JP4582896B2 - K1 gene - Google Patents

Description

加えて、一般にシスティン残基をコードする１またはそれ以上のコドンは、特定のポリペプチドのジスフィド結合に影響を与えるので、システイン残基の欠失の結果、置換することが可能である。
【００４２】
置換基を選択することによって作られる機能における実質的な変化は、上記アミノ酸のリストに記載されたものより少し保存性が劣っている：例えば、
a)置換基の領域におけるポリペプチドの構造背景、
b)標的部位のポリペプチドの電荷または疎水性、
c)アミノ酸側鎖の大きさ(容積)。
【００４３】
蛋白の特性に最も大きな変化を生み出すと一般的に期待される置換は、以下のものである：
a) 親水性残基、例えばセリルまたはスレオニルが疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、ファニルアラニル、ヴァリル、またはアラニルに対して置換される、
b) システィンまたはプロリンは、いかなる他の残基に対して置換される、
c) 電気的陽性側鎖を有している残基、例えば、リジル、アルギニル、ヒスチジルは電気的陰性残基、例えば、バルタミルまたはアスパルチルによって置換されるが、
d) 非常に大きな側鎖を有している残基、例えば、フェニルアラニンはグリシンのような側鎖を有しないものと置換できる。
【００４４】
以上のとおり、本発明遺伝子Ｋ１およびその遺伝子産物の提供は、転写活性因子としての新規遺伝子の解明、把握、診断、予防および治療等に極めて有用な情報乃至手段を与える。また、本発明遺伝子は、上記Ｃ型肝炎ウイルスコアタンパクと相互作用し、ウイルスの癌化を抑制する作用による肝癌予防および治療の処置に利用される本発明遺伝子の発現の誘導を促進する新規薬剤の開発の上でも好適に利用できる。更に、個体或は組織における本発明遺伝子の発現またはその産物の発現の検出や、該遺伝子の変異（欠失や点変異）乃至発現異常の検出は、上記Ｃ型肝炎ウイルスコアタンパクと相互作用の解明や本発明遺伝子発現タンパクとＣ型肝炎ウイルスコアタンパクと相互作用に関する遺伝子診断において好適に利用できる。
【００４５】
本発明遺伝子は、具体的には配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号：２の塩基配列を含む遺伝子、または該配列番号：２で示される塩基配列の全部またはその相補鎖を含むポリヌクレオチドからなる遺伝子として示されるが、特にこれらに限定されることなく、例えば、上記特定のアミノ酸配列において一定の改変を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子や、上記特定のアミノ酸配列や塩基配列と一定の相同性を有する遺伝子であることができる。前記特定のアミノ酸配列や塩基配列と一定の相同性は、例えば少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有するものであり、これら相同物を含む。
【００４６】
本発明遺伝子改変体については、配列番号：１に示されるアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列（改変されたアミノ酸配列）をコードする塩基配列を含む遺伝子もまた包含される。 ここで、「アミノ酸の欠失、置換または付加」の程度およびそれらの位置などは、改変された蛋白質が、配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質（Ｋ１蛋白）と同様の機能を有する同効物であれば特に制限されないが、好ましくは１から十数個、更に好ましくは１から数個程度の改変が、Ｋ１蛋白と同様の機能を有するうえで好ましく例示される。
【００４７】
ここで「同様の機能」とは、転写活性因子としての他の遺伝子の転写活性化作用、またはｃＡＭＰ応答エレメント結合活性またはｂｏｘ−Ｂ結合活性などの配列特異的結合活性により、他の蛋白質との相互作用を与える活性、例えばＣ型肝炎ウイルスコアタンパクと相互作用し、ウイルスの癌化を抑制する作用、あるいは肝臓の代謝酵素のプロモーターに存在するｃＡＭＰ応答エレメント結合活性またはｂｏｘ−Ｂ結合活性などの配列特異的結合し、該プロモーターの転写を活性化することにより肝臓における薬物代謝遺伝子の発現を制御する活性など、これら転写調節活性を例示できる。
【００４８】
かくしてＫ１は、ＣＲＥＢ(cAMP responsive element binding factor)/ＡＴＦファミリーのひとつである。これらの特性を以後「Ｋ１活性」または「Ｋ１ポリペプチド活性」または「Ｋ１の生物学的活性」という。これらの活性の中には、前記Ｋ１ポリペプチドの抗原性および免疫原性活性、特に配列番号１のポリペプチドの抗原性および免疫原性活性も含まれる。本発明のポリペプチドは、Ｋ１の少なくとも１つの生物学的活性を示すことが好ましい。
【００４９】
また、上記改変されたアミノ酸配列をコードする遺伝子は、その利用によって改変前のアミノ酸配列をコードする本発明Ｋ１遺伝子が検出できるものであってもよい。
【００５０】
さらに本発明のＤＮＡ分子としては、例えば配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を有するＫ１遺伝子を挙げることができるが、特にこれに限定されることなく、当該Ｋ１遺伝子の相同物も包含される。
【００５１】
ここで「Ｋ１遺伝子の相同物」とは、本発明Ｋ１遺伝子（またはその遺伝子産物）と配列相同性を有し、上記構造的特徴並びに遺伝子発現パターンにおける共通性、および上記したようなその生物学的機能の類似性によりひとつの遺伝子ファミリーと認識される一連の関連遺伝子を意味し、Ｋ１遺伝子のアレル体（対立遺伝子）も当然含まれる。
【００５２】
上記遺伝子でコードされるアミノ酸配列の改変（変異）などは、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあるが、天然由来の蛋白または遺伝子（例えば本発明のヒトＫ１またはヒトＫ１遺伝子）に基づいて人為的に改変することもできる。本発明は、このような改変・変異の原因および手段などを問わず、上記特性を有する全ての改変遺伝子を包含する。本発明の遺伝子（ヒトＫ１遺伝子）には、配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子の対立遺伝子（アレル体）もまた包含される。
【００５３】
上記の人為的手段としては、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987)；同 100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」、日本生化学会編, p105 (1986)〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967)；同 91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981)；同 24, 245 (1983)〕およびそれらの組合せ方法などが例示できる。より具体的には、ＤＮＡの合成は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。
【００５４】
本発明遺伝子の具体的態様としては、配列番号：２に示される塩基配列を有する遺伝子を例示できる。この塩基配列中のコーディング領域は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列の各アミノ酸残基を示すコドンの一つの組合せ例を示している。本発明の遺伝子は、かかる特定の塩基配列を有する遺伝子に限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ、選択した塩基配列を有することも可能である。コドンの選択は、常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度などを考慮することができる〔Ncleic Acids Res., 9, 43 (1981)〕。
【００５５】
また、本発明ＤＮＡ分子は、前記のとおり、配列番号：２に示される塩基配列と一定の相同性を有する塩基配列からなるものも包含する。
【００５６】
上記相同性は、配列番号：２に示される塩基配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは、９８％の同一性を有するポリヌクレオチドおよびその相補鎖ポリヌクレオチドを言う。
【００５７】
かかる遺伝子としては、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃または０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃のストリンジェントな条件下で配列番号：２に示される塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列を有する遺伝子を例示することもできる。
【００５８】
本発明遺伝子は、本発明により開示された本発明遺伝子の具体例についての配列情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、II、III」、日本生化学会編（1986）など参照〕。
【００５９】
具体的には、本発明遺伝子が発現される適当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981)；Science, 222, 778 (1983)など〕。
【００６０】
上記において、ｃＤＮＡの起源としては、本発明の遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに由来する培養細胞などが例示される。また、これらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。また、ｃＤＮＡライブラリーは市販されてもおり、本発明においてはそれらｃＤＮＡライブラリー、例えばクローンテック社（Clontech Lab.Inc.）などより市販されている各種ｃＤＮＡライブラリーなどを用いることもできる。
【００６１】
本発明の遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。
【００６２】
具体的には、例えばｃＤＮＡによって産生される蛋白質に対して、該蛋白質の特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーションなどやこれらの組合せなどを例示できる。
【００６３】
ここで用いられるプローブとしては、本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡなどが一般的に使用できるが、既に取得された本発明遺伝子やその断片も良好に利用できる。また、本発明遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセンス・プライマー、アンチセンス・プライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。
【００６４】
前記プローブとして用いられるヌクレオチド配列は、配列番号２に対応する部分ヌクレオチド配列であって、少なくとも１５個の連続した塩基、好ましくは２０個の連続した塩基、より好ましくは３０個の連続した塩基、最も好ましくは５０個の連続した塩基を有するものも含まれる、或いは前記配列を有する陽性クローンそれ自体をプローブとして用いることも出来る。ここで本発明において選択されるプローブとして用いられるヌクレオチド配列は、配列番号２に対応する部分ヌクレオチド配列であって、かつ他のＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリー遺伝子のＤＮＡ配列とは異なるオリゴヌクレオチド配列のプライマー配列であることを必須の要件とすることはいうまでもない。
【００６５】
本発明の遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法〔Science, 230, 1350 (1985)〕によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法〔Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、12(6), 35 (1994)〕、特に５'-ＲＡＣＥ法〔M.A. Frohman, etal., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)〕などの採用が好適である。
【００６６】
かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、本発明によって明らかにされた本発明の遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、これは常法に従って合成できる。尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法などによればよい。
【００６７】
また、上記で得られる本発明遺伝子或いは各種ＤＮＡ断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)〕やマキサム−ギルバート法〔Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)〕などに従って、また簡便には市販のシークエンスキットなどを用いて、その塩基配列を決定することができる。
【００６８】
このようにして得られる本発明の遺伝子によれば、例えば該遺伝子の一部または全部の塩基配列を利用することにより、個体もしくは各種組織における本発明遺伝子の発現の有無を特異的に検出することができる。
【００６９】
かかる検出は常法に従って行うことができ、例えばＲＴ−ＰＣＲ〔Reverse transcribed-Polymerase chain reaction; E.S. Kawasaki, et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press,Inc.,SanDiego, 21-27 (1991)〕によるＲＮＡ増幅やノーザンブロッティング解析〔Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1989)〕、in situ ＲＴ−ＰＣＲ〔Nucl. Acids Res., 21, 3159-3166 (1993)〕や in situ ハイブリダイゼーションなどを利用した細胞レベルでの測定、ＮＡＳＢＡ法〔Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350, 91-92 (1991)〕およびその他の各種方法を挙げることができる。好適には、ＲＴ−ＰＣＲによる検出法を挙げることができる。
【００７０】
尚、ここでＰＣＲ法を採用する場合に用いられるプライマーとしては、本発明遺伝子のみを特異的に増幅できる該遺伝子特有のものである限り、特に制限はなく、本発明遺伝子の配列情報に基いて適宜設定することができる。通常プライマーとして１０〜３５程度のヌクレオチド、好ましくは１５〜３０ヌクレオチド程度の長さを有する本発明遺伝子の部分配列を有するものを挙げることができる。
【００７１】
このように、本発明の遺伝子には、本発明にかかるＫ１遺伝子を検出するための特異プライマーおよび／または特異プローブとして使用されるＤＮＡ断片もまた包含されるが、上記プライマーの要件と同様に他のＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリー遺伝子のＤＮＡ配列とは異なるオリゴヌクレオチド・プライマー／またはプローブであることを必須の要件とする。
【００７２】
ここで、「ＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリー遺伝子のＤＮＡ配列とは異なる」オリゴヌクレオチドとは、Ｋ１遺伝子のみを検出し他のＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリー遺伝子を検出しないために、Ｋ１遺伝子の塩基配列中のヌクレオチド配列であって、他のＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリー遺伝子のＤＮＡ配列に含まれる配列を除外する意味である。
【００７３】
当該ＤＮＡ断片は、配列番号：２に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とするＤＮＡとして規定することできる。ここで、ストリンジェントな条件としては、プライマーまたはプローブとして用いられる通常の条件を挙げることができ、特に制限はされないが、例えば、前述するような０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃の条件または０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃の条件を例示することができる。
【００７４】
本発明のＫ１遺伝子によれば、通常の遺伝子工学的手法を用いることにより、該遺伝子産物（Ｋ１蛋白）またはこれを含む蛋白質を容易に大量に、安定して製造することができる。
【００７５】
従って本発明は、本発明遺伝子によってコードされるＫ１蛋白質などの蛋白質を始め、該蛋白質の製造のための、例えば本発明遺伝子を含有するベクター、該ベクターによって形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養して上記本発明蛋白質を製造する方法などをも提供するものである。
【００７６】
本発明蛋白質の具体的態様としては、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＫ１蛋白質を挙げることができるが、本発明蛋白質には、該Ｋ１蛋白質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記配列番号：１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個乃至複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ前記Ｋ１活性を有する蛋白質を挙げることができる。ここで前記Ｋ１活性とは、Ｋ１遺伝子の過剰発現に基づく、転写活性因子としての他の遺伝子の転写活性化作用、またはｃＡＭＰ応答エレメント結合活性またはｂｏｘ−Ｂ結合活性などの配列特異的結合活性により、他の蛋白質との相互作用を与える活性、例えばＣ型肝炎ウイルスコアタンパクと相互作用し、ウイルスの癌化を抑制する作用、あるいは肝臓の代謝酵素のプロモーターに存在するｃＡＭＰ応答エレメント結合活性またはｂｏｘ−Ｂ結合活性などの配列特異的結合し、該プロモーターの転写を活性化することにより肝臓における薬物代謝遺伝子の発現を制御する活性など、これら転写調節活性を例示できる。具体的には、前記Ｋ１遺伝子の相同物（アレル体を含むＫ１同等遺伝子）の遺伝子産物を挙げることができる。
【００７７】
また、本発明Ｋ１蛋白質の相同物には、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のＫ１蛋白質と同一活性を有する、哺乳動物、例えばヒト、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラット、ウサギなど由来の蛋白質も包含される。
【００７８】
本発明の蛋白質は、本発明により提供されるＫ１遺伝子の配列情報に基づいて、常法の遺伝子組換え技術〔例えば、Science, 224, 1431 (1984) ; Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985)；Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 5990 (1983)など参照〕に従って調製することができる。
【００７９】
該蛋白質の製造は、より詳細には、該所望の蛋白をコードする遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から回収することにより行なわれる。
【００８０】
上記宿主細胞としては、原核生物および真核生物のいずれも用いることができ、例えば原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌といった一般的に用いられるものが広く挙げられ、好適には大腸菌、とりわけエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２株に含まれるものを例示できる。また、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、前者としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Cell, 23: 175 (1981)〕やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞およびそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77: 4216 (1980)〕などが、後者としては、サッカロミセス属酵母細胞などが好適に用いられる。勿論、これらに限定される訳ではない。
【００８１】
原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーターおよびＳＤ（シャイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを好適に利用できる。上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来のプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３などがよく用いられるが、これらに限定されず既知の各種のベクターを利用することができる。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクターの市販品としては、例えばｐＧＥＸ−４Ｔ（Amersham Pharmacia Biotech社）、ｐＭＡＬ−Ｃ２，ｐＭＡｌ−Ｐ２（New England Biolabs社）、ｐＥＴ２１，ｐＥＴ２１／ｌａｃｑ（Invitrogen社）、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Invitrogen社）等を例示できる。
【００８２】
脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベクターとしては、通常、発現しようとする本発明遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終了配列を保有するものが挙げられ、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの例としては、具体的には、例えばＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２dhfr〔Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)〕等が例示できる。上記以外にも既知の各種の市販ベクターを用いることができる。動物細胞を利用した発現系に利用されるかかるベクターの市販品としては、例えばｐＥＧＦＰ−Ｎ，ｐＥＧＦＰ−Ｃ（Clontrech社）、ｐＩＮＤ（Invitrogen社）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（Invitrogen社）などの動物細胞用ベクターや、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴ（ＧｉｂｃｉＢＲＬ社）、ｐＡｃＧＨＬＴ（PharMingen社）、ｐＡｃ５／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ｈｉｓ（以上Invitrogen社）などの昆虫細胞用ベクターなどが挙げられる。
【００８３】
また、酵母細胞を宿主とする場合の発現ベクターの具体例としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983)〕などが例示できる。市販の酵母細胞用発現ベクターには、例えばｐＰＩＣＺ（Invitrogen社）、ｐＰＩＣＺα（Invitrogen社）なとが包含される。
【００８４】
プロモーターとしても特に限定なく、エッシェリヒア属菌を宿主とする場合は、例えばトリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＰＬ／ＰＲプロモーターなどを好ましく利用できる。宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、例えばｐＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどを好適に利用できる。また、動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモーターとしては、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを例示できる。
【００８５】
尚、本発明遺伝子の発現ベクターとしては、通常の融合蛋白発現ベクターも好ましく利用できる。該ベクターの具体例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として発現させるためのｐＧＥＸ（Promega 社）などを例示できる。
【００８６】
また、成熟ポリペプチドのコード配列が宿主細胞からのポリペプチドの発現、分泌を助けるポリヌクレオチド配列としては、分泌配列、リーダ配列が例示でき、細菌宿主に対して融合成熟ポリペプチドの精製に使用されるマーカー配列(ヘキサヒスチジン・タグ、ヒスチジン・タグ)、哺乳動物細胞の場合はヘマグルチニン(HA)・タグを例示できる。
【００８７】
所望の組換えＤＮＡ（発現ベクター）の宿主細胞への導入法およびこれによる形質転換法としては、特に限定されず、一般的な各種方法を採用することができる。
【００８８】
また得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により所望のように設計した遺伝子によりコードされる本発明の目的蛋白質が、形質転換体の細胞内、細胞外または細胞膜上に発現、生産（蓄積、分泌）される。
【００８９】
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
【００９０】
かくして得られる本発明の組換え蛋白質は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックII」、1175-1259 頁、第１版第１刷、1980年 6月23日株式会社東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987)など参照〕により分離、精製できる。
【００９１】
該方法としては、具体的には、通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せが例示でき、特に好ましい方法としては、本発明蛋白質に対する特異的な抗体を結合させたカラムを利用したアフィニティクロマトグラフィーなどを例示することができる。
【００９２】
尚、本発明蛋白質をコードする所望の遺伝子の設計に際しては、配列番号：２に示されるＫ１遺伝子の塩基配列を良好に利用することができる。該遺伝子は、所望により、各アミノ酸残基を示すコドンを適宜選択変更して利用することも可能である。
【００９３】
また、Ｋ１遺伝子でコードされるアミノ酸配列において、その一部のアミノ酸残基ないしはアミノ酸配列を置換、欠失、付加などにより改変する場合には、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシスなどの前記した各種方法により行うことができる。
【００９４】
本発明蛋白質は、また、配列番号：１に示すアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。該方法には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法が包含される。
【００９５】
かかるペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていく所謂ステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含し、本発明蛋白質の合成は、そのいずれによってもよい。
【００９６】
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、常法に従うことができ、例えば、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドなど）法、ウッドワード法などを例示できる。
【００９７】
これら各方法に利用できる溶媒も、この種ペプチド縮合反応に使用されることのよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチルなどおよびこれらの混合溶媒などを挙げることができる。
【００９８】
尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸乃至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第３級ブチルエステルなどの低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルなどのアラルキルエステルなどとして保護することができる。
【００９９】
また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばチロシン残基の水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第３級ブチル基などで保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に、例えばアルギニン残基のグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基などの適当な保護基により保護することができる。
【０１００】
上記保護基を有するアミノ酸、ペプチドおよび最終的に得られる本発明蛋白質におけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸などを用いる方法などに従って実施することができる。
【０１０１】
かくして得られる本発明蛋白質は、前記した各種の方法、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、向流分配法などのペプチド化学の分野で汎用される方法に従って、適宜精製を行うことができる。
【０１０２】
本発明Ｋ１蛋白質は、その特異抗体を作成するための免疫抗原としても好適に利用でき、この抗原を利用することにより、所望の抗血清（ポリクローナル抗体）およびモノクローナル抗体を取得することができる。
【０１０３】
該抗体の製造法自体は、当業者によく理解されているところであり、本発明においてもこれら常法に従うことができる〔例えば、続生化学実験講座「免疫生化学研究法」、日本生化学会編（1986）など参照〕。
【０１０４】
かくして得られる抗体は、例えばＫ１蛋白の精製およびその免疫学的手法による測定ないしは識別などに有利に利用することができる。
【０１０５】
また、本発明のＫ１遺伝子発現産物、またはＫ１ポリペプチドおよびそれらの部分は、転写活性因子として、肝癌に対する抗癌化作用を有することから、前記Ｋ１遺伝子発現産物、またはＫ１ポリペプチドおよびそれらの部分を有効成分とする肝癌の予防・治療剤としての医薬組成物として有用である。
【０１０６】
医薬組成物において有効成分とする蛋白質には、その医薬的に許容される塩もまた包含される。かかる塩には、当業界で周知の方法により調製される、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウムなどの無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などが包含される。更に上記塩には、本発明蛋白質と適当な有機酸ないし無機酸との反応による無毒性酸付加塩も包含される。代表的無毒性酸付加塩としては、例えば塩酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩およびナプシレートなどが例示される。
【０１０７】
上記医薬組成物は、本発明蛋白質を活性成分として、その薬学的有効量を、適当な無毒性医薬担体ないし希釈剤と共に含有するものが含まれる。
【０１０８】
上記医薬組成物（医薬製剤）に利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤或は賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。
【０１０９】
特に好ましい本発明医薬製剤は、通常の蛋白製剤などに使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤などを適宜使用して調製される。
【０１１０】
上記安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体などを例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤などと組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。
【０１１１】
上記Ｌ−アミノ酸としては、特に限定はなく例えばグリシン、システィン、グルタミン酸などのいずれでもよい。
【０１１２】
上記糖としても特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖などの単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖などの二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸などの多糖類などおよびそれらの誘導体などを使用できる。
【０１１３】
界面活性剤としても特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用でき、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系などを使用できる。
【０１１４】
セルロース誘導体としても特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを使用できる。
【０１１５】
上記糖類の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０１〜１０ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。界面活性剤の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０００１〜０．０１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。ヒト血清アルブミンの添加量は、有効成分１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．００１〜０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。アミノ酸は、有効成分１μｇ当り約０．００１〜１０ｍｇ程度とするのが適当である。また、セルロース誘導体の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．００１〜０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。
【０１１６】
