JP4535436B2 - 微生物回収方法および微生物回収キット - Google Patents

Description

本発明は、微生物回収方法および微生物回収キットに関するものである。

例えば、レジオネラ属菌は、呼吸器系の病原細菌であり、元来は土壌中に広く分布するが、人口環境である２４時間浴槽水等からも検出されるようになっている。

そして、これらから空中に飛散し、呼吸器系感染を起こすことによって発症する、レジオネラ肺炎やポンティアック熱等が問題となっている。

ところで、このようなレジオネラ属菌等の微生物を検出するには、単位体積当りの微生物数が検出限界以上であることが必要となる（例えば、特許文献１参照。）。

したがって、浴槽水等の被処理水中に微生物が生息している場合でも、その数が極めて少ない場合には、微生物を検出できずに見逃してしまう場合がある。
このような場合、被処理液中から微生物を回収して検出することが考えられる。

しかしながら、効率よく微生物を回収する方法について、有効な方法が見出されていないのが実情である。

特開平５-３２２８９７号公報

本発明の目的は、被処理液中の微生物を、簡易かつ収率よく回収することができる微生物回収方法、および微生物回収キットを提供することにある。

このような目的は、下記の本発明により達成される。
（１） レジオネラ属菌を含有する被処理液中から、前記レジオネラ属菌を回収する微生物回収方法であって、
少なくとも表面付近が、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された担体に、前記被処理液を接触させることにより、前記担体に前記レジオネラ属菌を付着させる第１の工程と、
前記レジオネラ属菌が付着した前記担体に、ｐＨが９．５以上、１２以下の等張液である回収液を接触させることにより、前記回収液中に前記レジオネラ属菌を遊離させて回収する第２の工程とを有することを特徴とする微生物回収方法。
これにより、被処理液中の微生物を、簡易かつ収率よく回収することができる。

（２） 前記被処理液を前記担体に接触させる時間は、５００ｍＬ当り１〜２４０分である上記（１）に記載の微生物回収方法。
これにより、被処理液中の微生物を、より効率よく担体に付着させることができる。

（３） 前記被処理液を前記担体に接触させる際の前記被処理液の温度は、７０℃以下である上記（１）または（２）に記載の微生物回収方法。
これにより、被処理液中の微生物を、より収率よく担体に付着させることができる。

（４） 前記回収液の量は、前記被処理液の量より少ない上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の微生物回収方法。

これにより、回収液の単位体積当りの微生物数を、被処理液のそれよりも大きくすることができる。

（５） 前記回収液は、緩衝液である上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の微生物回収方法。

これにより、微生物をより確実に担体から遊離させることができるとともに、微生物の崩壊をより確実に防止することができる。

（６） 前記回収液を前記担体に接触させる時間は、２．５ｍＬ当り０．１秒〜５分である上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の微生物回収方法。
これにより、微生物をより効率よく回収液中に回収することができる。

（７） 前記回収液を前記担体に接触させる際の前記回収液の温度は、７０℃以下である上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の微生物回収方法。
これにより、微生物をより効率よく回収液中に回収することができる。

（８） 前記担体は、粒状のものである上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の微生物回収方法。

これにより、担体の表面積を増大させることができ、より効率よく微生物を付着させることができる。

（９） 粒状の前記担体の平均粒径は、２０〜５０００μｍである上記（８）に記載の微生物回収方法。

これにより、担体の表面積を十分に確保することができるので、担体への微生物の付着率をより向上させることができる。

（１０） 前記担体は、その少なくとも表面付近が多孔質なものである上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の微生物回収方法。

これにより、担体の表面積をより増大させることができ、担体への微生物の付着率をさらに向上させることができる。

（１１） 前記担体は、主として樹脂材料で構成された基材と、該基材の表面を覆うように設けられ、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された被覆層とを有するものである上記（１）ないし（１０）のいずれかに記載の微生物回収方法。

これにより、担体の形状、大きさ（平均粒径等）、物性（密度等）等の調整が容易となる。

（１２） 前記樹脂材料は、ポリアミドおよびエポキシ樹脂の少なくとも一方を主成分とするものである上記（１１）に記載の微生物回収方法。

これにより、例えば、基材の表面付近に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された粒子の一部を貫入させることにより、リン酸カルシウム系化合物層を形成する場合には、基材の硬さ（硬度）を適度なものとすることができるので、前記粒子による被覆を容易かつ確実に行うことができる。

