JP4572162B2 - Microscope equipment - Google Patents
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Description
本発明は、光学顕微鏡により取得された画像情報と簡易な光学系を使用して、粒子の三次元的位置取得する顕微鏡装置に関する。 The present invention relates to a microscope apparatus that acquires three-dimensional positions of particles using image information acquired by an optical microscope and a simple optical system.
蛋白質機能解析の研究では、エバネッセント蛍光顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡などの蛍光顕微鏡を用いて、観察の対象となる蛋白質に蛍光粒子を負荷し、蛍光粒子から発せられる信号から、蛍光粒子の位置、すなわち、蛋白質の位置を継時的に検出することで、前記蛋白質の挙動および状態を解析する。この解析方法に関しては、特許文献１に開示されている。上記の方法では、蛋白質の挙動を妨害しないように、蛍光粒子は出来る限り小さな方が良い。蛋白質を蛍光標識するための物質として、蛍光色素分子を用いるのが一般的である。特に蛍光色素分子として蛍光蛋白質を用いる場合、遺伝子工学的に標的蛋白質に融合させることができる。 In protein functional analysis research, using fluorescent microscopes such as an evanescent fluorescent microscope and confocal fluorescent microscope, the fluorescent particles are loaded on the protein to be observed, and the position of the fluorescent particles, that is, the position of the fluorescent particles, that is, By detecting the position of the protein over time, the behavior and state of the protein are analyzed. This analysis method is disclosed in Patent Document 1. In the above method, the fluorescent particles should be as small as possible so as not to disturb the behavior of the protein. As a substance for fluorescently labeling a protein, a fluorescent dye molecule is generally used. In particular, when a fluorescent protein is used as the fluorescent dye molecule, it can be fused to the target protein by genetic engineering.
光学顕微鏡の結像面にビデオレートカメラを設置することで、試料を実時間で観察できる。共焦点顕微鏡によって、光学切片の薄い試料の断面像を取得できるので、光軸方向に対物レンズを走査し、取得した光学切片を光軸方向に並べることで、三次元画像を取得することができる。共焦点顕微鏡を用いて、ビデオレートカメラの垂直同期信号と同期させて、ピエゾアクチュエータにより対物レンズの焦点位置を制御して、三次元画像を得る技術は、特許文献２に開示されている。この技術は、前記ビデオレートカメラの撮影時間の間は対物レンズを固定させ、それ以外の時間に対物レンズを目的の位置に移動させることで、必要とする焦点位置での共焦点像をビデオフレームに合わせて取得できる。図２に示すように階段状に対物レンズを移動させ、得た共焦点像をＺ軸方向に重ねれば、三次元画像が構築される。しかしながら、上記の方法では、広視野の観測が可能であると言う利点はあるが、対物レンズを光軸方向に走査する必要がある為、時間分解能は低い。また、レーザー走査型の共焦点顕微鏡、あるいは、２光子励起顕微鏡などは、集光したレーザー光を水平面に走査する必要がある為、さらに時間分解能は低下する。 By installing a video rate camera on the imaging plane of the optical microscope, the sample can be observed in real time. A confocal microscope can acquire a cross-sectional image of a sample with a thin optical section, and a three-dimensional image can be acquired by scanning the objective lens in the optical axis direction and arranging the acquired optical sections in the optical axis direction. . A technique for obtaining a three-dimensional image by controlling the focal position of an objective lens by a piezoelectric actuator using a confocal microscope in synchronization with a vertical synchronization signal of a video rate camera is disclosed in Patent Document 2. In this technique, the objective lens is fixed during the shooting time of the video rate camera, and the objective lens is moved to a target position at other times, so that a confocal image at a required focal position is converted into a video frame. Can be obtained according to As shown in FIG. 2, when the objective lens is moved stepwise and the obtained confocal images are overlapped in the Z-axis direction, a three-dimensional image is constructed. However, the above method has an advantage that a wide field of view can be observed, but the time resolution is low because the objective lens needs to be scanned in the optical axis direction. In addition, since the laser scanning confocal microscope or the two-photon excitation microscope needs to scan the focused laser beam on the horizontal plane, the time resolution is further reduced.
代わりに、単粒子しか観測できないが、高速に三次元位置を取得できる技術が、非特許文献１、２に挙げられる。非特許文献１では、粒子の水平面上の位置は、四分割フォトダイオードにより取得し、光軸方向の位置は、像の散乱強度により取得する。非特許文献２は、２光子励起法を用いて、集光したレーザー光を水平面に走査し、同時に、特許文献２と同様に対物レンズを走査するが、走査範囲を狭することで、高速化を図っている。双方どちらの方法も、粒子ひとつのみの三次元位置計測が可能であり、複数の計測は不可能である。また、これらの方法は、粒子の散乱光の強度を指標に光軸方向の位置を計測する。従って、粒子の大きさが精度に大きく影響を与える。蛋白質機能解析の研究に用いる場合、１ミクロンを超える粒子を用いることはできない。蛍光粒子、あるいは、蛍光色素を用いて、散乱光の代わりに蛍光を用いる方法も考えられるが、径の小さい蛍光粒子や蛍光色素は、フォトンを発する過程が確率的であるため、その蛍光強度が激しく揺らぐ。その為、光軸方向の位置計測の精度は著しく低下する。 Instead, only single particles can be observed, but Non-Patent Documents 1 and 2 list technologies that can acquire a three-dimensional position at high speed. In Non-Patent Document 1, the position of the particle on the horizontal plane is obtained by a quadrant photodiode, and the position in the optical axis direction is obtained by the scattering intensity of the image. Non-Patent Document 2 uses a two-photon excitation method to scan a focused laser beam on a horizontal plane and simultaneously scans an objective lens as in Patent Document 2, but speeds up by narrowing the scanning range. I am trying. Both methods can measure the three-dimensional position of only one particle, and cannot perform multiple measurements. In these methods, the position in the optical axis direction is measured using the intensity of the scattered light of the particles as an index. Therefore, the size of the particles greatly affects the accuracy. When used for protein functional analysis studies, particles larger than 1 micron cannot be used. A method of using fluorescence instead of scattered light by using fluorescent particles or fluorescent dyes is also conceivable, but fluorescent particles and fluorescent dyes with small diameters are probabilistic in the process of emitting photons, so their fluorescence intensity is probable. Shake violently. Therefore, the accuracy of position measurement in the optical axis direction is significantly reduced.