本発明医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。
【０１１７】
また本発明医薬製剤中には、各種添加剤、例えば緩衝剤、等張化剤、キレート剤などをも添加することができる。ここで緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）などを例示できる。等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンなどを例示できる。またキレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸などを例示できる。
【０１１８】
本発明医薬製剤は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時水、生埋的食塩水などを含む緩衝液などで溶解して適当な濃度に調製した後に使用することも可能である。
【０１１９】
本発明の医薬製剤の投与単位形態としては、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤などの固体投与形態や、溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシルなどの液剤投与形態が含まれ、これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、軟膏剤などに分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形乃至調製することができる。
【０１２０】
例えば、錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウムなどの賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウムなどの崩壊剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリドなどの界面活性剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤、グリセリン、デンプンなどの保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤などを使用できる。
【０１２１】
更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠とすることができ、また二重錠ないしは多層錠とすることもできる。
【０１２２】
丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤、ラミナラン、カンテンなどの崩壊剤などを使用できる。
【０１２３】
カプセル剤は、常法に従い通常本発明の有効成分を上記で例示した各種の製剤担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセルなどに充填して調整される。
【０１２４】
経口投与用液体投与形態は、慣用される不活性希釈剤、例えば水を含む医薬的に許容される溶液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、エリキシルなどを包含し、更に湿潤剤、乳剤、懸濁剤などの助剤を含ませることができ、これらは常法に従い調製される。
【０１２５】
非経口投与用の液体投与形態、例えば滅菌水性乃至非水性溶液、エマルジョン、懸濁液などへの調製に際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルおよびオリーブ油などの植物油などを使用でき、また注入可能な有機エステル類、例えばオレイン酸エチルなどを配合できる。これらには更に通常の溶解補助剤、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、分散剤などを添加することもできる。滅菌は、例えばバクテリア保留フィルターを通過させる濾過操作、殺菌剤の配合、照射処理および加熱処理などにより実施できる。また、これらは使用直前に滅菌水や適当な滅菌可能媒体に溶解することのできる滅菌固体組成物形態に調製することもできる。
【０１２６】
坐剤や膣投与用製剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチンおよび半合成グリセライドなどを使用できる。
【０１２７】
ペースト、クリーム、ゲルなどの軟膏剤の形態に成形するに際しては、希釈剤として、例えば白色ワセリン、パラフイン、グリセリン、セルロース誘導体、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイトおよびオリーブ油などの植物油などを使用できる。
【０１２８】
経鼻または舌下投与用組成物は、周知の標準賦形剤を用いて、常法に従い調製することができる。
【０１２９】
尚、本発明薬剤中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品などを含有させることもできる。
【０１３０】
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤は経口投与され、注射剤は単独でまたはブドウ糖やアミノ酸などの通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じ単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤は直腸内投与され、経膣剤は膣内投与され、経鼻剤は鼻腔内投与され、舌下剤は口腔内投与され、軟膏剤は経皮的に局所投与される。
【０１３１】
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。一般的には、該投与量は、通常、１日当り体重１ｋｇ当り、約０．０１μｇ〜１０ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度とするのがよく、該製剤は１日に１〜数回に分けて投与することができる。
【０１３２】
現在のところ、Ｃ型肝炎を発症すると、高率で肝癌を発症するが、その根本的な治療法は、見つかっておらず、画期的治療法が期待されている。Ｃ型肝炎はＣ型肝炎ウイルスが、肝細胞に感染し発症することはよく知られているところであり、該Ｃ型肝炎ウイルスの構成成分である、コアタンパクを強制発現させたトランスジェニックマウスは、肝癌を発症することが知られており、肝癌の発症と深い関係があると考えられている。このＣ型肝炎ウイルスコアタンパクは、転写因子ＬＺＩＰと相互作用し、ＬＺＩＰの転写活性化能を抑制し、さらに、細胞を癌化させる作用があることが知られている。 本発明者らは、後記実施例に示されるように、本発明の転写因子Ｋ１はこのＬＺＩＰと高いアミノ酸配列の相同性を示し、肝臓特異的な発現をすることを見い出した。このことは、転写因子Ｋ１が、直接または、ＬＺＩＰを介して間接的に、または、ＬＺＩＰの転写標的遺伝子への結合を競合することを介して間接的に、Ｃ型肝炎ウイルスコアタンパクと相互作用し、肝癌の発症に関与する可能性を示唆している。従って、本発明のＫ１遺伝子を発現するベクターを使って遺伝子治療を行い、Ｋ１遺伝子をウイルス感染細胞に過剰に発現させることによって、コアタンパクの癌化作用を打ち消すことによってＣ型肝炎ウイルスによる肝癌の発症を予防治療できる可能性がある。
【０１３３】
即ち、本発明Ｋ１遺伝子の全部または一部のセンス鎖を包含する任意の遺伝子発現ベクターを作成し、該発現ベクターをこれら組織において強制的に発現させることにより、Ｋ１遺伝子の過剰発現に基づく、転写活性因子としての他の遺伝子の転写活性化作用、またはｃＡＭＰ応答エレメント結合活性またはｂｏｘ−Ｂ結合活性などの配列特異的結合活性により、他の蛋白質との相互作用を与える活性、例えばＣ型肝炎ウイルスコアタンパクと相互作用し、ウイルスの癌化を抑制する作用、あるいは肝臓の代謝酵素のプロモーターに存在するｃＡＭＰ応答エレメント結合活性またはｂｏｘ−Ｂ結合活性などの配列特異的結合し、該プロモーターの転写を活性化することにより肝臓における薬物代謝遺伝子の発現を制御する活性など、これら転写調節活性を有する遺伝子治療用組成物として、或いは遺伝子治療剤として利用できると考えられる。
【０１３４】
従って、本発明は、Ｋ１遺伝子の全部または一部のセンス鎖を含有する遺伝子治療用ベクターおよび該ベクターによりＫ１遺伝子のセンス鎖を導入した細胞を有効成分とする医薬を提供しようとするものである。
【０１３５】
即ち、本発明によれば、配列番号：２で示される塩基配列の全部または一部を含むＫ１遺伝子のセンス鎖を含有する遺伝子治療用導入用ベクターおよび該ベクターによりＫ１遺伝子センス鎖を導入した細胞、並びに該遺伝子治療用導入用ベクターおよび該ベクターによりＫ１遺伝子センス鎖を導入した細胞を有効成分とする遺伝子治療剤が提供される。
【０１３６】
また、本発明によれば、配列番号：２で示される塩基配列の全部または一部のセンス鎖を含むＫ１遺伝子センス鎖を含有する遺伝子治療用導入用ベクターおよび該ベクターによりＫ１遺伝子センス鎖を導入した細胞を、Ｃ型肝炎の患者のＣ型肝炎ウイルスコアタンパクと相互作用させるため、Ｃ型肝炎の患者の肝臓内または患者の血管組織部位に投与することによってこれら組織における転写活性化作用に基づく抗癌化作用、あるいはこれら細胞におけるＫ１遺伝子の発現量を促進することを特徴とするＣ型肝炎の患者の癌化抑制およびＫ１活性促進剤または抗癌薬を提供することができる。
【０１３７】
更にまた、本発明によれば、上記Ｋ１遺伝子センス鎖を含有する遺伝子治療用導入用のウイルスベクターを有効成分として含有する医薬、特に、Ｋ１活性、即ち、転写活性作用、ｃＡＭＰ応答エレメント結合活性またはｂｏｘ−Ｂ結合活性などの配列特異的結合活性作用、或いはこれら結合活性の亢進作用に基づく結合した遺伝子の転写を活性化するための処置等に使用される当該医薬が提供される。
【０１３８】
以下、かかる遺伝子治療につき詳述する。尚、以下の遺伝子治療の実施においては、特記しないかぎり、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、および免疫学の慣用的な方法を用いることができる。これらは、例えばマニアティス(Maniatis,T., et al., Molecular cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982))、サムブルック(Sambrook,J., et al.,Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1981))、アウスベル(Ausbel,F.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons, New York, New York,(1992))、グローバー(Glover,D., DNA Cloning,I and II(Oxford Press)(1985))、アナンド(Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press(1992))、グスリー(Guthrie,G., et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, (Academic Press)(1991))およびフィンク(Fink,et al., Hum. Gene Ther., 3, 11-19(1992)に記載されている。
【０１３９】
遺伝子治療は、本発明は、本発明Ｋ１遺伝子の発現する細胞において、細胞内でのｍＲＮＡ量を増大させ、Ｋ１遺伝子の発現を促進するためのセンス医薬の提供によるＫ１活性促進または転写活性化作用、ｃＡＭＰ応答エレメント結合活性またはｂｏｘ−Ｂ結合活性などの配列特異的結合活性作用、或いはこれら結合活性の亢進作用に基づく結合した遺伝子の転写を活性化作用を促進する遺伝子治療法を提供する。該治療法は、例えばＫ１遺伝子を有するＫ１発現細胞本来のｍＲＮＡの転写或いは翻訳の過程を促進することによって、標的とする遺伝子の発現を促進させる方法である。そのためには遺伝子のｍＲＮＡと相補的なセンス・オリゴヌクレオチドを製造し、該センス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に供給する方法としてとらえることができる。
【０１４０】
かかるＫ１遺伝子の発現機能を促進する作用を供給すれば、受容細胞／標的細胞におけるＫ１活性を促進することができる。当該センス・オリゴヌクレオチドを含有するベクターまたはプラスミドを用いて染色体外に維持し、目的の細胞に導入することができる。
【０１４１】
上記センス・オリゴヌクレオチドを用いたＣ型肝炎患者に対する遺伝子治療によれば、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ由来のベクターに該センス・オリゴヌクレオチドを組み込み、これをＫ１活性発現細胞に感染させてセンス・オリゴヌクレオチドを過剰発現させることにより、所望の遺伝子の作用を得ることが出来る。
【０１４２】
このようにＫ１遺伝子を有する細胞にセンス・オリゴヌクレオチドを導入してＫ１蛋白の発現を促進させる場合、当該センス・オリゴヌクレオチドは対応するＫ１遺伝子の全長に対応するものである必要はなく、例えば該Ｋ１遺伝子の発現機能を促進する機能と実質的に同質な機能を保持する限りにおいて、前記した改変体であっても、また特定の機能を保持した一部配列からなる遺伝子を使用することもできる。
【０１４３】
かかる組換えおよび染色体外維持の双方のための所望遺伝子の導入のためのベクターは、当該分野において既に知られており、本発明ではかかる既知のベクターのいずれもが使用できる。例えば、発現制御エレメントに連結したＫ１のセンス・オリゴヌクレオチドのコピーを含み、かつ目的の細胞内で当該センス・オリゴヌクレオチド産物を発現できるウイルスベクターまたはプラスミドベクターを挙げることができる。かかるベクターとして、通常前述する発現用ベクターを利用することもできるが、好適には、例えば起源ベクターとして、米国特許第５２５２４７９号明細書およびＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／０７２８２号明細書に開示されたベクター（ｐＷＰ−７Ａ、ｐｗＰ−１９、ｐＷＵ−１、ｐＷＰ−８Ａ、ｐＷＰ−２１および／またはｐＲＳＶＬなど）またはｐＲＣ／ＣＭＶ（Invitrogen社製）などを用いて、調製されたベクターを挙げることができる。より好ましくは、後述する各種ウイルス・ベクターである。
【０１４４】
なお、遺伝子導入治療において用いられるベクターに使用されるプロモーターとしては、各種疾患の治療対象となる患部組織に固有のものを好適に利用することができる。
【０１４５】
その具体例としては、例えば、肝臓に対しては、アルブミン、α−フェトプロティン、α１−アンチトリプシン、トランスフェリン、トランススチレンなどを例示できる。結腸に対しては、カルボン酸アンヒドラーゼＩ、カルシノエンブロゲンの抗原などを例示できる。子宮および胎盤に対しては、エストロゲン、アロマターゼサイトクロームＰ４５０、コレステロール側鎖切断Ｐ４５０、１７アルファーヒドロキシラーゼＰ４５０などを例示できる。
【０１４６】
前立腺に対しては、前立腺抗原、ｇｐ９１−フォックス遺伝子、前立腺特異的カリクレインなどを例示できる。乳房に対しては、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ３、β−カゼイン、β−ラクトグロビン、乳漿蛋白質などを例示できる。肺に対しては、活性剤蛋白質Ｃウログロブリンなどを例示できる。皮膚に対しては、Ｋ−１４−ケラチン、ヒトケラチン１または６、ロイクリンなどを例示できる。
【０１４７】
脳に対しては、神経膠繊維質酸性蛋白質、成熟アストロサイト特異蛋白質、ミエリン塩基性蛋白質、チロシンヒドロキシラーゼなどを例示できる。膵臓においては、ヴィリン、グルカゴン、ランゲルハンス島アミロイドポリペプチドなどを例示できる。甲状腺に対しては、チログロブリン、カルシトニンなどを例示できる。骨に対しては、α１コラーゲン、オステオカルシン、骨シアログリコプロティンなどを例示できる。腎臓に対してはレニン、肝臓／骨／腎臓アルカリ性ホスフォターゼ、エリスロポエチンなどを、膵臓に対しては、アミラーゼ、ＰＡＰ１などを例示できる。
【０１４８】
なおセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターの製造において、導入されるセンス・オリゴヌクレオチド（Ｋ１遺伝子配列に対応する配列全部または一部）は、本発明のＫ１遺伝子の塩基配列情報に基づいて、前記の如く、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる。
【０１４９】
かかるセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターの細胞への導入は、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈法、ウイルス形質導入などを始めとする、細胞にＤＮＡを導入する当該分野において既に知られている各種の方法に従って行うことができる。なお、Ｋ１のセンス・オリゴヌクレオチドで形質転換された細胞は、それ自体単離状態でＫ１活性を促進するための医薬や、治療研究のためのモデル系として利用することも可能である。
【０１５０】
遺伝子治療においては、上記のセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターは、患者の対象とする組織部位に局所的にまたは全身的に注射投与することにより患者の標的細胞内に導入することができる。この際全身的投与によれば、他の部位にＫ１ｍＲＮＡが発現し得るいずれの細胞にも到達させることができる。形質導入された遺伝子が各標的細胞の染色体内に恒久的に取り込まれない場合には、該投与を定期的に繰り返すことによって達成できる。
【０１５１】
本発明の遺伝子治療方法は、前述するセンス・オリゴヌクレオチド導入用の材料（センス・オリゴヌクレオチド導入用ベクター）を直接体内に投与するインビボ（in vivo）法と、患者の体内より一旦標的とする細胞を取り出して体外で遺伝子を導入して、その後、該細胞を体内に戻すエクスビボ（ex vivo）法の両方の方法を包含する。
【０１５２】
またＫ１のセンス・オリゴヌクレオチドを直接細胞内に導入する遺伝子治療も可能である。
【０１５３】
後述する、本発明Ｋ１に対応する配列のセンス・オリゴヌクレオチド全部もしくはその断片を含有する遺伝子導入用ベクターおよび該ベクターによりヒトＫ１のセンス・オリゴヌクレオチドが導入された細胞を有効成分とする本発明の遺伝子治療剤は、特にＣ型肝炎患者をその利用対象とするものであるが、上記の遺伝子治療（処置）は、Ｃ型肝炎患者患者以外にも Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質に起因するＣ型肝炎合併症の治療をも目的として行うことができる。
【０１５４】
また、センス・オリゴヌクレオチドを導入する標的細胞は、遺伝子治療（処置）の対象により適宜選択することができる。例えば、標的細胞として、特に脳・神経組織、脳細胞、脳神経細胞の他、Ｋ１発現が認められる組織の細胞、心臓、胎盤、肺、肝臓、膵臓、脾臓、小腸、末梢血組織以外に、神経細胞、リンパ球、線維芽細胞、肝細胞、造血幹細胞、如き細胞などを挙げることができる。
【０１５５】
上記遺伝子治療におけるセンス・オリゴヌクレオチド導入方法には、ウイルス的導入方法および非ウイルス的導入方法が含まれる。
【０１５６】
ウイルス的導入方法としては、例えば、Ｋ１のセンス・オリゴヌクレオチドが正常細胞に発現する外来の物質であることに鑑みて、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる方法を挙げることができる。その他のウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、ＨＩＶ（human immunodeficiency virus）ベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ，adeno-associated virus）、ヘルペスウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターおよびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ，Epstein-Barr virus）ベクターなどがあげられる。
【０１５７】
非ウイルス的な遺伝子導入方法としては、リン酸カルシウム共沈法；ＤＮＡを封入したリポソームと予め紫外線で遺伝子を破壊した不活性化センダイウイルスを融合させて膜融合リポソームを作成し、細胞膜と直接融合させてＤＮＡを細胞内に導入する膜融合リポソーム法〔Kato,K.,et al., J. Biol. Chem., 266, 22071-22074 (1991)〕；プラスミドＤＮＡを金でコートして高圧放電によって物理的に細胞内にＤＮＡを導入する方法〔Yang,N.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 9568-9572 (1990)〕；プラスミドＤＮＡを直接インビボで臓器や腫瘍に注入するネイキッド（naked）ＤＮＡ法〔Wolff,J.A.,et al., Science, 247, 1465-1467 (1990)〕；多重膜正電荷リポソームに包埋した遺伝子を細胞に導入するカチオニック・リポソーム法〔八木国夫, 医学のあゆみ, Vol.175, No.9, 635-637 (1995)〕；特定細胞のみに遺伝子を導入し、他の細胞に入らないようにするために、目的とする細胞に発現するレセプターに結合するリガンドをＤＮＡと結合させてそれを投与するリガンド−ＤＮＡ複合体法〔Frindeis,et al., Trends Biotechnol., 11, 202 (1993); Miller,et al., FASEB J., 9, 190 (1995)〕などを使用することができる。
【０１５８】
上記リガンド−ＤＮＡ複合体法には、例えば肝細胞が発現するアシアロ糖蛋白レセプターをターゲットとしてアシアロ糖蛋白をリガンドとして用いる方法〔Wu, et al., J. Biol. Chem., 266, 14338 (1991); Ferkol,et al.,FASEB J., 7, 1081-1091 (1993)〕や、腫瘍細胞が強く発現しているトランスフェリン・レセプターを標的としてトランスフェリンをリガンドとして用いる方法〔Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 87,3410 (1990)〕などが含まれる。
【０１５９】
また本発明で用いられる遺伝子導入法は、上記の如き各種の生物学的および物理学的な遺伝子導入法を適宜組合せたものであってもよい。該組合せによる方法としては、例えばあるサイズのプラスミドＤＮＡをアデノウイルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン抱合抗体と組合わせる方法を例示できる。該方法によれば、得られる複合体がアデノウイルスベクターに結合し、かくして得られる三分子複合体を細胞に感染させることにより本発明センス・オリゴヌクレオチドの導入を行い得る。この方法では、アデノウイルスベクターにカップリングしたＤＮＡが損傷される前に、効率的な結合、内在化およびエンドソーム分解が可能となる。また、前記リポソーム／ＤＮＡ複合体は、直接インビボにて遺伝子導入を媒介できる。
【０１６０】
以下、具体的な本発明のセンス・オリゴヌクレオチド導入用ウイルスベクターの作成法並びに標的細胞または標的組織へのセンス・オリゴヌクレオチド導入法について述べる。
【０１６１】
レトロウイルスベクター・システムは、ウイルスベクターとヘルパー細胞（パッケージング細胞）からなっている。ここでヘルパー細胞は、レトロウイルスの構造蛋白質ｇａｇ（ウイルス粒子内の構造蛋白質）、ｐｏｌ（逆転写酵素）、ｅｎｖ（外被蛋白質）などの遺伝子を予め発現しているが、ウイルス粒子を生成していない細胞を言う。一方、ウイルスベクターは、パッケージングシグナルやＬＴＲ(long terminal repeats)を有しているが、ウイルス複製に必要なｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖなどの構造遺伝子を持っていない。パッケージング・シグナルはウイルス粒子のアセンブリーの際にタグとなる配列で、選択遺伝子（ｎｅｏ，ｈｙｇ）とクローニングサイトに組込まれた所望の導入センス・オリゴヌクレオチド（Ｋ１に対応する全センス・オリゴヌクレオチドまたはその断片）がウイルス遺伝子の代りに挿入される。ここで高力価のウイルス粒子を得るにはインサートを可能な限り短くし、パッケージングシグナルをｇａｇ遺伝子の一部を含め広くとることと、ｇａｇ遺伝子のＡＴＧを残さぬようにすることが重要である。
【０１６２】
所望のＫ１のセンス・オリゴヌクレオチドを組み込んだベクターＤＮＡをヘルパー細胞に移入することによって、ヘルパー細胞が作っているウイルス構造蛋白質によりベクターゲノムＲＮＡがパッケージされてウイルス粒子が形成され、分泌される。組換えウイルスとしてのウイルス粒子は、標的細胞に感染した後、ウイルスゲノムＲＮＡから逆転写されたＤＮＡが細胞核に組み込まれ、ベクター内に挿入されたセンス遺伝子が発現する。
【０１６３】
尚、所望の遺伝子の導入効率を上げる方法として、フイブロネクチンの細胞接着ドメインとヘパリン結合部位と接合セグメントとを含む断片を用いる方法〔Hanenberg,H.,et al., Exp.Hemat., 23, 747 (1995)〕を採用することもできる。
【０１６４】
なお、上記レトロウイルスベクター・システムにおいて用いられるベクターとしては、例えばマウスの白血病ウイルスを起源とするレトロウイルス〔McLachlin, J.R., et al., Proc. Natl. Acad. Res. Molec. Biol., 38, 91-135 (1990)〕を例示することができる。
【０１６５】
アデノウイルスベクターを利用する方法につき詳述すれば、該アデノウイルスベクターの作成は、バークネル〔Berkner,K.L., Curr.Topics Microbiol.Immunol., 158, 39-66 (1992)〕、瀬戸口康弘ら〔Setoguchi,Y.,et al., Blood, 84, 2946-2953 (1994)〕、鐘カ江裕美ら〔実験医学, 12,28-34 (1994)〕およびケナーら〔Ketner,G.,et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,USA., 91, 6186-6190 (1994)〕の方法に準じて行うことができる。
【０１６６】
例えば、非増殖性アデノウイルスベクターを作成するには、まずアデノウイルスの初期遺伝子のＥ１および／またはＥ３遺伝子領域を除去する。次に、目的とする所望の外来遺伝子発現単位（目的とする導入センス・オリゴヌクレオチド、即ち本発明Ｋ１のセンス・オリゴヌクレオチド、そのセンス・オリゴヌクレオチドを転写するためのプロモーター、転写された遺伝子の安定性を賦与するポリＡから構成）およびアデノウイルスゲノムＤＮＡの一部を含むプラスミドベクターと、アデノウイルスゲノムを含むプラスミドとを、例えば２９３細胞に同時にトランスフェクションする。この２者間で相同性組換えを起こさせて、遺伝子発現単位とＥ１とを置換することにより、所望のＫ１のセンス・オリゴヌクレオチドを包含する本発明ベクターである非増殖性アデノウイルスベクターを作成することができる。また、コスミドベクターにアデノウイルスゲノムＤＮＡを組み込んで、末端蛋白質を付加した３’側アデノウイルスベクターを作成することもできる。更に組換えアデノウイルスベクターの作成には、ＹＡＣベクターも利用可能である。
【０１６７】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの製造につき概略すると、ＡＡＶはアデノウイルスの培養系に混入してくる小型のウイルスとして発見された。これには、ウイルス複製にヘルパーウイルスを必要とせず宿主細胞内で自律的に増殖するパルボウイルス属と、ヘルパーウイルスを必要とするディペンドウイルス属の存在が確認されている。該ＡＡＶは宿主域が広く、種々の細胞に感染するありふれたウイルスであり、ウイルスゲノムは大きさが４６８０塩基の線状一本鎖ＤＮＡからなり、その両端の１４５塩基がＩＴＲ(inverted terminal repeat)と呼ばれる特徴的な配列を持って存在している。このＩＴＲの部分が複製開始点となり、プライマーの役割をなす。更にウイルス粒子へのパッケージングや宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組込みにも、該ＩＴＲが必須となる。また、ウイルス蛋白質に関しては、ゲノムの左半分が非構造蛋白質、即ち複製や転写をつかさどる調節蛋白質のＲｅｐをコードしている。
【０１６８】
組換えＡＡＶの作成は、ＡＡＶが染色体ＤＮＡに組み込まれる性質を利用して行うことができ、かくして所望の遺伝子導入用ベクターが作成できる。この方法は、より詳しくは、まず野生型ＡＡＶの５'と３'の両端のＩＴＲを残し、その間に所望の導入用センス・オリゴヌクレオチド（Ｋ１ センス・オリゴヌクレオチド）を挿入したプラスミド（ＡＡＶベクタープラスミド）を作成する。一方、ウイルス複製やウイルス粒子の形成に必要とされるウイルス蛋白質は、別のヘルパープラスミドにより供給させる。この両者の間には共通の塩基配列が存在しないようにし、遺伝子組換えによる野生型ウイルスが出現しないようにする必要がある。その後、両者のプラスミドを例えば２９３細胞へのトランスフェクションにより導入し、さらにヘルパーウイルスとしてアデノウイルス（２９３細胞を用いる場合は非増殖型のものでもよい）を感染させると、非増殖性の所望の組換えＡＡＶが産生される。続いて、この組換えＡＡＶは核内に存在するので、細胞を凍結融解して回収し、混入するアデノウイルスを５６℃加熱により失活させる。更に必要に応じて塩化セシウムを用いる超遠心法により組換えＡＡＶを分離濃縮する。上記のようにして所望の遺伝子導入用の組換えＡＡＶを得ることができる。
【０１６９】
ＥＢＶベクターの製造は、例えば清水らの方法に準じて行うことができる〔清水則夫、細胞工学, 14(3), 280-287 (1995)〕。
【０１７０】
本発明のセンス・オリゴヌクレオチド導入用ＥＢＶベクターの製造につき概略すると、ＥＢウイルス（Epstein-Barr virus: EBV）は、エプスタイン(Epstein)らによりバーキット（Burkitt）リンパ腫由来の培養細胞より分離されたヘルペス科に属するウイルスである〔Kieff, E. and Liebowitz, D.: Virology, 2nd ed. Raven Press, New York, 1990, pp.1889-1920〕。該ＥＢＶには細胞をトランスフォームする活性があるので、遺伝子導入用ベクターとするためには、このトランスフォーム活性を欠いたウイルスを調製しなければならない。これは次の如くして実施できる。
【０１７１】
即ち、まず、所望の外来遺伝子を組み込む標的ＤＮＡ近傍のＥＢＶゲノムをクローニングする。そこに外来遺伝子のＤＮＡ断片と薬剤耐性遺伝子を組込み、組換えウイルス作製用ベクターとする。次いで適当な制限酵素により切り出された組換えウイルス作製用ベクターをＥＢＶ陽性Ａｋａｔａ細胞にトランスフェクトする。相同組換えにより生じた組換えウイルスは抗表面免疫グロブリン処理によるウイルス産生刺激により野生型ＡｋａｔａＥＢＶとともに回収できる。これをＥＢＶ陰性Ａｋａｔａ細胞に感染し、薬剤存在下で耐性株を選択することにより、野生型ＥＢＶが共存しない所望の組換えウイルスのみが感染したＡｋａｔａ細胞を得ることができる。さらに組換えウイルス感染Ａｋａｔａ細胞にウイルス活性を誘導することにより、目的とする大量の組換えウイルスベクターを産生することができる。
【０１７２】
組換えウイルスベクターを用いることなく所望のセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に導入する、非ウイルスベクターの製造は、例えば膜融合リポソームによる遺伝子導入法により実施することができる。これは膜リポソーム（脂質二重膜からなる小胞）に細胞膜への融合活性をもたせることにより、リポソームの内容物を直接細胞内に導入する方法である。
【０１７３】
上記膜融合リポソームによるセンス・オリゴヌクレオチドの導入は、例えば中西らの方法によって行うことができる〔Nakanishi,M.,et al.,Exp.Cell Res., 159, 399-499 (1985); Nakanishi,M.,et al., Gene introduction into animal tissues.In Trends and Future Perspectives in Peptide and Protein Drug Delivery (ed. by Lee, V.H. et al.)., Harwood Academic Publishers Gmbh. Amsterdam, 1995, pp.337-349〕。
【０１７４】
以下、該膜融合リポソームによるセンス・オリゴヌクレオチドの導入法につき概略する。即ち、紫外線で遺伝子を不活性化したセンダイウイルスと所望のセンス・オリゴヌクレオチドや発現蛋白質などの高分子物質を封入したリポソームを３７℃で融合させる。この膜融合リポソームは、内側にリポソーム由来の空洞を、外側にウイルス・エンベロープと同じスパイクがある疑似ウイルスともよばれる構造を有している。更にショ糖密度勾配遠心法で精製後、標的とする培養細胞または組織細胞に対して膜融合リポソームを４℃で吸着させる。次いで３７℃にするとリポソームの内容物が細胞に導入され、所望のセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に導入できる。ここでリポソームとして用いられる脂質としては、５０％(モル比）コレステロールとレシチンおよび陰電荷をもつ合成リン脂質で、直径３００ｎｍの１枚膜リポソームを作製して使用するのが好ましい。
【０１７５】
また、別のリポソームを用いてセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に導入する方法としては、カチオニック・リポソームによるセンス・オリゴヌクレオチド導入法を挙げることができる。該方法は、八木らの方法に準じて実施できる〔Yagi,K.,et al., B.B.R.C., 196, 1042-1048 (1993)〕。この方法は、プラスミドも細胞も負に荷電していることに着目して、リポソーム膜の内外両面に正の電荷を与え、静電気によりプラスミドの取り込みを増加させ、細胞との相互作用を高めようとするものである。ここで用いられるリポソームは正荷電を有する多重膜の大きなリポソーム（multilamellar large vesicles: ＭＬＶ）が有用であるが、大きな１枚膜リポソーム（large unilamellar vesicles: ＬＵＶ）や小さな１枚膜リポソーム（small unilamellar vesicles: ＳＵＶ）を使用してプラスミドとの複合体を作製し、所望のセンス・オリゴヌクレオチドを導入することも可能である。
【０１７６】
プラスミド包埋カチオニックＭＬＶの調製法について概略すると、これはまず脂質ＴＭＡＧ（N-(α-trimethylammonioacetyl)-didodecyl-D-glutamate chloride）、ＤＬＰＣ（dilauroyl phosphatidylcholine）およびＤＯＰＥ（dioleoyl phosphatidylethanolamine）をモル比が１：２：２となる割合で含むクロロホルム溶液（脂質濃度として１ｍＭ）を調製する。次いで総量１μモルの脂質をスピッツ型試験管に入れ、ロータリーエバポレーターでクロロホルムを減圧除去して脂質薄膜を調製する。更に減圧下にクロロホルムを完全に除去し、乾燥させる。次いで２０μgの遺伝子導入用プラスミドを含む０．５mlのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩液−Ｍｇ，Ｃａ含有を添加し、窒素ガス置換後、２分間ボルテックスミキサーにより攪袢して、所望のセンス・オリゴヌクレオチドを含有するプラスミド包埋カチオニックＭＬＶ懸濁液を得ることができる。