（１３） 前記リン酸カルシウム系化合物は、ハイドロキシアパタイトを主成分とするものである上記（１）ないし（１２）のいずれかに記載の微生物回収方法。
これにより、担体に微生物が極めて効率よく付着するようになる。

（１４） 前記担体は、その比表面積が５〜１００ｍ^２／ｇである上記（１）ないし（１３）のいずれかに記載の微生物回収方法。

これにより、担体の機械的強度が低下するのを防止しつつ、微生物の担体への付着効率をより向上させることができる。

（１５） 前記被処理液は、浴槽水である上記（１）ないし（１４）のいずれかに記載の微生物回収方法。
本発明の微生物回収方法は、浴槽水に含まれる微生物の回収への適用が好適である。

（１６） 上記（１）ないし（１５）のいずれかに記載の微生物回収方法に使用するための微生物回収キットであって、
前記担体と、
前記担体を収納する収納空間と、該収納空間に連通する注入口および排出口とを備える容器と、
前記収納空間内に、前記排出口を塞ぐように設けられたフィルタとを有することを特徴とする微生物回収キット。
これにより、被処理液中の微生物を、簡易かつ収率よく回収することができる。

（１７） 前記容器は、その少なくとも一部が折り畳み可能となっている上記（１６）に記載の微生物回収キット。
これにより、回収キットの保管時において、スペースの削減を図ることができる。

本発明によれば、被処理液中の微生物を、簡易かつ収率よく回収することができる。
また、回収液の量を、被処理液の量を少なくすることにより、微生物を濃縮することができる。このため、仮に、被処理液中において、微生物が少数しか存在せず、その存在が確認できない（検出不能な）場合でも、回収液中において、その存在を確認することができるようになる。これにより、被処理液に対する早期の対処（例えば、殺菌等）を行うことができる。

以下、本発明の微生物回収方法および微生物回収キットを添付図面に示す好適実施形態に基づいて詳細に説明する。

本発明の微生物回収方法は、微生物を含有する被処理液中から、微生物を回収する方法であり、担体に被処理液を接触させることにより、この担体に微生物を付着させる第１の工程と、微生物が付着した担体に、ｐＨ９以上の回収液を接触させることにより、回収液中に微生物を遊離させて回収する第２の工程とを有している。

まず、本発明において用いられる担体について説明する。
図１は、本発明で用いられる担体の一例を示す断面図である。

図１に示す担体１は、粒状（ほぼ球状）をなしている。担体１には、ブロック状（塊状）、ペレット状、シート状等の各種形状のものを使用することもできるが、粒状のものを用いることにより、その表面積を増大させることができ、より効率よく微生物を付着させることができる。

担体１は、その少なくとも表面付近が、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成されたものである。リン酸カルシウム系化合物は、各種細胞との親和性（細胞親和性）が高いため、かかる担体１は、その表面に微生物を付着させる担体１として好適に使用される。

図１に示す担体１は、主として樹脂材料で構成された基材１１と、基材１１の表面を覆うように設けられ、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成されたリン酸カルシウム系化合物層１２とを有している。これにより、担体１の形状、大きさ（平均粒径等）、物性（密度等）等の調整が容易となる。

なお、担体１は、その全体が、リン酸カルシウム系化合物を主材料として構成されたものであってもよい。全体がリン酸カルシウム系化合物で構成される担体１は、微生物（特に、菌類）を効率よく捕集できる。

また、担体１の比表面積は、５〜１００ｍ^２／ｇであるのが好ましく、１５〜８０ｍ^２／ｇであるのがより好ましい。下限値を下回った場合、効率よく微生物を付着させることができないおそれがある。また、上限値を上回った場合、担体１の機械的強度が低下することにより担体１が破砕し、後述の微生物回収の際に、フィルタの目詰まりを引き起こすおそれがある。

基材１１を構成する樹脂材料としては、各種熱硬化性樹脂、各種熱可塑性樹脂を用いることができ、具体的には、熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリアミド（例えば、ナイロン６、ナイロン６・６、ナイロン６・１０、ナイロン１２）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリイミド、アクリル樹脂、熱可塑性ポリウレタン等、熱硬化性樹脂としては、例えば、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、不飽和ポリエステル、アルキド樹脂、熱硬化性ポリウレタン、エボナイド等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。

