JP4532619B2 - New calcium antagonist - Google Patents

Description

（式中、Rは直鎖または分岐鎖状アルキル基を示す。）
で表されるウリジン５’−アルキルホスフェート化合物を有効成分とするカルシウム拮抗剤、特に血小板凝集抑制剤にある。
【０００９】
上記式Ｉにおいて、Rで示されるアルキル基は、直鎖状または分岐鎖状のいずれであってもよい。その炭素数は、通常３０を超えることはなく、好ましくは４〜２４、更に好ましくは１６〜２０である。このようなアルキル基の具体例としては、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、エイコシルなどの直鎖状アルキルまたはゲラニル、ファルネシルなどの分岐鎖状アルキルを挙げることが出来る。現時点で最も好ましいと考えられるものは、Ｒが炭素数１６のｎ−ヘキサデシル基を表す場合、すなわちウリジン５’−ヘキサデシルホスフェート（ＵＭＰＣ１６）である。
【００１０】
有効成分としてのウリジン５’−アルキルホスフェート化合物（I)は、遊離形のみならず、医薬的に許容される限り、水和物、塩、エステルなど、生体内で遊離形を与えることの出来る任意の形で使用されてよい。従って、以下の記載において、化合物（I)は、遊離形のみならず、そのような医薬的に許容される任意形をも包括して意味するものとする。
【００１１】
本発明化合物（Ｉ）、すなわちウリジン５’-アルキルホスフェートは、一般にウリジン５’−モノホスフェート（式Ｉにおいて、Ｒ＝Ｈに相当する化合物）から自体常套の方法により合成することが出来る。たとえば、ウリジン５’−モノホスフェートおよび種々の直鎖状または分岐鎖状アルキルアルコールをｔ−ブチルアルコールに溶解し、ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で反応させることにより、製造することが出来る。反応温度は、溶媒の種類により異なるが、通常６０〜１００℃、好ましくは７０〜９０℃であり、反応時間は、反応温度により異なるが、通常２〜２０時間、好ましくは６〜８時間である。
【００１２】
化合物（I)は、後記するように、ウサギの血小板を使用する凝集試験において、阻害効果を有する事実が確認された。また、化合物（I）について、細胞内カルシウムイオン流入抑制作用を有する事実も確認された。従って、化合物（Ｉ）は、カルシウム拮抗剤として有用なものであり、更に血小板凝集抑制剤として有用なものである。
【００１３】
化合物（I)は、たとえば経口、非経口、口腔、経直腸または経皮投与により、すなわち薬剤を適用するのに都合のよい方法で投与することが出来る。経口投与のためには、液体または固体、たとえば、シロップ、懸濁液、エマルジョン、錠剤、カプセルまたはロゼンジとして処方できる。
【００１４】
液体処方は、一般に、化合物（Ｉ）を、沈殿防止剤、保存剤、フレーバー剤、着色剤などのような任意の添加剤と共に、適当な液体担体（たとえばエタノール、グリセリン、ポリエチレングリコール、油、水）中ヘ、懸濁または溶解させて調製する。
【００１５】
錠剤形である組成物は、固体処方の製造に慣用的な適宜の医薬担体を用いて製造することが出来る。このような担体の例は、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、ラクトース、シュークロースおよびセルロースを包含する。
【００１６】
カプセル形である組成物は、慣用的カプセル化操作を用いて製造できる。たとえば、活性成分含有のペレットを標準担体の使用により調製し、次いで硬ゼラチンカプセルに充填することができる。別法として、いずれか適当な医薬担体、たとえば水性ガム、セルロース、シリケートまたは油を用いて分散液または懸濁液を調製し、ついで該分散液または懸濁液を軟ゼラチンカプセルに充填することができる。
【００１７】
化合物（Ｉ）は、また、ボーラス注射または点滴により非経口投与してもよい。典型的な非経口用組成物は、該化合物の滅菌水性担体または非経口的に許容される油中、たとえばポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、レシチン、落花生油またはゴマ油中溶液または懸濁液からなる。別法として、該溶液を凍結乾燥し、ついで投与直前に適当な溶媒で復元してもよい。
【００１８】
本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセルまたはアンプルのような単位投与形であるのが好ましい。経口投与用の各投与単位は、１〜２５０ｍｇ（非経口投与では、好ましくは０.１〜６０ｍｇ）の化合物（Ｉ）（遊離塩基として換算）を含有するのが好ましい。
【００１９】
成人患者の場合、一日の投与量は、たとえば化合物（Ｉ）（遊離塩基として換算）が、１ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜２５０ｍｇ（たとえば５〜２００ｍｇ）の経口用量、あるいは０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０.１ｍｇ〜６０ｍｇ（たとえば１〜４０ｍｇ）の静脈内、皮下または筋肉内用量であり、それを一日に１〜４回投与する。また、化合物（Ｉ）を、好ましくは一日当たり４００ｍｇまでの用量で、連続的静脈内注入により投与してもよい。かくして、経口投与による一日の全用量は、１〜２０００ｍｇの範囲にあり、非経口投与による一日の全用量は０.１〜４００ｍｇの範囲にある。適当には、該化合物を連続的治療の期間中、たとえば１週間またはそれ以上の期間投与する。
【００２０】
【発明の実施の態様】
以下の記載は、本発明化合物（Ｉ）の製造例、製剤例および試験例を示すものである。
【００２１】
製造例
ウリジン５’−モノホスフェート（６００μｍｏｌ）およびヘキサデシルアルコール（６ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのｔ−ブチルアルコールに溶解した後、３ｍｍｏｌのジシクロヘキシルカルボジイミドを加え、８０℃で２０時間加熱する。反応終了後、生成した沈殿を濾別し、ｔ−ブチルアルコールを減圧下に除去する。残渣をヘキサンおよびアセトンの混液（１：１）で数回洗浄し、乾燥した後、クロロホルムおよびメタノールの混液（９５：５）に溶解する。これを同溶液にて作成したシリカゲルカラムに負荷し、カラムを同液で充分洗浄してジシクロカルボジイミドを流出させる。以後、メタノールの濃度を順次、上昇させることによって、ウリジン５’−ヘキサデシルホスフェートを溶出する。溶出液から溶媒を減圧下に除去することにより、白色の沈殿を得た。対ウリジン５’−モノホスフェートあたりの収率は、３２．４％であった。
【００２２】
製剤例１（静脈内注射）
化合物（Ｉ） １−４０ｍｇ
バッファー pＨ約７まで
溶媒 １００ｍｌまで
【００２３】
製剤例２（ボーラス注射）
化合物（Ｉ） １−４０ｍｇ
バッファー pＨ約７まで
共溶媒 ５ｍｌまで
【００２４】
上記製剤例１および２において、バッファーの具体例としてはクエン酸塩、リン酸塩および水酸化ナトリウム／塩酸を、溶媒の具体例としては水を、共溶媒の具体例としてはプロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびアルコールを挙げることが出来る。
【００２５】
製剤例３（錠剤）
化合物（Ｉ） １−４０ｍｇ
希釈剤／充填剤 ５０−２５０ｍｇ
結合剤 ５−２５ｍｇ
崩壊剤 ５−５０ｍｇ
滑沢剤 １−５ｍｇ
【００２６】
上記製剤例３において、希釈剤／充填剤の具体例としては微結晶セルロース、ラクトースおよび澱粉を、結合剤の具体例としてはポリビニルピロリドンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースを、崩壊剤の具体例としてはナトリウム澱粉グリコレートおよびクロスポビドンを、滑沢剤の具体例としてはステアリン酸マグネシウムおよびステアリルフマル酸ナトリウムを挙げることが出来る。
【００２７】
製剤例４（経口用懸濁液）
化合物（Ｉ） １−４０ｍｇ
沈殿防止剤 ０.１−１０ｍｇ
希釈剤 ２０−６０ｍｇ
保存剤 ０.０１−１.０ｍｇ
バッファー pＨ約５−８まで
