JP4532811B2

JP4532811B2 - Female hormone-like agent

Info

Publication number: JP4532811B2
Application number: JP2002077933A
Authority: JP
Inventors: 一真吉積; 智弘大野
Original assignee: Fancl Corp
Current assignee: Fancl Corp
Priority date: 2002-03-20
Filing date: 2002-03-20
Publication date: 2010-08-25
Anticipated expiration: 2022-03-20
Also published as: JP2003277274A

Description

【０００１】
本発明は、エストラジオールのエストロゲン受容体結合阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エストロゲンは女性ホルモンの一種であり、発情作用を示すホルモン及び類似の作用を持つ物質の総称である。天然に存在するステロイド系のエストロゲンとしては、エストラジオールが主要なものであるが、その他のステロイド系のエストロゲンとしては、例えばエストロン、エストリオール、エリキン、ホモエストロン、エチニルエストラジオール等が知られている。また、非ステロイド系のエストロゲンとしては、例えばジエチルスチルベストロール、ヘキセストロール等が知られている。
【０００３】
これらのエストロゲン作用物質のうち、ステロイド系エストロゲンは、例えばエストロゲンの減少に起因する無月経、無排卵周期症、機能性子宮出血、子宮発育不全等を適応症とする医薬として用いられており、更年期障害の治療や乳汁分泌抑制などにも用いられている。また、非ステロイド系エストロゲンは、主として、前立腺癌、前立腺肥大症等の疾患の治療薬として用いられている。
【０００４】
一方、植物にもエストロゲン作用物質が含まれていることが知られており、これらは植物エストロゲンと総称されている。このような植物エストロゲンとしては、例えばゲニステイン、ダイゼイン、ミロエストロール等のイソフラボン類が比較的強いエストロゲン様活性を示すことが報告されている（梅原千治、佐藤武雄著、ステロイドホルモン、製剤生理臨床、卵胞ホルモン、南江堂発行、昭和４１年）。更に最近、これらの植物エストロゲンを含む植物を日常的に摂取することが、骨粗鬆症や婦人科疾患、乳癌、子宮癌、前立腺癌、前立腺肥大症等の疾患の発現の減少、さらには血中コレステロール量の減少に寄与する可能性が指摘されている。
【０００５】
更に最近になって、ある種の微生物の代謝産物の中から、５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）−３−メチルクロマン−４−オンが単離され、エストロゲン様活性を有することが報告されている（特開平２−２１８６７８号公報及び特開平２−３００１８１号公報）。
【０００６】
現在使用されているエストロゲン作用剤は、いずれも、胃腸障害、血栓症、子宮出血、肝障害等の副作用を有するという問題があり、長期間投与すると子宮癌や乳癌等が発現する場合があることが知られている。したがって、これらの副作用が軽減されたエストロゲン作用剤が望まれている。
【０００７】
一方、更年期障害は、女性における生殖期の終結に起こる内分泌、体性および生理学上の変化の症候群と定義される。月経不順は、排卵の喪失によって引起こされる長期月経出血の症状の出現である。排卵の喪失は、卵胞の発生の障害によって引起こされる。最近、更年期障害の治療のための最も一般的な方法は、受胎調節ピルの投与、エストロゲンおよびプロゲステロン製剤の経口投与またはプロゲステロンのみの製剤の経口投与を含めたホルモン置換法である(Ｓｈａａｂａｎ、1996年)。更年期障害の症状を緩和させる一方で、これらの治療法は、多くの関連した危険および副作用を示す。ホルモン治療に関連した危険としては、子宮内膜癌、高血圧、高脂血症、胆石症(胆石)、乳癌、および深部静脈血栓症が挙げられる(Ｂａｒｅｎｔｓｅｎ、1996年)。
【０００８】
一方、尋常性ざ瘡（ニキビ）は思春期になって初めて発症してくるため、性ホルモンの分泌増加に伴う内分泌機能の変調が本症の発症と密接に関係していることは明らかである。すなわち、男女共にアンドロゲンの分泌量がエストロゲンの分泌量と比較して、相対的に増加していることが基本となっている（フレグランスジャーナル 74号４−７頁 1985年）。また、ニキビは思春期に好発するとされているが、最近、思春期後に発症する女性ニキビ患者が増加している。こうした女性の多数で、テストステロンやジヒドロテストステロンなどのアンドロゲンの血中濃度が上昇していることが報告されている（日本香粧品科学会誌 21巻 4号 337−340頁 1997）。このように、思春期以後に発症する女性のニキビはホルモンバランスの乱れが関与している。
【０００９】
こうしたニキビ治療としては、抗生物質、ビタミン剤、ホルモン剤などの内服薬や、サリチル酸やイオウなどを含んだ角層溶解作用、殺菌作用、抗炎症作用を持つ外用薬の処方がなされている。しかし、月経前症候群と同様、医師の管理下で行われているものであり、医師のもとに通わなければならない煩わしさが伴う。また、一般医薬品でニキビを適用とした内服薬としてはビタミンＢ_２・Ｂ_６製剤や、殺菌、抗炎症作用を持つ外用薬が市販されているが、いずれもホルモンバランスに注目したものではない。
【００１０】