また、上記方法は、共焦点光学系、２光子励起光学系、対物レンズを走査する為のアクチュエータなど、多くの高額な部品を具備するため、装置としては非常に高価になってしまう。これを避ける技術として、特許文献３が挙げられる。特許文献３では、二色のレーザーを有し、光軸方向に沿って二色の諧調を作り、粒子の二色の散乱光の出力差から、粒子の光軸方向の位置を計測する。この方法は、安価で、かつ、広視野を観測できる。さらに、走査を行わない為、時間分解能は、映し出すカメラ等の画像取得装置のフレームレートのみで決定する。しかし、蛍光粒子、あるいは、蛍光色素を用いた場合、その蛍光強度の揺らぎが、光軸方向の位置計測の精度を低くさせる。 In addition, the above method includes a lot of expensive parts such as a confocal optical system, a two-photon excitation optical system, and an actuator for scanning an objective lens, so that the apparatus becomes very expensive. Patent document 3 is mentioned as a technique which avoids this. In Patent Document 3, a two-color laser is provided, two-tone gradation is created along the optical axis direction, and the position of the particle in the optical axis direction is measured from the output difference between the two colors of scattered light from the particle. This method is inexpensive and can observe a wide field of view. Further, since scanning is not performed, the time resolution is determined only by the frame rate of an image acquisition device such as a camera to be projected. However, when fluorescent particles or fluorescent dyes are used, fluctuations in the fluorescence intensity reduce the accuracy of position measurement in the optical axis direction.
蛋白質機能解析の研究において、蛋白質-蛋白質相互作用を計測するために、原子間力顕微鏡が用いられる。原子間力顕微鏡は、光軸方向の微弱な力を計測することができるからである。しかしながら、原子間力顕微鏡は、光軸方向の力しか計測できない。そこで、原子間力顕微鏡のカンチレバーのひねりを計測することで、水平方向の力も計測できる技術がある。しかし、原子間力顕微鏡では、カンチレバーの中心にレーザーを照射する等の複雑かつ高精度の光学系が必要であるため、装置は高額である。
原子間力顕微鏡において、カンチレバーの代わりに細いガラスニードルを用いる技術が、非特許文献３に挙げられる。一般的な原子間力顕微鏡は、カンチレバーの光軸方向への撓りを検出する技術であるが、非特許文献３の技術は、カンチレバーの様な板状ではなく、円筒状のガラスニードルを用いて、光軸方向ではなく、光軸に対して垂直方向への撓りを検出する。この技術は、ガラスニードルのばね定数がカンチレバーより小さいため、非常に感度が良い。しかし、光軸方向の撓りは捉えることはできない。ガラスニードルによる原子間力顕微鏡にて、光軸方向の撓りを捉える場合、ガラスニードルの先端に金属片を反射板として付加する。これにより、従来の原子間力顕微鏡と同様の光学系を用いて、光軸に対して垂直方向への撓りと光軸方向の撓りを同時に計測する事が可能となる。
しかし、ガラスニードルの先端に金属片を光軸に対し垂直に付加する事は、技術的に困難である。
In the study of protein function analysis, atomic force microscopy is used to measure protein-protein interactions. This is because the atomic force microscope can measure a weak force in the optical axis direction. However, the atomic force microscope can measure only the force in the optical axis direction. Therefore, there is a technology that can measure the force in the horizontal direction by measuring the cantilever twist of the atomic force microscope. However, since an atomic force microscope requires a complicated and high-precision optical system such as irradiating a laser at the center of a cantilever, the apparatus is expensive.
In the atomic force microscope, Non-Patent Document 3 includes a technique using a thin glass needle instead of a cantilever. The general atomic force microscope is a technique for detecting the bending of the cantilever in the optical axis direction. However, the technique of Non-Patent Document 3 uses a cylindrical glass needle instead of a plate shape like a cantilever. Thus, the bending in the direction perpendicular to the optical axis is detected instead of the optical axis direction. This technique is very sensitive because the spring constant of the glass needle is smaller than the cantilever. However, bending in the optical axis direction cannot be captured. When capturing the deflection in the optical axis direction with an atomic force microscope using a glass needle, a metal piece is added to the tip of the glass needle as a reflector. This makes it possible to simultaneously measure the deflection in the direction perpendicular to the optical axis and the deflection in the optical axis direction using an optical system similar to that of a conventional atomic force microscope.
However, it is technically difficult to add a metal piece perpendicular to the optical axis at the tip of the glass needle.
そこで、上記問題に鑑みて、本発明では、光学顕微鏡により取得された画像情報を使用して、回折限界より小さな蛍光粒子、あるいは、蛍光色素分子の三次元的な重心位置を取得する際に、共焦点光学系、２光子励起光学系等を使わずに、安価であり、広視野を保ちながら、かつ、時間分解能をカメラ等の画像取得装置のフレームレート以下に下げることのない、及び、簡易に三次元的に力を計測できる顕微鏡装置の構築を課題としている。 Therefore, in view of the above problem, the present invention uses a more obtained image information into an optical microscope, small fluorescent particles than the diffraction limit, or, when acquiring a three-dimensional position of the center of gravity of the fluorophore Without using a confocal optical system, a two-photon excitation optical system, etc., being inexpensive, maintaining a wide field of view, and not reducing the time resolution below the frame rate of an image acquisition device such as a camera; and The objective is to build a microscope that can easily measure force in three dimensions.
