JP4536233B2

JP4536233B2 - Method for producing transgenic animals

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Publication number: JP4536233B2
Application number: JP2000266340A
Authority: JP
Inventors: 一範仲嶋; 秀典田畑
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2000-09-01
Filing date: 2000-09-01
Publication date: 2010-09-01
Anticipated expiration: 2020-09-01
Also published as: JP2002065112A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、子宮から胎児を摘出することなく子宮内の哺乳類の胎児の特定の部位に、電気穿孔法により外来遺伝子を導入し、遺伝子が導入された胎児をそのまま子宮内で発生させることからなる遺伝子導入哺乳動物の製造方法、当該方法で製造される遺伝子導入哺乳動物に関する。
本発明は、胎児を子宮から取り出すことなく、発生中期〜後期の胎児の特定の部位に目的の外来遺伝子を簡便にかつ効率よく導入する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子の発現の特異性や、遺伝子産物の生理作用の解明や、疾患モデルを作成するなどのために動物に外来遺伝子を導入する方法が開発されている。外来遺伝子を導入された動物としては、トランスジェニックマウスが有名である。トランスジェニックマウスは、通常はマイクロインジェクション法により、受精卵に外来遺伝子を導入して作成されている。また、ウイルスに外来遺伝子を組み込んで感染させることにより遺伝子を導入する方法も広く行われている。しかし、ウイルスを用いる方法は、ウイルスベクターを製作するに非常に多くの時間が必要であり、ウイルスの取扱いにも熟練を要する。操作者への感染の危険性などの問題もあった。このようなウイルスを用いる方法に代えて、電気穿孔法により胚に直接外来遺伝子を導入方法が、特にニワトリにおいて開発されてきた（Muramatsu, T., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 230, 376-380 (1997)など）。この電気穿孔法は、従来のウイルスを用いる方法に比べて簡便であり、多数の外来遺伝子の導入に利用されてきた。また、この電気穿孔法は、ＤＮＡがマイナスに帯電していることを利用して、導入した遺伝子を陽極の方向に移動させることができ、胚の目的とする特定の位置に外来遺伝子を導入することも可能であるという大きな利点を有している。さらに、この方法は物理的な現象に基づくものであることから、ほとんどどの細胞にも適用できるという適用の容易性も有している。
【０００３】
また、受精卵に外来遺伝子を導入した場合には、個体の全ての細胞に外来遺伝子が組み込まれ、個体の特定の部位に外来遺伝子を導入することはできなかった。例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）に特異的に外来遺伝子を導入し、ＣＮＳ細胞の分化、発生をみようとする場合には、中枢神経系が形成される初期の時期に、外来遺伝子を導入することが必要であるが、このような手法は上記のウイルスベクターをもちいる方法と、ニワトリにおける電気穿孔法以外に未だ開発されていない。また、受精卵に外来遺伝子を導入する際、ＣＮＳ特異的に発現するプロモーターを利用して、遺伝子そのものはＣＮＳ以外にも導入されるもののＣＮＳのみに目的遺伝子を発現させる方法も試みられているが、プロモーターの特異性の厳密さが問題となり、信頼性に欠ける。そこで、マウスの発生初期（胎生８〜９日等）の胎児を子宮外に取り出して直接ＣＮＳに遺伝子導入し、全胚培養によりその後の影響を解析する手法も報告されている（Akamatsu, et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1999; 96(17): 9885-9890）。この方法は、中枢神経系の発生初期の短時間の状況解析には有用ではあった。しかしながら、この方法では、全胚培養はせいぜい２日間程度しか続けることができないとか、培養はあくまでも人工的な環境であり、本来の子宮内での発生過程とは異なる可能性がある、などの限界があった。
【０００４】
このように、受精卵に外来遺伝子を導入した場合には、特定の器官での特定の遺伝子の役割を解析することはできない（外来遺伝子に特定の器官で発現するプロモーターをつないだ場合もあるが、この方法では信頼性を欠き実用性は低かった。）ので、発生期の特定の器官のみに目的の外来遺伝子を導入し、これを正常に発生、発育させるための技術開発が求められていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、発生期の特定の器官に目的の外来遺伝子を導入し、これを正常に発生、発育させるための最初の手法を提供するものである。即ち本発明は、受精卵から分化がはじまり、器官が発生してきた段階で、当該器官に特異的に目的の外来遺伝子を導入し、かつ外来遺伝子が導入された個体を正常に発生、発育させることができる方法を初めて提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、電気穿孔法を用いる外来遺伝子の新たな導入方法を検討してきたところ、哺乳類の発生中期〜後期の胎児の特定の器官に、ガラス毛細管を用いて目的の遺伝子を組み込んだ哺乳類発現プラスミドベクターを子宮筋越しに注入し、遺伝子を導入したい領域にピンセット型の電極をあて、適当な電圧パルスをかけることにより特定の部位に目的の外来遺伝子を導入することができ、当該外来遺伝子を導入された胎児が子宮内で正常に発育することを見出した。これは電気穿孔法により、子宮から胎児を摘出することなく特定の部位に目的の外来遺伝子を導入することができるということを初めて見出したものであり、また更に遺伝子が導入された胎児がそのまま子宮内で発生を続けることができるということを初めて見出したものである。
【０００７】
即ち、本発明は、子宮から胎児を摘出することなく子宮内の哺乳類の胎児の特定の部位に、電気穿孔法により外来遺伝子を導入し、遺伝子が導入された胎児をそのまま子宮内で発生させることからなる遺伝子導入哺乳動物の製造方法、及び当該方法により製造された遺伝子導入哺乳動物に関する。
また、本発明は、子宮から胎児を摘出することなく、子宮内の哺乳類の胎児の特定の部位に、電気穿孔法により外来遺伝子を導入する方法、及び当該方法で外来遺伝子が導入された哺乳類の胎児を、そのまま子宮内で発育させる方法に関する。
さらに、本発明は、外来遺伝子が導入され子宮内で発育させている胎児又は出生後の子孫を測定又は解析して、導入した外来遺伝子の機能を分析する方法に関する。
【０００８】
本発明の方法は、脳内の神経細胞が発生過程でさかんに産生され移動する時期（マウスでは胎生１５日頃）において、子宮から胎児を摘出することなく電気穿孔法による遺伝子導入を行い、更にそのまま子宮内で発生を続けさせることを可能にする全く新しい方法である。本発明の方法により、現在脳への遺伝子導入法として一般的に使われているウィルスベクターを用いた方法よりもきわめて簡単に、任意の遺伝子をプラスミドの状態で生きた胎児の脳に導入し、その後の影響を正常の子宮内での発生を経た形（出産させ、そのまま育てることも可能）で観察することができることを可能とするものである。
【０００９】
つぎに本発明をより具体的に説明する。
本発明者らは、胎生１２．５〜１７日のマウスの胎児の脳室に子宮外から５〜１０μｇ／μｌの１〜２μｌのプラスミドベクターを注入した。そして、子宮の外側から直径５ｍｍの電極を用いて３０〜３５Ｖの電気パルスをあてた。このときの電気抵抗は、６００〜１０００ｍΩであった。
この結果、例えば、胎生１４日で処置を行った５８の胎児のうちから、４７匹の外来遺伝子が発現している子供が生まれた（出生率８１％）。これは非常によいバイアビリティー（viability）であり、遺伝子導入が効率よく行なわれたことを示している。
【００１０】
本発明者らは、この方法を種々のプラスミドベクターによりさらに検証した。まず最初に、ＣＭＶプロモーターの制御下で強化緑色蛍光蛋白質（enhanced green fluorescent protein(ＥＧＦＰ)）を発現するｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クローンテック社製）を用いた。胎生１４日のマウスの胎児の脳にｐＥＧＦＰ−Ｎ１を導入し、胎生１５日に固定したところ、脳室帯及び放射状線維（radial fibers）にＥＧＦＰの蛍光を観察することができた（図１Ａ参照）。特に、細胞体や線維のみならず、軟膜下の放射状線維の末端（エンドフィート）においても強い蛍光を観察することができた（図１Ｆ参照）。
電気穿孔法から２日後（電気穿孔法を行ったのが胎生１４日であるから、胎生１６日に固定した。）には、中間帯を移動する多数の神経芽細胞の蛍光像が観察された（図１Ｂ参照）。３日後には、皮室板内を活発に移動する神経芽細胞にも発現が観察された。皮質板とは、将来神経細胞が層状に配列して大脳皮質を形成する部分である。３日後の写真はここには記載してないが、同様のことは、ＣＭＶプロモーターによる修飾赤色蛍光蛋白質（modified red fluorescent protein(ＤｓＲｅｄ)）を発現するｐＤｓＲｅｄ−Ｎ１（クローンテック社製）を用いた実験によっても示された（図１Ｅ参照）。図１Ｅでは、赤色になっている細胞が、観察されたＤｓＲｅｄ陽性の細胞である。
この観察結果は、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）やトリチウムチミジンの取り込み分析によって明らかにされてきた成長過程における神経芽細胞の移動の様式（Angevine, J. B., et al., Nature, 192, 766-768 (1961) ; Altman, J., et al., Exp. Neurol., 107, 36-47 (1990)など）に完全に対応しており、今回の電気穿孔法による遺伝子導入は、正常な発生過程を阻害しないことがわかった。
【００１１】
さらに、胎生１５日にｐＥＧＦＰ−Ｎ１を導入し、生後３日目（（Ｐ）３）に固定したところ、これらの部分においてまだ蛍光陽性の神経芽細胞の移動を観察することができた（図２ａ参照）。しかし、移動する細胞の数はこの時期では劇的に減少することがわかった。
実験に用いたＥＧＦＰは、細胞の全体に分布するため、導入された細胞の全形状を明瞭に目視することができる（図２Ｃ参照）。同じ部位において、多数のＥＧＦＰ陽性の神経芽細胞が、脳辺縁帯のすぐ下に並んで観察された。観察された神経芽細胞は、移動を終えて、成熟神経細胞への分化が開始している。これらの神経芽細胞における最初のプロセスは、辺縁帯において一次樹状突起に対応する枝分かれ構造の形成であった（図２Ｄ〜Ｆ参照）。ＥＧＦＰの蛍光は、放射状線維の束にも観察された。ＥＧＦＰ蛍光のある放射状線維は、内側の皮質よりも外側の皮質においてより多く観察された。ＥＧＦＰの蛍光により、一部の放射状線維は、大脳基底核原基と新皮質の境界を外側に向かって走り、その後急激に方向を変えて辺縁帯にむかって走ることが観察された（図２Ａ〜Ｂ参照）。ＥＧＦＰは各放射状線維の末端部に至るまでその構造を明らかにした（図２Ｂ参照）。