また、一方、近年では骨粗鬆症の問題が大きくなっている。骨粗鬆症は、骨量が減少することによって起こる骨が脆くなる病態である。
【００１１】
正常の骨においては、骨吸収（骨盤の溶解）と骨形成が交互にバランスよく行われて、代謝回転しつつも一定の骨量に保たれている。ところが、このバランスが崩れて、吸収が促進すると骨重量が減少し、骨が細くなって骨折しやすくなり、また疼痛を伴う場合もある。このような状態を骨粗鬆症と呼んでおり、特に閉経後の女性に多いことが特徴である。統計によっても異なるが、この年代の女性においては約１/4に認められるとも報告されている。さらに、老人の寝たきりの原因ともなるため、高齢化社会における生活の質（Quality of Life）の向上という観点からも、有効性の高い治療薬が求められている。さらに治療は長期に亘るため、高い安全性も必要である。
【００１２】
骨粗鬆症の発生メカニズムはまだ完全に明らかにはなっていないが、治療にあたっては、骨吸収を抑制するか、または骨形成を促進することが必要と考えられている。このような考えに基づき、骨粗鬆症の治療には、エストロゲンが臨床に導入されてきた。
【００１３】
エストロゲンは、骨吸収抑制作用と骨形成促進作用を併せ持ち、骨粗鬆症の進行を抑制する。しかし長期投与にあたっては、腹部膨満感・悪心などの消化器症状に加え、乳癌・子宮内膜癌の発生を始め、子宮内膜出血・帯下の増加・乳房痛など、女性ホルモンに特有の重篤な副作用が発現する恐れがあり、さらに糖代謝・脂質代謝異常、静脈血栓などの副作用も認められている。したがって、長期投与した際の安全性に問題がある。このように、骨粗鬆症の予防、あるいは治療効果が優れた安全な食品や医薬の開発が望まれているにも係らず、現状では有効性と安全性をともに解決した製品が開発されていない。
【００１４】
本発明の課題は、エストラジオールのエストロゲン受容体結合阻害剤を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上述した問題点を解決するために鋭意研究を行った結果、日本で抗癌作用や免疫賦活作用などの目的で健康補助食品に利用されているプロポリス、及び一般的に青汁と称されて飲用されているアブラナ科のケールに、エストロゲン様作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【００１６】
すなわち、本発明は、
プロポリスのエタノール抽出物を有効成分とするエストラジオールのエストロゲン受容体結合阻害剤、
に関する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明で使用するプロポリスは、蜂が集めた樹脂状の黒い塊であり、ブラジル産プロポリス、中国産プロポリス、オーストラリア産プロポリス、ウルグアイ産プロポリス、日本産プロポリスなど何れの産地のものでもよく、特に限定されるものではないが、汎用性の面から見て、ブラジル産プロポリス、中国産プロポリスが好ましい。
【００１８】
プロポリスは、プロポリス自身を乾燥させた乾燥物、その粉砕物、超臨界抽出物、水あるいはアルコール、エーテル、アセトンなどの有機溶媒による粗抽出物、および粗抽出物を分配、カラムクロマトなどの各種クロマトグラフィーなどで段階的に精製して得られた抽出物画分など全てを含む。これらは単独で用いても良く、また２種以上混合して用いても良い。
【００１９】
例えば、ブラジル産プロポリスの原塊乾燥物１Kgに99.5％エタノール抽出液３Ｌを加え、室温で一晩浸漬することにより得た抽出液を、そのまま使用しても良いし、各種クロマトグラフィーを組み合わせて、精製したものを使用しても良い。
【００２０】
抽出されたプロポリス抽出物の溶液中のプロポリス抽出物濃度は特に制限はないが、１５〜７０重量％、好ましくは２０〜６０重量％程度が好ましい。この濃度が１５重量％以下では、乾燥時に多量のエタノールや水などの溶液を蒸発させる必要があり、７０重量％以上になると溶液の粘度が高くなり過ぎ、加工適性が悪くなる恐れがある。
【００２１】
本発明で使用されるケール（Brassicca Oleracea L.var.acephala DC.）には、キッチンケール、マローケール、ブッシュケール、ツリーケール、コラード、緑藻カンランなどがある。アブラナ科の植物でもともと南ヨーロッパ原産の野菜であり、キャベツの原種といわれている。葉など通常食用として供されているもので構わないし、栽培方法や栽培地も特に限定されるものでもない。
【００２２】
ケール、その抽出物としては、ケール自身を乾燥させた乾燥物、その粉砕物、圧搾汁、水あるいはアルコール、エーテル、アセトンなどの有機溶媒による粗抽出物、および粗抽出物を分配、カラムクロマトなどの各種クロマトグラフィーなどで段階的に精製して得られた抽出物画分など、全てを含む。これらは単独で用いても良く、また２種以上混合して用いても良い。
【００２３】
例えば、ケールの葉、茎、花や根などの乾燥物１Kgに99.5％エタノール抽出液３Ｌを加え、室温で一晩浸漬することにより得た抽出液をそのまま使用しても良いし、その抽出液を各種クロマトグラフィーを組み合わせて、精製したものを使用しても良い。
【００２４】
これらの本発明によるプロポリス及びケールの乾燥物または抽出物に、エストロゲン様作用を有することは、従来から全く知られておらず、本発明により得られた新知見である。
【００２５】
本発明によるプロポリス及びケールは、卓越したエストロゲン様作用を有しており、抗骨粗鬆症剤、更年期障害の改善・治療剤、前立腺癌・前立腺肥大症・乳癌及び子宮癌の予防・治療剤あるいは女性の思春期後発症のざ瘡改善・治療剤を目的とした食品、医薬又は化粧料として使用可能である。