上記課題を解決するための手段として、本発明は以下の特徴を有している。
本発明に係る顕微鏡装置は、二つの光路の光路長の差によって焦点位置の異なる画像を作り出し、この二つの光路により得られる二つの画像を受光面に投影する光学装置と、前記受光面を有し前記光学装置により投影された画像に基づき、二つの異なる焦点面の画像情報を取得する画像取得装置とを具備する顕微鏡装置であって、前記光学装置は、一対の無限系対物レンズと結像レンズ、あるいは、有限系対物レンズと、光学顕微鏡の結像面に配置されたスリットと、該結像面の実像を同倍あるいは数倍に伝達するためのリレーレンズと、結像側の光路を二つに分けるためのハーフミラーあるいはダイクロックミラーと、分けられた二つの光路を一つにまとめるミラーとを具備し、前記画像取得装置は、観察標本内の試料の焦点の異なる二画像を取得する手段、前記試料の散乱像、あるいは、蛍光像の強度分布の重心位置を計算することで、該試料の水平方向の位置を取得する手段、上記重心位置における点像分布関数の標準偏差よりも狭い範囲における蛍光強度を取得する手段、上記二画像による蛍光強度の差から、該試料の光軸方向における位置を取得し、観察標本内における試料の三次元位置を取得する手段を具備することを特徴とする。
本発明に係る顕微鏡装置は、二つの光路の光路長の差によって焦点位置の異なる画像を作り出し、この二つの光路により得られる二つの画像を受光面に投影する光学装置と、前記受光面を有し前記光学装置により投影された画像に基づき、二つの異なる焦点面の画像情報を取得する画像取得装置とを具備する顕微鏡装置であって、前記光学装置は、一対の無限系対物レンズと結像レンズ、あるいは、有限系対物レンズと、光学顕微鏡の結像面に配置されたスリットと、該結像面の実像を同倍あるいは数倍に伝達するためのリレーレンズと、結像側の光路を二つに分けるためのハーフミラーあるいはダイクロックミラーと、分けられた二つの光路を一つにまとめるミラーとを具備し、前記画像取得装置は、観察標本内の粒子の焦点の異なる二画像を取得する手段、回折限界より小さな粒子の散乱像、あるいは、蛍光像の強度分布が近似的にガウス分布に従うことを利用して、該粒子の散乱像、蛍光像を二次元ガウス関数で近似し、該粒子の水平方向の位置を取得する手段、前記散乱像、あるいは、蛍光像の中心位置の蛍光強度を取得する手段、上記二画像による蛍光強度の差から、該粒子の光軸方向における位置を取得し、観察標本内における粒子の三次元位置を取得する手段を具備することを特徴とする。
本発明に係る顕微鏡装置は、試料が載置される試料ステージと、試料面に対して操作されるガラスニードル或いはカンチレバーと、ガラスニードル或いはカンチレバーを操作するための三軸マニピュレータと、試料を照射するレーザー光を射出するレーザーとを、更に備え、試料に照射されたレーザー光を、光学装置における一対の無限系対物レンズと結像レンズ、あるいは有限系対物レンズを介して前記光学装置へ導くように構成されていることを特徴とする。
As means for solving the above problems, the present invention has the following features.
The microscope apparatus according to the present invention includes an optical device that generates images having different focal positions based on a difference in optical path length between two optical paths, and projects the two images obtained by the two optical paths onto the light receiving surface, and the light receiving surface. And a microscope apparatus having an image acquisition device for acquiring image information of two different focal planes based on an image projected by the optical device, wherein the optical device forms an image with a pair of infinite system objective lenses. A lens or a finite objective lens, a slit arranged on the imaging plane of the optical microscope, a relay lens for transmitting the real image of the imaging plane to the same or several times, and an optical path on the imaging side A half mirror or a dichroic mirror for dividing into two, and a mirror that combines the two divided optical paths into one, and the image acquisition device includes two images with different focal points of the sample in the observation specimen. Means for obtaining the horizontal position of the sample by calculating the centroid position of the intensity distribution of the scattered image or fluorescence image of the sample, and the standard deviation of the point image distribution function at the centroid position Means for acquiring fluorescence intensity in a narrower range, and means for acquiring the position of the sample in the optical axis direction from the difference in fluorescence intensity between the two images and acquiring the three-dimensional position of the sample in the observation specimen. It is characterized by that.
The microscope apparatus according to the present invention includes an optical device that generates images having different focal positions based on a difference in optical path length between two optical paths, and projects the two images obtained by the two optical paths onto the light receiving surface, and the light receiving surface. And a microscope apparatus having an image acquisition device for acquiring image information of two different focal planes based on an image projected by the optical device, wherein the optical device forms an image with a pair of infinite system objective lenses. A lens or a finite objective lens, a slit arranged on the imaging plane of the optical microscope, a relay lens for transmitting the real image of the imaging plane to the same or several times, and an optical path on the imaging side A half mirror or dichroic mirror for dividing the image into two, and a mirror that combines the two divided optical paths into one, and the image acquisition device includes two images with different focal points of particles in the observation specimen. By utilizing the fact that the intensity distribution of particles that are smaller than the diffraction limit or the intensity distribution of the fluorescence image approximately follows a Gaussian distribution, the particle scattering image and the fluorescence image are approximated by a two-dimensional Gaussian function. Means for acquiring the horizontal position of the particle, means for acquiring the fluorescence intensity at the center position of the scattered image or fluorescence image, and the position of the particle in the optical axis direction from the difference in fluorescence intensity between the two images. And means for acquiring the three-dimensional position of the particle in the observation specimen.
A microscope apparatus according to the present invention irradiates a sample with a sample stage on which the sample is placed, a glass needle or cantilever operated with respect to the sample surface, a triaxial manipulator for operating the glass needle or cantilever, and the sample A laser that emits laser light, and guides the laser light irradiated on the sample to the optical device via a pair of infinite objective lens and imaging lens or finite objective lens in the optical device. It is configured.
