JP4569299B2

JP4569299B2 - プトレスシン生産能を有する微生物及びそれを用いたプトレスシンの製造方法

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Publication number: JP4569299B2
Application number: JP2005003920A
Authority: JP
Inventors: 聡米田; 正善村松
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 2005-01-11
Filing date: 2005-01-11
Publication date: 2010-10-27
Anticipated expiration: 2025-01-11
Also published as: JP2006191808A

Description

本発明は、ナイロン４６の原料となるプトレスシン（１，４−ジアミノブタン）を製造する能力を持つ微生物、及びその微生物を用いたプトレスシンの製造方法に関する。

ナイロン４６は、１，４−ジアミノブタン（以下、プトレスシンという）またはその機能誘導体とアジピン酸またはその機能誘導体とからつくられ、ナイロン６６を中心とした汎用ポリアミドよりも耐熱性が高いことを特徴とする。また、ナイロン４６は、優れた耐熱性に加えて、引張強度，曲げ強度，衝撃強度などの機械的強度、摺動特性、耐疲労性にも優れていることから、自動車部品、電子部品などへの利用価値が大きく、有用なエンジニアリングプラスチックスとして需要も拡大している。

ナイロン４６の原料であるプトレスシンは、アクリロニトリルにシアン化水素を反応させてコハク酸ニトリルとし、次いで水素添加することにより化学合成される（非特許文献１）。しかしながら、この化学合成では猛毒のシアン化水素を使用しており、環境負荷が大きく、製造コストも高くつく。

一方、微生物学的にプトレスシンを生産する方法についても報告があり、大腸菌（非特許文献２）、乳酸菌（非特許文献３）が使用されている。しかしながら、従来の微生物は、生産能力が低く、10日間の培養で培養液１Ｌあたり多くても0.3グラム程度であり、また、生産したプトレスシンが代謝され、菌内または培養液中に多くは蓄積させることができない。

従って、微生物によるプトレスシン生産を実用的なレベルで可能にするためには、よりプトレスシン生産能の高い微生物が望まれる。
ファインケミカルマーケットデータ、第１巻、1999、株式会社シーエムシー ’The Acetylation of Polyamines in Escherichia coli’ DONALD T. DUBIN AND SANFORD M. ROSENTHAL The Jounal of Biological Chemistry Vol.235，No.3，March 1960 M.E.Arena, et al., Journal of Applied Microbiology 2001, 90(2), 158-162

従って、本発明は、従来の微生物に比べてプトレスシン生産能の高い微生物を提供すること、および該微生物を用いてプトレスシンを効率的にかつ安価に生産する方法を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、エンテロバクター属に属する微生物の中に、プトレスシンを高生産する微生物を見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）配列番号１に示す塩基配列と90％以上相同な16S rDNA配列を有し、かつ、プトレスシン生産能を有するエンテロバクター属に属する微生物。
（２）エンテロバクター属に属する微生物が、エンテロバクター・アズブリエ（Enterobacter asburiae) PAY 3057株（NITE P-52)である、（１）に記載の微生物。
（３）（１）又は(２）に記載の微生物を、プトレスシン生成のための基質と窒素源を添加した培地にて嫌気的条件下で培養し、培養物中からプトレスシンを採取することを特徴とする、プトレスシンの製造方法。
（４）プトレスシン生成のための基質が、アルギニンまたはオルニチンである、（３）に記載のプトレスシンの製造方法。

本発明によれば、プトレスシン高生産能を有する微生物が提供される。従って、この微生物をプトレスシン生成のための基質と嫌気的条件下で培養することにより、エンジニアリングプラスチックとして有用なナイロン４６の原料であるプトレスシンを安価に高生産することができる。

以下、本発明を詳細に説明する。
１．プトレスシン生産能を有する微生物
本発明の微生物は、配列番号１に示す塩基配列と90％以上相同な16S rDNA配列を有し、かつ、プトレスシン生産能を有する微生物である。

このような微生物の例としては、本発明者らが、兵庫県姫路市で採取した土壌サンプルから分離したPAY 3057株を挙げることができる。

PAY 3057株は、16S rRNA遺伝子の塩基配列を決定し、NCBIのプログラム BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用いて同定を行ったところ、エンテロバクター属に属することがわかった。また、PAY 3057株は、基準株との間のDNA-DNAハイブリダイゼーションによりDNA-DNA相同値を比較した結果、アズブリエ（asburiae)種であると認められ、エンテロバクター・アズブリエPAY 3057株（Enterobacter asburiae PAY 3057株）と命名した。本菌株は、2004年12月15日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（NPMD)（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号NITE P-52として寄託されている。