【００２６】
本発明のプロポリス及びケールを、エストロゲン様作用剤、抗骨粗鬆症剤、更年期障害の改善・治療剤、前立腺癌・前立腺肥大症・乳癌及び子宮癌の予防・治療剤あるいは女性の思春期後発症のざ瘡改善・治療剤含有食品又は医薬として製造することができる。
【００２７】
エストロゲン様作用剤、抗骨粗鬆症剤、更年期障害の改善・治療剤、前立腺癌・前立腺肥大症・乳癌及び子宮癌の予防・治療剤あるいは女性の思春期後発症のざ瘡改善・治療剤のような医薬の適用方法としては、経口投与又は非経口投与のいずれも採用することができる。投与に際しては、有効成分を経口投与、直腸内投与、注射などの投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などが挙げられ、これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水などが挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００２８】
食品としては、そのまま、又は種々の栄養成分を加えて、若しくは飲食品中に含有せしめて、抗骨粗鬆症剤、更年期障害の改善・治療剤、前立腺癌・前立腺肥大症・乳癌及び子宮癌の予防・治療剤あるいは女性の思春期後発症のざ瘡改善・治療剤に有用な保健用食品又は食品素材として食される。例えば、上述した適当な助剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペーストなどに成形して食用に供してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージなどの食肉加工食品、かまぼこ、ちくわなどの水産加工食品、パン、菓子、バター、粉乳、発酵乳製品に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、茶、清涼飲料などの飲料に添加して使用してもよい。
【００２９】
本発明のプロポリス及びケールの有効投与量は、患者の年齢、体重、症状、患者の程度、投与経路、投与スケジュール、製剤形態、素材の阻害活性の強さなどにより、適宜選択・決定されるが、例えば、プロポリスの経口投与の場合、一般に１日当たり10〜500ｍg/kg体重程度、好ましくは、１日当たり150〜350mg/kg体重程度とされ、１日に数回に分けて投与してもよい。ケールでは、乾燥重量として、通常成人換算で0.1g/体重kg以上であり、１日に数回に分けて投与してもよい。
【００３０】
また、本発明のプロポリスあるいはケールを含有せしめて、エストロゲン様作用剤含有化粧料または化粧料素材として使用する場合、例えば、中国産プロポリスの乾燥物あるいは抽出物を小麦胚芽油あるいはオリーブ油に添加してエストロゲン様作用剤含有組成物とし、これを化粧料素材として使用することができる。本発明のケールの乾燥物または抽出物の添加量は、特に限定されるものではないが、一例としてあげると、小麦胚芽油あるいはオリーブ油の重量に対して0.1重量％以上60重量％以下、好ましくは0.5重量％以上50重量％以下が適当である。プロポリスでは、小麦胚芽油あるいはオリーブ油の重量に対して0.01重量％以上60重量％以下、好ましくは0.1重量％以上50重量％以下が適当である。
【００３１】
また、上記のエストロゲン様作用剤含有組成物を直接、化粧料成分として使用し、エストロゲン様作用を有する化粧料を製造することができる。化粧料には、植物油のような油脂類、高級脂肪酸、高級アルコール、シリコーン、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤、防腐剤、糖類、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子のような高分子、増粘剤、粉体成分、紫外線吸収剤、紫外線遮断剤、ヒアルロン酸のような保湿剤、香料、ｐＨ調整剤、乾燥剤等を含有させることができる。ビタミン類、皮膚賦活剤、血行促進剤、常在菌コントロール剤、活性酸素消去剤、抗炎症剤、抗癌剤、美白剤、殺菌剤等の他の薬効成分、生理活性成分を含有させることもできる。
【００３２】
化粧料としては、化粧水、乳液、クリーム、パック等の皮膚化粧料、メイクアップベースローション、メイクアップクリーム、乳液状又はクリーム状あるいは軟膏型のファンデーション、口紅、アイカラー、チークカラーといったメイクアップ化粧料、ハンドクリーム、レッグクリーム、ボディローション等の身体用化粧料等、入浴剤、口腔化粧料、毛髪化粧料とすることができる。本発明の方法で得られるエストロゲン様作用剤含有組成物を含有せしめた化粧料としては、機能面からは、例えば乳液、化粧液、フェイスクリーム、ハンドクリーム、ローション、エッセンス、シャンプー、リンスなどが好ましい。
【００３３】
このような化粧料は、常法に従って製造することができる。化粧料における本発明のプロポリスの乾燥物または抽出物の添加量は、特に限定されるものではないが、一例としてあげると、化粧料全重量の0.01重量％以上20重量％以下程度が適当である。
【００３４】
本発明のプロポリス及びケールは、天然物であるためその毒性は低く、例えばケールのエタノール抽出物を毎日1000mg/kg、100日間という長期間に亘ってラットに経口投与しても死亡例は認められず、体重変化も観察されなかった。
【００３５】
［実施例］以下に実施例を挙げて具体的に説明するが、これに限定されるものではない。
製造例１（プロポリス抽出物の製造）