胎生期にｐＥＧＦＰ−Ｎ１を導入した生後の脳において、ＥＧＦＰ陽性の成熟神経細胞はまったく見られなかった。さらに、胎生１５日目において遺伝子導入し、生後１１日目に固定した脳では、ＥＧＦＰ陽性の成熟神経細胞及び神経芽細胞は全く認められず、形態学的にグリアと考えられる少数の細胞のみが陽性であった（図３Ｋ参照）。この実験結果の解釈として、神経芽細胞が移動を終了して成熟神経細胞へと分化すると、ＣＭＶプロモーターが作動しなくなることが考えられた。現在、成熟神経細胞をラベルせずに移動神経芽細胞のみをラベルして可視化する手法は全く知られていないことから、ＣＭＶプロモーターを使用した本手法は、神経芽細胞の移動過程及び配置決定機構を解析する上で非常に有用であると考えられた。
【００１２】
次に、ＥＧＦＰ遺伝子がヒトＥＦ１αプロモーターで発現制御されるプラスミドであるｐＥＦＢＯＳ−ＥＧＦＰを作成して実験をした。ｐＥＦＢＯＳ−ＥＧＦＰの発現パターンは、胎生期においてはｐＥＧＦＰ−Ｎ１のそれとほぼ同じであった。すなわち、胎生１４日目にｐＥＦＢＯＳ−ＥＧＦＰを脳内に注入し、１〜３日後に固定した場合、標識された細胞群は、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１の場合と同様なパターンで移動した（図１Ｃ〜Ｅ参照。Eにおいては、緑色の細胞がそれである）。しかしながら、生後においては、ｐＥＦＢＯＳ−ＥＧＦＰで得られた結果とｐＥＧＦＰ−Ｎ１のそれとはまったく異なるパターンであった。図３Ａ及びＦは、胎生１４日目にｐＥＦＢＯＳ−ＥＧＦＰを注入した、生後２１日目の脳から作成した、異なる２枚の切片のパターンを示している。生後２１日目においても、明確にＥＧＦＰの発現が観察された。ＮｅｕＮ−陽性の成熟神経細胞にＥＧＦＰの強い発現が見られた（図３Ｈ〜Ｊ参照）。標識されたニューロンは脳皮質における第２層／第３層に集まって配置していた（図３Ｅ参照）。これは、胎生１４日目に発生した神経芽細胞の運命についての報告と一致している。
【００１３】
皮質のより内側において標識されたニューロンは、より深い位置に観察された（図３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ参照）。この相違は、脳皮質の部位間の神経細胞発生の経過の違い、すなわち、外側の方が内側よりも発生が早いことを反映している。ＥＧＦＰの蛍光は、細胞体のみならずその樹状突起や軸索においても強く観察された。これらの細胞の頂部樹状突起は辺縁帯に向かって発達し、軸索は深層部で見事に分岐している様子が明確に目視できた。脳梁を通過している交連線維（図３Ａ、Ｂ、Ｆ）及び反対側の皮質における分岐（図３Ｇ）もまた明確に目視できた。ＥＧＦＰを発現するために、汎神経マーカーであるＴα１α−チューブリンのプロモーターを使用した場合にも、生後５日目において脳梁線維の同様なパターンを観察することができた（図３Ｌ参照）。
【００１４】
前記で説明してきた本発明の方法を要約すれば、妊娠母体（マウス）を麻酔して開腹する。子宮を露出させ、ガラス毛細管を用いて、目的の遺伝子を組み込んだ哺乳類発現プラスミドベクターを胎児の脳室へ子宮筋越しに注入する。遺伝子を導入したい領域を考慮してピンセット型の電極をあて、適当な電圧パルスをかけることにより遺伝子導入する。閉腹して、そのまま発生を継続させるということである。
このように本発明の新規な電気穿孔法は、マウスの胎児における細胞の運命、神経細胞の移動、位置決定及び軸索の伸長を決定するなどの発生中期または終期における遺伝子の機能及び発現を解析するために非常に有用なものである。このシステムの大きな利点は簡便なことである。複数の遺伝子を多数構築して生体内で簡単に実験を行うこともできる。さらにＥＧＦＰ発現プラスミドベクターを用いれば、おのおのの神経細胞の全形態及び線維連絡パターンを目視することができる。したがってこの方法は、突然変異マウスのフェノタイプの分析にも役立つ。そして、特定の遺伝子とＥＧＦＰの共発現ベクターを用いて、その遺伝子の過剰発現の結果生じる形態学的な変化を研究することもできる。この方法は、中期又は後期の神経発生における分子メカニズムの研究に非常に役立つものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の遺伝子導入哺乳動物の製造方法は、第一に子宮から胎児を摘出することなく胎児に外来遺伝子を導入できることを特徴にするものであり、遺伝子が導入された胎児をそのまま子宮内で発生させることを第二の特徴とするものである。
本発明の哺乳類としては、ヒトを除く哺乳類動物であればラット、マウス、ハムスター、ウサギ、犬、猿などのいずれでもよいが、実験用としてはマウスやラットが好ましい。
本発明の外来遺伝子としては、発現又は機能を測定できるものであれば特に制限はなく、広範囲のものを使用することができる。これらの外来遺伝子は各種のプロモーターと併せて使用するのが好ましい。外来遺伝子を組み込むベクターとしては、発現ベクターであれば種々のものを使用することができる。これらのベクターには必要に応じて、マーカーやタグなどの標識を組み込むこともできる。外来遺伝子を哺乳類発現プラスミドベクターに組み込む方法は通常の方法により行うことができる。
【００１６】
本発明の電気穿孔法としては、通常の電気穿孔法の方法により行うことができる。好ましい例としては、マイクロインジェクションにより外来遺伝子を注入し、次いで電極を当てて注入された遺伝子を細胞に取り込ませる方法が挙げられる。
本発明の外来遺伝子を導入する器官としては、前述した例では脳であったが、脳に限定されるものではなく、脊髄、心臓、肝臓などの各種の器官に適用することができる。目的とする器官に応じて、また発生を観察すべき細胞に応じて導入場所を適宜設定することができる。例えば、脳などの中枢神経系の場合には、多くの場合脳室への注入が好ましいが、目的・部位によっては脳表側（髄膜側）から導入することも可能である。
【００１７】
本発明の方法を適用する胎児は、器官形成の初期段階が好ましいが、これに限定されるものではない。一般的には、発生中期〜後期の胎児が好ましいが、発生初期であってもよい。哺乳動物がマウスである場合には、胎生１１〜１９日の胎児である場合が好ましい。
【００１８】
本発明は、前記した本発明の方法により製造された哺乳動物を包含する。即ち、本発明の方法により外来遺伝子が導入された遺伝子導入動物を包含するものである。
【００１９】
また、本発明は、子宮から胎児を摘出することなく、子宮内の哺乳類の胎児の特定の部位に、電気穿孔法により外来遺伝子を導入する方法を提供するものでもある。本発明のこの方法は、前記した本発明の遺伝子導入動物の製造方法における遺伝子注入方法と同様に行うことができる。
前記した遺伝子導入哺乳動物の製造方法は、子宮内において動物を発育することを含有するものであるが、本発明のこの方法は遺伝子注入動物の出生を必要としない場合に適用されるものである。
したがって、本発明は、前記した本発明の方法により遺伝子が導入された胎児を子宮内で発育させる方法を包含するものである。
【００２０】
さらに、本発明は、前記した本発明の方法により外来遺伝子が導入された胎児を子宮内で発育させ、発育している胎児（出生後の子供を含む）を測定又は解析して、導入した外来遺伝子の機能を分析する方法を提供するものである。即ち、本発明のこの方法は、遺伝子が導入されて正常に子宮内で発育している状態において、外来遺伝子の機能を分析することが新規な方法を提供するものである。
本発明のこの方法により、現在脳への遺伝子導入法として一般的に使われているウィルスベクターを用いた手法よりもきわめて簡単に、任意の遺伝子をプラスミドの状態で生きた胎児の脳に導入し、その後の影響を正常の子宮内での発生を経た形（出産させ、そのまま育てることも可能）で観察することができる。
【００２１】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２２】
実施例１遺伝子の導入
妊娠ＩＣＲマウスは、ＳＬＣ社（静岡県）から購入した。
妊娠マウス手術法や胚の操作方法はすでに報告されている方法に準じて行った（Nakajima, K., Mikoshiba, K., Miyata, T., Kudo, C., and Ogawa, M. (1997) 94, 8196-8201）。
胎生１４日または１５日目に、妊娠マウスをペントバルビタールで深麻酔し、子宮を露出した。ＱＩＡＧＥＮプラスミドマキシキットで精製したプラスミドＤＮＡを、濃度５〜１０μｇ／μｌになるように１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解した。ファーストグリーン溶液（０．１％）をそのプラスミド溶液に１：１０の比になるように添加した。プラスミド溶液の約１〜２μｌ（胎生１２．５〜１３日に対して０．８μｌ、胎生１４日〜１５日に対して１．２μｌ、胎生１６日〜１７日に対して２μｌ）を、マイクロキャピラリーチューブ（ＧＤ−１；ナリシゲ社、東京）から作ったガラスマイクロピペットにより、側脳室に注入した。胎児を子宮外から挟むように、先端直径５ｍｍの電極板を有しているトゥイザーズ型電極（ＣＵＹ６５０−５；トキワ科学、福岡）を配置した。陽極と陰極で子宮外から胎児の頭部をはさむように固定する。その際、陽極側が、遺伝子を導入したい部位側になるようにする。電気パルス（胎生１２．５日〜１３日に対して３０Ｖ、胎生１４日に対して３２〜３５Ｖ、胎生１５日及びその後に対して３５Ｖ；５０ミリ秒）をエレクトロポーレイター（ＣＵＹ２１Ｅ；トキワ科学）により９５０ミリ秒の間隔で５回かけた。すべての胎児について導入が終了したら、子宮を腹腔内に戻し、閉腹して、胎児の正常な発生が続けられるようにした。
ＣＭＶプロモーターの下流にＥＧＦＰの遺伝子を結合させたｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クローンテック）プラスミドの他に、異なるベクターとして、pDsRed1-N1（クローンテック）及びｐＥＦＢＯＳ−ＥＧＦＰ（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１のEGFPの部分を切り出し、pEFBOSに組み換えたもの）を用いて同様な実験を行った。
【００２３】
実施例２組織の調整及び観察
すべての動物は氷上又はペントバルビタールで麻酔し、胎生期又は生後の段階で、０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。脳を摘出し、４％ＰＦＡで４℃で２〜１６時間さらに後固定した。ＰＢＳで１時間洗浄後、サンプルをＰＢＳ中の３０％ショ糖溶液に平衡化した。生後２１日の脳のサンプルは、ＯＣＴ化合物（サクラ社、東京）に包埋し、液体窒素で凍結した。冠状断の凍結切片（２０μｍ）をクリオスタット（ＣＭ１９００；ライカ社）で作成した。切片は、シランでコーティングされたガラススライド（マツナミ社、日本）に貼り付けた。０．０１％トライトンＸ−１００を含有するＰＢＳ（シグマ）（ＰＢＳＴ）中でＯＣＴ化合物を除いた後、パーマフロアー（イミュノン社；ピッツバーグ、ＰＡ）を用いてカバースリップをのせた。これを、蛍光顕微鏡で直接観察した。
ＭＡＰ２染色の場合には、切片は抗ＭＡＰ２抗体（１：１００、ケミコン社、テメキューラー、ＣＡ）で反応し、ついでＴＲＩＴＣラベルされた抗マウスＩｇＧ抗体（１：１０、カペルオーロラ社、ＯＨ）で免疫染色した。
【００２４】