これらの中でも、基材１１を構成する樹脂材料としては、ポリアミドおよびエポキシ樹脂の少なくとも一方を主成分とするものであるのが好適である。例えば、後述するように、基材１１の表面付近に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された粒子の一部を貫入させることにより、リン酸カルシウム系化合物層１２を形成する場合には、基材１１を前述した材料で構成することにより、その硬さ（硬度）を適度なものとすることができるので、前記粒子による被覆を容易かつ確実に行うことができる。

リン酸カルシウム系化合物層１２を構成するリン酸カルシウム系化合物としては、特に限定されず、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０の各種化合物を用いることができ、例えば、Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２、Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６Ｆ_２、Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６Ｃｌ_２、Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２、Ｃａ_２Ｐ_２Ｏ_７、Ｃａ（ＰＯ_３）_２、ＣａＨＰＯ_４等のうちの１種または２種以上を混合して用いることができる。

これらの中でも、リン酸カルシウム系化合物としては、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２）を主成分とするものが好適である。ハイドロキシアパタイトは、生体材料として用いられるものであり、担体１に微生物が極めて効率よく付着するようになる。また、ハイドロキシアパタイトは、微生物に対するダメージを与える可能性が特に低いため、微生物が崩壊しない（破壊されない）状態で、後述する回収液中に回収することができる。これにより、微生物をより確実に検出することができる。

なお、これらのリン酸カルシウム系化合物は、公知の湿式合成法、乾式合成法などによって合成することができる。この場合、リン酸カルシウム系化合物中には、その合成の際に残存する物質（原料等）または合成の過程で生じる二次反応生成物等が含まれていてもよい。

また、リン酸カルシウム系化合物層１２は、図１に示すように、基材１１の表面付近に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された粒子１３（以下、単に「粒子１３」と言う。）の一部が貫入することにより形成されたものであるのが好ましい。これにより、リン酸カルシウム系化合物層１２と基材１１との密着性を優れたものとすることができる。このため、リン酸カルシウム系化合物層１２の基材１１の表面からの剥離を好適に防止すること、すなわち、担体１の強度を優れたものとすることができる。

この場合、リン酸カルシウム系化合物層１２は、例えば、基材１１の表面に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された多孔質粒子（以下、単に「多孔質粒子」と言う。）を衝突させることにより形成することができる。かかる方法によれば、容易かつ確実に、リン酸カルシウム系化合物層１２を形成することができる。

この基材１１と多孔質粒子との衝突は、例えば、市販のハイブリダイゼーション装置やメカノフュージョン装置等を用いて、乾式で行うことができる。このときの条件は、例えば、基材１１と多孔質粒子との混合比が、重量比で４００：１〜２０：１程度、装置内の温度が、基材１１の主材料として用いた樹脂材料の軟化温度以下（通常、８０℃以下）とされる。

このような担体１は、その密度（比重）が水の密度に近いのものであるのが好ましい。具体的には、担体１の密度は、０．８〜２ｇ／ｃｍ^３程度であるのが好ましく、０．９〜１．３５ｇ／ｃｍ^３程度であるのがより好ましい。これにより、担体１を、後述する被処理液や回収液中でより均一に懸濁させることができる。その結果、これらの液体と担体１とをより確実かつ均一に接触させることができ、担体１へ微生物が付着する効率や、回収液中への微生物の収率をより向上させることができる。

また、担体１の平均粒径は、２０〜５０００μｍ程度であるのが好ましく、４０〜２００μｍ程度であるのがより好ましい。これにより、担体１の表面積を十分に確保することができるので、担体１への微生物の付着率をより向上させることができる。また、粒径が小さ過ぎると、担体１同士の間を液体が流れにくくなるおそれがある。

また、担体１は、その少なくとも表面付近（本実施形態では、リン酸カルシウム系化合物層１２）が多孔質なものであるのが好ましい。これにより、担体１の表面積をより増大させることができ、担体１への微生物の付着率をさらに向上させることができる。

次に、本発明の微生物回収方法に使用される微生物回収キットについて説明する。
＜第１実施形態＞
まず、本発明の微生物回収キットの第１実施形態について説明する。

図２は、本発明の微生物回収キットの第１実施形態を示す模式図（内部透視図）、図３は、図２に示す回収キットが折り畳まれた状態を示す模式図である。なお、以下の説明では、図２および図３中の上側を「上」、下側を「下」と言う。