ブラジル産及び中国産プロポリス原塊それぞれ10gに99.5％エタノール３Ｌを加え、50℃で一晩浸漬した後、ロータリーエバポレーターにてエタノールを除去することにより、プロポリス抽出物をそれぞれ324mg、216mgを得た。
【００３６】
製造例２（ケール抽出物の製造）
ケールの葉を90℃で乾燥させ、苦みの渋味成分となる酵素を失活させた。その粉砕物４kgを電熱式水浴機で加熱還流しながら、99.5％エタノール（和光純薬工業）20Ｌを用いて抽出を行い、ケール抽出物80ｇを得た。
【００３７】
試験方法
ラット子宮エストロゲン受容体への結合試験評価は、B. KOFFMANらの方法（J. Steroid Biochem. Molec. Biol.，38（2）135−139，1991）を一部改変して行った。
【００３８】
［cytosol（サイトゾル）画分の調製］
特に記述しない限り、以下に示す全ての操作は、４℃の温度で行った。
【００３９】
まず、粉砕した凍結子宮組織に４倍量のリン酸緩衝液（pH8.0）を加え、ポリトロンPT-10プローブ（Brinkman Instrument Co. Inc.製）を用いて、フル調節条件で、５秒間破砕し、次の破砕まで60秒間氷中で冷却し、その後、５秒間破砕する操作を二回繰り返し行うことによりホモジナイズした。このホモジネートを105000×gで30分間遠心分離し、得られた上清をデカンテーションし、これをサイトゾル画分として使用した。サイトゾル画分のタンパク質含量は、タンパク質標準試料として牛血清アルブミンを用いて、Lowry et. al.の方法（J. Biol. Chem. 193 265−275 1951）により測定した。
【００４０】
［ラット子宮エストロゲン受容体への結合試験評価］
タンパク質濃度が1.2〜7.2mg/mlになるように調製したサイトゾル画分をリン酸緩衝液（pH 8.0）に溶解し、１nMの［³H］で標識した17-β-エストラジオールと製造例１及び２で得られた各プロポリス抽出物又はケール抽出物500μg/mlとなるように加え、40℃で20時間反応させた。また、非特異的結合試験（ブランク）は、3000倍過剰量のジスチルベステロールの存在化で行った。
【００４１】
次に、遊離したステロイドや試料サンプルを、デキストラン処理した活性炭懸濁液（0.5％ノーリットＡ、0.005％デキストランを含むリン酸緩衝液（pH 7.4）；以下、DCCと略す）を用いて、４℃で10分間インキュベーションすることにより除去した。その後、5000×gで10分間遠心分離することによりＤＣＣを沈殿させ、得られたタンパク質結合ステロイドを含む上清100μlに、シンチレーションカクテル溶液（Packard Instrument Co.製、Downer Grove、III）４mlを加え、シンチレーションカウンター（Packard Model 2425、30−40％ efficiency）により測定した。抑制率は、下記式により算出した。
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ_１−Ｂ）／（Ｃ₀ −Ｂ）〕×１００
（式中、Ｃ₁ は既知量の供試化合物と［³H］標識17−β−エストラジオールが共存している状態での［³H］標識17−β−エストラジオールのラット子宮エストロゲン受容体に対する結合量を表わし、Ｃ₀ は供試化合物を除いた時の［³H］標識17−β−エストラジオールのラット子宮エストロゲン受容体に対する結合量を表わし、Ｂは過剰のジスチルベステロール（3×10^-6Ｍ）存在下での［³H］標識17−β−エストラジオールのラット子宮エストロゲン受容体に対する結合量を表わす。）
結果を表１に示した。
【００４２】
【表１】

【００４３】
なお、本測定系におけるポジティブコントロールとしての17-β-エストラジオールのIC₅₀値は、0.84nM（2.29×10^-4ng/ml）であった。
表１からもわかるように、本発明のプロポリス抽出物及びケール抽出物は、17-β-エストラジオールのエストロゲン受容体結合阻害作用を拮抗的に抑制し、強いエストロゲン様作用を有することがわかる。
【００４４】
例１［錠剤の製造］
製造例１で得られたブラジル産プロポリスのエタノール抽出物を用いて、常法に従って下記の組成の錠剤を製造した。
（組成）（配合：重量％）
ブラジル産プロポリス抽出物２４
乳糖６３
コーンスターチ１２
グァーガム１
【００４５】
例２［ジュースの製造］
製造例２で得られたケールのエタノール抽出物を用いて、常法に従って下記の組成のジュースを製造した。
（組成）（配合：重量％）
冷凍濃縮温州みかん果汁５．０
果糖ブドウ糖液糖１１．０
クエン酸０．２
Ｌ−アスコルビン酸０．０２
香料０．２
色素０．１
ケール抽出物０．２
水８３．２８
【００４６】
例３［フェイスクリームの製造］
製造例１で得られた中国産プロポリスのエタノール抽出物を用いて、常法に従って下記の組成のフェイスクリームを製造した。
（組成）（配合：重量％）
イソステアリン酸イソプロピル８．０
ホホバ油６．０
セタノール８．０
ステアリルアルコール２．０
ポリオキシエチレンラウリルエーテル１．５
プロピレングリコール６．０
ソルビトール１．０
パラベン０．４
中国産プロポリス抽出物０．５
ビタミンＥ０．５
香料０．１
精製水６６．０
【００４７】
本発明により、新規エストラジオールのエストロゲン受容体結合阻害剤が提供される。[0001]
The present invention relates to an estrogen receptor binding inhibitor of estradiol.
