in 25 mL of purified water. The lysate is applied to a Dowex 50W-X8 (H +, 20-50 mesh) column. Combine the column eluate and the washing solution, add pyridine under cooling to adjust the pH to 5.5 to 6.0, and then concentrate. Methanol (10 mL of methanol to 0.9 g of the pyridinium salt) is added to the pyridinium salt of the obtained MHE-FS or amidated derivative of MHE-FS, and the whole is moistened. Next, 60 mL of DMSO is added with stirring and completely dissolved, and then 30 mL of dioxane is added. The solution is heated to 90 ° C. in a glass pressure vessel. After 24 hours, return to room temperature and open. Further, dioxane-DMSO-methanol (3: 6: 1 v / v) of pyridine hydrochloride (2 g of pyridine was mixed with 8 mL of purified water, 7.5 mL of 3N HCl was added little by little with stirring, and then concentrated and dried). Add 4 mL of solution, reseal and heat to 90 ° C. for 36 hours. After completion of the reaction, 300 mL of purified water was added, and the pH was adjusted to 9 to 9.5 with 1N NaOH, followed by recrystallization (ethanol) and drying, thereby reducing the sulfate group-reducing MHE-FS or MHE-FS amide. Can be obtained.
[0055]
The depolymerized heparin and the amidated depolymerized heparin derivative obtained by the depolymerization method of the present invention can be formulated by an ordinary method and administered as an injection or an oral preparation. In addition, depolymerized heparin and amidated depolymerized heparin derivatives generally exhibit physiological activity or pharmacological activity substantially equivalent to the free form in vivo, for example, derivatives of the compounds of the present invention and pharmaceutically acceptable products. Salts, addition salts, hydrates and the like are included in the technical scope of the present invention. In addition, for example, it is administered by the following administration method, and the dose or administration rate is usually determined by measuring the whole blood clotting time or whole blood activated partial thromboplastin time after administration of this drug, and , Determined by the application area or purpose of use.
[0056]
For example, in the intravenous infusion method, the amount corresponding to 5000 to 50000 heparin units of depolymerized heparin and amidated depolymerized heparin derivative is diluted with 1000 mL of 5% glucose injection solution, physiological saline or Ringer's solution, and 20 to 20 minutes per minute. Instilled intravenously at a rate of around 30 drops. Further, in the intravenous intermittent injection method, an amount corresponding to 2000 to 50000 heparin units of depolymerized heparin and amidated depolymerized heparin derivative is injected intravenously every 4 to 8 hours. In the subcutaneous injection / intramuscular injection method, a depolymerized heparin and an amidated depolymerized heparin derivative corresponding to 2000 to 10000 heparin units are injected every 4 hours. Furthermore, a single administration can be performed once to several times a day.
[0057]
For use in extracorporeal circulation (hemodialysis / cardiopulmonary bypass), the appropriate amount for each patient is calculated based on the results of a heparin sensitivity test prior to dialysis. Prior to initiation, doses of depolymerized heparin and amidated depolymerized heparin derivatives corresponding to 1000-3000 heparin units are administered, and an amount corresponding to 500-1500 heparin units per hour is intermittently added after the start of dialysis. . In the case of the local heparinization method, an amount corresponding to 1500 to 2500 heparin units per hour is continuously infused. During cardiopulmonary perfusion, although it depends on the method and method, an amount corresponding to 150 to 300 heparin units / kg is usually administered, and additional administration is appropriately performed according to the extension of the extracorporeal circulation time. In particular, the amidated derivatives of MHE-FS and MHE-FS obtained in the examples have an average molecular weight of about 7000 to 12000, and thus are not likely to leak from a dialyzer like low molecular weight heparin.
[0058]
In the case of oral administration, an amount of depolymerized heparin and an amidated depolymerized heparin derivative corresponding to 500 to 2000 heparin units / g are taken once to several times a day. In the case of an external preparation, it is used as an ointment of depolymerized heparin and an amidated depolymerized heparin derivative in an amount corresponding to 100 to 500 heparin units / g, and an appropriate amount is applied once or several times a day or applied to gauze or the like. . In the case of suppositories, depolymerized heparin and amidated depolymerized heparin derivatives in an amount corresponding to 1000-4000 heparin units / g are applied to the anus or vagina once or twice a day.
[0059]
【Example】
Example 1 Examination of depolymerization conditions of HE (heparin)
50 mg of heparin (Scientific Protein Laboratories) is weighed and dissolved in 4 mL (pH 7.2) of 0.25M phosphate buffer, and 20 or 40 mg of iron powder (Fe) (Wako Pure Chemical Industries) and Wakogel (silica gel) are dissolved. ) (SiO₂) 12.5, 25, 50 or 100 mg (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and the mixture was tightly sealed at room temperature and stirred vigorously. After 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 and 6 hours, the reaction product was filtered and subjected to HPLC, and the change in the estimated molecular weight of heparin over time was measured. The results are shown in FIG.
[0060]
Regardless of the amount of reagent, heparin was depolymerized over time regardless of the amount of reagent, and the molecular weight was decreased to an average molecular weight of 4,000 to 5,000 after 6 hours of reaction.
[0061]
For confirmation of molecular weight fractionation by liquid chromatography (HPLC), MHE-FS was dissolved in distilled water, and molecular weight fractionation was performed under the following conditions. Detector: RID-10A (manufactured by Shimadzu Corporation), light scattering detector: mini dawn (Wyatt technology), column: Shodex OH pak SB-5003 (manufactured by Showa Denko), guard column: Shodex OH pak SB-5000G (Showa Denko) Made). Standards include polyethylene glycol 10,000 (Mw. Av. = 10,000, ALDRICH), # 6,000 (Mw. Av. = 8,500, Tokyo Kasei), # 4,000 (Mw. Av. = 3) (1,000, Tokyo Kasei) and # 1,540, (Mw = 1,450, Kanto Chemical) were used to prepare a calibration curve and confirm the molecular weight fraction.
[0062]
From the above results, it became clear that heparin having a specific molecular weight can be synthesized by adjusting the reaction time and the amount of reagents, and this time, the reaction proceeds relatively stably among these methods. Method using reagent (heparin: Fe: SiO₂= 5: 2: 1.25) and a large amount of MHE-FS (medium molecular heparin) was synthesized.
[0063]
Example 2 Synthesis of MHE-FS (medium molecular heparin) under optimal conditions
Heparin (1.0 g) was dissolved in 0.25 M phosphate buffer (80 mL, pH = 7.2), and iron powder (400 mg) and Wakogel (250 mg) were added thereto. After 4 hours, the reaction product was filtered through Celite (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), the filtrate was adjusted to pH = 4.5 with acetic acid, and 5% hexadecyltrimethylammonium bromide aqueous solution was not precipitated with ammonium salt. Added up to. Next, the precipitate was completely separated by centrifugation, 5% sodium iodide solution in ethanol (50 mL) was added to the precipitate, and the mixture was stirred for 1 hour and filtered. The precipitate was recrystallized from ethanol and crude MHE-FS. Got. This was dissolved in distilled water and subjected to HPLC, and fractions having a molecular weight of 5,000 to 10,000 were collected. After concentration under reduced pressure, recrystallization from ethanol gave MHE-FS (720 mg). As a result, the target MHE-FS (medium molecular heparin) was synthesized with a yield of about 70%.
[0064]
Example 3 Instrumental analysis of MHE-FS
Infrared absorption (IR) spectrum was measured using a Fourier transform infrared spectrometer FTIR-8200PC type (manufactured by Shimadzu Corporation). Samples were prepared by the KBr tablet method. That is, about 3 mg of heparin and MHE-FS were weighed, about 100 mg of KBr was mixed, pellets were prepared with a handy press, and IR spectra were measured.
[0065]
The ultraviolet absorption (UV) spectrum was measured using a self-recording spectrophotometer UV-240 (manufactured by Shimadzu Corporation). 1 mg of heparin and MHE-FS were weighed and adjusted to a concentration of 1 mg / mL with distilled water, and the UV spectrum was measured.
[0066]
Heparin and MHE-FS using D Varian XL-200 (200MHz)₂Dissolved in O,¹1 H NMR spectrum was measured.
[0067]
As a result, the IR and NMR spectra of MHE-FS were almost the same as heparin, but the UV spectrum showed a maximum absorption at 290 nm (FIG. 2).
[0068]
Example 4 Method for synthesizing amidated derivative of MHE-FS
The following reagents were used for the synthesis of amidated derivatives (the abbreviations in the parentheses indicate abbreviations when converted to amidated derivatives).
[0069]
[Chemical Formula 3]