図２に示す微生物回収キット（以下、単に「回収キット」と言う。）２は、前述したような担体１と、この担体１を収納する収納空間２０と、収納空間２０に連通する注入口２２および排出口２３とを備える容器２１とを有している。

容器２１内（収納空間２０）に収納する担体１の量は、特に限定されないが、処理する液体（被処理液）の容積５００ｍＬ当り０．３〜５ｇ程度であるのが好ましく、０．５〜３ｇ程度であるのがより好ましい。担体１の量が少な過ぎると、担体１に付着できる微生物の数が制限され、微生物の収率が低くなるおそれがあり、一方、担体１の量が多過ぎると、担体１が被処理液および回収液（溶離液）中で移動し難くなることから、これらの液体と担体１との接触が不十分となり、微生物の収率が低下するおそれがある。

なお、このような回収キット２は、担体１が、予め容器２１に収納された形態のものであってもよく、容器２１とは、個別に担体１が添付され、使用時に担体１を容器２１に投入して使用する形態のものであってもよい。

容器２１は、ほぼ円筒状をなす側壁部２１１と、ほぼ円盤状をなす上壁部２１２および底壁部２１３と有している。

側壁部２１１は、蛇腹状（ベローズ状）をなし、図３に示すように、折り畳み可能となっている。これにより、回収キット２の保管時において、スペースの削減を図ることができる。

また、上壁部２１２および底壁部２１３には、それぞれ、収納空間２０に連通する注入口２２および排出口２３が設けられている。

これらの注入口２２および排出口２３は、それぞれ、栓２４、２５によって閉塞（封止）可能になっている。

なお、側壁部２１１の形状は、円筒状に限定されず、例えば、立方体、直方体、袋状等のいかなるものであってもよいが、担体１と、被処理液および回収液と担体１との接触を均一に行うことができ、また強度に優れることから円筒状であるのが好ましい。

容器２１（側壁部２１１、上壁部２１２および底壁部２１３）の構成材料としては、特に限定されず、例えば、ＡＢＳ樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、熱可塑性ポリウレタン、ポリメチルメタクリレート、ポリオキシエチレン、フッ素樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、アセタール樹脂、アクリル樹脂、ポリエチレンテレフタレート等の熱可塑性樹脂や、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂、不飽和ポリエステル等の熱硬化性樹脂等が挙げられる。また、容器２１の構成材料には、例えば、各種セラミックス材料、各種金属材料等を用いることもできる。

また、収納空間２０内（容器２１の底壁部２１３）には、排出口２３を塞ぐように、フィルタ２６が設けられている。

このフィルタ２６は、担体１の通過を阻止し、かつ、被処理液および回収液を通過させ得る開口径を有するものである。この開口径は、担体１の平均粒径の０．１〜９０％程度であるのが好ましく、担体１の平均粒径の１〜５０％程度であるのがより好ましい。開口径が小さ過ぎると、被処理液および回収液の組成、粘度等によっては、これらの液体の通過抵抗が大きくなり、処理に要する時間が長くなるおそれがあり、一方、開口径が大き過ぎると、担体１がフィルタ２６を容易に通過してしまうおそれがある。

次に、図２に示す回収キット２を用いて行う微生物回収方法（本発明の微生物回収方法）の一例について説明する。

図４は、本発明の微生物回収方法を説明するための模式図である。なお、以下の説明では、図４中の上側を「上」、下側を「下」と言う。

［１］被処理液を担体に接触させる工程（第１の工程）
まず、微生物を含む被処理液３を用意する。

微生物としては、例えば、レジオネラ属菌、大腸菌Ｏ１５７、黄色ぶどう球菌、コレラ菌、炭疽菌等が挙げられる。特に、本発明の微生物回収方法は、レジオネラ属菌のようなアルカリに対して比較的高い耐性を有する微生物の回収に適用するのが好適である。

後述するように、本発明では、担体１から微生物を回収する際に、ｐＨ９以上の回収液を用いるが、微生物がアルカリに耐性を有するものであれば、細胞の破壊（破壊）等を生じることを防止しつつ回収することができる。このように、微生物をほぼ完全な形で回収できれば、回収液４中に微生物が存在するか否かをより確実に検出することができる。