上記課題を解決するための手段により、本発明は、光学顕微鏡により取得された画像情報を使用して、複数の回折限界より小さな蛍光粒子、あるいは、蛍光色素分子の三次元的な重心位置を取得できる原子間力顕微鏡として機能できる。また、光軸方向のみならず光軸に直交する方向の力も計測できる原子間力顕微鏡として機能する顕微鏡装置を構築できる。
また、本発明は、特に蛋白質機能解析の研究で役立ち、ｎｍ（ナノメートル）、ｍｓ（ミリ秒）の精度で蛋白質の挙動および状態を三次元的に観測することが可能になる。
By means for solving the above problems, the present invention uses a more obtained image information into an optical microscope, small fluorescent particles from a plurality of diffraction limit, or a three-dimensional position of the center of gravity of the fluorophore It can function as an atomic force microscope that can be acquired. In addition, it is possible to construct a microscope apparatus that functions as an atomic force microscope capable of measuring not only the optical axis direction but also the force in the direction orthogonal to the optical axis.
In addition, the present invention is particularly useful in research on protein function analysis, and it becomes possible to observe the behavior and state of a protein three-dimensionally with an accuracy of nm (nanometer) and ms (millisecond).
本発明を実施するための最良の形態を、図面を参照しながら説明する。ただし、これらは一実施形態にすぎず、本発明の特許請求の範囲を限定するものではない。
図１は、本発明の実施形態に係る顕微鏡装置の構成を示す概略図である。図示するように、顕微鏡装置は、光学装置として、スリット１０１、リレーレンズ１０２、ハーフミラー１０３、ミラー１０４を備え、これ以外に画像取得装置１０５を備える。スリット１０１は、一対の無限系対物レンズと結像レンズ、あるいは、有限系対物レンズからなる光学系の結像面に配置する。リレーレンズ１０２によって、スリット１０１により視野が絞られた像を画像取得装置１０５まで伝達する。リレーレンズ１０２によって、顕微鏡像の倍率を変化させることができる。ハーフミラー１０３は、リレーレンズの近傍に配置し、光路を光路ａ、光路ｂの二つに分割する。ハーフミラーの代わりにダイクロックミラーを用いてもよい。蛍光色素等が発する蛍光波長は広がりを持っているので、ダイクロックミラーによって、光路を分割することができる。レーザー照射による散乱像を観測する場合は、二色のレーザー光による散乱像を取得すればよい。ハロゲン光等の白色光を用いても良い。光路ｂは、光路ａと直交するが、ミラー１０４によって曲げられ、画像取得装置１０５上に結像する。ここで、ハーフミラー１０３と画像取得装置１０５の受光面までの距離をＬ、ハーフミラー１０３とミラー１０４までの距離をＤとすると、行路ａと光路ｂの光路長には、｛ｓｑｒｔ（Ｌ２＋Ｄ２）＋ｄ｝−Ｌだけの差が生じる。すなわち、行路ａと光路ｂのそれぞれから、焦点面の異なる顕微鏡像を得ることができる。光路ｂによる像は、光路長が光路ａに比べて長い為、光路aによる像より拡大率が若干大きくなる。光路ｂは、画像取得装置１０５に対し、ａｔａｎ（Ｄ／Ｌ）の角度で入射することになるが、Ｌが十分にＤよりも大きければ無視できる。本実施例では、Ｌ＝２６０ｍｍ、Ｄ＝４０ｍｍであり、入射角は８．７度である。
The best mode for carrying out the present invention will be described with reference to the drawings. However, these are merely embodiments, and do not limit the scope of the claims of the present invention.
FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of a microscope apparatus according to an embodiment of the present invention. As illustrated, the microscope apparatus, as an optical device, comprising a slit 101, a relay lens 102, half mirror 103 comprises a mirror 104, an image acquisition apparatus 105 in addition to this. The slit 101 is disposed on the imaging plane of an optical system including a pair of infinite objective lens and imaging lens, or a finite objective lens. An image whose field of view is narrowed by the slit 101 is transmitted to the image acquisition device 105 by the relay lens 102. The magnification of the microscopic image can be changed by the relay lens 102. The half mirror 103 is disposed in the vicinity of the relay lens, and divides the optical path into two, an optical path a and an optical path b. A dichroic mirror may be used instead of the half mirror. Since the fluorescence wavelength emitted by the fluorescent dye or the like has a broadening, the optical path can be divided by the dichroic mirror. When observing a scattered image by laser irradiation, a scattered image by two colors of laser light may be acquired. White light such as halogen light may be used. The optical path b is orthogonal to the optical path a, but is bent by the mirror 104 and forms an image on the image acquisition device 105. Here, when the distance between the half mirror 103 and the light receiving surface of the image acquisition device 105 is L, and the distance between the half mirror 103 and the mirror 104 is D, the optical path length of the path a and the path b is {sqrt (L2 + D2) A difference of only + d} −L occurs. That is, microscopic images with different focal planes can be obtained from each of the path a and the optical path b. Since the image by the optical path b has a longer optical path length than the optical path a, the enlargement ratio is slightly larger than the image by the optical path a. The optical path b is incident on the image acquisition device 105 at an angle of atan (D / L), but can be ignored if L is sufficiently larger than D. In this embodiment, L = 260 mm, D = 40 mm, and the incident angle is 8.7 degrees.