【０１７７】
上記で得られたプラスミド包埋カチオニックＭＬＶを遺伝子治療剤として使用する一例としては、例えば発現目的センス・オリゴヌクレオチドを組み込んだ発現プラスミドを上記カチオニックＭＬＶにＤＮＡ量として０．６μg、リポソーム脂質量として３０nモルになるように包埋し、これを２μlのリン酸緩衝生理食塩液に懸濁させて患者より抽出した標的細胞または患者組織に対して隔日投与する方法が例示できる。
【０１７８】
本発明の遺伝子治療において、所望遺伝子の標的細胞または標的組織への導入方法には、代表的には２種類の方法が含まれる。
【０１７９】
その第１法は、治療対象とする患者から標的細胞を採取した後、該細胞を体外で例えばインターロイキン−２(ＩＬ−２)などの添加の下で培養し、レトロウイルスベクターに含まれる目的とするＫ１のセンス・オリゴヌクレオチドを導入した後、得られる細胞を再移植する手法(ex vivo法)である。該方法はＡＤＡ欠損症を始め、欠陥遺伝子によって発生する遺伝子病や動脈硬化症、癌、ＡＩＤＳなどの治療に好適であると報告されている。
【０１８０】
第２法は、目的センス・オリゴヌクレオチド（Ｋ１のセンス・オリゴヌクレオチド）を直接患者の肝臓内や門脈内、血管組織などの標的部位に注入する遺伝子直接導入法(直接法)である。
【０１８１】
上記遺伝子治療の第１法は、より詳しくは、例えば次のようにして実施される。即ち、患者から採取した単核細胞を血液分離装置を用いて単球から分取し、分取細胞をＩＬ−２の存在下にＡＩＭ−Ｖ培地などの適当な培地で７２時間程度培養し、導入すべきセンス・オリゴヌクレオチド（Ｋ１のセンス・オリゴヌクレオチド）を含有するベクターを加える。 センス・オリゴヌクレオチドの導入効率をあげるために、プロタミン存在下に３２℃で１時間、2500回転にて遠心分離した後、３７℃で１０％炭酸ガス条件下で２４時間培養してもよい。この操作を数回繰り返した後、更にＩＬ−２存在下にＡＩＭ−Ｖ培地などで４８時間培養し、細胞を生理食塩水で洗浄し、生細胞数を算定し、センス・オリゴヌクレオチド導入効率を前記in situ ＰＣＲや、例えば所望の対象が本発明のようにＫ１活性(例えば、転写活性)であればその活性の程度を測定することにより、目的センス・オリゴヌクレオチド導入効果を確認する。
【０１８２】
活性の程度は、後記実施例で示されるようにイン・ビトロでのルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写活性化の程度によって確認することが可能である。
【０１８３】
また、培養細胞中の細菌・真菌培養、マイコプラズマの感染の有無、エンドトキシンの検索などの安全度のチェックを行い、安全性を確認した後、予測される効果用量のセンス・オリゴヌクレオチド（Ｋ１のセンス・オリゴヌクレオチド）が導入された培養細胞を患者に点滴静注により戻す。かかる方法を例えば数週間から数カ月間隔で繰り返することにより遺伝子治療が施される。
【０１８４】
ここでウイルスベクターの投与量は、導入する標的細胞により適宜選択される。通常、ウイルス価として、例えば標的細胞 １×１０⁸細胞に対して１×１０³ｃｆｕから１×１０⁸ｃｆｕの範囲となる投与量を採用することが好ましい。
【０１８５】
上記第１法の別法として、目的センス・オリゴヌクレオチド（Ｋ１のセンス・オリゴヌクレオチド）を含有するレトロウイルスベクターを含有するウイルス産生細胞と例えば患者の細胞とを共培養して、目的とする細胞へセンス・オリゴヌクレオチド（Ｋ１のセンス・オリゴヌクレオチド）を導入する方法を採用することもできる。
【０１８６】
遺伝子治療の第２法（直接法）の実施に当たっては、特に体外における予備実験によって、遺伝子導入法によって、実際に目的センス・オリゴヌクレオチド（Ｋ１のセンス・オリゴヌクレオチド）が導入されるか否かを、予めベクター遺伝子ｃＤＮＡのＰＣＲ法による検索やイン・サイツゥＰＣＲ法によって確認するか、あるいは目的センス・オリゴヌクレオチド（Ｋ１のセンス・オリゴヌクレオチド）の導入に基づく所望の治療効果である特異的活性の上昇や標的細胞の増殖増加や増殖抑制などを確認することが望ましい。また、ウイルスベクターを用いる場合は、増殖性レトロウイルスなどの検索をＰＣＲ法で行うか、逆転写酵素活性を測定するか、あるいは膜蛋白(env)遺伝子をＰＣＲ法でモニターするなどにより、遺伝子治療に際してセンス・オリゴヌクレオチド導入による安全性を確認することが重要であることはいうまでもない。
【０１８７】
本発明遺伝子治療法において、特にＣ型肝炎患者またはＣ型肝炎合併症を対象とする場合は、患者から例えば末梢血細胞(Ｋ１発現細胞)を採取後、酵素処理などを施して培養細胞を樹立した後、例えばレトロウイルスにて所望のセンス・オリゴヌクレオチドを標的とする末梢血細胞(Ｋ１発現細胞)に導入し、Ｇ４１８細胞にてスクリーニングした後、ＩＬ−１２などの発現量を測定(in vivo)測定し、次いで放射線処理を施行し、患者末梢血や肝臓、門脈内に接種するＣ型肝炎およびその合併症治療の癌化予防法または治療法を一例として挙げることができる。
【０１８８】
本発明はまた、本発明のセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターまたは目的センス・オリゴヌクレオチド（Ｋ１のセンス・オリゴヌクレオチドど）が導入された細胞を活性成分とし、それを薬学的有効量、適当な無毒性医薬担体ないしは希釈剤と共に含有する医薬組成物または医薬製剤（遺伝子治療剤）を提供する。
【０１８９】
本発明の医薬組成物（医薬製剤）に利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤ないし賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用できる。
【０１９０】
例えば、本発明のセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターを含む医薬製剤は、該ベクターをリポソームに包埋された形態あるいは所望のセンス・オリゴヌクレオチドが包含されるレトロウイルスベクターを含むウイルスによって感染された培養細胞の形態に調製される。
【０１９１】
これらは、リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合した形態などに調製することもでき、またプロタミンなどの遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調製することもできる。
【０１９２】
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。
【０１９３】
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。
【０１９４】
一般には、医薬製剤としての所望センス・オリゴヌクレオチド含有レトロウイルスベクターの投与量は、１日当り体重１ｋｇ当り、例えばレトロウイルスの力価として約１×１０³ｐｆｕから１×１０¹⁵ｐｆｕ程度とするのがよい。
【０１９５】
また所望の導入用センス・オリゴヌクレオチドが導入された細胞の場合は、１×１０⁴細胞／bodyから１×１０¹⁵細胞／body程度の範囲から選ばれるのが適当である。
【０１９６】
該製剤は１日に１回または数回に分けて投与することもでき、１から数週間間隔で間欠的に投与することもできる。尚、好ましくは、プロタミンなど遺伝子導入効率を高める物質またはこれを含む製剤と併用投与することができる。
【０１９７】
本発明に従う遺伝子治療をＣ型肝炎の癌化予防または治療に適用する場合は、前記した種々の遺伝子治療を適宜組合わせて行う（結合遺伝子治療）こともでき、前記した遺伝子治療に、従来のインターフェロンなどの抗ウイルス剤、食事療法などを組合わせて行うこともできる。さらに本発明遺伝子治療は、その安全性を含めて、ＮＩＨのガイドラインを参考にして実施することができる〔Recombinant DNA Advisory Committee, Human Gene Therapy, 4, 365-389 (1993)〕。
【０１９８】
また本発明によれば、Ｋ１遺伝子の存在を検出するために、血液または血清のごとき生物学的試料を調製し、所望により核酸を抽出し、Ｋ１遺伝子が存在する否かについて分析することが可能である。 該検出方法は、例えば、Ｋ１ＤＮＡ断片を作成し、Ｋ１遺伝子のスクリーニングおよび／またはその増幅に用いられるように設計される。より具体的には、例えばプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノーザンブロット法などにおけるプローブとしての性質を有するもの、核酸配列をポリメラーゼで増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、増幅したＫ１の全部または一部のＤＮＡ断片を得ることができるためのプローブとしての性質を有するものを作成できる。そのためにはまずＫ１と同じ配列を持つプライマーを作成し、スクリーニング用プローブとして用い、生物学的試料（核酸試料）と反応させることにより、当該Ｋ１配列を有する遺伝子の存在を確認することができる。該核酸試料は、標的配列の検出を容易にする種々の方法、例えば変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッティングで調製してもよい。
【０１９９】
前記スクリーニング方法としては、特にＰＣＲ法を用いるのが感度の点から好ましく、該方法は、Ｋ１断片をプライマーとして用いる方法であればとくに制限されず、従来公知の方法(Science, 230, 1350-1354(1985))や新たに開発された、或いは将来使用されるＰＣＲ変法(榊 佳之、ほか編、羊土社、実験医学、増刊, 8(9)(1990); 蛋白質・核酸・酵素、臨時増刊、共立出版(株), 35(17)(1990))のいずれも利用することが可能である。
【０２００】
プライマーとして使用されるＤＮＡ断片は、化学合成したオリゴＤＮＡであり、これらオリゴＤＮＡの合成は自動ＤＮＡ合成装置など、例えばＤＮＡ合成装置(PharmaciaLKB Gene Assembler Plus: ファルマシア社製)を使用して合成することができる。合成されるプライマー(センスプライマーまたはアンチセンスプライマー)の長さは約１０〜３０ヌクレオチド程度が好ましく例示できる。上記スクリーニングに用いられるプローブは、通常は標識したプローブを用いるが、非標識であってもよく、直接的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合によって検出してもよい。適当な標識、並びにプローブおよびリガンドを標識する方法は、本発明の技術分野で知られており、ニック・トランスレーション、ランダム・プライミングムまたはキナーゼ処理のような、既知の方法によって取り込ませることができる放射性標識、ビオチン、蛍光性基、化学発光基、酵素、抗体などがこれらの技術に包含される。
【０２０１】
検出のために用いるＰＣＲ法としては、例えばＲＴ−ＰＣＲ法が例示されるが、当該分野で用いられる種々の変法を適応することができる。
【０２０２】
さらに本発明のＫ１遺伝子の利用において、Ｋ１遺伝子の発現レベルやＫ１遺伝子のポリモルフィズム（多型：個人差）を調べることにより（K１の遺伝子診断）、Ｃ型肝炎による癌化の予測を行い、薬剤の選択を始めとする治療法の選択のための診断・分析（より副作用の少ない治療法の選択を促す）に有用である。
【０２０３】
一般に、ヒトの薬物代謝には、大きな個人差があることが知られているが、この個人差を判定することは、ヒトに投与される薬物による副作用の軽減や、負っている疾患の治療法の選択のために有用である。
【０２０４】
近年、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法やＲＦＬＰ法などによる遺伝子の多型を診断することにより、患者の体質を診断する遺伝子診断が注目されている。肝臓は、薬物代謝において、最も重要な臓器であり、多くの薬物代謝酵素が存在するが、これら薬物代謝酵素の発現は、肝細胞に存在する転写因子によって制御されていることが知られている。
【０２０５】
本発明者らは、後記実施例に示されるようにＫ１遺伝子が、肝臓特異的な発現をしており、肝臓の代謝酵素のプロモーター（転写発現制御部位）に良く見られるＣＲＥ(cAMP resposible element)や、肝臓の代謝酵素アルコールデヒドロゲナーゼのプロモーターに見られるｂｏｘ−Ｂに結合し、転写を活性化することを見い出した。
【０２０６】
これらの事実は、Ｋ１が肝臓の薬剤代謝酵素の発現を制御していると考えられ、例えばＫ１遺伝子の発現レベルやK１遺伝子のポリモルフィズム（多型：個人差）の分析を行なうことにより（K１の遺伝子診断）、転写因子K１の転写標的遺伝子である薬物代謝酵素の発現レベルを予測し、患者の薬物に対する代謝体質診断に利用することができる。
【０２０７】
また、転写因子Ｋ１の転写活性化能を利用し、薬物代謝酵素に関与するプロモーターを検索し、ポリモルフィズムを同定する手段に用いることができる。このようにして見出される薬物代謝酵素のプロモーターのポリモルフィズムを遺伝子解析するすることにより、薬物代謝酵素の発現レベルを予測し、また患者の薬物に対する代謝体質診断に役立てることができる。
【０２０８】
本発明は、具体的には、ａ）生理的条件下において、転写活性を促進するために被検物質を処理するのに十分な時間の間、Ｃ型肝炎コアタンパクの存在下において本発明の遺伝子発現産物に対して被検物質を提示させる工程、
ｂ）被検物質の存在下の活性に対する比較において、遺伝子発現産物の転写活性を促進を検出し、そしてＣ型肝炎コアタンパクの癌化を抑制する化合物の被検物質の存在を特定する工程を含む、
本発明の遺伝子または遺伝子発現産物およびポリペプチドを用い、本発明の遺伝子または遺伝子発現産物、及びポリペプチドの転写活性を促進する候補化合物をスクリーニングする、転写活性を促進する候補化合物のスクリーニング方法を提供するものである。
【０２０９】
本発明における被検物質としては、低分子化合物、高分子化合物、蛋白質、酵素、抗体等が例示できる。また、候補化合物とは、本発明の遺伝子発現産物の転写活性に対して影響を与える上記被検物質を意味する。
【０２１０】
また、本発明によれば、ａ）被検物質を本発明の遺伝子発現産物に対して被検物質を反応させる工程、
ｂ）被検物質の存在下の転写活性に対する比較において、本発明の遺伝子発現産物の転写活性を促進作用によって、そして被検物質の遺伝子発現レベルが上昇される代謝酵素の存在を特定する工程を含む、
本発明の遺伝子または遺伝子発現産物およびポリペプチドを用い、本発明の遺伝子または遺伝子発現産物、及びポリペプチドの転写活性促進作用によって、遺伝子発現レベルが上昇される候補代謝酵素をスクリーニングする候補代謝酵素のスクリーニング方法が提供できる。該方法においては、被検物質とは、例えば、下記に示すような代謝酵素を意味する。
【０２１１】
従って、本発明によれば、本発明の遺伝子の有する転写因子Ｋ１の薬物代謝酵素に関与するプロモーター転写活性化能を利用し、その作用の影響を受けて薬物代謝酵素の発現レベルの上昇する候補薬物代謝酵素のスクリーニングを行なうことができる。これら候補薬物代謝酵素としては、例えば、シトクローム(CYP)、エポキシヒドロラーゼ(HPHX)、メチル転移酵素(MT)、グルタチオンＳ−転移酵素(GST)、Ｎ−アセチル転移酵素(NAT)、硫酸転移酵素(ST)、ＵＤＰ−グリコシル転移酵素(UGT)、アルデヒド脱水素酵素(ALDH)、アルコール脱水素酵素(ADH)、キノン酸化還元酵素(NQO)、エステラーゼ、およびＡＴＰ結合カセット(Ｐ糖タンパク、多剤耐性タンパク)などの酵素およびそれらの分子種の酵素、例えばシトクローム(CYP)の分子種としては、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ａ７、ＣＹＰ２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ３、ＣＹＰ２Ｃ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｄ７ＡＰ、ＣＹＰ２Ｄ８Ｐ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｆ１、ＣＹＰ３Ａ３、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ５Ｐ１、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ１１Ｂ２、およびＣＹＰ２７などを例示できる。
【０２１２】
また、本発明の測定方法は、試料中のＫ１遺伝子の検出のための試薬キットを利用することによって、簡便に実施することができる。
【０２１３】
故に本発明は上記Ｋ１ ＤＮＡ断片を含有することを特徴とするＫ１の検出用試薬キットが提供される。
【０２１４】
該試薬キットは、少なくとも配列番号：２に示される塩基配列もしくはその相補的塩基配列の一部または全てにハイブリダイズするＤＮＡ断片を必須構成成分として含んでいれば、他の成分として、標識剤、ＰＣＲ法に必須な試薬（例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、プライマーなど）が含まれていてもよい。
【０２１５】
また、上記Ｋ１遺伝子のポリモルフィズムの測定の場合は、解析対象となるＫ１の多型の配列の変化の中に制限酵素断片の長さに変化をもたらすような多型(切断に用いた制限酵素の認識の配列変化、あるいはかなりの長さの挿入または欠失)である場合は、ＲＦＬＰ法による測定が好ましく例示される。しかしながら、このようなＤＮＡ多型はほんの一部のみであるため、多型の配列の変化の中に制限酵素断片の長さに変化をもたらすような配列がない場合は、多型のある遺伝子の近傍のＤＮＡ配列情報に基づいてプライマーを作成するＰＣＲ−ＳＳＣＰ法の適応を好ましく例示できる。
【０２１６】
標識剤としては、放射性同位元素または蛍光物質などの化学修飾物質などが挙げられるが、ＤＮＡ断片自身が予め該標識剤でコンジュゲートされていてもよい。更に当該試薬キットには、測定の実施の便益のために適当な反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤、反応停止液などが含まれていてもよい。
【０２１７】
更に、本発明は、前記測定方法を用いるＫ１遺伝子の多型検出方法および該方法に用いる診断剤並びに診断用キットをも提供するものである。
【０２１８】
また、前記方法を用いることにより、被検試料中から得られたＫ１配列を直接的若しくは間接的に配列決定することにより、野生型Ｋ１と相同性の高い相同物である新たなＫ１遺伝子に関連する関連遺伝子を見出すことができる。
【０２１９】
従って、本発明はかかる測定と被検試料中のＫ１ ＤＮＡの配列決定により、被検試料中のヒトＫ１遺伝子に関連する関連遺伝子のスクリーニング方法をも提供するものである。
【０２２０】
また、本発明の配列番号：１で示されるヒトＫ１遺伝子でコードされる蛋白質、または該配列番号：１において、１もしくは数個乃至複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、またはこれらの断片から蛋白質を合成し、もしくは該蛋白質に対する抗体を合成することによって、野生型Ｋ１および／または変異Ｋ１の測定が可能となる。
【０２２１】
従って、本発明は、野生型Ｋ１および／または変異Ｋ１の抗体測定法、抗原測定法を提供するものである。かかる変化は、この分野における前記慣用技術によるＫ１配列分析によっても決定できるが、更に好ましくは、抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル抗体)を用いて、Ｋ１蛋白質中の相違、またはＫ１蛋白質の有無を検出することができる。本発明の測定法の具体的な例示としては、Ｋ１抗体は、血液・血清などのヒトより採取した生体材料試料含有溶液からＫ１蛋白質を免疫沈降し、かつポリアクリルアミドゲルのウェスタン・ブロットまたはイムノブロット上でＫ１蛋白質と反応することができる。また、Ｋ１抗体は免疫組織化学的技術を用いてパラフィンまたは凍結組織切片中のＫ１蛋白質を検出することができる。
【０２２２】
抗体産生技術および精製する技術は当該分野においてよく知られているので、これらの技術を適宜選択することができる。
【０２２３】
野生型Ｋ１またはその突然変異体を検出する方法に関連するより好ましい具体例には、モノクローナル抗体および／または、ポリクローナル抗体を用いるサンドイッチ法を含む、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ＥＬＩＳＡ)、放射線免疫検定法(ＲＩＡ)、免疫放射線検定法(ＩＲＭＡ)、および免疫酵素法(ＩＥＭＡ)が含まれる。
【０２２４】
また、本発明は、Ｋ１蛋白に対するＫ１結合活性を有する細胞膜画分または細胞表面上に存在するＫ１レセプターをも提供することが可能である。該Ｋ１レセプターの取得は、細胞膜画分を含む生体材料試料中において標識したＫ１蛋白をコンジュゲートさせ、Ｋ１結合反応物を抽出・単離、精製し、単離物のアミノ酸配列を特定することによって達成され、該Ｋ１レセプター蛋白の取得並びに配列決定は、この分野の当業者には容易に達成できる。
【０２２５】
また本発明は、Ｋ１レセプター蛋白質またはその結合断片を種々の薬剤のいずれかをスクリーニングする技術に用いることによって、化合物(Ｋ１レセプター反応物：化合物は低分子化合物、高分子化合物、蛋白質、蛋白質部分断片、抗原、または抗体など言う)をスクリーニングすることに利用可能である。好ましくは、Ｋ１レセプターを利用する。かかるスクリーニング試験に用いるＫ１レセプターポリペプチドまたはその断片は、固体支持体に付着するか、または細胞表面に運ばれている溶液中の遊離物であってもよい。
【０２２６】
薬剤スクリーニングの一例としては、例えば、Ｋ１蛋白質またはその断片を発現する組換え蛋白質で安定して形質転換した原核生物または真核生物の宿主細胞を、好ましくは競合的結合アッセイにおいて利用することができる。また遊離のまたは固定した形態のかかる細胞を標準結合アッセイに用いることもできる。より具体的には、Ｋ１レセプター蛋白質またはその断片と、試験する物質との間の複合体の形成を測定し、Ｋ１レセプター蛋白質またはその断片とＫ１蛋白質またはその断片との間の複合体の形成が試験する物質によって阻害される程度を検出することによって化合物をスクリーニングすることが可能である。
【０２２７】
かくして、本発明は、当該分野で既知の方法によって、かかる物質とＫ１レセプター蛋白質またはその断片とを接触させ、次いで、該物質とＫ１レセプター蛋白質またはその断片との間の複合体の存在、またはＫ１レセプター蛋白質またはその断片とリガンドとの間の複合体の存在について測定することを特徴とする薬剤のスクリーニング方法を提供することができる。さらに、Ｋ１レセプター活性を測定して、かかる物質がＫ１レセプターを阻害でき、かくして上記定義されたＫ１の活性、例えば、遺伝子の転写を促進する作用、あるいはｃＡＭＰ応答エレメントまたはｂｏｘ−Ｂ配列の結合させた後、該ｃＡＭＰ応答エレメントまたはｂｏｘ−Ｂ配列と結合した遺伝子産物を転写活性化を促進させる作用などの作用を調節できるかどうか、或いは蛋白−蛋白相互結合の調節または複合体形成能の調節ができるかどうか判断する。かかる競合結合アッセイにおいて、より具体的には、Ｋ１レセプター蛋白質またはその断片を標識する。遊離のＫ１レセプター蛋白質またはその断片を、蛋白質：蛋白質複合体で存在するものから分離し、遊離（複合体未形成）標識の量は、各々、試験される因子のＫ１レセプターに対する結合またはＫ１レセプター：Ｋ１蛋白質結合の阻害の尺度となる。Ｋ１蛋白質の小さなペプチド(ペプチド疑似体)をこのように分析し、Ｋ１レセプター阻害活性を有するものを測定できる(後記ｂ)。
【０２２８】
本発明において、薬剤スクリーニングのための他の方法は、Ｋ１レセプター蛋白質に対して適当な結合親和性を有する化合物についてのスクリーニング法であって、該略すると、多数の異なるペプチド試験化合物をプラスチックのピンまたは他の物質の表面のごとき固体支持体上で合成し、次いでペプチド試験化合物をＫ１レセプター蛋白質と反応させ、洗浄する。次いで既知の方法を用いて反応結合Ｋ１レセプター蛋白質を検出する方法も例示できる（ＰＣＴ特許公開番号：ＷＯ８４−０３５６４号）。精製されたＫ１レセプターは、直接、前記の薬剤スクリーニング技術で使用するプレート上に被覆することができる。しかしながら、ポリペプチドに対する非−中和抗体を用いて抗体を補足し、Ｋ１レセプター蛋白質を固相上に固定することができる。さらに本発明は、競合薬剤スクリーニングアッセイの使用をも目的とし、Ｋ１レセプター蛋白質またはその断片に対する結合性につき、Ｋ１レセプター蛋白質に特異的に結合できる中和抗体と試験化合物とを競合させる。抗体による該競合によって、Ｋ１レセプター蛋白質の１またはそれ以上の抗原決定部位を有するいずれのペプチドの存在をも検出することが可能である。
【０２２９】
また、本発明のＫ１活性を阻害する薬剤の候補化合物をスクリーニングする方法において、例えば、Ｋ１遺伝子発現産物またはＫ１蛋白質(以下、Ｋ１蛋白質と併せて称する)、またはそれらの断片に対する抗体と、被検液および標識化されたＫ１蛋白質、Ｋ１蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたＫ１蛋白質、Ｋ１蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩の割合を測定することを特徴とする被検液中のＫ１蛋白質、Ｋ１蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩を定量するスクリーニング方法も可能である(後記(ｂ))。
【０２３０】
また被検液と担体上に不溶化した前記抗体および標識化された別の異なるＫ１蛋白質に対する抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のＫ１蛋白質、Ｋ１蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩の定量法も可能である。
【０２３１】
さらに、Ｋ１蛋白質、Ｋ１蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩に基質を接触させた場合とＫ１蛋白質、Ｋ１蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩に基質および試験化合物を接触させた場合における、Ｋ１蛋白質、Ｋ１蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩の活性を測定して、比較することによってＫ１蛋白質またはその塩の活性（例、Ｋ１活性）を阻害する化合物またはその塩をスクリーニングすることも可能である(後記(d))。
【０２３２】
本発明によれば、Ｋ１ポリペプチドまたはＫ１遺伝子発現産物の機能を刺激または抑制する化合物を同定するためのスクリーニング法であって、(a) 候補化合物と、該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物（または該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物を担持している細胞もしくはその膜）またはその融合タンパク質との結合を、該候補化合物に直接または間接的に結合させた標識により測定する方法、(b) 候補化合物と、該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物（または該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物を担持している細胞もしくはその膜）またはその融合タンパク質との結合を、標識競合物質(Ｋ１抗体またはＫ１レセプター)の存在下で測定する方法、(c) 候補化合物が該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物の活性化または抑制により生ずるシグナルをもたらすか否かを、該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物を担持している細胞または細胞膜に適した検出系を用いて調べる方法、(d) 候補化合物と、配列番号１に示されるアミノ酸配列のポリペプチドまたは遺伝子発現産物を含有する溶液とを同時に混合して混合物を調製し、該混合物中の該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物の活性を測定し、該混合物の活性をスタンダードと比較する方法、および(e) 候補化合物が細胞における該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡおよび該ポリペプチドの産生に及ぼす効果を検出する方法よりなる群から選択される方法を含んでなるスクリーニング法が提供される。
【０２３３】
また、薬剤スクリーニングに関し、さらなる方法としては、非機能性Ｋ１遺伝子を含有する宿主真核細胞系または細胞の使用が挙げられる。宿主細胞系または細胞を薬剤化合物の存在下において一定期間増殖させた後、該宿主細胞の増殖速度を測定して、該化合物が例えば、細胞の成長を調節できるかどうか、或いは蛋白−蛋白相互結合の調節または複合体形成能の調節できるかどうかを確認する。増殖速度を測定する１手段として、Ｋ１レセプターの生物活性を測定することも可能である。
【０２３４】
また本発明によれば、より活性または安定した形態のＫ１蛋白質誘導体または例えば、イン・ビボ(in vivo)でＫ１蛋白質の機能を高めるかもしくは妨害する薬剤を開発するために、それらが相互作用する目的の生物学的に活性な蛋白質または構造アナログ、例えばＫ１アゴニスト、Ｋ１アンタゴニスト、Ｋ１インヒビターなどを作製することが可能である。前記構造アナログは例えばＫ１と他の蛋白質の複合体の三次元構造をＸ線結晶学、コンピューター・モデリングまたは、これらの組み合わせた方法によって決定することができる。また、構造アナログの構造に関する情報は、相同性蛋白質の構造に基づく蛋白質のモデリングによって得ることも可能である。
【０２３５】
また上記より活性または安定した形態のＫ１蛋白質誘導体を得る方法としては、例えばアラニン・スキャンによって分析することが可能である。該方法はアミノ酸残基をアラニンで置換し、ペプチドの活性に対するその影響を測定する方法でペプチドの各アミノ酸残基をこのように分析し、当該ペプチドの活性や安定性に重要な領域を決定する方法である。該方法によって、より活性な、または安定なＫ１誘導体を設計することができる。
【０２３６】
また機能性アッセイによって選択した標的−特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造を解析することも可能である。原則として、このアプローチにより、続く薬剤の設計の基本となるファーマコア(pharmacore)を得る。機能性の薬理学的に活性な抗体に対する抗−イディオタイプ抗体を生成させることによって、化学的または生物学的に生成したペプチドのバンクよりペプチドを同定したり単離したりすることが可能である。故に選択されたペプチドもファーマコアとして作用すると予測される。
【０２３７】
このようにして、改善されたＫ１活性もしくは安定性またはＫ１活性のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニストなどとしての作用を有する薬剤を設計・開発することができる。
【０２３８】
かくして上記に例示した薬剤スクリーニング方法のいずれかを用いて、所望のＫ１タンパクとＣ型肝炎コアタンパクとの相互作用を阻害するような候補化合物を合成し、その化合物を用いて更にＣ型肝炎コアタンパクの癌化への作用を打ち消すことが可能な候補化合物を選択することができる。
【０２３９】
また、本発明のＫ１タンパクとＣ型肝炎コアタンパクとの相互作用を指標として候補物を上記いずれかのスクリーニング方法を用いてスクリーニングすることにより、Ｃ型肝炎コアタンパクの癌化作用を打ち消す作用のある候補物のスクリーニングに用いることができる。
【０２４０】
また本発明によれば、Ｋ１遺伝子含有ノックアウト・マウス(変異マウス)を作成することによってＫ１遺伝子配列のどの部位が生体内で上記したような多様なＫ１活性に影響を与えるかどうか、即ちＫ１遺伝子産物、並びに改変Ｋ１遺伝子産物が生体内でどのような機能を有するかを確認することができる。
【０２４１】
該方法は、遺伝子の相同組換えを利用して、生物の遺伝情報を意図的に修飾する技術であり、マウスの胚性幹細胞(ＥＳ細胞)を用いた方法を例示できる（Capeccchi, M. R., Science, 244, 1288-1292 (1989))。
【０２４２】
尚、上記変異マウスの作製方法はこの分野の当業者にとって既に通常の技術であり、この改変技術(野田哲生編、実験医学,増刊, 14 (20) (1996)、羊土社)に、本発明のヒト野生型Ｋ１遺伝子および変異Ｋ１遺伝子を適応して容易に変異マウスを作製し得る。従って前記技術の適応により、改善されたＫ１活性もしくは安定性またはＫ１活性のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニストなどとしての作用を有する薬剤を設計・開発することができる。
【０２４３】
【発明の効果】
本発明によれば、肝臓に特異的に高発現する新規な転写活性因子Ｋ１遺伝子が提供される。
【０２４４】
本発明によれば、Ｋ１オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、該オリゴヌクレオチド・プローブと結合する検体中のＫ１ 遺伝子または遺伝子産物を検出することによって、Ｋ１遺伝子のポリモルフィズム（多型：個人差)の解析により、Ｃ型肝炎による癌化の予測が可能となり、薬物治療などの治療方法の選択のための分析に有用である。
【０２４５】
本発明遺伝子の利用によれば、Ｋ１遺伝子発現産物またはＫ１ポリペプチドを製造でき、これを抗原とする抗体をも製造することが出来る。本発明によれば、該Ｋ１遺伝子発現産物またはＫ１ポリペプチドを有効成分とするＣ型肝炎による癌化の予防または治療に対する医薬組成物並びに医薬が提供される。
【０２４６】
また、Ｋ１遺伝子の提供によれば、該遺伝子がコードするＫ１蛋白質を遺伝子工学的に大量に製造することができ、該蛋白質の提供によれば、Ｋ１蛋白質活性やＫ１蛋白質の結合活性などの機能を調べることもできる。
【０２４７】
またＫ１蛋白質は、Ｋ１遺伝子およびその産物が関与する疾患（例えば、Ｃ型肝炎、およびＣ型肝炎合併症）の癌化の解明や診断、治療などに有用である。
【０２４８】
本発明によれば、更にＫ１センス・オリゴヌクレオチドを含有する遺伝子治療に有用な遺伝子導入用ベクター、該Ｋ１センスセンス・オリゴヌクレオチド導入された細胞および該ベクターまたは細胞を有効成分とする遺伝子治療剤、並びにその利用による遺伝子治療法などが提供される。
【０２４９】
本発明によれば、Ｋ１タンパクまたは遺伝子発現産物とＣ型肝炎コアタンパクとを用いる相互作用物のスクリーニング方法が提供される。
【０２５０】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げる。
【０２５１】
実施例１
(1-1) ヒト小腸完全長ｃＤＮＡライブラリーからクローンの単離
ヒト小腸組織から、アイソジェン(Isogen:日本ジーン社製)を用いて全ＲＮＡ２ｍｇを単離し、オリゴテックス−ｄＴ３０ スーパー(oligotex-dT30super:第一薬品社製)を用いてポリ(Ａ)⁺ＲＮＡ−ｄＴ３０を精製した。５０μｇのポリ(Ａ)⁺ＲＮＡを用いてオリゴキャッピング法（Szuki Y, and Sugano S, et al., Gene, 200, 149-156(1997)）により完全長ｃＤＮＡライブラリーを作製した。ベクターには、ｐＭＥ１８−ＦＬ３(Genebank accession No. AB009864)を用いた。
【０２５２】
次いで、上記で得られたプラスミドＤＮＡをＰＩ−１００ロボットを用いて単離した(クラボウ社製)。
【０２５３】
このようにして得られたｃＤＮＡライブラリーのサイズは、全長エンリッチドｃＤＮＡライブラリーに対して約２００００クローン／μｇのポリ(Ａ)⁺ＲＮＡであった。
【０２５４】
