JP4568022B2 - スクリーニング方法 - Google Patents
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Description
SIK2は、主に脂肪組織に発現しており、CREBからの転写活性を抑制するので、この作用を阻害することができれば、糖尿病の予防・治療等に有効であると考えられる。
本発明のスクリーニング方法は、配列番号:1、配列番号:2又は配列番号:3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号:4で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとの分子間相互作用を促進もしくは阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、(a)配列番号:1、配列番号:2又は配列番号:3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号:4で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとを、被検化合物の存在下、インキュベートする工程、及び(b)配列番号:1、配列番号:2又は配列番号:3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号:4で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドの分子間相互作用を、蛍光エネルギー移動による蛍光の変化を測定することによって測定し、被検化合物の非存在下における、蛍光エネルギー移動による蛍光の変化と比較する工程 を有することを特徴とする。
配列番号:1で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ヒト由来の塩誘導性キナーゼ2(以下、本明細書において「SIK2」ともいう)のN末端のメチオニンからC末端のアスパラギンまでの926個のアミノ酸からなるペプチド配列である。配列番号:1で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、cAMP−PKAシグナルで誘導され、PKAによりリン酸化されて活性化され、cAMP responsive element binding protein(以下、本明細書において「CREB」という」)の遺伝子発現活性を制御しているタンパク質である。
蛍光エネルギー移動とは、ある蛍光分子から他の分子へ励起エネルギーが移動する現象をいい、これを利用してポリペプチド間の相互作用を検出することができる。この方法においては、配列番号:1、配列番号:2又は配列番号:3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号:4で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドのそれぞれの特定の部位に異なる2種類の色素を導入する。そして、一方の色素(ドナー)を励起したときに、他方の色素が近くに存在すると、励起エネルギーは他方の色素(アクセプター)に移動し、結果として、ドナーを励起したにもかかわらず、ドナーの蛍光は消光し、アクセプターの蛍光が大きくなる。ところが、2種類の色素が遠くに離れていると、このようなエネルギー移動が起こらず、単にドナーの蛍光が観察される。このエネルギー移動の効率は、2種類の色素間の位置関係で決定される。従って、エネルギー移動効率を測定することによって、両者の距離が決定され、両者の分子間相互作用を検出できる。用いられる色素としては、例えば、ドナーとして、cyan fluorescent protein(CFP)が挙げられ、アクセプターとして、yellow fluorescent protein(YFP)が挙げられる。
なお、本発明のスクリーニング方法において用いられる被検化合物としては、例えば、ペプチド(タンパク質を含む)、合成低分子化合物、動植物や細菌の細胞抽出物、細胞培養上清などが用いられるが、これらに制限されない。
本発明の第2の実施の形態に係るスクリーニング方法は、配列番号:1、配列番号:2又は配列番号:3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドのタンパク質リン酸化活性を阻害もしくは促進する化合物をスクリーニングする方法であって、(a)配列番号:1、配列番号:2又は配列番号:3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号:4又は配列番号:5で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとを、被検化合物の存在下、リン酸化反応に必要な条件下で接触させ、インキュベートする工程、(b)配列番号:4又は配列番号:5で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドのリン酸化状態を検出する工程、及び(c)被検化合物の非存在下における、配列番号:4又は配列番号:5で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドのリン酸化のレベルと比較して、配列番号:4又は配列番号:5で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドのリン酸化のレベルの変化を低下もしくは上昇させる化合物を選択する工程を有することを特徴とする。
また、配列番号:5で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、従来より公知のペプチドの合成方法に従って製造することができる。また、配列番号:4で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
リン酸化状態を検出する方法に特に制限はないが、例えば、配列番号:4又は配列番号:5で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドのリン酸化状態を識別し得る抗体を用いて、抗体との免疫学的な反応によって検出することができる。本発明において、リン酸化 のレベルとは、配列番号:4又は配列番号:5で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド(以下、基質ペプチドともいう)に占めるリン酸化ペプチドの割合を意味する用語として用いられる。従って、たとえば基質 ペプチド のリン酸化レベルの上昇とは、リン酸化ペプチドの割合が増大する状態を意味する。
すなわち、被検化合物の存在下において、存在下の場合がリン酸化のレベルが低下していれば、その被検化合物が、配列番号:4又は配列番号:5で表わされるポリペプチドもしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドのリン酸化活性を阻害すると判断できる。
なお、本発明の第2の実施の形態に係るスクリーニング方法において用いられる被検化合物としては、例えば、ペプチド(タンパク質を含む)、合成低分子化合物、動植物や細菌の細胞抽出物、細胞培養上清などが用いられるが、これらに制限されない。