上記のような光路ｂの画像取得装置１０５に対する入射の傾きを除去する為に、図２に示す方法がある。図２に示す顕微鏡装置は、スリット２０１、リレーレンズ２０２、ダイクロックミラー２０３、２０４、ミラー２０５、画像取得装置２０６、及び、ガラスキューブ２０７または凹レンズ２０８からなる。ダイクロックミラー２０３と２０４は、同じ波長特性を持つ。図１に示す装置と同様に、スリット２０１は、一対の無限系対物レンズと結像レンズ、あるいは、有限系対物レンズからなる光学系の結像面に配置し、リレーレンズ２０２によって、スリット２０１により視野が絞られた像を画像取得装置２０５まで伝達する。リレーレンズ２０２の近傍に配置されたダイクロックミラー２０３が、光路を光路ｃ、光路ｄ二つに分ける。二つのミラー２０５、及び、ダイクロックミラー２０４によって、二つの光路が一つにまとめられる。上記により、二つの光路は、画像取得装置２０６に対し垂直に入射される。ここで、光路ｃ、光路ｄの長さには差がない。焦点位置に差を設けるため、光路ｄにのみ、ガラスキューブ２０７を配置する。ガラスは、空気よりも屈折率が高いため、光路ｄは、ガラスを通り屈折され画像取得装置２０６に入射される。これは、光路長を長くした事と等価である。ガラスキューブ２０７の代わりに凸レンズを挿入しても同様の効果が得られる。光路ｄの光路長を短くしたい場合は、ガラスキューブ２０７の代わりに凹レンズ２０８を挿入すれば良い。 In order to remove the inclination of incidence on the image acquisition device 105 in the optical path b as described above, there is a method shown in FIG. The microscope apparatus shown in FIG. 2 includes a slit 201, a relay lens 202, dichroic mirrors 203 and 204, a mirror 205, an image acquisition apparatus 206, and a glass cube 207 or a concave lens 208. The dichroic mirrors 203 and 204 have the same wavelength characteristics. Similar to the apparatus shown in FIG. 1, the slit 201 is disposed on the imaging surface of an optical system composed of a pair of infinite objective lens and imaging lens, or a finite objective lens. An image with a narrow field of view is transmitted to the image acquisition device 205. A dichroic mirror 203 disposed in the vicinity of the relay lens 202 divides the optical path into two optical paths c and d. The two optical paths are combined into one by the two mirrors 205 and the dichroic mirror 204. As described above, the two optical paths are perpendicularly incident on the image acquisition device 206 . Here, there is no difference in the length of the optical path c and the optical path d. In order to provide a difference in the focal position, the glass cube 207 is disposed only in the optical path d. Since glass has a higher refractive index than air, the optical path d is refracted through the glass and is incident on the image acquisition device 206. This is equivalent to increasing the optical path length. The same effect can be obtained by inserting a convex lens instead of the glass cube 207 . In order to shorten the optical path length of the optical path d, a concave lens 208 may be inserted instead of the glass cube 207 .
図１に示す顕微鏡装置を用いて取得された画像を図３に示す。上半分が光路ａによる、下半分が光路ｂによる画像である。図１、および、図２に示す顕微鏡装置を用いれば、図３に示すように、焦点の異なる二つの画像を受光面で一枚の画像として取得できる。 The image acquired using the microscope apparatus shown in FIG. 1 is shown in FIG. The upper half is an image by the optical path a, and the lower half is an image by the optical path b. If the microscope apparatus shown in FIG. 1 and FIG. 2 is used, as shown in FIG. 3, two images with different focal points can be acquired as one image on the light receiving surface.
図４に、６００ｎｍ毎に焦点の位置をずらした時の蛍光粒子の蛍光像を示す。観察試料として、半導体ナノクリスタル蛍光粒子（Ｅｖｉｄｅｎｔ社）を用いた。波長５３２ｎｍのレーザーで励起し、６００ｎｍ以上の反射光を蛍光として取得した。上記半導体ナノクリスタルは、発光部の直径が約５ｎｍであり、回折限界よりも十分小さいので、得られる蛍光像の蛍光強度は、近似的にガウス分布に従う。図４上部の５つの図は、光路ａにより作られた６００ｎｍ毎の上記半導体ナノクリスタルの蛍光像である。下部の５つの図は、同じ半導体ナノクリスタルの像であるが、光路ｂにより作られた蛍光像である。焦点が適合した位置から、観察試料の載る顕微鏡ステージを光軸（Ｚ軸）方向に移動させて行くと、像がぼけ、少しずつ暗くなっていく。光路ｂにより作られた蛍光像は、光路ａで焦点が合っている時、像がぼけて暗いが、顕微鏡ステージを移動させて行くにつれ、像が鮮明になり明るくなる。 FIG. 4 shows a fluorescent image of fluorescent particles when the focus position is shifted every 600 nm. Semiconductor nanocrystal fluorescent particles (Evident) were used as observation samples. Excitation was performed with a laser having a wavelength of 532 nm, and reflected light of 600 nm or more was obtained as fluorescence. Since the semiconductor nanocrystal has a light emitting portion having a diameter of about 5 nm and sufficiently smaller than the diffraction limit, the fluorescence intensity of the obtained fluorescent image approximately follows a Gaussian distribution. The five figures at the top of FIG. 4 are fluorescence images of the semiconductor nanocrystals made every 600 nm created by the optical path a. The lower five figures are images of the same semiconductor nanocrystal, but a fluorescent image created by the optical path b. When the microscope stage on which the observation sample is placed is moved in the optical axis (Z-axis) direction from the position where the focal point is matched, the image becomes blurred and gradually becomes darker. The fluorescent image produced by the optical path b is blurred and dark when focused on the optical path a, but the image becomes clearer and brighter as the microscope stage is moved.