また、被処理液３としては、特に限定されないが、浴槽水（温泉水）、クーリングタワーの冷却水、加湿用水、温度５０℃以下の貯湯タンク水、河川水、湖沼水、井戸水、プールの水等が挙げられるが、浴槽水（特に、循環式浴槽水）が好適である。近年、浴槽水中でのレジオネラ属菌の発生が問題となっている。かかる問題を解決するためには、レジオネラ属菌が増殖する前に検出することが重要となる。本発明を用いれば、仮に、浴槽水中に存在するレジオネラ属菌の数が少ない場合でも、効率よくレジオネラ属菌（微生物）を回収でき、確実に検出することができる。このため、浴槽水に対する早期の対処が可能となる。

次に、被処理液３を、担体１に接触させることにより、担体１に微生物を付着させる。
具体的には、まず、前述したような回収キット２を用意し、容器２１の排出口２３を栓２５で閉塞し、注入口２２を開放しておく。なお、容器２１（収納空間２０）内には、担体１が収納された状態とする。

次いで、この収納空間２０内に、注入口２２を介して被処理液３を注入（供給）する（図４中（ａ）参照）。

次いで、注入口２２を栓２４で閉塞し、容器２１を振盪（揺動）、攪拌、超音波の付与等することにより、被処理液３中に担体１を懸濁させる（図４中（ｂ）参照）。これにより、担体１に被処理液３を接触させ、担体１の表面に微生物を付着させる。

ここで、担体１は、少なくとも表面付近が微生物に対して親和性の高いリン酸カルシウム系化合物を主材料として構成されているので、微生物が効率よく付着する。

この被処理液３を担体１に接触させる時間は、５００ｍＬ当り１〜２４０分程度であるのが好ましく、１０〜１８０分程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、担体１に付着する微生物数が少なくなり、十分に微生物を回収できないおそれがあり、一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、微生物が崩壊してしまい、後述する工程において微生物の検出を行う場合には、その検出を正確に行うことが困難となるおそれがある。

また、この際（処理時）の被処理液３の温度は、７０℃以下であるのが好ましく、５０℃以下であるのがより好ましく、５〜５０℃程度であるのがさらに好ましい。処理時の被処理液３の温度が低く過ぎると、微生物の種類等によっては、担体１に微生物を効率よく付着させることができないおそれがあり、一方、処理時の被処理液３の温度を前記上限値を超えて高くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、微生物が崩壊して（破壊されて）しまい、後述する工程において微生物の検出を行う場合には、その検出を正確に行うことが困難となるおそれがある。

次いで、栓２５を取り外して、容器２１の排出口２３を開放する。これにより、容器２１内の被処理液３を排出口２３を介して排出する。

なお、担体１はフィルタ２６を通過することができないため、収納空間２０には、微生物が付着した担体１が残存することとなる（図４中（ｃ）参照）。
次いで、排出口２３を栓２５で閉塞する。

［２］回収液を担体に接触させる工程（第２の工程）
次に、微生物が付着した担体１に、ｐＨ９．０以上の回収液４を接触させ、担体１に付着した微生物を回収液４中に遊離させて回収する。
具体的には、まず、栓２４を取り外して、容器２１の注入口２２を開放する。

次いで、収納空間２０内に、注入口２２を介して回収液４を注入（供給）する（図４（ｄ）参照。）。

次いで、注入口２２を栓２４で閉塞し、容器２１を振盪（揺動）、攪拌、超音波の付与等することにより、回収液４中に担体１を懸濁させる（図４中（ｅ）参照）。これにより、担体１に回収液４を接触させ、担体１の表面から微生物を遊離させる（取り外す）。

ここで、担体１にｐＨ９以上の回収液４を接触させると、例えば、担体１の表面の荷電状態が変化すること等が一要因となり、担体１に付着していた微生物が担体１から効率よく遊離する。

用いる回収液４のｐＨは、９以上であればよく、特に、９．５以上であることが望ましい。また、その上限値は特に限定されないが、１４以下であるのが好ましく、１２以下であるのがより好ましい。

また、回収液４は、等張液（微生物の細胞内液の浸透圧とほぼ等しい浸透圧の液体）であるのが好ましい。これにより、浸透圧の違いによる微生物の崩壊を防止することもできる。