[0070]
Specifically, L-arginine methyl ester dihydrochloride (SIGMA), L-aspartic acid dimethyl ester hydrochloride (SIGMA), L-methionine methyl ester hydrochloride (SIGMA), L-phenylalanine methyl ester hydrochloride (Aldrich) , L-Serine methyl ester hydrochloride (Hasui Tesque), 2-amino-4-methylthiophene-3-ethyl ester (Lancaster), L-phenylalaninol (Tokyo Kasei), R-(+)-phenylethylamine (Tokyo) Kasei), L-2-phenylglycine methyl ester monohydrochloride (Aldrich), D-2-phenylglycine methyl ester monohydrochloride (Aldrich), aminoethanesulfonic acid (taurine) (Wako Pure Chemicals), N-benzyloxy Carbonyl-L-lysine (Lancaster) and S-benzyl-L-cysteine (Lancaster).
[0071]
Synthesis of parinylphenylalanine (FSF) to medium molecule
An aqueous solution of 900 mg of L-phenylalanine methyl ester hydrochloride 900 mg, 700 mg of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) (Hemi Tesque) at pH = 4.75 in 15 mL of an aqueous solution of 560 mg of MHE-FS. After gradually adding 1 mL and stirring for 4 hours, a small amount of water and a 5% aqueous solution of hexadecyltrimethylammonium bromide (Hanai Tesque) were added until no ammonium salt precipitate formed. Next, this precipitate is completely separated by centrifugation, 50 mL of 5% sodium iodide (Hasui Tesque) ethanol solution is added to the precipitate, stirred for 1 hour, filtered, and the precipitate is recrystallized with ethanol. As a result, white powdered heparinylphenylalanine methyl ester was obtained. Next, 10 mL of a 0.1 mol / L sodium hydroxide solution was added to the compound, and the mixture was stirred at 0 to 5 ° C. under nitrogen pressure for 2 days. After the reaction, acetic acid was added to the reaction solution to adjust to pH = 5, followed by filtration. Ethanol was added to the filtrate, and 380 mg of parinylphenylalanine (hereinafter referred to as FSF) was obtained in a yield of 68% to the middle molecule of the white powder. It was.
[0072]
In the same manner as the FSF synthesis method described above, various amidated derivatives of MHE-FS were used in the same manner as in the above FSF synthesis method. And FSTR were synthesized. The synthesis yield of each derivative is shown in Table 1.
[0073]
[Table 1]
Yield of amidated derivatives of MHE-FS

[0074]
Example 5 Instrumental Analysis of Heparin, MHE-FS and MHE-FS Amidated Derivatives Infrared absorption (IR) spectra were measured using a Fourier transform infrared spectrometer FTIR-8200PC. Samples were prepared by the KBr tablet method. That is, about 3 mg of heparin and MHE-FS were weighed, about 100 mg of KBr was mixed, and pellets were produced with a handy press. And the IR spectrum was measured on condition of the following.
[0075]
The ultraviolet absorption (UV) spectrum was measured using a self-recording spectrophotometer UV-240 (manufactured by Shimadzu Corporation). 1 mg of various medium molecular weight heparins were weighed and prepared with distilled water to a concentration of 0.5 mg / mL, and UV spectra were measured.
[0076]
Using Varian XL-200 (200MHz), heparin and a new medium molecular heparin₂Dissolved in O,¹H NMR spectra were measured,
[0077]
The results of IR and UV spectra of each derivative are shown in Table 2.
[Table 2]
IR and UV spectral data for HE, MHE-FS and amidated derivatives of MHE-FS