非特許文献１、２の方法では、上記の焦点移動に伴う、粒子像の蛍光強度から、粒子のＺ軸上の位置を算出する。本実施例では、回折限界より小さな蛍光粒子、あるいは、蛍光色素分子の散乱像、もしくは、蛍光像は、近似的に二次元ガウス分布に従うことを利用して、粒子の蛍光像を［数１］にて近似する。
図５（ａ）に、８０ｎｍ毎に７５００ｎｍ／ｓの速度で顕微鏡ステージを階段状にずらした時の光路ａ、及び、光路ｂにおける蛍光粒子の蛍光像を［数１］で近似した時のパラメータＩを示す。灰色の実線が光路ａ、黒色の実線が光路ｂを示す。それぞれの光路で、焦点が適合した時に、パラメータＩは最も大きくなる。顕微鏡ステージを焦点方向に移動させ、その時の顕微鏡ステージの位置と、粒子の蛍光強度を記録しておくことにより、図５（ｂ）に示すような、光路ｂの粒子におけるパラメータＩと、Ｚ軸上の位置の相関のグラフを作る。図５（ｂ）の相関表を元に、図５（ａ）の０から２５００ｍｓの間の蛍光強度をＺ軸上の位置に変換したグラフを図５（ｃ）に示す。この方法は、蛍光強度の揺らぎ（分散）が、そのままＺ軸上の位置計算の精度となる。従って、蛍光強度の低さ（画像のＳ／Ｎが低い）、あるいは、蛍光強度の明滅、照射むら、レーザーの出力揺らぎなどが、位置精度を低下させる。図５（ｃ）の例では、位置精度は、Ｚ軸上の粒子の位置が２５０ｎｍから１２５０ｎｍで、１５ｎｍ程度であった。 FIG. 5A shows parameters obtained by approximating the fluorescence image of the fluorescent particles in the optical path a and the optical path b when the microscope stage is shifted stepwise at a speed of 7500 nm / s every 80 nm by [Equation 1]. I is shown. A gray solid line indicates the optical path a, and a black solid line indicates the optical path b. In each optical path, the parameter I is the largest when the focus is matched. By moving the microscope stage in the focal direction and recording the position of the microscope stage at that time and the fluorescence intensity of the particles, the parameter I and the Z axis of the particles in the optical path b as shown in FIG. Make a graph of the correlation of the top position. FIG. 5C shows a graph in which the fluorescence intensity between 0 and 2500 ms in FIG. 5A is converted to a position on the Z-axis based on the correlation table of FIG. 5B. In this method, the fluctuation (dispersion) of the fluorescence intensity directly becomes the accuracy of the position calculation on the Z axis. Therefore, low fluorescence intensity (image S / N is low), or flickering of fluorescence intensity, irradiation unevenness, laser output fluctuation, and the like decrease the position accuracy. In the example of FIG. 5C, the positional accuracy is about 15 nm when the particle position on the Z-axis is 250 nm to 1250 nm.
本発明では、上記の蛍光強度の揺らぎによる、位置精度の低下を除去する為に、二つの焦点位置の異なる画像を同時に取得する。光路ａにおける粒子の蛍光像を［数１］で近似計算を行った時のパラメータＩをＩＡとすると、ＩＡは、［数２］に従う。
従って、ＩＡ、ＩＢの差分を加算で割ることで、［数６］に示すように蛍光強度の項Ｐが打ち消される。
図６に、図５（ａ）の１０００ｍｓから３０００ｍｓの間における、（ＩＡ−ＩＢ）／（ＩＡ＋ＩＢ）を示す。図５（ｂ）と同様にして、（ＩＡ−ＩＢ）／（ＩＡ＋ＩＢ）とＺ位置の相関表を作ることで、ＩＡ、ＩＢから、Ｚ位置を計算することができる。図６（ｂ）に上記相関表を、図６（ｃ）に（ＩＡ−ＩＢ）／（ＩＡ＋ＩＢ）から得られる焦点位置のグラフを示す。８０ｎｍの階段状の変位が明瞭に確認できる。この時の分解能は、位置精度は、Ｚ軸上の粒子の位置が７５０ｎｍから１７５０ｎｍで、７ｎｍ程度であった。この様に、異なる焦点面における２枚の画像を用いて、粒子の蛍光揺らぎの効果を除去することにより、従来の方法に比べ分解能が向上する。本発明は、粒子の散乱像、あるいは、蛍光像を［数１］で近似した時に、水平方向の座標は取得できているので、粒子の三次元位置が取得できることになる。 FIG. 6 shows (IA−IB) / (IA + IB) between 1000 ms and 3000 ms in FIG. Similarly to FIG. 5B, the Z position can be calculated from IA and IB by creating a correlation table between (IA−IB) / (IA + IB) and the Z position. FIG. 6B shows the above correlation table, and FIG. 6C shows a graph of the focal position obtained from (IA−IB) / (IA + IB). A stepwise displacement of 80 nm can be clearly confirmed. As for the resolution at this time, the position accuracy was about 7 nm with the particle position on the Z-axis ranging from 750 nm to 1750 nm. In this way, the resolution is improved as compared with the conventional method by removing the effect of the fluorescence fluctuation of the particles using two images at different focal planes. In the present invention, when the particle scattering image or the fluorescence image is approximated by [Equation 1], the horizontal coordinate can be acquired, so that the three-dimensional position of the particle can be acquired.
上記の方法を数値計算的に簡単にすることもできる。［数７］を用いて粒子の水平方向の座標を、蛍光強度を重みとした重心位置として計算する。
図７に蛍光強度を取得する範囲の広さを変えた時のＺ位置計算の精度を示す。横軸に、蛍光強度を取得する範囲の広さを点像分布関数の標準偏差に対する倍率で示し、縦軸に上記方法にて、Ｚ位置を計測した時の位置精度を示す。１２回試行を繰り返し、その平均値をプロットした。図７によれば、蛍光強度を取得する範囲の広さが点像分布関数の標準偏差の二倍を越えると、急激に位置精度が低下する。横軸のゼロは、上述したガウス関数で近似した場合を示した。蛍光強度を取得する範囲の広さを点像分布関数の標準偏差以下であれば、上述したガウス関数で近似した方法と分解能に大きな差はない。この方法は、計算が簡単であると共に、散乱像あるいは蛍光像が、ガウス分布に従う必要がない。従って、回折限界よりも大きな粒子の三次元位置も計測することができる。また、観察対象が、粒子のような球形でなくても、その重心位置を三次元的に取得することができる。 FIG. 7 shows the accuracy of the Z position calculation when the range of the fluorescence intensity acquisition range is changed. The horizontal axis indicates the range of the fluorescence intensity acquisition range by the magnification with respect to the standard deviation of the point spread function, and the vertical axis indicates the position accuracy when the Z position is measured by the above method. The trial was repeated 12 times, and the average value was plotted. According to FIG. 7, when the range of the fluorescent intensity acquisition range exceeds twice the standard deviation of the point spread function, the position accuracy is drastically lowered. Zero on the horizontal axis represents the case of approximation by the Gaussian function described above. If the range of the fluorescence intensity acquisition is less than the standard deviation of the point spread function, there is no significant difference in resolution from the method approximated by the Gaussian function described above. This method is simple to calculate and does not require that the scattered or fluorescent image follow a Gaussian distribution. Therefore, the three-dimensional position of particles larger than the diffraction limit can also be measured. Further, even if the observation target is not a spherical shape like particles, the center of gravity position can be acquired three-dimensionally.