本発明の微生物には、上記のPAY 3057株のほか、その類縁微生物も含まれる。PAY 3057株の類縁微生物としては、例えば、16S rRNA遺伝子（16S rRNA DNA)の塩基配列が、配列番号１の塩基配列と90％以上、好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上相同である微生物であって、かつ、プトレスシン高生産能を有する微生物をいう。ここで、プトレスシン高生産能とは、例えば、１日あたり、0.1〜1.0g/L、好ましくは、0.5〜1.0g/Lのプトレスシンを生産する能力をいう。

PAY 3057株の類縁微生物は、上記プトレスシン生産能と配列番号１に記載の塩基配列を指標として単離することができる。

例えば、後記実施例に示すように、土壌サンプルを、アルギニンを含む培地に添加して嫌気的条件下で培養し、培養液をGC/MS分析してプトレスシン高生産が認められた土壌サンプルを選抜する（一次スクリーニング）。次に、選抜した土壌サンプルの培養液をプレート上で培養し、コロニーを形成させて微生物を単離し、さらに単離した微生物を嫌気的条件で培養し、GC/MS分析してプトレスシン高生産が認められた微生物を選択し（二次スクリーニング）、この微生物菌株の16S rRNAに対応するDNA（以下、「16S rRNA遺伝子」という）の塩基配列について、NCBIのプログラム BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)の塩基配列データベースに対して相同性検索を行う。

本発明の微生物は、嫌気的条件下で行う以外は、エンテロバクター属に属する公知の微生物と同様な方法により培養・増殖することができる。

培地としては、資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類及び必要な栄養源を適当に含有する培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、又はペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、コーンスチープリカー等の含窒素化合物が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。

培養温度は、本発明微生物の生育温度の範囲、好ましくは最適生育温度の範囲に設定すればよく、例えば25〜40℃の範囲が挙げられる。培養時間は、通常、24〜72時間程度行う。また、培養期間中、pHは6.0〜7.0に保持することが好ましい。培地のpHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。

２．本発明の微生物を用いるプトレスシン製造
本発明の微生物は、プトレスシンの製造に使用することができる。上記１において得られた微生物菌株を、プトレスシン生成のための基質と窒素源を添加した培地にて嫌気的条件下で培養し、プトレスシンを生産することができる。プトレスシン生成のための基質としては、好適にはアルギニンであるが、オルニチンであってもよい。また、窒素源としては、特に限定はされないが、前記の窒素源のうち、酵母エキス、肉エキスなどの天然窒素源が好ましい。培養は、例えば、25〜35℃で12〜48時間程度行う。

なお、上記の嫌気的条件とは、分子状酸素が全く存在しない状態をいう。嫌気的条件下で培養を行うためには、静置して行うこともできるが、不活性ガスを通気しながら行うことが好ましい。不活性ガスとしては、二酸化炭素、窒素、アンモニア、アルゴン等を用いればよく、通気量、通気手段はプトレスシン生産性から適宜決定すればよい。

また、より増殖能の高い菌株を用いた方が、単位培養液及び単位時間当たりのプトレスシン生産量が高くなるため、まず前培養によって菌体を活性化させ、これをプトレスシン生産用の本培養の培地に接種して培養を行うことが好ましい。

前培養及び本培養用培地中の基質含有量は、培地中の固形分換算で0.2〜1.0％、好ましくは0.2〜0.5％である。また、培地には、基質と窒素源を少なくとも含有していればよく、その他の成分については、当該技術分野で通常用いられる前記の炭素源、無機塩類等を添加することができる。

微生物菌株の培地への使用量は、例えば、菌体を接種する場合、培地1Lあたり、0.1〜5mg、好ましくは0.2〜2mgであればよく、基質含有量により適宜増減すればよい。

基質は培養開始時にその全量を添加しても、培養中に連続的または間欠的に添加してもよい。また、生成したプトレスシンを培養終了後に一括して取り出しても、培養中に連続的または間欠的に取り出してもよい。

本発明における培養は、培養液中の所望のプトレスシン生成量が最高に達した時点で終了させることができるように、培養液中のプトレスシンをガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等の周知の方法により測定しながら行うことが好ましい。

培養液中に蓄積されたプトレスシンは、培養終了後、常法によって培養液から精製する。精製は、当該技術分野において通常使用されている周知の手段、例えば、ろ過、遠心分離、イオン交換又は吸着クロマトグラフィー、溶媒抽出等の操作が必要に応じて、適宜組み合わせて行えばよい。

微生物の形態は、特に限定されず、微生物の菌体、菌体処理物のいずれであってもよい。菌体処理物としては、例えば、菌体破砕物、培養物（菌体、培養上清）から抽出した酵素などをいう。