[0078]
Example 6 Measurement of absolute molecular weight of amidated derivative of MHE-FS
A physiologically active substance having a complicated structure such as heparin is considered to exhibit various activities from the viewpoint of molecular weight distribution, molecular size, affinity with receptors, and the like. Until now, when measuring the molecular weight of low molecular weight heparin, a calibration curve was created using the molecular weight standard, and the relative molecular weight was obtained, so the accuracy was dependent on the quality of the standard. In addition, the molecular weight of each standard was determined using intrinsic viscosity, ultracentrifugation, etc., and therefore the molecular weight distribution of low molecular weight heparin at each company differed greatly. This time, the SEC / MALLS method (James, E. Knobloch et al .; Anal. Biochem., 245, 231-241, 1997) was used to measure the absolute molecular weight, and heparin, the medium molecular heparin obtained in the present invention, and each 13 kinds of medium molecular heparin derivatives FSF, FSD, FSM, FSS, FSR, FSAMC, FSPA, FSPEA, FSLPG, FSBC, FSBCK, FSTR and FSDPG were analyzed by molecular exclusion chromatography using a multi-angle light scattering detector ( (SEC / MALLS) and the difference between heparin and dalteparin (Kissei Pharmaceutical, Fragmin Injection, Lot No 7047AH) was examined. In addition, the accuracy of absolute molecular weight was confirmed using pullulan P-10 (manufactured by Showa Denko, Mw. Av. = 11,800), which is monodispersed and has a clear molecular weight, as a standard substance for this experiment. As a result, pullulan was monodispersed and the average molecular weight was 11,760.
Heparin, MHE-FS, dalteparin and amidated derivatives of MHE-FS were weighed in 2.5-3 mg and prepared to a concentration of 25 mg / mL. This was injected into HPLC, and the molecular weight was measured by the SEC / MALLS method. The analysis was performed under the following conditions. Detector: RID-10A (manufactured by Shimadzu Corporation), light scattering detector: mini dawn (Wyatt technology), column: Shodex OH pak SB-803HQ (manufactured by Showa Denko), guard column: Shodex OH pak SB-G (Showa Denko) Made). The same method was used for the standard. The obtained data was analyzed using the analysis software ASTRA, and the average absolute molecular weight of each was determined.
[0079]
The measurement results of the molecular weights of heparin, MHE-FS and amidated derivatives of MHE-FS by the SEC / MALLS method are shown in Table 3 (Mw: absolute molecular weight (weight molecular weight), Mn: number average molecular weight). That is, the average molecular weight of the heparin used this time was 14,170, and the average molecular weight of MHE-FS synthesized from this heparin was 8,327. The average molecular weight of dalteparin was 6,635, which was significantly different from MHE-FS. If Mw / Mn is 1, monodispersion is shown, and polydispersity is shown as it becomes larger than 1. The measurement results are shown in Table 3.
[0080]
[Table 3]
SEC / MALLS analysis of HE, MHE-FS and amidated derivatives of MHE-FS

[0081]
Example 7 Measurement of sulfate group
The ratio of sulfate groups contained in the synthesized amidated derivatives of MHE-FS and MHE-FS was measured. As a standard solution, ammonium sulfate 0, 5, 10, 25, 50, 75, 100 μmol / mL (Wako Pure Chemical Industries) dissolved in distilled water was used.
[0082]
In order to obtain the sulfate group content in heparin, MHE-FS and amidated derivatives of MHE-FS, a calibration curve was prepared with ammonium sulfate concentration on the X axis and absorbance (500 nm) on the Y axis.
[0083]
About 1 mg of heparin was prepared with 1 mol / L hydrochloric acid to a concentration of 1 mg / 2 mL, hydrolyzed for 1, 3, 5 and 6 hours, and the sulfuric acid content was measured.
[0084]
The content of sulfate groups in heparin, MHE-FS and amidated derivatives of MHE-FS was measured based on the method of K.S. Dodgson et al. (K. S. Dodgson, et al .; Biochem. J., 84, 106, 1962). About 5 mg of heparin, MHE-FS and amidated derivatives of MHE-FS were weighed and adjusted to a concentration of 10 mg / mL with 1 mol / L hydrochloric acid. Next, 100 μL of this solution was transferred to a test tube with a stopper, and hydrolyzed in a boiling water bath in a draft for 5 hours. After hydrolysis, the mixture was concentrated under reduced pressure, and 4.5 mL of 0.1 mol / L hydrochloric acid was added thereto to dissolve the precipitate well, followed by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes. About 100 μL of each standard solution was collected in a test tube with a stopper, and 4.4 mL of 0.1 mol / L hydrochloric acid was added. Next, the standard solution and the sample solution (centrifugation supernatant) are sampled in 2 mL aliquots (for the blank test and for the main test) separately. For the blank test, the gelatin solution (0.5 g of gelatin (DIFCO)) is collected. 100 mL of distilled water was added, dissolved in a hot water bath (60-70 ° C.) and left overnight at 4 ° C.) In this test, a gelatin-barium chloride solution (0.5 g of chloride in 50 mL of the gelatin solution shown on the left) was used. Add 0.25 mL of barium (anhydrous) (Wako Pure Chemical) and stir for 4 hours or more), mix well, let stand at room temperature for 20 minutes, and then use UVIDEC 77Σ (JASCO) within 500 hours using UVIDEC 77Σ. Absorbance was measured at. The results are shown in Table 4.
[0085]
[Table 4]
Sulfate content of amidated derivatives of HE, MHE-FS and MHE-FS

[0086]
The proportions of sulfate groups in heparin and MHE-FS were 31.75% and 34.52%, respectively, whereas that of the amidated derivative of MHE-FS was 23.51 to 1.80%. Therefore, since the proportion of sulfate groups of the amidated derivative of MHE-FS is lower than that of heparin and MHE-FS, the anticoagulant activity of heparin is reduced by amidating the derivative of MHE-FS. It is thought that it was done.
[0087]
Example 8 Measurement of uronic acid content
The uronic acids (L-iduronic acid and D-glucuronic acid) contained in the synthesized MHE-FS and amidated derivatives of MHE-FS were measured. As a standard solution, sodium glucuronate 0, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5 mg / mL (Wako Pure Chemicals, Lot No ECK4854) dissolved in distilled water was used.
[0088]
In order to determine the content of uronic acid in the amidated derivatives of heparin, MHE-FS and MHE-FS, a calibration curve was prepared with the concentration of sodium glucuronate on the X axis and the absorbance at 530 nm on the Y axis.
[0089]
The uronic acid content of heparin, MHE-FS and amidated derivatives of MHE-FS was measured using the method of T. Bitter et al. (T. Bitter, et al .; Anal. Biochem., 4, 330, 1962). Heparin, MHE-FS and amidated derivatives of MHE-FS were weighed and prepared with distilled water to a concentration of 1 mg / mL, and then 200 μL of each sample, blank (distilled water) and standard substance were stoppered. The sample was collected in a test tube. Next, ice-cooled sodium tetraborate sulfate solution (0.95 g of sodium tetraborate decahydrate (Wako Pure Chemicals, Lot No ACN3456)) ice-cooled concentrated sulfuric acid 100 mL (Kishida, Lot) 3.0 mL dissolved in No ES60424H) was dropped into a test tube containing the sample, and a carbazole solution (carbazole 12.5 mg (Wako Pure Chemicals, Lot No CAJ0034) dissolved in absolute ethanol 10 mL) was added. 100 μL was added. After thorough mixing, the mixture was heated in a boiling water bath for 20 minutes, cooled to room temperature, and the absorbance (530 nm) was measured using a Shimadzu autograph spectrophotometer UV-240. The results are shown in Table 5.
[0090]
[Table 5]
Uronic acid content of amidated derivatives of HE, MHE-FS and MHE-FS