共溶媒 ０−４０ｍｇ
フレーバー ０.０１−１.０ｍｇ
着色剤 ０.００１−０.１ｍｇ
【００２８】
上記製剤例４において、沈殿防止剤の具体例としてはキサンチンガムおよび微結晶セルロースを、希釈剤の具体例としてはソルビトール溶液、典型的には水を、保存剤の具体例としては安息香酸ナトリウムを、バッファーの具体例としてはクエン酸塩を、共溶媒の具体例としてはアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびシクロデキストリンを挙げることが出来る。
【００２９】
試験例
1．試験材料と試験方法
１−１．試験材料：−
試験化合物としてのウリジン５'−オクチルホスフェート（Ｉ： Ｒ＝Ｃ₈Ｈ₁₇）（ＵＭＰＣ８）、ウリジン５'−ドデシルホスフェート（Ｉ： Ｒ＝Ｃ₁₂Ｈ₂₅）（ＵＭＰＣ１２）、ウリジン５'−ヘキサデシルホスフェート（Ｉ： Ｒ＝Ｃ₁₆Ｈ₃₃）（ＵＭＰＣ１６）、ウリジン５'−エイコシルホスフェート（Ｉ： Ｒ＝Ｃ₂₀Ｈ₄₁（ＵＭＰＣ２０）およびウリジン５'−テトラコシルホスフェート（Ｉ： Ｒ＝Ｃ₂₄Ｈ₄₉）（ＵＭＰＣ２４）は、それぞれ、製造例の方法に準じて合成した。
【００３０】
血小板凝集誘導剤としての１−ヘキサデシル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＡＦ）は、Ｂachem Ｆeinchemikalien ＡＧ (Ｂubendorf, Ｓwitzerland)から購入したものを使用した。
【００３１】
カルシウム−イオン透過担体「Ａ２３１８７」、ウシ血漿由来トロンビン、アラキドン酸、パルミチン酸、アデノシン５'−ジホスフェート（ＡＤＰ）、イオノマイシンカルシウム塩およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、fraction Ｖ，必須脂肪酸を含まない）は、Ｓigma Ｃhemical Ｃo. (Ｓt. Ｌouis，ＭＯ，ＵＳＡ）の製品を用いた。フラ２ＡＭとフラ２は、同仁（熊本、日本）の製品を用いた。塩酸ベラパミル、１２−ミリスチン酸１３−酢酸ホルボール（ＰＭＡ）およびＦicoll−Ｐaqueは、それぞれ和光純薬（東京、日本）、Ｒesearch Ｂiochemicals Ｉnternational（Ｎatick, ＭＡ，ＵＳＡ）およびアマシャム・ファルマシア・バイオテク（東京、日本）から入手した。溶媒は全ての試薬が特級である。
【００３２】
バッファー組成は、次のとおりである：（１）基本タイロード（Ｔyrode）液：ＮaＣl ８.０１g/L，ＫＣl ０.１９５g/L，ＭｇＣl₂ ６Ｈ₂Ｏ ０.２１５g/L，ＮaＨＣＯ₃ １.０２g/L，グルコース１.０１g/L，ｐＨ ７.２；（２）Ｃa²⁺ を含まずＥＤＴＡを含んだタイロード／ゼラチン：バッファー（１）と同じであるが、ゼラチン（２.５g/L）とＮａ₂ ＥＤＴＡ（０.３７３g/L）を含む,ｐＨ６.５; (３）Ｃａ²⁺を含んだタイロード／ゼラチン：バッファー（１）と同じであるが、ＣaＣl₂ ２Ｈ₂Ｏ（０.１４３g/L）を含む,ｐＨ７.２; (４）ＨＥＰＥＳ−ＥＤＴＡを含む緩衝性生理食塩水：ＨＥＰＥＳ １.００g/L，ＮaＣl ８.０１g/L, ＫＣl ０.１９５g/L, デキストロース１.０１g/L, Ｎa₂ ＥＤＴＡ ０.３７３g/L, ｐＨ７.４。
【００３３】
ウサギ血小板の調製：プラスチック容器やシリコン処理したガラス製容器が全ての血小板の調製と刺激実験に用いられた。洗浄されたウサギの血小板は、スガタニらの方法（J.Biol.Chem.，２６２巻、５７４０頁、１９８７年）を一部修正して調製した。それぞれ４５mL分のウサギ血液を、５mLの４１mM クエン酸−８５mM クエン酸三ナトリウム−２％グルコース溶液中で加え、１７０ｇで１０分間遠心分離した。血小板が豊富な血漿である上清多血小板血漿（platelet-rich plasma：ＰＲＰ）は、１０mLのFicoll-Paqueで下層にし、７５０ｇで２０分間遠心分離した。血小板層は、０.１mMのＥＤＴＡを含んだ４０mLのＨＥＰＥＳ−緩衝性生理食塩水（ｐＨ７.２）と穏やかに混合し、０.２mLのFicoll-Paqueに重層し、７５０ｇで、１０分間遠心分離した。再び、血小板層を０.１mMのＥＤＴＡを含んだ４０mLのＨＥＰＥＳ−緩衝性生理食塩水（ｐＨ７．２）で懸濁し、７５０ｇで１０分間遠心分離した。血球は、０.１mM ＥＤＴＡを含んだタイロード/ゼラチン（ｐＨ６.５）で、１.０×１０⁹ cells/mLとなるように懸濁した。
【００３４】
1−２．試験方法：−
（血小板凝集試験）
血小板（１×１０⁸ cells，４００μL）は、１mM Ｃa²⁺ を含んだタイロード／ゼラチン緩衝液中で刺激を受け、活性化される。凝集活性は、凝集測定器（Ｎikko Ｈematracer, ＰＡＴ−２Ａ）を使って、光透過の変化として測定される。０.０５％エタノール−０.００５％ジメチルスルホキシドを含んだ生理食塩水に溶解させたウリジン５'−アルキルホスフェートや生理食塩水に溶解させたベラパミルは、特に示さない場合は、ＰＡＦ等の刺激剤を添加する１分前に、反応系に添加される。血小板凝集阻害の割合は、［（コントロール反応−阻害反応）／コントロール反応］×１００で計算する。ＩＣ₅₀は、添加量−反応量曲線の回帰分析によって得られる。
【００３５】
（サイトゾル中の遊離カルシウム濃度の測定）
０.１mMのＥＤＴＡを含んだＨＥＰＥＳ−緩衝性生理食塩水（ｐＨ７.４）中に懸濁したウサギ血小板（１×１０⁹ cells/mL）は、１×１０^-6Ｍのフラ２−アセトキシメチルエステルと、３７℃４５分間インキュベートして細胞内に取り込ませ、細胞外色素を取り除くために１度洗浄した。０.１mM ＥＤＴＡを含んだタイロード/ゼラチン緩衝液（ｐＨ６.５）で１×１０⁹ cells／mL濃度となるように再懸濁した。この血小板懸濁液（０.４８mL）を、丸底試験管に分取し、外液中のＣａ²⁺（[Ｃａ²⁺]₀）濃度が１mMとなるようにＣaＣl₂を添加した。
【００３６】
その後、これらのサンプルは、特注のキュベットホルダーに移し、記録計を備えた日本分光（東京、日本）蛍光分光光度計ＣＡＦ−１００中に設置し、３７℃に保温した。試験管内の磁石を回転させ、絶えず細胞を攪拌した。少なくとも５分間３７℃に保った後、細胞は、０.０１mMの前述した濃度のウリジン５'−アルキルホスフェートで１分間、次いで、０.０１mLの前述した濃度の凝集惹起物質を添加することにより、活性化した。フラ２蛍光は、３４０nm（Ｆ３４０）と３８０nm（Ｆ３８０）（それぞれ誤差±５nm）の励起波長で連続的に測定した。［Ｃａ²⁺]ｉの測定は、相当する発光シグナル（５００±１０nm）を、Ｒ３４０／３８０と表す比シグナル（Ｆ３４０／Ｆ３８０）と同様に計測した。
【００３７】
細胞内Ｃａ²⁺濃度［Ｃａ²⁺]ｉは、次の式から算出できる（G.Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem., ２６０巻、３４４０頁、１９８５年）。
[Ｃａ²⁺]i＝Ｋｄ×Ｂ×［（Ｒ−Ｒmin）／（Ｒmax−Ｒ）］
ただし、Ｋｄ：Ｃａ²⁺に対するフラ２の解離定数で、in vivoでは２２４nMと仮定する式から算出できる（G.Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem., ２６０巻、３４４０頁、１９８５年）； Ｂ：Ｃａ²⁺を含んだ溶液中でのＦ３８０に対するＣａ²⁺を含まない溶液中でのＦ３８０の割合； Ｒ：Ｆ３４０／Ｆ３８０で表される蛍光比； Ｒmax：２０％ TritonX-100を０.０１mL添加し、細胞を溶解したときの細胞内フラ２による最大発光シグナル値； Ｒmin：Ｒmaxの測定後、１５０mM Tris/450mM ＥＧＴＡを０.０１mL添加し、Ｃａ²⁺を除去したときの発光シグナル値。
【００３８】
いずれの実験も、それぞれの阻害剤について３乃至４回測定した。また、血小板反応蛍光、色素の漏れおよび蛍光標識の影響を最小限に止めるために、実験を１時間以内に完了するように設定した。
データ表示：表や図に示した結果は、調整した血小板を分離して用い、少なくとも２回行った実験を表し、特別の場合を除き、複数回の平均値（±平均の範囲）を提供している。