[0002]
[Prior art]
Estrogens are a type of female hormone, and are a general term for hormones that exhibit estrus and similar substances. As the naturally occurring steroidal estrogens, estradiol is the main one, but as other steroidal estrogens, for example, estrone, estriol, erikin, homoestrone, ethinylestradiol and the like are known. As non-steroidal estrogens, for example, diethylstilbestrol, hexestrol and the like are known.
[0003]
Among these estrogen agonists, steroidal estrogen is used as a drug for indications such as amenorrhea, anovulatory cycle, functional uterine bleeding, uterine growth disorder caused by decreased estrogen. It is also used to treat disorders and suppress milk secretion. Nonsteroidal estrogens are mainly used as therapeutic agents for diseases such as prostate cancer and benign prostatic hyperplasia.
[0004]
On the other hand, it is known that plants also contain estrogen-active substances, and these are collectively called phytoestrogens. As such phytoestrogens, isoflavones such as genistein, daidzein, and miroestrol have been reported to exhibit relatively strong estrogen-like activity (authored by Chiharu Umehara and Takeo Sato, steroid hormones, clinical pharmacology) , Follicular hormone, published by Nankodo, 1966). More recently, the daily intake of plants containing these phytoestrogens has led to a decrease in the occurrence of diseases such as osteoporosis, gynecological diseases, breast cancer, uterine cancer, prostate cancer, benign prostatic hyperplasia, and blood cholesterol levels. It has been pointed out that it may contribute to a decrease in
[0005]
More recently, 5,7-dihydroxy-2- (4-hydroxyphenyl) -3-methylchroman-4-one has been isolated from certain microbial metabolites and has estrogenic activity. It has been reported (Japanese Patent Laid-Open Nos. 2-218678 and 2-300181).
[0006]
All currently used estrogen agonists have side effects such as gastrointestinal disorders, thrombosis, uterine bleeding, liver disorders, and uterine cancer, breast cancer, etc. may develop if administered for a long time It has been known. Therefore, an estrogen agonist with reduced side effects is desired.
[0007]
Menopause, on the other hand, is defined as a syndrome of endocrine, somatic and physiological changes that occur at the end of the reproductive period in women. Menstrual irregularity is the appearance of symptoms of long-term menstrual bleeding caused by the loss of ovulation. Ovulation loss is caused by impaired follicular development. Recently, the most common methods for the treatment of climacteric disorders are hormone replacement methods including the administration of fertility pills, oral administration of estrogen and progesterone formulations or oral administration of progesterone-only formulations (Shaaban, 1996). ). While alleviating the symptoms of menopause, these therapies present many associated risks and side effects. Risks associated with hormonal treatment include endometrial cancer, hypertension, hyperlipidemia, cholelithiasis (gallstones), breast cancer, and deep vein thrombosis (Barentsen, 1996).
[0008]
On the other hand, acne vulgaris occurs only in adolescence, and it is clear that the modulation of endocrine function associated with increased secretion of sex hormones is closely related to the onset of this disease. . That is, it is fundamental that the secretion amount of androgen is relatively increased in both men and women compared with the secretion amount of estrogen (Fragrance Journal No. 74, pages 4-7, 1985). Acne is said to occur more frequently during puberty, but recently there are an increasing number of female acne patients who develop after puberty. In many of these women, it has been reported that blood levels of androgens such as testosterone and dihydrotestosterone are elevated (Vol.21, No.4, 337-340 1997). Thus, acne in women who develop after puberty is associated with disturbances in hormone balance.
[0009]
For the treatment of acne, oral medicines such as antibiotics, vitamins and hormones, and external medicines containing stratum corneum dissolving action, bactericidal action and anti-inflammatory action containing salicylic acid and sulfur have been prescribed. However, as with premenstrual syndrome, it is performed under the control of a doctor and involves the troublesomeness of having to go to the doctor. In addition, vitamin B ₂ and B ₆ preparations and topical medicines with bactericidal and anti-inflammatory effects are commercially available as internal medicines for which acne is applied as a general pharmaceutical, but none of them focuses on hormone balance.
[0010]
On the other hand, in recent years, the problem of osteoporosis is increasing. Osteoporosis is a pathological condition in which the bone becomes brittle when the bone mass decreases.