このライブラリーから、４０００クローンについてＡＢＩ３７７自動シーケンサー（ABI社）を用いて５’ランダムシーケンスを行い、インサートの全長シーケンスを行った。
【０２５５】
(1-2) クローンの選別
上記(1-1)で得られたデータからＢＬＡＳＴプログラム(Altschu, SF et al. Nucleic Acid Res,25,3389-3402(1997))を利用したＧｅｎＢａｎｋデーターベースの検索の結果、ＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリーと予測されるクローンを得た。
【０２５６】
上記(1-2)で選別したクローンについて、ＡＢＩ３７７自動シーケンサー（ABI社）を用いてＦＡＳＴＡプログラム(Person,W.R.,et al.,Proc. Natl.Acad. Sci.,USA, 85, 2444-2448 (1988))を使用するＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータ・ベース中のＤＮＡ配列とこのヌクレオチドのデータとの比較より、この遺伝子が他の如何なる公知のＤＮＡ配列とも相同性を有しないことが明らかとなった。
【０２５７】
本発明者らはこの配列の全体の配列を決定し、このクローンがＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリーの新規なメンバーであることを見出した。この遺伝子の全長配列を得る為に本発明者らは、全長エンリッチドｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、この遺伝子に対して同一の４つのクローンを同定した。４つのうちの２つがほとんど同じサイズであり、ｍＲＮＡの開始部位がほぼ同一であった。
【０２５８】
このように、本発明者らは、配列番号：１で示されるように４６１アミノ酸からなるオープン・リーディング・フレーム(ORF）を含んでいる２．５ｋｂの推定の全長ｃＤＮＡを得、該遺伝子をＫ１（Ｋａｉ１）と命名した。また配列番号：２は１３８３塩基からなる配列番号：１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を示し、全長核酸配列は、２５８６塩基からなる配列番号：３に示されるとおりである（図１）。
【０２５９】
ゲノム配列データベースの検索の結果、本発明者らは、Ｋ１遺伝子のエクソン配列を含んでいる一つのコスミドの完全配列(cosmid No. R33590 Genbank accession No. AC005620)を特定した。図２に得られたＫ１のゲノムの構造を示す。
Ｋ１のゲノムの構造は、１０のエクソンを有する全長１９．４キロ塩基対の領域のゲノム配列であり、ヒト染色体１９ｐ１３．３にマップされた。
【０２６０】
最初のＡＵＧコドンの周りの配列はコザックのコンセンサス配列に相応していた(Nucleic Acids Res. 15(20), 8125-48, 1987)。
【０２６１】
図３Ａに本発明のＫ１（Ｋａｉ１）、ＬＺＩＰ、ＯＡＳＩＳの３つの ＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリー遺伝子とのアミノ酸配列構造比較を、図３Ｂに本発明のＫ１と別のＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリー遺伝子を含むアミノ酸配列の整列比較図をそれぞれ示す。 図３Ａ中には、ｂ−Ｚｉｐドメインである塩基性ドメイン（basic domain）及びロイシン・ジッパー・ドメイン（Leucine-Zip）、並びにＤ／ＥＨＸＹがそれぞれ示されている。また、図３Ｂ中には、塩基性ドメイン（basic region）とロイシン・ジッパー・ドメイン（leucine zipper）がそれぞれ示されている。
【０２６２】
蛋白のデータベースの検索において、Ｋ１のアミノ酸配列は、ショウジョウバエのＢＢＦ−２、ヒトＬＺＩＰ、およびマウスＯＡＳＩＳの３つの ＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリー遺伝子とより広範囲いに渡って相同性を示した。
【０２６３】
マウスＯＡＳＩＳは、最近、星状細胞からクローニングされたが、蛋白の機能は未だ分析されていない (Brain Res Mol Brain Res. 69, 93-103 (1999))。
【０２６４】
これらの遺伝子の間は、保存領域は、ｂ−Ｚｉｐドメインだけでなく、ｂ−Ｚｉｐドメインの周辺にもあった。ＬＺＩＰ、ＯＡＳＩＳ、及びＢＢＦ−２の間とＫ１の塩基性Ｚｉｐ領域のアミノ酸類似性は、それぞれ８４％、６９％、７１％であった。
【０２６５】
Ｋ１、ＬＺＩＰ、およびＯＡＳＩＳはｂ−Ｚｉｐ周辺の配列類似性が認められたが，一方では、それらは構造的な違いがあった。
【０２６６】
Ｋ１は、「ＬＸＮＸＴＸＸ」配列の３つの繰り返しからなるｂ−ＺｉｐドメインではないＣ末端領域において別のロイシン・ジッパー・モチーフを持っていた。この特徴は、ＬＺＩＰ、または他のＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリーにおいては見られなかった。ロイシン・ジッパーは、しばしば蛋白−蛋白作用ドメインにおいてみられる(Science, 259(5092): 230-234(1993))。
【０２６７】
Ｋ１のこの第２のロイシン・ジッパー・ドメインは、他の蛋白に対して相互作用を与えるかもしれない。
【０２６８】
また、Ｋ１には、ｂ−Ｚｉｐドメインの直後に、膜貫通領域と推定される（Putative Transmembrane domain）、疎水性ドメインが存在する。
【０２６９】
別のＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリーの一つ、ＡＴＦ−６にも、これと似た膜貫通領域が存在し、ＡＴＦ−６は平常時は小胞体膜に存在し、ツニカマイシンなどによる小胞体ストレス刺激により、ＡＴＦ−１は、遊離され、核に移行し、転写を活性化させることが知られている。(JBC2000, 275 27103-27020)。Ｋ１もこれに似た機構で、転写活性化能が制御されているのかもしれない。
【０２７０】
対照的に、ＬＺＩＰは、単純ヘルペスウイルス転写活性因子ＶＰ１６に作用することが知られている宿主細胞因子(HCF:host cell factor)に関連するＤ／ＥＨＸＹモチーフを保有している (Gene Dev, 11 3122-3127(1997))。Ｋ１はＤ／ＥＨＸＹモチーフを示さなかった。
【０２７１】
実施例２ ノーザン・ブロット分析
組織におけるＫ１の発現プロファイルを調べる為、各種のヒト組織を用いたノーザン・ブロット分析を行なった。ノーザン・ブロット分析には、ヒトＭＴＮ(Multiple-Tissue Northern)ブロットＩとII（クローンテック社製）を使用した。
【０２７２】
プライマーは、クロスハイブリダイゼーションを避けるためにｂ−Ｚｉｐドメインを含んでいないＫ１ｃＤＮＡの５’領域の７０８塩基対をプローブとして用い、３５サイクルのＰＣＲ増幅を行い発現の有無を調べた。プライマーは、以下に示すＰ７およびＢａｍ３を作製した。
配列番号：４ P7：5'- TGGGCCACCAGCTTGGAGCAGAGAC -3'
配列番号：５ Bam3：5'- AAGGATCCtcaCTCCTGACAGTGCCCAGCCCCAGGTC -3'
ＰＣＲ産物はＱＩＡクイック・ゲル・キット(Quoagen 社製)によって精製され、ランダム・プライマーＤＮＡ標識キットＶｅｒ．２（タカラ社製宝）を使用して［α−³²Ｐ］−ｄＣＴＰで標識した。
【０２７３】
ブロットは、１時間プレハイブリダイゼーションを行ない、それから５０％フォルムアミド、５ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト氏液、および５００μｇ/ｍｌの熱変性サケ精子ＤＮＡを含む０．５％ＳＤＳの混合液において４２℃で１８時間ハイブリダイズした。
【０２７４】
ハイブリダイズしたブロットは、２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで３０分間室温で洗浄した、そして０．１ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで５５℃で６０分間洗浄した。洗浄した膜は乾燥し、ＢＡＳ−２５００バイオ・イメージ分析器(フジフイルム社製)を使用してオートラジオグラムで分析した。
【０２７５】
その結果を図４に示す。
【０２７６】
その結果、ヒト成人１６組織中、肝臓のみで、２．５ｋｂのバンドのＫ１ｍＲＮＡの発現が確認された（小腸での発現は、ノーザン・ブロット分析では検出限界以下であった）。Ｋ１発現パターンのこの組織特異性は、哺乳動物においてユビキタスに発現されたＬＺＩＰあるいはＯＡＳＩＳのそれとは異なっていた(Lu,R., et al.,Mol Cell Biol.,17,5117-5126(1997): Kozak, M., Nucleic Acids Res. , 15 (20) 8125-8148 (1987))。
【０２７７】
尚、用いたヒト組織は、心臓（Heart）、脳（brain）、胎盤（Placenta）、肺（Lung）、肝臓（Liver）、骨格筋（Skeletal muscle）、腎臓（Kidney）、膵臓（Pancreas）、脾臓（Spleen）、胸腺（Thymus）、前立腺（Prostate）、精巣（Testis）、卵巣（Ovary）、小腸（Small intestine）、結腸（Colon）及び末梢血白血球（Peripheral blood leukocyte; P.B.L.）である。
【０２７８】
実施例３ ＧＡＬ４−Ｋ１融合タンパクの発現によるＫ１の転写活性化能の評価
幾つかのＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリーは、転写活性因子または、転写抑制因子として作用する。
【０２７９】
Ｋ１が転写活性化因子であるかどうか特定するために、本発明者らは、ＧＡＬ４−Ｋ１融合蛋白を発現させるプラスミドを構築し、ＣＯＳ７細胞に対してＧＡＬ４結合エレメントを含んでいるルシフェラーゼ・リポーター・プラスミドで遺伝子導入を行った。
【０２８０】
本発明者らは、以下のようなＧＡＬ４ＤＮＡに融合したＫ１の種々の欠失変異体を構築し、ルシフェラーゼ・リポーター・プラスミドで遺伝子導入し、それぞれのルシフェラーゼ活性を調べた。
【０２８１】
１）ＧＡＬ４−Ｋ１融合タンパクの発現ベクター
ＧＡＬ４−Ｋ１融合タンパク発現プラスミドｐＧＡＬ４−Ｋ１は、ＥＦ１−ａｌｐｈａプロモーターをもつ、哺乳類細胞発現プラスミド ｐＳＧ５ (プロメガ社製：Promega)に、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合部位の遺伝子とＫ１のデリーションミュータントをインフレームで組み込んで作成した。
【０２８２】
２）ＧＡＬ４ エレメントを含むルシフェラーゼ発現ベクター
ルシフェラーゼレポーター発現プラスミドｐＧＡＬ−Ｌｕｃは、ルシフェラーゼ遺伝子をもつプラスミドｐＧＬ２ベーシック (プロメガ社製) にウサギグロビン遺伝子のＴＡＴＡ−ｂｏｘと合成オリゴＤＮＡ由来のエレメントをタンデムに組み込んで作成したｐＲＧＰ３にＧＡＬ４結合配列を組み込んで作成した（Yamamoto, Nature,367,568-572(1994))。
【０２８３】
３） トランスフェクション
トランスフェクションには、リポフェクタミン２０００（Life technology社製）を用い、操作はこの試薬に添付のプロトコールに沿った。ＣＯＳ７細胞を６ウエル・プレートに植え継ぎ後、２４時間後にトランスフェクションした。
【０２８４】
上記プラスミドを１．０μｇ含むベクター溶液を１μｌ、スーパーフェクトを１０μｌ、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ無血清培地（ライフ・テクノロジー社製）を１００μｌ含むトランスフェクション溶液を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ無血清培地で洗浄した細胞のプレートに加えた。２４時間後にルシフェラーゼの活性を測定した。
【０２８５】
４） ルシフェラーゼの活性測定
デュアル-ルシフェラーゼ・リポター・アッセイ・システム(Dual-LuciferaseReporter Assay System:プロメガ社製)を用い、操作はこの試薬に添付のプロトコールに沿った。培養プレートにキットに添付の溶解緩衝液４００μｌを加え、細胞を溶解させた後、卓上遠心機で１５００ｒｐｍ、５秒遠心し、この上清２０μｌを、添付の反応試薬ＬＡＲII１００μlに混合し、１回目の化学発光をルミノメーターで測定した。続いて、キット添付のストップ＆グロー試薬１００μlを加え、２回目の化学発光を測定した。これらの比により、ルシフェラーゼの活性を算出した。
【０２８６】
その結果を図５に示す。
【０２８７】
転写因子は大きく、転写活性化能を有する転写活性化因子と転写抑制能を有する、転写抑制因子に分けられる。ＧＡＬ４-完全長Ｋ１がルシフェラーゼ発現を活性化することから、Ｋ１は転写活性化能をもつ、転写活性化因子であることがわかった。
【０２８８】
Ｋ１の転写活性ドメインの領域を調べるために、本発明者らは、ＧＡＬ４ＤＮＡに融合したＫ１の種々の欠失変異体を構築し、ルシフェラーゼ・リポーター・プラスミドで同時形質転換させた。Ｃ末端領域(Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４およびＤ５)で欠失させたＧＡＬ４−Ｋ１融合蛋白は、リポーター発現を活性化することができた。またＮ末端領域(Ｄ６及びＤ７)で欠失させた構築物は、活性化させる能力を失った。活性化する能力を持つ最小の領域はアミノ酸配列１−１４９を含んでいるＤ５であった。したがって、Ｎ末側、１４９アミノ酸だけでも活性化できることからこの部分に転写活性化部位があると考えられる。この領域において、Ｋ１蛋白は、プロリン・リッチな領域を有している。プロリン・リッチな領域は、しばしば転写因子の転写活性ドメインにおいて見られた(Cell, 79,93-105(1994))。
【０２８９】
膜貫通ドメインを欠失した欠失変異体(Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４およびＤ５)は、膜貫通ドメインを保持したもの(ＦＬ、Ｄ１)よりも、顕著に高い活性を示した。これは、膜貫通ドメインを除去することにより、遊離型のＫ１が核に移行しやすくなり、転写活性化能が高められたためと考えられる。
【０２９０】
実施例４ グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ GST ）−Ｋ１融合タンパクによる、Ｋ１の転写活性化エレメントへの結合能の検討
ＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリー蛋白はＣＲＥコンセンサス配列ＴＧＡＣＧＴＣＡ(Montminy, M.R., PNAS, 83 6682-6686(1986))の特異的配列に結合する能力を有している。ＢＢＦ−２はｂｏｘ−Ｂ、ＣＲＥに結合することが知られており、ＬＺＩＰもまたＣＲＥに結合する(Abel,T., et al., Genes Dev., 6(3)466-480 (1992) : Lu,Ｒ., et al.,Mol Cell Biol., 17, 5117-5126(1997))。
【０２９１】
Ｋ１のＤＮＡ結合配列特異性を特定するために、本発明者らはゲルシフトアッセイを実施した。
【０２９２】
方法：１） ＧＳＴ融合タンパクの発現ベクター
ＧＳＴ−Ｋ１融合蛋白を発現するプラスミドｐＧＳＴ−Ｋ１は、ＧＳＴ発現プラスミドｐＧＥＸ−３Ｘ(ファルマシア・バイオテック社製)の制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ認識部位間の全体のＯＲＦを含むＫ１のインフレーム挿入によって構築された。
【０２９３】
ＯＲＦの全体を含んでいるＫ１のＰＣＲ産物は、ｐｆｕＴＵＲＢＯ(ストラタジーン社製)で配列番号６で示されるＢａｍ５’と配列番号７で示されるＥｃｏＲＩ３’プライマーを用いて増幅することにより産生させた。
【０２９４】
Ｂａｍ５’プライマー：
配列番号６；5'-TTGGATCCCCATGAATACGGATTTAGCTGCTGG-3'
ＥｃｏＲＩ３’プライマー：
配列番号７；5'-GTCGAATTCGATCTGTTTCAGGCTGTGTCTGGGTCTG-3'
クローンの配列は、３７７自動シーケンサー(PEバイオシステムズ社製)によって確認した。
【０２９５】
２）ＧＳＴ融合タンパクの精製
大腸菌株 ＸＬ−１ｂｕｌｅをＧＳＴ−Ｋ１融合タンパク発現プラスミドｐＧＳＴ−Ｋ１で形質転換し、ＬＢ培地２ｍｌで３７℃で一晩、前培養した後、ＬＢ培地２０mlで本培養を２時間行い、１ｍＭ ＩＰＴＧにより発現誘導を行い、さらに２時間培養を行った。大腸菌を集菌し、破砕溶液（50mM Tris-HCl (pH8.0), 50mM NaCl, 5mM EDTA 、 2mM DDT ）に懸濁後、超音波破砕を１分間行い、抽出液を得た。これを卓上遠心機で５０００ｒｐｍで５分遠心を行い、上清１ｍｌに２００μｌ のにグルタチオン・セファロース４Ｂ (アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製)に結合させた後、１ｍｌの破砕溶液で２回洗い、２０ｍＭグルタチオンで溶出する。各結合反応のために、ＧＳＴ−Ｋ１の０．１μｇを用いた。
【０２９６】
３） ゲルシフトアッセイ
以下に示す、合成オリゴを各組ごとにアニーリングを行い、[γ-³²P]−ＡＴＰにより、メカラベルＤＮＡ５’末端標識キット(Megalabel DNA 5'-end labeling kit :タカラ社製)を用いて放射性標識を行い、以下に示す配列番号８および配列番号９で示されるＢｏｘ−Ｂ[Box-Bプローブ：D.mulleri Adh-1 promoter (Cell, 53451-461(1988))]、配列番号１０および配列番号１１で示されるＣＲＥ[CREプローブ：somatostatin promoter (Mol. Cell Biol., 20 (10) 3470-3481 (2000)]、配列番号１２および配列番号１３で示されるＣ／ＥＢＰ[C/EBPプローブ：albumin promoter (Gene Dev., 5 1553-1567(1991))]、配列番号１４および配列番号１５で示されるＡＰ−１[AP-1プローブ：c-jun promoter (Cell 55 875-885 (1988))]、および配列番号１６および配列番号１７で示されるＮＦ−ΚＢ[NF-kBプローブ：IL-2 receptor-alpha promoter (J. Biol. Chem.,264, 8475-8478 (1989))]検出たのめのプローブをそれぞれ合成した。
[Box-Bプローブ：D.mulleri Adh-1 promoter (Cell, 53 451-461(1988))]
配列番号８： 5'-TCGAGCTCGGATGTACACGTAATCGTATTACTC-3'
配列番号９： 5'-CGAGAGTAATACGATTACGTGTACATCCGAGCT-3'
[CREプローブ：somatostatin promoter (MCB，20(10), 3470-3481(2000))]
配列番号１０： 5'-TCGAGCTCGGATGGCTGACGTCAGAGATTACTC-3'
配列番号１１： 5'-CGAGAGTAATCTCTGACGTCAGCCATCCGAGCT-3'
[C/EBPプローブ：albumin promoter (Gene Dev., 5 1553-1567 (1991))]
配列番号１２： 5'-TCGAGCTCGGATGATTTTGTAATGGGGTTACTC-3'
配列番号１３： 5'-CGAGAGTAACCCCATTACAAAATCATCCGAGCT-3'
[AP-1プローブ：c-jun promoter (cell 55 875-885 (1988))]
配列番号１４： 5'-TCGAGCTCGGATCAAAGTTTAGTCAATTACTC-3'
配列番号１５： 5'-CGAGAGTAATTGACTAAACTTTGATCCGAGCT-3'
[NF-kBプローブ：IL-2 receptor-alpha promoter (JBC,264,8475-8478(1989))]
配列番号１６： 5'-TCGAGCTCGGAGGGGAATCTCCCGGGTTACTC-3'
配列番号１７： 5'-CGAGAGTAACCCGGGAGATTCCCCTCCGAGCT-3'.
ＧＳＴ−Ｋ１融合タンパク溶液を１回のゲルシフトアッセイあたり、４μｌと、２０ｆｍｏｌの上記各プローブを１０μｌの結合反応溶液［５０ｍＭ トリス−塩酸(pH 8.0)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１μｇ／μｌポリ（ｄＩ・ｄＣ）、２０％のグリセロール］を加え、室温で３０分保温し、４％アクリルアミドゲルにアプライした。電気泳動には、ゲルシャフトアッセイ（GelShift Assay Kit：ストラタジーン社製)添付の１ｘ泳動バッファーを用い、１０ｍＡの定電圧で２時間泳動した。
【０２９７】
電気泳動終了後、ゲルを乾燥し、オートラジオグラムはＢＡＳ−２５００バイオ・イメージ・アナライザー（フジフィルム社製）で解析を行った。
【０２９８】
その結果を図６に示す。
【０２９９】
図６から分かるようにＧＳＴ−Ｋ１融合タンパクはＣＲＥ、ｂｏｘ−Ｂに結合し、Ｃ／ＥＢＰ、ＡＰ−１、ＮＦΚＢには、結合しなかった。また、過剰の未標識オリゴを加えると、ＣＲＥ、ｂｏｘ−Ｂへの結合は競合的に阻害されることから、Ｋ１は配列特異的な結合をしていることがわかる。
【０３００】
実施例５ Ｋ１の発現によるｂｏｘ−Ｂ転写活性化エレメントを介した転写活性化能の測定
１）Ｋ１発現ベクター
Ｋ１発現プラスミド、ｐＭＥ−Ｋ１オリゴキャップライブラリから、得られたクローンを用いた。即ち、Ｋ１蛋白を発現するプラスミドｐＭＥ−Ｋ１は、前記全長エンリッチドｃＤＮＡライブラリーから単離され(Gene, 200, 149-156 (1997): Nature Genet., 21, 191-194 (1999))、ＳＰｐｈａによって発現誘導がかかるベクターｐＭＥ１８に全長Ｋ１ｃＤＮＡの２５８６塩 基対を含んでいる。
【０３０１】
Ｋ１の膜貫通領域欠失変異体発現プラスミドｐＭＥ−Ｋ１ＴＭは、配列番号１８および配列番号１９で示されるプライマー：
配列番号１８： 5'Eco-P1 ：TTgaattcCATCTGCAGACAGAACTGGATGGAC
配列番号１９： TM-XBE：AAggatccgaattcTCTAGATCATGTCTGGGCTGACTTGCTGGTGGACTGC
を用いて、増幅したＰＣＲ産物(アミノ酸番号 1-320) をＥｃｏＲＩとＸｂａＩ制限酵素サイトで、ｐＭＥ１８Ｓに導入したものである。
【０３０２】
２） 転写活性化エレメントを含むルシフェラーゼ発現ベクター
ルシフェラーゼ・レポーター・プラスミドｐＢｏｘ−Ｌｕｃは、ウサギ・ベータ−グロビンＴＡＴＡ ボックスを含んでいるｐＧＬ２−ベーシックから構築したｐＲＢＧＰ３(Nature 336, 544-51 (1988))の ＸｈｏＩ部位中にＢｏｘ−Ｂオリゴヌクレオチド（配列番号８）の挿入によって構築された。
【０３０３】
各プラスミドは、製品説明書に従いＱｉａｇｅｎプラスミド・キット(QiagenPlasmid Kit ;キアジン社製(Qiagen))を用いて精製し、ＤＮＡ配列はＡＢＩ３７７自動シーケンサー(ＰＥバイオシステムズ社製)によって分析した。
【０３０４】
３）トランスフェクション
実施例３と同様の方法で、活性測定を行った。
【０３０５】
４） ルシフェラーゼの活性測定
実施例３と同様の方法で、活性測定を行った。
【０３０６】
その結果を図７に示す。図７中に左側にＫ１の構築物をそれぞれ示す。
【０３０７】
図７より、完全長Ｋ１タンパクは、Ｂｏｘ−Ｂエレメント依存的に約３.５倍のルシフェラーゼの転写活性化を示した。また、膜貫通部位を欠失した構造物は、１６．４倍の転写活性化を示した。このことから、生体内でもＫ１がＡＤＨなどの肝臓の代謝酵素などの転写活性化をコントロールする可能性が考えられる。
【０３０８】
上記各実施例より得られた結果から、Ｋ１と他の相同メンバー、ＢＢＦ−２、ＬＺＰおよびＯＡＳＩＳの関係について、検討するとＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリーの全てのメンバーは、それらのｂ−Ｚｉｐにおける類似性を分ち合っているが、幾つかのメンバーは、他の領域における付加的な類似性およびサブファミリーの中で更にグループ分けすることが可能である。
【０３０９】
例えばＡＴＦ１、ＣＲＥＢ及びＣＲＥＭは一つのサブ・ファミリーにグループ分けすることが出来る(Hai, T.W., et al., Genes Dev., (12B) 2083-2090 (1989): Hoeffler, J.P., et al., Science, 242 (4884) 1430-1433(1988): Foulkes, N.S., et al., Cell, 64 (4)739-749(1991))。
【０３１０】
Ｋ１は、ｂ−ＺｉｐドメインにおいてＣＲＥＢ／ＡＴＦ１ファミリー遺伝子と相同性を有し、そして２つの哺乳動物のＣＲＥＢ／ＡＴＦ１ファミリーメンバー、ＬＺＩＰ及びＯＡＳＩＳとより高い相同性を有する。
【０３１１】
相同性領域はｂ−Ｚｉｐドメインだけでなく、ｂ−ＺＩＰドメイン周囲でもあった。ｂ−Ｚｉｐドメインにおけるこれらの相同性は、それらがＣＲＥＢ／ＡＴＦ１ファミリーのサブ・ファミリーと特徴付けられるかもしれない。
【０３１２】
ｂ−Ｚｉｐドメインにおける塩基性ＤＮＡ結合ドメインは、標的エレメントのＤＮＡ配列を認識し、塩基性ドメインにおける類似性を有しているメンバーは、類似配列エレメントに結合するかもしれない(Cell, 71 (7): 1223-37 (1992))。
【０３１３】
実際、Ｋ１とＢＢＦ−２はｂｏｘ−Ｂエレメントに結合する。ＬＺＰおよびＯＡＳＩＳもまたｂｏｘ−Ｂエレメントに結合するかもしれない、Ｋ１、ＬＺＰおよびＯＡＳＩＳのこれら３つの因子は、哺乳動物細胞において類似の標的遺伝子のひとつの転写を調節する可能性がある。
【０３１４】
また、ｂ−Ｚｉｐ転写因子は、ロイシン・ジッパーを通してひとつのダイマーを形作ることが知られている。それらはときどき他のｂ−Ｚｉｐ因子との間にヘテロダイマーを形作り、別の作用を示す(Science,2401759-1764(1988))。ヘテロダイマーを形作る能力はロイシン・ジッパードメインの類似性に依存する。例えばＣＲＥＢまたはＣＲＥＭは、ヘテロダイマーを形作ることができ、ロイシン・ジッパードメインは有意な類似性を有する(Cell, 64 (4): 739-49 (1991))。
【０３１５】
Ｋ１、ＬＺＰおよびＯＡＳＩＳは、ロイシン・ジッパードメインの部分的な類似性を有す(図３Ａ)。
【０３１６】
Ｋ１、ＬＺＰおよびＯＡＳＩＳは、それらの間にヘテロダイマーを形作り、直接相互に影響し合い、機能的な関係を持っている潜在性がある。近年、ＬＺＩＰはＨＣＶコア蛋白に対して相互作用すること、そしてＣＲＥを通して転写活性を調節し、細胞形質転換と相関するが報告された(Jin,D.Y.,et al., EMBO J., 19 (4) 729-740(2000))。
【０３１７】
ＨＣＶコア蛋白は、ＬＺＩＰ、Ｋ１に対する構造的な類似性がＨＣＶコア蛋白に対して潜在的に相互作用し、肝細胞癌の発生に関係している理由のためにＨＣＶの他のコンポーネントなしにトランスジェニック・マウスの肝細胞癌を誘導することができた(Moriya, K. et al., Nat. Med., 4(9)1065-1067 (1998))。
【０３１８】
ＬＺＩＰのユビキタスな発現パターンと対照的に、Ｋ１は肝臓特異的な発現を示した。もし、Ｋ１とＨＣＶコア蛋白が相互作用することが出来たならば、肝臓におけるＫ１の発現の特異性は、肝臓においてＨＣＶの病因に関連しているかもしれない。また、Ｋ１には、ｂ−Ｚｉｐドメインの直後に、膜貫通領域と推定される、疎水性ドメインが存在する。
【０３１９】
別のＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリーの一つ、ＡＴＦ−６にも、これと似た膜貫通領域が存在し、ＡＴＦ−６は平常時は小胞体膜に存在し、ツニカマイシンなどによる小胞体ストレス刺激により、ＡＴＦ−１は、遊離され、核に移行し、転写を活性化させることが知られている。(J. Biol. Chem.,275,27103-27020(2000))。Ｋ１もこれに似た機構で、転写活性化能が制御されているのかもしれない。小胞体ストレス応答は、ウイルスの感染による過剰タンパク発現でもみられることが知られていることからも（Genes & Development,13,1211- 1233(1999))、ＨＣＶの感染と、Ｋ１遺伝子の機能に関係する可能性が示唆される。
【０３２０】
組織特異的な転写エレメントは、多くの組織特異的遺伝子において存在することが知られている。組織特異的エレメントに結合する転写因子は、しばしば組織特異的な発現が見られる。それらの多くは、転写活性化因子であり、細胞の適当なタイプにおいてそれ自身の発現レベルを活性化させることによって組織特異的遺伝子の発現を上昇させるように調節する(Exp Hematol. ,(2):99-107(1995):, Mol Cell Biol.,13(11):6752-65,(1993))。
【０３２１】
本発明者らは、Ｋ１の発現が１６のヒト成人組織において肝臓特異的であったこと、そしてＫ１がｂｏｘ−Ｂエレメントを通して直接的にルシフェラーゼ・レポーターの発現を活性化することを示した。 ｂｏｘ−Ｂエレメントは、最初にショウジョウバエのＡＤＨ遺伝子のプロモーターにおいて見出され、脂肪体特異的エンハンサーとして作用した(Cell 6;53(3):451-61 (1988))。 ｂｏｘ−Ｂエレメントは、また肝臓において主に発現しているヒトのＡＤＨ遺伝子のプロモーターにおいても見出されている(Abel, T., et al., Genes Dev., 6(3)466-480(1992))。しかしながら、ショウジョウバエのＢＢＦ−２は、ヒトのＡＤＨのｂｏｘ−Ｂ様エレメントに結合するが、このエレメントに結合する哺乳動物の因子は特定されていなかった。
【０３２２】
このように、本発明者らが、見出した本発明のＫ１は肝臓特異的発現を示すそのような最初の因子であろう。Ｋ１はｂｏｘ-Ｂ様エレメントを通してＡＤＨの肝臓優勢な発現を調節するであろう。Ｋ１の肝臓特異的な発現のために、Ｋ１が他の肝臓特異的な遺伝子の発現を調節することに関連している可能性がある。本発明者らはヒトＡＤＨプロモータにおいて見出されたｂｏｘ-Ｂ様エレメントの領域周辺においてこれを研究している。肝臓特異的遺伝子のプロモーター領域の分析は、何がＫ１の主要な標的であるかを示すであろうし、Ｋ１と関係したシグナルの形質導入経路のヒントを提供するであろう。
【０３２３】
本発明のＫ１によれば、Ｃ型肝炎ウイルスのコアタンパクと相互作用することにより、肝臓、特にＣ型肝炎疾患との関連が考えられ、遺伝子治療のターゲットや、薬剤のターゲット、薬剤スクリーニングのターゲット、遺伝子診断のターゲットとなりうる。
【０３２４】
また、本発明のＫ１はアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターに相互作用し、発現をコントロールするかもしれず、これにより遺伝子診断のターゲットとなりうる。また、同様に肝臓の薬剤代謝酵素などのプロモーターに相互作用する可能性もあり、同様に遺伝子診断のターゲットとなり得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｋ１遺伝子の配列を示す図である。
【図２】本発明Ｋ１のゲノムの構造を示す図面である。
【図３】図３Ａは、本発明Ｋ１、ＬＺＩＰおよびＯＡＳＩＳのシェーマ・ダイアグラム図である。図３Ｂは、本発明Ｋ１とＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリーの他のメンバーの間のｂ−Ｚｉｐドメインの複数整列比較を示す図面である。
【図４】ノーザンブロッティングによる、組織における本発明のＫ１の発現パターンの図面代用写真である。
【図５】本発明Ｋ１における転写活性化領域のマッピング図面と対応する転写活性を示す図面である。
【図６】ゲル・シャフトアッセイによる本発明Ｋ１のＤＮＡ結合能力を示す図面代用写真である。
【図７】本発明Ｋ１のＣＲＥおよびＢｏｘ−Ｂエレメントを通した転写活性化を示す図面である。
【配列表】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a gene having a novel transcriptional activity specifically expressed in the liver and use of the gene.
[0002]
[Prior art]
One of the important factors for tissue-specific expression of genes is considered to be a transcription factor. In tissue-specific gene promoters, tissue-specific transcription elements are often found, and transcription factors regulate their expression by binding to the elements. It is known that some parts of transcription factors involved in the regulation of tissue specific gene expression are expressed in a tissue specific manner.
[0003]
For example, muscle creatine kinase, which is a typical muscle-specific gene, has an E-box element in the promoter (Cell. 58, 823-831 (1989)). Ten E-box elements, such as myosin light chain 1/3 (Gene Dev., 2, 1779-1790 (1988)), or troponin C (Moll Cell Biol., 13, 6752-6765 (1993)) It is found in another promoter of a unique muscle-specific gene. MyoD, a basic-helix-loop-helix transcription factor, binds to the E-box element within the promoter and regulates expression of muscle-specific gene expression of muscle creatine kinase (Cell, 58, 823- 831 (1989)). MyoD expression is also specific in muscle (Nature, 341 303-307 (1989)).
[0004]
In erythroid, α- and β-globin are expressed erythroid-specifically, and the expression is regulated through GATA elements within their promoter (Cell, 58 877-885 (1989): Nature, 339, 446-451 (1989): Exp. Hematol., 23, 99-107 (1995)). The zinc finger transcription factor, GATA-1, is known to bind to the GATA element and regulates globin expression in erythroid. GATA-1 is mainly expressed in erythroid (Nature, 339 446-451 (1989)).