本発明の第3の実施の形態に係るスクリーニング方法は、配列番号:1、配列番号:2又は配列番号:3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドのタンパク質リン酸化活性を阻害もしくは促進する化合物をスクリーニングする方法であって、(a)DNA結合因子と、該DNA結合因子に対応する応答配列に連結されたレポーター遺伝子を含むベクターと、配列番号:1、配列番号:2又は配列番号:3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号:4で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとを、被検化合物の存在下、インキュベートする工程、(b)レポーター遺伝子の発現を検出する工程、及び(c)被検化合物の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現のレベルと比較して、レポーター遺伝子の発現のレベルを低下もしくは上昇させる化合物を選択する工程を有することを特徴とする。
本発明のスクリーニング方法においては、CREBのリガンド結合領域と他の転写因子との融合タンパク質を用いることもできる。転写因子は、DNA結合領域のみでよい。本発明において、CREBという場合には、この融合タンパク質も含むものとする。用いられる転写因子としては、例えば酵母由来のGAL4タンパク質、GCN4タンパク質、ADR1タンパク質等が挙げられる。
なお、本発明のスクリーニング方法において用いられる被検化合物としては、例えば、ペプチド(タンパク質を含む)、合成低分子化合物、動植物や細菌の細胞抽出物、細胞培養上清などが用いられるが、これらに制限されない。
本発明の第3の実施の形態に係るスクリーニング方法は、in vivo及びin vitroで行いうる。これに限定するわけではないが、本発明のスクリーニング方法は、DNA結合因子をコードする遺伝子を含むベクター、該DNA結合因子に対応する応答配列に連結されたレポーター遺伝子を含むベクター、配列番号:1、配列番号:2又は配列番号:3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクター、及び配列番号:4で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクターを保持する細胞を、被検化合物と接触させ、レポーター遺伝子の発現を指標として、上記被検化合物の作用を測定することによって行なうことが好ましい。用いられる細胞としては哺乳動物細胞が好ましく、哺乳動物細胞としては、例えば、HEK293、CV1、HeLa、3T3−L1、CHO、NIH3T3、BHK−21、COS−7等が挙げられる。
なお、遺伝子の導入は、慣用のリポソーム法やエレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
培養終了後、細胞を回収して適当な溶解バッファー中で破砕し、遠心によって上清を得て細胞抽出液とし、これを用いてレポーター遺伝子の発現をアッセイする。
配列番号:4で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドが、配列番号:1で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド(SIK2)によってリン酸化されると、TORC2のCREB転写活性の促進が阻害される。これによりレポーター遺伝子の発現が阻害されるので、被検化合物の存在下及び非存在下におけるレポーター遺伝子の発現のレベルと比較し、レポーター遺伝子の発現のレベルを低下もしくは上昇させる化合物を選択し、SIK2のタンパク質リン酸化活性を阻害もしくは促進する化合物をスクリーニングすることが可能である。
実施例1
配列番号:5で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド(SALNRTSSDSALHT)の8番目のセリンに相当する部位をリン酸化し、N末端側にシステインを導入したペプチドを合成した。次いで、このペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に結合させてKLH−ペプチド複合体を調製した。得られたKLH−ペプチド複合体を免疫原として抗体を作製した。免疫は、体重が1.9kgの雌ウサギ(系統:日本白色種)に、抗原0.4mgを3回投与した。アジュバントとしてTiter MaxGold 0.5ml/回を使用した。
3回目の抗原を投与して60日経過後に採血し、抗血清を得た。
結果を図1に示す。図1に示すように、キャリヤープロテインのGSTは、クマシーブリリアントブルーによって染色されるが、抗体とは反応しないことがわかる。また、TROC2(野生型)はSIK2の存在下でリン酸化され、抗体と反応するが、171位のセリンをアラニンに変異した、TORC2(S171A)は抗体と反応しないことがわかる。
全長ヒトTORC2遺伝子(配列番号:4で表わされるアミノ酸配列をコードする配列)はIMAGE clone5310152(Invitrogen社製)より入手した。翻訳開始ATGコドンの直前にBglII部位をサイトダイレクト法(PfuTarbo-Stratagene社製)で導入し、BglII/NotIで切断した後、pTargetのBamHI-NotIに導入してpTarget-TORC2を作製した。
一方、pTarget-TORC2(S171A)は上述のpTarget-TORC2に対して配列番号:10及び11で表わされる塩基配列を有する合成DNAによりサイトダイレクト法(PfuTarbo-Stratagene社製)でSer171をAla171に変異させて作製した。
上記結果より、TORC2はCREBの転写活性を促進するが、SIK2によりその171位に存在するセリンがリン酸化されるとCREBの転写活性の促進作用が抑制されることが示された。
cAMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)をコードする遺伝子を含むベクターpIRES-PKA(対照としてpIRES(Clontech社製))、更に前述の配列番号:1で表わされるアミノ酸配列をコードするSIK2遺伝子を発現ずるベクターpTarget-SIK2(対照としてpTarget(Promega社製))を、CRE制御下にルシフェラーゼ遺伝子を配置したレポーター発現ベクター(pTAL-CRE200ng:Clontech社製)と共にLipofectamin2000試薬(2μL:Invitrogen社製)を用いてHEK293細胞へ導入した。導入効率の補正のためにウミシイタケ由来のルシフェラーゼをSV40プロモーター下に発現するベクター(pRL-SV4030ng:Promega社製)を共導入した。導入後4.5時間インキュベーションした後、10%仔ウシ血清を含むDEME培地へ培地交換を行い、培地中に0、10、100nMになるようにスタウロスポリン(Sigma社製)を加え、37℃で24時間培養をした。この培養を行った後、デュアルルシフェラーゼ定量試薬(Promega社製)を用いてルシフェラーゼ活性を測定し、PKAの非存在下及び存在下、SIK2の非存在下及び存在下におけるCRE活性へのスタウロスポリンの効果を求めた。CRE特異的活性の指標は、pTAL-CREもしくはCREが結合していないルシフェラーゼベクター(pTAL)導入細胞のルシフェラーゼ活性をそれぞれウミシイタケ由来ルシフェラーゼの活性で補正し、補正後のpTAL-CREに由来する活性をpTALに由来する活性で割ることによって、CREに由来する特異的活性を求めた。