[0091]
As for the content of uronic acid (L-iduronic acid and D-glucuronic acid), FSDPG contained the largest amount of 43.43%, and the others contained 28-40% uronic acid.
[0092]
Example 9 Analysis of amino sugar (hexosamine) content
In general, hexosamine is considered to be very important as a factor that affects various biological activities of heparin as well as sulfate group and uronic acid. On the other hand, for the measurement of hexosamine, a colorimetric analysis method has been mainly used until now, but it was difficult to analyze in a trace amount. This time, we measured the hexosamine content using a trace amount of amidated derivatives of MHE-FS and MHE-FS, utilizing the fact that hexosamine is an amino sugar and is colored by the ninhydrin reaction.
[0093]
As the standard solution, D-(+)-glucosamine hydrochloride (Wako Pure Chemicals, Lot No TPH6525) 0, 10, 100, 1000 μg / mL dissolved in 0.02 mol / L hydrochloric acid was used.
Moreover, the Hitachi high-speed amino acid analyzer type L-8500 was used for the measurement, and it measured by the amino acid chromatograph method. The analysis conditions are as follows. Injection volume: 30 μL, column: Hitachi custom ion exchange resin # 2622 filled in a stainless steel tube with an inner diameter of 4.6 mm and a length of 60 mm, buffer solution (Table 6): B1, B2, B3, B4 and B5, reaction solution : Ninhydrin reagent solution L-8500 set manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Chemical reaction tank temperature: 135 ° C, Detector: Visible part absorptiometer (measurement wavelength: 440 nm and 570 nm).
[0094]
[Table 6]
Buffer for amino acid analyzer

[0095]
1) Wako Pure Chemical Industries ninhydrin reagent L-8500 set.
Equivalent amount of ninhydrin solution (containing 0.22 mol of ninhydrin, sodium borohydride and propylene glycol monomethyl ether in 1 L) and buffer solution (containing 2.0 mol of lithium acetate dihydrate and propylene glycol monomethyl ether in 1 L) Mixed liquid.
2) Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride buffer with pH 9.0 60.57 mg of tris (hydroxymethyl) aminomethane was dissolved in 32.5 mL of diluted hydrochloric acid, and water was added to make 1000 mL.
3) 0.1 M Ditoleitol Test Solution 77 mg of Ditoleitol is dissolved in Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride buffer solution at pH 9.0 to make 5 mL.
4) Acid ninhydrin reagent
Dissolve 2.5 g of ninhydrin in glacial acetic acid and add 40 mL of hydrochloric acid. Prepared before use.
5) Citric acid reagent
Weigh 24.2 g of citric acid monohydrate and make up to 1000 mL with water.
[0096]
About 100 μg each of heparin, amidated derivatives of MHE-FS and MHE-FS was weighed into a sample test tube, and the test tube was placed in a reaction vial and dried under reduced pressure. Next, 100 μL of 6 mol / L hydrochloric acid (containing 1% phenol) for hydrolysis was placed at the bottom of the reaction vial, and the reaction vial was purged with nitrogen under reduced pressure, followed by hydrolysis at 105 ° C. for 18 hours. After drying, the test tube was taken out, 100 μL of 0.02 mol / L hydrochloric acid was added and mixed well, filtered through a filter, and the filtrate was used as a sample solution. The sample solution was measured for the content of hexosamine in each derivative using an amino acid analyzer. The results are shown in Table 7.
[0097]
[Table 7]
Hexosamine content of amidated derivatives of HE, MHE-FS and MHE-FS

[0098]
Heparin had a hexosamine content of about 14% and a MHE-FS of about 15%. In addition, it was about 13 to 40% for the amidated derivative of MHE-FS. FSDPG showed a high value of 40%.
[0099]
Example 10 Elemental analysis
The components of heparin are uronic acid, amino sugar and sulfuric acid. These components are composed of five kinds of elements C, H, O, N, and S, and it is considered that the ratio of these elements may affect the medicinal properties of heparin. Therefore, for the amidated derivative of MHE-FS synthesized this time, the content of each element contained in one molecule was determined by elemental analysis. As the element analyzer, CHN CORDER (manufactured by Yanagimoto) was used.
[0100]
About 3 mg / vial of heparin and amidated derivatives of MHE-FS were weighed and then thoroughly dried, and the content of each element (C, H, N, O or S) was measured by a combustion method. The results are shown in Table 8.
[0101]
[Table 8]
Elemental analysis of HE and MHE-FS amidated derivatives

[0102]
The derivatives synthesized this time have a sulfur content (S) of 7.84 to 9.72%, an oxygen content (O) of 52.48 to 57.96%, a heparin sulfur content (10.58%) and an oxygen content ( 61.25%), but the hydrogen content (H), carbon content (C) and nitrogen content (N) increased.
[0103]
Example 11 Anticoagulant
MHE-FS 5000 Low molecular weight heparin international unit (anti-factor Xa activity) physiological saline appropriate amount
The pH was adjusted to 5.0-7.5 and the total volume was 5 mL. The obtained anticoagulant had an osmotic pressure ratio of about 1 (ratio of physiological saline).
[0104]
Example 12 Anticoagulant
It was prepared in the same manner as in Example 11 except that FSLPG was used instead of MHE-FS. The obtained anticoagulant had an osmotic pressure ratio of about 1 (ratio of physiological saline).
[0105]
Pharmacological test
Pharmacological test Effect on blood coagulation system in vitro
The effects of MHE-FS and amidated derivatives of MHE-FS on the blood coagulation system in vitro were examined. That is, in order to investigate the APTT prolongation action and anti-Xa activity of heparin, MHE-FS and amidated derivatives of MHE-FS, human normal plasma (Coagulation Control Plasma (Normal) Level 1: manufactured by Pacific Hemostasis) was used, The items were measured.
[0106]
1) Measurement of activated partial thromboplastin time (APTT)
For the APTT measurement, APTT-Test Wako (APTT-P reagent, Kephalin) (Wako Pure Chemical Industries), Amelung-Coagulometer, and Decabet (MC Medical) were used. Test plasma was prepared by adding 1 volume of heparin, MHE-FS and amidated derivatives of MHE-FS or PBS (−) (control) to 9 volumes of normal human plasma, and 100 μL of activated partial thromboplastin reagent to 100 μL of these test plasmas. After heating at 37 ° C. for 3 minutes, 100 μL of calcium chloride solution was added, and the time until coagulation was measured using an automatic blood coagulation time measuring device Amelung-Coagulometer.
[0107]
2) Measurement of anti-Xa activity
Test Team R Heparin S (Daiichi Kagaku) was used for anti-Xa activity measurement. 2 volumes of normal human plasma, amidated derivatives of heparin, MHE-FS and MHE-FS or buffer (50 mM 2-amino-2-hydroxyl-1, 3-propanediol, pH 8.4) (control) 2 volumes and buffer The test plasma was prepared by adding 6 volumes of the solution, and 100 μL of the test plasma was heated at 37 ° C. for 5 minutes, and then 50 μL of bovine-derived Xa test solution (7.1 nkat / mL) was added. Further, after heating for 30 seconds, 100 μL of a pre-warmed substrate solution (N-benzoyl-L-isoleucil-L-glutamyl-glycyl-L-arginyl-p-nitroanilide / hydrochloride) was added for 3 minutes. After continuing the heating, 950 μL of a reaction stop solution (10% acetic acid) was added, and the remaining factor Xa was measured at an absorbance of 405 nm. The measurement results are shown in Table 9.
[0108]
[Table 9]
Anti-Xa / APTT activity of HE, MHE-FS and amidated derivatives of MHE-FS