[0005]
In the liver, the expression of albumin, a typical liver-specific gene, is C / EBP belonging to a basic leucine zipper (b-Zip) that interacts at the D site in the albumin promoter (ref). -regulated by α (Science, 244 (4902): 343-346 (1989)). The expression pattern of the C / EBP family is dominant or abundant in the liver (Science, 240, 1759-1764 (1988): Gene Dev., 318, 1146-1156 (1989): Cell, 61, 279-291 (1990): Gene Dev., 4, 1541-1551 (1990)). Human type I alcohol dehydrogenase (ADH) is also expressed predominantly in the liver, and expresses tissue-specific different patterns and evolutionary gene expression (Science, 171 (966) 71-73 (1971) ). Transient expression of these genes during liver development is through the D / element binding protein that is a member of the b-Zip protein through several active elements in the C / EBP-α, LAP, HNF1 and ADH promoters (ref). (Moll Cell Biol., 10, 5007-5010 (1990): Moll Cell Biol., 12, 3023 -3031 (1992): J. Bio.Chem., 266 ( 8) 11594-11603 (1991)).
[0006]
Drosophila ADH is expressed in the fat pad, a functional analog at the end of the mammalian liver. In the Drosophila ADH gene promoter, the box-B element is defined as a factor for the expression of the ADH gene and acts as a fat body-specific enhancer (Cell, 53 (3), 451-461, (1988) : Nature, 332, 853-856 (1988)). A box-B-like element has also been identified within the promoter of mammalian liver, ADH-2, a tyrosine aminotransferase (Gene Dev., 6, p466-480 (1992)). A transcription factor that binds to the box-B element binds to the box-B element identified from Drosophila and is named box-B binding factor 2 (BBF-2 / dCREB-B) (Gene Dev., 6, p466-480 (1992): Moll Cell Biol., 12 (9) 4123-4131 (1992)). BBF-2 belongs to the CREB / ATF family of b-Zip proteins. BBF-2 has also been shown to bind to box-B-like elements as a mammalian liver-specific gene.
[0007]
However, no mammalian transcription factor has been identified that binds to a box-B-like element. A mammalian member of the CREB / ATF family with high homology to BBF-2 in the b-Zip domain or other regions of the b-Zip region has been cloned and named as LZIP (Luman / CREB3) ( Gene, 25, 241-245 (1994): EMBO J.19 (4) 729-740 (2000): Moll Cell Biol., 20 (3) 919-928 (2000)). LZIP binding to CRE (cAMP responsive element) is identified and activates transcription through CRE. Recently, LZIP is known to enhance hepatitis C virus (HCV) core protein interaction and extracellular transformation. The expression pattern of LZIP is found everywhere in human tissues (EMBO J., 19 (4) 729-740 (2000)).
[0008]
The ability of LZIP to bind to Box-B-like elements has not been evaluated.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel gene having a transcriptional activation effect expressed specifically in the liver. According to the gene of the present invention, a human hepatitis C virus (HCV) core protein can be interacted with to provide gene therapy for human hepatitis C, gene diagnosis, and a screening method for candidate compounds for human hepatitis C. In addition, according to the gene of the present invention, a transcriptional activating action is shown for a liver drug metabolizing enzyme promoter, and a gene diagnosis method for liver drug metabolism is provided.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
Here we isolated a novel member of the CREB / ATF family named K1 that is expressed specifically in the liver. K1 was fairly intimate with BBF-2 and LZIP in the b-Zip domain. We have now discovered that K1 has the ability to activate transcription through binding to the box-B element.
[0011]
That is, the present invention provides the following inventions.
Item 1. A gene comprising the following polynucleotide (a), (b), (c) or (d):
(A) a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a complementary strand thereof,
(B) a polynucleotide having at least 95% homology to a polynucleotide encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(C) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and having a gene transcription activity;
(D) a protein comprising an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having cAMP response element binding activity or box-B binding activity; Encoding polynucleotide.
Item 2. A gene comprising the following polynucleotide (a) or (b):
(A) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a complementary strand thereof,
(B) A polynucleotide that hybridizes with the polynucleotide comprising the base sequence of (a) above under stringent conditions.
[0012]
Item 3. Item 3. The gene according to Item 2, which is the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
[0013]
Item 4. A gene which is a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
[0014]
Item 5. Item 5. An expression product of the gene according to any one of Items 1 to 4.
[0015]
Item 6. Item 5. A recombinant expression vector having the gene according to any one of Items 1 to 4.
[0016]
Item 7. Item 7. A host cell comprising the recombinant expression vector according to Item 6.
[0017]
Item 8. Item 5. A cloned cDNA that expresses the gene according to any one of Items 1 to 4, a fragment thereof, a derivative thereof, and a homologue thereof.
[0018]
Item 9. An oligonucleotide probe or primer comprising at least 15 contiguous nucleotide sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and different from the DNA sequence of the CREB / ATF family gene.
[0019]
Item 10. Item 10. The oligonucleotide probe or primer according to Item 9, comprising at least 30 contiguous nucleotide sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and different from the DNA sequence of the CREB / ATF family gene.
[0020]
Item 11. Item 6. An antibody having binding ability to the expression product of the gene according to Item 5, or a partial fragment thereof.
[0021]
Item 12. Item 6. A preventive or therapeutic agent for liver cancer using the gene expression product of Item 5 as an active ingredient.
[0022]
Item 13. A polypeptide comprising the following amino acid sequence (a), (b), (c) or (d):
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) a polypeptide having at least 95% homology to a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(C) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and having a gene transcription activity,
(D) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having cAMP response element binding activity or box-B binding activity .
[0023]
Item 14. a) Gene expression according to any one of Items 1 to 4 in the presence of hepatitis C core protein for a time sufficient to treat a test substance to promote transcriptional activity under physiological conditions A step of presenting a test substance to the product,
b) In comparison with the activity in the presence of the test substance, a compound that detects the promotion of transcriptional activity of the gene expression product according to any one of Items 1 to 4 and suppresses canceration of hepatitis C core protein. Including the step of identifying the presence of the test substance,
The gene according to any one of Items 1 to 4, or the gene according to any one of Items 1 to 4, or the polypeptide according to Item 13 or the gene expression product according to Item 5 or the polypeptide according to Item 5. A screening method for a candidate compound that promotes transcriptional activity, comprising screening a gene expression product and a candidate compound that promotes the transcriptional activity of the polypeptide of Item 13.
[0024]
Item 15. A screening kit used in the screening method for a candidate compound that promotes the transcription activity according to Item 14.
[0025]
Item 16. Item 5. A method for predicting canceration due to hepatitis C by measuring the level of gene expression of the gene according to any one of Items 1 to 4, and analyzing the difference in the level of gene expression or polymorphism of the gene.
[0026]
Item 17. a) reacting the test substance with the gene expression product according to any one of Items 1 to 4,
b) A metabolic enzyme in which the gene expression level of the test substance is increased by the action of promoting the transcription activity of the gene expression product according to any one of Items 1 to 4 in comparison with the transcriptional activity in the presence of the test substance Including the step of identifying the presence of
The gene according to any one of Items 1 to 4, or the gene according to any one of Items 1 to 4, or the polypeptide according to Item 13 or the gene expression product according to Item 5 or the polypeptide according to Item 5. A screening method for a candidate metabolic enzyme, wherein a candidate metabolic enzyme whose gene expression level is increased by the gene expression product and the transcriptional activity promoting action of the polypeptide according to Item 13 is screened.
[0027]
Moreover, according to the present invention, a method for screening an interactant using the K1 gene or gene expression product can be provided.
[0028]
According to the present invention, a screening method for identifying a compound that stimulates or suppresses the function of a K1 polypeptide or a K1 gene expression product comprising:
(a) Binding of the candidate compound to the polypeptide or gene expression product (or a cell carrying the polypeptide or gene expression product or a membrane thereof) or a fusion protein thereof directly or indirectly to the candidate compound A method of measuring with a label bound to
(b) Measure binding of the candidate compound to the polypeptide or gene expression product (or a cell carrying the polypeptide or gene expression product or a membrane thereof) or a fusion protein thereof in the presence of a labeled competitor how to,
(c) Use a detection system suitable for the cell or cell membrane carrying the polypeptide or gene expression product to determine whether the candidate compound provides a signal generated by activation or suppression of the polypeptide or gene expression product. To find out,
(d) A candidate compound and a solution containing the polypeptide or gene expression product are simultaneously mixed to prepare a mixture, the activity of the polypeptide or gene expression product in the mixture is measured, and the activity of the mixture How to compare the standard to the standard, and
(e) a method for detecting an effect of a candidate compound on mRNA encoding the polypeptide in the cell and production of the polypeptide
There is provided a screening method comprising a method selected from the group consisting of:
[0029]
Hereinafter, the indications by abbreviations of amino acids, peptides, base sequences, nucleic acids and the like in this specification are the provisions of IUPAC-IUB [IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)], "Guidelines for preparing specifications including base sequence or amino acid sequence" (edited by the Patent Office) and common symbols in this field shall be followed.
[0030]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
As a specific example of the gene of the present invention, one deduced from the DNA sequence of the PCR product named “K1” shown in the Examples described later can be mentioned. The base sequence is as shown in SEQ ID NO: 3.
[0031]
This gene is a human cDNA encoding a novel transcriptional activator (referred to as K1 protein) having a 461 amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and consists of a total length of 2586 bases.
[0032]
The K1 protein encoded by the gene K1 of the present invention is GenBank / EMBL data using the FASTA program (Person WR, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 85, 2444-2448 (1988)). As a result of the base search, homology with CREB / ATF family such as human LZIP, mouse OASIS, and Drosophila BBF-2 was detected. The gene of the present invention has a total length of 19.4 kilobase pairs having 10 exons composed of b-Zip domains including two leucine zipper domains (Leucine-Zip) and a basic domain (basic domain, basic region). It consisted of a genome sequence. The genomic sequence was mapped to human chromosome 19p13.3.
[0033]
In the present invention, the gene includes not only double-stranded DNA but also each single-stranded DNA such as sense strand and antisense strand constituting the DNA, and is not limited to the length. Absent. Therefore, unless otherwise stated, the gene (DNA) of the present invention has a double-stranded DNA containing human genomic DNA, a single-stranded DNA containing a cDNA (sense strand), and a sequence complementary to the sense strand. Both single-stranded DNA (antisense strand) and fragments thereof are included.
[0034]
In the present invention, the gene includes a leader sequence, a coding region, an exon, and an intron. Examples of the polynucleotide include RNA and DNA. DNA includes cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA, and a polypeptide having a specific amino acid sequence includes fragments, homologues, derivatives, and mutants thereof.
[0035]
Variants are naturally occurring allelic variants, non-naturally occurring variants, deletion, substitution, addition, and insertion variants; polynucleotide sequences that do not substantially alter the function of the encoded polypeptide. It means a mutant having.
[0036]
These amino acid sequence alterations (mutations, etc.) may occur in nature due to, for example, mutation or post-translational modification, etc., but artificially utilizing natural-derived genes (eg, specific genes of the present invention). You can also do this.
[0037]
The polypeptides include alleles, homologues, natural variants that are at least 90%, preferably 95%, more preferably 98%, even more preferably 99% homologous.
[0038]
Mutants have structural features that are commonly conserved, and are based on the biological activity of the gene expression product of the present invention, for example, transcriptional activation of other genes as transcriptional activators based on overexpression of the K1 gene, or cAMP Activity that gives interaction with other proteins, for example, hepatitis C virus core protein, and suppresses canceration of the virus by sequence-specific binding activity such as response element binding activity or box-B binding activity Controls the expression of drug metabolizing genes in the liver by activating the transcription of the promoter or the transcription of the cAMP response element binding activity or box-B binding activity existing in the promoter of liver metabolic enzymes And the like that have these transcriptional regulatory activities. Hereinafter, the gene transcription activation action refers to an action in which an expression product of K1 gene (or a sense strand of K1 gene) promotes transcription activation of other genes and promotes expression of other genes.
[0039]
Polypeptide homology can be analyzed by sequence analysis software, for example, measurement using the FASTA program (Clustal, V., Methods Mol. Biol., 25, 307-318 (1994)) or by SWISSSPLOTS.
[0040]
Variant DNA means a silent or conservative variant with respect to amino acid substitution, and represents a mutation in the base sequence in which the amino acid residue encoded by the base sequence does not change.
[0041]
The number of conservative amino acid substitutions is as shown below:

In addition, one or more codons that typically encode a cysteine residue affect the dysfide binding of a particular polypeptide and can be replaced as a result of a deletion of a cysteine residue.
[0042]
Substantial changes in the function created by selecting substituents are slightly less conservative than those listed in the list of amino acids above:
a) the structural background of the polypeptide in the region of the substituents,
b) charge or hydrophobicity of the polypeptide at the target site,
c) Amino acid side chain size (volume).
[0043]
The substitutions commonly expected to produce the greatest changes in protein properties are:
a) a hydrophilic residue such as ceryl or threonyl is substituted for a hydrophobic residue such as leucyl, isoleucyl, fanylalanyl, valyl or alanyl;
b) Cystine or proline is substituted for any other residue,
c) Residues having electropositive side chains, such as lysyl, arginyl, histidyl, are replaced by electronegative residues, such as valamyl or aspartyl,
d) Residues with very large side chains, for example phenylalanine, can be substituted for those without side chains such as glycine.
[0044]
As described above, the provision of the gene K1 of the present invention and the gene product thereof provides information or means that are extremely useful for elucidating, grasping, diagnosing, preventing and treating a novel gene as a transcriptional activator. In addition, the gene of the present invention interacts with the above-mentioned hepatitis C virus core protein, and a novel drug that promotes the induction of the expression of the gene of the present invention used for the treatment of liver cancer prevention and treatment by suppressing the canceration of the virus It can be suitably used in the development of Furthermore, the detection of the expression of the gene of the present invention or the product thereof in an individual or tissue, and the detection of mutation (deletion or point mutation) or abnormal expression of the gene can be performed by interacting with the above hepatitis C virus core protein. It can be suitably used in elucidation and gene diagnosis relating to the interaction between the gene expression protein of the present invention and the hepatitis C virus core protein.
[0045]
Specifically, the gene of the present invention comprises a gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or the entire nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a complementary strand thereof. Although it is shown as a gene comprising a polynucleotide comprising, but not particularly limited thereto, for example, a gene encoding an amino acid sequence having a certain modification in the specific amino acid sequence, and the specific amino acid sequence or base sequence It can be a gene with a certain homology. The certain homology with the specific amino acid sequence or base sequence is, for example, at least 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more. Includes homologues.
[0046]
Regarding the gene variant of the present invention, a gene comprising a base sequence encoding an amino acid sequence (modified amino acid sequence) in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 Also included. Here, the degree of “amino acid deletion, substitution or addition” and the position thereof are such that the modified protein has the same function as the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (K1 protein). Although it is not particularly limited as long as it has the same effect, preferably 1 to a dozen or more, more preferably about 1 to several modifications are preferably exemplified in order to have the same function as the K1 protein.
[0047]
Here, the “similar function” refers to the transcription activation effect of another gene as a transcriptional activator, or sequence-specific binding activity such as cAMP response element binding activity or box-B binding activity, and the like. Interacting activity, for example, interacting with hepatitis C virus core protein to suppress viral canceration, cAMP response element binding activity or box-B binding activity present in liver metabolic enzyme promoter These transcriptional regulatory activities, such as the activity of controlling the expression of drug metabolism genes in the liver by activating the promoter transcription by sequence-specific binding, can be exemplified.
[0048]
Thus, K1 is one of the CREB (cAMP responsive element binding factor) / ATF family. These characteristics are hereinafter referred to as “K1 activity” or “K1 polypeptide activity” or “K1 biological activity”. Among these activities are also antigenic and immunogenic activities of said K1 polypeptide, in particular the antigenic and immunogenic activities of the polypeptide of SEQ ID NO: 1. The polypeptide of the present invention preferably exhibits at least one biological activity of K1.
[0049]
In addition, the gene encoding the modified amino acid sequence may be one that can detect the K1 gene of the present invention that encodes the amino acid sequence before the modification.
[0050]
Furthermore, examples of the DNA molecule of the present invention include the K1 gene having a base sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, but the K1 gene is not particularly limited thereto. Homologues thereof are also encompassed.
[0051]
Here, the “K1 gene homologue” has sequence homology with the K1 gene of the present invention (or its gene product), commonality in the structural features and gene expression patterns, and biology as described above. It means a series of related genes that are recognized as one gene family due to the similarity of their functional functions, and naturally includes alleles (alleles) of the K1 gene.
[0052]
The alteration (mutation) of the amino acid sequence encoded by the above gene may occur in nature by, for example, mutation or post-translational modification. However, the protein or gene derived from nature (for example, human K1 of the present invention or human) Artificially modified based on the K1 gene). The present invention encompasses all modified genes having the above characteristics regardless of the cause and means of such modification / mutation. The gene of the present invention (human K1 gene) also includes an allele of a gene encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
[0053]
Examples of the artificial means include cytospecific mutagenesis [Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987); 100, 468 (1983); Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984); Genetic engineering methods such as Secondary Biochemistry Experiment Course 1 “Gene Research Method II”, edited by Japanese Biochemical Society, p105 (1986)], chemical synthesis means such as phosphate triester method and phosphate amidite method [J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967); 91, 3350 (1969); Science, 150, 178 (1968); Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981); 24, 245 (1983)] and those The combination method of these etc. can be illustrated. More specifically, DNA synthesis can be performed by chemical synthesis by the phosphoramidite method or triester method, and can also be performed on a commercially available automatic oligonucleotide synthesizer. Double-stranded fragments are chemically synthesized single strands produced by synthesizing complementary strands and annealing the strands together under appropriate conditions, or adding complementary strands using DNA polymerase with appropriate primer sequences. It can also be obtained from things.
[0054]
As a specific embodiment of the gene of the present invention, a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 can be exemplified. The coding region in this base sequence shows one combination example of codons indicating each amino acid residue of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. The gene of the present invention is not limited to a gene having such a specific base sequence, and may have a selected base sequence by combining arbitrary codons for each amino acid residue. The selection of codons can be in accordance with a conventional method, for example, considering the frequency of codon usage of the host to be used [Ncleic Acids Res., 9, 43 (1981)].
[0055]
Moreover, the DNA molecule of the present invention includes those consisting of a base sequence having a certain homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, as described above.
[0056]
The homology is at least 70% identity, preferably at least 90% identity, more preferably at least 95% identity, most preferably 98% identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. And the complementary polynucleotide thereof.
[0057]
Such a gene is, for example, represented by SEQ ID NO: 2 under stringent conditions of 50 ° C. in 0.2 × SSC containing 0.1% SDS or 1 × SSC containing 0.1% SDS. A gene having a base sequence that hybridizes with DNA comprising a base sequence can also be exemplified.
[0058]
The gene of the present invention can be easily produced and obtained by general genetic engineering techniques based on the sequence information of the specific examples of the gene of the present invention disclosed by the present invention [Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); secondary biochemistry experiment course "gene research method I, II, III", Japan Biochemical Society edition (1986) etc.).
[0059]
Specifically, a cDNA library is prepared according to a conventional method from an appropriate source from which the gene of the present invention is expressed, and a desired clone is selected from the library using an appropriate probe or antibody specific to the gene of the present invention. [Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981); Science, 222, 778 (1983), etc.].
[0060]
In the above, examples of the origin of cDNA include various cells and tissues that express the gene of the present invention, cultured cells derived therefrom, and the like. In addition, separation of total RNA from these, separation and purification of mRNA, acquisition of cDNA, and cloning thereof can be performed according to conventional methods. In addition, cDNA libraries are commercially available, and in the present invention, these cDNA libraries, for example, various cDNA libraries commercially available from Clontech Lab. Inc. can be used.
[0061]
The method for screening the gene of the present invention from a cDNA library is not particularly limited, and can be performed according to a usual method.
[0062]
Specifically, for example, for a protein produced by cDNA, a method for selecting a corresponding cDNA clone by immunoscreening using a specific antibody of the protein, or a probe that selectively binds to a target DNA sequence is used. Examples thereof include plaque hybridization, colony hybridization, and combinations thereof.
[0063]
As the probe used here, DNA that is chemically synthesized based on information on the base sequence of the gene of the present invention can be generally used, but the gene of the present invention and fragments thereof already obtained can also be used well. it can. In addition, sense primers and antisense primers set based on the base sequence information of the gene of the present invention can also be used as screening probes.
[0064]
The nucleotide sequence used as the probe is a partial nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 2, and has at least 15 consecutive bases, preferably 20 consecutive bases, more preferably 30 consecutive bases, Preferably, those having 50 consecutive bases are also included, or positive clones having the above sequences themselves can be used as probes. Here, the nucleotide sequence used as the probe selected in the present invention is a partial nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 2 and a primer sequence having an oligonucleotide sequence different from the DNA sequence of other CREB / ATF family genes. Needless to say, it is an essential requirement.
[0065]
In obtaining the gene of the present invention, a DNA / RNA amplification method by PCR [Science, 230, 1350 (1985)] can be preferably used. In particular, when it is difficult to obtain a full-length cDNA from a library, the RACE method [Rapid amplification of cDNA ends; experimental medicine, 12 (6), 35 (1994)], particularly the 5′-RACE method [MA Frohman, etal., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)].
[0066]
Primers used in adopting such a PCR method can be appropriately set based on the sequence information of the gene of the present invention clarified by the present invention, and can be synthesized according to a conventional method. It should be noted that isolation and purification of the amplified DNA / RNA fragment can be carried out in accordance with a conventional method as described above, for example, gel electrophoresis.
[0067]
The gene or various DNA fragments of the present invention obtained above can be obtained by conventional methods such as the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)] or the Maxam-Gilbert method [Methods in Enzymology]. , 65, 499 (1980)], etc., or simply using a commercially available sequence kit or the like, the base sequence can be determined.
[0068]
According to the gene of the present invention thus obtained, the presence or absence of expression of the gene of the present invention in an individual or various tissues can be specifically detected by using, for example, a part or all of the base sequence of the gene. Can do.
[0069]
Such detection can be performed according to a conventional method, for example, RT-PCR (Reverse transcribed-Polymerase chain reaction; ES Kawasaki, et al., Amplification of RNA.In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc. , SanDiego, 21-27 (1991)], Northern blotting analysis (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1989)), in situ RT-PCR [Nucl. Acids Res., 21, 3159-3166 (1993) )] Or in situ hybridization, NASBA method [Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350, 91-92 (1991)], and other various methods. Preferable examples include a detection method by RT-PCR.
[0070]
The primer used when employing the PCR method is not particularly limited as long as it is unique to the gene capable of specifically amplifying only the gene of the present invention, and is based on the sequence information of the gene of the present invention. It can be set appropriately. Examples of the normal primer include those having a partial sequence of the gene of the present invention having a length of about 10 to 35 nucleotides, preferably about 15 to 30 nucleotides.
[0071]
As described above, the gene of the present invention also includes a DNA fragment used as a specific primer and / or a specific probe for detecting the K1 gene according to the present invention. It is an essential requirement that the oligonucleotide primer / or probe be different from the DNA sequence of the CREB / ATF family gene.
[0072]
Here, the “different from the DNA sequence of the CREB / ATF family gene” oligonucleotide means a nucleotide sequence in the nucleotide sequence of the K1 gene in order to detect only the K1 gene and not other CREB / ATF family genes. Therefore, it is meant to exclude sequences contained in the DNA sequences of other CREB / ATF family genes.
[0073]
The DNA fragment can be defined as DNA characterized by hybridizing under stringent conditions with DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. Here, stringent conditions include normal conditions used as primers or probes, and are not particularly limited. For example, in 0.2 × SSC containing 0.1% SDS as described above, The conditions of 50 ° C. or 60 ° C. in 1 × SSC containing 0.1% SDS can be exemplified.
[0074]
According to the K1 gene of the present invention, the gene product (K1 protein) or a protein containing the gene product can be easily and stably produced in a large amount by using a normal genetic engineering technique.
[0075]
Therefore, the present invention includes a protein such as K1 protein encoded by the gene of the present invention, a vector containing the gene of the present invention for the production of the protein, a host cell transformed with the vector, the host cell, and the like. And a method for producing the above-described protein of the present invention by cultivating the protein.
[0076]
Specific examples of the protein of the present invention include the K1 protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. The protein of the present invention includes not only the K1 protein but also homologues thereof. Examples of the homologue include a protein having an amino acid sequence in which one or several to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and having the K1 activity. be able to. Here, the K1 activity is based on the transcription activation action of other genes as transcription activators based on the overexpression of the K1 gene, or the sequence-specific binding activity such as cAMP response element binding activity or box-B binding activity. An activity that interacts with other proteins, for example, an activity that interacts with the hepatitis C virus core protein to suppress canceration of the virus, or a cAMP response element binding activity or box that exists in the promoter of a liver metabolic enzyme These transcriptional regulatory activities such as the activity of controlling the expression of drug metabolism genes in the liver by activating sequence-specific binding such as -B binding activity and activating transcription of the promoter can be exemplified. Specifically, the gene product of the homologue of the K1 gene (K1 equivalent gene including allele) can be mentioned.
[0077]
Further, homologues of the K1 protein of the present invention include mammals having the same activity as the K1 protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, such as humans, horses, sheep, cows, dogs, monkeys, cats, bears, Proteins derived from rats, rabbits and the like are also included.
[0078]
Based on the sequence information of the K1 gene provided by the present invention, the protein of the present invention can be prepared by conventional gene recombination techniques [for example, Science, 224, 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Comm., 130 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 5990 (1983), etc.].
[0079]
More specifically, the protein is produced by preparing a recombinant DNA (expression vector) in which a gene encoding the desired protein can be expressed in a host cell, introducing the recombinant DNA into the host cell, This is done by culturing the transformant and then recovering from the resulting culture.
[0080]
As the host cell, any of prokaryotes and eukaryotes can be used. For example, prokaryotic hosts include widely used cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. Examples include those contained in the Escherichia coli K12 strain. In addition, eukaryotic host cells include cells such as vertebrates and yeasts. For example, COS cells [Cell, 23: 175 (1981)], which are monkey cells, and Chinese hamster ovary cells. And its dihydrofolate reductase-deficient strain [Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77: 4216 (1980)] and the like, and Saccharomyces yeast cells are preferably used as the latter. Of course, it is not necessarily limited to these.
[0081]
When a prokaryotic cell is used as a host, a promoter and SD (Shine and Dalgarno) are used upstream of the gene so that the gene of the present invention can be expressed in the vector. An expression plasmid provided with a base sequence and an initiation codon necessary for initiation of protein synthesis (for example, ATG) can be preferably used. In general, plasmids derived from Escherichia coli, such as pBR322, pBR325, pUC12, and pUC13, are often used as the vector. However, the present invention is not limited to these, and various known vectors can be used. Commercially available products of the above-mentioned vectors used in expression systems using E. coli include, for example, pGEX-4T (Amersham Pharmacia Biotech), pMAL-C2, pMAl-P2 (New England Biolabs), pET21, pET21 / lacq (Invitrogen) And pBAD / His (Invitrogen).
[0082]
Examples of the expression vector in the case of using a vertebrate cell as a host generally include a promoter located upstream of the gene of the present invention to be expressed, an RNA splice site, a polyadenylation site and a transcription termination sequence. If necessary, this may have a replication origin. Specific examples of the expression vector include pSV2dhfr [Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)] carrying the SV40 early promoter. In addition to the above, various known commercial vectors can be used. Examples of commercially available vectors used in expression systems using animal cells include animals such as pEGFP-N, pEGFP-C (Clontrech), pIND (Invitrogen), pcDNA3.1 / His (Invitrogen). Vectors for cells, vectors for insect cells such as pFastBac HT (GibciBRL), pAcGHLT (PharMingen), pAc5 / V5-His, pMT / V5-His, pMT / Bip / V5-his (Invitrogen) Can be mentioned.
[0083]
Specific examples of expression vectors in the case of using yeast cells as a host include, for example, pAM82 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983)] having a promoter for the acid phosphatase gene. it can. Examples of commercially available expression vectors for yeast cells include pPICZ (Invitrogen) and pPICZα (Invitrogen).
[0084]
The promoter is not particularly limited, and when a bacterium belonging to the genus Escherichia is used as a host, for example, tryptophan (trp) promoter, lpp promoter, lac promoter, recA promoter, PL / PR promoter and the like can be preferably used. When the host is Bacillus, SP01 promoter, SP02 promoter, penP promoter and the like are preferable. As a promoter in the case of using yeast as a host, for example, pH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like can be suitably used. Examples of preferred promoters when animal cells are used as hosts include SV40-derived promoters, retrovirus promoters, metallothionein promoters, heat shock promoters, cytomegalovirus promoters, SRα promoters and the like.
[0085]
As the expression vector of the gene of the present invention, a normal fusion protein expression vector can also be preferably used. Specific examples of the vector include pGEX (Promega) for expression as a fusion protein with glutathione-S-transferase (GST).
[0086]
In addition, examples of the polynucleotide sequence that helps the expression and secretion of the polypeptide from the host cell by the coding sequence of the mature polypeptide include a secretory sequence and a leader sequence, which are used for purification of the fusion mature polypeptide from a bacterial host. Examples of marker sequences (hexahistidine tag, histidine tag), and mammalian cells include hemagglutinin (HA) tag.
[0087]
A method for introducing a desired recombinant DNA (expression vector) into a host cell and a transformation method using the method are not particularly limited, and various general methods can be employed.
[0088]
The obtained transformant can be cultured according to a conventional method, and the target protein of the present invention encoded by a gene designed as desired by the culture is expressed in the cell, outside the cell or on the cell membrane of the transformant, Produced (accumulated and secreted).
[0089]
As the medium used for the culture, various media commonly used according to the employed host cells can be appropriately selected and used, and the culture can also be performed under conditions suitable for the growth of the host cells.
[0090]
The recombinant protein of the present invention thus obtained can be subjected to various separation operations utilizing its physical properties, chemical properties, etc. ["Biochemical Data Book II", pages 1175-1259, first edition, first print, as desired. Jun. 23, 1980, published by Tokyo Chemical Co., Ltd .; Biochemistry, 25 (25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987), etc.].