[0011]
In normal bone, bone resorption (dissolution of the pelvis) and bone formation are alternately performed in a well-balanced manner, and a constant bone mass is maintained while turning over. However, when this balance is lost and the absorption is promoted, the bone weight is reduced, the bone becomes thin and easily fractured, and sometimes painful. Such a condition is called osteoporosis, and is particularly characterized by postmenopausal women. It is reported that it is recognized about 1/4 in women of this age, though it depends on statistics. Furthermore, since it also causes bedridden elderly people, there is a need for highly effective therapeutic agents from the viewpoint of improving the quality of life in an aging society. Furthermore, since treatment is long-term, high safety is also necessary.
[0012]
Although the mechanism of osteoporosis has not been fully clarified yet, it is considered necessary to suppress bone resorption or promote bone formation in the treatment. Based on this idea, estrogen has been clinically introduced for the treatment of osteoporosis.
[0013]
Estrogens have both bone resorption inhibitory action and bone formation promoting action, and suppress the progression of osteoporosis. However, in the long-term administration, in addition to gastrointestinal symptoms such as abdominal bloating and nausea, the occurrence of breast cancer and endometrial cancer, endometrial hemorrhage, increased subbing, breast pain, etc. Serious side effects may occur, and side effects such as abnormal sugar metabolism / lipid metabolism and venous thrombosis are also observed. Therefore, there is a problem in safety when administered for a long time. Thus, despite the desire for the development of safe foods and medicines that are excellent in preventing or treating osteoporosis, products that solve both efficacy and safety have not been developed at present.
[0014]
An object of the present invention is to provide an estrogen receptor binding inhibitor of estradiol.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventor has found that propolis is used in health supplements for the purpose of anticancer action and immunostimulatory action in Japan, and generally green juice. It was found that the cruciferous kale, which is referred to as “R”, has an estrogenic effect, and the present invention has been completed.
[0016]
That is, the present invention
An estrogen receptor binding inhibitor of estradiol, comprising an ethanol extract of propolis as an active ingredient,
About.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The propolis used in the present invention is a resinous black lump collected by bees, and may be from any origin, such as Brazilian propolis, Chinese propolis, Australian propolis, Uruguay propolis, Japanese propolis, etc. However, Brazilian propolis and Chinese propolis are preferable from the viewpoint of versatility.
[0018]
Propolis is a dried product obtained by drying propolis itself, its pulverized product, supercritical extract, crude extract using water or organic solvents such as alcohol, ether, acetone, etc., and various chromatographs such as column chromatography. Includes all extract fractions obtained by stepwise purification by graphy. These may be used alone or in combination of two or more.
[0019]
For example, an extract obtained by adding 3 L of 99.5% ethanol extract to 1 kg of propolis ingot from Brazil and soaking overnight at room temperature may be used as it is, or by combining various chromatographies. A purified product may be used.
[0020]
The concentration of the propolis extract in the solution of the extracted propolis extract is not particularly limited, but is preferably 15 to 70% by weight, and preferably about 20 to 60% by weight. If this concentration is 15% by weight or less, it is necessary to evaporate a large amount of a solution such as ethanol or water at the time of drying. If it is 70% by weight or more, the viscosity of the solution becomes too high and the processability may be deteriorated.
[0021]
Examples of the kale (Brassicca Oleracea L. var. Acephala DC.) Used in the present invention include kitchen kale, mallow kale, bush kale, tree kale, collard, and green algal kanran. The cruciferous plant is originally a vegetable from southern Europe and is said to be the original species of cabbage. It may be one that is usually used for food, such as leaves, and the cultivation method and cultivation place are not particularly limited.
[0022]
Kale and its extracts include dried products obtained by drying kale itself, pulverized products, pressed juice, crude extracts with water or organic solvents such as alcohol, ether and acetone, and crude extracts, column chromatography, etc. All the extract fractions obtained by stepwise purification by various chromatographic methods are included. These may be used alone or in combination of two or more.
[0023]
For example, an extract obtained by adding 3 L of 99.5% ethanol extract to 1 kg dry matter such as kale leaves, stems, flowers and roots and soaking overnight at room temperature may be used as it is. These may be purified by combining various chromatographies.
[0024]
The dryness or extract of propolis and kale according to the present invention has an estrogen-like action that has never been known so far, and is a new finding obtained by the present invention.
[0025]
The propolis and kale according to the present invention have an excellent estrogenic action, and are anti-osteoporosis agents, menopausal improvement / treatment agents, prostate cancer / prostatic hypertrophy / breast cancer and uterine cancer prevention / treatment agents or It can be used as a food, medicine or cosmetic for the purpose of improving or treating post-pubertal acne.
[0026]
The propolis and kale of the present invention may be used as an estrogenic agent, an anti-osteoporosis agent, an agent for improving / treating climacteric disorder, a prophylactic / therapeutic agent for prostate cancer / prostatic hypertrophy / breast cancer, and uterine cancer It can be produced as a food or medicine containing a pressure ulcer improving / treating agent.