一方、生後２１日目の脳は、クリオスタットの標本ディスク上で凍結し、５０μｍにスライスした。このスライスをＰＢＳ中にとり、抗ＮｅｕＮ抗体（１：１００、ケミコン社、テメキューラー、ＣＡ）及びＴＲＩＴＣラベルされた抗マウスＩｇＧ抗体（１：１０、キャペルオーロラ社、ＯＨ）を用いて免疫染色した。染色されたスライスをシランコーティングされたスライドにのせ、蛍光イメージをＣＣＤカメラ又は共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【００２５】
【発明の効果】
本発明は、発生途中の哺乳類の胎児の特定の器官を対象として外来遺伝子を導入することができる新規な方法を提供するものである。本発明の方法によれば、特定の神経細胞で遺伝子を発現させるためのプロモーターのスクリーニング、あるいは人工タンパク質のモデリング等において、いくつものプラスミドを生体内で発現させ、それを解析する作業を行う場合、それを短時間で行えるようになる。
ニワトリ胚で行われている電気穿孔法を、よりヒトに近い哺乳動物に対して行う。全胚培養において問題となる培養可能な胎児の発生段階の限界、正常発生を再現できる期間の限定を解消できる。また、ウィルスベクターやトランスジェニックマウスの作製に伴う操作の煩雑さや危険性、それにかかる時間、費用を解決できる。
また、本発明の方法は、遺伝子治療などにも応用できるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、マウスの中枢神経系に導入されたＥＧＦＰの発現による蛍光を観察した図面に代わる写真である（Eの赤色の細胞は、RFPの発現による蛍光を観察したものである）。
【図２】図２は、マウスの中枢神経系に導入されたＥＧＦＰの発現による蛍光を観察した図面に代わる写真である。
【図３】図３は、マウスの中枢神経系に導入されたＥＧＦＰの発現による蛍光を観察した図面に代わる写真である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention comprises introducing a foreign gene into a specific part of a mammalian fetus in the uterus by electroporation without removing the fetus from the uterus, and generating the fetus into which the gene has been introduced as it is in the uterus. The present invention relates to a method for producing a transgenic mammal and a transgenic mammal produced by the method.
The present invention relates to a method for easily and efficiently introducing a target foreign gene into a specific fetal region in the middle to late stage of development without removing the fetus from the uterus.
[0002]
[Prior art]
Methods for introducing foreign genes into animals have been developed to elucidate the specificity of gene expression, the physiological effects of gene products, and to create disease models. Transgenic mice are well known as animals introduced with foreign genes. A transgenic mouse is usually prepared by introducing a foreign gene into a fertilized egg by a microinjection method. In addition, a method of introducing a gene by incorporating a foreign gene into a virus and infecting it is also widely performed. However, the method using a virus requires a very long time to produce a virus vector, and requires skill in handling the virus. There were also problems such as the risk of infection to the operator. In place of such a method using a virus, a method for introducing a foreign gene directly into an embryo by electroporation has been developed particularly in chickens (Muramatsu, T., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. , 230, 376-380 (1997)). This electroporation method is simpler than conventional methods using viruses, and has been used to introduce a large number of foreign genes. In addition, this electroporation method can utilize the fact that DNA is negatively charged to move the introduced gene in the direction of the anode, and introduce the foreign gene into a specific target position of the embryo. It has the great advantage that it is also possible. Furthermore, since this method is based on a physical phenomenon, it can be easily applied to almost any cell.
[0003]
In addition, when a foreign gene was introduced into a fertilized egg, the foreign gene was incorporated into all cells of the individual, and the foreign gene could not be introduced into a specific site of the individual. For example, when a foreign gene is specifically introduced into the central nervous system (CNS) and the differentiation and development of CNS cells are to be observed, the foreign gene should be introduced at an early stage when the central nervous system is formed. However, such a method has not been developed yet other than the method using the above-described virus vector and the electroporation method in chickens. In addition, when a foreign gene is introduced into a fertilized egg, a method of expressing a target gene only in the CNS has been attempted using a promoter that is specifically expressed in the CNS, although the gene itself is introduced in addition to the CNS. The strictness of the specificity of the promoter is a problem and lacks reliability. Therefore, a method has also been reported in which embryos in the early stages of development (eg embryonic day 8-9) are taken out of the uterus and directly introduced into the CNS, and the subsequent effects are analyzed by whole embryo culture (Akamatsu, et al). ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96 (17): 9885-9890). This method was useful for short-term analysis of the initial state of the central nervous system. However, with this method, the whole embryo culture can be continued only for about two days at the most, or the culture is an artificial environment, which may be different from the development process in the uterus. was there.
[0004]
Thus, when a foreign gene is introduced into a fertilized egg, the role of a specific gene in a specific organ cannot be analyzed (although a promoter that is expressed in a specific organ may be connected to the foreign gene). However, this method lacked reliability and its practicality was low.) Therefore, it was required to develop a technology to introduce the target foreign gene only into a specific organ in the nascent stage, and to develop and develop it normally. .