*: Concentration that extends APTT to 100 seconds
[0109]
In Table 9, when the prolongation effect of APTT is expressed as a heparin ratio, the greater the value, the more the bleeding tendency is reduced than heparin. For example, in MHE-FS, it is reduced about twice. Further, when the anti-Xa activity is expressed by a 1 / heparin ratio, the greater this value is, the better the anti-Xa activity (antithrombotic action) is than heparin. Therefore, the higher the ratio of anti-Xa activity and APTT prolongation action (anti-Xa activity / APTT ratio) used as one of the methods for expressing anticoagulant potential, the higher the possibility of a safer heparin substitute. There is. That is, when heparin was 1, MHE-FS was 2.44, FSAMC was 2.15, FSBCK was 4.89, FSPA was 1.24, and FSLPG was 1.27. From these results, these derivatives are expected as safer anticoagulants with less bleeding promotion and antithrombotic action as a result of the anti-Xa activity being retained and the APTT prolonging action being weakened.
[0110]
Among the derivatives of MHE-FS substituted with carboxylic acid, the type of functional group at the C-terminus (hydroxyl group (FSPA), carboxylic acid (FSF)) had almost no difference in APTT activity, but anti-Xa activity was FSPA) was about 7 times more active than carboxylic acid (FSF). When the functional group at the C-terminal is a methyl group (FSPEA) compared to carboxylic acid (FSLPG), APTT was reduced to about 1 / 2.5, but anti-Xa activity was about 1/4. It had fallen to. The APTT prolongation action was reduced in the order of FSDPG, FSF, FSBC, and FSBCK where the benzene ring is distant from the binding site with heparin. Furthermore, when the natural L-form and the non-natural D-form were compared, APTT was almost the same, but the anti-Xa activity was about 10 times higher in the L-form.
[0111]
Pharmacological test Effect on ex vivo blood coagulation system
The influence of the amidated derivative of MHE-FS and MHE-FS on the blood coagulation system in vivo was examined. Male mice (3-5 mice per group) were treated with heparin and MHE-FS at 0.1, 0.3 and 1.0 mg / kg, FSLPG and FSDPG at 0.3, 1.0, 3.0 and 10.0 mg. / kg, other amidated derivatives of MHE-FS were administered into the tail vein at doses of 1.0, 3.0, 10.0 and 30.0 mg / kg (control is PBS (−)). After a minute, blood was collected from the abdominal aorta under ether and Nembutal anesthesia using 3.8% sodium citrate (1 volume to 9 volumes of blood), and the following items were measured.
[0112]
1) Measurement of activated partial thromboplastin time (APTT)
For the APTT measurement, APTT-Test Wako (APTT-P reagent, Kephalin) (Wako Pure Chemical Industries), Amelung-Coagulometer, and Decabet (MC Medical) were used. Add 100 μL of activated partial thromboplastin reagent to 100 μL of plasma obtained from the collected blood, heat at 37 ° C. for 3 minutes, add 100 μL of calcium chloride solution, and coagulate using Amelung-Coagulometer The time until was measured.
[0113]
2) Anti-Xa activity
Test Team R Heparin S (Daiichi Kagaku) was used for anti-Xa activity measurement. A test plasma was prepared by adding 8 volumes of buffer solution (50 mM 2-amino-2-hydroxyl-1,3-propanediol, pH 8.4) to 2 volumes of plasma obtained from the collected blood, and 100 μL of this test plasma was added at 37 ° C. After heating for 5 minutes, 50 μL of bovine-derived Xa test solution (7.1 nkat / mL) was added. Further, after heating for 30 seconds, 100 μL of a pre-warmed substrate solution (N-benzoyl-L-isoleucil-L-glutamyl-glycyl-L-arginyl-p-nitroanilide / hydrochloride) was added for 3 minutes. After continuing the heating, 950 μL of a reaction stop solution (10% acetic acid) was added, and the remaining factor Xa was measured at an absorbance of 405 nm. The results are shown in Table 10.
[0114]
[Table 10]
Anti-Xa / APTT activity of HE, MHE-FS and amidated derivatives of MHE-FS