【００３９】
２．試験結果
２−１．血小板凝集を惹起するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の効果：−
ＰＡＦとＵＭＰＣ１６の血小板凝集に対する投与量に依存的な効果を、図１に示す。すなわち、図１は、血小板凝集を惹起するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の効果を示す図であって、Ａは凝集を惹起するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の異なった濃度における効果を示し、Ｂは血小板凝集を惹起するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６とパルミチン酸の投与量依存的効果を示し、Ｃは種々の濃度のＰＡＦによる血小板凝集に対するＵＭＰＣ１６の阻害活性を示す。
【００４０】
図１のＡにおけるａ〜ｆは、次の実験条件を示す。すなわち、１mMＣaＣl₂を含んだタイロード／ゼラチン緩衝液（ｐＨ７.２）中の洗浄ウサギ血小板（１×１０⁸ cells, ０．３８mL）を、２.０％エタノール−２.０％ジメチルスルホキシドを含んだ生理食塩水に溶解したＵＭＰＣ１６（指示された濃度）（１０μＬ）と、１分間プレインキュベートし（ａ）、その後０.１％ＢＳＡを含んだ生理食塩水に溶解したＰＡＦ（１０μＬ）（最終濃度８×１０^-11Ｍ）に、２分間（ＰＡＦ刺激により最大反応が得られる時間）、暴露した（ｂ）。血小板凝集の阻害率を上記の方法により計算し、結果を複数個の平均値で示した（±平均値の範囲）。ｃは媒介物、ｄは６×１０^-6Ｍ、ｅは８×１０^-6Ｍ、ｆは１×１０^-5Ｍの場合を示す。
【００４１】
図１のＡに示すように、ＵＭＰＣ１６は、８×１０^-11Ｍ ＰＡＦによる血小板の形態、変化を抑制しなかったが、血小板凝集を阻害した。ＵＭＰＣ１６による凝集阻害は、ＵＭＰＣ１６とＰＡＦの濃度に依存した（図１のＢとＣ参照）。一方、１〜１０μＭ濃度のパルミチン酸（ＵＭＰＣ１６のアルキルの一部から成る）は、ＰＡＦによる血小板凝集を抑制しなかった。
【００４２】
２−２．血小板凝集を惹起するトロンビン、アラキドン酸、ＡＤＰ、Ａ２３１８７およびＰＭＡに対するＵＭＰＣ１６の効果：−
ＵＭＰＣ１６による血小板凝集阻害は、ＰＡＦに対してのみ惹起されるのか検討するために、凝集惹起物質に対するＵＭＰＣ１６の効果を試験した。すなわち、2−1．（図１）の場合と同様に、血小板（１×１０⁸ cells, ０.３８mL）を１分間ＵＭＰＣ１６とプレインキュベートし、その後凝集惹起物質（１０μＬ）、すなわち０.１％ＢＳＡを含んだ生理食塩水に溶解したＰＡＦ（最終濃度８×１０^-11Ｍ）、生理食塩水に溶解したトロンビン（最終濃度０.０２U/mL）、４％エタノールを含んだ生理食塩水に溶解したアラキドン酸（最終濃度２×１０^-5Ｍ）、生理食塩水に溶解したＡＤＰ（最終濃度２.５×１０^-5Ｍ）、４％ジメチルスルホキシドを含んだ生理食塩水に溶解したＡ２３１８７（最終濃度２×１０^-7Ｍ）および４％エタノールを含んだ生理食塩水に溶解したＰＭＡ（最終濃度２×１０^-8Ｍ）に、それぞれ２分、４分、２分、２分、４分および３０分間（媒介物の存在下、凝集惹起物質で刺激することにより最大反応が得られる時間）、暴露した。血小板凝集の阻害率は、上記方法で計算し、結果を複数個の平均値で、図２に示した（±平均値の範囲）。
【００４３】
図２から明らかなように、血小板凝集を惹起するトロンビン、アラキドン酸、ＡＤＰは、血小板凝集を惹起するＰＡＦと同様にＵＭＰＣ１６により明らかに抑制された。阻害の強さは、凝集惹起物質とＵＭＰＣ１６の濃度に依存した。凝集を惹起するＰＡＦ（８×１０^-11Ｍ）、トロンビン（０.０２Ｕ／mL）、アラキドン酸（２×１０^-5Ｍ）およびＡＤＰ（２.５×１０^-5Ｍ）に対するＩＣ₅₀値は、それぞれ２.４×１０^-6Ｍ、５.４×１０^-6Ｍ、２.１×１０^-6Ｍおよび２.２×１０^-6Ｍであった（データを示さず）。反対に、２×１０^-8Ｍから２×１０^-7Ｍの濃度のＡ２３１８７による血小板凝集と、２×１０^-9Ｍから２×１０^-7Ｍの濃度のＰＭＡによる血小板凝集は、１×１０^-5ＭのＵＭＰＣ１６により阻害されなかった。これらの結果は、ＵＭＰＣ１６がＰＡＦの刺激のみならず、受容体を介した刺激を阻害するが、Ａ２３１８７により惹起される細胞外カルシウムの流入や、プロテインキナーゼＣ経路の活性化には影響を及ぼさなかったことを示している。
【００４４】
２−３．血小板凝集を誘発するＰＡＦとトロンビンに対するウリジン５'-アルキルホスフェート化合物（Ｉ）の阻害効果：−
各種ウリジン５’−アルキルホスフェート化合物（Ｉ）、すなわちＵＭＰＣ８、ＵＭＰＣ１２、ＵＭＰＣ１６、ＵＭＰＣ２０およびＵＭＰＣ２４の血小板凝集阻害作用を調べた。すなわち、２.０％エタノール−２.０％ジメチルスルホキシドを含む生理食塩水に溶解した所定濃度のＵＭＰＣ８、ＵＭＰＣ１２、ＵＭＰＣ１６、ＵＭＰＣ２０またはＵＭＰＣ２４（１０μＬ）を、１mM ＣaＣl₂含有タイロード／ゼラチン緩衝液（ｐＨ７.２）中の血小板（１×１０⁸ cells, ０.３８mL）に１分間暴露し、その後０.１％ＢＳＡを含む生理食塩水に溶解したＰＡＦ（最終濃度８×１０^-11Ｍ）（Ａ）または生理食塩水に溶解したトロンビン（最終濃度０.０２U/mL）（Ｂ）に、それぞれ２分または４分間暴露する。血小板凝集の阻害率を、上記した方法により計算し、結果を図３に複数個の平均値で示した（±平均値の範囲）。
【００４５】
図３のＡやＢから明らかなように、これらのウリジン５’−アルキルホスフェート化合物（Ｉ）は、ＰＡＦやトロンビンによる血小板凝集に影響を及ぼす。極頭基のメチレン鎖の長さを引き延ばしたＣ１６やＣ２０を含むウリジン５'−アルキルホスフェート類は、血小板凝集を惹起するＰＡＦをＰＡＦ刺激に対する阻害が報告（K. D. Newman et al., J. Clin. Invest., ６１巻、３９５頁、１９７８年；T. C. Lee et al., Arch. Biochem. Biophys., ２２３巻、３３頁、１９８３年；F. H. Valone et al., Thromb. Res., ４０巻、３８５頁、１９８５年）されているカルシウムチャネル阻害剤であるベラパミルより強く阻害した。つまり、１×１０^-5ＭのＵＭＰＣ１６と１×１０^-5Ｍのベラパミルは、それぞれ対照試験に対し、８×１０^-11Ｍ ＰＡＦによる凝集を０％及び１９％抑制した。８×１０^-11Ｍ ＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の凝集阻害のＩＣ₅₀値（２.４×１０^-6Ｍ）は、ＵＭＰＣ２０のＩＣ₅₀値（２.２×１０^-6Ｍ）と同程度であった。さらに、ＵＭＰＣ１６とＵＭＰＣ２０は、ＰＡＦだけでなく、トロンビンの凝集も同様に抑制した。
【００４６】
２−４．凝集を惹起するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の阻害作用の特徴：―
次に、ＵＭＰＣ１６により惹起された血小板凝集阻害が、ベラパミルで見られたのと同様に、補足のカルシウムにより元に戻るかどうかを調べた。すなわち、１mM又は１０mMのＣaＣl₂を含んだタイロード／ゼラチン緩衝液（ｐＨ７.２）中の血小板（１×１０⁸ cells, ０.３８mL）を、２.０％エタノール−２.０％ジメチルスルホキシドを含んだ生理食塩水に溶解したＵＭＰＣ１６（最終濃度１×１０^-5Ｍ）（１０μＬ）と１分間プレインキュベーションした後、０.１％ＢＳＡを含む生理食塩水に溶解したＰＡＦ（最終濃度８×１０^-11Ｍ）に２分間暴露した。血小板凝集の阻害率は、上記した方法により計算し、結果を図４に複数個の平均値として示した（±平均値の範囲）。
【００４７】
図４から理解できるように、血小板の懸濁液中で、１mMから１０mMの範囲でカルシウム濃度を増加させたところ、ＰＡＦの凝集惹起に対するＵＭＰＣ１６による阻害は元に戻らなかった。逆に、補足ＣaＣl₂濃度を１０mMにするとＰＡＦによる血小板凝集誘発の程度は、７２％に減少した。
【００４８】