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides an initial method for introducing a target foreign gene into a specific organ during development, and for normal development and development thereof. That is, the present invention introduces a target foreign gene specifically into the organ at the stage where differentiation begins from the fertilized egg and the organ has developed, and the individual into which the foreign gene has been introduced is normally generated and developed. This is the first time that a method is available.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have studied a new method for introducing a foreign gene using electroporation. A mammal in which a target gene is incorporated into a specific organ of a fetus in the middle to late stage of the mammal using a glass capillary tube. The target foreign gene can be introduced into a specific site by injecting an expression plasmid vector over the myometrium, applying a tweezers-type electrode to the region into which the gene is to be introduced, and applying an appropriate voltage pulse. It was found that the fetus into which the fetus was introduced developed normally in the womb. This is the first finding that the target foreign gene can be introduced into a specific site by electroporation without removing the fetus from the uterus. For the first time that it can continue to occur.
[0007]
That is, the present invention introduces a foreign gene by electroporation to a specific part of a mammalian fetus in the uterus without removing the fetus from the uterus, and the fetus into which the gene has been introduced is generated as it is in the uterus. And a transgenic mammal produced by the method.
The present invention also provides a method for introducing a foreign gene into a specific part of a mammalian fetus within the uterus by electroporation without removing the fetus from the uterus, and a method for introducing a foreign gene into which the foreign gene has been introduced by the method. The present invention relates to a method for developing a fetus as it is in a womb.
Furthermore, the present invention relates to a method for measuring the function of an introduced foreign gene by measuring or analyzing a fetus or a postnatal offspring to which a foreign gene has been introduced and developed in the womb.
[0008]
In the method of the present invention, gene introduction by electroporation is performed without removing the fetus from the uterus at the time when neurons in the brain are produced and migrated in the development process (about 15 days of gestation in mice), and further, as it is. It is a completely new method that allows the development to continue in the womb. By the method of the present invention, an arbitrary gene is introduced into a living fetal brain in a plasmid state much more easily than a method using a viral vector generally used as a gene introduction method into the brain at present. It is possible to observe the subsequent effects in a form that has been developed in normal uterus (it is possible to give birth and grow as it is).
[0009]
Next, the present invention will be described more specifically.
The present inventors injected 1 to 2 μl of a plasmid vector of 5 to 10 μg / μl from outside the uterus into the cerebral ventricle of embryonic day 12.5 to 17 mice. Then, an electric pulse of 30 to 35 V was applied from the outside of the uterus using an electrode having a diameter of 5 mm. The electrical resistance at this time was 600 to 1000 mΩ.
As a result, for example, 47 out of 58 fetuses treated on the 14th day of embryonic life were born (expressing birth rate 81%). This is very good viability, indicating that gene transfer was performed efficiently.
[0010]
We further validated this method with various plasmid vectors. First, pEGFP-N1 (manufactured by Clontech) that expresses enhanced green fluorescent protein (EGFP) under the control of the CMV promoter was used. When pEGFP-N1 was introduced into the embryonic brain of embryonic day 14 mice and fixed on embryonic day 15, EGFP fluorescence could be observed in the ventricular zone and radial fibers (see FIG. 1A). ). In particular, strong fluorescence could be observed not only at cell bodies and fibers, but also at the ends (end feet) of radial fibers under the buffy coat (see FIG. 1F).
Two days after the electroporation (the electroporation was performed on embryonic day 14 and fixed on embryonic day 16), fluorescent images of many neuroblasts moving in the intermediate zone were observed. (See FIG. 1B). Three days later, expression was also observed in neuroblasts that actively migrated within the dermal plate. The cortical plate is a part where neurons in the future will be arranged in layers to form the cerebral cortex. Although the photograph after 3 days is not described here, pDsRed-N1 (manufactured by Clontech) expressing the modified red fluorescent protein (modified red fluorescent protein (DsRed)) by the CMV promoter was used. It was also shown by experiment (see FIG. 1E). In FIG. 1E, the red cells are the observed DsRed positive cells.