*: Dosage to extend APTT to 100 seconds
[0115]
In Table 10, when the prolongation effect of APTT is expressed as a heparin ratio, the bleeding tendency is reduced as compared with heparin as the value increases. Further, when the anti-Xa activity is expressed by a 1 / heparin ratio, the greater this value is, the better the anti-Xa activity (antithrombotic action) is than heparin. Therefore, the higher the ratio of anti-Xa activity and APTT prolongation action (anti-Xa activity / APTT ratio) used as one of the methods for expressing anticoagulant potential, the higher the possibility of a safer heparin substitute. There is. That is, when heparin was set to 1, FSAMC was 1.91, FSPA was 2.14, FSPEA was 1.81, FSLPG was 2.48, and FSBCK was 2.22. That is, these derivatives are expected to be applied as anticoagulants having higher safety than heparin in clinical practice.
[0116]
Among the derivatives of MHE-FS substituted with carboxylic acid, there was almost no difference in APTT activity in the C-terminal functional groups (hydroxyl group (FSPA), carboxylic acid (FSF)) as in the in vitro results. As for the anti-Xa activity, the hydroxyl group (FSPA) was about 7 times as active as the carboxylic acid (FSF). In addition, when the functional group at the C-terminal is a methyl group (FSPEA) compared to carboxylic acid (FSLPG), APTT was reduced to about 1/3 as in the in vitro results. , About 1 / 4.5. When comparing the natural L-form (FSLPG) and the non-natural D-form (FSDPG), the extension of APTT is reduced to about 1/3 in the D-form compared to the L-form, but the anti-Xa activity is L-form showed about 10 times higher activity.
[0117]
2. Pharmacological test Effects on PAN nephropathy
The effects of amidated derivatives of MHE-FS and MHE-FS on puromycin aminonucleoside (PAN) nephropathy were examined.
[0118]
PAN nephropathy was induced by intraperitoneally administering PAN (Wako Pure Chemical Industries) dissolved in physiological saline at a dose of 110 mg / 5 mL / kg to rats. Rats were orally administered 25 mL / kg of tap water 1, 4, 7, 10 and 14 days after the initiation of PAN nephropathy, then housed in metabolic cages (CT-10, CLEA Japan) and fasted and watered. Urine was collected for 16 hours. The collected urine was measured for urine volume, urinary protein concentration was measured using Micro TP Test Wako (Wako Pure Chemical Industries), and urinary protein excretion / day was calculated.
[0119]
The test substance was intravenously administered at a dose of 0.15-5 mg / mL / kg, and methylprednisolone (mepredrone for injection, Fujirebio, MP) was orally administered at a dose of 10 mg / 5 mL / kg. The administration period was once / day from 30 minutes before PAN administration and 1 day after administration, 14 days in a row.
[0120]
As animals, 4-week-old Jcl: SD male rats were used. The number of animals in each group was 6-7. In addition, as a positive control substance, MP was dissolved in an attached dissolution liquid (total amount: 2 mL) and then diluted with PBS (−) to prepare a concentration of 2 mg / mL.
[0121]
The measured value was expressed as an average value ± standard error. Multiple comparisons were conducted between the control group and the test substance administration group. First, test the uniformity of the variance of each group using the Levene method, one-way analysis of variance in the case of equal variance, and Kruskal-Wallis test after data rank conversion in the case of unequal variance. Tested by Tukey method. A t-test was performed between the control group and the positive control group. The results are shown in FIG. Each measured value is shown as an average value ± SE of 6-7 animals per group. * (P <0.05) and ** (P <0.01) were significantly different from the control.
[0122]
The urinary protein excretion in the control group started to increase to 58.6 ± 31.9 mg / day 4 days after PAN administration, peaked at 130 ± 24.7 mg / day after 10 days, and then decreased. In contrast, the urinary protein excretion amount in the MP administration group, which was a positive control substance, decreased significantly after 7 days from the PAN administration (FIG. 3A). A decrease in urinary protein excretion was observed in the FSF 1 mg / kg administration group, and urinary protein excretion in the 3 mg / kg administration group decreased to 32% of the control group 10 days after PAN administration (FIG. 3B). In the FSDPG 1 mg / kg administration group, a decrease in urinary protein excretion was observed (FIG. 3C). Urinary protein excretion in the FSLPG 1 mg / kg administration group was significantly reduced at 7 and 10 days after PAN administration (FIG. 3D). Therefore, since it became clear that FSF and FSLPG suppress urinary protein excretion in PAN nephropathy, acute and chronic glomerulonephritis, nephrotic syndrome, diabetic nephropathy, nephrosclerosis, interstitial nephritis, chronic Can be applied to prevent and treat various renal diseases that cause renal proteinuria such as pyelonephritis, acute tubular necrosis, ventilated kidney, heavy metal / drug poisoning, side effects due to drugs, tubular acidosis, renal failure, lupus nephritis, etc. .
[0123]
3. Pharmacological test Effect on platelet aggregation in vitro
The effects of collagen and thrombin-induced aggregation on rat platelets of amidated derivatives of MHE-FS and MHE-FS were investigated.
[0124]
1) Rat platelet collection
Pentobarbital sodium (Nembutal Injection, Dainippon Pharmaceutical) 40 mg / kg, i.p. An SD male rat was opened under anesthesia to expose the abdominal aorta. An 18-gauge syringe needle was attached to a 20 mL syringe pump containing 0.8 mL of a 3.8% sodium citrate solution (diagnostic titramine “fuso”, Fuso Pharmaceutical), and 8 mL or more of blood was collected from the abdominal aorta. Immediately after blood collection, the solution was added to the syringe pump and mixed by inversion so that the addition ratio of the sodium citrate solution was 10% of the amount of blood collected. The blood was centrifuged at a low speed (650 to 750 rpm, 20 minutes at 25 ° C.), and the supernatant was collected. This was designated as platelet rich plasma (PRP). The remaining blood was centrifuged (3000 rpm, 4 ° C., 10 minutes), and the supernatant was collected. This was defined as platelet poor plasma (PPP).
[0125]
2) Preparation of washed platelet solution
1/100 volume of 200 mmol / L EDTA-2Na solution was added to PRP and mixed gently. This was centrifuged (2300 rpm, 4 ° C., 10 minutes), and the supernatant was removed by suction. The sediment was suspended in Tris-HCl buffered physiological saline (pH 7.4) containing 0.3 mmol / L EDTA-2Na in the same amount as the original PPP. Centrifugation was again performed (2300 rpm, 4 ° C., 10 minutes), and the supernatant was removed by aspiration. Ca containing 0.1% bovine serum albumin (Fraction V, Seikagaku Corporation) in the same amount as the original PPP.²⁺Suspended in -free Tyrode solution (BSA-Tyrode) and used as a washed platelet solution.
[0126]
3) Effect on collagen-induced platelet aggregation
PRP was used for the measurement. PRP counts the number of platelets with a multi-item automatic blood cell counter, 5 × 10^FiveIt was prepared with PPP so as to be / mL. PPP was added to the control cuvette, and 180 μL each of the prepared PRP was added to the measurement cuvette. The added cuvette was preheated for 5 minutes or more at 37 ° C., and then the measurement was started. One minute after the start of measurement, 10 μL of PBS (−) or 10 μL of various concentrations of the test substance (heparin, MHE-FS or amidated derivative of MHE-FS) was added to the measurement cuvette. After further 3 minutes, 10 μL of 0.4 mg / mL collagen (final concentration 20 μg / mL) was added as a platelet-aggregating substance, and then measurement was performed for 10 minutes. The light transmittance of PPP at the start of the measurement was 100%, the prepared PRP was 0%, and the change in the light transmittance after addition of the aggregate was measured as the platelet aggregation rate.
Collagen (collagen reagent “form”, Nycomed Arzneimittel-Moriya Sangyo) was diluted with the SKF buffer attached to the reagent.
A multi-item automatic blood cell measuring device (K-1000, JASCO) was used for the measurement of platelet count, and a platelet aggregation measuring device (PAM-8C, Mevanics) was used for the measurement of platelet aggregation.
[0127]
4) Effect on thrombin-induced platelet aggregation
Washed platelet solution was used for the measurement. Count the platelet count of the washed platelet solution as before,^FiveDiluted with BSA-Tyrode solution to / mL. The BSA-Tyrode solution was added to the control cuvette, and 180 μL each of the washed platelet solution was added to the measurement cuvette, and the measurement was performed in the same manner as in the previous section. However, 10 μL of a 40 unit / mL thrombin solution (final concentration 0.2 unit / mL) was added as an aggregated substance. Thrombin (thrombin 5,000 units Mochida, Mochida Pharmaceutical) was dissolved in PBS (−).
[0128]
5) Statistical analysis
The maximum aggregation rate up to 10 minutes after the addition of each aggregated substance was determined. The inhibition rate of heparin, MHE-FS or amidated derivatives of MHE-FS on platelet aggregation was calculated by the following formula. However, the data used for calculating the inhibition rate was data obtained from platelets of the same individual.
[0129]
Suppression rate (%)
= (1-maximum aggregation rate when each test substance is added / maximum aggregation rate when PBS (-) is added) × 100
The measurement was repeated 3 to 5 times using platelets from different individuals, and the average value and standard deviation were calculated. For test substances that showed concentration-dependent inhibition of platelet aggregation, a linear regression equation was obtained for 2 to 4 doses at which the inhibition rate was around 50%, and the 50% inhibition rate (IC₅₀) Was calculated.
[0130]
6) Test substances Heparin, MHE-FS, FSF, FSR, FSD, FSM, FSS, FSAMC, FSPA, FSPEA, FSLPG, FSBC, FSBCK, FSDPG and FSTR were used. Heparin, MHE-FS and amidated derivatives of MHE-FS were prepared in various concentrations using PBS (-) and used after filtration through a 0.45 μm filter (Sartorius). PBS (-) was used as a negative control substance.
[0131]
As a result, concentration-dependent aggregation-inhibiting action was observed for collagen and thrombin aggregation with all drugs including heparin.₅₀They varied greatly depending on the drug. For collagen-induced aggregation, FSLPG and FSDPG showed a strong inhibitory action exceeding that of heparin (Table 11). For thrombin aggregation, FSF, FSLPG, FSDPG, FSBC and FSBCK showed a strong inhibitory action exceeding that of heparin (Table 12). Based on the above results, all derivatives having a stronger action than heparin are expected to be applied as anticoagulants instead of heparin, DIC therapeutic agents, or renal disease therapeutic agents based on platelet aggregation inhibition.
[0132]
[Table 11]
Against collagen (20 μg / mL) -induced platelet aggregation in rats
50% inhibitory concentration for HE, MHE-FS and amidated derivatives of MHE-FS