観察試料として、半導体ナノクリスタルを用いた例で説明したが、蛍光ビーズの蛍光像や、微小ビーズの暗視野像など、コントラストの良い像を用いれば、本手法の位置分解能は、１ｎｍ以下となる。また、本手法は、エバネッセント照明、共焦点、射光照明、暗視野照明、二光子励起照明等、様々な照明法によって作られる、散乱像、および、蛍光像で利用可能である。 Although the example using a semiconductor nanocrystal has been described as an observation sample, if a high-contrast image such as a fluorescent image of a fluorescent bead or a dark field image of a microbead is used, the position resolution of this method is 1 nm or less. . In addition, the present technique can be used for scattered images and fluorescent images created by various illumination methods such as evanescent illumination, confocal illumination, incident illumination, dark field illumination, and two-photon excitation illumination.
次に、本手法を用いた原子間力顕微鏡について説明する。図８に本実施形態に係る原子間力顕微鏡装置として機能する顕微鏡装置の構成の一例を示す。図１に示す顕微鏡装置に加え、無限系対物レンズ８０１、結像レンズ８０２、試料ステージ８０３、ガラスニードル８０４、三軸マニピュレータ８０５、照射用レーザー８０６、コンデンサレンズ８０７から成る。照射用レーザーは、コンデンサレンズ８０７を通り、試料を照射する。暗視野照明や射光照明を用いる場合、コンデンサレンズ８０７の開口数は、対物レンズ８０１より大きくする。対物レンズ８０１と結像レンズ８０２により、ガラスニードル８０４の顕微鏡像が画像取得装置１０５に映し出される。三軸マニピュレータ８０５は、ガラスニードル８０４を三次元的に動かせる。ガラスニードル８０４先端の画像を画像取得装置１０５に映し出し、その像の重心の三次元的位置を上述した方法により取得することで、光軸に対して垂直方向への撓りと光軸方向の撓りを同時に計測できる。また、さらに、コンデンサレンズ８０７の代わりに無限系対物レンズ、ダイクロックミラー８０８、結像レンズ８０９、画像取得装置８１０を設けることによって、ガラスニードルの三次元変位のみならず、蛍光像も同時に取得する事ができる。無限系対物レンズ８０１、結像レンズ８０２の代わりに、１つの有限系対物レンズを用いても良い。無限系対物レンズ８０７、結像レンズ８０９も同様に、１つの有限系対物レンズを用いても良い。ガラスニードル８０４の代わりにカンチレバーを用いることもできる。本発明は、従来の原子間力顕微鏡とは異なり、簡便な光学系である為、照射レーザー、ピンホールの微調整等を行う必要がない。 Next, an atomic force microscope using this method will be described. FIG. 8 shows an example of the configuration of a microscope apparatus that functions as an atomic force microscope apparatus according to this embodiment. In addition to the microscope apparatus shown in FIG. 1, it includes an infinite system objective lens 801, an imaging lens 802, a sample stage 803, a glass needle 804, a triaxial manipulator 805, an irradiation laser 806, and a condenser lens 807. The irradiation laser passes through the condenser lens 807 and irradiates the sample. When dark field illumination or incident illumination is used, the numerical aperture of the condenser lens 807 is made larger than that of the objective lens 801. A microscope image of the glass needle 804 is projected on the image acquisition device 105 by the objective lens 801 and the imaging lens 802. The triaxial manipulator 805 can move the glass needle 804 in three dimensions. An image of the tip of the glass needle 804 is displayed on the image acquisition device 105, and the three-dimensional position of the center of gravity of the image is acquired by the method described above, so that the deflection in the direction perpendicular to the optical axis and the deflection in the optical axis direction are obtained. Can be measured simultaneously. Further, by providing an infinite system objective lens, a dichroic mirror 808, an imaging lens 809, and an image acquisition device 810 instead of the condenser lens 807, not only the three-dimensional displacement of the glass needle but also the fluorescence image is acquired simultaneously. I can do things. Instead of the infinite objective lens 801 and the imaging lens 802, one finite objective lens may be used. Similarly, for the infinite system objective lens 807 and the imaging lens 809, one finite system objective lens may be used. A cantilever can be used instead of the glass needle 804. Unlike the conventional atomic force microscope, the present invention is a simple optical system, so there is no need for fine adjustment of the irradiation laser and pinhole.
本発明によって開発された焦点の異なる２枚の画像をひとつの画像取得装置で取得するように用いられる光学装置と、蛍光粒子、あるいは、蛍光色素分子の三次元重心位置計算方法を実行する画像取得装置及び、ガラスニードルを用いた顕微鏡装置であり、微小空間像を移動する粒子を三次元的に追跡することができる。 Image acquisition for executing the three-dimensional center-of-gravity position calculation method of an optical device and fluorescent particles or fluorescent dye molecules used to acquire two images with different focal points developed by the present invention with one image acquisition device It is a microscope apparatus using an apparatus and a glass needle , and can track three-dimensionally the particles moving in the micro space image.