このような回収液４としては、例えば、トリエタノールアミン塩酸−水酸化ナトリウム緩衝液、ベロナ−ル（５，５−ジエチルバルビツル酸ナトリウム）−塩酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール−塩酸緩衝液、ジエタノールアミン−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ホウ酸ナトリウム−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液、ホウ酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、炭酸水素ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸二ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、ブリトン−ロビンソン緩衝液、ＧＴＡ緩衝液等の各種緩衝液（緩衝剤を含有する液体）が挙げられる。これにより、微生物をより確実に担体１から遊離させることができるとともに、微生物の崩壊をより確実に防止することができる。その結果、微生物の検出をより確実に行うことができる。

また、回収液４中に遊離する微生物を生存した状態で回収する場合には、回収液４中には、微生物の成育に必要な各種添加物を添加するようにしてもよい。これにより、微生物の生存数が低減するのを効果的に防止することができる。

このような添加物としては、例えば、グルコース、各種ビタミン類、グルタミン等のようなアミノ酸類、ＮａＣｌ、ＫＣｌのような電解質等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。

この回収液４を担体１に接触させる時間は、２．５ｍＬ当り０．１秒〜５分程度であるのが好ましく、１秒〜１分程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、回収液中に十分に微生物を回収できないおそれがあり、一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、微生物が崩壊して（破壊されて）しまい、後述する工程において微生物の検出を行う場合には、その検出を正確に行うことが困難となるおそれがある。

また、この際（処理時）の回収液４の温度は、７０℃以下であるのが好ましく、５０℃以下であるのがより好ましく、５〜５０℃程度であるのがさらに好ましい。処理時の回収液４の温度が低く過ぎると、微生物の種類等によっては、微生物を担体１から効率よく遊離させることができないおそれがあり、一方、処理時の回収液４の温度を前記上限値を超えて高くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、微生物が崩壊して（破壊されて）しまい、後述する工程において微生物の検出を行う場合には、その検出を正確に行うことが困難となるおそれがある。

次いで、栓２５を取り外して、容器２１の排出口２３を開放する。これにより、容器２１内の回収液４を、排出口２３を介して排出して回収する（図４中（ｆ）参照）。

ここで、本工程［２］において用いる回収液４の量を、前記工程［１］の被処理液３の量よりも少ない量とすることにより、回収液４の単位体積当りの微生物数を、被処理液３のそれよりも大きくすることができる。すなわち、微生物の濃縮を確実に行うことができる。このため、仮に被処理液３中の微生物数が少なく、その存在を確認（検出）できない場合でも、回収液４の容量を適宜設定することにより、回収液４中において、微生物の存在を確認できるようになる。

なお、このような回収液４による処理は、複数回に分けて行ってもよい。これにより、回収液４中に回収される微生物の収率をより高くすることができる。

＜第２実施形態＞
次に、本発明の微生物回収キットの第２実施形態について説明する。

図５は、本発明の微生物回収キットの第２実施形態を示す模式図（内部透視図）である。

以下、第２実施形態の回収キットについて、前記第１実施形態の回収キットとの相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。

図５に示す回収キット２は、ほぼ円筒状をなす容器２１内に、２枚のフィルタ２６ａ、２６ｂが設けられ、容器２１およびフィルタ２６ａ、２６ｂにより収納空間２０が画成されている。

この回収キット２では、容器２１の図５中上側の端部が注入口２２を構成し、下側の端部が排出口２３を構成する。

また、フィルタ２６ａ、２６ｂには、それぞれ、前記第１実施形態で説明したフィルタ２６と同様のものを用いることができる。

このような第２実施形態の回収キット２によっても、前記第１実施形態の回収キット２と同様の作用・効果が得られる。

＜第３実施形態＞
次に、本発明の微生物回収キットの第３実施形態について説明する。

図６は、本発明の微生物回収キットの第３実施形態を示す模式図（内部透視図）である。

以下、第３実施形態の回収キットについて、前記第１および第２実施形態の回収キットとの相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。

第３実施形態の回収キットは、容器２１の構成が異なる以外は、前記第２実施形態の回収キットと同様である。

すなわち、図６に示す回収キット２では、容器２１の図中上側の端部の内径および外径が縮径しており、当該部分が注入口２２を構成している。

そして、注入口２２のサイズ（内径）が、通常のシリンジ１００の先端部（口部）１１０を装着し得るように設定されている。

このような第３実施形態の回収キット２によっても、前記第１および第２実施形態の回収キット２と同様の作用・効果が得られる。

特に、注入口２２にシリンジ１００の先端部１１０を装着し得る。このため、シリンジ１００を回収キット２に装着（接続）し、シリンジ１００を押圧操作することにより、シリンジ１００内に収納された液体を容器２１内に強制的に注入することができる。これにより、液体の容器２１内の通過速度を、自重による場合に比べて、格段に速めることができ、被処理液３の処理効率をより上昇させることができる。