[0133]
[Table 12]
Against thrombin (0.2 units / mL) -induced platelet aggregation in rats
50% inhibitory concentration for HE, MHE-FS and amidated derivatives of MHE-FS

[0134]
Among the MHE-FS derivatives used for screening this time, FSLPG and FSDPG whose benzene ring configuration was closest to the binding site with MHE-FS strongly suppressed both platelet aggregation by collagen and thrombin, both of which were heparin, It was stronger than MHE-FS. In addition, the FSF and the farthest FSBCK with the FSF and benzene ring arrangement slightly inhibited thrombin-induced aggregation, but the collagen-induced aggregation was comparable to that of heparin (FSF) or about 1/4 (FSBC). ) Or 1/8 (FSBCK). These facts indicate that the compound to be bound to MHE-FS has a benzene ring and a carboxylic acid, so that platelet aggregation due to thrombin is strongly suppressed. For collagen-induced aggregation, the arrangement of the benzene ring is changed to MHE-FS. It suggests that it has a strong inhibitory effect by being close to the vicinity of the binding site.
[0135]
4. Pharmacological test Effects on radical scavenging action
The radical scavenging action of amidated derivatives of MHE-FS and MHE-FS was investigated.
[0136]
The involvement of free radicals in the development of nephritis has been reported. In particular, the involvement of free radicals has been clarified in nephritis involving antigen-antibody complexes and nephritis resulting from the accumulation of methylguanidine, a type of uremic toxin, in the body (Oyanagi Yoshihiko; active oxygen and disease, Kagaku Doujin, Kyoto (1984), Yoshihiko Oyanagi; SOD and active enzyme modulators-pharmacological action and clinical application-, Nippon Medical Museum, Tokyo (1989), Satoshi Sanaka et al .; Special issue on kidney and dialysis, 122-126 Tokyo Medical Co., Ltd. (1994), Kazumasa Aoyagi et al .; Special issue on kidney and dialysis, 127-134, Tokyo Medical Co., Ltd. (1994)).
[0137]
1) Test substance
Heparin, MHE-FS, FSF, FSR, FSD, FSM, FSS, FSAMC, FSPA, FSPEA, FSLPG, FSBC, FSBCK, FSDPG and FSTR were used. Each preparation was prepared at 1 mg / mL using a medium.
[0138]
2) Method
This was performed according to the method of L.M.hiebert and Ji-min Liu (L.M.Hiebert and Ji-min Liu: Atherosclerosis, 83, 47-51, 1990). That is, normal porcine pulmonary artery vascular endothelial cells (PPA-EC) (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) or human umbilical artery vascular endothelial cells (HUA-EC) (Diatron) in a type I collagen-coated flask (75 cm²The cells were cultured in M199 Earl medium (Gibco) (2 mL) containing 20% fetal bovine serum (Bio-whittaker) and cell growth additive factors (EGM-2 additive factor set; Sanko Junyaku). 1x10 cells at the third passage^Five An experiment was conducted by dispensing a type I collagen-coated 6-well plate (Falcon) at a cell density of cells / well. That is, the test substance (1 mg / mL) was treated with 1/20 of the total amount of the medium, and then hypoxanthine (0.2 μM / mL) (Sigma) and xanthine oxidase (4 U / mL) (Boehringer Mannheim) prepared in the medium were used. In either case, 1/20 volume of the total amount of the medium was added to generate free radicals and left to stand. After 24 hours, the culture supernatant was collected, and the cells were collected by treatment with EDTA-trypsin (0.02% -0.25% = 1: 1), and the number of viable cells was counted using a Coulter counter (Coulter). Measured. Thereafter, the cell viability was calculated with the average viable cell number of cells not applied with the test substance (Normal) as 100%.
Significance between groups was tested by Tukey method after confirming uniformity of dispersion by Bartlett method. The results are shown in Table 13.
[0139]
[Table 13]
By treatment with pipexanthin and xanthine oxidase
Effects of HE, MHE-FS and MHE-FS amidated derivatives on PPA-ECE