This observation is based on the pattern of neuroblast migration during the growth process (Angevine, JB, et al., Nature, 192, 766-768), which has been revealed by bromodeoxyuridine (BrdU) and tritium thymidine incorporation analysis. 1961); Altman, J., et al., Exp. Neurol., 107, 36-47 (1990), etc.). It turned out not to inhibit.
[0011]
Furthermore, when pEGFP-N1 was introduced on the 15th day of embryogenesis and fixed on the third day after birth ((P) 3), migration of fluorescence-positive neuroblasts could still be observed in these parts (FIG. 2a). However, it was found that the number of migrating cells decreased dramatically during this period.
Since EGFP used in the experiment is distributed throughout the cell, the entire shape of the introduced cell can be clearly seen (see FIG. 2C). At the same site, a number of EGFP positive neuroblasts were observed side by side just below the marginal zone. The observed neuroblasts have finished migrating and have started to differentiate into mature neurons. The initial process in these neuroblasts was the formation of branching structures corresponding to primary dendrites in the marginal zone (see FIGS. 2D-F). EGFP fluorescence was also observed in radial fiber bundles. More radial fibers with EGFP fluorescence were observed in the outer cortex than in the inner cortex. Due to the fluorescence of EGFP, it was observed that some radial fibers ran outwardly across the boundary between the basal ganglia primordia and the neocortex, and then suddenly changed direction toward the marginal zone (Fig. 2A-B). EGFP revealed its structure up to the end of each radial fiber (see FIG. 2B).
In the postnatal brain into which pEGFP-N1 was introduced in the embryonic period, no EGFP-positive mature neurons were found. Furthermore, in the brain that was introduced with a gene on day 15 and fixed on day 11 after birth, EGFP-positive mature neurons and neuroblasts were not observed at all, and only a small number of cells morphologically considered to be glia. It was positive (see FIG. 3K). As an interpretation of this experimental result, it was considered that the CMV promoter would not work when the neuroblasts finished migrating and differentiated into mature neurons. At present, since there is no known method for labeling and visualizing only migrating neuroblasts without labeling mature neurons, this method using a CMV promoter is a mechanism for determining neuroblast migration processes and arrangement. It was thought that it was very useful in analyzing.
[0012]
Next, pEFBOS-EGFP, a plasmid whose expression was controlled by the human EF1α promoter, was prepared and tested. The expression pattern of pEFBOS-EGFP was almost the same as that of pEGFP-N1 in the embryonic period. That is, when pEFBOS-EGFP was injected into the brain on the 14th day of embryogenesis and fixed after 1 to 3 days, the labeled cell group migrated in the same pattern as that of pEGFP-N1 (FIGS. 1C to 1E). See, in E, green cells). However, after birth, the results obtained with pEFBOS-EGFP were completely different from those of pEGFP-N1. FIGS. 3A and F show the pattern of two different sections made from the brain of day 21 after injecting pEFBOS-EGFP on day 14 of embryo. Even on the 21st day after birth, the expression of EGFP was clearly observed. Strong expression of EGFP was observed in NeuN-positive mature neurons (see FIGS. 3H to J). Labeled neurons were clustered and placed in the second / third layer in the brain cortex (see FIG. 3E). This is consistent with a report on the fate of neuroblasts generated on embryonic day 14.
[0013]
Neurons labeled more inside the cortex were observed at deeper positions (see FIGS. 3A, C, D, F). This difference reflects the difference in the course of neuronal development between regions of the brain cortex, that is, the outer side develops faster than the inner side. The fluorescence of EGFP was strongly observed not only in the cell body but also in its dendrite and axon. The apical dendrites of these cells developed toward the marginal zone, and the axons were clearly visible in the deep layers. Commissural fibers passing through the corpus callosum (FIGS. 3A, B, F) and bifurcations in the contralateral cortex (FIG. 3G) were also clearly visible. Even when the promoter of Tα1α-tubulin, which is a pannergic marker, was used to express EGFP, a similar pattern of corpus callosum fibers could be observed on the fifth day after birth (see FIG. 3L).
[0014]
To summarize the method of the present invention described above, a pregnant mother (mouse) is anesthetized and opened. The uterus is exposed, and a mammalian expression plasmid vector incorporating the gene of interest is injected into the fetal ventricle through the uterine muscle using a glass capillary tube. In consideration of the region into which the gene is to be introduced, a tweezers-type electrode is applied, and the gene is introduced by applying an appropriate voltage pulse. It is to close the stomach and continue generation.