微生物の菌体または菌体処理物は固定化して用いることもできる。固定化法としては、従来公知の担体結合法、架橋化法、包括法などの方法が挙げられる。担体結合法では、担体に菌体や酵素を固定化させるが、固定化は物理的吸着、イオン結合、共有結合のいずれであってもよい。担体としては多糖（アセチルセルロース、アガロース）、無機物質（多孔質ガラス、金属酸化物）、合成高分子（ポリアクリルアミド、ポリスチレン）等が用いられる。架橋化法では、グルタルアルデヒド等の二官能性試薬を用いて菌体や酵素同士を架橋、結合させることによって固定化する。また、包括法では、多糖（アルギン酸、カラギーナン）、ポリアクリルアミド、コラーゲン、ポリウレタン等の高分子ゲルの格子や半透膜カプセルに酵素や菌体を包み込むことによって固定化する。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）プトレスシン高生産菌の単離と同定
(1) プトレスシン高生産菌の単離
日本各地で採集した土壌検体（400種）を下記表１に示す組成の液体培地に添加し、混合ガス（窒素：二酸化炭素：水素=8:8:1)下、30℃にて21日間培養した。その後、培養液を下記表２に示す条件にてガスクロマトグラフ質量分析計（GC/MS)で分析し、プトレスシン生産量を測定した。

プトレスシン約1g/Lを生産した検体１種の培養液を前記表１に示す組成の培地に寒天1.5g／Lを加えた固体培地にて混合ガス（窒素：二酸化炭素：水素=8:8:1)下で培養した。

プレート上のコロニーから菌を単離し、再び液体培地（表１）にて単離菌を混合ガス（窒素：二酸化炭素：水素=8:8:1)下で培養し、同様にしてガスクロマトグラフ質量分析計（GC/MS)で分析し、プトレスシン生産量を測定した。

その結果、プトレスシンを高生産（0.6g以上/L/4日）する菌株を取得し、PAY3057株と命名した。PAY3057株は、2004年12月15日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（NPMD)（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号NITE P-52として寄託されている。

（2) PAY3057株の同定
PAY3057株の16S rDNA塩基配列による相同性検索を以下のようにして行った。ゲノムの抽出には、InstraGene Matrix(BIO RAD, CA, USA)を使用し、操作はBIO RAD社のプロトコールに従った。抽出したゲノムDNAを鋳型とし、プライマー9F（5’−gagtttgatcctggctcag−3’:配列番号２）及びプライマー1510R（5’−ggctaccttgttacga−3’:配列番号３）を用いて、PCR（Ready-To-Go PCR Beads:Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USAを使用)により16S ribosomal RNA遺伝子（16S rDNA）の全塩基配列1500〜1600bpの領域を増幅した。その後、増幅された16S rDNAをシーケンシングし（ABI PRISM 3100 DNA Sequencer:Applied Biosystems, CA, USAを使用)、16S rDNAの塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号１に示す。

得られた16S rDNAの塩基配列を用いて相同性検索を行った。相同性検索を行う際のデータベースとして、MicroSeq Microbial Identification System Software V.1.4.1（Applied Biosystem, CA, USA)を使用した。さらに、BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用いてGeneBankDNA塩基配列データベース（GeneBank/DDBJ/EMBL)に対して相同性検索を行った。その結果、PAY3057株はEnterobacter asburiaeと99%の相同性を示した。

（実施例２）本発明微生物菌株によるプトレスシン合成
PAY 3057株を基質（アルギニン）を含む前記表１に示す組成の培地に接種し、混合ガス（窒素：二酸化炭素：水素=8:8:1)下、30℃にて約１週間培養した。

培養液を前記表２に示す条件にてガスクロマトグラフ質量分析計（GC/MS)で分析し、プトレスシン生産をモニターした。プトレスシン生産が最大になった時点で培養を停止した。図１に、本発明微生物菌株（PAY 3057株）、および他の微生物菌株（プトレスシンを高生産しない微生物菌株）によるプトレスシン生産に関するGC/MS分析結果を示す。

本発明微生物菌株（PAY 3057株）、および他の微生物菌株によるプトレスシン生産に関するGC/MS分析結果を示す。

Claims

エンテロバクター・アズブリエ（Enterobacter asburiae）PAY 3057株（NITE P-52）。
請求項１に記載の微生物を、プトレスシン生成のための基質と窒素源を添加した培地にて嫌気的条件下で培養し、培養物中からプトレスシンを採取することを特徴とする、プトレスシンの製造方法。
プトレスシン生成のための基質が、アルギニンまたはオルニチンである、請求項２に記載のプトレスシンの製造方法。