さらに、ＵＭＰＣ１６は、ＰＡＦの添加後でも効果があるのか調べるために、血小板凝集に対するＵＭＰＣ１６の添加時間の影響を試験した。すなわち、ＵＭＰＣ１６または対照試験用の溶媒を、８×１０^-8ＭのＰＡＦ添加前後の指定された時間に血小板に添加し、血小板凝集の阻害率を上記方法により計算し、結果を図5に複数個の平均値として示した（±平均値の範囲）。８×１０^-11ＭのＰＡＦを添加する前に１分間１×１０^-5ＭのＵＭＰＣ１６とインキュベートしただけでなく、８×１０^-11ＭのＰＡＦと同時に１×１０^-5ＭのＵＭＰＣ１６を添加した場合も、ＰＡＦによる凝集が１００％阻害された。一方、ＵＭＰＣ１６をＰＡＦの添加後１０秒、３０秒及び１分経過した後の血小板に添加すると、血小板凝集は、それぞれ、対照試験に対し２９％、４２％及び７５％程度となった（図５）。これらの所見は、ＵＭＰＣ１６がベラパミル同様に脱凝集を引き起こし、ＰＡＦより後に添加した場合でさえ、ＰＡＦ刺激に対する阻害効果があったことを示している。
【００４９】
２−５．［Ｃa²⁺]ｉ反応を誘発するＰＡＦとイオノマイシンに対するＵＭＰＣ１６の作用：−
［Ｃa²⁺]ｉ反応を誘発するＰＡＦやイオノマイシンに対するＵＭＰＣ１６の作用を調べるため、ＵＭＰＣ１６や溶媒を３７℃の温水中で、直接血小板と１分間、プレインキュベーションした。最大反応は、溶媒の存在下で、ＰＡＦの刺激により測定した。添加を指示したのは、溶媒（ａ）、ＰＡＦ（ｂ，８×１０^-11Ｍ）、ＵＭＰＣ１６（ｃ，１×１０−⁵Ｍ）、イオノマイシン（ｄ，４×１^-8Ｍ）を添加した。結果は、少なくとも４回行った実験の代表例を、図６に示す。
【００５０】
血小板内カルシウム濃度を変化させるＰＡＦやイオノマイシンに対するベラパミルとＵＭＰＣ類の効果を比較した。すなわち、血小板（１０⁹ cells/mL）を、溶媒、ベラパミル（最終濃度１×１０^-1Ｍ）またはＵＭＰＣ類（最終濃度１×１０^-5Ｍ）と、上記２．４（図５）に記載したように、１分間、インキュベート、処理した後、ＰＡＦ（最終濃度４×１０^-11Ｍ）やイオノマイシン（最終濃度４×１０^-8Ｍ）に暴露した。最大[Ｃａ²⁺]ｉレベルは、上記したように、フラ−２蛍光で測定した。結果は、４-６回行った測定結果の平均値±ＳＤとして表１に示す。
【００５１】
【表１】

【００５２】
この結果から、ＵＭＰＣ１６は、［Ｃa²⁺]ｉを誘発するＰＡＦの作用を減弱させるが、［Ｃa²⁺]ｉを誘発するイオノマイシンの作用を減弱させないことが理解できる（図６、表１）。１mMの細胞外カルシウムの存在下において、未刺激血小板の平均［Ｃa²⁺]ｉが５２.０±１８.４nM（ｎ＝１５）であり、ＵＭＰＣ１６はこの値を変化させなかった。８×１０^-11ＭのＰＡＦを添加すると、血小板［Ｃa²⁺]ｉは４７４．７±７４．２ｎＭに上昇するが、ＵＭＰＣ１６は、このＰＡＦによる［Ｃa²⁺]ｉの上昇を減弱させた。ＵＭＰＣ１６による［Ｃa²⁺]ｉ反応の阻害の程度は、ベラパミルによるものより高かったが（表１）、血小板凝集阻害の様式は、よく似ていた。
【００５３】
３．試験結果の解析
上記試験結果は、ＵＭＰＣ１６が、ＰＡＦだけでなく、血小板凝集を惹起するトロンビン、アラキドン酸及びＡＤＰをも投与量依存的に直接阻害し、その阻害は血小板活性化を惹起するＰＡＦに限局したものでないことを示している（図１および２）。ＵＭＰＣ化合物のうち、ＵＭＰＣ１６は、血小板活性化に対する阻害効果がＵＭＰＣ８やＵＭＰＣ１２よりも強い（図３）。アラキドン酸は、ホスホリパーゼＣ経路の活性を誘発すると考えられているエンドペルオキシドやトロンボキサンＡ₂を経てシクロオキシゲナーゼやトロンボキサンＡ₂シンテターゼにより代謝される。ＰＡＦ、トロンビン、トロンボキサンＡ₂およびＡＤＰによる刺激は、受容体を介して伝達され、４０−ｋＤａのタンパク質リン酸化を惹起する、プロテインキナーゼＣシステムと関連しているホスホリパーゼＣの活性化を誘発する。ＵＭＰＣ１６は、これら受容体を介した刺激による血小板凝集や、［Ｃa²⁺]ｉの変化を誘発するＰＡＦの作用を阻害した（図２と６および表１）。
【００５４】
血小板懸濁液中のカルシウム濃度の増加は、ＵＭＰＣ１６のＰＡＦに対する凝集誘発の阻害を回復させず（図４）、これは、ベラパミルの活性様式とは相違する。他の所見は、好中球におけるベラパミルの阻害効果が、単にカルシウムの流入を阻害するためだけでなく、ベラパミルにより活性化されたプロテインキナーゼＣ酵素に対する直接的な阻害活性もまたあるということを示している。一方、ＵＭＰＣ１６は、カルシウムイオン透過担体であり、血小板凝集を惹起するＡ２３１８７や［Ｃa²⁺]ｉを変化させるイオノマイシンの作用を阻害しなかった(図２と６)。さらに、ＵＭＰＣ１６は、血小板凝集を惹起するＰＭＡを阻害しなかった(図２）。ＰＭＡは、血小板において、40ｋＤａのタンパク質をリン酸化するプロテインキナーゼＣを直接活性化させ、細胞外Ｃa²⁺を必要としない。
【００５５】
図５で示したように、あらかじめＰＡＦで凝集された血小板に添加したとき、１×１０^-5Ｍの濃度のＵＭＰＣ１６は、凝集を阻害できる。すなわち、脱凝集を引き起こす。ベラパミルは、４０‐ｋＤａや２０−ｋＤａのタンパク質のリン酸化を元に戻すことにより、ＰＡＦで凝集した血小板に脱凝集を引き起こすと報告されてきた（G. Bonadonna et al., Thromb. Heamos., ５６巻、３０８頁、１９８６年）。我々は、ウサギ血小板に結合するＰＡＦの動態についての研究で、ＰＡＦにより完全に凝集された血小板は、受容体に対するＰＡＦの量が減少すると同時に、脱凝集が見られる、つまり、血小板凝集を維持するために、受容体にＰＡＦの結合が必要であるということを示していることを解明している。
【００５６】
以上、ＵＭＰＣ１６の活性様式は、受容体に特異的に結合する凝集惹起物質を介するカルシウム流入を阻害したり、カルシウムチャンネル阻害剤であるベラパミルと同様に、凝集惹起物質の結合を阻害することによるものであると考えることが出来る。なお、細胞内カルシウムに依存する反応の阻害は、血小板反応に対するＵＭＰＣ１６の阻害活性に影響を与える可能性が考えられる。結論として、ＵＭＰＣ１６は、血小板反応を介する受容体をベラパミルより効果的に阻害するということが出来る。
【００５７】
【発明の効果】
本願発明のヌクレオシド５'−アルキルホスフェート化合物（Ｉ）は、カルシウム拮抗作用を有し、特に細胞外液カルシウムの細胞内流入阻止に基づくカルシウム拮抗作用を有することから、心筋障害や不整脈発生の防止に有効であり、また優れた血小板凝集抑制作用を有することから、血栓症、塞栓症または動脈硬化症の予防薬または治療薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 血小板凝集を惹起するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の効果を示す図である。Ａは凝集を誘発するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の異なった濃度における効果を示し、Ｂは血小板凝集を惹起するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６とパルミチン酸の投与量依存的効果を示し、Ｃは種々の濃度のＰＡＦによる血小板凝集に対するＵＭＰＣ１６の阻害活性を示す。
【図２】 血小板凝集を惹起する凝集惹起物質に対するＵＭＰＣ１６の阻害効果を示す図である。
【図３】 血小板凝集惹起剤に対するウリジン５'−アルキルホスフェート類の阻害効果を示す図である。Ａは惹起剤がＰＡＦの場合のもの、Ｂは惹起剤がトロンビンの場合のものである。
【図４】 血小板凝集を惹起するＰＡＦのＵＭＰＣ１６による阻害活性に対する細胞外カルシウムの効果を示す図である。
【図５】 血小板凝集を惹起するＰＡＦに対し、様々な時間にＵＭＰＣ１６を添加したときの効果を示す図である。
【図６】 血小板内カルシウム濃度を変化させるＰＡＦやイオノマイシンに対するＵＭＰＣ１６の効果を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to new uses of uridine 5′-alkyl phosphate compounds, in particular as calcium antagonists.