** P <0.01, V.S.PBS. (Tukey's test)
[0140]
As a result, the cell viability in the examination using PPA-EC was significantly higher (P <0.01; Tukey's test) in the test substance-treated cells other than FSPA compared to the cells to which the test substance was not applied (Table 13). ). That is, radical scavenging action was confirmed in test substances other than FSPA.
[0141]
Pharmacological test6. Effects on rat mesangial cells (MC) and normal human mesangial cells (NHMC) in vitro
In vitro effects of MHE-FS and amidated derivatives of MHE-FS on rat mesangial cell (MC) and normal human mesangial cell (NHMC) proliferation were examined. Insulin (Sigma), L-glutamine (Cosmo Bio), and Antibiotic-antimycotic (GIBCO) as antibiotics were used. The test drug was prepared using a medium at a concentration of 300 to 3000 μg / mL, and was used after being filtered through a 0.45 μm filter.
[0142]
1) Examination of MC growth inhibitory action
MC is added to RPMI 1640 (GIBCO) culture solution containing 20% FCS, and 4.0 × 10 is added to a 6-well microplate (FALCON).^FourCells / well were seeded and cultured for 24 hours. Thereafter, the medium was replaced with RPMI 1640 culture medium containing 0.4% FCS (FCS, Biowhittaker) and cultured for 3 days.
Further, the medium was replaced with a 10% FCS-containing RPMI 1640 culture solution, and each test substance was added to 1/10 volume of the total volume. Four days later, all the cells were peeled off with Trypsin-EDTA solution, and the number of cells was measured using a Coulter counter. The results are shown in FIG. 4A.
[0143]
2) Examination of NHMC growth inhibitory action
NHMC (TaKaRa) is added to 20% FCS-containing MsBM medium (Biowhittaker), and the number of cells is 3.5 × 10 on a 6-well microplate.^FourCells / well were seeded and cultured for 24 hours. Thereafter, the MsBM medium containing 0.4% FCS (FCS, Biowhittaker) was replaced and cultured for 3 days. Further, the MsBM medium containing 10% FCS was replaced, and each test substance was added to 1/10 volume of the total volume. Six days later, all cells were detached with Trypsin-EDTA solution, and the number of cells was measured with a Coulter counter. The results are shown in FIG. 4B.
[0144]
Evaluation of the test substance with respect to the MC and NHMC growth inhibitory effect was performed based on the inhibition rate shown in the following formula.
Suppression rate (%) =
[1- (Number of cells at test substance treatment−number of cells 7 or 9 days after addition of culture medium containing 0.4% FCS / number of cells of untreated control−7 or 9 days after addition of culture medium containing 0.4% FCS) Cell count)]
× 100
[0145]
As a result, the heparin application group suppressed MC proliferation by 31.32 to 46.05% in a dose-dependent manner at a dose of 30 to 300 μg / mL. In the FSF, FSLPG and FSDPG application groups, the dose was suppressed in a dose-dependent manner at a dose of 30 to 300 μg / mL, and the suppression rate was higher in all doses than in the heparin application group (FIG. 4A).
[0146]
In addition, the heparin application group inhibited NHMC proliferation by 57.93 to 77.27% in a dose-dependent manner at a dose of 50 to 200 μg / mL. In the FSF and FSDPG application groups, growth suppression was observed in a dose-dependent manner. Moreover, the inhibition rate in the FSF, FSLPG and FSDPG medium-molecule heparin derivative application groups was higher than that in the heparin application group (FIG. 4B). From the above results, it was clarified that the FSF, FSLPG and FSDPG used this time were compounds having an inhibitory action on renal mesangial cell proliferation superior to heparin.
[0147]
6. Pharmacological test Effect on inhibition of complement activation in vitro
The in vitro complement activation inhibitory action of MHE-FS and amidated derivatives of MHE-FS was examined.
[0148]
Sensitized sheep erythrocytes (8.5% sensitized sheep erythrocytes, Denka Seken, EA) 5 × 10⁸ Suspend in gelatin veronal buffer (GVB) to a concentration of cells / mL, add guinea pig complement (dried complement, Denka Seiken) dissolved in GVB to 200 μL of this EA suspension and add GVB. A total volume of 1.5 mL was used. After reacting for 1 hour in a constant temperature bath at 37 ° C., the mixture was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, and the amount of hemoglobin in the supernatant was measured using UVIDEC-77Σ (JASCO) at a measurement wavelength of 542 nm. At the same time, specimens were prepared by adding GVB instead of complement as physical hemolysis, and by adding pure water instead of complement and GVB as 100% hemolysis, and after performing the same operation, the amount of hemoglobin in the supernatant Was measured. The action of each test substance was examined under the condition that the hemolysis rate due to complement activation was about 50%. Moreover, the addition amount of the test substance was added so as to be 1/100 volume of the total volume. The inhibition rate against hemolysis of EA by complement activation of each test substance was calculated by the following formula.
[0149]
Suppression rate (%) =
[1- (Hemolysis rate when each test substance is added / Hemolysis rate of control (addition of solvent only))]
× 100
[0150]
Heparin, MHE-FS, FSF, FSR, FSD, FSM, FSS, FSAMC, FSPA, FSPEA, FSLPG, FSBC, FSBCK, FSDPG and FSTR were used. Nafamostat mesilate (Fusan for injection) as a positive control^®, Torii Pharmaceutical). The results are shown in Table 15.
[0151]
[Table 14]

[0152]
When the physiological activity of heparin other than anticoagulant action such as complement activation inhibitory action is applied clinically, side effects such as bleeding tendency become a problem. As an index for detecting an amidated derivative of MHE-FS that has a strong inhibitory effect on complement activation and is less likely to bleed (each MHE-FS when heparin has a dose obtained by extending APTT to 100 seconds as 1) Ratio of amidated derivative of) × (IC of inhibition of complement activation of heparin)₅₀IC of each amidated derivative of MHE-FS when₅₀The reciprocal of the ratio was calculated. As a result, although it was smaller than the index of Nafamostat used as a positive control drug, 15.30, L-phenylglycine (LPG), phenylalanine (F), D-phenylglycine (DPG), benzyl-L- By introducing cysteine (BC), benzyloxycarbonyl-L-lysine (BCK), methionine (M) and aspartic acid (D), the index was 8.78 to 1.15, which was larger than 1 of heparin. (Table 15). This suggests that FSF, FSBCK, FSBC, FSDPG, FSLPG, FSM and FSD have fewer side effects and stronger complement activation-inhibiting action than heparin.
[0153]
From this result, FSF, FSBCK, FSBC, FSDPG, FSLPG, FSMPG, FSD, especially FSF is a therapeutic agent for diseases such as nephritis in which complement activation is considered to be involved in the onset or progression of pathological conditions. The clinical application of was suggested. In addition, benzene ring and OH, OCH in MHE-FS_Three, -OCOCH_Three, -NHCOCH_ThreeIt is presumed that a stronger complement activity suppressing action can be obtained by introducing a substance having an electron donating group such as.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a line graph showing temporal changes in the estimated molecular weight of heparin according to reaction time and reagent amount.
FIG. 2 shows UV spectra of heparin and MHE-FS
FIG. 3 is a line graph showing the effect of heparin derivatives on PAN nephropathy rats. * (P <0.05), ** (P <0.01)
FIG. 4 is a bar graph showing the effects of heparin derivatives on rat mesangial cells (MC) (A) and normal human mesangial cells (NHMC) (B) in vitro.

Claims (2)

A method for depolymerizing heparin comprising the following steps in the following order :
(1) Heparin dissolved in pH 6-8 buffer
(2) Addition of iron as reducing metal and silicon dioxide as metal oxide to the solution The method for depolymerizing heparin according to claim 1, further comprising the following steps in the following order after the step (2).
(a) Adjust the reaction solution to pH 3 to 5.5
(b) Add hexadecyltrimethylammonium bromide
(c) Add ethanol solution of sodium iodide

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