Thus, the novel electroporation method of the present invention analyzes the function and expression of genes in the middle or final stages of development, such as determining cell fate, neuronal migration, localization and axon elongation in mouse fetuses. It is a very useful thing to do. The major advantage of this system is simplicity. A large number of genes can be constructed and experiments can be easily performed in vivo. Further, if an EGFP expression plasmid vector is used, the entire morphology and fiber communication pattern of each nerve cell can be visually observed. This method is therefore also useful for analyzing the phenotype of mutant mice. Using a co-expression vector of a specific gene and EGFP, morphological changes resulting from overexpression of the gene can be studied. This method is very useful for studying molecular mechanisms in middle or late neurogenesis.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The method for producing a transgenic mammal of the present invention is characterized in that a foreign gene can be introduced into a fetus without first removing the fetus from the uterus, and the fetus into which the gene has been introduced is generated as it is in the uterus. This is a second feature.
The mammal of the present invention may be any of rats, mice, hamsters, rabbits, dogs, monkeys and the like as long as it is a mammal other than humans, but mice and rats are preferred for experiments.
The foreign gene of the present invention is not particularly limited as long as it can measure expression or function, and a wide range of genes can be used. These foreign genes are preferably used in combination with various promoters. As a vector into which a foreign gene is incorporated, various vectors can be used as long as they are expression vectors. A label such as a marker or a tag can be incorporated into these vectors as necessary. A method for incorporating a foreign gene into a mammalian expression plasmid vector can be carried out by an ordinary method.
[0016]
The electroporation method of the present invention can be performed by a normal electroporation method. A preferred example is a method in which a foreign gene is injected by microinjection, and then the injected gene is taken into a cell by applying an electrode.
The organ into which the foreign gene of the present invention is introduced is the brain in the above example, but is not limited to the brain, and can be applied to various organs such as spinal cord, heart and liver. The introduction site can be appropriately set according to the target organ and according to the cell whose development should be observed. For example, in the case of the central nervous system such as the brain, in most cases, injection into the ventricle is preferable, but depending on the purpose and site, it can be introduced from the surface of the brain (meningeal side).
[0017]
The fetus to which the method of the present invention is applied is preferably in the early stage of organ formation, but is not limited thereto. In general, a fetus in the middle to late stage of development is preferred, but it may be in the early stage of development. When the mammal is a mouse, it is preferable that the embryo is a fetus of 11 to 19 days old.
[0018]
The present invention includes a mammal produced by the method of the present invention described above. That is, it includes a transgenic animal into which a foreign gene has been introduced by the method of the present invention.
[0019]
The present invention also provides a method for introducing a foreign gene into a specific part of a mammalian fetus in the uterus by electroporation without removing the fetus from the uterus. This method of the present invention can be performed in the same manner as the gene injection method in the method for producing a transgenic animal of the present invention described above.
The method for producing a transgenic mammal described above involves developing an animal in the uterus, but this method of the present invention is applied when the birth of a transgenic animal is not required. .
Accordingly, the present invention includes a method for developing a fetus into which a gene has been introduced by the above-described method of the present invention in utero.
[0020]
Furthermore, the present invention provides a method for developing a fetus into which a foreign gene has been introduced by the above-described method of the present invention in utero, measuring or analyzing the growing fetus (including a postnatal child), and introducing the introduced foreign A method for analyzing the function of a gene is provided. That is, this method of the present invention provides a novel method for analyzing the function of a foreign gene in a state in which the gene is introduced and normally developing in the uterus.
By this method of the present invention, an arbitrary gene can be introduced into a living fetal brain in a plasmid state much more easily than a method using a viral vector generally used as a method for gene transfer into the brain at present. Then, the subsequent effects can be observed in the form of normal development in the uterus (it is possible to give birth and raise it as it is).
[0021]
【Example】
EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to these Examples.
[0022]
Example 1 Gene Introduction Pregnant ICR mice were purchased from SLC (Shizuoka Prefecture).
Pregnant mouse surgery and embryo manipulation were performed according to the methods already reported (Nakajima, K., Mikoshiba, K., Miyata, T., Kudo, C., and Ogawa, M. (1997) 94, 8196-8201).
On the 14th or 15th day of gestation, pregnant mice were deeply anesthetized with pentobarbital to expose the uterus. Plasmid DNA purified with the QIAGEN plasmid maxi kit was dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) to a concentration of 5 to 10 μg / μl. Fast green solution (0.1%) was added to the plasmid solution in a 1:10 ratio. About 1-2 μl of plasmid solution (0.8 μl for embryos 12.5-13 days, 1.2 μl for embryos 14-15 days, 2 μl for embryos 16-17 days) It injected into the lateral ventricle with the glass micropipette made from the tube (GD-1; Narishige company, Tokyo). A Twizers-type electrode (CUY650-5; Tokiwa Kagaku, Fukuoka) having an electrode plate with a tip diameter of 5 mm was placed so as to sandwich the fetus from outside the uterus. Fix the fetal head from outside the uterus with the anode and cathode. At that time, the anode side is set to the site side where the gene is to be introduced. Electroporate (CUY21E; Tokiwa Science) with electric pulses (30V for embryos 12.5-13, 32-35V for embryo 14 days, 35V for embryo 15 days and then 35V; 50 milliseconds) 5 times at intervals of 950 milliseconds. When introduction was completed for all fetuses, the uterus was returned to the abdominal cavity and closed to allow normal development of the fetus to continue.
In addition to the pEGFP-N1 (Clontech) plasmid in which the EGFP gene was linked downstream of the CMV promoter, pDsRed1-N1 (Clontech) and pEFBOS-EGFP (the EGFP part of pEGFP-N1 were excised as different vectors, A similar experiment was performed using a recombinant pEFBOS.
[0023]
Example 2 Tissue preparation and observation All animals were anesthetized on ice or with pentobarbital and in the embryonic or postnatal stage with 4% paraformaldehyde (PFA) in 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.4). Fixed. The brain was removed and postfixed with 4% PFA at 4 ° C. for 2-16 hours. After washing with PBS for 1 hour, the sample was equilibrated with a 30% sucrose solution in PBS. A 21-day-old brain sample was embedded in an OCT compound (Sakura, Tokyo) and frozen in liquid nitrogen. A frozen section (20 μm) of a coronal section was prepared with a cryostat (CM1900; Leica). The sections were attached to glass slides (Matsunami, Japan) coated with silane. After removing the OCT compound in PBS (PBST) containing 0.01% Triton X-100, a coverslip was placed using a perm floor (Immunon, Pittsburgh, PA). This was directly observed with a fluorescence microscope.
In the case of MAP2 staining, the sections are reacted with an anti-MAP2 antibody (1: 100, Chemicon, Temecula, CA), and then immunized with a TRITC-labeled anti-mouse IgG antibody (1:10, Capel Aurora, OH). Stained.
[0024]
On the other hand, the brain on the 21st day after birth was frozen on a cryostat specimen disk and sliced to 50 μm. This slice was taken in PBS and immunostained with an anti-NeuN antibody (1: 100, Chemicon, Temeculer, CA) and a TRITC-labeled anti-mouse IgG antibody (1:10, Capell Aurora, OH). Stained slices were placed on silane-coated slides and fluorescence images were observed using a CCD camera or confocal laser fluorescence microscope.
[0025]
【The invention's effect】
The present invention provides a novel method capable of introducing a foreign gene into a specific organ of a developing mammalian fetus. According to the method of the present invention, in the screening of a promoter for expressing a gene in a specific nerve cell, or in the modeling of an artificial protein or the like, when expressing a number of plasmids in a living body and performing an operation of analyzing it, You can do that in a short time.
Electroporation performed on chicken embryos is performed on mammals that are closer to humans. The limitations of the developmental stage of fetuses that can be cultivated and the limitation of the period during which normal development can be reproduced can be solved. In addition, it is possible to solve the complexity and danger of operations associated with the production of virus vectors and transgenic mice, the time and cost required for the operations.
The method of the present invention can also be applied to gene therapy and the like.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photograph replacing a drawing in which fluorescence due to expression of EGFP introduced into the central nervous system of a mouse was observed (red cells in E are those in which fluorescence due to expression of RFP was observed) ).
FIG. 2 is a photograph replacing a drawing in which fluorescence due to the expression of EGFP introduced into the central nervous system of a mouse was observed.
FIG. 3 is a photograph replacing a drawing in which fluorescence due to the expression of EGFP introduced into the central nervous system of a mouse was observed.