[0091]
Specific examples of the method include ordinary reconstitution treatment, treatment with a protein precipitating agent (salting out method), centrifugation, osmotic shock method, ultrasonic crushing, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration). , Adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC) and other liquid chromatography, dialysis methods, and combinations thereof can be exemplified, and a particularly preferred method is specific to the protein of the present invention. Affinity chromatography using a column to which various antibodies are bound can be exemplified.
[0092]
In designing a desired gene encoding the protein of the present invention, the base sequence of the K1 gene shown in SEQ ID NO: 2 can be favorably used. The gene can be used by appropriately selecting and changing a codon indicating each amino acid residue as desired.
[0093]
In addition, when the amino acid sequence encoded by the K1 gene is altered by substitution, deletion, addition or the like, a part of the amino acid residue or amino acid sequence is modified by the aforementioned various methods such as cytospecific mutagenesis. It can be carried out.
[0094]
The protein of the present invention can also be produced by a general chemical synthesis method according to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. The method includes peptide synthesis methods by a normal liquid phase method and a solid phase method.
[0095]
More specifically, in this peptide synthesis method, based on amino acid sequence information, a so-called stepwise elongation method in which each amino acid is sequentially linked one by one to extend the chain and a fragment consisting of several amino acids is synthesized in advance. And then a fragment condensation method in which each fragment is subjected to a coupling reaction, and the protein of the present invention may be synthesized by any of them.
[0096]
The condensation method employed in the peptide synthesis can also follow conventional methods, for example, azide method, mixed acid anhydride method, DCC method, active ester method, redox method, DPPA (diphenylphosphoryl azide) method, DCC + addition Examples thereof include 1-hydroxybenzotriazole, N-hydroxysuccinamide, N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide method, and Woodward method.
[0097]
Solvents that can be used in each of these methods can also be appropriately selected from general solvents that are well known to be used in this kind of peptide condensation reaction. Examples thereof include dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), hexaphosphoroamide, dioxane, tetrahydrofuran (THF), ethyl acetate, and a mixed solvent thereof.
[0098]
In the peptide synthesis reaction, an amino acid or a carboxyl group in a peptide that is not involved in the reaction is generally converted to a lower alkyl ester such as methyl ester, ethyl ester or tertiary butyl ester, such as benzyl ester, p- It can be protected as aralkyl esters such as methoxybenzyl ester and p-nitrobenzyl ester.
[0099]
An amino acid having a functional group in the side chain, for example, a hydroxyl group of a tyrosine residue may be protected with an acetyl group, a benzyl group, a benzyloxycarbonyl group, a tertiary butyl group, or the like, but such protection is necessarily required. There is no. Further, for example, the guanidino group of the arginine residue may be a suitable nitro group, tosyl group, p-methoxybenzenesulfonyl group, methylene-2-sulfonyl group, benzyloxycarbonyl group, isobornyloxycarbonyl group, adamantyloxycarbonyl group, etc. Can be protected by various protecting groups.
[0100]
The deprotection reaction of these protecting groups in the amino acids and peptides having the above protecting groups and the finally obtained protein of the present invention can also be carried out by conventional methods such as catalytic reduction, liquid ammonia / sodium, hydrogen fluoride, bromide. It can be carried out according to a method using hydrogen, hydrogen chloride, trifluoroacetic acid, acetic acid, formic acid, methanesulfonic acid or the like.
[0101]
The protein of the present invention thus obtained can be appropriately purified according to the various methods described above, for example, methods widely used in the field of peptide chemistry such as ion exchange resin, distribution chromatography, gel chromatography, and countercurrent distribution. it can.
[0102]
The K1 protein of the present invention can be suitably used as an immunizing antigen for preparing the specific antibody. By using this antigen, desired antiserum (polyclonal antibody) and monoclonal antibody can be obtained.
[0103]
The method for producing the antibody itself is well understood by those skilled in the art, and in the present invention, these conventional methods can be followed [for example, the Second Biochemistry Experiment Course “Immunobiochemistry Research Method”, edited by the Japanese Biochemical Society. (See 1986).
[0104]
The antibody thus obtained can be advantageously used, for example, for purification of K1 protein and measurement or identification thereof by immunological techniques.
[0105]
Moreover, since the K1 gene expression product of the present invention, or the K1 polypeptide, and a portion thereof have an anticancer effect on liver cancer as a transcriptional activator, the K1 gene expression product, the K1 polypeptide, and a portion thereof It is useful as a pharmaceutical composition as a prophylactic / therapeutic agent for hepatocarcinoma comprising
[0106]
The protein as an active ingredient in the pharmaceutical composition also includes pharmaceutically acceptable salts thereof. Such salts include non-toxic alkali metal salts such as sodium, potassium, lithium, calcium, magnesium, barium, ammonium, alkaline earth metal salts, ammonium salts and the like prepared by methods well known in the art. The Further, the above salts include nontoxic acid addition salts obtained by reacting the protein of the present invention with a suitable organic acid or inorganic acid. Representative non-toxic acid addition salts include, for example, hydrochloride, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, bisulfate, acetate, oxalate, valerate, oleate, laurate, Borate, benzoate, lactate, phosphate, p-toluenesulfonate (tosylate), citrate, maleate, fumarate, succinate, tartrate, sulfonate, glycolate And maleate, ascorbate, benzenesulfonate and napsilate.
[0107]
The pharmaceutical composition includes those containing the protein of the present invention as an active ingredient and a pharmaceutically effective amount thereof together with a suitable non-toxic pharmaceutical carrier or diluent.
[0108]
The pharmaceutical carrier that can be used in the above pharmaceutical composition (pharmaceutical preparation) includes a filler, a bulking agent, a binder, a moistening agent, a disintegrating agent, a surfactant, a lubricant, which are usually used according to the use form of the preparation. A diluent such as an agent or an excipient can be exemplified, and these are appropriately selected and used depending on the dosage unit form of the resulting preparation.
[0109]
Particularly preferred pharmaceutical preparations of the present invention include various components that can be used in normal protein preparations, such as stabilizers, bactericides, buffers, isotonic agents, chelating agents, pH adjusters, surfactants, etc. Prepared using.
[0110]
Examples of the stabilizer include human serum albumin, ordinary L-amino acids, saccharides, cellulose derivatives and the like, and these can be used alone or in combination with a surfactant. In particular, according to this combination, the stability of the active ingredient may be further improved.
[0111]
The L-amino acid is not particularly limited and may be any of glycine, cysteine, glutamic acid and the like.
[0112]
The sugar is not particularly limited. For example, monosaccharides such as glucose, mannose, galactose and fructose, sugar alcohols such as mannitol, inositol and xylitol, disaccharides such as sucrose, maltose and lactose, dextran, hydroxypropyl starch and chondroitin Polysaccharides such as sulfuric acid and hyaluronic acid, and derivatives thereof can be used.
[0113]
There is no particular limitation on the surfactant, and any of ionic and nonionic surfactants can be used. For example, polyoxyethylene glycol sorbitan alkyl ester, polyoxyethylene alkyl ether, sorbitan monoacyl ester, A fatty acid glyceride system can be used.
[0114]
The cellulose derivative is not particularly limited, and methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, carboxymethyl cellulose sodium and the like can be used.
[0115]
The addition amount of the saccharide is appropriately about 0.0001 mg or more, preferably about 0.01 to 10 mg per 1 μg of the active ingredient. The amount of the surfactant added is suitably about 0.00001 mg or more, preferably about 0.0001 to 0.01 mg, per 1 μg of the active ingredient. The amount of human serum albumin added is suitably about 0.0001 mg or more, preferably about 0.001 to 0.1 mg, per μg of active ingredient. The amino acid is suitably about 0.001 to 10 mg per μg of active ingredient. The amount of cellulose derivative added is suitably about 0.00001 mg or more, preferably about 0.001 to 0.1 mg per 1 μg of active ingredient.
[0116]
The amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical preparation of the present invention is appropriately selected from a wide range, but is usually about 0.00001 to 70% by weight, preferably about 0.0001 to 5% by weight. is there.
[0117]
Various additives such as buffering agents, tonicity agents, chelating agents and the like can also be added to the pharmaceutical preparation of the present invention. Here, examples of the buffer include boric acid, phosphoric acid, acetic acid, citric acid, ε-aminocaproic acid, glutamic acid and / or a salt thereof (for example, an alkali such as a sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt thereof). Metal salts and alkaline earth metal salts). Examples of isotonic agents include sodium chloride, potassium chloride, sugars, glycerin and the like. Examples of chelating agents include sodium edetate and citric acid.
[0118]
The pharmaceutical preparation of the present invention can be used as a solution preparation. In addition, the pharmaceutical preparation can be freeze-dried and stored, and then dissolved in a buffer solution containing water for use, saline, etc. It is also possible to use it after it has been prepared.
[0119]
As the dosage unit form of the pharmaceutical preparation of the present invention, various forms can be selected according to the therapeutic purpose, and representative examples thereof include solids such as tablets, pills, powders, powders, granules, capsules and the like. Administration forms and solution administration forms such as solutions, suspensions, emulsions, syrups, elixirs, etc., are further included depending on the route of administration, oral, parenteral, nasal, vaginal, suppository, They are classified into sublingual and ointment and can be prepared, molded or prepared according to ordinary methods.
[0120]
For example, in the case of forming into a tablet form, the above-mentioned preparation carrier includes, for example, excipients such as lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose, silicic acid, potassium phosphate, water , Ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, methylcellulose, polyvinylpyrrolidone and other binders, sodium carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose calcium, low substituted hydroxypropylcellulose, dry starch , Disintegrants such as sodium alginate, agar powder, laminaran powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, lauryl sulfate Surfactants such as sodium and stearic acid monoglycerides, disintegration inhibitors such as sucrose, stearin, cocoa butter and hydrogenated oil, quaternary ammonium bases, absorption promoters such as sodium lauryl sulfate, humectants such as glycerin and starch, Adsorbents such as starch, lactose, kaolin, bentonite and colloidal silicic acid, lubricants such as purified talc, stearate, boric acid powder and polyethylene glycol can be used.
[0121]
Furthermore, the tablet can be a tablet coated with a normal coating as necessary, for example, a sugar-coated tablet, a gelatin-encapsulated tablet, an enteric-coated tablet, or a film-coated tablet, and can also be a double tablet or a multilayer tablet.
[0122]
In shaping into a pill form, as a formulation carrier, for example, excipients such as glucose, lactose, starch, cacao butter, hydrogenated vegetable oil, kaolin, talc, binders such as gum arabic powder, tragacanth powder, gelatin, ethanol, Disintegrants such as laminaran and agar can be used.
[0123]
Capsules are usually prepared by mixing the active ingredients of the present invention with the various preparation carriers exemplified above and filling them into hard gelatin capsules, soft capsules and the like according to conventional methods.
[0124]
Liquid dosage forms for oral administration include pharmaceutically acceptable solutions, emulsions, suspensions, syrups, elixirs and the like, including conventional inert diluents such as water, and wetting agents, emulsions, suspensions. Auxiliaries such as agents can be included and these are prepared according to conventional methods.
[0125]
In preparing liquid dosage forms for parenteral administration, such as sterile aqueous or non-aqueous solutions, emulsions, suspensions, etc., diluents such as water, ethyl alcohol, propylene glycol, polyethylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, Polyoxygenated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters and vegetable oils such as olive oil can be used, and injectable organic esters such as ethyl oleate can be blended. Furthermore, usual solubilizers, buffers, wetting agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, dispersing agents and the like can be added to these. Sterilization can be performed by, for example, filtration operation through a bacteria retention filter, blending of a bactericide, irradiation treatment, heat treatment, and the like. They can also be prepared in the form of sterile solid compositions that can be dissolved in sterile water or a suitable sterilizable medium immediately before use.
[0126]
When forming into a suppository or a preparation for vaginal administration, for example, polyethylene glycol, cacao butter, higher alcohol, esters of higher alcohol, gelatin, semi-synthetic glyceride and the like can be used as a pharmaceutical carrier.
[0127]
When forming into the form of an ointment such as paste, cream or gel, for example, white petrolatum, paraffin, glycerin, cellulose derivatives, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as silicon, bentonite and olive oil can be used as a diluent. .
[0128]
The composition for nasal or sublingual administration can be prepared according to a conventional method using a known standard excipient.
[0129]
In addition, in the chemical | medical agent of this invention, a coloring agent, a preservative, a fragrance | flavor, a flavor agent, a sweetener, other pharmaceuticals etc. can be contained as needed.
[0130]
The administration method of the pharmaceutical preparation is not particularly limited, and is determined according to various preparation forms, patient age, sex and other conditions, the degree of disease, and the like. For example, tablets, pills, solutions, suspensions, emulsions, granules, and capsules are administered orally, and injections are administered intravenously alone or mixed with normal fluids such as glucose and amino acids. Independently administered intramuscularly, intradermally, subcutaneously or intraperitoneally, suppositories are administered rectally, vaginal agents are administered intravaginally, nasal agents are administered intranasally, sublingual agents are administered orally, Ointments are topically administered transdermally.
[0131]
The amount of the active ingredient to be contained in the pharmaceutical preparation and the dose thereof are not particularly limited, and are appropriately selected from a wide range depending on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, patient age, sex, and other conditions. Selected. In general, the dose is usually about 0.01 μg to 10 mg, preferably about 0.1 μg to 1 mg per kg of body weight per day. Can be administered in divided doses.
[0132]
At present, when hepatitis C develops, hepatic cancer develops at a high rate, but no fundamental treatment has been found, and a breakthrough treatment is expected. It is well known that hepatitis C virus develops when hepatitis C virus infects hepatocytes, and the transgenic mouse forcibly expressing the core protein, which is a component of hepatitis C virus, It is known to develop liver cancer and is thought to be closely related to the development of liver cancer. It is known that this hepatitis C virus core protein interacts with the transcription factor LZIP, suppresses the transcription activation ability of LZIP, and further has an effect of cancerizing cells. The present inventors have found that the transcription factor K1 of the present invention exhibits high amino acid sequence homology with LZIP and expresses in a liver-specific manner, as shown in Examples described later. This means that transcription factor K1 interacts with hepatitis C virus core protein directly, indirectly through LZIP, or indirectly through competing for binding of LZIP to a transcription target gene. This suggests the possibility of being involved in the development of liver cancer. Accordingly, gene therapy is performed using the vector expressing the K1 gene of the present invention, and the K1 gene is overexpressed in virus-infected cells, thereby canceling the canceration effect of the core protein, thereby preventing hepatitis C caused by hepatitis C virus. It may be possible to prevent and treat the onset.
[0133]
That is, an arbitrary gene expression vector including all or part of the sense strand of the K1 gene of the present invention is prepared, and the expression vector is forcibly expressed in these tissues, whereby transcription based on overexpression of the K1 gene is performed. Activity that gives interaction with other proteins by transcription activation of other genes as an activator, or sequence-specific binding activity such as cAMP response element binding activity or box-B binding activity, such as hepatitis C virus It interacts with the core protein and suppresses the canceration of the virus, or sequence-specific binding such as cAMP response element binding activity or box-B binding activity present in the promoter of liver metabolic enzyme, and transcription of the promoter These activities, such as the activity that regulates the expression of drug metabolism genes in the liver by activation, As gene therapeutic composition having a regulatory activity, or considered to be utilized as a gene therapy agent.
[0134]
Accordingly, the present invention is intended to provide a gene therapy vector containing all or part of the sense strand of the K1 gene, and a medicament comprising as an active ingredient a cell into which the sense strand of the K1 gene has been introduced. .
[0135]
That is, according to the present invention, a gene therapy introduction vector containing a sense strand of the K1 gene containing all or part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and a cell into which the K1 gene sense strand has been introduced by the vector And a gene therapy agent comprising, as an active ingredient, the gene therapy introduction vector and a cell into which the K1 gene sense strand has been introduced by the vector.
[0136]
In addition, according to the present invention, a gene therapy introduction vector containing a K1 gene sense strand containing the sense strand of all or part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and a K1 gene sense strand introduced by the vector Based on the transcriptional activation effect in these tissues by administering the cells into hepatitis C patient liver or to the patient's vascular tissue site to interact with hepatitis C virus core protein of hepatitis C patients It is possible to provide an agent for suppressing canceration and promoting K1 activity or an anticancer drug in patients with hepatitis C, which is characterized by promoting an anticancer effect or the expression level of K1 gene in these cells.
[0137]
Furthermore, according to the present invention, a medicament containing the above-described viral vector for gene therapy introduction containing the K1 gene sense strand as an active ingredient, particularly K1 activity, ie, transcriptional activity, cAMP response element binding activity or Provided is a medicament for use in a treatment for activating transcription of a linked gene based on a sequence-specific binding activity such as box-B binding activity or an enhancement of these binding activities.
[0138]
Hereinafter, such gene therapy will be described in detail. In the following gene therapy, conventional methods of chemistry, molecular biology, microbiology, recombinant DNA, genetics, and immunology can be used unless otherwise specified. These include, for example, Maniatis (Tania, T., et al., Molecular cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)), Sambrook (J., et al. Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1981)), Ausbel (FM, et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, New York, (1992)), Grover (Glover, D., DNA Cloning, I and II (Oxford Press) (1985)), Anand (Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press (1992) ), Guthrie (G., et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, (Academic Press) (1991)) and Fink (Fink, et al., Hum. Gene Ther., 3, 11-19 ( 1992).
[0139]
In gene therapy, according to the present invention, in a cell expressing the K1 gene of the present invention, K1 activity is promoted or transcriptionally activated by providing a sense drug for increasing the amount of mRNA in the cell and promoting the expression of the K1 gene. Furthermore, the present invention provides a gene therapy method that promotes the activation of transcription of a linked gene based on a sequence-specific binding activity such as cAMP response element binding activity or box-B binding activity, or an enhanced activity of these binding activities. The therapeutic method is a method of promoting the expression of a target gene by, for example, accelerating the transcription or translation process of mRNA inherent in the K1-expressing cell having the K1 gene. For this purpose, a sense oligonucleotide complementary to the mRNA of the gene can be produced, and this sense oligonucleotide can be regarded as a method of supplying the target cells.
[0140]
If the action of promoting the expression function of the K1 gene is supplied, the K1 activity in the recipient cell / target cell can be promoted. It can be maintained outside the chromosome using a vector or plasmid containing the sense oligonucleotide and introduced into the target cell.
[0141]
According to gene therapy for hepatitis C patients using the sense oligonucleotide described above, the sense oligonucleotide is incorporated into a retrovirus, adenovirus, or AAV-derived vector, and this is infected with K1 activity-expressing cells. By overexpressing the oligonucleotide, the desired gene action can be obtained.
[0142]
Thus, when the sense oligonucleotide is introduced into a cell having the K1 gene to promote the expression of the K1 protein, the sense oligonucleotide does not need to correspond to the full length of the corresponding K1 gene. As long as the function that promotes the expression function of the K1 gene is maintained, a gene consisting of a partial sequence that retains a specific function can be used as well as the above-described variant. .
[0143]
Vectors for the introduction of desired genes for both recombination and extrachromosomal maintenance are already known in the art, and any such known vector can be used in the present invention. For example, a viral vector or a plasmid vector containing a copy of the K1 sense oligonucleotide linked to an expression control element and capable of expressing the sense oligonucleotide product in the target cell can be mentioned. As such vectors, the above-described expression vectors can be used, but preferably, for example, vectors disclosed in US Pat. No. 5,252,479 and PCT International Publication No. WO 93/07282, for example, as origin vectors ( Examples include vectors prepared using pWP-7A, pwP-19, pWU-1, pWP-8A, pWP-21 and / or pRSVL) or pRC / CMV (Invitrogen). More preferred are various virus vectors described later.
[0144]
In addition, as a promoter used for a vector used in gene transfer therapy, a promoter specific to a diseased tissue to be treated for various diseases can be suitably used.
[0145]
Specific examples thereof include, for example, albumin, α-fetoprotein, α1-antitrypsin, transferrin, transstyrene and the like for the liver. For the colon, carboxylic acid anhydrase I, an antigen of carcinoenbrogen, and the like can be exemplified. For the uterus and placenta, estrogen, aromatase cytochrome P450, cholesterol side chain cleavage P450, 17 alpha hydroxylase P450 and the like can be exemplified.
[0146]
For the prostate, prostate antigen, gp91-fox gene, prostate-specific kallikrein and the like can be exemplified. Examples of the breast include erb-B2, erb-B3, β-casein, β-lactoglobin, and whey protein. For the lung, active agent protein C uroglobulin and the like can be exemplified. Examples of the skin include K-14-keratin, human keratin 1 or 6, and leucline.
[0147]
For the brain, examples include glial fibrillary acidic protein, mature astrocyte specific protein, myelin basic protein, and tyrosine hydroxylase. Examples of the pancreas include virin, glucagon, and islets of Langerhans. Examples of thyroid gland include thyroglobulin and calcitonin. For bone, α1 collagen, osteocalcin, bone sialoglycoprotein and the like can be exemplified. For the kidney, renin, liver / bone / kidney alkaline phosphatase, erythropoietin and the like can be exemplified, and for the pancreas, amylase, PAP1 and the like can be exemplified.
[0148]
In the production of the sense oligonucleotide introduction vector, the sense oligonucleotide (all or a part of the sequence corresponding to the K1 gene sequence) to be introduced is based on the nucleotide sequence information of the K1 gene of the present invention as described above. It can be easily produced and obtained by a general genetic engineering technique.
[0149]
Such a sense / oligonucleotide-introducing vector can be introduced into cells by various methods already known in the art for introducing DNA into cells, such as electroporation, calcium phosphate coprecipitation, and virus transduction. Can be done according to the method. The cells transformed with the K1 sense oligonucleotide can be used as a drug for promoting K1 activity in the isolated state or as a model system for therapeutic research.
[0150]
In gene therapy, the above-mentioned vector for introducing a sense oligonucleotide can be introduced into a target cell of a patient by locally or systemically injecting it into a target tissue site of the patient. In this case, systemic administration can reach any cell where K1 mRNA can be expressed at other sites. If the transduced gene is not permanently incorporated into the chromosome of each target cell, it can be achieved by periodically repeating the administration.
[0151]
The gene therapy method of the present invention includes an in vivo method in which the above-described material for introducing a sense oligonucleotide (sense oligonucleotide introduction vector) is directly administered into the body, and a target cell from the patient's body. And ex vivo methods in which the cells are taken out and the gene is introduced outside the body, and then the cells are returned to the body.
[0152]
In addition, gene therapy in which a K1 sense oligonucleotide is directly introduced into cells is also possible.
[0153]
A gene introduction vector containing the entire sense oligonucleotide having a sequence corresponding to the present invention K1 or a fragment thereof, and a cell into which human K1 sense oligonucleotide is introduced by the vector, which will be described later, as an active ingredient The gene therapy agent is intended especially for patients with hepatitis C, but the gene therapy (treatment) described above is not limited to patients with hepatitis C, but hepatitis C caused by hepatitis C virus core protein. It can also be performed for the purpose of treating complications.
[0154]
Moreover, the target cell into which the sense oligonucleotide is introduced can be appropriately selected depending on the target of gene therapy (treatment). For example, in addition to brain / nerve tissue, brain cells, brain neurons, tissue cells with K1 expression, heart, placenta, lung, liver, pancreas, spleen, small intestine, peripheral blood tissues as target cells, Examples thereof include cells, lymphocytes, fibroblasts, hepatocytes, hematopoietic stem cells, and the like.
[0155]
The methods for introducing sense oligonucleotides in the gene therapy include viral introduction methods and non-viral introduction methods.
[0156]
Examples of the viral introduction method include a method using a retroviral vector as a vector in view of the fact that the K1 sense oligonucleotide is a foreign substance expressed in normal cells. Other viral vectors include adenovirus vectors, HIV (human immunodeficiency virus) vectors, adeno-associated virus vectors (AAV), herpes virus vectors, herpes simplex virus (HSV) vectors, and Epstein-Barr virus (EBV). , Epstein-Barr virus) vector.
[0157]
Non-viral gene transfer methods include calcium phosphate coprecipitation; fusion of liposomes encapsulating DNA with inactivated Sendai virus that had previously been destroyed by ultraviolet light to create membrane-fused liposomes that are fused directly to the cell membrane. Membrane fusion liposome method for introducing DNA into cells [Kato, K., et al., J. Biol. Chem., 266, 22071-22074 (1991)]; To introduce DNA into cells [Yang, NS et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 9568-9572 (1990)]; Naked that directly injects plasmid DNA into an organ or tumor in vivo (Naked) DNA method [Wolff, JA, et al., Science, 247, 1465-1467 (1990)]; Cationic liposome method for introducing a gene embedded in multi-layer positively charged liposomes into cells [Kunio Yagi, Medicine Noyumi, Vol.175, No.9, 635-637 (1995)]; specific In order to introduce a gene only into a cell and prevent it from entering other cells, a ligand that binds to a receptor expressed in the target cell is bound to DNA and administered to the ligand-DNA complex method [Frindeis , et al., Trends Biotechnol., 11, 202 (1993); Miller, et al., FASEB J., 9, 190 (1995)] and the like.
[0158]
In the ligand-DNA complex method, for example, asialoglycoprotein receptor expressed in hepatocytes is used as a target and asialoglycoprotein is used as a ligand [Wu, et al., J. Biol. Chem., 266, 14338 (1991 Ferkol, et al., FASEB J., 7, 1081-1091 (1993)] and methods using transferrin as a ligand targeting transferrin receptors that are strongly expressed in tumor cells [Wagner et al., Proc Natl. Acad. Sci., USA., 87,3410 (1990)].
[0159]
Further, the gene transfer method used in the present invention may be a combination of various biological and physical gene transfer methods as described above as appropriate. Examples of the combination method include a method in which a certain size of plasmid DNA is combined with a polylysine-conjugated antibody specific for adenovirus hexon protein. According to this method, the sense oligonucleotide of the present invention can be introduced by binding the resulting complex to an adenovirus vector and infecting the cell with the thus obtained trimolecular complex. This method allows efficient binding, internalization and endosomal degradation before the DNA coupled to the adenoviral vector is damaged. The liposome / DNA complex can also mediate gene transfer directly in vivo.
[0160]
Hereinafter, a specific method for preparing a viral vector for introducing a sense oligonucleotide of the present invention and a method for introducing a sense oligonucleotide into a target cell or target tissue will be described.
[0161]
The retroviral vector system consists of a viral vector and helper cells (packaging cells). Here, helper cells express genes such as retrovirus structural protein gag (structural protein in viral particles), pol (reverse transcriptase), env (envelope protein), etc., but generate viral particles. Not say cells. On the other hand, viral vectors have packaging signals and LTR (long terminal repeats), but do not have structural genes such as gag, pol, and env necessary for virus replication. The packaging signal is a sequence that becomes a tag during the assembly of the viral particle, and the desired gene (neo, hyg) and the desired introduced sense oligonucleotide (K1 corresponding to K1 or The fragment) is inserted instead of the viral gene. Here, in order to obtain high titer virus particles, it is important to shorten the insert as much as possible, to widen the packaging signal including a part of the gag gene, and not to leave the ATG of the gag gene. is there.
[0162]
By transferring a vector DNA incorporating a desired sense oligonucleotide of K1 into a helper cell, the vector genomic RNA is packaged by a viral structural protein produced by the helper cell, and a virus particle is formed and secreted. In a virus particle as a recombinant virus, after infecting a target cell, DNA reversely transcribed from the viral genomic RNA is incorporated into the cell nucleus, and the sense gene inserted into the vector is expressed.
[0163]
As a method for increasing the efficiency of introducing a desired gene, a method using a fragment containing a cell adhesion domain of fibronectin, a heparin binding site and a junction segment [Hanenberg, H., et al., Exp. Hemat., 23, 747 (1995)] can also be adopted.
[0164]
Examples of vectors used in the retroviral vector system include retroviruses derived from mouse leukemia virus (McLachlin, JR, et al., Proc. Natl. Acad. Res. Molec. Biol., 38, 91-135 (1990)].
[0165]
The adenoviral vector can be described in detail with reference to Berkner (Berkner, KL, Curr. Topics Microbiol. Immunol., 158, 39-66 (1992)), Setoguchi Yasuhiro et al. [Setoguchi Y., et al., Blood, 84, 2946-2953 (1994)], Hiromi Kaneka et al. [Experimental Medicine, 12, 28-34 (1994)], and Kenner et al. [Ketner, G., et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 91, 6186-6190 (1994)].
[0166]
For example, to create a non-proliferating adenovirus vector, first the E1 and / or E3 gene region of the adenovirus early gene is removed. Next, the desired desired foreign gene expression unit (target introduced sense oligonucleotide, ie, the sense oligonucleotide of the present invention K1, the promoter for transcription of the sense oligonucleotide, the stability of the transcribed gene) A plasmid vector containing a part of adenoviral genomic DNA and a plasmid containing the adenoviral genome are simultaneously transfected into, for example, 293 cells. By making homologous recombination between the two and replacing the gene expression unit with E1, a non-proliferative adenovirus vector, which is the vector of the present invention containing the desired sense oligonucleotide of K1, is prepared. can do. Alternatively, adenoviral genomic DNA can be incorporated into a cosmid vector to create a 3'-side adenoviral vector with a terminal protein added. Furthermore, YAC vectors can also be used for the production of recombinant adenovirus vectors.
[0167]
In summary of the production of adeno-associated virus (AAV) vectors, AAV was discovered as a small virus that enters adenovirus culture systems. In this, the presence of a genus Parvovirus that grows autonomously in a host cell without requiring a helper virus for virus replication and a genus Dependvirus that requires a helper virus have been confirmed. The AAV has a wide host range and is a common virus that infects various cells. The viral genome is composed of linear single-stranded DNA having a size of 4680 bases, and 145 bases at both ends thereof are ITR (inverted terminal repeat). It exists with a characteristic arrangement called. This ITR portion serves as a replication origin and serves as a primer. Furthermore, the ITR is essential for packaging into viral particles and integration into chromosomal DNA of host cells. As for viral proteins, the left half of the genome encodes a nonstructural protein, that is, a regulatory protein Rep that controls replication and transcription.