以上のように、本発明によれば、被処理液３に含まれる微生物を、簡易かつ収率よく回収液４中に回収することができる。

以上、本発明の微生物回収方法および微生物回収キットについて説明したが、本発明は、これらに限定されるものではなく、必要に応じて任意の工程が追加されてもよい。

また、微生物を回収する目的は、微生物を検出する目的に限定されるものではなく、例えば、単に微生物の純度を上昇させる（濃縮する）目的等のいかなるものであってもよい。

次に、本発明の具体的実施例について説明する。
１．回収キットの作製
平均粒径８０μｍのハイドロキシアパタイト多孔質粒子１ｇ（比表面積４０ｍ^２／ｇ、容積：約１．６ｍＬ）を、容量：２０ｍＬのエコノパックカラム（バイオラッド社製）に充填して、図５に示すような回収キットを作製した。なお、２枚のフィルタ開口径は、それぞれ、１０μｍである。

２．レジオネラ属菌の回収
微生物として、レジオネラ属菌（微生物）を含有する浴槽水（被処理液）を用意した。

（実施例１）
まず、滅菌ダルベッコＰＢＳ（０．８ｗｔ％ＮａＣｌ水溶液）を、回収キットの容器内を通過させ、容器内を滅菌ダルベッコＰＢＳで満たした。

次に、２５±１℃の浴槽水（原液）：５００ｍＬを、注入口から容器内に供給し、排出口から流出する浴槽水（廃液）を回収した。このとき、浴槽水の通過時間は、約１８０分であった。

次に、２５±１℃、ｐＨ９．５の滅菌緩衝液（回収液）：２．５ｍＬを、注入口から容器内に注入し、排出口から流出する滅菌緩衝液を回収した。このとき、滅菌緩衝液の通過時間は、約５０秒であった。

なお、滅菌緩衝液には、０．０５ＭＮａ_２ＣＯ_３−ＮａＨＣＯ_３＋３ｗｔ％ＮａＣｌを用いた。

（実施例２）
回収液として、ｐＨ１０の滅菌緩衝液を用いた以外は、前記実施例１と同様にして、レジオネラ属菌を回収した。

なお、滅菌緩衝液には、０．０５ＭＮａ_２ＣＯ_３−ＮａＨＣＯ_３＋３ｗｔ％ＮａＣｌを用いた。

（実施例３）
回収液として、ｐＨ１０．５の滅菌緩衝液を用いた以外は、前記実施例１と同様にして、レジオネラ属菌を回収した。

なお、滅菌緩衝液には、０．０５ＭＮａ_２ＰＯ_３−ＮａＨＰＯ_３＋３ｗｔ％ＮａＣｌを用いた。

（比較例）
回収液として、ｐＨ８．９の滅菌緩衝液を用いた以外は、前記実施例１と同様にして、レジオネラ属菌を回収した。
なお、滅菌緩衝液には、０．０５ＭＴｒｉ−ＨＣｌ＋３ｗｔ％ＮａＣｌを用いた。

３．評価
原液、廃液および回収された滅菌緩衝液の一部を、それぞれ採取し、各サンプルに対して、それぞれレジオネラ属菌の菌数測定を培養法により行った。
この結果を、図７に示す。

図７に示すように、各実施例で回収された滅菌緩衝液中には、いずれも、レジオネラ属菌が検出された。これに対して、比較例で回収された滅菌緩衝液中には、レジオネラ属菌がほとんど検出されなかった。

また、各実施例では、それぞれ、原液単位体積当りのレジオネラ属菌の菌数に対して、回収された滅菌緩衝液単位体積当りのレジオネラ属菌の菌数は、明らかに多かった。

このことから、ｐＨ９以上の回収液を用いること（本発明）により、微生物が担体から効率よく遊離し、回収液中に回収できることが明らかとなった。

また、ナイロン粒子（基材）とハイドロキシアパタイト粒子とを用意し、これらをＮＡＲＡハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−１（（株）奈良機械製作所製、定格動力５．５ｋＷ、定格電流２３Ａ）に投入し、この装置を６４００回転／分、４５℃で５分間稼動させた。これにより、図１に示すような担体を得た。なお、得られた担体は、その表面付近が多孔質なものであった。