[0002]
[Prior art]
Infectious diseases are being overcome by drugs such as antibiotics, while circulatory diseases are combined with a rapid increase in fat intake accompanying westernization of diet and high sodium chloride diet since ancient times in Japan. However, we are looking at the expansion of cases, and there is concern that it will become a serious problem in the future when aging is progressing. Reflecting this situation, various circulatory drugs have been developed, and among them, a cardiovascular drug having a mechanism of calcium antagonism is highly expected due to its excellent drug efficacy.
[0003]
Calcium antagonists relax both the thick and thin coronary arteries by inhibiting calcium ion influx into vascular smooth muscle cells, thereby increasing coronary blood flow and increasing oxygen supply to the myocardium Let Conventional calcium antagonists are mainly divided into three types: nifedipine, verapamil and diltiazem. Among these, nifedipine type (dihydropyridine type) calcium antagonists are not only blood vessels but also calcium ions in cardiomyocytes. It has an action of suppressing inflow, and is understood to have a relatively weak cardiac inhibitory action compared to verapamil and diltiazem.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Calcium antagonists are currently attracting attention as therapeutic agents for ischemic heart diseases such as angina pectoris and myocardial infarction, and the provision of calcium antagonists with more powerful and safe efficacy has always been requested. ing.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In order to meet such a demand, the present inventors have confirmed that the uridine 5′-alkyl phosphate compound has a remarkable calcium antagonistic activity, while conducting various studies on various nucleoside compounds, and based on this finding. The present invention has been completed.
[0006]
Regarding uridine compounds, there is a fact that prior to the present invention, the presence or absence of the platelet aggregation action of uridine 5′-monophosphate (UMP) was examined, but it was reported that a negative result was obtained ( Pharmaceutical Journal, 111 (9) 504-509 (1991)).
[0007]
Uridine 5′-alkyl phosphates have also been reported to inhibit sexual aggregation between α and α haploid (haploid) cells of yeast but do not affect cell growth (FEMS Microbiol). Lett., 147, 17-22 (1997)). It has been shown that this inhibition of aggregation is not due to the direct action of uridine 5′-alkyl phosphates on the yeast cell wall.
[0008]
The subject of the present invention is the formula I:
[Chemical 2]

(In the formula, R represents a linear or branched alkyl group.)
In a calcium antagonist, particularly a platelet aggregation inhibitor, which contains a uridine 5′-alkyl phosphate compound represented by the formula:
[0009]
In the above formula I, the alkyl group represented by R may be either linear or branched. The carbon number usually does not exceed 30, preferably 4 to 24, and more preferably 16 to 20. Specific examples of such an alkyl group include linear alkyl such as butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, decyl, undecyl, dodecyl, tetradecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, eicosyl or branched chain such as geranyl and farnesyl. And alkyl. What is considered to be most preferable at the present time is when R represents an n-hexadecyl group having 16 carbon atoms, that is, uridine 5′-hexadecyl phosphate (UMPC16).
[0010]
Uridine 5′-alkyl phosphate compound (I) as an active ingredient is not limited to the free form, and may be any form that can give the free form in vivo, such as a hydrate, salt, ester, etc. as long as it is pharmaceutically acceptable. May be used in the form of Therefore, in the following description, the compound (I) is meant to encompass not only the free form but also any such pharmaceutically acceptable form.
[0011]
The compound (I) of the present invention, that is, uridine 5′-alkyl phosphate can be generally synthesized from uridine 5′-monophosphate (a compound corresponding to R = H in formula I) by a conventional method. For example, it can be produced by dissolving uridine 5′-monophosphate and various linear or branched alkyl alcohols in t-butyl alcohol and reacting them in the presence of dicyclohexylcarbodiimide. The reaction temperature varies depending on the type of solvent, but is usually 60 to 100 ° C., preferably 70 to 90 ° C., and the reaction time varies depending on the reaction temperature, but is usually 2 to 20 hours, preferably 6 to 8 hours. .
[0012]
As described later, it was confirmed that Compound (I) has an inhibitory effect in an agglutination test using rabbit platelets. Moreover, the fact that compound (I) has an intracellular calcium ion influx inhibitory action was also confirmed. Therefore, compound (I) is useful as a calcium antagonist, and further useful as a platelet aggregation inhibitor.
[0013]
Compound (I) can be administered, for example, by oral, parenteral, buccal, rectal or transdermal administration, i.e. in a manner convenient for the application of the drug. For oral administration, it can be formulated as a liquid or solid, for example, a syrup, suspension, emulsion, tablet, capsule or lozenge.
[0014]
Liquid formulations generally comprise Compound (I), together with optional additives such as suspending agents, preservatives, flavoring agents, coloring agents, etc., in a suitable liquid carrier (eg ethanol, glycerin, polyethylene glycol, oil, water ) Prepare by suspending or dissolving.
[0015]
A composition in the form of a tablet can be produced using any suitable pharmaceutical carrier conventional for the production of solid formulations. Examples of such carriers include magnesium stearate, starch, lactose, sucrose and cellulose.
[0016]
Compositions that are in capsule form can be prepared using conventional encapsulation procedures. For example, pellets containing the active ingredient can be prepared by use of a standard carrier and then filled into hard gelatin capsules. Alternatively, a dispersion or suspension may be prepared using any suitable pharmaceutical carrier such as aqueous gum, cellulose, silicate or oil and then filled into a soft gelatin capsule. it can.
[0017]
Compound (I) may also be administered parenterally by bolus injection or infusion. A typical parenteral composition consists of a solution or suspension of the compound in a sterile aqueous carrier or parenterally acceptable oil such as polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, lecithin, peanut oil or sesame oil. Alternatively, the solution may be lyophilized and then reconstituted with a suitable solvent just prior to administration.
[0018]
The pharmaceutical composition of the present invention is preferably in unit dosage form such as a tablet, capsule or ampoule. Each dosage unit for oral administration preferably contains 1 to 250 mg (preferably 0.1 to 60 mg for parenteral administration) of compound (I) (converted as the free base).
[0019]
In the case of an adult patient, for example, the daily dose of Compound (I) (converted as the free base) is 1 mg to 500 mg, preferably 1 mg to 250 mg (for example, 5 to 200 mg), or 0.1 mg to 100 mg. An intravenous, subcutaneous or intramuscular dose of preferably 0.1 mg to 60 mg (eg 1 to 40 mg), which is administered 1 to 4 times a day. Compound (I) may also be administered by continuous intravenous infusion, preferably at a dose of up to 400 mg per day. Thus, the total daily dose by oral administration is in the range of 1-2000 mg and the total daily dose by parenteral administration is in the range of 0.1-400 mg. Suitably the compound is administered for a period of continuous therapy, for example for a week or more.
[0020]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The following description shows production examples, formulation examples and test examples of the compound (I) of the present invention.