Claims

Without removing the fetus from the uterus, a mammalian expression plasmid vector incorporating a foreign gene is injected into the specific part of the middle to late fetus of the mammal in the uterus by microinjection through the myometrium, and then the uterus Excluding humans, which consists of introducing a foreign gene by immobilizing an electrode so that the region including the specific site is sandwiched from outside and applying a voltage pulse, and then generating the fetus into which the gene has been introduced as it is in the womb A method for producing a transgenic mammal.

The method of claim 1, wherein the mammalian expression plasmid vector comprises a labelable sequence capable of detecting or identifying the expression of the introduced gene.

The method according to claim 1 or 2, wherein the site into which the foreign gene is introduced is the ventricular wall.

The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the mammal is a mouse, and the mid- to late-stage fetuses are fetuses of embryonic days 11-19.

A mammal excluding a human produced by the method according to claim 3 .

The mammal according to claim 5, wherein the mammal is a mouse.

Without removing the fetus from the uterus, a mammalian expression plasmid vector incorporating a foreign gene is injected into the specific part of the fetus in the middle to late stage of development in mammals excluding humans in the uterus through the uterine muscle by microinjection. Then, a method for introducing a foreign gene by immobilizing an electrode and applying a voltage pulse so as to sandwich the region including the specific site from outside the uterus.

8. The method of claim 7, wherein the mammalian expression plasmid vector comprises a labelable sequence capable of detecting or identifying the expression of the introduced gene.

The method according to claim 7 or 8, wherein the site into which the foreign gene is introduced is a ventricular wall .

The method according to any one of claims 7 to 9, wherein the mammal is a mouse, and the middle to late stage fetus is a fetus of embryonic day 11-19.

A method for developing a mammalian fetus excluding a human into which a foreign gene has been introduced by the method according to any one of claims 7 to 10 in a uterus as it is.

A method for analyzing the function of an introduced foreign gene by measuring or analyzing a fetus or a post-natal offspring growing in utero by the method according to claim 9 .