そして、この担体を用いて、前記実施例１〜３および比較例と同様にして、浴槽水からレジオネラ属菌の回収を行ったところ、前記と同様の結果が得られた。

本発明で用いられる担体の一例を示す断面図である。 本発明の微生物回収キットの第１実施形態を示す模式図（内部透視図）である。 図２に示す回収キットが折り畳まれた状態を示す模式図である。 本発明の微生物回収方法を説明するための模式図である。 本発明の微生物回収キットの第２実施形態を示す模式図（内部透視図）である。 本発明の微生物回収キットの第３実施形態を示す模式図（内部透視図）である。 各液体中のレジオネラ属菌の菌数を示すグラフである。

符号の説明

１ 担体
１１ 基材
１２ リン酸カルシウム系化合物層
１３ 粒子
２ 微生物回収キット
２０ 収納空間
２１ 容器
２１１ 側壁部
２１２ 上壁部
２１３ 底壁部
２２ 注入口
２３ 排出口
２４、２５ 栓
２６ フィルタ
３ 被処理液
４ 回収液
１００ シリンジ
１１０ 先端部

Claims (17)

1. レジオネラ属菌を含有する被処理液中から、前記レジオネラ属菌を回収する微生物回収方法であって、
   少なくとも表面付近が、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された担体に、前記被処理液を接触させることにより、前記担体に前記レジオネラ属菌を付着させる第１の工程と、
   前記レジオネラ属菌が付着した前記担体に、ｐＨが９．５以上、１２以下の等張液である回収液を接触させることにより、前記回収液中に前記レジオネラ属菌を遊離させて回収する第２の工程とを有することを特徴とする微生物回収方法。
2. 前記被処理液を前記担体に接触させる時間は、５００ｍＬ当り１〜２４０分である請求項１に記載の微生物回収方法。
3. 前記被処理液を前記担体に接触させる際の前記被処理液の温度は、７０℃以下である請求項１または２に記載の微生物回収方法。
4. 前記回収液の量は、前記被処理液の量より少ない請求項１ないし３のいずれかに記載の微生物回収方法。
5. 前記回収液は、緩衝液である請求項１ないし４のいずれかに記載の微生物回収方法。
6. 前記回収液を前記担体に接触させる時間は、２．５ｍＬ当り０．１秒〜５分である請求項１ないし５のいずれかに記載の微生物回収方法。
7. 前記回収液を前記担体に接触させる際の前記回収液の温度は、７０℃以下である請求項１ないし６のいずれかに記載の微生物回収方法。
8. 前記担体は、粒状のものである請求項１ないし７のいずれかに記載の微生物回収方法。
9. 粒状の前記担体の平均粒径は、２０〜５０００μｍである請求項８に記載の微生物回収方法。
10. 前記担体は、その少なくとも表面付近が多孔質なものである請求項１ないし９のいずれかに記載の微生物回収方法。
11. 前記担体は、主として樹脂材料で構成された基材と、該基材の表面を覆うように設けられ、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された被覆層とを有するものである請求項１ないし１０のいずれかに記載の微生物回収方法。
12. 前記樹脂材料は、ポリアミドおよびエポキシ樹脂の少なくとも一方を主成分とするものである請求項１１に記載の微生物回収方法。
13. 前記リン酸カルシウム系化合物は、ハイドロキシアパタイトを主成分とするものである請求項１ないし１２のいずれかに記載の微生物回収方法。
14. 前記担体は、その比表面積が５〜１００ｍ^２／ｇである請求項１ないし１３のいずれかに記載の微生物回収方法。
15. 前記被処理液は、浴槽水である請求項１ないし１４のいずれかに記載の微生物回収方法。
16. 請求項１ないし１５のいずれかに記載の微生物回収方法に使用するための微生物回収キットであって、
    前記担体と、
    前記担体を収納する収納空間と、該収納空間に連通する注入口および排出口とを備える容器と、
    前記収納空間内に、前記排出口を塞ぐように設けられたフィルタとを有することを特徴とする微生物回収キット。
17. 前記容器は、その少なくとも一部が折り畳み可能となっている請求項１６に記載の微生物回収キット。

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