１０１ スリット
１０２ 結像レンズ
１０３ ハーフミラー
１０４ ミラー
１０５ 画像取得装置
２０１ スリット
２０２ 結像レンズ
２０３ ダイクロックミラー
２０４ ダイクロックミラー
２０５ ミラー
２０６ 画像取得装置
８０１ 無限系対物レンズ
８０２ 結像レンズ
８０３ 標本試料
８０４ ガラスニードル
８０５ 三軸マニピュレータ
８０６ レーザー
８０７ コンデンサレンズ、もしくは、対物レンズ
８０８ ミラー、もしくは、ダイクロックミラー
８０９ 結像レンズ
８１０ 画像取得装置
DESCRIPTION OF SYMBOLS 101 Slit 102 Imaging lens 103 Half mirror 104 Mirror 105 Image acquisition apparatus 201 Slit 202 Imaging lens 203 Dichroic mirror 204 Dichroic mirror 205 Mirror 206 Image acquisition apparatus 801 Infinite system objective lens 802 Imaging lens 803 Specimen sample 804 Glass needle 805 Triaxial manipulator 806 Laser 807 Condenser lens or objective lens 808 Mirror or dichroic mirror 809 Imaging lens 810 Image acquisition device
Claims (3)
前記光学装置は、
一対の無限系対物レンズと結像レンズ、あるいは、有限系対物レンズと、
光学顕微鏡の結像面に配置されたスリットと、
該結像面の実像を同倍あるいは数倍に伝達するためのリレーレンズと、
結像側の光路を二つに分けるためのハーフミラーあるいはダイクロックミラーと、
分けられた二つの光路を一つにまとめるミラーとを具備し、
前記画像取得装置は、
観察標本内の試料の焦点の異なる二画像を取得する手段、
前記試料の散乱像、あるいは、蛍光像の強度分布の重心位置を計算することで、該試料の水平方向の位置を取得する手段、
上記重心位置における点像分布関数の標準偏差よりも狭い範囲における蛍光強度を取得する手段、
上記二画像による蛍光強度の差から、該試料の光軸方向における位置を取得し、観察標本内における試料の三次元位置を取得する手段
を具備することを特徴とする顕微鏡装置。 An optical device that creates images having different focal positions based on a difference in optical path length between the two optical paths, and projects the two images obtained by the two optical paths onto the light receiving surface, and the optical device that has the light receiving surface and is projected by the optical device. A microscope apparatus comprising an image acquisition device that acquires image information of two different focal planes based on an image,
The optical device comprises:
A pair of infinite objective lens and imaging lens, or finite objective lens;
A slit arranged on the imaging surface of the optical microscope;
A relay lens for transmitting the real image of the imaging plane to the same magnification or several times;
A half mirror or dichroic mirror to divide the optical path on the imaging side into two,
A mirror that combines two separated optical paths into one,
The image acquisition device includes:
Means for acquiring two images of different focal points of the sample in the observation specimen;
Means for obtaining the horizontal position of the sample by calculating the center of gravity position of the scattered image of the sample or the intensity distribution of the fluorescent image;
Means for acquiring fluorescence intensity in a range narrower than the standard deviation of the point spread function at the center of gravity position;
Means for obtaining the position of the sample in the optical axis direction from the difference in fluorescence intensity between the two images and obtaining the three-dimensional position of the sample in the observation specimen
A microscope apparatus comprising:
前記光学装置は、
一対の無限系対物レンズと結像レンズ、あるいは、有限系対物レンズと、
光学顕微鏡の結像面に配置されたスリットと、
該結像面の実像を同倍あるいは数倍に伝達するためのリレーレンズと、
結像側の光路を二つに分けるためのハーフミラーあるいはダイクロックミラーと、
分けられた二つの光路を一つにまとめるミラーとを具備し、
前記画像取得装置は、
観察標本内の粒子の焦点の異なる二画像を取得する手段、
回折限界より小さな粒子の散乱像、あるいは、蛍光像の強度分布が近似的にガウス分布に従うことを利用して、該粒子の散乱像、蛍光像を二次元ガウス関数で近似し、該粒子の水平方向の位置を取得する手段、
前記散乱像、あるいは、蛍光像の中心位置の蛍光強度を取得する手段、
上記二画像による蛍光強度の差から、該粒子の光軸方向における位置を取得し、観察標本内における粒子の三次元位置を取得する手段
を具備することを特徴とする顕微鏡装置。 An optical device that creates images having different focal positions based on a difference in optical path length between the two optical paths, and projects the two images obtained by the two optical paths onto the light receiving surface, and the optical device that has the light receiving surface and is projected by the optical device. A microscope apparatus comprising an image acquisition device that acquires image information of two different focal planes based on an image,
The optical device comprises:
A pair of infinite objective lens and imaging lens, or finite objective lens;
A slit arranged on the imaging surface of the optical microscope;
A relay lens for transmitting the real image of the imaging plane to the same magnification or several times;
A half mirror or dichroic mirror to divide the optical path on the imaging side into two,
A mirror that combines two separated optical paths into one,
The image acquisition device includes:
Means for acquiring two images with different focal points of particles in the observation specimen;
By utilizing the fact that the scattered image of a particle smaller than the diffraction limit or the intensity distribution of the fluorescent image approximately follows a Gaussian distribution, the scattered image and fluorescent image of the particle are approximated by a two-dimensional Gaussian function, and the horizontal Means for obtaining the position of the direction,
Means for acquiring the fluorescence intensity at the center position of the scattered image or fluorescent image;
Means for obtaining the position of the particle in the optical axis direction from the difference in fluorescence intensity between the two images and obtaining the three-dimensional position of the particle in the observation specimen
A microscope apparatus comprising:
試料面に対して操作されるガラスニードル或いはカンチレバーと、
ガラスニードル或いはカンチレバーを操作するための三軸マニピュレータと、
試料を照射するレーザー光を射出するレーザーとを、更に備え、
試料に照射されたレーザー光を、光学装置における一対の無限系対物レンズと結像レンズ、あるいは有限系対物レンズを介して前記光学装置へ導くように構成されていることを特徴とする請求項１または請求項２項に記載の顕微鏡装置。 A sample stage on which the sample is placed;
A glass needle or cantilever operated against the sample surface;
A triaxial manipulator for operating a glass needle or cantilever;
A laser that emits a laser beam that irradiates the sample; and
The laser light irradiated to the sample is configured to be guided to the optical device via a pair of infinite objective lens and imaging lens or a finite objective lens in the optical device. Or the microscope apparatus of Claim 2 .
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