[0168]
Recombinant AAV can be produced by utilizing the property that AAV is incorporated into chromosomal DNA, and thus a desired vector for gene introduction can be produced. More specifically, in this method, first, a plasmid (AAV vector plasmid) in which ITRs at both ends of 5 ′ and 3 ′ of wild-type AAV are left, and a desired introduction sense oligonucleotide (K1 sense oligonucleotide) is inserted therebetween. ). On the other hand, viral proteins required for virus replication and virus particle formation are supplied by another helper plasmid. It is necessary to make sure that there is no common base sequence between the two so that wild-type virus due to genetic recombination does not appear. Thereafter, when both plasmids are introduced into, for example, 293 cells by transfection, and further infected with adenovirus as a helper virus (which may be a non-proliferative type when 293 cells are used), a desired non-proliferative set is obtained. Alternative AAV is produced. Subsequently, since this recombinant AAV exists in the nucleus, the cells are recovered by freezing and thawing, and the adenovirus mixed therein is inactivated by heating at 56 ° C. If necessary, the recombinant AAV is separated and concentrated by ultracentrifugation using cesium chloride. A desired recombinant AAV for gene transfer can be obtained as described above.
[0169]
The EBV vector can be produced, for example, according to the method of Shimizu et al. [Norio Shimizu, Cell Engineering, 14 (3), 280-287 (1995)].
[0170]
The production of an EBV vector for introduction of a sense oligonucleotide according to the present invention is summarized as follows. EB virus (Epstein-Barr virus: EBV) is isolated from cultured cells derived from Burkitt lymphoma by Epstein et al. It belongs to the family [Kieff, E. and Liebowitz, D .: Virology, 2nd ed. Raven Press, New York, 1990, pp.1889-1920]. Since the EBV has an activity of transforming cells, it is necessary to prepare a virus lacking the transforming activity in order to obtain a vector for gene transfer. This can be done as follows.
[0171]
That is, first, the EBV genome in the vicinity of the target DNA into which a desired foreign gene is incorporated is cloned. A DNA fragment of a foreign gene and a drug resistance gene are incorporated therein and used as a recombinant virus production vector. Subsequently, the recombinant virus production vector excised with an appropriate restriction enzyme is transfected into EBV-positive Akata cells. Recombinant virus generated by homologous recombination can be recovered together with wild type AkataEBV by virus production stimulation by anti-surface immunoglobulin treatment. By infecting this with EBV-negative Akata cells and selecting a resistant strain in the presence of a drug, it is possible to obtain Akata cells infected only with a desired recombinant virus that does not coexist with wild-type EBV. Further, by inducing viral activity in recombinant virus-infected Akata cells, a desired large amount of recombinant viral vector can be produced.
[0172]
Production of a non-viral vector in which a desired sense oligonucleotide is introduced into a target cell without using a recombinant viral vector can be carried out, for example, by a gene transfer method using membrane-fused liposomes. This is a method in which the contents of liposomes are directly introduced into cells by imparting fusion activity to cell membranes to membrane liposomes (vesicles composed of lipid bilayer membranes).
[0173]
Introduction of the sense oligonucleotide by the membrane fusion liposome can be performed, for example, by the method of Nakanishi et al. (Nakanishi, M., et al., Exp. Cell Res., 159, 399-499 (1985); Nakanishi, M., et al., Gene introduction into animal tissues. In Trends and Future Perspectives in Peptide and Protein Drug Delivery (ed. By Lee, VH et al.)., Harwood Academic Publishers Gmbh. Amsterdam, 1995, pp.337- 349].
[0174]
Hereinafter, the introduction method of the sense oligonucleotide by the membrane fusion liposome will be outlined. That is, a Sendai virus whose gene has been inactivated by ultraviolet rays and a liposome encapsulating a high-molecular substance such as a desired sense oligonucleotide or expressed protein are fused at 37 ° C. The membrane-fused liposome has a structure called a pseudovirus having a liposome-derived cavity on the inside and the same spike as the virus envelope on the outside. Further, after purification by sucrose density gradient centrifugation, the membrane-fused liposome is adsorbed at 4 ° C. to the target cultured cells or tissue cells. Subsequently, when the temperature is 37 ° C., the contents of the liposome are introduced into the cell, and the desired sense oligonucleotide can be introduced into the target cell. Here, as the lipid used as the liposome, it is preferable to prepare and use a monolayer liposome having a diameter of 300 nm with 50% (molar ratio) cholesterol, lecithin and a synthetic phospholipid having a negative charge.
[0175]
Moreover, as a method for introducing a sense oligonucleotide into a target cell using another liposome, a sense oligonucleotide introduction method using a cationic liposome can be mentioned. This method can be performed according to the method of Yagi et al. [Yagi, K., et al., B.B.R.C., 196, 1042-1048 (1993)]. In this method, focusing on the fact that both the plasmid and the cell are negatively charged, a positive charge is applied to both the inner and outer surfaces of the liposome membrane, the uptake of the plasmid is increased by static electricity, and the interaction with the cell is enhanced. To do. As the liposome used here, a multilamellar large vesicles (MLV) having a positive charge is useful, but a large unilamellar vesicles (LUV) or a small unilamellar vesicles (LUV). : SUV) can be used to create a complex with the plasmid and introduce the desired sense oligonucleotide.
[0176]
The outline of the preparation method of plasmid-embedded cationic MLV is as follows. First, lipid TMAG (N- (α-trimethylammonioacetyl) -didodecyl-D-glutamate chloride), DLPC (dilauroyl phosphatidylcholine) and DOPE (dioleoyl phosphatidylethanolamine) at a molar ratio of 1. : Prepare a chloroform solution (lipid concentration: 1 mM) containing 2: 2. Next, a total amount of 1 μmol of lipid is put in a Spitz-type test tube, and chloroform is removed under reduced pressure by a rotary evaporator to prepare a lipid thin film. Further, chloroform is completely removed under reduced pressure and dried. Next, 0.5 ml of Dulbecco's phosphate buffered saline-Mg, Ca containing 20 μg of gene transfer plasmid was added, and after substitution with nitrogen gas, the mixture was stirred with a vortex mixer for 2 minutes to obtain the desired sense oligo A plasmid-embedded cationic MLV suspension containing nucleotides can be obtained.
[0177]
As an example of using the plasmid-embedded cationic MLV obtained above as a gene therapy agent, for example, an expression plasmid incorporating a sense oligonucleotide for expression purposes is 0.6 μg as the DNA amount in the cationic MLV, and 30 n as the liposome lipid amount. An example is a method of embedding in a molar state and suspending it in 2 μl of a phosphate buffered physiological saline and administering it to target cells or patient tissues extracted from a patient every other day.
[0178]
In the gene therapy of the present invention, methods for introducing a desired gene into a target cell or target tissue typically include two methods.
[0179]
The first method involves collecting target cells from a patient to be treated and then culturing the cells outside the body under the addition of, for example, interleukin-2 (IL-2). This is a method (ex vivo method) in which the obtained cells are re-transplanted after introducing the K1 sense oligonucleotide. This method has been reported to be suitable for the treatment of ADA deficiency, genetic diseases caused by defective genes, arteriosclerosis, cancer, AIDS, and the like.
[0180]
The second method is a direct gene introduction method (direct method) in which a target sense oligonucleotide (sense oligonucleotide of K1) is directly injected into a target site such as in a patient's liver, portal vein, or vascular tissue.
[0181]
More specifically, the first method of gene therapy is performed as follows, for example. That is, mononuclear cells collected from a patient are collected from monocytes using a blood separation device, and the sorted cells are cultured in an appropriate medium such as AIM-V medium in the presence of IL-2 for about 72 hours. A vector containing the sense oligonucleotide to be introduced (K1 sense oligonucleotide) is added. In order to increase the efficiency of introduction of the sense oligonucleotide, it may be centrifuged at 2500 rpm for 1 hour at 32 ° C. in the presence of protamine, and then cultured at 37 ° C. under 10% carbon dioxide for 24 hours. After repeating this operation several times, the cells were further cultured for 48 hours in an AIM-V medium in the presence of IL-2, the cells were washed with physiological saline, the number of viable cells was calculated, and the sense oligonucleotide introduction efficiency was increased. If the desired target is K1 activity (for example, transcriptional activity) as in the present invention, the effect of introducing the target sense oligonucleotide is confirmed by measuring the degree of the activity.
[0182]
The degree of activity can be confirmed by the degree of transcriptional activation of the luciferase reporter gene in vitro, as shown in Examples below.
[0183]
In addition, after confirming the safety, such as bacterial / fungal culture in the cultured cells, presence of mycoplasma infection, endotoxin search, etc., and confirming the safety, sense oligonucleotide (K1 sense of the expected effective dose) -Return the cultured cells introduced with the oligonucleotide) to the patient by intravenous infusion. Gene therapy is performed by repeating such a method, for example, at intervals of several weeks to several months.
[0184]
Here, the dosage of the viral vector is appropriately selected depending on the target cells to be introduced. Usually, as virus titer, for example, target cells 1 × 10⁸1 x 10 for cells^Three1 x 10 from cfu⁸It is preferable to employ a dose that falls within the cfu range.
[0185]
As an alternative to the first method, a target cell is obtained by co-culturing a virus-producing cell containing a retroviral vector containing a target sense oligonucleotide (K1 sense oligonucleotide) and, for example, a patient's cell. It is also possible to adopt a method of introducing a helic oligonucleotide (K1 sense oligonucleotide).
[0186]
In conducting the second method (direct method) of gene therapy, it is determined whether or not the target sense oligonucleotide (sense oligonucleotide of K1) is actually introduced by the gene introduction method, particularly by preliminary experiments outside the body. Increase in specific activity, which is a desired therapeutic effect based on the search of vector gene cDNA in advance by PCR method or in-situ PCR method, or based on introduction of target sense oligonucleotide (sense oligonucleotide of K1) It is desirable to confirm the increase in proliferation and suppression of proliferation of target cells. When viral vectors are used, gene therapy can be performed by searching for proliferative retroviruses by PCR, measuring reverse transcriptase activity, or monitoring membrane protein (env) genes by PCR. Needless to say, it is important to confirm the safety by introducing the sense oligonucleotide.
[0187]
In the gene therapy method of the present invention, especially when targeting hepatitis C patients or hepatitis C complications, for example, peripheral blood cells (K1-expressing cells) are collected from the patients and then subjected to enzyme treatment to establish cultured cells. Subsequently, for example, retrovirus is introduced into peripheral blood cells (K1-expressing cells) targeting the desired sense oligonucleotide, and after screening with G418 cells, the expression level of IL-12 or the like is measured (in vivo). An example is a method for preventing or treating cancerous hepatitis C and its complications that are then administered by radiation treatment and inoculated into the patient's peripheral blood, liver, or portal vein.
[0188]
The present invention also comprises, as an active ingredient, a cell into which the sense oligonucleotide introduction vector of the present invention or the target sense oligonucleotide (K1 sense oligonucleotide, etc.) has been introduced. A pharmaceutical composition or pharmaceutical preparation (gene therapy agent) is provided that is contained together with an active pharmaceutical carrier or diluent.
[0189]
As a pharmaceutical carrier that can be used in the pharmaceutical composition (pharmaceutical preparation) of the present invention, a filler, a bulking agent, a binder, a moistening agent, a disintegrant, a surfactant, which are usually used according to the use form of the preparation, Diluents or excipients such as lubricants can be exemplified, and these can be appropriately selected and used depending on the dosage unit form of the resulting preparation.
[0190]
For example, the pharmaceutical preparation containing the sense oligonucleotide introduction vector of the present invention is a culture in which the vector is embedded in a liposome or a virus-infected culture containing a retroviral vector containing the desired sense oligonucleotide. Prepared in cell form.
[0191]
These can be prepared in a form mixed in phosphate buffered saline (pH 7.4), Ringer's solution, or an injection for intracellular composition, and administered together with a substance that increases gene transfer efficiency such as protamine. It can also be prepared in such a form.
[0192]
The administration method of the pharmaceutical preparation is not particularly limited, and is determined according to various preparation forms, patient age, sex and other conditions, the degree of disease, and the like.
[0193]
The amount of the active ingredient to be contained in the pharmaceutical preparation and the dose thereof are not particularly limited, and are appropriately selected from a wide range depending on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, patient age, sex, and other conditions. Selected.
[0194]
In general, the dosage of the desired sense oligonucleotide-containing retroviral vector as a pharmaceutical formulation is about 1 × 10 5 per kg body weight per day, for example, the titer of retrovirus.^Three1 x 10 from pfu¹⁵It should be about pfu.
[0195]
In addition, in the case of a cell into which a desired sense oligonucleotide for introduction is introduced, 1 × 10^Four1 x 10 from cells / body¹⁵It is appropriate to select from the range of about cells / body.
[0196]
The preparation can be administered once or several times a day, or can be intermittently administered at intervals of 1 to several weeks. In addition, Preferably, it can administer together with the substance which improves gene transfer efficiency, such as a protamine, or a formulation containing this.
[0197]
When the gene therapy according to the present invention is applied to the prevention or treatment of canceration of hepatitis C, the above-mentioned various gene therapies can be appropriately combined (joined gene therapy). A combination of antiviral agents such as interferon and diet therapy can also be performed. Furthermore, the gene therapy of the present invention, including its safety, can be performed with reference to NIH guidelines [Recombinant DNA Advisory Committee, Human Gene Therapy, 4, 365-389 (1993)].
[0198]
Further, according to the present invention, in order to detect the presence of the K1 gene, it is possible to prepare a biological sample such as blood or serum, extract a nucleic acid as desired, and analyze whether or not the K1 gene is present. It is. The detection method is designed so that, for example, a K1 DNA fragment is prepared and used for screening and / or amplification of the K1 gene. More specifically, for example, K1 amplified by polymerase chain reaction (PCR) that has a property as a probe in plaque hybridization, colony hybridization, Southern blotting, Northern blotting, or the like, and a nucleic acid sequence is amplified by polymerase. A probe having the property of being able to obtain all or a part of the DNA fragment can be prepared. For that purpose, first, a primer having the same sequence as K1 is prepared, used as a screening probe, and reacted with a biological sample (nucleic acid sample), whereby the presence of a gene having the K1 sequence can be confirmed. The nucleic acid sample may be prepared by various methods that facilitate detection of the target sequence, such as denaturation, restriction digestion, electrophoresis or dot blotting.
[0199]
The screening method is particularly preferably a PCR method from the viewpoint of sensitivity. The method is not particularly limited as long as it uses a K1 fragment as a primer, and a conventionally known method (Science, 230, 1350-1354). (1985)) and newly developed or future modified PCR methods (Yoshiyuki Tsuji, et al., Yodosha, Experimental Medicine, Special Edition, 8 (9) (1990); protein, nucleic acid, enzyme, extraordinary Any of the special editions, Kyoritsu Publishing Co., Ltd., 35 (17) (1990)) can be used.
[0200]
DNA fragments used as primers are chemically synthesized oligo DNAs, and these oligo DNAs are synthesized using an automatic DNA synthesizer such as a DNA synthesizer (Pharmacia LKB Gene Assembler Plus: Pharmacia). Can do. The length of the synthesized primer (sense primer or antisense primer) is preferably about 10 to 30 nucleotides. The probe used for the screening is usually a labeled probe, but may be unlabeled or detected by specific binding to a directly or indirectly labeled ligand. Appropriate labels and methods for labeling probes and ligands are known in the art of the invention and can be incorporated by known methods such as nick translation, random priming or kinase treatment. Radioactive labels, biotin, fluorescent groups, chemiluminescent groups, enzymes, antibodies, etc. are encompassed by these techniques.
[0201]
As a PCR method used for detection, for example, an RT-PCR method is exemplified, but various modified methods used in this field can be applied.
[0202]
Further, in the use of the K1 gene of the present invention, by examining the expression level of the K1 gene and the polymorphism (polymorphism: individual difference) of the K1 gene (K1 genetic diagnosis), canceration due to hepatitis C is predicted, It is useful for diagnosis / analysis (selecting treatment with fewer side effects) for the selection of treatment including the selection of treatment.
[0203]
In general, it is known that there are large individual differences in drug metabolism in humans. Determining this individual difference can reduce side effects caused by drugs administered to humans and treat illnesses. Useful for selection.
[0204]
In recent years, genetic diagnosis for diagnosing a patient's constitution by diagnosing gene polymorphism by PCR-SSCP method, RFLP method or the like has attracted attention. The liver is the most important organ in drug metabolism, and there are many drug metabolizing enzymes, but the expression of these drug metabolizing enzymes is known to be controlled by transcription factors present in hepatocytes. .
[0205]
The present inventors have shown that the K1 gene has liver-specific expression as shown in the Examples below, and is often found in liver metabolizing enzyme promoters (transcriptional expression control sites). It was also found that it binds to box-B found in the promoter of liver metabolic enzyme alcohol dehydrogenase and activates transcription.
[0206]
These facts are considered that K1 regulates the expression of drug metabolizing enzymes in the liver. For example, by analyzing the expression level of K1 gene and polymorphism (polymorphism: individual difference) of K1 gene (of K1) Gene diagnosis), the expression level of a drug metabolizing enzyme that is a transcription target gene of transcription factor K1 can be predicted, and used for diagnosis of a metabolite of a patient drug.
[0207]
In addition, the transcription activation ability of transcription factor K1 can be used to search for promoters involved in drug metabolizing enzymes and to be used as means for identifying polymorphism. By analyzing the polymorphism of the drug-metabolizing enzyme promoter thus found, the expression level of the drug-metabolizing enzyme can be predicted, and can be used for diagnosis of metabolites of the patient's drug.
[0208]
The present invention specifically relates to a) in the presence of hepatitis C core protein for a time sufficient to treat a test substance to promote transcriptional activity under physiological conditions. A step of presenting a test substance to a gene expression product,
b) detecting the promotion of the transcriptional activity of the gene expression product in comparison with the activity in the presence of the test substance and identifying the presence of the test substance of the compound that suppresses canceration of the hepatitis C core protein Including,
Provided is a method for screening a candidate compound that promotes transcriptional activity by using the gene or gene expression product and polypeptide of the present invention to screen a candidate compound that promotes the transcriptional activity of the gene or gene expression product and polypeptide of the present invention. To do.
[0209]
Examples of the test substance in the present invention include low molecular compounds, high molecular compounds, proteins, enzymes, antibodies and the like. The candidate compound means the test substance that affects the transcription activity of the gene expression product of the present invention.
[0210]
Further, according to the present invention, a) a step of reacting a test substance with the gene expression product of the present invention,
b) a step of identifying the presence of a metabolic enzyme that enhances the transcriptional activity of the gene expression product of the present invention and increases the gene expression level of the test substance in comparison with the transcriptional activity in the presence of the test substance. Including,
A candidate metabolic enzyme that uses the gene or gene expression product and polypeptide of the present invention to screen for a candidate metabolic enzyme whose gene expression level is increased by the transcription activity promoting action of the gene or gene expression product and polypeptide of the present invention. A screening method can be provided. In the method, the test substance means, for example, a metabolic enzyme as shown below.
[0211]
Therefore, according to the present invention, a candidate that increases the expression level of a drug metabolizing enzyme under the influence of its action using the ability of the transcription factor K1 of the gene of the present invention to activate the promoter transcription involved in the drug metabolizing enzyme. Screening for drug metabolizing enzymes can be performed. These candidate drug metabolizing enzymes include, for example, cytochrome (CYP), epoxy hydrolase (HPHX), methyltransferase (MT), glutathione S-transferase (GST), N-acetyltransferase (NAT), sulfate transferase ( ST), UDP-glycosyltransferase (UGT), aldehyde dehydrogenase (ALDH), alcohol dehydrogenase (ADH), quinone oxidoreductase (NQO), esterase, and ATP-binding cassette (P glycoprotein, multidrug resistance Enzymes such as (protein) and their molecular species, for example, cytochrome (CYP) molecular species include CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2A6, CYP2A7, CYP2A13, CYP2B3, CYP2C6, CYP2C8, CYP2C8, CYP2C8, CYP2C8, CYP2C8 CYP2D7AP, CYP2D8P, CYP2E1, CY 2F1, CYP3A3, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A5P1, CYP3A7, CYP4A11, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4B1, CYP11B2, and CYP27 etc. can be exemplified.
[0212]
The measurement method of the present invention can be easily carried out by using a reagent kit for detecting the K1 gene in a sample.
[0213]
Therefore, the present invention provides a reagent kit for detecting K1, which contains the K1 DNA fragment.
[0214]
As long as the reagent kit contains a DNA fragment that hybridizes to at least a part of or all of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or its complementary base sequence as an essential component, a labeling agent, Reagents essential for the PCR method (for example, Taq DNA polymerase, deoxynucleotide triphosphate, primer, etc.) may be included.
[0215]
In the measurement of the polymorphism of the K1 gene, a polymorphism that causes a change in the length of the restriction enzyme fragment among the changes in the sequence of the polymorphism of K1 to be analyzed (the restriction enzyme used for the cleavage). In the case of a recognition sequence change, or a considerably long insertion or deletion), measurement by the RFLP method is preferably exemplified. However, since these DNA polymorphisms are only a part, if there is no sequence that causes a change in the length of a restriction enzyme fragment among the changes in the polymorphic sequence, the polymorphic gene The adaptation of the PCR-SSCP method for creating a primer based on neighboring DNA sequence information can be preferably exemplified.
[0216]
Examples of the labeling agent include chemical modifiers such as radioisotopes or fluorescent substances, but the DNA fragment itself may be conjugated with the labeling agent in advance. Furthermore, the reagent kit may contain an appropriate reaction diluent, standard antibody, buffer solution, detergent, reaction stop solution, etc. for the convenience of carrying out the measurement.
[0217]
Furthermore, the present invention also provides a method for detecting a polymorphism of the K1 gene using the measurement method, a diagnostic agent used for the method, and a diagnostic kit.
[0218]
In addition, by using the above method, the K1 sequence obtained from the test sample is directly or indirectly sequenced, so that it is related to a new K1 gene that is highly homologous to wild-type K1. Related genes can be found.
[0219]
Accordingly, the present invention also provides a method for screening related genes related to the human K1 gene in a test sample by such measurement and sequencing of K1 DNA in the test sample.
[0220]
In addition, a protein encoded by the human K1 gene represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention, or an amino acid sequence in which one or several to several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 1, or By synthesizing a protein from these fragments or synthesizing an antibody against the protein, wild type K1 and / or mutation K1 can be measured.
[0221]
Therefore, the present invention provides an antibody measurement method and an antigen measurement method for wild-type K1 and / or mutant K1. Such a change can be determined by K1 sequence analysis by the conventional technique in this field, but more preferably, an antibody (polyclonal or monoclonal antibody) is used to detect a difference in K1 protein or the presence or absence of K1 protein. Can do. As a specific example of the measurement method of the present invention, the K1 antibody immunoprecipitates K1 protein from a biomaterial sample-containing solution collected from humans such as blood and serum, and Western blot or immunoblot of polyacrylamide gel. Above it can react with K1 protein. K1 antibody can detect K1 protein in paraffin or frozen tissue sections using immunohistochemical techniques.
[0222]
Since antibody production techniques and techniques for purification are well known in the art, these techniques can be selected as appropriate.
[0223]
More preferred embodiments related to methods for detecting wild type K1 or mutants thereof include enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs), radioimmunoassays, including sandwich methods using monoclonal and / or polyclonal antibodies (RIA), immunoradioassay (IRMA), and immunoenzymatic method (IEMA).
[0224]
The present invention can also provide a cell membrane fraction having K1 binding activity for K1 protein or a K1 receptor present on the cell surface. The K1 receptor is obtained by conjugating a labeled K1 protein in a biomaterial sample containing a cell membrane fraction, extracting, isolating and purifying the K1 binding reaction product, and specifying the amino acid sequence of the isolate. Acquired and acquisition and sequencing of the K1 receptor protein can be easily accomplished by one skilled in the art.
[0225]
The present invention also provides a compound (K1 receptor reactant: a compound is a low molecular compound, a high molecular compound, a protein, a protein partial fragment) by using the K1 receptor protein or a binding fragment thereof in a technique for screening any of various drugs. , Antigen, or antibody). Preferably, the K1 receptor is used. The K1 receptor polypeptide or fragment thereof used in such screening tests may be free matter in solution that is attached to a solid support or carried to the cell surface.
[0226]
As an example of drug screening, for example, prokaryotic or eukaryotic host cells stably transformed with a recombinant protein expressing the K1 protein or fragment thereof can be used, preferably in competitive binding assays. . Such cells in free or fixed form can also be used in standard binding assays. More specifically, the formation of a complex between the K1 receptor protein or fragment thereof and the substance to be tested is measured, and the formation of a complex between the K1 receptor protein or fragment thereof and the K1 protein or fragment thereof is determined. Compounds can be screened by detecting the extent to which they are inhibited by the substance being tested.
[0227]
Thus, the present invention contacts such a substance with a K1 receptor protein or fragment thereof by methods known in the art and then the presence of a complex between the substance and the K1 receptor protein or fragment thereof, or K1 It is possible to provide a method for screening a drug characterized by measuring the presence of a complex between a receptor protein or a fragment thereof and a ligand. Furthermore, by measuring the K1 receptor activity, such substances can inhibit the K1 receptor, thus causing the activity of K1 as defined above, for example the action of promoting gene transcription, or binding of a cAMP response element or box-B sequence. Thereafter, whether the gene product bound to the cAMP response element or the box-B sequence can regulate the action such as the action of promoting transcription activation, or the regulation of protein-protein mutual binding or the ability to form a complex. Determine if you can. In such competitive binding assays, more specifically, the K1 receptor protein or fragment thereof is labeled. The free K1 receptor protein or fragment thereof is separated from that present in the protein: protein complex, and the amount of free (uncomplexed) label is the binding of the agent being tested to the K1 receptor or the K1 receptor, respectively: It is a measure of inhibition of K1 protein binding. A small peptide (peptidomimetic) of the K1 protein can be analyzed in this way, and one having K1 receptor inhibitory activity can be measured (see b).
[0228]
In the present invention, another method for drug screening is a screening method for a compound having an appropriate binding affinity for the K1 receptor protein, which is abbreviated as a number of different peptide test compounds. Or synthesized on a solid support, such as the surface of another substance, and then the peptide test compound is reacted with the K1 receptor protein and washed. Next, a method for detecting a reaction-bound K1 receptor protein using a known method can also be exemplified (PCT Patent Publication No. WO84-03564). Purified K1 receptor can be coated directly onto plates used in the aforementioned drug screening techniques. However, non-neutralizing antibodies against the polypeptide can be used to capture the antibody and immobilize the K1 receptor protein on the solid phase. The present invention is also aimed at the use of a competitive drug screening assay, in which a neutralizing antibody capable of specifically binding to the K1 receptor protein is allowed to compete with the test compound for binding to the K1 receptor protein or a fragment thereof. By the competition by the antibody, it is possible to detect the presence of any peptide having one or more antigenic determinants of the K1 receptor protein.
[0229]
In the method for screening a candidate compound for a drug that inhibits K1 activity of the present invention, for example, an antibody against a K1 gene expression product or K1 protein (hereinafter also referred to as K1 protein), or a fragment thereof, The ratio of the labeled K1 protein, the partial peptide of K1 protein, or the salt thereof bound to the antibody is determined by competitively reacting the solution and the labeled K1 protein, the partial peptide of K1 protein or a salt thereof. A screening method for quantifying K1 protein, a partial peptide of K1 protein, or a salt thereof in a test solution, characterized by measurement, is also possible (described later (b)).
[0230]
In addition, the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is measured after reacting the test solution with the antibody insolubilized on the carrier and the labeled antibody against another different K1 protein simultaneously or continuously. It is also possible to quantify the K1 protein, the partial peptide of K1 protein, or a salt thereof in the test solution.
[0231]
Further, when the substrate is brought into contact with the K1 protein, a partial peptide of K1 protein or a salt thereof, and when the substrate and the test compound are brought into contact with the K1 protein, a partial peptide of K1 protein or a salt thereof, the K1 protein, K1 It is also possible to screen a compound or a salt thereof that inhibits the activity (eg, K1 activity) of K1 protein or a salt thereof by measuring and comparing the activity of a partial peptide of the protein or a salt thereof (described later ( d)).
[0232]
According to the present invention, there is provided a screening method for identifying a compound that stimulates or suppresses the function of a K1 polypeptide or K1 gene expression product, comprising: (a) a candidate compound and said polypeptide or gene expression product (or said A cell or a membrane thereof carrying a polypeptide or a gene expression product) or a fusion protein thereof, a method of measuring by a label directly or indirectly bound to the candidate compound, (b) a candidate compound; Measures binding of the polypeptide or gene expression product (or a cell carrying the polypeptide or gene expression product or a membrane thereof) or a fusion protein thereof in the presence of a labeled competitor (K1 antibody or K1 receptor). (C) a candidate compound is generated by activation or suppression of the polypeptide or gene expression product (D) a candidate compound and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 by using a detection system suitable for a cell or cell membrane carrying the polypeptide or gene expression product. A method of simultaneously mixing a solution containing a polypeptide or gene expression product to prepare a mixture, measuring the activity of the polypeptide or gene expression product in the mixture, and comparing the activity of the mixture with a standard; and (e) A screening method is provided comprising a method selected from the group consisting of a method wherein the candidate compound detects mRNA encoding the polypeptide in a cell and the effect on the production of the polypeptide.
[0233]
Further methods for drug screening include the use of host eukaryotic cell lines or cells containing non-functional K1 genes. After the host cell line or cells are grown for a period of time in the presence of the drug compound, the rate of growth of the host cell is measured to determine whether the compound can regulate cell growth, for example, or protein-protein interconnection It is confirmed whether or not the ability to regulate the complex formation ability. As one means of measuring the growth rate, the biological activity of the K1 receptor can also be measured.
[0234]
Also according to the present invention, they interact in order to develop more active or stable forms of K1 protein derivatives or agents that enhance or interfere with the function of K1 protein in vivo, for example in vivo. It is possible to produce the desired biologically active protein or structural analog, such as a K1 agonist, K1 antagonist, K1 inhibitor and the like. The structural analog can determine, for example, the three-dimensional structure of a complex of K1 and another protein by X-ray crystallography, computer modeling, or a combination thereof. Information on the structure of structural analogs can also be obtained by protein modeling based on the structure of homologous proteins.