[0021]
Production example
After dissolving uridine 5′-monophosphate (600 μmol) and hexadecyl alcohol (6 mmol) in 20 mL of t-butyl alcohol, 3 mmol of dicyclohexylcarbodiimide is added and heated at 80 ° C. for 20 hours. After completion of the reaction, the formed precipitate is filtered off and t-butyl alcohol is removed under reduced pressure. The residue is washed several times with a mixture of hexane and acetone (1: 1), dried and then dissolved in a mixture of chloroform and methanol (95: 5). This is loaded onto a silica gel column prepared with the same solution, and the column is thoroughly washed with the same solution to allow dicyclocarbodiimide to flow out. Thereafter, uridine 5′-hexadecyl phosphate is eluted by sequentially increasing the concentration of methanol. A white precipitate was obtained by removing the solvent from the eluate under reduced pressure. The yield per uridine 5′-monophosphate was 32.4%.
[0022]
Formulation Example 1 (intravenous injection)
Compound (I) 1-40 mg
Up to buffer pH 7
Solvent up to 100ml
[0023]
Formulation Example 2 (Bolus injection)
Compound (I) 1-40 mg
Up to buffer pH 7
Up to 5ml co-solvent
[0024]
In the above Formulation Examples 1 and 2, citrate, phosphate and sodium hydroxide / hydrochloric acid are specific examples of buffers, water is specific examples of solvents, and propylene glycol and polyethylene glycol are specific examples of cosolvents. And alcohol.
[0025]
Formulation Example 3 (tablet)
Compound (I) 1-40 mg
Diluent / Filler 50-250mg
Binder 5-25mg
Disintegrant 5-50mg
Lubricant 1-5mg
[0026]
In Formulation Example 3 above, specific examples of the diluent / filler include microcrystalline cellulose, lactose and starch, specific examples of the binder include polyvinylpyrrolidone and hydroxypropylmethylcellulose, and specific examples of the disintegrant include sodium starch glyco Specific examples of the lubricant and crospovidone include magnesium stearate and sodium stearyl fumarate.
[0027]
Formulation Example 4 (oral suspension)
Compound (I) 1-40 mg
Anti-precipitation agent 0.1-10mg
Diluent 20-60mg
Preservative 0.01-1.0mg
Buffer pH up to about 5-8
Co-solvent 0-40mg
Flavor 0.01-1.0mg
Colorant 0.001-0.1mg
[0028]
In Formulation Example 4, xanthine gum and microcrystalline cellulose are used as specific examples of the precipitation inhibitor, sorbitol solution, typically water, is used as a specific example of the diluent, and sodium benzoate is used as a specific example of the preservative. Specific examples of the buffer include citrate, and specific examples of the cosolvent include alcohol, propylene glycol, polyethylene glycol, and cyclodextrin.
[0029]
Test example
1． Test materials and test methods
1-1. Test material:-
Uridine 5'-octyl phosphate (I: R = C as test compound) ₈ H ₁₇ ) (UMPC8), uridine 5'-dodecyl phosphate (I: R = C ₁₂ H _{twenty five} ) (UMPC12), uridine 5'-hexadecyl phosphate (I: R = C ₁₆ H ₃₃ ) (UMPC16), uridine 5'-eicosyl phosphate (I: R = C ₂₀ H ₄₁ (UMPC20) and uridine 5'-tetracosyl phosphate (I: R = C _{twenty four} H ₄₉ ) (UMPC24) was synthesized according to the method of Production Example.
[0030]
1-hexadecyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PAF) as a platelet aggregation inducer was purchased from Bachem Feinchemikalien AG (Bubendorf, Switzerland).
[0031]
Calcium-ion permeable carrier “A23187”, bovine plasma-derived thrombin, arachidonic acid, palmitic acid, adenosine 5′-diphosphate (ADP), ionomycin calcium salt and bovine serum albumin (BSA, fraction V, free of essential fatty acids) , Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). For Hula 2AM and Hura 2, products from Dojin (Kumamoto, Japan) were used. Verapamil hydrochloride, 12-myristic acid 13-phorbol acetate (PMA) and Ficoll-Paque are Wako Pure Chemical (Tokyo, Japan), Research Biochemicals International (Natick, MA, USA) and Amersham Pharmacia Biotech (Tokyo, Japan), respectively. ). All reagents are special grade solvents.
[0032]
The buffer composition is as follows: (1) Basic Tyrode solution: NaCl 8.01 g / L, KCl 0.195 g / L, MgCl ₂ 6H ₂ O 0.215 g / L, NaHCO 3 _Three 1.02 g / L, glucose 1.01 g / L, pH 7.2; (2) Ca ²⁺ Tyrode / gelatin without EDTA: Same as buffer (1) but with gelatin (2.5 g / L) and Na ₂ EDTA (0.373 g / L), pH 6.5; (3) Ca ²⁺ Tyrode / gelatin containing: Same as buffer (1) but with CaCl ₂ 2H ₂ O (0.143 g / L), pH 7.2; (4) Buffered saline containing HEPES-EDTA: HEPES 1.00 g / L, NaCl 8.01 g / L, KCl 0.195 g / L, Dextrose 1.01 g / L, Na ₂ EDTA 0.373 g / L, pH 7.4.
[0033]
Rabbit platelet preparation: Plastic containers and siliconized glass containers were used for all platelet preparation and stimulation experiments. Washed rabbit platelets were prepared by a partial modification of the method of Sugatani et al. (J. Biol. Chem., 262, 5740, 1987). Each 45 mL of rabbit blood was added in 5 mL of 41 mM citrate-85 mM trisodium citrate-2% glucose solution and centrifuged at 170 g for 10 minutes. Platelet-rich plasma (PRP), a plasma rich in platelets, was layered with 10 mL Ficoll-Paque and centrifuged at 750 g for 20 minutes. The platelet layer is gently mixed with 40 mL HEPES-buffered saline (pH 7.2) containing 0.1 mM EDTA, overlaid with 0.2 mL Ficoll-Paque, and centrifuged at 750 g for 10 minutes. did. Again, the platelet layer was suspended in 40 mL of HEPES-buffered saline (pH 7.2) containing 0.1 mM EDTA and centrifuged at 750 g for 10 minutes. The blood cells are Tyrode / gelatin (pH 6.5) containing 0.1 mM EDTA, 1.0 × 10 6. ⁹ It was suspended so that it might become cells / mL.
[0034]
1-2. Test method:-
(Platelet aggregation test)
Platelets (1 × 10 ⁸ cells, 400 μL) is 1 mM Ca ²⁺ Stimulated and activated in Tyrode / gelatin buffer containing Aggregation activity is measured as a change in light transmission using an aggregometer (Nikko Hematracer, PAT-2A). Unless otherwise indicated, uridine 5'-alkyl phosphate dissolved in physiological saline containing 0.05% ethanol-0.005% dimethyl sulfoxide and verapamil dissolved in physiological saline are stimulants such as PAF. 1 minute before adding to the reaction system. The rate of inhibition of platelet aggregation is calculated by [(control reaction-inhibition reaction) / control reaction] × 100. IC ₅₀ Is obtained by regression analysis of an addition amount-reaction amount curve.
[0035]
(Measurement of free calcium concentration in cytosol)
Rabbit platelets (1 x 10) suspended in HEPES-buffered saline (pH 7.4) containing 0.1 mM EDTA. ⁹ cells / mL) is 1 × 10 ^-6 The cells were incubated with M fur-2-acetoxymethyl ester at 37 ° C. for 45 minutes to be taken up into cells and washed once to remove extracellular dye. 1 × 10 with Tyrode / gelatin buffer (pH 6.5) containing 0.1 mM EDTA ⁹ Resuspended to a cell / mL concentration. This platelet suspension (0.48 mL) is dispensed into a round bottom test tube, and Ca in the external solution is removed. ²⁺ ([Ca ²⁺ ] ₀ ) CaCl so that the concentration is 1 mM. ₂ Was added.
[0036]
Thereafter, these samples were transferred to a custom-made cuvette holder, placed in a JASCO (Tokyo, Japan) fluorescence spectrophotometer CAF-100 equipped with a recorder, and kept at 37 ° C. The magnet in the test tube was rotated to constantly agitate the cells. After holding at 37 ° C. for at least 5 minutes, the cells are added with 0.01 mM uridine 5′-alkyl phosphate at the aforementioned concentration for 1 minute and then 0.01 mL of the aforementioned concentration-inducing agent by adding 0.01 mL. Activated. Hula 2 fluorescence was measured continuously at excitation wavelengths of 340 nm (F340) and 380 nm (F380), each with an error of ± 5 nm. [Ca ²⁺ i was measured in the same manner as the ratio signal (F340 / F380) expressed as R340 / 380, with the corresponding emission signal (500 ± 10 nm).
[0037]
Intracellular Ca ²⁺ Concentration [Ca ²⁺ i can be calculated from the following equation (G. Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem., 260, 3440, 1985).