[0027]
Estrogen-like agents, anti-osteoporosis agents, menopausal disorder improvement / treatment agents, prostate cancer / prostatic hypertrophy / breast cancer and uterine cancer prevention / treatment agents, or post-pubertal acne improvement / treatment agents for women As an application method of the medicine, either oral administration or parenteral administration can be employed. In administration, the active ingredient can be mixed with a solid or liquid nontoxic pharmaceutical carrier suitable for administration methods such as oral administration, rectal administration, and injection, and administered in the form of a conventional pharmaceutical preparation. Examples of such preparations include solid preparations such as tablets, granules, powders and capsules, solutions such as solutions, suspensions and emulsions, freeze-dried preparations, and the like. It can be prepared by conventional means. Examples of the non-toxic pharmaceutical carrier include glucose, lactose, sucrose, starch, mannitol, dextrin, fatty acid glyceride, polyethylene glycol, hydroxyethyl starch, ethylene glycol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, amino acid, gelatin, Examples include albumin, water, and physiological saline. Further, if necessary, conventional additives such as a stabilizer, a wetting agent, an emulsifier, a binder, and an isotonic agent can be appropriately added.
[0028]
As food, as it is, or in addition to various nutritional components or contained in foods and drinks, anti-osteoporosis agents, menopausal improvement / treatment agents, prostate cancer / prostatic hypertrophy / breast cancer and uterine cancer prevention / It is eaten as a health food or food material useful as a therapeutic agent or a post-pubertal onset acne amelioration / treatment agent for women. For example, after adding the above-mentioned appropriate auxiliaries, it may be used for edible by using conventional means, forming into an edible form, for example, granular, granular, tablet, capsule, paste, etc. It can also be used in various foods such as processed foods such as ham and sausage, processed fish foods such as kamaboko and chikuwa, bread, confectionery, butter, milk powder, fermented milk products, water, fruit juice, milk, You may add and use for drinks, such as tea and a soft drink.
[0029]
The effective dose of the propolis and kale of the present invention is appropriately selected and determined according to the patient's age, weight, symptoms, patient grade, administration route, administration schedule, formulation form, strength of the inhibitory activity of the material, etc. For example, in the case of oral administration of propolis, it is generally about 10 to 500 mg / kg body weight per day, preferably about 150 to 350 mg / kg body weight per day, and may be divided into several times a day. In kale, the dry weight is usually 0.1 g / kg body weight or more in terms of adult, and may be administered in several divided doses per day.
[0030]
Further, when the propolis or kale of the present invention is contained and used as an estrogen-like agent-containing cosmetic or cosmetic material, for example, a dry product or extract of Chinese propolis is added to wheat germ oil or olive oil. An estrogen-like agent-containing composition can be used as a cosmetic material. The amount of the dry product or extract of the kale of the present invention is not particularly limited, but as an example, 0.1 wt% or more and 60 wt% or less, preferably 0.1 wt% or less, preferably 0.5% by weight or more and 50% by weight or less is appropriate. In propolis, 0.01 wt% or more and 60 wt% or less, preferably 0.1 wt% or more and 50 wt% or less is appropriate with respect to the weight of wheat germ oil or olive oil.
[0031]
Further, a cosmetic having an estrogenic action can be produced by directly using the above-described composition containing an estrogenic agent as a cosmetic ingredient. For cosmetics, fats and oils such as vegetable oils, higher fatty acids, higher alcohols, silicones, anionic surfactants, cationic surfactants, amphoteric surfactants, nonionic surfactants, preservatives, sugars, sequestering agents , Polymers such as water-soluble polymers, thickeners, powder components, UV absorbers, UV blockers, moisturizers such as hyaluronic acid, perfumes, pH adjusters, desiccants, etc. . Vitamins, skin activators, blood circulation promoters, resident bacteria control agents, active oxygen scavengers, anti-inflammatory agents, anticancer agents, whitening agents, bactericides, and other medicinal components and physiologically active components can also be included.
[0032]
Cosmetics include skin lotions such as lotions, emulsions, creams, packs, makeup base lotions, makeup creams, emulsions, cream-like or ointment-type foundations, lipsticks, eye colors, and cheek colors. Preparations, body creams such as hand creams, leg creams and body lotions, bath preparations, oral cosmetics, and hair cosmetics. As the cosmetics containing the estrogen-like agent-containing composition obtained by the method of the present invention, from the functional aspect, for example, emulsion, cosmetic liquid, face cream, hand cream, lotion, essence, shampoo, rinse, etc. are preferable. .
[0033]
Such a cosmetic can be produced according to a conventional method. The addition amount of the dried product or extract of the propolis of the present invention in cosmetics is not particularly limited. For example, an appropriate amount is about 0.01% by weight to 20% by weight of the total weight of the cosmetics. .
[0034]
Since the propolis and kale of the present invention are natural products, their toxicity is low.For example, even if an ethanol extract of kale is orally administered to a rat over a long period of 1000 mg / kg daily for 100 days, no death is observed. Neither weight change was observed.
[0035]
[Example] The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
Production Example 1 (Production of propolis extract)
39.5L of 99.5% ethanol was added to 10g each of Brazilian and Chinese propolis ingots, immersed at 50 ° C overnight, and then the ethanol was removed by a rotary evaporator to obtain 324 mg and 216 mg of propolis extracts, respectively.