[0235]
Further, as a method for obtaining a more active or stable form of the K1 protein derivative, it is possible to analyze it by, for example, alanine scanning. In this method, amino acid residues are substituted with alanine, and each amino acid residue of the peptide is analyzed in this way by measuring its influence on the activity of the peptide, and regions important for the activity and stability of the peptide are determined. Is the method. By this method, more active or stable K1 derivatives can be designed.
[0236]
It is also possible to isolate a target-specific antibody selected by a functional assay and then analyze its crystal structure. In principle, this approach provides a pharmacore that is the basis for subsequent drug design. By generating anti-idiotypic antibodies against functional pharmacologically active antibodies, it is possible to identify and isolate peptides from a bank of chemically or biologically generated peptides. Therefore, the selected peptides are also expected to act as pharmacores.
[0237]
In this manner, a drug having improved K1 activity or stability or an action as an inhibitor, agonist, antagonist or the like of K1 activity can be designed and developed.
[0238]
Thus, using any of the drug screening methods exemplified above, a candidate compound that inhibits the interaction between the desired K1 protein and hepatitis C core protein is synthesized, and the compound is further used to further develop hepatitis C core. Candidate compounds that can counteract the effects of protein on canceration can be selected.
[0239]
In addition, by screening the candidate using any one of the above screening methods using the interaction between the K1 protein of the present invention and the hepatitis C core protein as an index, the action of counteracting the canceration effect of the hepatitis C core protein is exhibited. It can be used to screen certain candidates.
[0240]
Further, according to the present invention, by creating a K1 gene-containing knockout mouse (mutant mouse), which part of the K1 gene sequence influences various K1 activities as described above in vivo, that is, the K1 gene The functions of the product and the modified K1 gene product can be confirmed in vivo.
[0241]
This method is a technique for intentionally modifying the genetic information of an organism using homologous recombination of a gene, and can be exemplified by a method using mouse embryonic stem cells (ES cells) (Capeccchi, MR, Science , 244, 1288-1292 (1989)).
[0242]
The above-described method for producing a mutant mouse is already a common technique for those skilled in the art, and this modification technique (Tetsuo Noda, Experimental Medicine, Special Issue, 14 (20) (1996), Yodosha) A mutant mouse can be easily produced by adapting the human wild type K1 gene and the mutant K1 gene of the invention. Therefore, by applying the technique, it is possible to design and develop a drug having improved K1 activity or stability, or an action as an inhibitor, agonist, antagonist, etc. of K1 activity.
[0243]
【The invention's effect】
According to the present invention, a novel transcriptional activator K1 gene that is highly expressed specifically in the liver is provided.
[0244]
According to the present invention, by using a K1 oligonucleotide as a probe and detecting a K1 gene or gene product in a sample that binds to the oligonucleotide probe, analysis of the polymorphism (polymorphism: individual difference) of the K1 gene This makes it possible to predict canceration due to hepatitis C, which is useful for analysis for selection of treatment methods such as drug treatment.
[0245]
By using the gene of the present invention, a K1 gene expression product or K1 polypeptide can be produced, and an antibody using this as an antigen can also be produced. ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the pharmaceutical composition and medicine with respect to the prevention or treatment of the canceration by hepatitis C which uses this K1 gene expression product or K1 polypeptide as an active ingredient are provided.
[0246]
Furthermore, according to the provision of the K1 gene, the K1 protein encoded by the gene can be produced in large quantities by genetic engineering. According to the provision of the protein, functions such as the K1 protein activity and the K1 protein binding activity can be provided. Can also be examined.
[0247]
The K1 protein is useful for elucidating, diagnosing and treating canceration of diseases involving the K1 gene and its products (for example, hepatitis C and hepatitis C complications).
[0248]
According to the present invention, a gene introduction vector further useful for gene therapy containing a K1 sense oligonucleotide, a cell into which the K1 sense sense oligonucleotide has been introduced, and a gene therapy agent comprising the vector or cell as an active ingredient, In addition, gene therapy methods and the like are provided.
[0249]
According to the present invention, there is provided a method for screening an interactant using K1 protein or gene expression product and hepatitis C core protein.
[0250]
【Example】
Examples are given below to illustrate the present invention in more detail.
[0251]
Example 1
(1-1) Isolation of clones from human small intestine full-length cDNA library
From human small intestine tissue, 2 mg of total RNA was isolated using isogen (Isogen: manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.), and poly (A) using oligotex-dT30 super (oligotex-dT30super: manufactured by Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.).⁺RNA-dT30 was purified. 50 μg of poly (A)⁺A full-length cDNA library was prepared by RNA using an oligo capping method (Szuki Y, and Sugano S, et al., Gene, 200, 149-156 (1997)). As a vector, pME18-FL3 (Genebank accession No. AB009864) was used.
[0252]
Subsequently, the plasmid DNA obtained above was isolated using a PI-100 robot (Kurabo).
[0253]
The size of the cDNA library thus obtained was about 20000 clones / μg of poly (A) with respect to the full-length enriched cDNA library.⁺It was RNA.
[0254]
From this library, 4000 clones were subjected to 5 'random sequence using an ABI377 automatic sequencer (ABI), and the full length sequence of the insert was performed.
[0255]
(1-2) Selection of clones
As a result of a GenBank database search using the BLAST program (Altschu, SF et al. Nucleic Acid Res, 25, 3389-3402 (1997)) from the data obtained in (1-1) above, the CREB / ATF family The expected clone was obtained.
[0256]
For the clones selected in (1-2) above, the FASTA program (Person, WR, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 2444-2448 (ABI) was used. Comparison of the DNA sequence in the GenBank / EMBL database with this nucleotide data using 1988)) revealed that this gene has no homology with any other known DNA sequence.
[0257]
We determined the entire sequence of this sequence and found that this clone was a novel member of the CREB / ATF family. To obtain the full-length sequence of this gene, we screened a full-length enriched cDNA library and identified four identical clones for this gene. Two of the four were almost the same size and the mRNA start site was nearly identical.
[0258]
Thus, the inventors obtained a 2.5 kb putative full-length cDNA containing an open reading frame (ORF) consisting of 461 amino acids as shown in SEQ ID NO: 1, and the gene was expressed as K1. It was named (Kai1). SEQ ID NO: 2 shows the nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 consisting of 1383 bases, and the full-length nucleic acid sequence is as shown in SEQ ID NO: 3 consisting of 2586 bases (FIG. 1).
[0259]
As a result of searching the genome sequence database, the present inventors specified the complete sequence of one cosmid (cosmid No. R33590 Genbank accession No. AC005620) containing the exon sequence of the K1 gene. FIG. 2 shows the structure of the K1 genome obtained.
The structure of the genome of K1 is a genomic sequence of a region of 19.4 kilobase pairs in total length having 10 exons and mapped to human chromosome 19p13.3.
[0260]
The sequence around the first AUG codon corresponded to the Kozak consensus sequence (Nucleic Acids Res. 15 (20), 8125-48, 1987).
[0261]
FIG. 3A shows a comparison of amino acid sequence structures with three CREB / ATF family genes of K1 (Kai1), LZIP, and OASIS of the present invention, and FIG. 3B shows an amino acid sequence including another CREB / ATF family gene of K1 of the present invention. An alignment comparison diagram is shown respectively. In FIG. 3A, a basic domain (basic domain) and a leucine zipper domain (Leucine-Zip), which are b-Zip domains, and D / EHXY are shown, respectively. FIG. 3B shows a basic domain and a leucine zipper domain, respectively.
[0262]
In a protein database search, the amino acid sequence of K1 showed broader homology with the three CREB / ATF family genes of Drosophila BBF-2, human LZIP, and mouse OASIS.
[0263]
Mouse OASIS has recently been cloned from astrocytes, but the function of the protein has not yet been analyzed (Brain Res Mol Brain Res. 69, 93-103 (1999)).
[0264]
Between these genes, the conserved region was not only in the b-Zip domain but also around the b-Zip domain. The amino acid similarity between LZIP, OASIS, and BBF-2 and the basic Zip region of K1 was 84%, 69%, and 71%, respectively.
[0265]
K1, LZIP, and OASIS showed sequence similarity around b-Zip, while they were structurally different.
[0266]
K1 had another leucine zipper motif in the C-terminal region that was not a b-Zip domain consisting of three repeats of the “LXNXTXX” sequence. This feature was not seen in LZIP or other CREB / ATF families. Leucine zippers are often found in protein-protein action domains (Science, 259 (5092): 230-234 (1993)).
[0267]
This second leucine zipper domain of K1 may interact with other proteins.
[0268]
K1 has a hydrophobic domain immediately after the b-Zip domain, which is presumed to be a transmembrane region (Putative Transmembrane domain).
[0269]
One of the other CREB / ATF families, ATF-6, has a similar transmembrane region. ATF-6 normally exists in the endoplasmic reticulum membrane, and by endoplasmic reticulum stress stimulation with tunicamycin, ATF-1 is known to be released, translocate to the nucleus, and activate transcription. (JBC2000, 275 27103-27020). K1 may also have a similar mechanism that regulates transcriptional activation.
[0270]
In contrast, LZIP possesses a D / EHXY motif associated with host cell factor (HCF) known to act on herpes simplex virus transcriptional activator VP16 (Gene Dev, 11 3122-3127 (1997)). K1 did not show a D / EHXY motif.
[0271]
Example 2 Northern blot analysis
In order to examine the expression profile of K1 in tissues, Northern blot analysis using various human tissues was performed. For Northern blot analysis, human MTN (Multiple-Tissue Northern) blots I and II (Clontech) were used.
[0272]
In order to avoid cross-hybridization, 708 base pairs in the 5 'region of K1 cDNA containing no b-Zip domain were used as a probe as a probe, and the presence or absence of expression was examined by performing PCR amplification for 35 cycles. As the primers, P7 and Bam3 shown below were prepared.
SEQ ID NO: 4 P7: 5'-TGGGCCACCAGCTTGGAGCAGAGAC-3 '
SEQ ID NO: 5 Bam3: 5′-AAGGATCCtcaCTCCTGACAGTGCCCAGCCCCAGGTC -3 ′
The PCR product was purified by the QIA quick gel kit (Quoagen), and the random primer DNA labeling kit Ver. 2 (Takara Treasure) [α-³²Labeled with P] -dCTP.
[0273]
The blot was prehybridized for 1 hour and then 18 hours at 42 ° C. in a mixture of 50% formamide, 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution and 0.5% SDS containing 500 μg / ml heat-denatured salmon sperm DNA. Hybridized.
[0274]
Hybridized blots were washed with 2 × SSC and 0.1% SDS for 30 minutes at room temperature, and washed with 0.1 × SSC and 0.1% SDS at 55 ° C. for 60 minutes. The washed membrane was dried and analyzed by autoradiogram using a BAS-2500 bio-image analyzer (Fujifilm).
[0275]
The result is shown in FIG.
[0276]
As a result, the expression of K1 mRNA with a 2.5 kb band was confirmed only in the liver in 16 human adult tissues (expression in the small intestine was below the detection limit in Northern blot analysis). This tissue specificity of the K1 expression pattern was different from that of LZIP or OASIS ubiquitously expressed in mammals (Lu, R., et al., Mol Cell Biol., 17, 5117-5126 (1997) : Kozak, M., Nucleic Acids Res., 15 (20) 8125-8148 (1987)).
[0277]
In addition, the human tissue used is heart, brain, placenta (Placenta), lung (Lung), liver (Liver), skeletal muscle (Skeletal muscle), kidney (Kidney), pancreas (Pancreas), Spleen, Thymus, Prostate, Testis, Ovary, Small intestine, Colon, and Peripheral blood leukocyte (PBL).
[0278]
Example 3 Evaluation of transcriptional activation ability of K1 by expression of GAL4-K1 fusion protein
Some CREB / ATF families act as transcription activators or transcription repressors.
[0279]
In order to identify whether K1 is a transcriptional activator, we constructed a plasmid that expresses the GAL4-K1 fusion protein and luciferase reporter containing a GAL4 binding element for COS7 cells. Gene transfer was performed with a plasmid.
[0280]
The present inventors constructed various deletion mutants of K1 fused to GAL4 DNA as described below, introduced the gene with a luciferase reporter plasmid, and examined each luciferase activity.
[0281]
1) Expression vector for GAL4-K1 fusion protein
The GAL4-K1 fusion protein expression plasmid pGAL4-K1 is a mammalian cell expression plasmid pSG5 (Promega) having an EF1-alpha promoter and the GAL4 DNA binding site gene and K1 deletion mutant in frame. Created by incorporating.
[0282]
2) Luciferase expression vector containing GAL4 element
The luciferase reporter expression plasmid pGAL-Luc is a plasmid pGL2 basic (manufactured by Promega) having a luciferase gene and a TAL-box of a rabbit globin gene and an element derived from a synthetic oligo DNA incorporated into pRGP3 prepared in tandem. (Yamamoto, Nature, 367, 568-572 (1994)).
[0283]
3) Transfection
Lipofectamine 2000 (manufactured by Life technology) was used for transfection, and the operation followed the protocol attached to this reagent. COS7 cells were transfected 24 hours after passage into 6-well plates.
[0284]
1 μl of a vector solution containing 1.0 μg of the above plasmid, 10 μl of Superfect, and 100 μl of a transfection solution containing OPTI-MEM serum-free medium (Life Technologies) washed with OPTI-MEM serum-free medium Added to. The activity of luciferase was measured after 24 hours.
[0285]
4) Measurement of luciferase activity
Using a dual-luciferase reporter assay system (manufactured by Promega), the operation was in accordance with the protocol attached to this reagent. 400 μl of lysis buffer attached to the kit was added to the culture plate to lyse the cells, and then centrifuged at 1500 rpm for 5 seconds in a tabletop centrifuge, and 20 μl of this supernatant was mixed with 100 μl of the attached reaction reagent LARII. Chemiluminescence was measured with a luminometer. Subsequently, 100 μl of stop & glow reagent attached to the kit was added, and the second chemiluminescence was measured. Based on these ratios, the luciferase activity was calculated.
[0286]
The result is shown in FIG.
[0287]
Transcription factors are broadly classified into transcription activators having transcription activation ability and transcription repression factors having transcription repression ability. Since GAL4-full length K1 activates luciferase expression, it was found that K1 is a transcriptional activator having transcription activation ability.
[0288]
To examine the region of the transcriptional activation domain of K1, we constructed various deletion mutants of K1 fused to GAL4 DNA and co-transformed with a luciferase reporter plasmid. The GAL4-K1 fusion protein deleted in the C-terminal region (D1, D2, D3, D4 and D5) was able to activate reporter expression. Also, constructs deleted in the N-terminal region (D6 and D7) lost the ability to activate. The smallest region with the ability to activate was D5 containing amino acid sequence 1-149. Therefore, since it can be activated only on the N-terminal side, 149 amino acids, it is considered that there is a transcription activation site in this part. In this region, the K1 protein has a proline-rich region. Proline-rich regions were often found in the transcriptional activation domain of transcription factors (Cell, 79, 93-105 (1994)).
[0289]
Deletion mutants lacking the transmembrane domain (D2, D3, D4 and D5) showed significantly higher activity than those retaining the transmembrane domain (FL, D1). This is presumably because the removal of the transmembrane domain facilitated the transfer of free K1 to the nucleus and enhanced the transcription activation ability.
[0290]
Example 4 Glutathione S transferase ( GST ) Examination of the ability of the K1 fusion protein to bind to the transcriptional activation element of K1
CREB / ATF family proteins have the ability to bind to a specific sequence of the CRE consensus sequence TGACGTCA (Montminy, M.R., PNAS, 83 6682-6686 (1986)). BBF-2 is known to bind to box-B, CRE, and LZIP also binds to CRE (Abel, T., et al., Genes Dev., 6 (3) 466-480 (1992). : Lu, R., et al., Mol Cell Biol., 17, 5117-5126 (1997)).
[0291]
To identify the DNA binding sequence specificity of K1, we performed a gel shift assay.
[0292]
Method: 1) GST fusion protein expression vector
Plasmid pGST-K1 expressing GST-K1 fusion protein was constructed by in-frame insertion of K1 containing the entire ORF between the restriction enzyme BamHI and EcoRI recognition site of GST expression plasmid pGEX-3X (Pharmacia Biotech). It was done.
[0293]
A PCR product of K1 containing the entire ORF was generated by amplification with pfuTURBO (Stratagene) using Bam5 'represented by SEQ ID NO: 6 and EcoRI3' primer represented by SEQ ID NO: 7.
[0294]
Bam5 'primer:
Sequence number 6; 5'-TTGGATCCCCATGAATACGGATTTAGCTGCTGG-3 '
EcoRI 3 'primer:
SEQ ID NO: 7; 5′-GTCGAATTCGATCTGTTTCAGGCTGTGTCTGGGTCTG-3 ′
The sequence of the clone was confirmed by a 377 automatic sequencer (manufactured by PE Biosystems).
[0295]
2) Purification of GST fusion protein
Escherichia coli strain XL-1 blue was transformed with GST-K1 fusion protein expression plasmid pGST-K1, pre-cultured overnight at 37 ° C. with 2 ml of LB medium, followed by main culture with 20 ml of LB medium for 2 hours, with 1 mM IPTG. Expression induction was performed, and further cultured for 2 hours. Escherichia coli was collected, suspended in a disruption solution (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM DDT), and then subjected to ultrasonic disruption for 1 minute to obtain an extract. This was centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes in a tabletop centrifuge, 200 μl of glutathione sepharose 4B (Amersham Pharmacia Biotech) was bound to 1 ml of the supernatant, washed twice with 1 ml of crushing solution, and 20 mM. Elute with glutathione. For each binding reaction, 0.1 μg of GST-K1 was used.
[0296]
3) Gel shift assay
The following synthetic oligos are annealed for each pair, and [γ-³²P] -ATP is used for radiolabeling using a mechanical label DNA 5′-end labeling kit (manufactured by Takara), and Box-B represented by SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 shown below. [Box-B probe: D. mulleri Adh-1 promoter (Cell, 53451-461 (1988))], CRE represented by SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 [CRE probe: somatostatin promoter (Mol. Cell Biol., 20 (10) 3470-3481 (2000)], C / EBP represented by SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 [C / EBP probe: albumin promoter (Gene Dev., 5 1553-1567 (1991))], SEQ ID NO: 14 And AP-1 [AP-1 probe: c-jun promoter (Cell 55 875-885 (1988))] represented by SEQ ID NO: 15 and NF-ΚB [NF-kB represented by SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 Probe: IL-2 receptor-alpha promoter (J. Biol. Chem., 264, 8475-8478 (1989))] Each probe was synthesized.
[Box-B probe: D. mulleri Adh-1 promoter (Cell, 53 451-461 (1988))]
Sequence number 8: 5'-TCGAGCTCGGATGTACACGTAATCGTATTACTC-3 '
SEQ ID NO: 9: 5′-CGAGAGTAATACGATTACGTGTACATCCGAGCT-3 ′
[CRE probe: somatostatin promoter (MCB, 20 (10), 3470-3481 (2000))]
SEQ ID NO: 10: 5'-TCGAGCTCGGATGGCTGACGTCAGAGATTACTC-3 '
SEQ ID NO: 11: 5'-CGAGAGTAATCTCTGACGTCAGCCATCCGAGCT-3 '
[C / EBP probe: albumin promoter (Gene Dev., 5 1553-1567 (1991))]
SEQ ID NO: 12: 5'-TCGAGCTCGGATGATTTTGTAATGGGGTTACTC-3 '
SEQ ID NO: 13: 5'-CGAGAGTAACCCCATTACAAAATCATCCGAGCT-3 '
[AP-1 probe: c-jun promoter (cell 55 875-885 (1988))]
SEQ ID NO: 14: 5'-TCGAGCTCGGATCAAAGTTTAGTCAATTACTC-3 '
SEQ ID NO: 15: 5'-CGAGAGTAATTGACTAAACTTTGATCCGAGCT-3 '
[NF-kB probe: IL-2 receptor-alpha promoter (JBC, 264,8475-8478 (1989))]
SEQ ID NO: 16: 5'-TCGAGCTCGGAGGGGAATCTCCCGGGTTACTC-3 '
SEQ ID NO: 17: 5'-CGAGAGTAACCCGGGAGATTCCCCTCCGAGCT-3 '.
4 μl of GST-K1 fusion protein solution per gel shift assay and 10 μl of 20 fmol of each of the above-mentioned probes [50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0.1 μg / Μl poly (dI · dC), 20% glycerol], and incubated at room temperature for 30 minutes, and applied to a 4% acrylamide gel. For electrophoresis, 1 × electrophoresis buffer attached to Gel Shaft Assay (GelShift Assay Kit: manufactured by Stratagene) was used, and electrophoresis was performed at a constant voltage of 10 mA for 2 hours.
[0297]
After completion of electrophoresis, the gel was dried, and the autoradiogram was analyzed with a BAS-2500 Bio Image Analyzer (Fuji Film).
[0298]
The result is shown in FIG.
[0299]
As can be seen from FIG. 6, the GST-K1 fusion protein bound to CRE and box-B, but did not bind to C / EBP, AP-1, and NFΚB. When excess unlabeled oligo was added, binding to CRE and box-B was competitively inhibited, indicating that K1 has sequence-specific binding.
[0300]
Example 5 Measurement of transcription activation ability via box-B transcription activation element by expression of K1
1) K1 expression vector
A clone obtained from the K1 expression plasmid, pME-K1 oligocap library was used. That is, the plasmid pME-K1 expressing the K1 protein was isolated from the full-length enriched cDNA library (Gene, 200, 149-156 (1997): Nature Genet., 21, 191-194 (1999)) and SPpha. The vector pME18, whose expression is induced, contains 2586 base pairs of full-length K1 cDNA.
[0301]
The transmembrane region deletion mutant expression plasmid pME-K1TM of K1 is a primer represented by SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19:
Sequence number 18: 5'Eco-P1: TTgaattcCATCTGCAGACAGAACTGGATGGAC
Sequence number 19: TM-XBE: AAggatccgaattcTCTAGATCATGTCTGGGCTGACTTGCTGGTGGACTGC
The amplified PCR product (amino acid number 1-320) was introduced into pME18S at the EcoRI and XbaI restriction enzyme sites.
[0302]
2) Luciferase expression vector containing transcription activation element
The luciferase reporter plasmid pBox-Luc is a Box-B oligonucleotide in the XhoI site of pRBGP3 (Nature 336, 544-51 (1988)) constructed from pGL2-basic containing a rabbit beta-globin TATA box. Constructed by insertion of SEQ ID NO: 8).
[0303]
Each plasmid was purified using a Qiagen plasmid kit (Qiagen) (Qiagen) according to the product instructions, and the DNA sequence was analyzed with an ABI377 automatic sequencer (PE Biosystems).
[0304]
3) Transfection
Activity was measured in the same manner as in Example 3.
[0305]
4) Measurement of luciferase activity
Activity was measured in the same manner as in Example 3.
[0306]
The result is shown in FIG. FIG. 7 shows the K1 construct on the left side.
[0307]
From FIG. 7, the full-length K1 protein showed about 3.5-fold transcriptional activation of luciferase depending on the Box-B element. Moreover, the structure lacking the transmembrane site showed 16.4 times the transcriptional activation. This suggests that K1 may control transcriptional activation of liver metabolic enzymes such as ADH even in vivo.
[0308]
From the results obtained from each of the above Examples, when the relationship between K1 and other homologous members, BBF-2, LZP and OASIS was examined, all members of the CREB / ATF family showed their similarity in b-Zip. Although shared, some members can be further grouped within additional similarities and subfamilies in other regions.
[0309]
For example, ATF1, CREB and CREM can be grouped into one subfamily (Hai, TW, et al., Genes Dev., (12B) 2083-2090 (1989): Hoeffler, JP, et al., Science, 242 (4884) 1430-1433 (1988): Foulkes, NS, et al., Cell, 64 (4) 739-749 (1991)).
[0310]
K1 has homology with the CREB / ATF1 family gene in the b-Zip domain and has higher homology with the two mammalian CREB / ATF1 family members, LZIP and OASIS.
[0311]
The homology region was not only the b-Zip domain but also the b-ZIP domain. These homologies in the b-Zip domain may be characterized as a subfamily of the CREB / ATF1 family.
[0312]
The basic DNA binding domain in the b-Zip domain recognizes the DNA sequence of the target element, and members with similarity in the basic domain may bind to similar sequence elements (Cell, 71 (7 ): 1223-37 (1992)).
[0313]
In fact, K1 and BBF-2 bind to the box-B element. These three factors of K1, LZP and OASIS, which LZP and OASIS may also bind to the box-B element, may regulate the transcription of one similar target gene in mammalian cells.
[0314]
The b-Zip transcription factor is known to form a single dimer through a leucine zipper. They sometimes form heterodimers with other b-Zip factors and show different effects (Science, 2401759-1764 (1988)). The ability to form heterodimers depends on the similarity of the leucine zipper domains. For example, CREB or CREM can form heterodimers, and the leucine zipper domain has significant similarity (Cell, 64 (4): 739-49 (1991)).
[0315]
K1, LZP and OASIS have partial similarity of leucine zipper domains (FIG. 3A).
[0316]
K1, LZP and OASIS have the potential to form a heterodimer between them, directly interact with each other and have a functional relationship. Recently, LZIP has been reported to interact with HCV core protein and to regulate transcriptional activity through CRE and correlate with cell transformation (Jin, DY, et al., EMBO J., 19 (4 729-740 (2000)).
[0317]
HCV core protein is transduced without other components of HCV because the structural similarity to LZIP, K1 potentially interacts with HCV core protein and is implicated in the development of hepatocellular carcinoma. It was possible to induce hepatocellular carcinoma in transgenic mice (Moriya, K. et al., Nat. Med., 4 (9) 1065-1067 (1998)).
[0318]
In contrast to the ubiquitous expression pattern of LZIP, K1 showed liver-specific expression. If K1 and HCV core protein could interact, the specificity of K1 expression in the liver may be related to the pathogenesis of HCV in the liver. K1 has a hydrophobic domain presumed to be a transmembrane region immediately after the b-Zip domain.
[0319]
One of the other CREB / ATF families, ATF-6, has a similar transmembrane region. ATF-6 normally exists in the endoplasmic reticulum membrane, and by endoplasmic reticulum stress stimulation with tunicamycin, ATF-1 is known to be released, translocate to the nucleus, and activate transcription. (J. Biol. Chem., 275, 27103-27020 (2000)). K1 may also have a similar mechanism that regulates transcriptional activation. It is known that the endoplasmic reticulum stress response is also observed in excessive protein expression due to viral infection (Genes & Development, 13, 1211-1233 (1999)). Possible implications are suggested.
[0320]
Tissue-specific transcription elements are known to exist in many tissue-specific genes. Transcription factors that bind to tissue-specific elements often have tissue-specific expression. Many of them are transcriptional activators and regulate to increase the expression of tissue-specific genes by activating their own expression levels in the appropriate type of cells (Exp Hematol., (2) : 99-107 (1995) :, Mol Cell Biol., 13 (11): 6752-65, (1993)).
[0321]
We have shown that K1 expression was liver-specific in 16 human adult tissues and that K1 activates luciferase reporter expression directly through the box-B element. The box-B element was first found in the promoter of the Drosophila ADH gene and acted as a fat pad-specific enhancer (Cell 6; 53 (3): 451-61 (1988)). The box-B element has also been found in the promoter of the human ADH gene, which is mainly expressed in the liver (Abel, T., et al., Genes Dev., 6 (3) 466-480 ( 1992)). However, Drosophila BBF-2 binds to the box-B-like element of human ADH, but no mammalian factor has been identified that binds to this element.
[0322]
Thus, the K1 of the present invention that we found would be such an initial factor that exhibits liver-specific expression. K1 will regulate liver predominant expression of ADH through a box-B-like element. Because of liver-specific expression of K1, K1 may be related to regulating the expression of other liver-specific genes. We have studied this around the region of the box-B-like element found in the human ADH promoter. Analysis of the promoter region of liver-specific genes will indicate what is the primary target of K1, and will provide hints for the transduction pathway of signals associated with K1.
[0323]
According to K1 of the present invention, interaction with the core protein of hepatitis C virus is considered to be associated with the liver, particularly hepatitis C disease, and targets for gene therapy, drug targets, drug screening It can be a target for genetic diagnosis.
[0324]
In addition, K1 of the present invention may interact with the alcohol dehydrogenase promoter and control its expression, which can be a target for genetic diagnosis. Similarly, it may interact with a promoter such as a drug metabolizing enzyme in the liver, and can also be a target for genetic diagnosis.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the sequence of a K1 gene.
FIG. 2 is a drawing showing the structure of the genome of the present invention K1.
FIG. 3A is a schema diagram of the present invention K1, LZIP and OASIS. FIG. 3B shows a multiple alignment comparison of b-Zip domains between the present invention K1 and other members of the CREB / ATF family.
FIG. 4 is a drawing-substituting photograph of the expression pattern of K1 of the present invention in tissues by Northern blotting.
FIG. 5 is a drawing showing the transcriptional activity corresponding to the mapping drawing of the transcriptional activation region in the present invention K1.
FIG. 6 is a drawing-substituting photograph showing the DNA binding ability of K1 of the present invention by gel shaft assay.
FIG. 7 shows transcriptional activation through CRE and Box-B elements of the present invention K1.
[Sequence Listing]

Claims (9)

Gene containing the following (a) or (b) polynucleotides:
(A) a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 ,
(B) SEQ ID NO: in the amino acid sequence represented by 1, poly 1 or a dozen amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence, and encodes a protein having a b ox-B binding activity nucleotide. A gene which is a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. A gene comprising the following polynucleotide (a) or (b):
(A) SEQ ID NO: nucleotide sequence or Ranaru polynucleotide represented by 2,
(B) a polynucleotide encoding a protein having at least 90% identity with the polynucleotide comprising the base sequence of (a) and having box-B binding activity . The gene according to claim 2, which is the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. An expression product of the gene according to any one of claims 1 to 4. A recombinant expression vector having the gene according to any one of claims 1 to 4. A host cell comprising the recombinant expression vector according to claim 6. The following (a) or (b) the polypeptide:
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) SEQ ID NO: in the amino acid sequence represented by 1, 1 or dozen amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence, and polypeptides having a b ox-B binding activity. An antibody having a binding property to the expression product of the gene according to claim 5 or the polypeptide according to claim 8 .

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