[Ca ²⁺ i = Kd × B × [(R−Rmin) / (Rmax−R)]
However, Kd: Ca ²⁺ The dissociation constant of hula 2 against, which can be calculated from the formula assuming in vivo 224 nM (G. Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem., 260, 3440, 1985); B: Ca ²⁺ Ca for F380 in a solution containing ²⁺ R: F340 / F380 fluorescence ratio; Rmax: 20% TritonX-100 is added at 0.01 mL and the cells are lysed, and the maximum light emission by intracellular Hula 2 is obtained. Signal value: Rmin: After measuring Rmax, 0.01 mL of 150 mM Tris / 450 mM EGTA was added, and Ca was added. ²⁺ Luminescent signal value when the is removed.
[0038]
All experiments were measured 3 to 4 times for each inhibitor. The experiment was also set to be completed within 1 hour to minimize the effects of platelet response fluorescence, dye leakage and fluorescent labeling.
Data display: The results shown in the tables and figures represent experiments performed at least twice using the adjusted platelets separately, and unless otherwise specified, provide multiple averages (± ranges). ing.
[0039]
2. Test results
2-1. Effect of UMPC16 on PAF causing platelet aggregation:-
The dose-dependent effect of PAF and UMPC16 on platelet aggregation is shown in FIG. That is, FIG. 1 is a diagram showing the effect of UMPC16 on PAF that causes platelet aggregation, where A shows the effect at different concentrations of UMPC16 on PAF that causes aggregation and B shows the effect on PAF that causes platelet aggregation. C shows dose-dependent effects of UMPC16 and palmitic acid, and C shows the inhibitory activity of UMPC16 on platelet aggregation by various concentrations of PAF.
[0040]
In FIG. 1A, a to f indicate the following experimental conditions. That is, 1 mM CaCl ₂ Washed rabbit platelets (1 × 10 5) in Tyrode / gelatin buffer (pH 7.2) containing ⁸ cells, 0.38 mL) is preincubated for 1 minute with UMPC16 (indicated concentration) (10 μL) dissolved in physiological saline containing 2.0% ethanol-2.0% dimethylsulfoxide (a), Thereafter, PAF (10 μL) dissolved in physiological saline containing 0.1% BSA (final concentration: 8 × 10 ^-11 M) was exposed for 2 minutes (the time when the maximum response was obtained by PAF stimulation) (b). The inhibition rate of platelet aggregation was calculated by the above method, and the results were shown as a plurality of average values (± range of average values). c is a mediator, d is 6 × 10 ^-6 M and e are 8 × 10 ^-6 M and f are 1 × 10 ^-Five The case of M is shown.
[0041]
As shown in FIG. 1A, the UMPC 16 has 8 × 10 ^-11 Although it did not suppress the morphology and changes of platelets by MPAF, it inhibited platelet aggregation. Aggregation inhibition by UMPC16 was dependent on the concentration of UMPC16 and PAF (see B and C in FIG. 1). On the other hand, palmitic acid at a concentration of 1 to 10 μM (consisting of a part of alkyl of UMPC16) did not inhibit platelet aggregation by PAF.
[0042]
2-2. Effect of UMPC16 on thrombin, arachidonic acid, ADP, A23187 and PMA causing platelet aggregation: −
In order to examine whether inhibition of platelet aggregation by UMPC16 is induced only by PAF, the effect of UMPC16 on the aggregation-inducing substance was tested. That is, 2-1. (FIG. 1), platelets (1 × 10 ⁸ cells, 0.38 mL) is preincubated with UMPC16 for 1 minute, and then PAF (final concentration 8 × 10 8) dissolved in an aggregation-inducing substance (10 μL), ie, physiological saline containing 0.1% BSA. ^-11 M), thrombin dissolved in physiological saline (final concentration 0.02 U / mL), arachidonic acid dissolved in physiological saline containing 4% ethanol (final concentration 2 × 10 ^-Five M), ADP dissolved in physiological saline (final concentration 2.5 × 10 ^-Five M) A23187 dissolved in physiological saline containing 4% dimethyl sulfoxide (final concentration 2 × 10 ^-7 M) and PMA dissolved in physiological saline containing 4% ethanol (final concentration 2 × 10 ^-8 M) were exposed for 2 minutes, 4 minutes, 2 minutes, 2 minutes, 4 minutes and 30 minutes, respectively (the time when maximum response was obtained by stimulation with an aggregating agent in the presence of a mediator). The inhibition rate of platelet aggregation was calculated by the above method, and the results are shown in FIG. 2 as a plurality of average values (± range of average values).
[0043]
As is apparent from FIG. 2, thrombin, arachidonic acid, and ADP that induce platelet aggregation were clearly suppressed by UMPC16, as did PAF that induce platelet aggregation. The strength of the inhibition depended on the aggregation inducer and the concentration of UMPC16. PAF that induces aggregation (8 × 10 ^-11 M), thrombin (0.02 U / mL), arachidonic acid (2 × 10 ^-Five M) and ADP (2.5 × 10 ^-Five IC for M) ₅₀ Each value is 2.4x10 ^-6 M, 5.4 × 10 ^-6 M, 2.1 × 10 ^-6 M and 2.2 × 10 ^-6 M (data not shown). Conversely, 2x10 ^-8 2x10 from M ^-7 Platelet aggregation by M23 A23187 and 2 × 10 ^-9 2x10 from M ^-7 Platelet aggregation by M at a concentration of PMA is 1 × 10 ^-Five It was not inhibited by M UMPC16. These results indicate that UMPC16 inhibits not only PAF stimulation but also receptor-mediated stimulation, but does not affect extracellular calcium influx induced by A23187 or activation of protein kinase C pathway. It shows that.
[0044]
2-3. Inhibitory effect of uridine 5′-alkyl phosphate compound (I) on PAF and thrombin inducing platelet aggregation: −
The platelet aggregation inhibitory action of various uridine 5′-alkyl phosphate compounds (I), that is, UMPC8, UMPC12, UMPC16, UMPC20 and UMPC24 was examined. That is, a predetermined concentration of UMPC8, UMPC12, UMPC16, UMPC20 or UMPC24 (10 μL) dissolved in physiological saline containing 2.0% ethanol-2.0% dimethyl sulfoxide was added to 1 mM CaCl. ₂ Platelets (1 x 10) in Tyrode / gelatin buffer (pH 7.2) ⁸ cells, 0.38 mL) for 1 minute, and then PAF dissolved in physiological saline containing 0.1% BSA (final concentration 8 × 10 ^-11 M) Expose to thrombin (final concentration 0.02 U / mL) (B) dissolved in (A) or saline for 2 or 4 minutes, respectively. The inhibition rate of platelet aggregation was calculated by the above-described method, and the results are shown as a plurality of average values in FIG. 3 (± average value range).
[0045]
As apparent from FIGS. 3A and 3B, these uridine 5′-alkyl phosphate compounds (I) affect platelet aggregation by PAF and thrombin. Uridine 5′-alkyl phosphates containing C16 and C20 with extended length of the methylene chain of the extreme head group reported inhibition of PAF that causes platelet aggregation against PAF stimulation (KD Newman et al., J. Clin. Invest., 61, 395, 1978; TC Lee et al., Arch. Biochem. Biophys., 223, 33, 1983; FH Valone et al., Thromb. Res., 40, 385 1985), which was more strongly inhibited than verapamil, a calcium channel inhibitor. That is, 1 × 10 ^-Five M UMPC16 and 1 × 10 ^-Five M Verapamil is 8 × 10 8 for each control study ^-11 Aggregation by MPAF was suppressed by 0% and 19%. 8 × 10 ^-11 IC for inhibition of aggregation of UMPC16 against MPAF ₅₀ Value (2.4 × 10 ^-6 M) is the IC of UMPC20 ₅₀ Value (2.2 × 10 ^-6 M). Furthermore, UMPC16 and UMPC20 similarly inhibited not only PAF but also thrombin aggregation.
[0046]
2-4. Features of the inhibitory action of UMPC16 on PAF causing aggregation:
Next, it was investigated whether the inhibition of platelet aggregation induced by UMPC16 was reversed by supplemental calcium, similar to that seen with verapamil. That is, 1 mM or 10 mM CaCl. ₂ Platelets in Tyrode / gelatin buffer (pH 7.2) containing ⁸ cells, 0.38 mL) dissolved in physiological saline containing 2.0% ethanol-2.0% dimethyl sulfoxide (final concentration 1 × 10 ^-Five M) (10 μL) and preincubation for 1 minute, followed by PAF dissolved in physiological saline containing 0.1% BSA (final concentration 8 × 10 ^-11 M) for 2 minutes. The inhibition rate of platelet aggregation was calculated by the method described above, and the results are shown in FIG. 4 as a plurality of average values (± range of average values).