結果を図3に示す。図3に示すように、PKA非存在下(Basal)の活性は非常に低いが、スタウロスポリン処理により上昇が見られた。PKA存在下ではCREが活性化され、高いレポーター活性が得られる。その活性値はスタウロスポリンでさほど影響を受けない。PKA存在下にSIK2を強制発現させると、PKA依存的なCRE活性化はほぼ完全に阻害される。しかし、スタウロスポリンを加えるとSIK2によるCRE阻害が観察されなくなり、CRE活性が上昇した。
実施例1で得られた抗血清を、等量のTris−HCl(pH7.4:PBS)で希釈した後、プロテインA−セファロース樹脂カラム(Amersham社製)に添加し、樹脂量の6倍容分のTris−HCl(pH7.4:PBS)でカラムを洗浄した後、0.2Mグリシン塩酸(pH2.7)溶液を樹脂量の5倍容分を注入添加した。カラムより溶出された溶液を分取して直ちに1Mトリス溶液(pH9.0)をpHが7になるまで加えて中和した後、PBSに透析し抗体を得た。
陽性コンとロールとして、パーオキシダーゼ(以下HRP)標識抗GST抗体(Pharmacia社製)用いジアミノベンジジン(以下DAB)で発色させた。
Claims (10)
- 配列番号:1、配列番号:2又は配列番号:3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号:4で 表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとの分子間相互作用を促進もしくは阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)配列番号:1、配列番号:2又は配列番号:3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番 号:4で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとを、被検化合物の存在下、インキュベートする工程、及 び
(b)配列番号:1、配列番号:2又は配列番号:3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番 号:4で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドの分子間相互作用を、蛍光エネルギー移動による蛍光の変 化を測定することによって測定し、被検化合物の非存在下における、蛍光エネルギー移動による蛍光の変化と比較する工程
を有することを特徴とするスクリーニング方法。 - 配列番号:1、配列番号:2又は配列番号:3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドのタンパク質リン酸化活性を阻害もしくは促進する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a) 配列番号:1、配列番号:2又は配列番号:3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号:4又は配列番号:5で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを、被検化合物の存在下、リン酸化反応に必要な条件下で接触させ、インキュベートする工程、
(b)配列番号:4又は配列番号:5で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するポリペプチドのリン酸化状態を検出する工程、及び
(c)被検化合物の非存在下における、配列番号:4又は配列番号:5で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペ プチドのリン酸化のレベルと比較して、配列番号:4又は配列番号:5で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドのリン酸化のレベルの変化を低下もしくは上昇させる化合物を選択する工程
を有することを特徴とするスクリーニング方法。 - 配列番号:4又は配列番号:5で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドのリン酸化状態を、配列番号:4又は配列番号:5で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドのリン酸化状態を識別し得る抗 体を用いて検出する、請求項2に記載のスクリーニング方法。
- 配列番号:4又は配列番号:5で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドが標識化されている、請求項2又は3に記載のスクリーニング方法。
- 配 列番号:1、配列番号:2又は配列番号:3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドのタンパク質リン酸化活性を阻害もしくは促進する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)DNA結合因子と、該DNA結合因子に対応する応答配列に連結されたレポーター遺伝子を含むベクターと、配列番号:1、配列番号:2又は配列番 号:3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号:4で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとを、被検化合物の存在下、インキュベートする工程、
(b)レポーター遺伝子の発現を検出する 工程、及び
(c)被検化合物の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現のレベルと比較して、レポーター遺伝子の発現のレベルを低下もしくは上昇さ せる化合物を選択する工程
を有することを特徴とするスクリーニング方法。 - 上記DNA結合因子が、cAMPレスポンス エレメント結合タンパク質、又はcAMPレスポンスエレメント結合タンパク質と他の転写因子のDNA結合領域との融合タンパク質である、請求項5に記載のスクリーニング方法。
- 上記DNA結合因子が、該DNA結合因子をコードする遺伝子を含むベクターを用いて、スクリーニング系で発現させたものである、請求項5又は6に記載のスクリーニング方法。
- 配列番号:1、配列番号:2又は配列番号:3で表わさ れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドが、該ポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクターを用いて、スクリーニング系で発現させたものである、請求項5〜7のいずれか1項に記載のスクリーニング方法。
- スクリーニングが細胞内で行われる、請求項5〜8のいずれか1項に記載のスクリーニング方法。
- 上記細胞が哺乳動物細胞である、請求項9に記載のスクリーニング方法。
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