[0036]
Production Example 2 (Manufacture of kale extract)
The kale leaf was dried at 90 ° C. to inactivate the enzyme that is a bitter astringent ingredient. While extracting 4 kg of the pulverized product with 20 L of 99.5% ethanol (Wako Pure Chemical Industries) while heating and refluxing with an electric water bath, 80 g of kale extract was obtained.
[0037]
Test Method The binding test for rat uterine estrogen receptor was evaluated by partially modifying the method of B. KOFFMAN et al. (J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 38 (2) 135-139, 1991).
[0038]
[Preparation of cytosol fraction]
Unless otherwise stated, all operations shown below were performed at a temperature of 4 ° C.
[0039]
First, 4 times the amount of phosphate buffer (pH 8.0) is added to the crushed frozen uterine tissue, and then crushed for 5 seconds under full control conditions using a Polytron PT-10 probe (manufactured by Brinkman Instrument Co. Inc.). Then, the mixture was cooled in ice for 60 seconds until the next crushing, and then homogenized by repeating the operation of crushing for 5 seconds twice. The homogenate was centrifuged at 105000 × g for 30 minutes, and the resulting supernatant was decanted and used as the cytosolic fraction. The protein content of the cytosol fraction was measured by the method of Lowry et. Al. (J. Biol. Chem. 193 265-275 1951) using bovine serum albumin as a protein standard sample.
[0040]
[Evaluation of binding test to rat uterine estrogen receptor]
The cytosolic fraction prepared so that the protein concentration is 1.2 to 7.2 mg / ml is dissolved in a phosphate buffer (pH 8.0), and 17-β-estradiol labeled with 1 nM [ ³ H] and Production Example 1 And 2, each propolis extract or kale extract obtained in step 2 was added at 500 μg / ml and reacted at 40 ° C. for 20 hours. In addition, the non-specific binding test (blank) was performed in the presence of a 3000-fold excess of distilbestrol.
[0041]
Next, the released steroid or sample sample was treated with dextran-treated activated carbon suspension (phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 0.5% Norrit A, 0.005% dextran; hereinafter abbreviated as DCC) at 4 ° C. Removed by incubation for 10 min. Thereafter, DCC was precipitated by centrifuging at 5000 × g for 10 minutes, and 4 ml of a scintillation cocktail solution (Packard Instrument Co., Downer Grove, III) was added to 100 μl of the supernatant containing the protein-bound steroid obtained. Measured with a scintillation counter (Packard Model 2425, 30-40% efficiency). The inhibition rate was calculated by the following formula.
Inhibition rate (%) = 100 − [(C ₁ −B) / (C ₀ −B)] × 100
Wherein C ₁ is the binding of [ ³ H] -labeled 17-β-estradiol to the rat uterine estrogen receptor in the presence of a known amount of the test compound and [ ³ H] -labeled 17-β-estradiol. C ₀ represents the amount of [ ³ H] -labeled 17-β-estradiol bound to the rat uterine estrogen receptor when the test compound is removed, and B represents an excess of distilvesterol (3 × 10 ^{− 6} M) represents the amount of [ ³ H] -labeled 17-β-estradiol bound to rat uterine estrogen receptor in the presence.
The results are shown in Table 1.
[0042]
[Table 1]

[0043]
The IC ₅₀ value of 17-β-estradiol as a positive control in this measurement system was 0.84 nM (2.29 × 10 ⁻⁴ ng / ml).
As can be seen from Table 1, it can be seen that the propolis extract and kale extract of the present invention antagonistically suppress the estrogen receptor binding inhibitory action of 17-β-estradiol and have a strong estrogen-like action.
[0044]
Example 1 [Manufacture of tablets]
Using the ethanol extract of Brazilian propolis obtained in Production Example 1, tablets having the following composition were produced according to a conventional method.
(Composition) (Composition: Weight%)
Brazilian propolis extract 24
Lactose 63
Cornstarch 12
Guar gum 1
[0045]
Example 2 [Manufacture of juice]
Using the ethanol extract of kale obtained in Production Example 2, a juice having the following composition was produced according to a conventional method.
(Composition) (Composition: Weight%)
Frozen and concentrated Wenzhou orange juice 5.0
Fructose glucose liquid sugar 11.0
Citric acid 0.2
L-ascorbic acid 0.02
Fragrance 0.2
Dye 0.1
Kale extract 0.2
Water 83.28
[0046]
Example 3 [Production of face cream]
Using the ethanol extract of Chinese propolis obtained in Production Example 1, a face cream having the following composition was produced according to a conventional method.
(Composition) (Composition: Weight%)
Isopropyl isostearate 8.0
Jojoba oil 6.0
Cetanol 8.0
Stearyl alcohol 2.0
Polyoxyethylene lauryl ether 1.5
Propylene glycol 6.0
Sorbitol 1.0
Paraben 0.4
Chinese propolis extract 0.5
Vitamin E 0.5
Fragrance 0.1
Purified water 66.0
[0047]
The present invention provides a novel estradiol estrogen receptor binding inhibitor .

Claims

An estrogen receptor binding inhibitor of estradiol comprising an ethanol extract of propolis as an active ingredient .