[0047]
As can be seen from FIG. 4, when the calcium concentration was increased in the range of 1 mM to 10 mM in the platelet suspension, the inhibition by UMPC16 on the induction of PAF aggregation was not restored. Conversely, supplementary CaCl ₂ When the concentration was 10 mM, the degree of induction of platelet aggregation by PAF decreased to 72%.
[0048]
Furthermore, in order to investigate whether UMPC16 was effective after addition of PAF, the influence of the addition time of UMPC16 on platelet aggregation was examined. That is, the solvent for UMPC16 or control test was 8 × 10 ^-8 The platelets were added to platelets at designated times before and after the addition of M PAF, and the inhibition rate of platelet aggregation was calculated by the above method, and the results are shown as a plurality of average values in FIG. 8 × 10 ^-11 1 × 10 min for 1 min before adding M PAF ^-Five Not only incubated with M UMPC16 but also 8 × 10 ^-11 1 × 10 simultaneously with M PAF ^-Five Even when M UMPC16 was added, aggregation by PAF was inhibited by 100%. On the other hand, when UMPC16 was added to platelets after 10 seconds, 30 seconds, and 1 minute after addition of PAF, the platelet aggregation was about 29%, 42%, and 75%, respectively, with respect to the control test (FIG. 5). ). These findings indicate that UMPC16 caused disaggregation like verapamil and had an inhibitory effect on PAF stimulation even when added after PAF.
[0049]
2-5. [Ca ²⁺ The action of UMPC16 on PAF and ionomycin inducing i responses:-
[Ca ²⁺ In order to investigate the effect of UMPC16 on PAF and ionomycin inducing i reaction, UMPC16 and solvent were preincubated directly with platelets for 1 minute in 37 ° C warm water. Maximum response was measured by stimulation with PAF in the presence of solvent. The instructions for addition were solvent (a), PAF (b, 8 × 10 ^-11 M), UMPC16 (c, 1 × 10 − ^Five M), ionomycin (d, 4 × 1) ^-8 M) was added. The results are shown in FIG. 6 as a representative example of experiments conducted at least four times.
[0050]
The effects of verapamil and UMPCs on PAF and ionomycin, which change the calcium concentration in platelets, were compared. That is, platelets (10 ⁹ cells / mL), solvent, verapamil (final concentration 1 × 10 ^-1 M) or UMPCs (final concentration 1 × 10 ^-Five M) and, as described in 2.4 (FIG. 5) above, after incubation and treatment for 1 minute, PAF (final concentration 4 × 10 ^-11 M) and ionomycin (final concentration 4 × 10 ^-8 Exposed to M). Maximum [Ca ²⁺ i levels were measured by fura-2 fluorescence as described above. The results are shown in Table 1 as the mean value ± SD of the measurement results obtained 4-6 times.
[0051]
[Table 1]

[0052]
From this result, the UMPC 16 determines that [Ca ²⁺ ] attenuates the effect of PAF inducing i ²⁺ It can be seen that the effect of ionomycin inducing i is not attenuated (FIG. 6, Table 1). In the presence of 1 mM extracellular calcium, the average of unstimulated platelets [Ca ²⁺ i was 52.0 ± 18.4 nM (n = 15) and UMPC16 did not change this value. 8 × 10 ^-11 When M PAF is added, platelets [Ca ²⁺ i rises to 474.7 ± 74.2 nM, but UMPC16 has a [Ca ²⁺ ] Reduced i's rise. According to UMPC16 [Ca ²⁺ The degree of inhibition of the i reaction was higher than that with verapamil (Table 1), but the mode of inhibition of platelet aggregation was very similar.
[0053]
3. Analysis of test results
The above test results show that UMPC16 directly inhibits not only PAF but also thrombin, arachidonic acid and ADP that induce platelet aggregation in a dose-dependent manner, and the inhibition is not limited to PAF that induces platelet activation. (FIGS. 1 and 2). Among UMPC compounds, UMPC16 has a stronger inhibitory effect on platelet activation than UMPC8 and UMPC12 (FIG. 3). Arachidonic acid is an endoperoxide or thromboxane A that is thought to induce the activity of the phospholipase C pathway. ₂ Via cyclooxygenase and thromboxane A ₂ Metabolized by synthetase. PAF, thrombin, thromboxane A ₂ And stimulation by ADP induces activation of phospholipase C associated with the protein kinase C system, which is transmitted through the receptor and causes 40-kDa protein phosphorylation. UMPC16 is responsible for platelet aggregation by stimulation through these receptors and [Ca ²⁺ Inhibited the effect of PAF inducing changes in i (Figures 2 and 6 and Table 1).
[0054]
Increasing calcium concentration in the platelet suspension does not restore the aggregation-induced inhibition of UMPC16 on PAF (FIG. 4), which is different from the mode of activity of verapamil. Other findings indicate that the inhibitory effect of verapamil on neutrophils is not only to inhibit calcium influx, but also a direct inhibitory activity on protein kinase C enzyme activated by verapamil. ing. On the other hand, UMPC16 is a calcium ion permeable carrier, and causes A23187 and [Ca to induce platelet aggregation. ²⁺ It did not inhibit the action of ionomycin to change i (FIGS. 2 and 6). Furthermore, UMPC16 did not inhibit PMA that causes platelet aggregation (FIG. 2). PMA directly activates protein kinase C, which phosphorylates a 40 kDa protein, in platelets. ²⁺ Do not need.
[0055]
As shown in FIG. 5, when added to platelets previously aggregated with PAF, 1 × 10 ^-Five UMPC16 at a concentration of M can inhibit aggregation. That is, it causes disaggregation. Verapamil has been reported to cause disaggregation in platelets aggregated with PAF by reversing phosphorylation of 40-kDa and 20-kDa proteins (G. Bonadonna et al., Thromb. Heamos., 56, 308, 1986). In a study on the kinetics of PAF binding to rabbit platelets, platelets fully aggregated by PAF are disaggregated at the same time as the amount of PAF to the receptor decreases, ie, maintain platelet aggregation Therefore, it has been elucidated that it shows that the receptor requires the binding of PAF.
[0056]
As described above, the mode of activity of UMPC16 is based on inhibition of calcium influx through an aggregation inducer that specifically binds to a receptor, or inhibition of the aggregation inducer binding in the same manner as verapamil, which is a calcium channel inhibitor. Can be considered. In addition, inhibition of the reaction depending on intracellular calcium may affect the inhibitory activity of UMPC16 on the platelet reaction. In conclusion, it can be said that UMPC16 more effectively inhibits receptors mediated by platelet responses than verapamil.
[0057]
【The invention's effect】
The nucleoside 5′-alkyl phosphate compound (I) of the present invention has a calcium antagonistic action, and in particular, has a calcium antagonistic action based on inhibition of extracellular fluid calcium into the cell, thereby preventing myocardial injury and arrhythmia. Since it is effective and has an excellent platelet aggregation inhibitory effect, it is useful as a prophylactic or therapeutic agent for thrombosis, embolism or arteriosclerosis.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the effect of UMPC16 on PAF that induces platelet aggregation. A shows the effect of different concentrations of UMPC16 on PAF inducing aggregation, B shows the dose-dependent effects of UMPC16 and palmitic acid on PAF inducing platelet aggregation, and C shows the platelet aggregation by various concentrations of PAF. Inhibitory activity of UMPC16 against.
FIG. 2 is a graph showing the inhibitory effect of UMPC16 on an aggregation-inducing substance that induces platelet aggregation.
FIG. 3 is a graph showing the inhibitory effect of uridine 5′-alkyl phosphates on platelet aggregation inducers. A is when the inducing agent is PAF, and B is when the inducing agent is thrombin.
FIG. 4 is a graph showing the effect of extracellular calcium on the inhibitory activity of PAF that causes platelet aggregation by UMPC16.
FIG. 5 is a graph showing the effect of adding UMPC16 at various times to PAF that causes platelet aggregation.
FIG. 6 is a graph showing the effect of UMPC16 on PAF and ionomycin that change the calcium concentration in platelets.

Claims (3)

Formula I:

(In the formula, R represents a linear or branched alkyl group having 16 to 20 carbon atoms .)
A calcium antagonist comprising, as an active ingredient, a uridine 5′-alkyl phosphate compound represented by the formula: The calcium antagonist according to claim 1, wherein the uridine 5'-alkyl phosphate compound is used in a free form or a pharmaceutically acceptable form capable of giving a free form in vivo selected from hydrates and salts. The calcium antagonist of Claim 1 or 2 used as a platelet aggregation inhibitor .

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